CZ304884B6 - Kompozice pro vyvolání zesílené imunitní odpovědi proti peptidovému nebo proteinovému antigenu u savce a její použití pro výrobu vakcíny - Google Patents
Kompozice pro vyvolání zesílené imunitní odpovědi proti peptidovému nebo proteinovému antigenu u savce a její použití pro výrobu vakcíny Download PDFInfo
- Publication number
- CZ304884B6 CZ304884B6 CZ2002-182A CZ2002182A CZ304884B6 CZ 304884 B6 CZ304884 B6 CZ 304884B6 CZ 2002182 A CZ2002182 A CZ 2002182A CZ 304884 B6 CZ304884 B6 CZ 304884B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antigen
- fusion protein
- adjuvant
- protein
- heavy chain
- Prior art date
Links
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 189
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 187
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims abstract description 75
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims abstract description 27
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 267
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 228
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 228
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 182
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 35
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 47
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 47
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 43
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 43
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 24
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 23
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 21
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 16
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 16
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 claims description 15
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 claims description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 15
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 12
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 claims description 6
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 6
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 claims description 4
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 claims description 4
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 3
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 2
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims 2
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 claims 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 claims 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 claims 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 114
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 102
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 16
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 abstract description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 101
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 84
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 80
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 55
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 46
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 45
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 45
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 39
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 38
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 34
- 230000004044 response Effects 0.000 description 34
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 32
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 30
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 29
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 29
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 24
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 24
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 22
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 22
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 21
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 21
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 description 19
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 18
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 18
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 18
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 17
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 15
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 15
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 15
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 12
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 101000883798 Homo sapiens Probable ATP-dependent RNA helicase DDX53 Proteins 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 11
- 102100038236 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX53 Human genes 0.000 description 11
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 11
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 10
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 10
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 9
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 7
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 5
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 230000023445 activated T cell autonomous cell death Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- -1 for example Proteins 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 101000916489 Homo sapiens Chondroitin sulfate proteoglycan 4 Proteins 0.000 description 3
- 101000829725 Homo sapiens Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 101001056234 Homo sapiens Sperm mitochondrial-associated cysteine-rich protein Proteins 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 102100023410 Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase Human genes 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- JFINOWIINSTUNY-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-3-ylmethanesulfonamide Chemical compound NS(=O)(=O)CC1CCNC1 JFINOWIINSTUNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 238000010600 3H thymidine incorporation assay Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010063916 CD40 Antigens Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000920667 Homo sapiens Epithelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 2
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 2
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000046689 human FOLH1 Human genes 0.000 description 2
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 108040006852 interleukin-4 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 2
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 102100036486 Cobalamin binding intrinsic factor Human genes 0.000 description 1
- 101710123904 Cobalamin binding intrinsic factor Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102100025012 Dipeptidyl peptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000908391 Homo sapiens Dipeptidyl peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000010787 Interleukin-4 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038486 Interleukin-4 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000932479 Mus musculus Fms-related tyrosine kinase 3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 101001040747 Mus musculus Guanine nucleotide-binding protein-like 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001043827 Mus musculus Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102100037765 Periostin Human genes 0.000 description 1
- 101710199268 Periostin Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 101710091872 Putative fusion protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710102802 Runt-related transcription factor 2 Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004241 Th2 cell Anatomy 0.000 description 1
- 101710090322 Truncated surface protein Proteins 0.000 description 1
- 101100537665 Trypanosoma cruzi TOR gene Proteins 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 101150015940 gL gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 102000045551 human EPCAM Human genes 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 102000027411 intracellular receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008582 intracellular receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 210000003956 transport vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000004260 weight control Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K2039/55527—Interleukins
- A61K2039/55533—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6056—Antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
- Y10S930/141—Interleukin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Kompozice pro vyvolání zesílené imunitní odpovědi proti peptidovému nebo proteinovému antigenu u savce, která zahrnuje i) fúzní protein postrádající variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu a zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojenou polypeptidovou vazbou k antigenu a ii) fúzní protein postrádající variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu a zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojenou polypeptidovou vazbou k adjuvantnímu proteinu, přičemž konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu pocházejí ze stejného druhu a jsou schopny se vázat k Fc receptoru. Použití této kompozice pro výrobu vakcíny vyvolávající zesílenou imunitní odpověď u savce proti předem zvolenému antigenu použitému ve formě antigenového fúzního proteinu této kompozice.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká kompozice pro vyvolání zesílené imunitní odpovědi proti peptidovému nebo proteinovému antigenu u savce a jejího použití pro výrobu vakcíny. Konkrétně se vynález týká způsobů a přípravků obsahujících kódující nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence definující fúzní proteiny obsahující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu a preselektovaný antigen, přičemž preselektovaný antigen ve fúzním proteinu je schopen u savce vyvolat silnější imunitní reakci ve srovnání s preselektovaným antigenem samotným.
Dosavadní stav techniky
Vývoj vakcín je tradičně zaměřen na vytváření protektivních protilátek schopných neutralizovat infekční agens. Až doposud agens používaná jako vakcíny typicky obsahovala inaktivované nebo oslabené mikroorganizmy (například bakterie nebo viry), jejich produkty (například toxiny) nebo purifikované antigeny. S nástupem moderní molekulární biologie a metod klonování genů je možné vyrobit čistší a mnohem specifičtější vakcíny. Kromě toho znalost imunitního systému na molekulární úrovni umožnila izolaci a charakterizaci imunitních reakcí stimulovaných infekčními agens. Dvě složky imunitního systému, o kterých se předpokládá, že jsou ústřední pro úspěšnou tvorbu imunitních reakcí, zahrnují: hlavní úlohu regulačních a cytotoxických T lymfocytů a způsob, kterým je těmto buňkám prezentován antigen buňkami prezentujícími antigen (antigen presenting cell - APC). (Viz například W. E. Paul, vyd. (1993) Fundamentals Of Immunology, Raven Press, Ltd., New York).
Typicky je antigenní protein nebo peptid přijatý z vnějšku APC (exogenní antigen) degradován v endocytámím vezikulu nebo endozomu APC, načež výsledné peptidové fragmenty tvoří komplex s proteiny hlavního histokompatibilního systému (MHC) II. třídy. Výsledný komplex se přesune na buněčný povrch, kde je vystaven imunitním buňkám obklopujícím APC. Peptidový fragment je přizpůsoben prostoru definovaném MHC molekulou a komplex může být rozpoznáván T lymfocytem exprimujícím receptor lymfocytů T, který má pro komplex vazebnou specificitu. Interakce mezi molekulou MHC II. třídy opatřenou peptidem a pomocným T lymfocytem, nazývaným v oboru T lymfocytem CD4, je dále stabilizovány další interakcí mezi molekulou MHC II. třídy samotnou a CD4+ receptorem na povrchu T lymfocytů. Tedy exogenní antigen, který je zpracován v APC buňkách, je předložen na buněčném povrchu prostřednictvím molekul MHC II. třídy. Komplex MHC II. třídy, když je prezentován CD4+ T lymfocytům, vede k tomu, že CD4+ pomocné lymfocyty sekretují cytokiny, které stimulují B lymfocyty k tvorbě protilátek proti peptidů. (viz Paul, výše).
Vakcinace exogenním antigenem má typicky za následek CD4 lymfocyty zprostředkovanou T lymfocytámí reakci, která obecně končí produkci protilátky. Cytotoxické T lymfocyty (CTL) nejsou touto dráhou typicky stimulovány. CTL jsou zjevně stimulovány v situacích, kdy antigen vzniká zvnitřku APC samotné (endogenní antigen), například prostřednictvím produkce virových proteinů v buňce infikované virem nebo proteinů specifických pro nádory v karcinomových buňkách. Ve skutečnosti se u mnoha virových onemocnění věří, že vytvoření CTL je rozhodující pro eliminaci buněk infikovaných virem, a tedy zotavení z infekce.
Studie ukazují, že endogenní a exogenní antigenyjsou zpracovány odlišně. Během syntézy vznikajících polypeptidů je část polypeptidu degradována intracelulámí strukturou nazývanou proteozom. Fragmenty z tohoto procesu tvoří komplex s nově syntetizovanými molekulami MHC I. třídy spíše než MHC II. třídy, načež výsledné komplexy MHC I. třídy obsahující antigen jsou transportovány na buněčný povrch. Opět T lymfocyty se specificitou pro specifický peptidový
-1 CZ 304884 B6 fragment vážou T lymfocyty, ale v tomto případě nezbytná interakce koreceptorů nastává mezi molekulou MHC 1. třídy a CD8 molekulou. V souladu s tím je endogenní antigen na povrchu APC prezentován CD8+ T lymfocytům. Ačkoliv existují některé typy CD8+ T lymfocytů, které nejsou cytotoxické, CD8+ T lymfocyty tvoří většinu CTL.
Proto se zdá, že návrh/konstrukce vakcíny schopné indukovat silnou CTL reakci vyžaduje, aby antigenní molekula (obecně protein) byla buď vytvořena uvnitř buňky nebo dopravena do vhodného buněčného kompartmentu, aby mohla vstoupit do dráhy MHC I. třídy. Jedna strategie je zavést gen kódující požadovaný protein nebo peptid do viru, a pak použít modifikovaný virus jako vakcínu (Lorenz et al. (1999) HUM. GENE THER. 10:623-631). Další strategií je injikovat DNA vektor kódující protein do buňky, a pak podávat buňku zvířeti nebo pacientovi, kde je exprimována buňkou, a je pak předložena na buněčném povrchu prostřednictvím molekul MHC I. třídy (Donnelly et al. (1997) ANNU. REV. IMMUNOL. 15:617). Bylo ukázáno, že jednodušší technika injikování DNA vektorů přímo do svalu nebo kůže indukuje CTL a/nebo protilátkovou reakci na několik antigenů (Lai et al. (1988) CRIT. REV. IMMUNOL. 18: 449-84 a patent Spojených Států US 5 589 466). Studie ukázaly, že antigen je zabrán a zpracován APC, kde je prezentován imunitním systému (Lai et al., výše).
Aplikace exogenních peptidů nebo proteinů dráze MHC I. třídy byla částečně úspěšná díky použití chemických adjuvancií, jako je například Freundovo adjuvans a směsi skvalenů a detergentů (Hilgers et al. (1999) VACCINE, 17: 219-228) a nověji díky použití malých perliček potažených antigenem, které jsou fagocytovány makrofágy a indukují CTL reakce prostřednictvím alternativní dráhy MHC I. třídy (De Bruijn et al. (1995) EUR. J. IMMUNOL. 25: 1274-1285). Kromě toho další metody pro zesílení imunitní reakce na antigen mohou obsahovat použití chemických adjuvancí v kombinaci s rekombinantními imunostimulačními cytokiny, například IL-2, IL-12, GM-CSF a dalšími. Například jeden způsob používá anti-haptenovou protilátku fúzovanou k IL2 jako způsob spojení tohoto cytokinu k antigennímu proteinu, který chemicky reagoval s haptenem (Harvill et al. (1996) J. IMMUNOL. 157:3165).
Další technika využívá protilátkovou „antigenizaci“, pomocí níž je část variabilního úseku imunoglobulinu nahrazena antigenním peptidem. Antigenní peptid hybridní molekuly je prezentován APC, jakmile se rekombinantní protilátka váže na APC prostřednictvím interakce s Fc receptory na povrchu APC (Lama et al. (1993) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 90: 11 683-11 687). Rozšíření tohoto přístupu používá injekci plazmidové DNA kódující „antigenizovaný“ těžký řetězec imunoglobulinu do sleziny. Jakmile je poskytnut partnerský lehký řetězec imunoglobulinu, začnou B lymfocyty pocházející ze sleziny sekretovat rekombinantní protilátku.
Imunogenicita aplikačního systému pro antigen je ale jeden z hlavních technických překážek v rozvoji moderních vakcín. Cílem vakcinace je vyvolat silnou imunitní reakci. Ale protože hostitelský imunitní systém je vyvinut kboji proti bakteriím a virům, když jsou bakterie nebo viry použity jako vektory, je posel/vektor typicky zničen spolu se zprávou. Kromě toho silné imunitní reakce na určité virové vektory, například vakcinii a adenovirus, omezují jejich použitelnost a předpokládá se, že podobné problémy mohou povstat v průběhu použití bakteriálních toxinů jako proteinových vektorů. Podobně „proteinové vektory“ založené na protilátce používající variabilní úseky, které díky své vlastní povaze, nejsou považovány za vlastní („šelf“) imunitním systémem, jsou potenciálně imunogenní. Předpokládá se, že mnohonásobné použití těchto nosičských molekul může indukovat anti-idiotypové reakce, a tím předem vyloučit jejich účinné použití. V souladu s tím je předmětem předkládaného vynálezu poskytnout vakcínu, která vytvoří silnou a dlouhodobou imunitu proti preselektovanému antigennímu proteinu nebo peptidů.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu v hlavním provedení i) je kompozice pro vyvolání zesílené imunitní odpovědi proti peptidovému nebo proteinovému antigenů u savce, která zahrnuje
-2CZ 304884 B6
a) fúzní protein postrádající variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu a zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojenou polypeptidovou vazbou k antigenů a
b) fúzní protein postrádající variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu a zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojenou polypeptidovou vazbou k adjuvantnímu proteinu, přičemž konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu pocházejí ze stejného druhu a jsou schopny se vázat k Fc receptorů.
Přednostní provedení tohoto aspektu vynálezu zahrnují zejména ii) kompozici podle provedení i), která zahrnuje sekvence konstantní těžké oblasti lidského imunoglobulinu;
iii) kompozici podle provedení i) nebo ii), kde adjuvantem je cytokin;
iv) kompozici podle provedení iii), v níž je cytokin zvolen ze souboru sestávajícího z IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, TNF a GMCSF;
v) kompozici podle provedení iv), ve které je cytokinem GMCSF;
vi) kompozici podle kteréhokoliv z provedení i) až v), ve které je antigen zvolen ze souboru sestávajícího z membránového antigenů specifického pro prostatu PSMA, ektodomény cytokinového receptorů, virového proteinu a antigenů specifického pro rakovinu;
vii) kompozici podle kteréhokoliv z provedení i) až vi), ve které každá konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu fúzního proteinu obsahuje pantovou oblast;
viii) kompozici podle kteréhokoliv z provedení i) až vii), ve které každá konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu fúzního proteinu obsahuje CH2 a CH3 doménu;
ix) kompozici podle kteréhokoliv z provedení i) až viii), ve které je imunoglobulinovou částí každého fúzního proteinu Fc.
Předmětem vynálezu je dále také (provedení vynálezu x)) použití kompozice podle kteréhokoliv z provedení i) až ix) pro výrobu vakcíny vyvolávající zesílenou imunitní odpověď u savce proti předem zvolenému antigenů použitému ve formě antigenového fúzního proteinu této kompozice.
Při tomto použití je v provedení xi) imunitní odpověď silnější než když se podá antigenový fúzní protein bez adjuvantního fúzního proteinu této kompozice.
V provedeních vynálezu x) až xi) se fúzní proteiny přednostně podávají současně (provedení vynálezu xii)).
V dalším popisu je vynález příležitostně objasňován v širším kontextu, než odpovídá rozsahu, který je skutečně předmětem tohoto vynálezu. Výslovně se proto uvádí, že do rozsahu vynálezu spadají jen provedení i) až xii) explicitně uvedená výše, a jen ta jsou také předmětem připojených patentových nároků. Následující popis má jen ilustrativní význam.
Vynález je částečně založen na objevu, že je možné zvýšit imunogenicitu preselektovaného peptidu nebo antigenního proteinu u savce fúzí preselektovaného antigenů ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Výsledný fuzní protein (v tomto textu také nazývaný „Fc-antigenní fúzní protein“ nebo „antigenní fúzní protein“) nebo sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein pak mohou být podávány savci ve formě vakcíny, aby se vyvolala imunitní reakce proti preselektovanému antigenů. Kromě toho bylo objeveno, že intenzita a typ imunitní reakce vyvolané proti preselektovanému antigenů mohou být modulovány podáváním specifických adjuvancií spolu s Fc-antigenním fúzním proteinem nebo sekvencí nukleové kyseliny kódující Fcantigenní fuzní protein.
-3CZ 304884 B6
V souladu s tím, vynález poskytuje způsob zvýšení imunogenicity preselektovaného antigenu u savce. V jednom aspektu způsob obsahuje podávání savci Fc-antigenního fúzního proteinu obsahujícího konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu spojený polypeptidovou vazbou kpreselektovanému antigenu v množství postačujícím ktomu, aby se vyvolala imunitní reakce.
V dalším aspektu způsob obsahuje podávání savci sekvence nukleové kyseliny, například deoxyribonukleové kyseliny (DNA) nebo ribonukleové kyseliny (RNA), kódující Fc-antigenní fúzní protein obsahující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu fúzovaný k preselektovanému antigenu. Preselektovaný antigen, když je částí Fc-antigenního fúzního proteinu (buď podávaný jako fúzní protein nebo nukleová kyselina, která je pak exprimována v příjemci za vzniku fúzního proteinu), je charakterizován tím, že je schopen stimulace imunitní reakce u savce, která je silnější než reakce vyvolaná srovnatelným množstvím (například hmotností nebo počtem molekul) preselektovaného antigenu samotného, tj. preselektovaným antigenem nefúzovaným ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu.
Kromě toho imunitní reakce vyvolané proti preselektovanému antigenu Fc-antigenního fúzního proteinu mohou být zesíleny nebo modulovány podáváním Fc-antigenního fúzního proteinu spolu s adjuvans. Ačkoliv v praxi vynálezu může být použitelná celá řada adjuvancií, například chemická adjuvancia, jako je například Freundovo kompletní adjuvans nebo oligonukleotid obsahující nemethylovanou CpG sekvenci, běžně výhodná adjuvancia pro použití s Fc-antigenními fúzními proteiny zahrnují druhý Fc fúzní protein (v tomto textu nazývaný „Fc-adjuvantní fúzní protein“ nebo „adjuvantní fúzní protein“) nebo nukleovou kyselinu kódující takový Fc fúzní protein. Výhodné Fc-adjuvantní fúzní proteiny zahrnují konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu spojený polypeptidovou vazbou k adjuvantnímu proteinu, například cytokinů. Výhodné cytokiny použitelné pro konstrukci Fc-adjuvantních fúzních proteinů zahrnují například interferon-γ (IFN-γ), interleukin-2 (IL—2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-12 (IL-12), IL-18, faktor nekrotizující nádory (TNF), faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GMCSF). Další třída Fc-adjuvantních fúzních proteinů zahrnuje úsek těžkého řetězce imunoglobulinu fúzovaný k adjuvantní skupině odpovídající extracelulámí doméně proteinu, která je obvykle částečně nebo výlučně vázaná k membráně. Například CD40 ligand je fúzován k Fc skupině, aby byl použit jako zesílený adjuvantní protein.
Společné podávání Fc-antigenního a Fc-adjuvantního fúzního proteinu, buď současně nebo jednoho po druhém (například Fc-antigen následovaný Fc-adjuvans nebo Fc-adjuvans následované Fc-antigenem), může být použito k modulaci typu imunitní reakce, která je stimulována proti preselektovanému antigenu. Dva druhy imunitní reakce, nazývané Thl a Th2, jsou spouštěny jako reakce na odlišné podněty a zapojují odlišné cytokiny. Thl zprostředkované imunitní reakce jsou typicky buněčné povahy, zatímco Th2 zprostředkované imunitní reakce jsou typicky humorální povahy. V souladu s tím Thl reakce může být použitelná pro napadení změněných buněk, jako jsou například karcinomové buňky nebo buňky infikované virem, zatímco Th2 reakce může být použitelná pro napadení extracelulámích agens, jako jsou například paraziti. Často je užitečné podávat cytokiny, fúzované ke konstantním úsekům těžkého řetězce imunoglobulinu, ke stimulaci buď obecné imunitní reakce nebo ke spouštění či modulaci specifických Thl nebo Th2 reakcí.
Například Fc-adjuvantní fuzní protein obsahující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu spojený peptidovou vazbou k GMCSF je účinný všeobecný stimulátor imunitní reakce, včetně obou reakcí Thl a Th2. Fc-adjuvantní fúzní protein obsahující IL-12 nebo IFN-γ může být společně podáván ke stimulaci primárně buněčné nebo Thl zprostředkované imunitní reakce. Alternativně může být Fc-adjuvantní fúzní protein obsahující IL-4 podáván ke stimulaci primárně humorální nebo Th2 zprostředkované imunitní reakce.
Kromě toho výběr konkrétního cytokinů přítomného v Fc-adjuvantním fúzním proteinu může ovlivnit třídu protilátky vytvářené proti preselektovanému antigenu Fc-antigenního fúzního proteinu. Například Fc-adjuvantní fuzní protein obsahující IL-12 může stimulovat pomocné T lymfocyty a produkci IgG2a třídy protilátek. Alternativně adjuvantní fúzní protein obsahující IL—4 může stimulovat produkci IgE třídy protilátek.
