ES2242888T3 - Constructo de expresion de adn para el tratamiento de infecciones por leishmaniosis. - Google Patents
Constructo de expresion de adn para el tratamiento de infecciones por leishmaniosis.Info
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Abstract
Constructo de expresión de ADN para la inmunización frente a infecciones por leishmaniosis, caracterizado porque las secuencias de polinucleótidos que confieren la inmunización son constructos de expresión constituidos por moléculas lineales de ácido desoxirribonucleico cerradas covalentes que presentan una zona bicatenaria lineal, en donde las hebras individuales que forman el emparejamiento bicatenario están unidas mediante cortos lazos monocatenarios de nucleótidos de ácido desoxirribonucleico, en donde dichas hebras constan sólo de la secuencia codificadora que codifica al menos el antígeno p36 LACK bajo el control de un promotor que se pone en funcionamiento en el animal al que se va a vacunar y de una secuencia terminadora, y en donde el constructo de expresión de ADN está unido de forma covalente con uno o más oligopéptidos para aumentar la eficacia de la transfección y el oligopéptido consta de un número de aminoácidos que oscila entre 3 y 30, de los que al menos la mitad son aminoácidos básicos del grupo formado por arginina o lisina.
Description
Constructo de expresión de ADN para el
tratamiento de infecciones por leishmaniosis.
La presente invención se refiere a un constructo
de expresión de ADN para el tratamiento de infecciones por
leishmaniosis, así como al desarrollo de su correspondiente
vacuna.
Las Leishmanias son Flagelados
tripanosomátidos del orden Kinetoplastida que se trasmiten a
determinadas especies de mamíferos y al hombre por la picadura de
los mosquitos de los géneros Phelebotomus y Lutzomyia.
Las leishmaniosis son enfermedades con cuadros clínicos de diversa
índole, pero todos ellos representan un problema muy grave para la
salud. Según datos de la OMS, padecen actualmente esta enfermedad
unos 12 millones de personas en todo el mundo. Entre un 2 y un 9 por
ciento de los pacientes con VIH desarrollan una leishmaniosis
visceral, lo que la convierte en la tercera enfermedad parasitaria
más frecuente en pacientes seropositivos.
Se da la circunstancia de que la quimioterapia
tiene poco o ningún efecto positivo cuando se utiliza como
tratamiento para esta enfermedad.
A la vista de los hechos, y teniendo en cuenta
que las personas que superan la infección desarrollan una fuerte
inmunidad frente a ésta, se pensó en la posibilidad de desarrollar
una inmunidad conferida por vacunación.
La inmunización puede definirse como la capacidad
del organismo para reconocer las estructuras de agentes patógenos a
los que ya ha combatido anteriormente. El sistema inmune presenta en
este caso dos "ramas" distintas: la humoral, basada en la
síntesis de anticuerpos capaces de combatir las bacterias que se
encuentran en el espacio extracelular, y la celular, basada sobre
todo en la actividad de los linfocitos T del sistema inmunitario.
Los linfocitos T son capaces de detectar células infectadas con
virus. La inmunidad humoral recibe también el nombre de vía Th2,
mientras que la inmunidad celular se conoce como vía Th1. Así, la
vacuna (o inmunoterapia) para la leishmaniosis provocada por
parásitos intracelulares debe desarrollarse creando una reacción
inmune tipo Th1. En el estado actual de la técnica se alude con
frecuencia al significado que puede tener la creación de una
respuesta tipo Th1 en el tratamiento o prevención de la
leishmaniosis (Handman y col., J Immunol 160:
3949-57, Gurunathan y col., Nature Med:
4(12): 1409-15). No obstante, también se
piensa que para estimular esta respuesta inmune tipo Th1 es
imprescindible utilizar una citoquina IL-12
coestimulatoria como tratamiento complementario (Parker y col., J.
Immunol. 140: 896-902).
Se han realizado protocolos de vacunación
experimentales con ratones para comprobar diversos antígenos. A este
respecto cabe señalar que los ratones BABL/c constituyen un buen
modelo para estudiar la leishmaniosis, pues presentan grandes
similitudes con los humanos en cuanto al progreso de la infección y
al desarrollo de las lesiones. De hecho, parece ser que la reacción
inmunológica que presentan estos animales a esta infección es igual
a la de los hombres, y probablemente también a la de los perros
(Cox, Int. J. Parasitol. 263: 1147-1157). Los
antígenos utilizados fueron los siguientes: gp 63 (Scott y col., J.
