CN1564867B - 治疗利什曼原虫感染的dna表达构建体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗利什曼原虫感染的DNA表达构建体以及相应的疫苗。该疫苗用于抗利什曼原虫病的免疫接种，其中具体利用了免疫原性的p36LACK抗原以激发免疫应答。采用线性双链的共价闭合的表达盒作为基因穿梭。该基因表达构建体可以结合于寡肽以增加转染效率。

Description

治疗利什曼原虫感染的DNA表达构建体

技术领域

本发明涉及一种治疗利什曼原虫感染的DNA表达构建体，以及相应的疫苗。

背景技术

利什曼原虫(Leishmania)属于动质体目鞭毛锥虫科(trypanosmatideflagellates of the order Kinetoplastida)。白蛉属(Phlebotomus)和罗蛉属(Lutzomyia)的雌性吸血性白蛉将它们传播到不同的哺乳动物种属和人类。利什曼病是有着多种临床表现的疾病并构成了一个主要的健康问题。根据WHO的估计，全世界范围内大约有1200万人感染了这种疾病。大约所有HIV患者的2到9％患有内脏利什曼病，这使得它被认为是影响HIV患者的第三大严重的寄生虫疾病。

作为治疗的化疗只表现出了有限的作用。

因为那些已经战胜感染的人出现了对随后感染的强烈的免疫力，因此发展一种有效的疫苗应当是有可能的。

免疫接种的原理是依照于免疫系统对过去已经成功地对抗过的病原体结构的识别。存在两种不同的主要途径：体液途径，它依赖于抗体的生成，这些抗体能在细胞间隙对抗细菌，以及细胞途径，它依赖于免疫系统的T淋巴细胞活性。T淋巴细胞能识别被病毒感染的细胞。体液免疫应答也被称为Th2途径以及细胞免疫应答称为Th1途径。利什曼病的接种或免疫治疗应当可能是通过诱导Th1免疫应答的方式，因为它的致病原是细胞内寄生虫。对于现有技术而言，诱导Th1反应对治疗或预防利什曼病的重要性是被频繁地引用的(Handman等，免疫学杂志，160：3949-57；Gurunathan等，自然医学：4(12)：1409-15)。为了促进对Th1型免疫应答的诱导，共刺激因子IL-12做为佐剂的必要性被引用(Parker等，免疫学杂志，140：896-902)。

在小鼠的各种试验性疫苗方案中测试了不同的抗原.Balb/c小鼠是研究利什曼病的好模型.在小鼠和人之间存在着在感染进展和病变发展方面的重要的相似性.小鼠的针对于这种感染的免疫应答似乎是与人相似的，并也可能是与狗相似的(Cox，Int.J.Parasitol.263：1147-1157).采用的抗原是gp63(Scott等，实验医学，168：1675-1684)，gp46(McMahon-Pratt等，感染和免疫61：3351-3359)，p-4和p-8(Scott等，免疫学99：615-624)以及称为gp36或LACK的抗原(Gonzales-seguinolaza等，欧洲生化杂志，259：909-916).LACK是一种来自利什曼原虫的36kDa抗原，它是高度保守的并在利什曼原虫的所有相关属中都能发现.它在前鞭毛体和无鞭毛体内都有表达，这是寄生虫在宿主体内生活周期的两种生活阶段.在小鼠模型中已经表明诱导依赖于γ干扰素和T辅助细胞分泌的IL-12的细胞毒Th1免疫应答有助于战胜感染的挑战，然而诱导IL-4启动的Th2辅助细胞反应有助于感染.为了促进免疫应答向Th1类型的转换，Gonzalo等采用疫苗病毒作为一种病毒基因转化方法，以及IL-12作为佐剂.它们将p36/LACK作为抗原.汇总了不同的接种方案.最成功的接种方案是用p36蛋白进行初次接种以及用编码p36和IL-12的重组疫苗病毒二次接种，比较于未接种小鼠，该方案可以导致病灶平均减少52％.在有着最高滴度的IgG2a抗体的动物中发现了对感染的最大程度的保护(Gonzalo等，微生物和感染，3(9)：701-711).