-4CZ 304884 B6
Jak diskutováno výše, ve výhodném provedení způsob zahrnuje podávání Fc-antigenního fúzního proteinu nebo nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní protein v kombinaci s Fcadjuvantním fúzním proteinem. S použitím dvou fuzních proteinů, každý obsahující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, je možné společně lokalizovat jak preselektovaný antigen tak adjuvantní protein (například cytokin) ve stejných nebo podobných buněčných typech u savce. Například makrofágy, B lymfocyty, granulocyty a dendritické buňky exprimují Fc receptory na svém buněčném povrchu. V souladu stím společným podáváním Fc-antigenu a Fcadjuvantních fúzních proteinů schopných vázat Fc receptory je možné společně lokalizovat antigen antigenního fúzního proteinu a adjuvans adjuvantního fúzního proteinu ve stejných buněčných typech. Adjuvans pak může stimulovat, zesílit nebo jinak modulovat imunitní reakci v okolí preselektovaného antigenu.
V tomto výhodném provedení používá vynález dvě odlišné formy lokalizace nebo koncentrace. Zaprvé vynález používá společnou skupinu, která je fúzována jak k antigenu tak k adjuvans, které jsou koncentrovány v určitých oblastech organizmu. Tímto způsobem je zvýšena účinná lokální koncentrace antigenu v sousedství adjuvans. Zadruhé vynález cílí antigen k mechanizmům imunitního systému pro zpracování a prezentaci antigenu. První koncentrační krok může být prováděn fúzí antigenu a adjuvantních proteinů ke skupině, což má za následek koncentraci v některé části organizmu, která je dostupná imunitnímu systému. Druhý cílící krok může být prováděn fúzí antigenního proteinu ke kterékoliv skupině, která zesiluje prezentaci nebo zpracování systémem prezentujícím antigen.
V souladu s tím vynález dosahuje těchto koncentračních účinků dvěma alternativními metodami. První metodou je konstrukce a podávání dvou různých fúzních proteinů, fúzní protein lokalizující antigen a fúzní protein lokalizující adjuvans. Druhou metodou je konstrukce a podávání fuze obsahující antigen, adjuvans a lokalizující protein. Fc skupina je příklad lokalizujícího proteinu.
Důležitý charakteristický rys konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu je to, že na rozdíl od preselektovaného antigenu v Fc-antigenním fúzním proteinu, je výhodně neimunogenní nebo je pouze slabě imunogenní pro předpokládaného příjemce. Jinak řečeno, v Fc-antigenním fúzním proteinu je preselektovaný antigen navržen tak, aby byl více imunogenní pro příjemce než konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu. Podobně se předpokládá, že Fc-adjuvantní fúzní protein by také byl neimunogenní nebo slabě imunogenní pro předpokládaného příjemce. Imunogenicita konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu může být redukována a v určitých případech eliminována s použitím sekvencí konstantního úseku imunoglobulinu pocházejících ze stejného živočišného druhu nebo podobných sekvencím přítomným u stejného živočišného druhu, jako je předpokládaný příjemce. Například jsou konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu, výhodně humánního původu, použity k vytvoření fúzních proteinů pro podávání člověku. Podobně, když je předpokládaný příjemce člověk, je adjuvantní protein v Fc-adjuvantním fúzním proteinu také výhodně humánního původu. Výběrem vhodných aminokyselinových sekvencí definujících konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu a adjuvantní proteiny, je možné optimalizovat imunitní reakce přímo primárně proti preselektovanému antigenu.
Ve výhodném provedení konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu Fc-antigenního fúzního proteinu obsahuje kloubový úsek imunoglobulinu a volitelně doménu konstantního úseku imunoglobulinu vybranou ze skupiny, kterou tvoří CH2 doména, CH3 doména a CH4 doména nebo jejich kombinace. Ale konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu výhodně postrádá alespoň CH1 doménu. Kromě toho Fc fúzní proteiny podle vynálezu výhodně postrádají doménu variabilního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu (Vh). Když má být fúzní protein podáván člověku, konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu výhodně obsahuje kloubový úsek a CH2 doménu nebo CH3 doménu a nejvýhodněji obsahuje kloubový úsek a obě CH2 doménu a CH3 doménu. Předpokládá se, že konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu použitelné v praxi vynálezu mohou pocházet z imunoglobulinů patřících do kterékoliv z pěti imunoglobulinových tříd nazývaných v oboru IgA (Iga), IgD (Igó), IgE (Ige), IgG (Igy) a IgM (Igp). Ale jsou výhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinu z IgG třídy.
-5CZ 304884 B6
Předpokládá se, že kterýkoliv požadovaný preselektovaný antigen může být zahrnut v Fcantigenním fuzním proteinu podle vynálezu. Ve výhodném provedení je preselektovaný antigen vybrán ze skupiny, kterou tvoří membránový antigen specifický pro prostatu, ektodoména cytokinového receptoru, virový protein a antigen specifický pro karcinom nebo nádor.
Fc-antigenní fuzní proteiny mající velký počet konfigurací mohou být použitelné v praxi vynálezu. Například N-koncová část preselektovaného antigenu může být spojena polypeptidovou vazbou s C-koncovou částí konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Alternativně může být C-koncová část preselektovaného antigenu spojena polypeptidovou vazbou sN-koncovou částí konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě toho se předpokládá, že Fcantigenní fúzní proteiny mohou obsahovat velké množství jednoho nebo více preselektovaných antigenů, z nichž jeden nebo více může být spojeno přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru k sobě navzájem nebo ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě toho dva nebo více Fc-antigenních fúzních proteinů může být spojeno spolu buď nekovalentně nebo kovalentně, například jednou nebo více disulfidovými vazbami za vzniku dimemích nebo multimemích přípravků. Předpokládá se, že Fc-antigenní fúzní proteiny v dimemích konstruktech mohou být stejné nebo navzájem odlišné. Například i když oba Fc-antigenní fúzní proteiny mohou obsahovat stejný konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, preselektované antigeny se mohou lišit. Předpokládá se, že podobné konfigurace mohou být použity také s Fcadjuvantními fúzními proteiny.
Kromě toho v praxi vynálezu může být použitelná celá řada sekvenci nukleových kyselin kódujících Fc fúzní proteiny. Například sekvence nukleové kyseliny mohou kódovat ve směru od 5' ke 3', buď konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu a preselektovaný antigen nebo preselektovaný antigen a konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě toho sekvence nukleové kyseliny volitelně mohou také obsahovat „vedoucí“ nebo „signální“ sekvenci založenou například na sekvenci lehkého řetězce imunoglobulinu fúzované přímo ke kloubovému úseku konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Ve výhodném provedení, když Fc úsek je založen na IgG sekvencích, Fc úsek kóduje ve směru od 5' ke 3' alespoň kloubový úsek imunoglobulinu (tj. kloubový úsek obsahující alespoň jednu aminokyselinu cystein schopnou tvorby disulfidové vazby s druhou sekvencí kloubového úseku imunoglobulinu), imunoglobulinovou CH2 doménu a CH3 doménu. Kromě toho sekvence nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní proteiny mohou také být integrovány do replikovatelného expresního vektoru, který může buď exprimovat Fc fúzní protein například v bakteriálním hostiteli, v předpokládaném příjemci nebo v obou.
Předpokládá se, že injekce sekvencí nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní protein, buď samotných nebo v kombinaci se sekvencemi nukleové kyseliny kódujícími Fc-adjuvantní fúzní protein, může mít za následek vznik buněčné imunitní reakce, humorální imunitní reakce nebo obou. Kombinace imunizace založené na nukleové kyselině a imunizace založené na proteinu (např. podávání Fc-antigenního fúzního proteinu před podáváním, během podávání nebo po podávání nukleové kyseliny kódující Fc antigenní fuzní protein) může působit synergicky, aby se vyvolala silnější imunitní reakce proti preselektovanému antigenu relativně k imunizaci buď se samotnou nukleovou kyselinou, nebo samotným proteinem.
Předcházející a další cíle, charakteristické rysy a výhody předkládaného vynálezu budou zjevnější z následujícího podrobného popisu, obrázků a patentových nároků, které následují.
Objasnění výkresů
Předcházejícím a dalším cílům, charakteristickým rysům a výhodám předkládaného vynálezu, a také vynálezu samotnému bude plněji porozuměno z následujícího popisu výhodných provedení při společném čtení s doprovázejícími obrázky, ve kterých:
Obrázky IA až IG jsou schématické zobrazení příkladů Fc-fúzních proteinů použitelných v praxi vynálezu. Obrázek IA představuje Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantní fuzní protein, kde konstant-6CZ 304884 B6 ní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojen k N-koncové části antigenů nebo adjuvans 2. Obrázek 1B představuje Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantní fúzní protein, kde konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojen k C-koncové části antigenů nebo adjuvans 2. Obrázky IC a ID představují dimemí protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantní fúzní protein. Na obrázku IC, v alespoň jednom polypeptidovém řetězci, je konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 připojen k N-koncové části antigenů nebo adjuvans 2 a na obrázku ID, konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojen k C-koncové části antigenů nebo adjuvans 2. Obrázek IE představuje dimemí protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují Fc-antigen-antigen, Fc-adjuvans-adjuvans, Fc-adjuvans-antigen nebo Fc-antigen-adjuvans fúzní protein. Obrázek IF představuje dimemí fuzní protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují antigen-Fc-adjuvantní nebo adjuvans-Fc-antigenní fuzní protein. Obrázek IG představuje dimemí fuzní protein, kde jeden nebo oba polypeptidové řetězce obsahují antigen-adjuvans-Fc nebo adjuvans-antigen-Fc fuzní protein.
Obrázky 2A až 2B jsou schématická znázornění DNA sekvencí použitelných v praxi vynálezu. Obrázek 2A představuje expresní vektor humánního Fc fúzního proteinu. Obrázek 2B představuje genovou fúzi pro expresi myšího IgG2a Fc fuzního proteinu.
Obrázky 3A až 3F jsou grafy ukazující účinek chemických a Fc-cytokinových adjuvancií na produkci protilátek u myší imunizovaných Fc-antigenním fúzním proteinem, fúzním proteinem myší Fc - humánní ektodomén receptoru IL-M (Fc-IL-4R). Na obrázku 3A byly myši imunizovány Fc-IL-4R a Fc-IL-2 ve Freundově kompletním adjuvans (CFA). Na obrázku 3B byly myši imunizovány Fc-IL-MR ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfáty (PBS). Na obrázku 3C byly myši imunizovány Fc-IL-4R v CFA. Na obrázku 3D byly myši imunizovány Fc-IL-4R a Fc-IL-2 v PBS. Na obrázku 3E byly myši imunizovány Fc-IL—4R a Fc-GMCSF v CFA. Na obrázku 3F byly myši imunizovány Fc-IL-^fR a Fc-GMCSF v PBS. Na obrázcích 4A až 3F čtverce, kosočtverce a trojúhelníky představují data pocházející od tří jednotlivých myší. Hladiny protilátek k antigenů byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázky 4A až 4D jsou grafy ukazující účinek imunizace myší s humánním karcinomovým antigenem, PSMA, ve formě Fc-antigenního fúzního proteinu s použitím proměnného množství FcGMCSF jako adjuvans. Na obrázku 4A byly myši imunizovány 50 pg Fc-PSMA fúzního proteinu samotného. Na obrázku 4B byly myši imunizovány 50 pg Fc-PSMA a 0,5 pg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 4C byly myši imunizovány 50 pg Fc-PSMA a 0,5 pg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 4D byly myši imunizovány 50 pg Fc-PSMA a 5 pg Fc-GMCSF. Na obrázcích 4A až 4D čtverce, kosočtverce a trojúhelníky představují data pocházející od tří jednotlivých myší.
Obrázky 5A až 5F jsou grady srovnávající specifické protilátkové reakce na PSMA antigen podávány buď jako nativní protein (5A až 5C) nebo jako myší Fc-PSMA fúzní protein (5D až 5F). Na obrázku 5A byly myši imunizovány 50 pg PSMA jako antigenem. Na obrázku 5B byly myši imunizovány 50 pg PSMA jako antigenem a 0,2 pg GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 5C byly myši imunizovány 50 pg PSMA jako antigenem a 0,5 pg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 5D byly myši imunizovány 50 pg Fc-PSMA jako antigenem. Na obrázku 5E byly myši imunizovány 50 pg Fc-PSMA jako antigenem a 0,2 pg GMCSF jako adjuvans. Na obrázku 5F byly myši imunizovány 50 pg Fc-PSMA jako antigenem a 0,5 pg Fc-GMCSF jako adjuvans. Na obrázcích 5 A až 5F čtverce, kosočtverce a trojúhelníky představují data pocházející od tří jednotlivých myší. Hladiny protilátek k antigenů byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázek 6 je graf srovnávající adjuvantní účinky Fc-GMCSF nebo Fc-F3L společně podávaného s Fc-PSMA na produkci protilátek proti humánnímu PSMA. Všechna zvířata dostala 50 pg Fc-7 CZ 304884 B6
PSMA buď samotného nebo v kombinaci s uvedeným Fc-cytokinem jako adjuvans. V jednotlivých pokusech byly testovány tři myši.
Obrázky 7A až 7B jsou grafy ukazující u jednotlivých myší imunogenicitu Fc-EpCAM fúzního proteinu, buď samotného nebo v kombinaci s Fc-GMCSF adjuvans. Obrázky 7A a 7B představují protilátkové titry měřené 7 a 14 dnů po zesilovací injekci, v daném pořadí. Zesilovací injekce byla podávána tři týdny po primární imunizaci. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představují myši imunizované subkutánně 10 pg Fc-EpCAM samotného a plné trojúhelníky představují myši imunizované subkutánně 10 pg Fc-EpCAM a 1 pg Fc-GMCSF jako adjuvans. Hladiny protilátek k antigenů byly měřeny testem EFISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu EFISA.
Obrázky 8A až 8B jsou grafy ukazující u myší imunogenicitu EpCAM-Fc (opačná orientace Fc úseku a antigenů) buď samotného nebo v kombinaci s Fc-GMCSF adjuvantním fúzním proteinem. Obrázky 8A a 8B představují protilátkové titry měřené 14 dnů a 21 dnů (tj. 7 dnů po zesilovací injekci) po imunizaci, v daném pořadí. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představují průměrné titry tři myší imunizovaných 25 pg EpCAM-Fc proteinu a plné trojúhelníky představují myši imunizované 25 pg EpCAM-Fc a 2,5 pg Fc-GMCSF jako adjuvans. Hladiny protilátek k antigenů byly měřeny testem EFISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu EFISA.
Obrázek 9 ukazuje schéma konstrukce plazmidového vektoru kódujícího EpCAM-Fc-GMCSF fúzní protein. V tomto případě je antigen EpCAM fúzován k aminokoncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu (Fc úsek) a adjuvans GMCSF je fúzováno ke karboxykoncové části Fc úseku.
Obrázky 10A až 10D jsou grafy ukazující protilátkové titry u myší, kterým byla podána injekce plazmidových vektorů kódujících Fc-EpCAM fúzní protein s použitím buď PBS nebo 25% (hmotnost/objem) roztoku sacharózy jako nosiče. Obrázky 10A až 10D představují protilátkové titry zaznamenané 14 dnů, 27 dnů, 55 dnů a 69 dnů po počáteční injekci, v daném pořadí. Na obrázcích prázdné kosočtverce představují titry pro jednotlivé myši, kterým byla podána injekce Fc-EpCAM kódujícího plazmidů v PBS a plné trojúhelníky představují titry pro jednotlivé myši, kterým byla podána injekce Fc-EpCAM kódujícího plazmidů v sacharóze. Hladiny protilátek k antigenů byly měřeny testem EFISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu EFISA.
Obrázky 1 IA až 11B jsou graíy ukazující stimulaci inkorporace 3H-thymidinu jako reakci na in vitro stimulaci antigenem splenocytů izolovaných z myší imunizovaných DNA vakcinací nebo injekcí proteinu. Obrázek 11B ukazuje rozšířený přehled dat v nižší části obrázku 1 IA. Na obrázcích plné kosočtverce představují splenocyty odebírané myším imunizovaným 100 pg plazmidové DNA kódující CMV-Fc-EpCAM fúzní protein, prázdné kroužky představují splenocyty odebírané myším imunizovaným 100 pg plazmidové DNA kódující CMV-EpCAM-Fc fúzní protein a křížky představují splenocyty odebírané myším imunizovaným 10 pg Fc-EpCAM proteinu. Sleziny byly odstraněny myším v 70. Den po první injekci plazmidové DNA nebo proteinu a dvou zesilovacích injekcích ve 3 týdenních intervalech.
Obrázky 12A až 12B jsou grafy ukazující test usmrcování cytotoxickými T lymfocyty (CTL) s použitím splenocytů z myší imunizovaných plazmidovou DNA nebo Fc-EpCAM proteinem. Obrázek 12A ukazuje aktivitu splenocytů proti myším CT26 nádorovým buňkám exprimujícím humánní EpCAM protein. Obrázek 12B ukazuje aktivitu splenocytů proti parenterálním myším CT26 nádorovým buňkám. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představují splenocyty imunizované DNA nesoucí konstrukt (CMV-promotor)-EpCAM, prázdné čtverce představují splenocyty z myší imunizovaných DNA nesoucí fúzní konstrukt (CMV-promotor)-Fc-EpCAM, prázdné trojúhelníky představují splenocyty z myší imunizovaných DNA nesoucí fúzní konstrukt
-8CZ 304884 B6 (CMV-promotor)-EpCAM-Fc a křížky představují splenocyty z myší imunizovaných FcEpCAM fúzním proteinem. CTL test používal splenocyty z imunizovaných myší pěstovaných pět dnů s 10 U/ml IL-2. Značené cílové buňky byly smíchány s označenými efektory a inkubovány čtyři hodiny. Uvolňování radioaktivity bylo použito pro výpočet procenta specifické lýzy.
Obrázek 13 je graf ukazující protilátkové titry u myší imunizovaných subkutánně 50 pg FcMCSP fuzního proteinu v PBS buď samotného nebo v kombinaci s 5 pg Fc-GMCSF jako adjuvans. Plné kosočtverce představují protilátkové titry v normálním séru, prázdné čtverce představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP fuzním proteinem samotným a plné trojúhelníky představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP fuzním proteinem v kombinaci s Fc-GMCSF adjuvans. Hladiny protilátek k antigenů byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Obrázky 14A až 14B jsou graíý ukazující protilátkové titry u myší imunizovaných Fc-gp41 pep 626 fuzním proteinem buď samotným nebo v kombinaci s Fc-cytokinovým adjuvans. Obrázky 14A a 14B představují protilátkové titry dosažené 7 a 33 dnů po druhé zesilovací injekci, v daném pořadí. Na obrázcích prázdné kosočtverce představují protilátkové titry u myší imunizovaných intradermální injekcí 25 pg Fc-gp41 pep 626 antigenů samotného, prázdné čtverce představují titry u myší imunizovaných intradermální injekcí 25 pg Fc-gp41 pep 626 antigenů v kombinaci s 2,5 pg Fc-GMCSF adjuvans a plné trojúhelníky představují protilátkové titry u myší imunizovaných intradermální injekcí 2,5 pg Fc-gp41 pep 626 antigenů v kombinaci s 2,5 pg Fc-IL2 adjuvans. Hladiny protilátek k antigenů byly měřeny testem ELISA, Y-osa ukazuje optickou denzitu odečítanou v testu ELISA.
Detailní popis vynálezu
Předkládaný vynález se týká účinné aplikace antigenních proteinů nebo peptidů in vivo pro indukci humorální imunitní reakce (tj. založené na protilátkách) nebo Th2 buňkami zprostředkované imunitní reakce, buněčné nebo Thl buňkami zprostředkované imunitní reakce a v některých případech obou typů imunitní reakce u savce. Nyní bylo objeveno, že je možné zesílit imunogenicitu preselektovaného antigenního proteinu nebo peptidu u savce fúzí preselektovaného antigenu ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu, aby se vytvořil Fc-antigenní fúzní protein. Výsledný Fc-antigenní fúzní protein nebo sekvence nukleové kyseliny kódující Fcantigenní fuzní proteiny pak mohou být podávány savci, například člověku, ve formě vakcíny, aby se vyvolala imunitní reakce proti preselektovanému antigenů.
Fc-antigenni fúzní protein selektivně cílí antigen k buňkám prezentujícím antigen (APC). Bez ohledu na jakékoliv teorie, má se za to, že vazba Fc-antigenního fuzního proteinu k APC je zprostředkována Fc receptory exprimovanými na četných typech imunitních buněk, včetně například: dendritických buněk, makrofágů, B lymfoeytů a granulocytů. Fc-antigenní fúzní protein se při podávání savci váže na Fc receptory, a poté je Fc-antigenní fuzní protein pohlcen APC endocytózou. Předpokládá se, že fúzní protein pohlcený endocytózou, včetně preselektovaného antigenu, je pak degradován na malé peptidy, které jsou pak prezentovány na buněčném povrchu. Předložené peptidy pak zprostředkovávají humorální a/nebo buněčnou imunitní reakci. Konkrétní typ stimulované imunitní reakce může být modulován společným podáváním Fc-antigenního fúzního proteinu s adjuvans, například adjuvantním fuzním proteinem.