Exp Med.168: 1675-1684), gp 46
(McMahon-Pratt y col., Infection and Immunity 61:
3351-3359), p-4 y
p-8 (Scott y col., Immunology 99:
615-624), así como p36, también conocido como
antígeno LACK (Gonzales-Aseguinolaza y col., Eur. J.
Biochem. 259: 909-916). LACK es un antígeno de
Leishmania de 36 kDa que está muy bien conservado y se
encuentra en todas las especies de Leishmania emparentadas.
Ésta se expresa en promastigotas y amastigotas parasitarios, que son
los dos estadios del ciclo parasitario que se desarrollan en el
huésped. En los modelos de ratones se ha podido demostrar que la
estimulación de una respuesta inmune citotóxica tipo Th1 al
interferón gamma y a la secreción de IL-12 por parte
de los linfocitos T auxiliares ayuda a superar una infección
ensayada, mientras que la estimulación de una respuesta tipo Th2
relacionada con la producción de IL-4 por parte de
esos mismos linfocitos favorece el desarrollo de dicha infección.
Para fomentar el desplazamiento de la respuesta inmune en la
dirección Th1, Gonzalo y col. utilizaron virus de vacuna como
vectores e IL-2 como adyuvante. Como agente
inmunógeno se utilizó el antígeno p36/LACK. Además, se crearon
diferentes regímenes de vacunación. El que tuvo más éxito,
consistente en una primera inmunización con proteína p36 y una
segunda estimulación con virus de vacuna recombinante, que codifica
p36 e IL-12, logró una reducción media de las
lesiones de un 52% en comparación con los ratones que no habían
recibido vacuna. La mayor protección frente a la infección la
presentaron los animales que tenían la titulación de anticuerpos
IgG2a más alta (Gonzalo y col. Microbes and Infection: 3 (9):
701-711).
Para infiltrar el ADN que codifica los antígenos
inmunógenos o partes del mismo se utilizan en la actualidad diversos
métodos de transfección química, física o biológica.
Entre los medios biológicos de transfección,
conocidos genéricamente bajo el nombre de vectores, cabe citar los
vectores víricos, los plásmidos o los constructos de ADN
minimalistas cerrados covalentes, que en adelante recibirán el
nombre de MIDGE (del inglés Minimalistic
Immunologically Defined Gene Expression
Vectors, vectores de expresión genética minimalistas definidos
inmunológicamente, véase EP 0 914 318 B1).
Los plásmidos se obtienen a partir de la
fermentación bacteriana. Además del gen deseado, contienen también
el ADN necesario para su clonación y selección, que por lo general
da lugar a los genes de resistencia a los antibióticos que se
utilizan durante la fermentación. Sin embargo, este ADN bacteriano
presenta el inconveniente de que puede contener secuencias
inmunoestimulatorias (ISS, por sus siglas en inglés, por ejemplo un
dinucleótido citosina-guanina (CpG) no metilada).
Éste es precisamente uno de los efectos que desea evitarse en la
inmunosupresión (esto se describe con todo detalle en el documento
DE 199 35 756). Además, si se utilizan constructos de expresión
genética basados en ADN de plásmidos, existe también el riesgo
inherente de que se produzca una propagación de genes de resistencia
a los antibióticos, lo que sin duda es inaceptable, sobre todo en
las campañas de vacunación. Por este motivo, el método de vacunación
propuesto por Gurunathan y col. (J. Exp. Med., Vol 186, No. 7,
(1997): 1137-1147), consistente en la utilización de
vectores de expresión eucarióticos que contienen el antígeno
p36/LACK específico de Leishmania, presenta múltiples
desventajas. En la práctica médica, los inconvenientes descritos que
presenta el uso de los vectores de expresión basados en plásmidos se
oponen considerablemente a la ampliación de su aplicación.