用于转化编码免疫原性抗原或它们的一部分的DNA的各种化学的、物理的和生物的方法是已知的。

转染的生物学方法，也称为基因穿梭，是载体、质粒或共价的封闭的微小化的DNA构建体，在下面称为MIDGE(微小化的免疫学限定的基因表达载体(minimalistic immunologically defined gene expressionvectors)，见EP 0 914 318 B1)。

通过细菌发酵获得质粒。除了所需基因外，它们还包括它们的扩增和选择所必需的DNA、常见的对抗使用于细菌发酵的抗生素的耐药基因。这种细菌DNA的缺点是它含有免疫刺激序列(“ISS”，就是非甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸，“CpG”)。这种作用在免疫抑制的患者中是特别不需要的(详细地描述于DE 199 35 756)。当使用基于质粒DNA的基因表达构建体时，也存在着将耐药基因播散的固有的危险，这在接种活动中似乎是特别不负责任的。因为这个原因，Gurunathan等(实验医学杂志，186卷，第7期(1997)：1137-1147)所建议的利用含有利什曼原虫特异p36LACK抗原的真核表达载体进行接种的方法也是非常不利的。上述的以质粒为基础的表达载体的缺点构成了它们在医学实践中广泛使用的障碍。

为了达到较大的转染效率，最常使用的基因转化方法是使用病毒载体。但是与它们的使用所相关的安全危险是它们的广泛应用的障碍。已知存在的高度危险是宿主有机体将启动对转染细胞的细胞毒反应。在临床试验中，大剂量腺病毒的应用导致了患者的死亡；免疫系统的过度反应似乎是它的原因(Lehrman，1999，自然，401：517-518)。另外，不能除外通过不稳定性将减毒疫苗株转化为强毒株。病毒成分自身也可以是免疫原性的，这通过患者的免疫系统造成它们作用的减弱。

除了这些缺点外，因为目前的基因转化方法的缺陷，所有的通过疫苗接种发展一种对利什曼原虫的有效的和安全的保护性作用的尝试都是不可能的。

发明内容

本发明的目的是提供一种安全的、有效的和保护性的抗利什曼原虫的免疫接种方法。

通过在独立权利要求中所包含的内容来达到此目的。

本发明基于提供一种用于抗利什曼原虫感染的免疫接种的DNA表达构建体，其中所提供的免疫接种的多核苷酸序列为由共价闭合的线性脱氧核糖核苷酸分子组成的表达构建体，该分子包括线性双链区域，其中通过短单链脱氧核糖核苷酸环连接形成双链的单链，其中上述形成双链的单链仅由在启动子和终止子序列调控下的编码序列(该启动子在被接种的动物中是可操纵的)组成，以及该构建体连接于一或多个肽以增加转染效率(见EP 0 941 318 B1)。所提供的这类DNA表达构建体有着其他方法(例如引用的接种方案)所不能达到的惊奇的作用(如下)，特别的，根据本发明的免疫接种没有上述的真核细胞表达载体的缺点。

根据本发明，计划使用免疫原性的p36LACK抗原用于激发免疫应答.将线性双链的共价闭合的表达盒作为基因转化物.该表达盒由编码序列、启动子和任选的终止子序列组成，因此该构建体只含有用于所需基因表达所必需的信息(见EP 0 941 318 B1)。因此，本发明提供了共价结合于寡肽的DNA表达序列以增强转染效率，寡肽优选的有5到25个氨基酸长度并且其中至少半数的氨基酸来自于赖氨酸和精氨酸的组。特别优选的为核定位序列。

优选的为：

●序列PKKKRKV(脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-赖氨酸-缬氨酸＝Seq ID 3)包括来自猴病毒SV40的核定位信号(NLS)。SV40NLS能将大到465kDa的蛋白定位到核内(Lanford等，1986，细胞15；46(4)：575-82)。这里利用该肽的特性通过将其连接于DNA以增加基因转化。

●或HIV基因产品TAT的11个氨基酸T肽片段(YGRKKRRQRRR＝Seq ID 2)。

在从属权利要求中含有更多的有利的方面。本发明在以下的实施例和附图中得到了更详细的描述和讨论。

在附图中所含的内容中示例性说明了依照本发明的DNA表达构建体和含有这些构建体的药用产品的惊奇作用。简写说明：

pMOK p36  编码p36抗原的质粒

Mp36-NLS  编码p36抗原并结合于NLS肽的MIDGE

pMOKctr   编码HBsAg的调控质粒

rVVp36    编码p36的重组疫苗病毒

phosphate 作为对照的磷酸缓冲液

control+  阳性对照，用硕大利什曼原虫感染小鼠的血清

control-  阴性对照，未处理小鼠的血清

附图说明

图1：显示了用硕大利什曼原虫前鞭毛体感染前的总IgG抗体滴度。只有在含有用重组疫苗病毒进行二次接种的接种方案中有可测定的抗体滴度。

图2：显示了感染后的总IgG抗体滴度。所有的接种方案都表现出了可测定的抗体反应，其中MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS激发出了最高滴度的循环抗体。