V jednom způsobu podávání je příjemci podáván Fc-antigenní fúzní protein. V dalším způsobu podávání je příjemci podávána sekvence nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní protein. Preselektovaný antigen, buď v podávaném Fc-antigenním proteinu nebo jako exprimovaný z podávané nukleové kyseliny, je více imunogenní než antigen samotný, tj. antigen, který není fúzovaný polypeptidovou vazbou ke konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Kromě toho za určitých okolností může být postupné podávání fuzního proteinu následované podá-9CZ 304884 B6 váním nukleové kyseliny, která jej kóduje fúzní protein nebo alternativně podávání nukleové kyseliny kódující fúzní protein následované podáváním stejného fúzního proteinu použito k maximalizaci imunogenicity preselektovaného antigenu. Má se za to, že optimální imunitní reakce byla vyvolána, když jsou aktivní obě složky Fc-antigenních fúzních proteinů. Jinak řečeno, preselektovaný antigen v Fc-antigenním fúzním proteinu je schopen vyvolat imunitní reakci a konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu je schopen vazby Fc receptoru na povrchu APC.
Kromě toho, jak diskutováno, síla a typ imunitní reakce vyvolané proti preselektovanému antigenu může být modulován společným podáváním specifických adjuvancií s Fc-antigenním fúzním proteinem a/nebo nukleovou kyselinou kódující Fc-antigenní fúzní protein. Ačkoliv chemická adjuvancia, např. alum nebo Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans, mohou být za určitých okolností, například při veterinárních aplikacích, použitelná v praxi vynálezu, jejich vedlejší účinky, například zjizvení tkáně, je mohou činit nepřijatelná pro humánní použití. V souladu s tím výhodná adjuvancia obsahují druhý Fc fúzní protein, kde konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu je fúzován k adjuvantnímu proteinu za vzniku Fc-adjuvantního fúzního proteinu. Má se za to, že co se týče Fc-antigenních fúzních proteinů, je optimální imunitní reakce vyvolána, když jsou aktivní obě složky Fc-adjuvantního fúzního proteinu. Jinak řečeno, adjuvans v Fc-adjuvantním fúzním proteinu je schopno modulace imunitní reakce a konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu je schopen vazby Fc receptoru na povrchu APC.
Ve výhodném provedení vynálezu jsou oba antigen a adjuvans podávány jako Fc fúzní proteiny nebo nukleové kyseliny kódující takové fúzní proteiny. Jinak řečeno, antigen je podáván jako Fcantigenní fúzní protein a adjuvans je podáván jako Fc-adjuvantní fúzní protein. Určitá výhodná provedení Fc fúzních proteinů použitelná v praxi vynálezu jsou ukázána na obrázcích IA až 1G.
Obrázek IA ukazuje názorný Fc fúzní protein, ve kterém C-koncová část konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojena, buď přímo nebo polypeptidovou spojovací částí (linker), kN-koncové části preselektovaného antigenu nebo adjuvans 2. Jak se v tomto textu používá, termín „polypeptidový linker“ označuje sekvenci jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, které spojují dva proteiny dohromady. Polypeptidový linker je často řada aminokyselin dlouhých přibližně 10 až 15 zbytků, obsahující například opakující se glycinové a/nebo serinové zbytky. Obrázek IB ukazuje názorný Fc fúzní protein, ve kterém C-koncová část preselektovaného antigenu nebo adjuvans 2 je připojena, buď přímo nebo polypeptidovým linkerem, k Nkoncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1.
Obrázek 1C ukazuje dimemí konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny spojené kovalentně dvěma disulfidovými vazbami. Dimemí konstrukt obsahuje dva Fc fuzní proteiny, ve kterých Ckoncová část každého konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojena k Nkoncové části preselektovaného antigenu adjuvans 2. Podobně, obrázek ID ukazuje dimemí konstrukt obsahující dva Fc fuzní proteiny spojené kovalentně dvěma disulfidovými vazbami. Dimemí konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kterých C-koncová část každého preselektovaného antigenu nebo adjuvans 2 je připojena k N-koncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1.
Obrázek IE ukazuje dimemí konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny spojené dvěma disulfidovými vazbami. Dimemí konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kterých C-koncová část každého konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu 1 je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového línkem, k N-koncové části preselektovaného antigenu adjuvans 2, jehož C-koncová část je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového línkem, k druhému antigenu nebo adjuvans 2'.
Obrázek 1F ukazuje dimemí konstrukt obsahující dva Fc fuzní proteiny také spojené dvěma disulfidovými vazbami. Dimemí konstrukt obsahuje dva Fc fuzní proteiny, ve kterých C-koncová část antigenu nebo adjuvans 2 je připojena, buď přímo, nebo prostřednictvím polypeptidového
- 10CZ 304884 B6 linkeru, k N-koncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinů 1, jehož Ckoncová část je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k N-koncové části odlišného adjuvans nebo antigenů 2'. Například tyto fúzní proteiny mohou obsahovat, ve směru od N- k C-konci, preselektovaný antigen-konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu-adjuvans.
Obrázek IG ukazuje dimemí konstrukt obsahující dva Fc fúzní proteiny také spojené dvěma disulfídovými vazbami. Dimemí konstrukt obsahuje dva Fc fúzní proteiny, ve kteiých C-koncová část antigenů nebo adjuvans 2 je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru, k N-koncové části odlišného adjuvans nebo antigenů 2', jehož C-koncová část je připojena, buď přímo nebo prostřednictvím polypeptidového linkeru k N-koncové části konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinů 1. Například tyto fúzní proteiny mohou obsahovat, ve směru od N- k C-konci, preselektovaný antigen-adjuvans-konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu.
V praxi vynálezu je obecně výhodné umístit Fc skupinu do N-koncové polohy relativně k adjuvantní skupině. Jestliže je adjuvantní skupina umístěná N-koncově k Fc skupině, pak se fúze adjuvans-Fc může vázat k receptoru adjuvans na imunitní buňce a Fc skupina je ve stejné orientaci, která je přijata, když se protilátka váže k buněčnému povrchu. Výsledkem je ADCC nebo fixace komplementu. Ale když je Fc skupina umístěna N-koncově k adjuvantní skupině, nenastane ADCC a fixace komplementu.
Konstrukty ukázané na obrázcích IC až IG jsou ukázány jako dimery zesítěné párem disulfidových vazeb mezi cysteiny na sousedních kloubových úsecích. Na obrázcích jsou disulfidové můstky ukázány jako spojující dohromady části dvou konstantních úseků těžkého řetězce imunoglobulinu prostřednictvím kloubového úseku charakteristického pro nativní formy těchto molekul. I když jsou výhodné konstrukty zahrnující kloubové úseky imunoglobulinů, vynález předpokládá, že může být vybráno zesítění v jiných polohách, je-li žádoucí. Kromě toho v některých případech mohou nekovalentně asociovat dva nebo více monomerů za vzniku dimerů nebo multimerů použitelných v praxi vynálezu.
Jak se v tomto textu používá, termín „konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinů“ je zaměnitelný s termínem „Fc úsek“ a označuje karboxy-koncovou část konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinů nebo její analog nebo část schopnou vazby Fc receptoru. Jakje známo, každý konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinů obsahuje čtyři nebo pět domén. Domény jsou nazvány postupně, jak následují: CHl-kloubový úsek-CH2-CH3(-CH4). CH4 se vyskytuje v IgM, který nemá kloubový úsek. Konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinů použitelný v praxi vynálezu výhodně obsahuje kloubový úsek imunoglobulinů a výhodně také zahrnuje CH3 doménu. Konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinů nejvýhodněji obsahuje kloubový úsek imunoglobulinů, CH2 doménu a CH3 doménu. Jak se v tomto textu používá, termín „kloubový úsek“ imunoglobulinů označuje celý kloubový úsek imunoglobulinů nebo alespoň část kloubového úseku imunoglobulinů postačující pro vznik jedné nebo více disulfidových vazeb s druhým kloubovým úsekem imunoglobulinů.
Předpokládá se, že vhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinů mohou pocházet z protilátek patřících do každé třídy imunoglobulinů nazývaných IgA, IgD, IgE, IgG a IgM, ale jsou výhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinů z třídy IgG. Kromě toho se předpokládá, že konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinů mohou pocházet z kterékoliv podtřídy IgG protilátky v oboru nazývaných IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4.
Domény konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinů mají zkříženou homologií mezi imunoglobulinovými třídami. Například CH2 doména IgG je homologní k CH2 doméně IgA a IgD a k CH3 doméně IgM a IgE. Výhodné konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinů obsahují proteinové domény odpovídající CH2 úseku a CH3 úseku IgG nebo jeho funkční části nebo derivátům. Konstantní úseky těžkého řetězce imunoglobulinů ale výhodně postrádají ale-11 CZ 304884 B6 spoň CH1 doménu. Kromě toho Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantní fúzní proteiny volitelně postrádají variabilní úsek imunoglobulinu. Ve výhodnějším provedení konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu obsahuje, ve směru od N-konce k C-konci, kloubový úsek imunoglobulinu, CH2 doménu a CH3 doménu, které jsou všechny založeny na sekvencích z molekuly IgG. Výběr vhodných konstantních úseků těžkého řetězce imunoglobulinu je detailně diskutován v patentech Spojených Států US 5 541 087 a US 5 726 044. Výběr konkrétních sekvencí konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu z určitých imunoglobulinových tříd a podtříd pro dosažení konkrétního výsledku je považován za rutinní činnost na úrovni znalostí v oboru,
Za některých okolností může být užitečné modifikovat konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, například mutací, delecí nebo jinými změnami zprostředkovanými genetickým inženýrstvím nebo jinými přístupy, tak, že určité aktivity, jako například fixace komplementu nebo stimulace cytotoxicity zprostředkované buňkami závislé na protilátkách (ADCC), jsou redukovány nebo odstraněny. Ale je považováno za nezbytné, že je udržována schopnost konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu vázat Fc receptor.
V praxi tohoto vynálezu je složka konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu Fcantigenních nebo Fc-adjuvantních fúzních proteinů výhodně pro předpokládaného příjemce neimunogenní nebo slabě imunogenní. Fc úsek je považován za neimunogenní nebo slabě imunogenní, jestliže konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu nevyvolá detekovatelnou protilátkovou reakci namířenou proti konstantnímu úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. V souladu s tím být konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu měl pocházet z imunoglobulinů přítomných ve stejném živočišném druhu nebo by měl být založen na aminokyselinových sekvencích odpovídajících imunoglobulinů přítomných ve stejném živočišném druhu, jakého je předpokládaný příjemce fúzního proteinu. Jinak řečeno, když Fc fúzní konstrukt (Fc-antigen a/nebo Fcadjuvantní fúzní protein) má být podáván člověku, měly by být použity humánní sekvence konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence humánních Fc IgG jsou popsány například vEllison et al. (1982, NUCLEIC ACIDS RES. 10: 4071-4079). Podobně by měly být použity myší Fc sekvence, když Fc fuzní protein má být podáván myším. Nukleotidové a aminokyselinové sekvence myších Fc IgG2a jsou popsány například v Bourgois et al. (1974, EUR. J. BIOCHEM. 43: 423—435). Měla by být použita stejná logika, jestliže Fc fúzní proteiny mají být podávány jiným zvířatům včetně domácích zvířat, například koček a psů, a hospodářských zvířat, například krav a koní.
Jak se v tomto textu používá, termín „preselektovaný antigen“ označuje kterýkoliv protein nebo jeho fragment nebo polypeptid, který je schopen buď samotný, nebo v kombinaci s jinými reagenciemi indukovat imunitní reakci u savce. Předpokládá se, že v Fc-antigenním fuzním proteinu podle vynálezu může být obsažen kterýkoliv požadovaný preselektovaný antigen. Ve výhodném provedení preselektovaný antigen je vybrán ze skupiny, kterou tvoří membránový antigen specifický pro prostatu (PSMA), ektodoména cytokinového receptoru, například ektodoména humánního IL-4 receptoru, nádorový specifický antigen (například antigen, který je řízené zvýšeně exprimován nebo je v nádorové buňce jinak přítomný ve zvýšených hladinách relativně k normální buňce) a virový protein, například protein kódovaný genomem humánního viru imunodeficience (HTV).
Jak se v tomto textu používá, termín „adjuvans“ označuje kteroukoliv látku, která je schopna působit jako imunomodulátor, například zesílením imunitní reakce (buď humorální nebo buněčné) proti preselektovanému antigenu. Jak se v tomto textu používá, termín „humorální“ imunita označuje imunitu zprostředkovanou protilátkami přítomnými v tělesných tekutinách, například v plazmě nebo v lymfe, zatímco termín „buněčná“ imunita, v oboru také nazývaná imunita „zprostředkovaná buňkami“, označuje imunologické reakce spouštěné T lymfocyty a zprostředkované efektorovými T lymfocyty a/nebo makrofágy.
Jak diskutováno výše, v imunizaci savců kromě člověka může být použitelná celá řada chemických adjuvancií, například Freundovo kompletní adjuvans. Ačkoliv je široce používáno u zvířat
- 12CZ 304884 B6 k vytváření vysokých titrů protilátky nebo významných reakcí cytotoxických T lymfocytů (CTL), jeho vedlejší účinky, například jizvení tkáně, jej činí nepřijatelné pro humánní použití. Tudíž je zapotřebí indukovat silné imunitní reakce bez doprovodného zánětu v místě injekce. Jedna nesporná výhoda bez doprovodného zánětu v místě injekce. Jedna nesporná výhoda použití Fcadjuvantních fuzních proteinů podle vynálezu je schopnost vyvolat silnou imunitní reakci bez potřeby chemických adjuvancí, jako je například Freundovo adjuvans.
Výhodná adjuvancia použitelná v praxi vynálezu zahrnují Fc-adjuvantní fúzní protein nebo nukleovou kyselinu, která jej kóduje. Výhodné adjuvantní proteiny pro zahrnutí do Fc fuzních proteinů jsou cytokiny. Jak se v tomto textu používá, termín „cytokin“ označuje kterýkoliv protein nebo peptidový analog nebo jeho funkční fragment, který je u savce schopen modulovat aktivitu imunitních buněk, například T lymfocytů. B lymfocytů, makrofágů, neutrofilů, eosinofilů, basofilů, dendritických buněk a jejich prekurzorů. Výhodné cytokiny zahrnují například IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, TNF a GMCSF. Extracelulámí doména CD40 ligandu je také výhodný protein k fůzi k Fc za vzniku Fc-adjuvans. Když je podáván s Fc-adjuvans, antigen v Fc-antigenním fúzním proteinu může vyvolat imunitní reakci, která je silnější, než když je Fc-antigenní fúzní protein podáván bez Fc-adjuvantního fuzního proteinu. V některých případech je hladina protilátky dosažená po pouze dvou imunizacích Fc-antigenu s Fc-adjuvans zrovna tak vysoká nebo vyšší než hladina dosažená s Freundovým adjuvans, a bez zjistitelné reakce kůže.
Co se týče konstantních úseků těžkého řetězce imunoglobulinu Fc-antigenních nebo Fc-adjuvantních fúzních proteinů, adjuvantní protein výhodně je pro předpokládaného příjemce neimunogenní nebo pouze slabě imunogenní. To může být uskutečněno zavedením do Fc adjuvantních fúzních proteinů, cytokinů definovaných aminokyselinovými sekvencemi odpovídajícími cytokinům, které lze izolovat ze stejného živočišného druhu, jako je předpokládaný příjemce. Například když má být Fc adjuvantní fuzní protein podáván člověku, je výhodně adjuvantní protein (například cytokin) humánního původu.
Společné podávání Fc-antigenních a Fc-adjuvantních fuzních proteinů, buď současně nebo jeden po druhém, může být použito k modulaci typu imunitní reakce, která je stimulována proti preselektovanému antigenu. Dva druhy imunitní reakce, nazývané Thl a Th2, jsou stimulovány jako reakce na odlišné typy infekce a zapojují odlišné cytokiny. Thl zprostředkované imunitní reakce jsou typicky buněčné povahy, zatímco Th2 zprostředkované imunitní reakce jsou typicky humorální povahy. V souladu s tím Thl reakce může být použitelná pro napadení změněných buněk, jako jsou například nádorové buňky nebo buňky infikované virem, zatímco Th2 reakce může být použitelná pro napadení extracelulámích agens, jako jsou například paraziti. Často je užitečné podávat cytokiny, fúzované ke konstantním úsekům těžkého řetězce imunoglobulinu, ke stimulaci buď obecné imunitní reakce nebo ke spuštění či modulaci specifických Thl nebo Th2 reakcí.
Kromě toho výběr konkrétního cytokinu přítomného v Fc-adjuvantním fúzním proteinu může ovlivnit třídu protilátky vytvářené proti preselektovanému antigenu Fc-antigenního fúzního proteinu. Například Fc-IL12 stimuluje reakci pomocných T lymfocytů stimulací produkce působků, které jsou známy jako Thl cytokiny, například IFN-γ, IL-2 a INF, které podporují silnou buněčnou imunitu a produkci IgG2a třídy protilátek. Naopak Fc-IL-4 stimuluje produkci Th2 cytokinů, například IL-5, IL-6, IL-10 a IL-4, které podporují humorální imunitu.
Jak diskutováno výše, ve výhodném provedení způsob obsahuje podávání Fc-antigenního fuzního proteinu nebo nukleové kyseliny kódující Fc-antigenní fúzní protein v kombinaci s Fcadjuvantním fúzním proteinem. S použitím dvou fuzních proteinů, z nichž každý obsahuje konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu, je možné společně lokalizovat jak preselektovaný antigen tak adjuvantní protein (například cytokin) ve stejných nebo podobných buněčných typech u savce. Například makrofágy, B lymfocyty, granulocyty a dendritické buňky exprimují Fc receptory na svém buněčném povrchu. V souladu s tím společným podáváním Fc-antigenních a Fc-adjuvantních fuzních proteinů schopných vázat Fc receptory je možné společně lokalizovat antigen antigen-fuzního proteinu a adjuvans adjuvantního fuzního proteinu ve stejném buněčném
- 13CZ 304884 B6 kompartmentu APC. Adjuvans pak může zesilovat nebo jinak modulovat imunitní reakci v okolí preselektovaného antigenů.
Kombinace Fc-cytokinů může být také použita synergicky ke stimulaci obecné reakce a pak pro ovlivnění, zda nastane buněčná (Thl) nebo humorální (Th2) reakce. Například Fc-GMCSF je silný obecný stimulátor imunitních reakcí. Ale aby se modulovala reakce dále směrem k buněčné nebo Thl zprostředkované imunitě, může být Fc-IL12 nebo Fc-IFNy adjuvantní protein společně podáván například s Fc-GMCSF. Aby se podporovala více humorální nebo Th2 zprostředkovaná reakce, může být Fc-IF4 adjuvantní protein společně podáván například s Fc-GMCSF k modulaci reakce k vytváření Th2 buněk. V závislosti na přesné povaze požadované fyziologické reakce mohou také být použity další Thl nebo Th2 podporující cytokiny, použité jako fúzní cytokiny pro Fc. Předpokládá se, že tento obecný přístup může také být použit k modulaci existující patologické reakce, jako je například autoimunita (Thl-zprostředkované onemocnění) a alergie (Th2-zprostředkované onemocnění) posunutím reakce směrem ke konkrétnímu antigenů a pryč od škodlivé reakce imunizací k nové reakci opačného Th typu.
Za některých okolností, při imunizaci zvířete Fc-antigenním fúzním proteinem, je užitečné použít nukleové kyseliny jako adjuvancia. Nukleové kyseliny, například oligonukleotidy obsahující sekvence obohacené cytosin-fosfodiesterová vazba-guanosin (CpG), mohou nasměrovat imunitní reakci směrem k Thl reakci a mohou volitelně být použity v kombinaci s dalšími adjuvancii, jako například cytokiny (viz například Brazolet et al. (1998) PROČ. NATF. ACAD. SCI. U.S.A. 95: 15 553-8, Liu et al. (1998) BLOOD 92: 3730-6 a Klinman et al. (1997) IMMUNOL. 158: 3 635-3 639). V souladu stím se předpokládá, že oligonukleotidy obsahující CpG mohou být společně podávány s Fc-antigenovou fúzí pro dosažení zesílené a příslušné modulované imunitní reakce. Takové molekuly nukleové kyseliny mohou být jakkoliv dlouhé, ale jsou výhodné nukleotidy další než 8 nukleotidů. Sekvence nukleové kyseliny výhodně obsahují sekvencí CpG a výhodněji sekvenci purin-purin-C-G-pyrimidin-pyrimidin, přičemž cytosiny v centrální CpG jsou nemethylovány. Frekvence CpG oligonukleotidů v DNA adjuvans je výhodně alespoň přibližně 5% a výhodněji přibližně 10%. Například jako adjuvans může být použity dvouvláknová forma oligodeoxynukleotidu TCCATGACGTTCCTGACGTT (sekv. id. č. 22). V závislosti na typu imunitní reakce, která je hledána, může být užitečné smíchat nukleovou kyselinu s alumem.