Los vectores que se utilizan con más frecuencia
por su alta eficacia en la transfección son los vectores víricos. No
obstante, los riesgos para la seguridad relacionados con su empleo
se oponen considerablemente a la ampliación de su aplicación. Se
sabe que existe un alto riesgo de que el organismo huésped presente
una reacción citotóxica a las células transfectadas. Por ejemplo, la
administración de una alta dosis de un adenovirus provocó la muerte
de un paciente en uno de los ensayos realizados que, al parecer,
tuvo su causa en una fuerte sobrerreacción del sistema inmunitario
(Lehrman, 1999, Nature 401: 517-518). Por otro lado,
dada la inestabilidad de la cepa atenuada de la vacuna, existen
altas probabilidades de que ésta mute y se convierta en una cepa
virulenta. Además, los propios componentes víricos pueden actuar
como inmunógenos, lo que reduciría su eficacia en el sistema
inmunitario del paciente.
A pesar de estos inconvenientes, todos ellos
determinados por los métodos de transferencia genética que se han
utilizado hasta la fecha, los investigadores aún no han sido capaces
de desarrollar una vacuna segura y eficaz contra la
leishmaniosis.
El objetivo de la presente invención es, pues,
proporcionar un método que permita desarrollar una vacuna segura,
eficaz y protectora contra la leishmaniosis.
Este objetivo se consigue mediante las
características que se mencionan en cada una de las
reivindicaciones.
La presente invención consiste en proporcionar un
constructo de expresión de ADN para la inmunización frente a
infecciones de leishmaniosis, caracterizado porque las secuencias de
polinucleótidos que confieren la inmunización son constructos de
expresión constituidos por moléculas lineales de ácido
desoxirribonucleico cerradas covalentes que presentan una zona
bicatenaria lineal, en donde las hebras individuales que forman el
emparejamiento bicatenario están unidas mediante cortos lazos
monocatenarios de nucleótidos de ácido desoxirribonucleico, y en
donde dichas hebras constan sólo de la secuencia codificadora que
está bajo el control de un promotor que se pone en funcionamiento en
el animal al que se va a vacunar y de una secuencia terminadora y,
además, están enlazadas con uno o más péptidos para reforzar la
eficacia de la transfección (véase EP 0 941 318 B1). Un constructo
de expresión de ADN de este tipo muestra efectos realmente
sorprendentes (véase más abajo) que no pueden conseguirse con otros
métodos (como los protocolos de vacunación citados); en particular,
en la vacunación ya no se producen los inconvenientes que hemos
descrito al hablar de los vectores de expresión eucarióticos.
Según la invención, se prevé, en particular, el
uso del antígeno inmunógeno p36 LACK para crear una respuesta
inmune. Como vector se utiliza un casete de expresión lineal
bicatenario cerrado covalente, que consta de la secuencia
codificadora, el promotor y, en su caso, las secuencias
terminadoras, de manera que el constructo sólo contiene la
información necesaria para la expresión del gen deseado (véase EP 0
941 318 B1). Según la invención se prevé también que, para aumentar
la eficacia de la transfección, el constructo de expresión de ADN se
una de forma covalente a un oligopéptido, que preferentemente tendrá
una longitud comprendida entre 5 y 25 aminoácidos, de los que al
menos la mitad deberán pertenecer a los grupos lisina o arginina.
Especialmente preferente es una secuencia de localización nuclear,
en particular:
- \bullet
- la secuencia de péptidos PKKKRKV (prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina = Seq ID 3) del virus del simio SV-40 (Papovavirus), que es una señal de localización nuclear (NLS, Nuclear Localization Signal). Especialmente en la NLS del SV-40 se demostró que las proteínas de hasta 465 kDa son dirigidas hacia el núcleo celular (Lanford y col. 1986, Cell 15; 46 (4): 575-82). Esta capacidad de los péptidos se aprovechó aquí enlazando al ADN para mejorar la transferencia genética.
- \bullet
- o el fragmento de péptido T que contiene once aminoácidos de longitud (YGRKKRRQRRR = Seq ID 2) del VIH-1, producto genético TAT.
En el resto de reivindicaciones secundarias se
citan otras medidas ventajosas. A continuación se describirá y
comentará la invención con más detalle a partir de ejemplos de
realización y figuras.