图3：二次接种和用硕大利什曼原虫前鞭毛体感染后的抗体亚型IgG2a和IgG1的比例。令人惊奇的，从抗体亚型的分布上看，NLS结合的MIDGE所激发的免疫应答是更具细胞毒性的，以及和pMOK p36方案所激发的反应只有轻度不同。

图4：病灶在感染后8周的时间框内的发展。基于MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS和pMOK p36/rVV p36的接种方案获得了对硕大利什曼原虫感染的最长时间的保护。病灶发展的减慢说明了保护作用。然而，在MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS组中获得了最有效和持续时间最长的保护。

图5：8周后病灶的大小。在感染8周后，病灶的大小在接种了MIDGEp36-NLS/MIDGE p36-NLS的动物中比在未接种的对照组中缩小了80％。比较于用p36/rVV接种的组，MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS组对硕大利什曼原虫的保护作用增加了11％。

具体实施方式

探讨了将微小化表达盒连接于肽的变更是否能改变免疫应答的强度或偏向.为了增加转染的效率，尝试了将不同的肽或其他有机分子连接于MIDGE载体.

因此，肌肉内应用将来自SV40病毒的核定位信号共价连接到编码HBsAg的MIDGE可以增加10到15倍的抗体滴度是有可能的。(Schirmbeck等，分子医学杂志，2001 Jun，79(5-6)：343-50)。

在小鼠的接种试验中，测试了不同的基因表达构建体，所有的构建体都编码抗原p36LACK。采用了连接有NLS肽的MIDGE(MIDGE p36-NLS)，质粒(pMOKp36)和重组疫苗病毒(rVVp36)。为了获得最大程度的保护，设计了不同的接种方案。作为临床接种成功的相关参数，测定了被感染动物的后足的感染相关病变的生长。测定了作为替代参数的IgG1和IgG2a抗体亚型的比例。通常认为亚型比例移向IgG2a是与对感染的保护或病变进展的显著减缓相关。除了用质粒初次接种和用重组疫苗病毒(rVV)二次接种的方法外，这些是本领域已知的方法，还要特别地明确是否接种本发明的药用产品也可以获得相似的保护作用。

将ELISA确定的总IgG抗体滴度作为激发免疫应答的标准。仅仅两种接种方案在用硕大利什曼原虫前鞭毛体感染前能激发出可测定的抗体水平(见图1)。在两个方案中，重组的疫苗病毒都被作为二次接种(强化接种)。不同的研究已经说明循环抗体单独不能作为推测的保护作用的指示。循环抗体和对感染的保护作用之间的联系只能在感染后才能确定。图2说明了用硕大利什曼原虫感染后的抗体滴度。所有的接种方案都显示了可测定的抗体滴度，在MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS中获得了最高的抗体滴度。

测定抗体亚型IgG1和IgG2a以说明在免疫应答偏向上的最后偏移。给定抗原的特异的γ免疫球蛋白(IgG)的亚型分布反映了对该抗原的整个免疫应答的偏向。如此，IgG1亚型更多的是体液反应的特征，与活化淋巴细胞分泌IL-4和IL-10的增加有关；而IgG2a亚型水平的增加通常为细胞Th1反应，与γ干扰素和IL-12的分泌增加有关。这些亚型的出现不是本发明所独有的，然而可以将相对滴度作为所形成的主要的免疫应答类型的标记。

如图3中所示，连接有NLS肽的MIDGE能激发细胞(Th1)免疫应答。如先前所设想的，免疫应答的细胞部分在对抗细胞内寄生虫上是决定性的。MIDGE p36-NLS诱导的Th2反应向Th1反应的转变和pMOKp36/rVV p36所诱导的只有轻度的不同。