Předkládaný vynález používá obvyklou metodologii rekombinantní DNA pro tvorbu Fc fuzních proteinů použitelných v praxi vynálezu. Fc fúze konstrukty výhodně jsou tvořeny na úrovni DNA a výsledné DNA integrovány do expresních vektorů a exprimovány za vzniku Fc-antigenních nebo Fc-adjuvantních fúzních proteinů podle vynálezu. Jak se v tomto textu používá, termín „vektor“ označuje kteroukoliv nukleovou kyselinu obsahující nukleotidovou sekvenci kompetentní pro zavedení do hostitelské buňky a pro rekombinaci a integraci do genomu hostitelské buňky nebo pro autonomní replikaci jako epizom. Takové vektory zahrnují lineární nukleové kyseliny, plazmidy, fagemidy, kosmidy, RNA vektory, virové vektory apod. Neomezující příklady virových vektorů zahrnují retroviry, adenoviry a adeno-asociované viry. Jak se v tomto textu používá, termín „genová exprese“ nebo „exprese“ Fc fúzního proteinu označuje transkripci DNA sekvence, translaci mRNA transkriptů a sekreci Fc fúzního proteinového produktu. Fc fúzní proteiny obsahující IL2, CD26, Tat, Rev, OSF-2, bIG-H3, IgE receptor, PSMA nebo gpl20 byly exprimovány s použitím expresních systémů typů diskutovaných v tomto textu. Stejné nebo podobné expresní konstrukty jsou popsány v patentech Spojených Států US 5 541 087 a US 5 726 044.
Jako alternativa k fúzi proteinů technikami genetického inženýrství může být k fúzi proteinových skupin použita chemická konjugace s použitím obvyklých chemických zesíťovacích činidel.
Základní vektory použitelné v praxi vynálezu zahrnují selekční (tj. selektovatelný) markér, například gen kódující dihydrofolátreduktázu (DHFR), řízený transkripčními regulačními sekvencemi, pocházejícími například z viru SV40 a bakteriální plazmidové sekvence pro selekci a udržování plazmidů v E. coli. Exprese sekvencí Fc-fuzního proteinu je řízena promotorem a volitelně zesi- 14CZ 304884 B6 lujícímu sekvencemi, například cytomegalovirovým (CMV) promotorem a zesilujícími sekvencemi.
Jestliže Fc-fúzní protein nebo nukleová kyselina kódující tento fúzní protein má být podávána člověku, sekvence kódující Fc fúzní protein výhodně začínají ve směru od 5' k 3' „vedoucí sekvencí“ pocházející například z protilátkového lehkého (L) řetězce, fúzovanou ve shodném čtecím rámci alespoň s částí těžkého řetězce imunoglobulinu nebo její mutantní formou, výhodně z Fcyl úseku humánního imunoglobulinového gl genu. Fcyl úsek imunoglobulinového Fcyl genu výhodně zahrnuje alespoň část kloubové domény a CH3 domény a výhodněji zahrnuje alespoň kloubovou doménu, CH2 doménu a CH3 doménu. Jestliže Fc fúzní protein má být podáván myším, výhodné sekvence nukleové kyseliny kódující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu zahrnují sekvence nukleové kyseliny kódující ve směru od 5' do 3' kloubový úsek, CH2 doménu a CH3 doménu z myší IgG2a protilátky. Je-li nutné, je karboxy-koncová část konstantního úseku těžkého řetězce imunoglobulinu modifikována na úrovni nukleové kyseliny tak, aby byla možná ligace ve shodném čtecím rámci se sekvencemi kódujícími buď preselektovaný antigen (v případě Fc-antigenu) nebo imunostimulační cytokin (v případě Fc-adjuvantního cytokinu). DNA kódující sekreční kazetu může být ve své genomové konfiguraci nebo své cDNA konfiguraci.
Část DNA kódující signální sekvenci výhodně kóduje peptidový segment, který řídí sekreci Fc fúzního proteinu a potom je odštěpen od zbytku Fc fúzního proteinu. Signální sekvence podle vynálezu je polynukleotid, který kóduje aminokyselinovou sekvenci, která zahajuje transport proteinu přes membránu endoplazmatického retikula. Signální sekvence, které jsou použitelné ve vynálezu, zahrnují signální sekvence protilátkového lehkého řetězce, např. protilátky 14.18 (Gillies et al. (1989) J. of IMMUNOL. METH., 12: 191), signální sekvence protilátkového těžkého řetězce, např. signální sekvence těžkého řetězce protilátky MOPC141 (Sakano et al. (1980) NÁTUŘE 286: 5774) a každé další signální sekvence, které jsou v oboru známy (viz například Watson (1984) NUCLEIC ACIDS RESEARCH 12: 14).
Signální sekvence byly v oboru dobře charakterizovány a je známo, že typicky obsahují 16 až 30 aminokyselinových zbytků a mohou obsahovat více nebo méně aminokyselinových zbytků. Typický signální peptid se skládá ze tří úseků: základní N-koncový úsek, centrální hydrofobní úsek a polárnější C-koncový úsek. Centrální hydrofobní úsek obsahuje 4 až 12 hydrofobních zbytků, které ukotvují signální peptid přes membránovou lipidovou dvouvrstvu během transportu vznikajícího polypeptidu. Po iniciaci je signální peptid obvykle štěpen v lumen endoplazmatického retikula buněčnými enzymy známými jako signální peptidázy. Potenciální štěpná místa signálního peptidů obecně sledují „(-3, -1) pravidlo“. Tedy typický signální peptid má malé neutrální aminokyselinové zbytky v polohách -1 a -3 a postrádá prolinové zbytky v tomto úseku. Signální peptidáza štěpí tento signální peptid mezi -1 a +1 aminokyselinami. Tedy signální sekvence může být štěpena z amino-koncové části fúzního proteinu v průběhu sekrece. To má za následek sekreci Fc fúzního proteinu. Sekvence signálního peptidů použitelné v praxi vynálezu jsou v oboru dobře známy, (viz například von Heijne (1986) NUCLEIC ACIDS RES. 14: 4683).
Jak je odborníkovi zjevné, výhodnost konkrétní signální sekvence pro použití v sekreční kazetě může vyžadovat určité rutinní experimenty. Tyto experimenty mohou zahrnovat stanovení schopnosti signální sekvence řídit sekreci Fc fúzního proteinu a/nebo stanovení optimální konfigurace, genomové nebo cDNA, sekvence, která bude použita, aby se dosáhlo účinné sekrece Fc fúzních proteinů. Kromě toho je odborník schopen vytvořit umělý signální peptid sledující předložená pravidla (von Heijne, odkaz výše) a testovat takovou umělou signální sekvenci na účinnost rutinními experimenty. Termíny „signál sekvence“, „signální peptid“, „vedoucí sekvence“ nebo „vedoucí peptidy“ jsou v tomto textu použit změnitelně.
Předpokládá se, že může být použit velký počet různých způsobů podávání Fc fuzních proteinů nebo sekvencí nukleové kyseliny kódující fúzní protein k imunizaci příjemce proti preselektovanému antigenů. K vyvolání CTL reakcí mohou být použity dvě odlišné aplikace podle předkláda- 15CZ 304884 B6 ného vynálezu, jedna založená na injekci DNA kódující Fc-antigenní fuzní protein a druhá založená na podávání Fc-antigenního fúzního proteinu schopného dodat protein dráze MHC I. třídy.
Injekce antigenních proteinů je použita typicky, aby se vyvolala imunitní reakce u savců. Ale vynález také poskytuje způsoby dodání antigenů k APC injekcí DNA. Obecně používaná technika je injikovat DNA expresní vektory kódující antigenní protein do svalu. Publikace svědčí pro to, že antigenní protein je exprimován svalovými buňkami, ale že antigen není těmito buňkami prezentován imunitnímu systému. Místo toho se má za to, že specializované APC, například makrofágy a dendritické buňky, migrují do místa injekce, navážou a prezentují antigen procesem, který ještě nebyl upřesněn. Použití expresních vektorů pro Fc-antigenní fúzní protein činí tento postup účinnější, protože sekretovaný fúzní protein se váže účinněji k APC než nativní antigenní protein.
Jeden důsledek přístupu s injekcí DNA je, že může mít často za následek vyvolání jak humorální tak buněčné reakce. Typicky mají proteiny podávané exogenně obtížnější příležitost pro vstup do dráhy pro prezentaci na molekulách MHC I. třídy. Nicméně podávání Fc fúzních proteinů podle vynálezu zesílí vytváření cytotoxických buněk, pravděpodobně prezentací preselektovaného exogenního antigenů prostřednictvím MHC I. třídy. Kombinace DNA imunizace a proteinové imunizace může také působit synergicky, nejdříve instruovat imunitní systém a pak zesílit stupeň reakce ve formě jak produkce protilátek tak cytotoxických buněčných reakcí. Společné podávání Fcadjuvantního fúzního proteinu, například Fc-IL-2, Fc-GMCSF, Fc-IL-12 a ligandů Fc-Flt3, spolu s Fc-antigenním fúzním proteinem, zajistí společnou lokalizací fúzních proteinů do stejného buněčného kompartmentu APC, a tím stimulaci účinnější imunitní reakce proti preselektovanému antigenů.
Přípravky podle předkládaného vynálezu (tj. Fc-antigen a/nebo Fc-adjuvantní fúzní proteiny nebo sekvence nukleové kyseliny kódující tyto fúzní proteiny) mohou být poskytnuty zvířeti kterýmkoliv vhodným prostředkem, přímo (např. lokálně, jako injekcí, implantací nebo topickým podáváním do určitého místa tkáně) nebo systémově (např. parenterálně nebo perorálně). Kde má být přípravek poskytnut parenterálně, jako například intravenózním, subkutánním, oftalmickým, intraperitoneálním, intramuskulámím, bukálním, rektálním, vaginálním, intraorbitálním, transdermálním, intracerebrálním, intrakrainálním, intraspinálním, intraventrikulámím, intrathekálním podáváním, podáváním do cisteren, intrakapsulámím, intranazálním podáváním nebo podáváním aerosolu, obsahuje přípravek výhodně část vodné nebo fyziologicky kompatibilní tekuté suspenze nebo roztoku. Tedy nosič nebo vehikulum je fyziologicky přijatelné tak, že kromě aplikace požadovaného přípravku pacientovi neovlivní nijak nepříznivě pacientovu elektrolytovou rovnováhu a/nebo rovnovážný objem. Tekuté médium pro přípravek může tedy zahrnovat normální fyziologický roztok (např. 9,85% vodný NaCl, 0,15M, pH 7 až 7,4).
Výhodné dávky Fc—antigenního fuzního proteinu při podávání jsou v rozmezí 50 ng/m2 až 1 g/m2, výhodněji 5 pg/m2 až 200 mg/m2 a nejvýhodněji 0,1 mg/m2 až 50 mg/m2. Výhodné dávky Fc-adjuvantního fúzního proteinu při podávání jsou v rozmezí 1 ng/m2 až 0,1 g/m2, výhodněji 0,5 pg/m2 až 20 mg/m2 a nejvýhodněji 10 pg/m2 až 5 mg/m2. Výhodné dávky nukleových kyselin kódujících Fc-antigenní nebo Fc-adjuvantní fúzní proteiny při podávání jsou v rozmezí 1 pg/m2 až 100 mg/m2, výhodněji 20 pg/m2 až 10 mg/m2 a nejvýhodněji 400 pg/m2 až 4 mg/m2.
Předpokládá se, že maximální imunizace může být dosaženo prováděním četných samostatných imunizací, například jedna až tři inokulace přibližně 3 týdny až šest měsíců od sebe. Kromě toho, jak diskutováno výše, maximálních imunitních reakcí může být dosaženo za určitých okolností střídáním mezi podáváním Fc fúzních proteinů a nukleových kyselin kódujících tyto Fc fúzní proteiny. Předpokládá se, že Fc-antigenní fuzní protein nebo nukleová kyselina kódující fúzní protein může být podávána savci před podáváním Fc adjuvantního fúzního proteinu nebo nukleové kyseliny kódující Fc adjuvantní fúzní protein, současně s tímto podáváním nebo po něm. Předpokládá se ale, že optimální způsoby podávání, dávky a zesilovací režimy mohou být stanoveny rutinními experimenty v rozsahu schopností odborníka.
- 16CZ 304884 B6
Vynález je dále ilustrován následující příklady, které rozsah vynálezu nijak neomezují. Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Konstrukce expresních vektorů pro Fc-antigen a Fc-adjuvans
Aby se řádně otestovala imunogenicita Fc fuzních proteinů v myším modelu, byly konstruovány expresní vektory s použitím sekvencí nukleové kyseliny kódujících Fc úseky myšího IgG2a. To snížilo riziko, že Fc úsek každého fúzního proteinu indukuje u savce imunitní reakci. Kromě toho jako fúzní partneři v Fc-adjuvantních fuzních konstruktech byly použity myší cytokiny, protože jejich biologické aktivity mohou být vysoce specifické pro daný živočišný druh. Tedy vektory publikované dříve (Lo et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11: 495-500) byly modifikovány (viz obrázek 2) nahrazením humánní Fc sekvence IgGl sekvencemi cDNA kódující Fc myšího IgG2a (patent Spojených Států US 5 726 044).
Fc sekvence myšího IgG2a byly klonovány z knihovny myších splenocytů amplifikaci polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). PCR primery obsahovaly adaptérové sekvence pro spojení vedoucí sekvence na 5' konci, a unikátní restrikční místo Smal/Xmal na 3' konci pro ligaci se sekvencemi kódujícími buď antigeny nebo adjuvantní cytokiny. Antigen a adjuvantní (cytokinové) sekvence byly připraveny s místem 5' Smál a udržováním čtecího rámce mezi Fc a antigenem nebo adjuvantními proteiny a unikátním místem Xhol umístěným hned po translačním stop signálu.
Výsledný DNA konstrukt kódoval vedoucí sekvenci lehkého řetězce fúzovanou přímo ke kloubovému úseku H řetězce myšího IgG2a a pokračoval CH2 a CH3 exony myšího IgG2a a fuzním partnerem (buď antigen nebo adjuvantní cytokin). Transkripce byla řízena CMV promotorem/enhancerem, kteiý byl shledán použitelným pro expresi ve většině typů buněk v kultuře, a také pro expresi ve svalu a dalších typech buněk pro DNA injekci in vivo. Selekční markér, gen dihydrofolátreduktázy (DHFR), byl vložen do každého vektoru pro usnadnění selekce trvale transfekovaných klonů, a také sekvence nezbytné pro udržování plazmidové DNA v E. coli.
Následující názorné konstrukty Fc-antigenu byly tvořeny zavedením správně upravených sekvencí mezi unikátní místa Smál až Xhol ve vektoru nazvaném pdCs-muFc, kde „mu“ vyjadřuje, že Fc je myšího původu:
Ektodoména (extracelulámí část) humánního IL4 receptoru (IL-^1R) byla klonována z humánních monoklonálních buněk periferní krve (PBMC) PCR amplifikaci. Použité primery byly:
5' GTCCCGGGTATGAAGGTCTTGCAGGAGC (sekv. id. č. 1) a
5' CCCCTCGAGCTAGTGCTGCTCGAAGGGCTCCCTG (sekv. id. č. 2), které obsahovaly místa Smál a Xhol, v daném pořadí, pro inzerci do pdCs-muFc vektoru. PCR reakční podmínky použité pro toto a následující klonování jsou uvedené dále. Pro amplifikaci požadovaného genu(ů) byly použity Advantage KlenTaq a Polymeráz Mix (C lontech, Palo Alto, CA) a specifické primery. Reakční směsi obsahovaly lOmM Tris-HCl, pH 8,3, 50mM KC1, l,5mM MgCl2, 0,01% želatinu (hmotnost/objem), 0,2mM každý z dNTP a 1,25 jednotky KlenTaq v celkovém objemu 100 μί. Bylo prováděno třicet PCR cyklů, každý cyklus se skládal z tepelné denaturace v 94 °C po dobu 1 minuty, nasedání primerů ve 42 °C po dobu 45 sekund a prodlužování primerů v 72 °C po dobu 1 minuty. Amplifikovaný produkt pak byl subklonován do SK vektoru (Stratagene, San Diego, CA) a jeho DNA sekvence ověřena standardním sekvencováním.
- 17CZ 304884 B6
Ektodoména humánního membránového antigenu specifického pro prostatu (PSMA) byla klonována z buněčné linie LnCAP karcinomu prostaty (ATCC CRL1740) prostřednictvím PCR s použitím primerů:
5' AAGCTTAAATCCTCCAATGAAGC (sekv. id. č. 3) a
5' CTCGAGTTAGGCTACTTCACTCAAAG (sekv. id. č. 4), pro sense a anti-sense vlákna, v daném pořadí. DNA sekvence byla ověřena a PCR fragment vložen do pdCs-muFc vektoru za vzniku pdCs-muFc-PSMA fúzního konstruktu.
Ektodoména humánního EpCAM (také známá jako KS antigen), povrchového proteinu epitelové buňky zvýšeně exprimovaného na většině karcinomových buněk, byla klonována z LnCAP buněk prostřednictvím PCR s použitím primerů:
5' CCCCGGGTAAACAGGAAGAATGTGTCTGTG (sekv. id. č. 5) a 5' CTCGAGTCATTTTAGACCCTGCATTGAG (sekv. id. č. 6) pro sense a anti-sense vlákna, v daném pořadí. DNA sekvence byla ověřena standardním sekvencováním a PCR fragment byl vložen do vektoru pdCs-muFc za vzniku fúzního konstruktu pdCsmuFc-EpCAM. Další vektor byl konstruován s použitím EpCAM ektodomény, jako N-koncového fúzního partnera a v tomto případě PCR produkt obsahoval přirozenou vedoucí sekvenci z EpCAM cDNA a sekvenci zralé ektodomény na hranici membránou procházející domény (membránové domény). 3' konec tohoto PCR produktu obsahoval vložené AflII místo pro ligaci k 5' AflII místu myšího Fc fragmentu. Použité PCR primery zahrnovaly:
5' TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC (sekv. id. č. 7) a
5' CCTTAAGCACCCTGCATTGAGAATTCAG (sekv. id. č. 8).
V tomto případě, myší Fc postrádal 3' inzerění místo pro zavedení fúzního proteinu, ale obsahoval translační terminační signál na konci sekvence kódující Fc.
Relativně konzervativní část úseku HIV gp41 v blízkosti membrány, rozprostírající se od Hind III místa k lysinovému zbytku přilehlému k membránovému úseku, byla exprimována jako Fc fúzní protein, jako příklad krátké polypeptidové antigenové sekvence. Ačkoliv byla použita proteinová sekvence z kmene HIV IIIB, kódující sekvence byla optimalizována pro optimální expresi v eukaryotických buňkách s použitím kodonů s vysokým obsahem GC. DNA sekvence kódující aminokyselinové zbytky 626 až 669, která měla následující sekvenci: C CCG GGA TCC CTG ATC CAC TCC CTG ATC GAG GAA TCC CAG AAC CAG CAA GAG AAG AAC GAG CAG GAG CTG CTG GAG CTC GAC AAG TGG GCC TCC CTG TGG AAC TGG TTC AAC ATC ACC AAT TGG TGG TAC ATC AAG TGA CTCGAG (sekv. id. č. 9) byla syntetizována chemicky a ligována do vektoru pdCs-muFc. Aminokyselinová sekvence fúzovaného polypeptidu byla: SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK (sekv. id. č. 10).
Další sekvence kódující HTV protein byly použity pro konstrukci Fc-antigenních fúzních proteinů, jak bylo popsáno dříve (patenty Spojených Států US 5 541 087 a US 5 726 044) s použitím spíše Fc myšího IgG2a než původního Fc humánního IgGl. Tyto konstrukty představují další provedení vynálezu.
Řada Fc-adjuvantních (cytokinových) fúzních proteinů obsahujících Fc myšího IgG2a a několik myších cytokinů byla konstruována stejným způsobem jako Fc-antigenní fuzní proteiny. Specifické cytokiny a klonovací primery jsou diskutovány níže.
-18CZ 304884 B6
Myší IL-2 byl klonován z myších mononukleámích buněk periferní krve (PBMC) prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' GGCCCGGGTAAAGCACCCACTTCAAGCTCC (sekv. id. č. 11) a (antisense):
5' CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (sekv. id. č. 12).
Myší GMCSF byl klonován z myších PBMC prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' CCCGGGAAAAGCACCCGCCCGCTCACCC (sekv. id. č. 13) a (antisense):
5' CTCGAGTCATTTTTGGCTTGGTTTTTTGC (sekv. id. č. 14).