El sorprendente efecto del constructo de
expresión de ADN según la invención y de un medicamento que contenga
dicho constructo se demostrará a partir de las representaciones de
las figuras. A este respecto, se han utilizado las siguientes
abreviaturas:
- pMOK p36
- Plásmido que codifica el antígeno p36
- Mp36-NLS
- Enlace entre MIDGE que codifica p36 y péptido NLS
- pMOK ctr
- Plásmido de control que codifica HBsAg
- rVVp36
- Virus de vacuna recombinante que codifica p36
- Fosfato
- Tampón de fosfato como control
- Control +
- Control positivo, con sueros de ratones infectados con Leishmania major
- Control -
- Control negativo, ratones en los que no se ha alterado el suero
Las figuras tienen el siguiente significado:
Fig. 1: Determinación de la titulación IgG total
antes de la infección inoculada con promastigotas de Leishmania
major. Sólo los regímenes de vacunación que incluyen una segunda
inmunización con virus de vacuna recombinante muestran una
titulación de anticuerpos medible.
Fig. 2: Determinación de la titulación IgG total
después de inocular la infección. Todos los protocolos de vacunación
muestran una respuesta a los anticuerpos medible, en donde la
titulación más alta se produce en los anticuerpos circulantes del
enlace MIDGE p36-NLS / MIDGE
p36-NLS.
Fig. 3: Relación entre los isotipos de
anticuerpos IgG 2a e IgG 1 después de la segunda inmunización e
infección inoculada con promastigotas de Leishmania major.
Sorprendentemente los MIDGE enlazados con el péptido NLS
desencadenan una respuesta inmune citotóxica (Th1) después de la
distribución de los isotipos de los anticuerpos que apenas se
diferencia de la que se desencadena con el régimen
pMOKp36/rVVp36.
Fig.4: Desarrollo de las lesiones durante las 8
semanas siguientes a la inoculación de la infección. En este caso,
los protocolos de vacunación basados en los enlaces MIDGE
p36-NLS/MIDGE p36-NLS y pMOK
p36/rVVp36 proporcionan la protección más duradera frente a una
infección por Leishmania major. Esta acción protectora se
refleja en un retraso considerable en el desarrollo de las lesiones.
No obstante, la protección más eficaz y duradera se produce con el
enlace MIDGE p36-NLS/MIDGE
p36-NLS.
Fig. 5: Tamaño de las lesiones después de la
octava semana. A las ocho semanas de la inoculación de la infección,
el tamaño de las lesiones de los animales a los que se les ha
vacunado con el enlace MIDGE p36-NLS/MIDGE
p36-NLS es un 80% más pequeño que el del grupo
control, que no ha recibido ninguna vacuna. Incluso se observó un
aumento del 11 por ciento en la protección frente a Leishmania
major en comparación con el grupo al que se había vacunado con
pMOK p36/rVVp36.
En particular:
Se investigó si la modificación de los casetes de
expresión minimalista con péptidos podía modificar la intensidad u
orientación de la respuesta inmune. Para aumentar la eficacia de la
transfección se intentó enlazar de forma covalente varios péptidos y
otras moléculas orgánicas con los MIDGE.
Así, se ha demostrado que el enlace covalente de
la señal de localización nuclear del virus SV-40 con
MIDGE codificador de HbsAg puede conseguir una titulación de
anticuerpos 10 o 15 veces superior después de su administración
intramuscular (Schirmbeck y col., J. Mol Med. 2001 Jun.79
(5-6): 343-50).
En un ensayo de vacunación en ratones se probaron
diversos constructos de expresión genética que codificaban el
antígeno p36 LACK. Aquí se utilizaron MIDGE enlazados con péptido
NLS (MIDGE p36-NLS), plásmido (pMOKp36) y virus de
vacuna recombinante (rVVp36). Para conseguir una protección inmune
lo más alta posible, se formularon varios regímenes de vacunación.
Como parámetro relevante para el éxito clínico de la vacunación se
midió el crecimiento de las lesiones causadas por la infección que
se inoculó en la pata trasera del animal. Como parámetro alternativo
se determinó la relación entre los anticuerpos subtipo IgG1 e IgG2.