为了评价获得的保护作用，将硕大利什曼原虫前鞭毛体用于感染。根据病灶的生长程度比较接种的成功性。可以观察到用MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS处理的小鼠出现了最小的病灶，说明通过接种方案MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS可以获得最长时间的保护作用(图4和5)。

就本发明的药用组合物在它的保护作用方面比目前本领域已知的最好的用重组疫苗病毒(rVV)二次接种(强化接种)的接种方案更好而言，这些结果是非常令人惊奇的。另外，它避免了质粒和减毒病毒的可能的副作用，并在保护作用上仍具有可比性(Gonzalo等，微生物和感染：3(9)：701-711)。虽然本发明的药用组合物有着相似的或更好的保护作用，但是它的主要优点是它避免了质粒和重组病毒的潜在的副作用。它可以被更简单，更廉价地生产，以及本发明的组合物是更安全的。

实施例

实施例1.1质粒pMOKD36的重组构建体

利用PCR从起始质粒pSCp36扩增两个片段：

1.PCR将近800个碱基对

引物：左5’-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT(＝Seq ID6)，

引物：右5’-TTATATGAGCTCAGAAGACACGGACAGGGACCTCTTCCGATCG(＝Seq ID 7)。

2.PCR将近950个碱基对：

引物：左5’-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT(＝Seq ID8)，

引物：右5’-TTATATGAGCTCTTACTCGGCCGTCGGAGATGG(＝Seq ID9)。

用Eco311消化来自第二个PCR反应的PCR产物并分离更小的片段(近200个碱基对)。

用Bpil消化来自第一个PCR反应的PCR产物。

将200个碱基对片段和来自第一个PCR反应的消化片段连接并随后用Kpnl和Sacl消化，以及插入连接于已经用Kpnl和Sacl消化过的pMOK载体中。得到的质粒命名为pMOKp36(＝Seq ID 1)。

实施例1.2：NLS序列共价结合于寡核苷酸

NLS的结合如下进行：含有序列PKKKRKV的NLS肽按两个步骤结合于ODN。首先，用sulfo-KMUS(5mM)的PBS溶液在室温下激活修饰后的寡核苷酸5’-PH-dGGG AGT CCA GT xT TTC TGG AC(其中xT代表氨基修饰的胸腺嘧啶和C2氨基连接的残基；＝ODN1＝Seq ID 4)。120分钟后加入50mM三羟甲基氨基甲烷终止反应，乙醇(300mM醋酸钠pH 5.2，5.5mM氯化镁，70％乙醇)沉淀后获得活性的ODN并用70％乙醇洗涤一轮。然后将得到的ODN以0.1mM溶解在PBS中，并和活化的肽在室温下再反应1小时。用凝胶电泳和溴化乙啶染色检测反应物。HPLC纯化NLS连接的ODN并将其用于合成MIDGE p36-NLS构建体。

实施例1.3：MIDGE p36-NLS的生产

MIDGE是线性共价的封闭表达盒，它仅由CMV启动子、一个内含子、相应基因序列和聚腺苷酸化序列组成(见EP 0 941 318 B1)。如下制备构建体：用Eco311将实施例1.1所描述的质粒pMOKp36完全消化。在Eco311存在下，利用T4DNA连接酶连接5’磷酸化的发夹样的5’-PH-GGG AGT CCA GT xT TTC TGG AC(＝ODN1＝Seq ID 4)和5，-AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC 3’(＝ODN2＝Seq ID 5)，加热到70℃终止反应。浓缩产生的混合物并用Eco311和T7DNA聚合酶在缺乏三磷酸脱氧核糖核苷酸的条件下处理之。利用离子交换层析法进行纯化。

实施例1.4：测定小鼠的p36抗体

根据如下的方案将MIDGE p36-NLS，pMOKp36和重组疫苗病毒p36(rVV)注射到雌性小鼠(Bal/c)内。

表1

组	初次接种	二次接种(强化)
			1	pMOKp36	pMOKp36
2	MIDGE p36-NLS	MIDGE p36-NLS

组	初次接种	二次接种(强化)
			3	pMOK对照	pMOK对照
4	pMOKp36	rVV p36
			5	MIDGE p36-NLS	rVV p36
7	磷酸缓冲液	磷酸缓冲液

每组中使用10只小鼠。

DNA的量为：

pMOKp36：100μg，i.d.

MIDGE p36-NLS：54,8μg，i.d.

rVV p36：5x10⁷pfu/动物，i.p.