Myší ligand Flt3 byl klonován z myšího thymu prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' CAAGCTTACACCTGACTGTTACTTCAGC (sekv. id. č. 15) a (antisense):
5' CTCGAGTCAAGGCTCTGGGAGCTCCGTGGC (sekv. id. č. 16).
Myší IL-12 p35 byl klonován z myších PBMC prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (sekv. id. č. 17) a (antisense):
5' CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (sekv. id. č. 18).
Myší IL-12 p40 byl klonován z myších PBMC prostřednictvím PCR s použitím PCR primerů (sense):
5' TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (sekv. id. č. 19) a (antisense):
5' CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (sekv. id. č. 20).
Všechny PCR produkty, kromě myšího IL-12 p40, byly klonovány jako fragmenty Smal/Xhol, analyzovány standardním DNA sekvencováním a ligovány do vektoru pdCs-muFc obsahujícího jako svůj Fc úsek myší Fc IgG2A. PCR produkt myší IL-12 p40 byl exprimován odděleně (ne jako Fc fuzní protein) ve vektoru obsahujícím stejný CMV promotor enhancer, vedoucí sekvenci lehkého řetězce fúzovanou přímo ke zralé p40 podjednotce myšího IL-12 a gen rezistence na neomycin v místě selekčního markerového genu DHFR ve vektoru pdCs-muFc. Výsledný vektor byl nazván pNC-mp40, kde „N“ označuje gen pro selekci neomycinem.
Všechny plazmidové konstrukty indukovaly syntézu a sekreci specifických fúzních proteinů přechodnou expresí v buňkách 293 z lidské ledviny. Stručně, plazmidy byly zavedeny do monovrst- 19CZ 304884 B6 vy buněk 293 z lidské ledviny prostřednictvím koprecipitace s fosforečnanem vápenatým (Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING - A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, N.Y.). Buňky byly ponechány přes noc (16 hodin), promyty PBS a živeny čerstvým tkáňovým kultivačním médiem (DMEM obsahující 10% fetální bovinní sérum (FBS)). Po dalších 2 až 3 dnech bylo kultivační médium testováno na sekretované fuzní proteiny Fc specifickým testem ELISA (Gillies et al. (1989) J. IMMUNOL. METHODS 125: 191) s použitím protilátek specifických pro myší IgG-Fc protein. V případě myšího Fc-IL12 byly obě Fc-p35 a p40 DNA expresních plazmidů přechodně exprimovány ve stejné buněčné kultuře, takže heterodimemí cytokinový fúzní protein byl sestaven před sekrecí buňkou (Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160:6195).
Potom byly vytvořeny trvale transfekované buňky exprimující různé Fc fúzní proteiny vnesením linearizované DNA do myších myelomových buněk NS/0 standardní technikou elektroporace. Stručně, buňky byly suspendovány, v kyvetě přístroje Gene Pulser (BioRad) v koncentraci 107 buněk/ml a 0,5 ml suspenze bylo smícháno s 10 pg DNA a směs byla chlazena na ledu po dobu 10 minut. Elektroporace, byla prováděna, s použitím přístroje Gene Pulser (BioRad) s nastavením 0,25 V a 500 pF. Buňkybyly ponechány zotavit se na ledu po dobu 10 minut, pak byly resuspendovány v růstovém médiu a přeneseny na 96 jamkové destičky. Buňky byly živeny každé 2 až 3 dny selekčním médiem obsahujícím 0,lM monotrexát počínaje 2 dny po elektroporaci. Rezistentní kolonie rostoucí na 96 jamkových destičkách byly testovány na expresi testem ELISA podle protokolu pro Fc.
Pro expresi myšího Fc-IL12 fúzního proteinu byla transfekovaná buněčná linie NS/0 již exprimující p40 podjednotku myšího IL-12 transfekována, jak bylo popsáno výše, expresním vektorem s myší Fc-p35 podjednotkou. Linie exprimující p40 byla získána elektroporaci buněk NS/0 vektorem pNC-pm40, popsaným výše, a selekcí v médiu obsahujícím neomycinový analog 6 418 (Life Sciences Technologies). Po druhé transfekcí byl prováděn screening přežívajících buněčných klonů testem Fc ELISA a testem ELISA pro myší IL-12 (Genzyme, Cambridge, MA).
Strukturní integrita výsledných fúzních proteinů byla testována elektroforézou na SDSpolyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE). Nejprve byly fúzní proteiny navázány k malému objemu (10 až 20 pm na ml média) proteinu A Sepharose (Repligen, Needham, MA). Navázaná látka byla promyta PBS obsahujícím Tween-20 (0,01%), pak eluována v gelovém pufru obsahujícím SDS a pak 2 minuty povařena v přítomnosti 5% 2-merkaptoethanolu. Redukované proteiny pak byly analyzovány na SDS-PAGE gelech (předem nalitých) a obarveny modří Coomassie. Purifikace ve velkém měřítku ze stabilních buněčných klonů byly prováděny s použitím kolon protein A Sepharose (Repligen, Needham, MA) podle instrukcí výrobce.
Příklad 2
Imunogenicita Fc-antigenu a účinek chemického nebo Fc-cytokinového adjuvans na produkci protilátek
Konstrukce myší Fc-huIL-4R alfa podjednotky připravený v příkladu 1 byl použit jako antigen pro testování potenciálního účinku těchto proteinů na cílení APC ve zvířecím modelu. Ektodoména IL-4R alfa podjednotky představuje dost konzervativní molekulu mezi živočišnými druhy, která má více než z 50 % identické sekvence mezi člověkem a myší.
Skupinám myší, byly podány injekce 50 pg Fc-antigenního fúzního proteinu (Fc-IL-4R) subkutánně buď v PBS nebo emulgovaného ve Freundově kompletním adjuvans (CFA). Některé skupiny také dostaly dávku 5 pg (smícháno s Fc-IL-4R) Fc-adjuvantního proteinu, a to buď FcIL12 nebo Fc-GMCSF. Dva týdny později byla myším podána injekce stejné směsi, ale byla podána do peritoneální dutiny. CFA formulace tvoří micely, které slouží jako zdroj pomalu uvolňovaného antigenů, který umožňuje kontinuální stimulaci imunitního systému. Mycobakteriální
-20CZ 304884 B6 proteiny v CFA také indikují silnou zánětlivou reakci stimulací cytokinů, a tím dále zesilují imunitní reakci. CFA ale vyvolává vážné vedlejší účinky včetně poškození kůže, čímž je u lidí nepoužitelné. Ukazuje se ale, že směsi s Fc-adjuvantními fuzními proteiny v PBS, nevyvolávají žádnou viditelnou kožní reakci či jakoukoliv jinou zjevnou známku toxicity u zvířete.
Dva týdny po zesilovací injekci (tj. 28 dnů po první injekci) byla zvířatům odebrána krev a byla připravena séra tak, že se plná krev nechala srazit v mikrozkumavkách, buňky a sraženina se stočily při vysoké rychlosti 12 000 RPM po dobu 5 minut a byl získán supematant. Výsledná séra byla naředěna testovacím pufrem (PBS obsahující 0,01% Tween-20) a testována na protilátky reaktivní s humánním IL-4R. Byla prováděna antigen-specifícká ELISA s použitím 96jamkových destiček potažených humánním Fc-huIL-4R (100 μΐ o koncentraci 5 pg/ml v PBS bylo přidáno do každé jamky a inkubováno ve 4 °C přes noc). Antigenem potažené destičky pak byly promyty a blokovány blokujícím pufrem (1% BSA, 0,01% Tween-20 v PBS) před použitím. Naředěná testovaná séra byla inkubována v jamkách po dobu 2 hodin při teplotě místnosti, a pak byly jamky osmkrát promyty testovacím pufrem. Byla přidána sekundární proti-myší Fcspecifická protilátka konjugovaná s křenovou peroxidázou (ředění 1:2 000, Jackson ImmunoResearch) a destičky byly inkubovány další hodinu. Po osmi dalších promytích testovacím pufrem byl přidán roztok o-fenylendiamindihydrochloridu (OPD) obsahující 25mM kyselinu citrónovou, 50mM NaHPO4, pH 5 a 0,03% čerstvě přidaný H2O2. Reakce byla zastavena přibližně po 30 minutách přidáním 100 μΐ 4N (2M) H2SO4. Výsledné destičky byly odečítány ve 490 nm na přístroji pro odečítání destiček, který automaticky subtrahoval pozadí odečítané v 650 nm. Výsledky byly vyneseny do grafu jako optická denzita versus ředění antiséra. Relativní protilátkové titry byly určovány množstvím ředění séra, které bylo zapotřebí k tomu, aby se optická denzita snížila pod arbitrámí hodnotu, například 1 jednotku O.D.
Výsledky imunizačních protokolů jsou ukázány na obrázku 3. Injekce myšího Fc-IL-4R fúzního proteinu samotného v PBS podle tohoto protokolu indukovala protilátkovou reakci pouze u jedné myši (obrázek 3B). Přidání CFA ale mělo za následek více reagujících myší, ale titry byly zhruba stejné jako u reagujících myší, kterým byla podána injekce Fc-IL4R fuzního proteinu samotného v PBS (obrázek 3C). Společné podávání myšího Fc-IL2 adjuvans s Fc-IL4R v PBS indukovalo reakci u všech zvířat, ale množství vytvořené protilátky se v jednotlivých případech měnilo (obrázek 3D). Kombinace CFA a myšího Fc-IL2 adjuvans společně (obrázek 3A) mělo za následek vyšší protilátkové titry než každá sloučenina samotná (obrázky 3C a 3D). Společné podávání myšího Fc-GMCSF adjuvans v PBS indukovalo nejsilnější imunitní reakci ze všech skupin (obrázek 3E), včetně skupiny, která byla imunizována kombinací obou Fc-GMCSF adjuvans a CFA (obrázek 3F). Jinak řečeno, myší Fc-GMCSF adjuvans v PBS, když bylo podáváno společně s myším Fc-IL4R antigenem, odstranilo potřebu použití CFA. Předpokládá se, že takový způsob by být vhodnější pro použití u člověka.
Příklad 3
Účinek Fc-GMCSF adjuvantní dávky na protilátku vytvářenou proti karcinomovému antigenu, PSMA, v Fc-PSMA fúzním proteinu
PSMA v současné době představuje lákavý cílový antigen asociovaný s humánními nádory díky své omezené distribuci v normální tkáni. PMSA je v současnosti testován v klinických zkouškách jako uvažovaná nádorová vakcína. V tomto příkladě byla hodnocena imunogenicita PMSA antigenu v Fc-PMSA fúzním proteinu.
Myší Fc-PSMA fuzní protein byl připraven tak, jak bylo projednáno v příkladu 1. Skupinám myší byla podána subkutánně injekce 50 pg myšího Fc-PSMA v PBS, spolu s měnící se koncentrací Fc-adjuvantního fuzního proteinu Fc-GMCSF, a pak jim byla intraperitoneálně podána zesilovací injekce 14 dnů později. Protilátkové titry byly měřeny testem ELISA zachytávajícím Fc-PSMA antigen, jak bylo popsáno v příkladu 2 pro Fc-IL4R fuzní protein. Výsledky byly
-21 CZ 304884 B6 vyneseny do grafu na obrázku 4 jako protilátkový titr (ředění, ve kterém OD byla snížena k 1) versus čas po první injekci.
V nepřítomnosti Fc-GMCSF měly myši protilátkové titry proti PSMA v rozmezí od 1 000 do přibližně 20 000 (obrázek 4A). Společné podávání tak malého množství, jako 0,05 pg FcGMCSF ale mělo za následek titry v rozmezí od 30 000 do 140 000 (obrázek 5B). Desetinásobné zvýšení Fc-GMCSF dále stimulovalo protilátkové titry proti tomuto karcinomovému antigenů (obrázky 4C a 4D). Nejvyšší podaná dávka (5 pg Fc-GMCSF fúzního proteinu na myš) ještě stále představuje přibližně 2 pg GMCSF na injekci - dávka bez zjevného účinku na myší kůži nebo bez jakýchkoliv systémových příznaků, že bylo zvíře imunizováno (viz obrázek 4D). Kromě toho na rozdíl od CFA nebylo znatelné zvětšení sleziny.
Příklad 4
Účinek Fc-zprostředkovaného dodání PSMA na protilátkovou reakci na imunizaci
Specifické účinky Fc složky Fc-antigenních a Fc-adjuvantních fúzních proteinů byly testovány srovnáním indukované imunitní reakce u myší, kterým byla podána injekce fuzních proteinů, nefúzovaného antigenů nebo adjuvantních proteinů nebo směsi předchozích. Pro tento účel byl použit humánní PSMA systém.
Nefúzovaný PSMA byl připraven proteolytickým štěpením humánního Fc-PSMA fúzního proteinu (Lo et al. (1998) PROTEIN ENGINEERING 11: 495-500) plazmidem podle instrukcí výrobce. Uvolňovaný Fc a neštěpený Fc-PSMA byly odstraněny adsorpcí k proteinu A Sepharose (Repligen, Needham, MA).
Skupinám myší (n=3) byla podána injekce jedné subkutánní dávky 50 pg PSMA buď samotného (obrázek 5A) nebo v kombinaci s 0,2 pg volného GMCSF (obrázek 5B) nebo s 0,5 pg FcGMCSF (obrázek 5C) (0,5 pg Fc-GMCSF obsahuje přibližně 0,2 pg GMCSF). V dalším souboru myší byla každé myši podána injekce jedné subkutánní dávky 50 pg myšího Fc-PSMA fúzního proteinu samotného (obrázek 5D) nebo spolu s 0,2 pg volného GMCSF (obrázek 5C) nebo s 0,5 pg Fc-GMCSF (obrázek 5F). Všechny injekční formulace byly v PBS bez chemického adjuvans. Protilátky reaktivní s myším Fc-PSMA byly měřeny 14. den po imunizaci.
Důležitost Fc složky Fc-antigenního fúzního proteinu ve Fc-PSMA fúzním proteinu pro imunogenicitu PSMA byla nápadná, když zvířatům byla podána injekce PBS formulací bez chemických adjuvancí. V podstatě nebyla primární imunitní reakce na PSMA podávaný v PBS (obrázek 5A). Přidání GMCSF nebo Fc-GMCSF k imunizaci mělo velmi malý účinek (obrázky 5B a 5C), kromě slabé reakce u jednoho zvířete (obrázek 5B). Na rozdíl od toho zvířata, kterým byla podána injekce Fc-PSMA samotného vykazovala silnou primární imunitní reakci ve všech případech (obrázek 5D). Přidání volného GMCSF k Fc-PMSA slabě zesilovalo účinek (obrázek 5E), ale společné podávání obou antigenů a cytokinu jako Fc fúzních proteinů poskytlo nejvyšší stupeň reakce (obrázek 5F).
Tyto výsledky ukazují, že kombinace Fc-antigenu a Fc-adjuvans je obzvláště užitečná při vytváření imunitní reakce a prokazují zjevný prospěch společné lokalizace antigenů a stimulačního cytokinu in vivo, pravděpodobně k APC.
Příklad 5
Srovnání adjuvantních účinků fúzních proteinů Fc-GMCSF nebo Fc-Flt3L
-22CZ 304884 B6
Bylo ukázáno, že ligand pro Flt3, v oboru také nazývaný ligand Flt3 (Flt3L), má rozhodující úlohu při vytváření a maturaci dendritických buněk (Soligo et al. (1998) BR. J. HAEMATOL. 101: 352-63). Předpokládá se, že dendritické buňky, spolu s tkáňovými makrofágy, jsou nejdůležitější APC. Studie na myších prokázaly, že denní injekce po dobu 10 dnů zvyšují počet a APC aktivitu dendritických buněk navratitelných z lymfatické tkáně a sleziny a že tyto buňky jsou neobyčejně účinné při prezentaci antigenů oběma CD4+ a CD8+ T lymfocytům. Předpokládá se, Langheransovy buňky kůže představují jeden typ dendritických buněk schopných prezentace antigenů po vychytání a migraci do lokálních lymfatických uzlin. Protože se předpokládá, že většina dendritických buněk neexprimuje uspořádání Fc receptorů typicky zjišťované na makrofágu (např. FcyRI), nemůže být předpovězeno, zda by společný lokalizující účinek Fc fúzních proteinů zapojil tuto linii APC.
Aby se otestovalo, zda by Flt3L mohl působit jako adjuvans, skupinám myší byla podána injekce myšího Fc-PSMA a myšího Fc-Flt3L, spíše než použití myšího Fc-GMCSF fúzního proteinu (silný stimulátor makrofágů a granulocytů). V tomto případě bylo očekáváno, že jakýkoliv adjuvantní účinek bude zprostředkován aktivací a vychytáváním dendritických buněk, což bude mít nakonec za následek protilátkovou reakci na PMSA. Výsledky jsou shrnuty na obrázku 6.
Tato studie ukazuje, že myší Fc-Flt3L je silně adjuvans, které stimuluje anti-PSMA protilátky právě tak jako, jestli ne lépe, stejná dávka Fc-GMCSF. Výsledky podporují pozorování, že kombinace Fc-antigenu a Fc-adjuvans může být obzvláště účinná při indukci imunitní reakce. Výsledky také ukazují, že dendritické APC zjevně mohou být cíleny Fc-antigenem a Fc-cytokinem, a také makrofágem APC, což svědčí pro to, že na těchto buňkách je přítomná alespoň jedna forma Fc receptoru.
Příklad 6
Imunitní reakce na Fc-EpCAM a EpCAM-Fc fúzní proteiny
Další potenciálně důležitý humánní karcinomový antigen, EpCAM (také nazýván KSA a 17-1A antigen) byl produkován jako fúzní protein Fc úsekem myšího IgG2a s použitím plazmidů a metod, jak byly popsány v příkladu 1 a byl podáván buď samotný nebo v kombinaci s Fc-GMCSF jako adjuvans. Myším byla podána subkutánně injekce a po 3 týdnech zesilovací injekce 10 pg Fc-EpCAM a 1 pg Fc-GMCSF v PBS. Kontrolní myši nedostaly Fc-GMCSF. Titry protilátek namířených proti EpCAM byly měřeny 7 dnů (obrázek 7A) a 14 dnů (obrázek 7B) po zesilovací injekci. Výsledky ukazují, že Fc-EpCAM, když byl podáván samotný, je účinný imunogen (prázdné kosočtverce) a že Fc-GMCSF může dále zesílit reakci na tento antigen (plné trojúhelníčky).
Kromě toho byl EpCAM antigen exprimován v opačné orientaci vzhledem k Fc fragmentu jako EpCAM-muFc (viz příklad 1, obrázek 1B). Tato molekula byla použita k imunizaci Balb/c myší subkutánní injekcí. Byly použity vyšší dávky EpCAM-Fc fúzního proteinu (25 pg na dávku) a množství adjuvans (2,5 pg Fc-GMCSF) bylo zvýšeno také. Titry protilátek namířených proti EpCAM byly měřeny 14 dnů (obrázek 8A) a 21 dnů (obrázek 8B) po imunizaci. EpCAM-Fc fúzní protein samotný byl úplně imunogenní v nepřítomnosti Fc-GMCSF (obrázky 8A a 8B, (prázdné kosočtverce)). Přidání Fc-cytokinu zvýšilo protilátkové titry přibližně 3krát (obrázek 8A a 8B, (plné trojúhelníčky)).
Aby se otestovalo, zda by imunitní reakce proti EpCAM mohla chránit savce před nádorovými buňkami exprimujícími tento antigen, neimunizovaným myším nebo myším imunizovaným EpCAM-Fc fúzním proteinem (a v některých případech Fc-cytokiny) byla podána injekce do ocasní žíly 105 buněk CT26 myšího karcinomu tračníku transfekovaných humánním EpCAM (Gillies et al. (1998) J. IMMUNOL. 160: 6195). Po jedenadvaceti dnech byla zvířata utracena a rozsah plicních metastáz byl hodnocen (1) určováním stádia co se týče rozsahu na povrchu plic a
-23CZ 304884 B6 (2) zvážením plic a srovnáním s normálními plícemi zvířete, aby se zjistil rozdíl hmotnosti, jejíž zvýšení bylo připisováno nádorové mase. Výsledky shrnuté v tabulce 1 ukazují, že všechny imunizované myši vykazovaly statisticky významnou redukci nádorových metastáz ve srovnání s kontrolními myšmi, včetně zvířat imunizovaných EpCAM-Fc fuzním proteinem samotným. Podobné výsledky byly dosaženy s použitím Fc-EpCAM fúzního proteinu jako antigenu.
Tabulka 1
Ošetřovaná skupina | Skóre metastáz | Průměrná hmotnost plic |
Kontrolní skupina | 4, 4, 4, 1, 1 | 412+/-130 |
EpCAM-Fc | 0, 0, 0, 0, 0 | 210+/-21 |
EpCAM-Fc + Fc-GM | 0, 0, 0, 0, 0 | 240+/-19 |
EpCAM-Fc + FC-IL2 | 0, 0, 0, 0, 0 | 230+/-19 |
Skóre metastáz bylo založeno na rozsahu postižení povrchu plic s použitím následujícího hodnocení: 1 = 1 až 25% rozsah, 2 = 26 až 50% rozsah, 3 = 51 až 75% rozsah a 4 = 76 až 100% rozsah.