En general, puede afirmarse que una relación desplazada hacia el
subtipo IgG2 suele encontrarse asociada a una mayor protección
frente a la infección o a una ralentización considerable en el
crecimiento de las lesiones. Además de analizar el método conocido
por el estado de la técnica, consistente en una primera inmunización
con plásmido y una segunda inmunización con virus de vacuna
recombinante (rVV), también se pretendía comprobar si se podía
conseguir una protección inmune similar con el medicamento según la
invención.
La titulación total de anticuerpos IgG como
medida de la estimulación de una respuesta inmune se determinó
mediante el método ELISA. Antes de la infección inoculada con
promastigotas de Leishmania major, sólo dos de los regímenes
de vacunación lograron crear anticuerpos medibles (véase Fig. 1). En
ambos casos se utilizaron virus de vacuna recombinantes como segunda
inmunización (revacunación). Algunos estudios demuestran que la
presencia de anticuerpos circulantes no tiene nada que ver en su
supuesta acción protectora. Es decir, la relación entre los
anticuerpos circulantes y la protección frente a la infección no se
observa hasta después de la inoculación de la infección. En la
Figura 2 pueden observarse las titulaciones de anticuerpos que
existían después de la inocular la infección con Leishmania
major. Todos los regímenes de vacunación muestran una titulación
de anticuerpos medible, en donde la más alta se produce con los
enlaces MIDGE p36-NLS/MIDGE
p36-NLS.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron los isotipos de los anticuerpos
IgG1 e IgG2a para intentar demostrar un posible cambio Th2/Th1 en la
respuesta inmune. La distribución de isotipos de inmunoglobulina
gamma (IgG) para un antígeno concreto refleja el desarrollo de la
respuesta inmune total frente a este antígeno. A este respecto los
subtipos IgG-1 son característicos de una respuesta
humoral, que está acompañada de una mayor producción de las
interleuquinas IL-4 e IL-10 por
parte de los linfocitos activados, mientras que un aumento en el
nivel del subtipo IgG2a es típico de una respuesta celular Th1, que
está acompañada por un aumento en la producción de IFN\gamma e
IL-12. Así pues, la aparición de los isotipos no es
exclusiva, pero las titulaciones relativas pueden considerarse un
indicador del tipo de respuesta inmune dominante que ha surgido.
Según la Figura 3, los vectores MIDGE enlazados
con péptido NLS son capaces de estimular una respuesta inmune
celular (Th1). Como puede observarse, la "rama celular" de la
respuesta inmune resulta decisiva a la hora de combatir los
parásitos intracelulares. El desplazamiento hacia la respuesta Th1
(desde la Th2) que provoca el enlace MIDGE p36-NLS
apenas se diferencia del que se consigue con el enlace
pMOKp36/rVVp36.
Para evaluar la acción protectora conseguida se
provocó una infección con promastigotas de Leishmania. El
éxito de la vacunación se valoró a partir del crecimiento de las
lesiones en función del tiempo (expresado en semanas). En este caso
se demostró que los ratones tratados con MIDGE
p36-NLS/MIDGE p36-NLS presentaban
las lesiones de menor diámetro, lo que significa que el uso del
enlace MIDGE p36-NLS en el régimen de vacunación
MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS genera
la inmunidad por vacunación más duradera (véase Figuras 4 y 5).
Los resultados son realmente sorprendentes,
puesto que el medicamento según la invención supera en su potencial
de acción a la segunda inmunización (revacunación) con virus de
vacuna recombinante que, según el estado de la técnica, es el
"mejor" régimen de vacunación existente hasta el momento;
además, reduce en gran medida los posibles efectos secundarios que
pueden provocar los plásmidos y los virus atenuados (Gonzalo y col.,
Microbes and Infection: 3 (9):701-711). Al mismo
tiempo, el medicamento según la invención es también equivalente o
mejor en lo que se refiere a su acción protectora. La ausencia de
los efectos secundarios causados por los plásmidos y los virus
recombinantes es la ventaja decisiva del medicamento según la
invención; además, su fabricación es más sencilla y menos costosa y
el método según la invención es esencialmente más seguro.
Se amplificaron dos fragmentos del plásmido de
partida PSCp36 mediante la técnica PCR.