溶解于pH 7.2的磷酸钠缓冲液中并应用。

2周后，用相应的DNA构建体(见表1)进行第二次接种(强化)。强化后3周，用5x10⁴硕大利什曼原虫前鞭毛体进行感染。它们被皮下注射到右侧后足。每周观察感染情况。用电子卡尺测定病变的大小并比较于未处理的左后足。

在感染8周后，将所有的小鼠放血以获得血清。测定对p36的总IgG抗体滴度以及利用ELISA方法进行IgG2a和IgG1的测定，在波长406nm处的吸收读数作为光密度。

序列表

<110>莫洛根有限公司

<120>治疗利什曼原虫感染的DNA表达构建体

<130>XI 1396/02

<150>DE 101 48 732.0

<151>2001-10-02

<150>DE 101 56 679.4

<151>2001-11-12

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>4791

<212>DNA

<213>质粒pscp36

<220>

<221>其他特征

<222>(1939)..(1045)

<223>卡那霉素抗性，反向互补

<220>

<221>启动子

<222>(2447)..(3243)

<223>CMV

<220>

<221>内含子

<222>(3250)..(3386)

<223>

<220>

<221>其他特征

<222>(3393)..(4331)

<223>p36蛋白质

<220>

<221>polyA_位点

<222>(4338)..(4539)

<223>pol y A位点aus SV 40

<400>1

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta     60

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cgtccggcgg caaggacggc gcggcgctgc tgtgggacct gagcaccggc gagcagctgt  4080

tcaagatcaa cgtggagtcg cccatcaacc agatcgcctt ctcgcccaac cgcttctgga  4140

tgtgcgtcgc gacggagagg tccctgtccg tgtacgacct ggagagcaag gctgtgattg  4200

cggagctgac gccggacggc gcgaagccgt ccgagtgcat ctccattgcc tggtccgccg  4260

acggcaacac tctgtactcc ggtcacaagg acaacctgat ccgcgtgtgg tccatctccg  4320

acgccgagta agagctcgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat  4380

gctttatttgtgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt  aaccattata agctgcaata  4440

aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg  4500

aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtag aattcagggg gagacccaat  4560

tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac  4620

aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc  4680

acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg  4740

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg c           4791

<210>2

<211>11

<212>PRT

<213>人类免疫缺陷病毒1型，TAT肽

<400>2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1               5                   10

<210>3

<211>7

<212>PRT

<213>猴病毒40，NLS肽

<400>3

Pro Lys Lys Lys Arg Lys val

1               5

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>ODN 1

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(12)..(12)

<223>XT＝反应性氨基修饰的胸腺嘧啶

<400>4

gggagtccag ttttctggac    20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>ODN 2

<400>5

aggggtccag ttttctggac    20

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>1.PCR：引物左

<400>6

ttatatggta ccatgaacat acgagggtca cct               33

<210>7

<211>42

<212>DNA

<213>1.PcR：引物右

<400>7

ttatatgagc tcagaagaca cggacaggga cctcttccgt cg     42

<210>8

<211>33

<212>DNA

<213>2.PcR：引物左

<400>8

ttatatggta ccatgaacat acgagggtca cct               33

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>2.PcR：引物右

<400>9

ttatatgagc tcttactcgg ccgtcggaga tgg               33

Claims (3)

1.用于抗利什曼原虫感染的免疫接种的DNA表达构建体，其特征在于接种的多核苷酸序列的形式为表达构建体，所述的表达构建体为编码p36 LACK抗原的微小化的免疫学限定的基因表达载体，该构建体由共价闭合的线性脱氧核糖核苷酸分子组成，该分子包括一个线性双链区域，形成所述双链区域的单链由短单链脱氧核糖核酸核苷酸环连接，所述的形成双链的单链仅由在被接种的动物中是可操纵型的启动子和终止子序列调控下的编码序列组成，所述编码序列编码p36 LACK抗原，且该DNA表达构建体共价连接于一或多个寡肽以增加转染效率，所述寡肽包括氨基酸序列PKKKRKV。

2.权利要求1的DNA表达构建体在生产用于治疗利什曼原虫感染性疾病的疫苗中的用途。

3.用于治疗利什曼原虫感染性疾病的疫苗，其含有权利要求1的DNA表达构建体。

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