Příklad 7
Kombinace antigen-Fc a cytokinových adjuvans v jednom fúzním proteinu
Protein popsaný v příkladu 6, EpCAM-Fc, slouží za vzor N-koncového antigenu, připojeného k Fc úseku imunoglobulinu jako karboxylová proteinová doména. Tento protein a další jemu podobné mohou být společně podávány s Fc-adjuvantními fúzními proteiny, např. Fc-cytokiny, k zesilování imunitní reakce na antigen. Alternativně mohou být antigen, konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu a adjuvantní protein (například cytokin) tvořeny jako jeden fúzní protein, například jako EpCAM-Fc-GMCSF fúzní protein.
Expresní plazmid pro tento protein byl konstruován s použitím sekvencí myšího IgG2a Fc a GMCSF tak, že konstrukt mohl být hodnocen v myším modelu. Malý fragment Xbal až Smál obsahující sekvence kódující vedoucí sekvence-EpCAM-Fc byl získán z původního EpCAM-Fc expresního vektoru (příklad 1) a ligován do velkého fragmentu Smál až Xbal expresního vektoru Fc-GMCSF (obrázek 9).
Výsledný vektor, pdCs—EpCAM—Fc—GMCSF, byl zaveden do buněk 293 s použitím metody precipitace fosfátem vápenatým pro přechodnou expresi a do buněk NS/0 elektroporaci pro trvalou expresi. Stabilní transfektanty byly vybrány pěstováním buněk v médiu obsahujícím metotrexát (0,1 μΜ). Exprimující klony byly identifikovány testem Fc ELISA (viz příklad 1) a klony s vysokým stupněm produkce byly množeny v kultuře. EpCAM-Fc-GMCSF protein byl purifikován z kondicionovaných médií vazbou na protein A Sepharose a následnou eluci (Repligen, Needham, MA) a strukturní integrita byla analyzována SDS-PAGE po redukci 2-merkaptoethanolem. Výsledky ukázaly, že protein měl molekulární hmotnost přibližně 90 kD, jak bylo očekáváno pro jednořetězcovou fúzi EpCAM, Fc a GMCSF.
Aby se porovnala relativní imunogenícita kombinovaného fúzního proteinu, myším byla podána subkutánně injekce ekvivalentních dávek EpCAM-Fc-GMCSF a jednotlivých fúzních proteinů v kombinaci: EpCAM-Fc a Fc-GMCSF. Stejné injekce byly podávány 14 dnů později a vzorky séra byly testovány na specifickou protilátkovou reaktivitu na humánní EpCAM 7 dnů po zesilovací injekci. Stejný přístup může být použit pro jiný antigenní protein nebo peptid, a také pro jiné stimulační cytokiny, jako je například IL-2, IL-12 a Flt3L.
-24CZ 304884 B6
Příklad 8
Imunizace Fc-antigenem injekcí DNA
Stejné expresní vektory použité pro transfekci a produkci myších Fc-EpCAM a EpCAM-Fc v savčích buňkách (viz příklad 1) byly injikovány jako „nahá“ plazmidová DNA do svalu zadní končetiny skupiny myší Balb/c. DNA byla injikována v koncentraci 0,5 mg/ml a celkové množství 100 pg bylo podáváno buď v PBS nebo roztoku 25% (hmotnost/objem) sacharózy. Injekce byly opakovány každé 3 týdny do celkového množství 3 injekcí. Protilátkové reakce byly měřeny v různou dobu a byly kvantifikovány testem ELISA s použitím 96jamkových destiček potažených humánním Fc-EpCAM pro navázání antigenů a s použitím proti-myší Fc specifické polyklonální protilátky konjugované s HRP (Jackson ImmunoResearch) pro detekci. Data předložená na obrázku 10 představují protilátkové titry zaznamenávané 14 dnů (obrázek 10A), 27 dnů (obrázek 10B), 55 dnů (obrázek 10C) a 69 dnů (obrázek 10D) po injekci.
Výsledky předložené na obrázku 10 ukazují, že nízké titry specifické anti-EpCAM protilátky byly indukovány v průběhu prvního měsíce při použití obou formulací (obrázky 10A a 10B). Mnohem vyšší titry byly získány 55. den (obrázek 10C) a ještě vyšší hladiny 69. den (obrázek 10D). Podobné výsledky byly získány s použitím DNA injekce vektoru exprimujícího EpCAMFc, ačkoliv titry byly nižší. Tato data ukazují, že antigen exprimovaný jako fúzní molekula obsahující antigenní protein a Fc úsek imunoglobulinu může indukovat imunitní reakci, když je zaveden injekcí nahé DNA a že perzistentní expozice antigenů vede k oddáleným reakcím u většiny zvířat.
Buněčné imunitní reakce byly testovány pěstováním splenocytů z myší očkovaných DNA nebo imunizovaných proteinem (70 dnů po injekci) stimulovaných odlišnými koncentracemi FcEpCAM proteinu in vitro. Data ukázaná na obrázku 11 (homí panel) ukazují proliferativní reakci (měřenou inkorporací 3H-thymidinu) na antigen u zvířat imunizovaných buď Fc-EpCAM proteinem (křížky) nebo DNA vakcinací expresním vektorem CMVpromotor-EpCAM-Fc (prázdné kroužky) nebo expresním vektorem CMVpromotor-Fc-EpCAM (plné kosočtverce). Proteinem imunizovaná zvířata vykazovala mnohem větší reakce na antigen, dokonce i při velmi nízkých dávkách. Reakce u DNA vakcinovaných zvířat (také ukázány v odlišném měřítku na dolním panelu na obrázku 11) byly závislé na dávce, ale byly menší než u myší, kterým byla podána injekce proteinu. Tyto reakce byly charakteristické pro reakce CD4+ T lymfocytů omezených MHC II. třídy.
Aby se otestovala cytotoxická aktivita (obecný ukazatel reakcí T lymfocytů omezených MHC I. třídy), kultury splenocytů z myší imunizovaných DNA nebo proteinem byly pěstovány po dobu 5 dnů v přítomnosti přibližně 10 U/ml IL-2. Efektorové buňky byly pěstované splenocyty a cílové buňky byly buď značené buňky CT26 exprimující EpCAM humánního karcinomu tračníku (syngenní pro myši Balb/c) nebo značené parenterální buňky (netransfekované buňky CT26). Efektorové a cílové buňky byly smíchány v odlišných poměrech a byl určován rozsah lýzy. Hodnoty 100 % lýzy bylo dosaženo inkubací značených cílových buněk v přítomnosti detergentu a bylo měřeno množství uvolňované značky.
Výsledky jsou ukázány na obrázku 12, kde obrázek 12A ukazuje aktivitu splenocytů proti buňkám CT26 exprimujícím humánní EpCAM, zatímco obrázek 12B ukazuje aktivitu splenocytů proti parenterálním buňkám CT26. Na obou obrázcích prázdné kosočtverce představují splenocyty izolované z myší imunizovaných DNA nesoucí EpCAM konstrukt, prázdné čtverce představují splenocyty izolované z myší imunizovaných DNA nesoucí Fc-EpCAM fúzní konstrukt, prázdné trojúhelníky představují splenocyty izolované z myší imunizovaných DNA nesoucí EpCAM-Fc fuzní konstrukt a křížky představují splenocyty izolované z myší imunizovaných Fc-EpCAM fúzními proteiny.
-25CZ 304884 B6
Obrázek 12 ukazuje, že ačkoliv DNA vakcinace vyvolala slabé cytotoxické reakce proti oběma cílovým buňkám, významně vyšší cytotoxicita byla pozorována u myší imunizovaných proteinem. Oba druhy buněk, parenterální nádorové buňky CT26 a nádorové buňky CT26 exprimující EpCAM, byly v testu usmrceny. Cytotoxicita pozorovaná proti parenterálním buňkám CT26 může být proto, že tyto buňky exprimují vysoké hladiny myšího homologu EpCAM, který je přibližně z 81 % identický s humánním proteinem na aminokyselinové úrovni. Nicméně imunizace proteinem Fc-EpCAM nevyvolala významnou cytotoxickou aktivitu proti nádorovým buňkám CT26 exprimujícím humánní EpCAM, čímž se vysvětluje účinná protektivní aktivita proti nádorům popsaná v příkladu 6.
Příklad 9
Imunizace Fc-fuzním proteinem obsahujícím podoblast karcinomového antigenního proteinu
Ačkoliv některé celé proteiny nemusí být použitelné jako antigeny pro imunitní terapii, menší podoblasti proteinů mohou být daleko účinnější. Například proteiny obsahují domény, které jsou post-translačně modifikovány, aby byly učiněny méně imunogenní, a tím se sníží imunitní reaktivita na aktuální polypeptidové složky. Velké proteiny mohou indukovat protilátky, které reagují pouze s nepolypeptidovými částmi antigenů a které nezprostředkují buněčnou cytotoxicitu závislou na protilátkách (ADCC), potenciálně důležitou složku protinádorové imunitní reakce. Jako dobrý příklad této situace lze uvést proteoglykovaný antigen chondroitinsulfát (MCSP) specifický pro humánní melanom, který je exprimován fakticky na všech melanomech, a také u několika typů karcinomu mozku. Tento protein je hodně glykosylovaný aje dále modifikován připojením několika řetězců glykosaminoglykanu. Protilátka známá jako 9.2.27 (Bumol et al. (1982) PROČ. NATL. ACAD. SCI. 79: 1245-1249) váže tento protein s vysokou afinitou, ale nezprostředkovává žádnou efektorovou funkci, ani ADCC nebo cytotoxicitu zprostředkovanou komplementem (CDC). Dokonce i částečně humanizované (chimérické) formy této protilátky neuspěly při zprostředkování této aktivity.
Aby se vyvolaly více zaměřené reakce na optimální cílové úseky této velké molekuly, byla v proteinové sekvenci identifikována předpokládaná místa připojení glykanu. (Pluske et al (1996) PROČ. NATL. ACAD. SCI. USA 93: 9710-9715). Byla vybrána podoblast nedaleko od membránové sekvence a v určité vzdálenosti od místa připojení glykanu.
Peptidová sekvence: QGATLRLDPTVLDAGELANRTGSVPRFRLLEGRHGRVVRVPRARTEPGGSQLVEQFTQQDLEDGRLGLVGRPEGRAPGPAGD (sekv . id. č. 21) byla reverzně translatována, výsledná DNA sekvence byla syntetizována chemicky a ligována do expresního vektoru pdCs-Fc-X s použitím stejných restrikčních míst použitých v dřívějších příkladech. Místo terminace translace bylo přidáno na 3' konec, hned za sekvenci kódující poslední aminokyselinu, pak následovalo unikátní místo Xhol. Konečný expresní plazmid byl elektroporací zaveden do myelomových buněk NS/0 a stabilní transfektanty exprimující požadovaný protein byly získány tak, jak bylo popsáno v příkladu 1.
Protein Fc-MCSP byl purifíkován z tkáňových supematantů s použitím chromatografie s proteinem A Sepharose (Repligen, Needham, MA). Protilátkové titry byly měřeny u myší Balb/c subkutánně imunizovaných 50 pg Fc-MCSP fuzního proteinu v PBS buď samotného nebo v kombinaci s 5 pg Fc-GMCSF jako adjuvans. Výsledky jsou ukázány na obrázku 13. Plné kosočtverce představují protilátkové titry v normálním séru, prázdné čtverce představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP a plné trojúhelníky představují protilátkové titry v séru myší imunizovaných Fc-MCSP a Fc-GMCSF adjuvans.
Specifické imunitní reakce na tuto podoblast MCSP byly detekovány 14. den a významně se zvýšily po imunizaci zesilovací injekcí. Výsledky ukazují, že myši imunizované oběma Fc-26CZ 304884 B6
GMCSF a Fc-MCSP stimulovaly vyšší protilátkové titry proti MCSP (plné trojúhelníky) než myši imunizované Fc-MCSP samotným (prázdné čtverce).
Příklad 10
Imunizace Fc-fúzním proteinem obsahujícím virový antigen
Vývoj účinné vakcíny proti viru humánního imunodeficitu (HIV), viru, který způsobuje AIDS, je jeden z nej důležitějších cílů ve výzkumu vakcín. Nedávno několik publikací ukázalo, že určité vlastnosti virového obalu slouží k oklamání imunitní reakce, aby odpovídala na irelevantní epitopy, a tím se maskují důležité a potenciálně neutralizační úseky virové částice. To zahrnuje přítomnost vysoce imunodominantních antigenních úseků, které slouží jako návnady, a extenzivní glykosylaci, která fyzicky maskuje a redukuje imunogenicitu důležitých epitopů (Wyatt et al. (1998) NÁTUŘE 393: 705-11).
Jeden možný způsob, jak obejít mechanismus návnady, je exprimovat malé úseky gen virového obalu, aby se zabránilo imunodominantním reakcím, které nejsou protektivní a indukovala se neutralizační reakce. Jeden problém při použití vakcín s malými podjednotkami je snížená imunogenicita buď umělého peptidu, nebo malého proteinu. Jeden přístup byl kondenzovat proteiny nebo peptidy k imunogenním nosičským proteinům, jako je například hemokyanin přílipky (KLH). To indukovalo silnou reakci na KLH, a také na protein nebo peptid. Dalším přístupem je vyrobit fuzní protein s Fc, jak bylo popsáno v příkladu 1 pro podoblast, například elektrodoménu gp41 (kotvící doména virového obalu, gpl60). Na rozdíl od jiných nosičů je na úsek imunoglobulinu nahlíženo jako na vlastní („šelf‘) antigen, čímž se minimalizuje jakýkoliv imunodominantní účinek.
Fc-gp41pep626 fuzní konstrukt obsahoval polypeptid o 44 aminokyselinách fúzovaný ke karboxy-koncové části Fc úseku myšího imunoglobulinu. Sekvence HIV kmene IIIB v tomto úseku obsahuje signál pro N-vázanou glykosylaci, takže Fc-gp41pep626 fúzní protein, tvořený buď v buňkách 293 přechodnou expresí nebo v myelomových buňkách NS/0 trvalou transfekci, vykazoval vysoký stupeň variace v mobilitě při analýze SDS-PAGE, což indikovalo heterogenitu v rozsahu glykosylace.
Navzdory faktu, že tento virový antigen byl docela malý (dlouhý 44 aminokyselinových zbytků) a byl heterogenně glykosylován, bylo možné vyvolat imunitní reakci u myší Balb/c (viz obrázek 14). V tomto případě byla skupinám pěti myší podána intradermální injekce s 25 pg Fcgp41pep626 1. den a injekce s dvojnásobným množstvím ve dvoutýdenních intervalech, buď samotného (prázdné kosočtverce) nebo v kombinaci s 2,5 pg Fc-adjuvantních fúzních proteinů, Fc-GMCSF (prázdné čtverce) nebo Fc-IL2 (plné trojúhelníky). Obrázky 14A a 14B představují protilátkové titry dosažené 7 a 33 dnů po druhé zesilovací injekci, v daném pořadí.
Imunitní reakce byly více závislé na společném podávání Fc-cytokinů a trvalo déle dosáhnout vysoký titr. Předpokládá se, že větší imunitní reakce může být vyvolána s použitím modifikací této sekvence, která neobsahuje glykosylační signál (ve skutečnosti mnoho kmenů toto místo nekóduje) nebo enzymatickým odstraněním sacharidových vedlejších řetězců in vitro.
Příklad 11
Adjuvantní aktivita Fc-fuzního proteinu obsahujícího extracelulámí doménu molekuly buněčného povrchu
-27CZ 304884 B6
Pro konstrukci Fc-adjuvantních fúzních proteinů je někdy užitečné fúzovat k Fc extracelulámí doméně proteinu, kteiý může být vázán na membránu. Například je fúzován CD40 ligand (CD40L) v N-koncové části C-koncové části k Fc. Volitelně je použit linker.
CD40L je použitelný, protože jeho receptor, CD40, je exprimován na povrchu B lymfocytů a je zapojen do stimulace B lymfocytů lymfocyty T. Jako faktor nekrotizující nádory, je CD40L trimer, který způsobuje dimerizaci nebo trimerizaci svého receptorů na buněčném povrchu. Výsledkem je, že jsou domény intracelulámího receptorů přivedeny do kontaktu a z tohoto plyne signální transdukce. Také jako TNF, CD40L může být vázaný na membráně, ale může být také z buněčného povrchu odštěpen a působit jako cytokin.
Fc-CD40L fúzní protein je zvířatům podáván společně s Fc-antigenním fúzním proteinem. V kontrolních experimentech jsou Fc-CD40L protein a Fc-antigenní protein podávány odlišným skupinám zvířat. Předpokládá se, že zvířata, kterým byla podána injekce obou fúzních proteinů, tvoří vyšší titr protilátek než zvířata, kterým byla podána injekce každého fúzního proteinu jednotlivě.
Alternativně byl použit jeden Fc fuzní protein obsahující oba antigeny a CD40L skupinu, s volitelnými linkery (L) mezi Fc, CD40L a antigenovými skupinami. Fúzní protein může mít řádění od N-konce k C-konci Fc-(L)-antigen-(L)-CD40L, FC-(L)-CD40L-(L)-antigen, antigen-(L)-CD40L-(L)-Fc, CD40L-(L)-antigen-(L)-Fc, antigen-(L)-Fc-(L)-CD40L nebo CD40L-Fc-(L)-antigen-L). Fúzní protein obsahující Fc, antigen a CD40L je injikován zvířatům a pak jsou měřeny protilátkové titry. Předpokládá se, že protilátkové titry vyvolané injekcí fúzního proteinu s oběma CD40L a antigenem jsou vyšší než titry dosažené injekcí fúzních proteinů obsahující pouze Fc a antigen nebo Fc a CD40L.
Ve výše uvedeném podávání fúzních proteinů jsou zvířatům podávány injekce intravenózně, subkutánně nebo jiným vhodným způsobem podávání. Časy mezi primárním a zesilovacím podáváním antigenů a/nebo adjuvancí a měřením protilátkových titrů jsou stejné, jak byly popsány v předešlých příkladech. Alternativně jsou použity standardní dávky a testovací režimy. Ekvivalenty
Vynález může být prováděn v jiných specifických formách bez odchýlení se od vynálezecké myšlenky nebo jejích podstatných charakteristických vlastností. Předchozí provedení je tedy nutné považovat ve všech ohledech spíše za ilustrativní než za omezující vynález popsaný v tomto textu.
Rozsah vynálezu je tedy udán připojenými patentovými nároky včetně všech změn, které spadají do rozsahu patentových nároků ve smyslu ekvivalence.
Zahrnutí formou odkazu
Nauka všech patentových dokumentů a vědeckých publikací, na které se odkazuje výše, je v tomto textu výslovně zahrnuta formou odkazu.
Claims (12)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Kompozice pro vyvolání zesílené imunitní odpovědi proti peptidovému nebo proteinovému antigenů u savce, vyznačující se tím, že zahrnujei) fuzní protein postrádající variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu a zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojenou polypeptídovou vazbou k antigenů a ii) fúzní protein postrádající variabilní doménu těžkého řetězce imunoglobulinu a zahrnující konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu připojenou polypeptídovou vazbou k adjuvantnímu proteinu, přičemž konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu pocházejí ze stejného druhu a jsou schopny se vázat k Fc receptoru.
- 2. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje sekvence konstantní těžké oblasti lidského imunoglobulinu.
- 3. Kompozice podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že adjuvantem je cytokin.
- 4. Kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že cytokin je zvolen ze souboru sestávajícího z IFN-γ, IL-2, IL-Í, IL-12, IL-18, TNF a GMCSF.
- 5. Kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že cytokinem je GMCSF.
- 6. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se tím, že antigen je zvolen ze souboru sestávajícího z membránového antigenů specifického pro prostatu PSMA, ektodomény cytokinového receptoru, virového proteinu a antigenů specifického pro rakovinu.
- 7. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků laž6, vyznačující se tím, že každá konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu fůzního proteinu obsahuje pantovou oblast.
- 8. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků laž7, vyznačující se tím, že každá konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu fúzního proteinu obsahuje CH2 a CH3 doménu.
- 9. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků laž8, vyznačující se tím, že imunoglobulinovou částí každého fúzního proteinu je Fc.
- 10. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 pro výrobu vakcíny vyvolávající zesílenou imunitní odpověď u savce proti předem zvolenému antigenů použitému ve formě antigenového fúzního proteinu této kompozice.
- 11. Použití podle nároku 10, kde imunitní odpověď je silnější než když se podá antigenový fúzní protein bez adjuvantního fúzního proteinu této kompozice.