1^{er} PCR aprox. de 800 pb;
Primera
fase
- izquierdo 5'-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT (= Seq ID 6),
Primera
fase
- derecha 5'-TATATGAGCTCAGAAGACACGGACAGGGACCTCTTCCGTCG (= Seq ID 7)
2º PCR aprox. de 950 pb;
Primera
fase
- izquierdo 5'-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT (= Seq ID 8),
Primera
fase
- derecha 5'-TTATATGAGCTCTTACTCGGCCGTCGGAGATGG (= Seq ID 9)
El producto PCR de la 2ª PCR se cortó con Eco31I
y después se aisló el fragmento más pequeño (aprox. 200 pb).
El producto PCR de la 1ª PCR se cortó con
Bpil.
Se ligó el fragmento de 200 pb con el fragmento
cortado de la primera PCR y, a continuación, se cortaron ambos con
KpnI y SacI y se ligaron en el vector pMOK cortado con KpnI y SacI.
Al plásmido surgido se le dio el nombre de pMOKp36 (= Seq ID 1).
El enlace NLS se realizó tal como se indica a
continuación: el péptido NLS con la secuencia PKKKRKV se enlazó con
los oligodesoxinucleótidos (ODN) en dos pasos. En primer lugar, el
oligonucleótido modificado
5'-PH-dGGG AGT CCA GT xT TTC TGG AC
(donde xT representa la base de timina aminomodificada con el
enlazante amino C_{2} = ODN 1 = Seq ID 4) (0,1mM) se activó con
sulfo-KMUS (5mM) en una solución salina fosfatada
(PBS) a temperatura ambiente. Transcurridos 120 min se detuvo la
reacción con 50 mM de tris(hidroximetil)aminometano y
se obtuvo el ODN después de precipitación con etanol (300mM NaOAc pH
5,2, 5,5mM MgCl_{2}, 70% etanol), centrifugación y lavado con
etanol al 70%. El ODN así obtenido (0,1 mM) se disolvió en PBS y se
hizo reaccionar con el péptido (0,2 mM) durante una hora a
temperatura ambiente. La reacción se comprobó mediante
electroforesis en gel (3%) y tinte de bromuro de etidio. El ODN
enlazado con NLS obtenido se limpió mediante la técnica HPLC y se
utilizó para la síntesis de los constructos MIDGE
p36-NLS.
Los MIDGE son casetes de expresión lineales
cerrados covalentes que constan únicamente del promotor CMV, un
intrón, la secuencia genética correspondiente y una secuencia de
poliadenilación (véase EP 0 941 318 B1). Los constructos se
obtuvieron tal como se indica a continuación: el plásmido descrito
en el Ejemplo 1.1 (pMOKp36) se metabolizó por completo con Eco 31I.
El enlace con 5'-oligodesoxinucleótidos (ODN)
fosforilados en forma de horquilla
5'-PH-GGG AGT CCA GT XT TTC TGG AC
(= ODN 1 = Seq ID 4) y 5'-AGG GGT CCA GTT TTC TGG
AC-3' (= ODN 2 = Seq ID 5) mediante
ADN-ligasa del fago T4 (T4
ADN-ligasa) en presencia de Eco 31I se detuvo
mediante calentamiento a 70ºC. La mezcla resultante se concentró y
se trató con Eco 31I y T7 ADN-ligasa en ausencia de
desoxirribonucleótidos trifosfatos. Después, se limpió mediante la
técnica de cromatografía por intercambio aniónico.
Se inyectó a ratones hembra (Balb/c) MIDGE
p36-NLS, pMOKp36 y virus de vacuna recombinante p36
(rVV) según el siguiente régimen de vacunación:
| Grupos | Primera inmunización: | Segunda inmunización (revac.) |
| 1 | pMOKp36 | pMOKp36 |
| 2 | MIDGE p36-NLS | MIDGE p36-NLS |
| 3 | Control pMOK | Control pMOK |
| 4 | pMOKp36 | rVVp36 |
| 5 | MIDGE p36-NLS | rVVp36 |
| 7 | Tampón fosfato | Tampón fosfato |
| En cada grupo se incluyó a 10 ratones. |
Las cantidades de ADN empleado fueron las
siguientes:
- pMOKp36: 100 \mug, i.d.
- MIDGE p36-NLS: 54,8 \mug, i.d.
- rVV p36: 5x107 pfu/ratón, i.p.
que se inyectaron disueltas en
tampón fosfato de sodio a pH
7,2.