- 12. Použití podle nároku 11 nebo 12, kde fúzní proteiny se podávají současně.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14496599P | 1999-07-21 | 1999-07-21 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ2002182A3 CZ2002182A3 (cs) | 2003-11-12 |
CZ304884B6 true CZ304884B6 (cs) | 2015-01-07 |
Family
ID=22510982
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ2002-182A CZ304884B6 (cs) | 1999-07-21 | 2000-07-21 | Kompozice pro vyvolání zesílené imunitní odpovědi proti peptidovému nebo proteinovému antigenu u savce a její použití pro výrobu vakcíny |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7955590B2 (cs) |
EP (1) | EP1198250B8 (cs) |
JP (1) | JP4764585B2 (cs) |
KR (1) | KR100689739B1 (cs) |
CN (1) | CN1308037C (cs) |
AT (1) | ATE374042T1 (cs) |
AU (1) | AU779388B2 (cs) |
BR (1) | BR0012569A (cs) |
CA (1) | CA2378866C (cs) |
CZ (1) | CZ304884B6 (cs) |
DE (1) | DE60036552T2 (cs) |
DK (1) | DK1198250T3 (cs) |
ES (1) | ES2292457T3 (cs) |
HU (1) | HUP0202796A2 (cs) |
MX (1) | MXPA02000746A (cs) |
NO (1) | NO20020255L (cs) |
PL (1) | PL201664B1 (cs) |
PT (1) | PT1198250E (cs) |
RU (1) | RU2248214C2 (cs) |
SK (1) | SK782002A3 (cs) |
WO (1) | WO2001007081A1 (cs) |
ZA (1) | ZA200200501B (cs) |
Families Citing this family (116)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
ATE336514T1 (de) | 2000-02-11 | 2006-09-15 | Merck Patent Gmbh | Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen |
GB0102145D0 (en) | 2001-01-26 | 2001-03-14 | Scancell Ltd | Substances |
EP1363931A4 (en) * | 2001-02-01 | 2004-04-07 | Tanox Inc | METHODS OF PRODUCING AND IDENTIFYING MONOCLONAL ANTIBODIES DIRECTED AGAINST A LARGE NUMBER OF HUMAN ANTIGENS |
AU2002248571B2 (en) | 2001-03-07 | 2007-01-18 | Merck Patent Gmbh | Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety |
WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
JP4309662B2 (ja) | 2001-05-03 | 2009-08-05 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 腫瘍特異的組換え抗体およびその使用 |
KR101021124B1 (ko) * | 2001-05-24 | 2011-03-14 | 지모제넥틱스, 인코포레이티드 | Taci-면역글로불린 융합 단백질 |
EP2354791A1 (en) | 2001-12-04 | 2011-08-10 | Merck Patent GmbH | Immunocytokines with modulated selectivity |
DE10160248A1 (de) * | 2001-12-07 | 2003-06-26 | Alexander Cherkasky | Fusionsproteinen enthaltend Fc-Regionen |
US8029803B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-10-04 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
US8025873B2 (en) * | 2002-06-20 | 2011-09-27 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
CN1315536C (zh) * | 2002-09-13 | 2007-05-16 | 李进 | 肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物 |
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
US8007805B2 (en) * | 2003-08-08 | 2011-08-30 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens |
US20050069521A1 (en) * | 2003-08-28 | 2005-03-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins |
WO2005063282A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-14 | Centocor, Inc. | Anti-retroviral agents, compositions, methods and uses |
BRPI0418286A (pt) | 2003-12-30 | 2007-05-02 | Merck Patent Gmbh | proteìnas de fusão de il-7 |
EA011859B9 (ru) | 2004-01-05 | 2013-07-30 | Емд Лексиген Ресерч Сентер Корп. | Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени |
US7670595B2 (en) * | 2004-06-28 | 2010-03-02 | Merck Patent Gmbh | Fc-interferon-beta fusion proteins |
CA2591297C (en) * | 2004-12-09 | 2015-01-13 | Stephen D. Gillies | Il-7 variants with reduced immunogenicity |
WO2006106905A1 (ja) | 2005-03-31 | 2006-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 会合制御によるポリペプチド製造方法 |
US7566456B2 (en) * | 2005-06-23 | 2009-07-28 | Haiming Chen | Allergen vaccine proteins for the treatment and prevention of allergic diseases |
US20070104689A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-05-10 | Merck Patent Gmbh | Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens |
ZA200804078B (en) * | 2005-10-13 | 2009-09-30 | Virexx Medical Corp | Chimeric hepatitis C virus antigens for eliciting an immune response |
CN101351475B (zh) * | 2005-12-30 | 2013-05-15 | 默克专利有限公司 | 具有提高的稳定性的白细胞介素12p40变体 |
WO2007076927A1 (en) | 2005-12-30 | 2007-07-12 | Merck Patent Gmbh | Anti-il-6 antibodies preventing the binding of il-6 complexed with il-6ralpha to gp130 |
DK1966245T3 (da) | 2005-12-30 | 2011-07-18 | Merck Patent Gmbh | Anti-CD19-Antistoffer med reduceret immunogenicitet |
EP4218801A3 (en) * | 2006-03-31 | 2023-08-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody modification method for purifying bispecific antibody |
US11046784B2 (en) * | 2006-03-31 | 2021-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies |
WO2008122039A2 (en) | 2007-04-02 | 2008-10-09 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Selenocysteine mediated hybrid antibody molecules |
ES2687808T3 (es) | 2007-09-26 | 2018-10-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Región constante de anticuerpo modificado |
MX2010003329A (es) | 2007-09-26 | 2010-04-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpo anti-receptor de il-6. |
SI2202245T1 (sl) | 2007-09-26 | 2016-10-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Postopek modificiranja izoelektrične točke protitelesa preko aminokislinske substitucije v CDR |
KR101643005B1 (ko) * | 2007-12-05 | 2016-07-28 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항nr10 항체 및 그의 이용 |
PL2275443T3 (pl) * | 2008-04-11 | 2016-05-31 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Cząsteczka wiążąca antygen zdolna do wiązania dwóch lub więcej cząsteczek antygenu w sposób powtarzalny |
US8383767B2 (en) * | 2008-06-27 | 2013-02-26 | Academia Sinica | Immunogenic protein carrier containing an antigen presenting cell binding domain and a cysteine-rich domain |
TWI440469B (zh) * | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
JP5717624B2 (ja) | 2009-03-19 | 2015-05-13 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
TWI544077B (zh) | 2009-03-19 | 2016-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antibody constant region change body |
CN102405230A (zh) | 2009-04-22 | 2012-04-04 | 默克专利有限公司 | 具有修饰的FcRn结合位点的抗体融合蛋白 |
CN102459344A (zh) | 2009-05-15 | 2012-05-16 | 中外制药株式会社 | 抗axl抗体 |
EA017172B1 (ru) * | 2009-08-04 | 2012-10-30 | Государственное Учреждение "Республиканский Научно-Практический Центр Трансфузиологии И Медицинских Биотехнологий" | Способ получения изоиммунной плазмы крови |
EP2481752B1 (en) | 2009-09-24 | 2016-11-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Modified antibody constant regions |
GB0922209D0 (en) | 2009-12-18 | 2010-02-03 | Univ Nottingham | Proteins, nucleic acid molecules and compositions |
WO2011108714A1 (ja) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
CN103596587B (zh) * | 2010-10-28 | 2016-09-07 | 健康和人类服务部秘书长代表的美利坚合众国政府 | 纤丝病毒融合蛋白及其应用 |
KR101398363B1 (ko) | 2010-11-17 | 2014-05-22 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 혈액응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 기능을 갖는 다중특이성 항원 결합 분자 |
MX365235B (es) | 2010-11-30 | 2019-05-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molécula de unión a antígeno capaz de unir repetidamente a la pluralidad de moléculas de antígeno. |
EP2679681B2 (en) | 2011-02-25 | 2023-11-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | FcgammaRIIB-specific FC antibody |
CN102212139A (zh) * | 2011-03-29 | 2011-10-12 | 中国人民解放军第二军医大学 | 森林脑炎病毒包膜E蛋白与人抗体Fc段融合蛋白及其用途 |
TW201817745A (zh) | 2011-09-30 | 2018-05-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有促進抗原清除之FcRn結合域的治療性抗原結合分子 |
US20150050269A1 (en) | 2011-09-30 | 2015-02-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities |
AR091902A1 (es) | 2012-07-25 | 2015-03-11 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Formulacion liquida de un conjugado de insulina de accion prolongada |
MX2015012461A (es) * | 2013-03-15 | 2016-08-08 | Bioven 3 Ltd | Proteinas sintéticas autoensamblables. |
CN103212069B (zh) * | 2013-05-13 | 2014-07-30 | 上海赛伦生物技术有限公司 | 可提高抗体滴度的免疫佐剂、其制备方法及应用 |
JP6442404B2 (ja) | 2013-06-11 | 2018-12-19 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター | 再発寛解型多発性硬化症(rrms)患者の治療予後予測方法、及び新規治療適応判断方法 |
EP3017048A4 (en) * | 2013-07-01 | 2017-05-17 | University of Maryland, College Park | Fc coupled compositions and methods of their use |
AU2014312215B2 (en) * | 2013-08-28 | 2020-02-27 | Abbvie Stemcentrx Llc | Site-specific antibody conjugation methods and compositions |
EP3050896B1 (en) | 2013-09-27 | 2021-07-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing polypeptide heteromultimer |
GB201403775D0 (en) | 2014-03-04 | 2014-04-16 | Kymab Ltd | Antibodies, uses & methods |
US9738702B2 (en) | 2014-03-14 | 2017-08-22 | Janssen Biotech, Inc. | Antibodies with improved half-life in ferrets |
EP3180020B1 (en) | 2014-08-11 | 2018-12-26 | Delinia, Inc. | Modified il-2 variants that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases |
MA40764A (fr) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité |
TW201627318A (zh) * | 2014-10-22 | 2016-08-01 | 臺北醫學大學 | 膽固醇酯轉運蛋白抗原肽及其融合蛋白以及其組合物及應用 |
EA201791366A1 (ru) | 2014-12-19 | 2018-02-28 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Антитела к c5 и способы их применения |
KR102650420B1 (ko) | 2014-12-19 | 2024-03-21 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법 |
US9969800B2 (en) | 2015-02-05 | 2018-05-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | IL-8 antibodies |
CA2972393A1 (en) | 2015-02-27 | 2016-09-01 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Composition for treating il-6-related diseases |
US11142587B2 (en) | 2015-04-01 | 2021-10-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing polypeptide hetero-oligomer |
JP7019423B2 (ja) | 2015-05-06 | 2022-02-15 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | 前立腺特異的膜抗原(psma)二重特異性結合剤及びその使用 |
US10697883B2 (en) | 2015-05-19 | 2020-06-30 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for determining application of therapy to multiple sclerosis (MS) patient |
US10857228B2 (en) * | 2015-06-10 | 2020-12-08 | The University Of Tokyo | Adjuvant for vaccines, vaccine, and immunity induction method |
US11359009B2 (en) | 2015-12-25 | 2022-06-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-myostatin antibodies and methods of use |
MX2018007781A (es) | 2015-12-28 | 2018-09-05 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Metodo para promover la eficiencia de purificacion del polipeptido que contiene la region de fragmento cristalizable (fc). |
US20170204154A1 (en) | 2016-01-20 | 2017-07-20 | Delinia, Inc. | Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune diseases |
KR20180116215A (ko) | 2016-03-14 | 2018-10-24 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 암의 치료에 이용하기 위한 세포상해 유도 치료제 |
US9567399B1 (en) | 2016-06-20 | 2017-02-14 | Kymab Limited | Antibodies and immunocytokines |
CN106177932A (zh) * | 2016-07-03 | 2016-12-07 | 查文娟 | 一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的疫苗 |
EP3494991A4 (en) | 2016-08-05 | 2020-07-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8 |
SG10201607778XA (en) | 2016-09-16 | 2018-04-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use |
EP3534947A1 (en) | 2016-11-03 | 2019-09-11 | Kymab Limited | Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods |
EP3538548A4 (en) | 2016-11-08 | 2020-08-19 | Delinia, Inc. | IL-2 VARIANTS FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US11851486B2 (en) | 2017-05-02 | 2023-12-26 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils |
JP7235249B2 (ja) | 2017-10-20 | 2023-03-08 | 学校法人兵庫医科大学 | 抗il-6受容体抗体を含有する術後の癒着を抑制するための医薬組成物 |
SG11202005732XA (en) | 2017-12-19 | 2020-07-29 | Xencor Inc | Engineered il-2 fc fusion proteins |
CN110028588A (zh) * | 2018-01-11 | 2019-07-19 | 上海细胞治疗研究院 | 抗原-Fc融合蛋白及其检测阳性CAR-T细胞的应用 |
CN111989117A (zh) * | 2018-02-14 | 2020-11-24 | 维埃拉生物股份有限公司 | 麦克唐纳猫肉瘤(fms)样酪氨酸激酶3受体配体(flt3l)的抗体及其用于治疗自身免疫性疾病和炎性疾病的用途 |
TWI827585B (zh) | 2018-03-15 | 2024-01-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體及其使用方法 |
US11529413B2 (en) | 2018-06-12 | 2022-12-20 | Kbio Holdings Limited | Virus and antigen purification and conjugation |
US11690907B2 (en) | 2018-06-12 | 2023-07-04 | Kbio Holdings Limited | Vaccines formed by virus and antigen conjugation |
US11696948B2 (en) | 2018-06-12 | 2023-07-11 | Kbio Holdings Limited | Vaccines formed by virus and antigen conjugation |
BR112020025250A2 (pt) | 2018-06-12 | 2021-03-09 | Kentucky Bioprocessing, Inc. | Purificação e conjugação de vírus e antígeno |
CA3103975A1 (en) * | 2018-06-21 | 2019-12-26 | Shattuck Labs, Inc. | Heterodimeric proteins and uses thereof |
MX2021002289A (es) * | 2018-08-29 | 2021-05-27 | Shattuck Labs Inc | Proteinas quimericas basadas en flt3l. |
SG11202102777PA (en) | 2018-09-27 | 2021-04-29 | Xilio Development Inc | Masked cytokine polypeptides |
SG11202103192RA (en) | 2018-10-03 | 2021-04-29 | Xencor Inc | Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins |
WO2020118605A1 (zh) * | 2018-12-13 | 2020-06-18 | 丁邦 | 抗体-肿瘤坏死因子α融合蛋白及其制法和应用 |
CN113811549A (zh) | 2019-02-21 | 2021-12-17 | Xencor股份有限公司 | 非靶向和靶向性il-10 fc融合蛋白 |
WO2020198661A1 (en) * | 2019-03-28 | 2020-10-01 | Orionis Biosciences, Inc. | Chimeric proteins and chimeric protein complexes directed to fms-like tyrosine kinase 3 (flt3) |
EP3969119A1 (en) | 2019-05-17 | 2022-03-23 | Xencor, Inc. | Il-7-fc-fusi0n proteins |
EP4037700A2 (en) | 2019-10-03 | 2022-08-10 | Xencor, Inc. | Targeted il-12 heterodimeric fc-fusion proteins |
CN114945586A (zh) * | 2020-01-21 | 2022-08-26 | 张晋宇 | 一种药物组合物及其用途 |
US20230110839A1 (en) * | 2020-02-28 | 2023-04-13 | Celltrion Inc. | Varicella zoster virus fusion protein and immunogenic composition comprising same |
AU2021245922A1 (en) * | 2020-04-01 | 2022-10-13 | Xilio Development, Inc. | Masked IL-2 cytokines and their cleavage products |
CN115996750A (zh) * | 2020-04-21 | 2023-04-21 | Kbio控股有限公司 | 通过病毒和抗原偶联形成的疫苗 |
CN118267456A (zh) * | 2020-07-01 | 2024-07-02 | 中国科学院生物物理研究所 | 融合蛋白疫苗平台的构建与应用 |
TWI815194B (zh) | 2020-10-22 | 2023-09-11 | 美商基利科學股份有限公司 | 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法 |
US20240190962A1 (en) * | 2020-12-23 | 2024-06-13 | Immunowake Inc. | Immunocytokines and uses thereof |
IL305333A (en) * | 2021-03-04 | 2023-10-01 | Helix Nanotechnologies Inc | Compositions comprising SBI adjuvant materials and methods of using them |
CN115137812A (zh) * | 2021-03-31 | 2022-10-04 | 中国科学院生物物理研究所 | 融合蛋白疫苗平台的构建与应用 |
CN116375881A (zh) * | 2021-12-31 | 2023-07-04 | 广州国家实验室 | 融合蛋白疫苗 |
WO2023178169A2 (en) * | 2022-03-15 | 2023-09-21 | Anemoi Biotech Holdings, Inc. | Compositions and methods for treating the pathophysiology of severe viral infection |
WO2023224914A1 (en) * | 2022-05-16 | 2023-11-23 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Assessing and treating caveolinopathy diseases |
CN114699521B (zh) * | 2022-06-07 | 2023-02-24 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 基于金属硫蛋白家族的免疫佐剂及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997024137A1 (en) * | 1995-12-28 | 1997-07-10 | Tanox Biosystems, Inc. | HYBRID WITH INTERFERON-α AND AN IMMUNOGLOBULIN Fc LINKED THROUGH A NON-IMMUNOGENIC PEPTIDE |
WO1999033868A2 (en) * | 1997-12-24 | 1999-07-08 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Human papillomavirus vaccine |
Family Cites Families (201)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US650064A (en) * | 1898-11-14 | 1900-05-22 | Kitson Hydrocarbon Heating And Incandescent Lighting Company | System of liquid distribution. |
US3941763A (en) * | 1975-03-28 | 1976-03-02 | American Home Products Corporation | PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates |
US4196265A (en) | 1977-06-15 | 1980-04-01 | The Wistar Institute | Method of producing antibodies |
US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
US4469797A (en) | 1982-09-23 | 1984-09-04 | Miles Laboratories, Inc. | Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
NZ210501A (en) | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
US4703008A (en) | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
KR850004274A (ko) | 1983-12-13 | 1985-07-11 | 원본미기재 | 에리트로포이에틴의 제조방법 |
US5082658A (en) | 1984-01-16 | 1992-01-21 | Genentech, Inc. | Gamma interferon-interleukin-2 synergism |
EP0158198A1 (en) | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
US5189015A (en) | 1984-05-30 | 1993-02-23 | Alfa-Laval Agri International Ab | Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability |
US5077204A (en) * | 1984-06-21 | 1991-12-31 | Chiron Corporation | Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use |
US5807715A (en) | 1984-08-27 | 1998-09-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin |
GR860984B (en) * | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
US4690915A (en) | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
US5679543A (en) | 1985-08-29 | 1997-10-21 | Genencor International, Inc. | DNA sequences, vectors and fusion polypeptides to increase secretion of desired polypeptides from filamentous fungi |
US5643565A (en) | 1985-09-20 | 1997-07-01 | Chiron Corporation | Human IL-2 as a vaccine adjuvant |
US4676980A (en) | 1985-09-23 | 1987-06-30 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Target specific cross-linked heteroantibodies |
US4935233A (en) | 1985-12-02 | 1990-06-19 | G. D. Searle And Company | Covalently linked polypeptide cell modulators |
US5359035A (en) | 1985-12-21 | 1994-10-25 | Hoechst Aktiengesellschaft | Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) |
DE3712985A1 (de) | 1987-04-16 | 1988-11-03 | Hoechst Ag | Bifunktionelle proteine |
EP0237019A3 (en) | 1986-03-14 | 1988-03-09 | Toray Industries, Inc. | Interferon conjugate and production thereof using recombinant gene |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
DK173067B1 (da) | 1986-06-27 | 1999-12-13 | Univ Washington | Humant erythropoietin-gen, fremgangsmåde til ekspression deraf i transficerede cellelinier, de transficerede cellelinier sa |
US4894227A (en) | 1986-08-01 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Composition of immunotoxins with interleukin-2 |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5508031A (en) | 1986-11-21 | 1996-04-16 | Cetus Oncology Corporation | Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2 |
US4987071A (en) | 1986-12-03 | 1991-01-22 | University Patents, Inc. | RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods |
US5019368A (en) | 1989-02-23 | 1991-05-28 | Cancer Biologics, Inc. | Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy |
DE3883899T3 (de) | 1987-03-18 | 1999-04-22 | Sb2, Inc., Danville, Calif. | Geänderte antikörper. |
US5091513A (en) | 1987-05-21 | 1992-02-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
US5258498A (en) | 1987-05-21 | 1993-11-02 | Creative Biomolecules, Inc. | Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins |
DE3856559T2 (de) | 1987-05-21 | 2004-04-29 | Micromet Ag | Multifunktionelle Proteine mit vorbestimmter Zielsetzung |
ATE122238T1 (de) | 1987-06-10 | 1995-05-15 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Bifunktionelle antikörperkonstruktionen und verfahren zur selektiven tötung von zellbeständen. |
US5064646A (en) | 1988-08-02 | 1991-11-12 | The University Of Maryland | Novel infectious bursal disease virus |
EP0305967B1 (de) | 1987-09-02 | 1993-05-05 | Ciba-Geigy Ag | Konjugate von Interferon alpha mit Immunglobulinen |
US5677425A (en) | 1987-09-04 | 1997-10-14 | Celltech Therapeutics Limited | Recombinant antibody |
DE3850542T2 (de) | 1987-09-23 | 1994-11-24 | Bristol Myers Squibb Co | Antikörper-Heterokonjugate zur Töting von HIV-infizierten Zellen. |