Después de 2 semanas se administró la segunda
inmunización (revacunación) con los constructos de ADN
correspondientes (véase Tabla 1). Tres semanas después de la
revacunación se provocó una infección con 5\cdot10^{4}
promastigotas de Leishmania major, que se inyectaron en la
pata trasera derecha de los ratones por vía subcutánea. Acto seguido
se hizo un seguimiento semanal del curso de la infección. El tamaño
de las lesiones se midió con un pie de rey electrónico, que comparó
el estado de la pata afectada con el de la pata izquierda, que no
había recibido ningún tipo de tratamiento.
Ocho semanas después de inocular la infección se
tomó una muestra de suero de todos los ratones. La titulación total
de anticuerpos IgG frente al antígeno p36 y los anticuerpos IgG2a e
IgG1 se midieron mediante la técnica ELISA, que midió la absorción
en densidad óptica a una longitud de onda \lambda = 406 nm.
<110> Mologen Forschungs-, Entwicklungs-
and Vertriebs GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> DNA-EXPRESSION
CONSTRUCT FOR TREATMENT OF INFECTIONS WITH LEISHMANIASIS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> XI 1396/02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/ DE 02/ 03799
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-10-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 101 48 732.0
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-10-02
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 101 56 679.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-11-12
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 4791
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<212> DNA
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<213> artificial sequence
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<220>
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<223> Plasmid pSCp36
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1939)..(1045)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Kanamycin resistance, reverse
complementary
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> promoter
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<222> (2447)..(3243)
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<223> CMV
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
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<222> (3250)..(3386)
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<223>
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3393)..(4331)
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<223> p36 protein
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> polyA_site
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4338)..(4539)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> poly A site aus SV 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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<210> 2
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<211> 11
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Human immunodeficiency virus type
1
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
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<223> TAT peptide
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg
Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Simian virus 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<223> NLS peptide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ODN 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> modified_base
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)..(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> xT = Thymin modified with a reactive
amino group
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggagtccag ttttctggac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ODN 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggggtccag ttttctggac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1. PCR: Primer left
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatatggta ccatgaacat acgagggtca cct
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1. PCR: Primer right
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatatgagc tcagaagaca cggacaggga cctcttccgt cg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2. PCR: Primer left
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatatggta ccatgaacat acgagggtca cct
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 33
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial sequence
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2. PCR: Primer right
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<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatatgagc tcttactcgg ccgtcggaga tgg
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (5)
1. Constructo de expresión de ADN para la
inmunización frente a infecciones por leishmaniosis,
caracterizado porque las secuencias de polinucleótidos que
confieren la inmunización son constructos de expresión constituidos
por moléculas lineales de ácido desoxirribonucleico cerradas
covalentes que presentan una zona bicatenaria lineal, en donde las
hebras individuales que forman el emparejamiento bicatenario están
unidas mediante cortos lazos monocatenarios de nucleótidos de ácido
desoxirribonucleico, en donde dichas hebras constan sólo de la
secuencia codificadora que codifica al menos el antígeno p36 LACK
bajo el control de un promotor que se pone en funcionamiento en el
animal al que se va a vacunar y de una secuencia terminadora, y en
donde el constructo de expresión de ADN está unido de forma
covalente con uno o más oligopéptidos para aumentar la eficacia de
la transfección y el oligopéptido consta de un número de aminoácidos
que oscila entre 3 y 30, de los que al menos la mitad son
aminoácidos básicos del grupo formado por arginina o lisina.
2. Constructo de expresión de ADN según la
reivindicación 1, caracterizado porque el constructo de
expresión codifica uno o más antígenos de Leishmania.
3. Constructo de expresión de ADN según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el oligopéptido
presenta la secuencia de aminoácidos PKKKRKV
(prolina-lisina-lisina-lisina-arginina-lisina-valina).
4. Utilización del constructo de expresión de ADN
según una o más de las reivindicaciones anteriores 1 a 3 para crear
una vacuna que sirva para tratar enfermedades debidas a infecciones
por leishmaniosis.
5. Vacuna para el tratamiento de enfermedades
debidas a infecciones por leishmaniosis, que contiene el constructo
de expresión de ADN según las reivindicaciones 1 a 4.
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