NZ226414A (en) | 1987-10-02 | 1992-07-28 | Genentech Inc | Cd4 peptide adhesion variants and their preparation and use |
AU2635088A (en) | 1987-12-04 | 1989-06-08 | Du Pont Merck Pharmaceutical Company, The | Immobilized interleukin 2 and interleukin 2 containing a carboxyl-terminal extension |
WO1989006692A1 (en) | 1988-01-12 | 1989-07-27 | Genentech, Inc. | Method of treating tumor cells by inhibiting growth factor receptor function |
CA1341588C (en) | 1988-01-26 | 2009-01-06 | Michel Revel | Human ifn-beta2/i1-6, its purification and use |
JP2643968B2 (ja) | 1988-02-03 | 1997-08-25 | サントリー株式会社 | Kex2エンドプロテアーゼ及びその製造方法 |
US5234830A (en) | 1988-02-03 | 1993-08-10 | Suntory Limited | DNA encoding a KEX2 endoprotease without a C-terminal hydrophobic region |
US5120525A (en) | 1988-03-29 | 1992-06-09 | Immunomedics, Inc. | Radiolabeled antibody cytotoxic therapy of cancer |
IE62463B1 (en) | 1988-07-07 | 1995-02-08 | Res Dev Foundation | Immunoconjugates for cancer diagnosis and therapy |
US5601819A (en) | 1988-08-11 | 1997-02-11 | The General Hospital Corporation | Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding |
US5457038A (en) | 1988-11-10 | 1995-10-10 | Genetics Institute, Inc. | Natural killer stimulatory factor |
US5242824A (en) | 1988-12-22 | 1993-09-07 | Oncogen | Monoclonal antibody to human carcinomas |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5116964A (en) | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
US5225538A (en) | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5166322A (en) | 1989-04-21 | 1992-11-24 | Genetics Institute | Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof |
US6750329B1 (en) | 1989-05-05 | 2004-06-15 | Research Development Foundation | Antibody delivery system for biological response modifiers |
IE63847B1 (en) | 1989-05-05 | 1995-06-14 | Res Dev Foundation | A novel antibody delivery system for biological response modifiers |
SE8901687D0 (sv) | 1989-05-11 | 1989-05-11 | Alfa Laval Agri Int | Fibronectin binding protein as well as its preparation |
US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
ATE123065T1 (de) * | 1989-07-07 | 1995-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Proteine und deren herstellung. |
JP3485184B2 (ja) * | 1989-07-14 | 2004-01-13 | アメリカン サイアナミド カンパニー | インターロイキン含有安定ワクチン組成物 |
US5073627A (en) | 1989-08-22 | 1991-12-17 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
EP0939121B2 (de) | 1989-09-12 | 2007-12-26 | AHP Manufacturing B.V. | TFN-bindende Proteine |
US5856298A (en) | 1989-10-13 | 1999-01-05 | Amgen Inc. | Erythropoietin isoforms |
DK0790309T3 (da) | 1989-12-22 | 2007-11-05 | Hoffmann La Roche | Cytotoksisk 40kD underenhed af lymfocytmodningsfaktor og monoklonale antistoffer rettet derimod |
US5314995A (en) | 1990-01-22 | 1994-05-24 | Oncogen | Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins |
US5349053A (en) * | 1990-06-01 | 1994-09-20 | Protein Design Labs, Inc. | Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses |
US7253264B1 (en) | 1990-06-28 | 2007-08-07 | Sanofi-Arentideutschland GmbH | Immunoglobulin fusion proteins, their production and use |
US5650150A (en) | 1990-11-09 | 1997-07-22 | Gillies; Stephen D. | Recombinant antibody cytokine fusion proteins |
US5709859A (en) | 1991-01-24 | 1998-01-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Mixed specificity fusion proteins |
CA2105863A1 (en) * | 1991-03-11 | 1992-09-12 | Guy L. Reed | Compositions and methods to inhibit the activation of active factor xiii |
US6072039A (en) | 1991-04-19 | 2000-06-06 | Rohm And Haas Company | Hybrid polypeptide comparing a biotinylated avidin binding polypeptide fused to a polypeptide of interest |
AU651228B2 (en) | 1991-05-31 | 1994-07-14 | Genentech Inc. | Treatment of HIV-associated immune thrombocytopenic purpura |
US5199942A (en) | 1991-06-07 | 1993-04-06 | Immunex Corporation | Method for improving autologous transplantation |
EP0601043B1 (en) | 1991-08-30 | 1998-11-25 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Hybrid cytokines |
US20020037558A1 (en) | 1991-10-23 | 2002-03-28 | Kin-Ming Lo | E.coli produced immunoglobulin constructs |
US6627615B1 (en) | 1991-12-17 | 2003-09-30 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for in vivo gene therapy |
DK0654085T3 (da) | 1992-01-23 | 1997-09-22 | Merck Patent Gmbh | Monomere og dimere antistof-fragment-fusionsproteiner |
DE69333433T2 (de) | 1992-04-01 | 2004-12-02 | The Rockefeller University | Verfahren zur in vitro kultivierung dendritischer vorläuferzellen und deren verwendung zur immunogen herstellung |
CA2131003A1 (en) | 1992-05-26 | 1993-12-09 | Raymond G. Goodwin | Novel cytokine that binds cd30 |
AU4528493A (en) | 1992-06-04 | 1994-01-04 | Regents Of The University Of California, The | In vivo gene therapy with intron-free sequence of interest |
US5614184A (en) | 1992-07-28 | 1997-03-25 | New England Deaconess Hospital | Recombinant human erythropoietin mutants and therapeutic methods employing them |
EP0671926B1 (en) | 1992-08-11 | 2002-11-13 | President And Fellows Of Harvard College | Immunomodulatory peptides |
DE4228839A1 (de) | 1992-08-29 | 1994-03-03 | Behringwerke Ag | Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Mediatoren |
EP0668777B2 (en) | 1992-11-05 | 2011-02-09 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Prostate-specific membrane antigen |
US5738849A (en) | 1992-11-24 | 1998-04-14 | G. D. Searle & Co. | Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them |
US5543297A (en) | 1992-12-22 | 1996-08-06 | Merck Frosst Canada, Inc. | Human cyclooxygenase-2 cDNA and assays for evaluating cyclooxygenase-2 activity |
US6096331A (en) | 1993-02-22 | 2000-08-01 | Vivorx Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions useful for administration of chemotherapeutic agents |
DE69435010T2 (de) | 1993-04-20 | 2008-04-30 | Hipler Partners Llp | Verfahren und stoffe für die behandlung von individuen, die infiziert sind mit intrazellulär infektiösen agentien |
US5759551A (en) | 1993-04-27 | 1998-06-02 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
HUT73876A (en) | 1993-04-29 | 1996-10-28 | Abbott Lab | Erythropoietin analog compositions and methods |
US5554512A (en) | 1993-05-24 | 1996-09-10 | Immunex Corporation | Ligands for flt3 receptors |
US6017536A (en) | 1993-06-07 | 2000-01-25 | Trimeris, Inc. | Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities |
US6479055B1 (en) | 1993-06-07 | 2002-11-12 | Trimeris, Inc. | Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission |
US6518013B1 (en) | 1993-06-07 | 2003-02-11 | Trimeris, Inc. | Methods for the inhibition of epstein-barr virus transmission employing anti-viral peptides capable of abrogating viral fusion and transmission |
US5464933A (en) | 1993-06-07 | 1995-11-07 | Duke University | Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission |
US6310180B1 (en) | 1993-06-21 | 2001-10-30 | Vanderbilt University | Method for synthesis of proteins |
CA2125763C (en) | 1993-07-02 | 2007-08-28 | Maurice Kent Gately | P40 homodimer of interleukin-12 |
IL110669A (en) | 1993-08-17 | 2008-11-26 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin analogs |
US5837682A (en) | 1996-03-08 | 1998-11-17 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin fragments and method of use |
CA2188813C (en) | 1994-04-26 | 2010-08-03 | Michael S. O'reilly | Angiostatin protein, nucleic acids encoding the same and methods of detection |
US5639725A (en) | 1994-04-26 | 1997-06-17 | Children's Hospital Medical Center Corp. | Angiostatin protein |
US5648240A (en) | 1994-05-24 | 1997-07-15 | Texas A&M University | MHC II analog from Staphylococcus aureus |
ATE420171T1 (de) * | 1994-07-15 | 2009-01-15 | Univ Iowa Res Found | Immunomodulatorische oligonukleotide |
US6429199B1 (en) | 1994-07-15 | 2002-08-06 | University Of Iowa Research Foundation | Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells |
US6309853B1 (en) | 1994-08-17 | 2001-10-30 | The Rockfeller University | Modulators of body weight, corresponding nucleic acids and proteins, and diagnostic and therapeutic uses thereof |
US5541087A (en) * | 1994-09-14 | 1996-07-30 | Fuji Immunopharmaceuticals Corporation | Expression and export technology of proteins as immunofusins |
DE69523857T2 (de) | 1994-09-16 | 2002-06-13 | Merck Patent Gmbh | Immunokonjugate |
EP1621206A1 (en) * | 1994-12-12 | 2006-02-01 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Chimeric cytokines and uses thereof |
US6485726B1 (en) | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US6086875A (en) | 1995-01-17 | 2000-07-11 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of immunogens |
US6030613A (en) | 1995-01-17 | 2000-02-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US5552524A (en) | 1995-01-31 | 1996-09-03 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5691309A (en) | 1995-01-31 | 1997-11-25 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5891680A (en) | 1995-02-08 | 1999-04-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Bioactive fusion proteins comprising the p35 and p40 subunits of IL-12 |
US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
ATE271606T1 (de) | 1995-03-10 | 2004-08-15 | Genentech Inc | Die aktivierung von rezeptoren durch gas6 |
US5719266A (en) | 1995-03-17 | 1998-02-17 | Eli Lilly And Company | Anti-obesity proteins |
US5591573A (en) | 1995-04-10 | 1997-01-07 | Alpha Therapeutic Corporation | Method and system for testing blood samples |
US5739277A (en) | 1995-04-14 | 1998-04-14 | Genentech Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US5579277A (en) | 1995-05-01 | 1996-11-26 | Apple Computer, Inc. | System and method for interleaving memory banks |
US6184344B1 (en) | 1995-05-04 | 2001-02-06 | The Scripps Research Institute | Synthesis of proteins by native chemical ligation |
US6281010B1 (en) | 1995-06-05 | 2001-08-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adenovirus gene therapy vehicle and cell line |
JPH11507632A (ja) | 1995-06-07 | 1999-07-06 | トリメリス,インコーポレーテッド | 併用療法を用いたhivおよび他のウイルス感染の治療 |
AU695934B2 (en) | 1995-06-30 | 1998-08-27 | Eli Lilly And Company | Methods for treating diabetes |
US6406689B1 (en) | 1995-10-03 | 2002-06-18 | Frank W. Falkenberg | Compositions and methods for treatment of tumors and metastatic diseases |
US5854205A (en) | 1995-10-23 | 1998-12-29 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic compositions and methods |
US6620413B1 (en) | 1995-12-27 | 2003-09-16 | Genentech, Inc. | OB protein-polymer chimeras |
US6080409A (en) | 1995-12-28 | 2000-06-27 | Dendreon Corporation | Immunostimulatory method |
US6750334B1 (en) | 1996-02-02 | 2004-06-15 | Repligen Corporation | CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor |
US6096313A (en) * | 1996-02-09 | 2000-08-01 | Ludwig Institute For Cancer Research | Compositions containing immunogenic molecules and granulocyte-macrophage colony stimulating factor, as an adjuvant |
CA2198968C (en) | 1996-03-04 | 2010-02-09 | Toyofumi Masuda | Process for production of secretory kex2 derivatives |
JP2001502521A (ja) | 1996-04-26 | 2001-02-27 | ベス イスラエル デアコネス メディカル センター | インターロイキン―15の拮抗剤 |
CN1136197C (zh) | 1996-05-30 | 2004-01-28 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 新的哒嗪酮衍生物 |
US5922685A (en) | 1996-06-05 | 1999-07-13 | Powderject Vaccines, Inc. | IL-12 gene therapy of tumors |
EP0826696B1 (de) | 1996-09-03 | 2002-05-29 | GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH | Verwendung bi-und trispezifischer Antikörper zur Induktion einer Tumorimmunität |
US5994104A (en) | 1996-11-08 | 1999-11-30 | Royal Free Hospital School Of Medicine | Interleukin-12 fusion protein |
US6737057B1 (en) * | 1997-01-07 | 2004-05-18 | The University Of Tennessee Research Corporation | Compounds, compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors |
US6100387A (en) | 1997-02-28 | 2000-08-08 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric polypeptides containing chemokine domains |
US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
US5998598A (en) * | 1997-03-10 | 1999-12-07 | The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immunoadhesins and methods of production and use thereof |
PT973550E (pt) | 1997-04-11 | 2003-01-31 | Searle & Co | Anticorpos antagonistas anti-integrina avb3 |
CA2292724A1 (en) | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Gryphon Sciences | Solid phase native chemical ligation of unprotected or n-terminal cysteine protected peptides in aqueous solution |
US6310183B1 (en) | 1997-09-10 | 2001-10-30 | Novo Nordisk A/S | Coagulation factor VIIa composition |
CA2693296C (en) | 1997-12-08 | 2013-09-10 | Merck Patent Gmbh | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
US20030105294A1 (en) | 1998-02-25 | 2003-06-05 | Stephen Gillies | Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins |
US6008321A (en) | 1998-03-16 | 1999-12-28 | Pharmacopeia, Inc. | Universal linker for combinatorial synthesis |
US6281331B1 (en) | 1998-03-23 | 2001-08-28 | Trimeris, Inc. | Methods and compositions for peptide synthesis |
BR9909583A (pt) | 1998-04-15 | 2002-01-15 | Lexigen Pharm Corp | Aumento da resposta imune mediado por uma proteìna de fusão anticorpo-citocina por co-administração com inibidor de angiogênese |
WO1999053958A2 (en) | 1998-04-17 | 1999-10-28 | Lexigen Pharmaceuticals Corporation | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with prostaglandin inhibitor |
US6284536B1 (en) | 1998-04-20 | 2001-09-04 | The Regents Of The University Of California | Modified immunoglobin molecules and methods for use thereof |
AU751823B2 (en) | 1998-05-14 | 2002-08-29 | Merck Patent Gmbh | Fused protein |
US6620382B1 (en) | 1998-05-22 | 2003-09-16 | Biopheresis Technologies, Llc. | Method and compositions for treatment of cancers |
CA2341029A1 (en) | 1998-08-17 | 2000-02-24 | Abgenix, Inc. | Generation of modified molecules with increased serum half-lives |
CN101386651A (zh) | 1998-08-25 | 2009-03-18 | 默克专利股份公司 | 表达以及分泌制管张素和内皮抑制素的免疫融合物 |
US6646113B1 (en) | 1998-09-17 | 2003-11-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants |
US6335176B1 (en) | 1998-10-16 | 2002-01-01 | Pharmacopeia, Inc. | Incorporation of phosphorylation sites |
US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
US7488590B2 (en) * | 1998-10-23 | 2009-02-10 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
DE69939548D1 (de) | 1998-11-06 | 2008-10-23 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Verfahren zur herstellung von faktor vii |
BR0007414A (pt) | 1999-01-07 | 2001-10-16 | Lexigen Pharm Corp | Expressão e exportação de proteìnas antiobesidade como proteìnas de fusão fc |
BR0010322A (pt) | 1999-05-06 | 2002-04-09 | Univ Wake Forest | Vetor de expressão, vacina e seu método de uso para eliciar uma resposta imune dirigida contra um antìgeno em um mamìfero |
US6348192B1 (en) | 1999-05-11 | 2002-02-19 | Bayer Corporation | Interleukin-2 mutein expressed from mammalian cells |
AU777963B2 (en) | 1999-05-19 | 2004-11-04 | Merck Patent Gmbh | Expression and export of interferon-alpha proteins as Fc fusion proteins |
WO2000078334A1 (en) | 1999-06-17 | 2000-12-28 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor |
AU781618C (en) * | 1999-07-02 | 2006-03-16 | Genentech Inc. | FVIIa antagonists |
JO2291B1 (en) | 1999-07-02 | 2005-09-12 | اف . هوفمان لاروش ايه جي | Erythropoietin derivatives |
CZ299516B6 (cs) | 1999-07-02 | 2008-08-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Konjugát erythropoetinového glykoproteinu, zpusobjeho výroby a použití a farmaceutická kompozice sjeho obsahem |
US6469136B1 (en) | 1999-07-07 | 2002-10-22 | Trimeris, Inc. | Methods and composition for peptide synthesis |
US7067110B1 (en) | 1999-07-21 | 2006-06-27 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
SK782002A3 (en) * | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
ATE316982T1 (de) | 1999-08-09 | 2006-02-15 | Lexigen Pharm Corp | Mehrere zytokin-antikörper komplexen |
AU784605B2 (en) * | 1999-10-20 | 2006-05-11 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Chimeric immunogenic compositions and nucleic acids encoding them |
WO2001036489A2 (en) | 1999-11-12 | 2001-05-25 | Merck Patent Gmbh | Erythropoietin forms with improved properties |
DE19963859A1 (de) | 1999-12-30 | 2001-07-12 | Apotech Res & Dev Ltd | Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen |
ATE336514T1 (de) | 2000-02-11 | 2006-09-15 | Merck Patent Gmbh | Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen |
PT1719528E (pt) | 2000-02-24 | 2012-01-06 | Philogen Spa | Composições e métodos para tratamento de angiogénese em lesões patológicas |
US6586398B1 (en) | 2000-04-07 | 2003-07-01 | Amgen, Inc. | Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods |
HUP0302299A2 (hu) | 2000-05-12 | 2003-10-28 | Neose Technologies, Inc. | Rekombináns glikopeptidek glikozilezési mintázatának in vitro módosítása |
EP1294401B1 (en) | 2000-06-29 | 2007-08-01 | EMD Lexigen Research Center Corp. | Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents |
US7138119B2 (en) * | 2000-09-15 | 2006-11-21 | Progenics Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibition of HIV-1 infection |
JP2004525621A (ja) | 2001-01-18 | 2004-08-26 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | グルコセレブロシダーゼ活性を有する二機能性融合タンパク質 |
MXPA03007323A (es) | 2001-02-19 | 2003-12-12 | Merck Patent Gmbh | Proteinas artificiales con inmunogenicidad reducida. |
WO2002069232A2 (en) | 2001-02-19 | 2002-09-06 | Merck Patent Gmbh | Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity |
AU2002248571B2 (en) | 2001-03-07 | 2007-01-18 | Merck Patent Gmbh | Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety |
WO2002079415A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-10-10 | Lexigen Pharmaceuticals Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
DE10118308A1 (de) * | 2001-04-12 | 2002-10-17 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung von Hydroxybenzoesäurebenzylestern |
JP4309662B2 (ja) | 2001-05-03 | 2009-08-05 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 腫瘍特異的組換え抗体およびその使用 |
CA2456470A1 (en) | 2001-08-13 | 2003-02-27 | University Of Southern California | Interleukin-2 mutants with reduced toxicity |
EP2354791A1 (en) | 2001-12-04 | 2011-08-10 | Merck Patent GmbH | Immunocytokines with modulated selectivity |
ES2311094T3 (es) * | 2002-02-27 | 2009-02-01 | Immunex Corporation | Composicion estabilizada de tnfr-fc que comprende arginina. |
CN101143221A (zh) * | 2002-03-15 | 2008-03-19 | 布赖汉姆妇女医院 | 适合治疗剂全身性递送的中央气道给药 |
WO2004055056A1 (en) | 2002-12-17 | 2004-07-01 | Merck Patent Gmbh | Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2 |
US20050037947A1 (en) * | 2003-05-06 | 2005-02-17 | Bitonti Alan J. | Inhibition of drug binding to serum albumin |
US20050281829A1 (en) * | 2003-05-06 | 2005-12-22 | Hehir Cristina A T | Fc chimeric proteins with anti-HIV drugs |
PL2298347T3 (pl) * | 2003-05-06 | 2016-03-31 | Bioverativ Therapeutics Inc | Białka chimeryczne czynnika krzepnięcia do leczenia zaburzenia hemostazy |
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
US7348004B2 (en) | 2003-05-06 | 2008-03-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
US20050069521A1 (en) | 2003-08-28 | 2005-03-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins |
RU2251699C1 (ru) * | 2003-09-25 | 2005-05-10 | Киселев Всеволод Иванович | Способ ранней и доклинической диагностики цервикального рака |
CN102405230A (zh) * | 2009-04-22 | 2012-04-04 | 默克专利有限公司 | 具有修饰的FcRn结合位点的抗体融合蛋白 |
-
1999
- 1999-07-21 SK SK78-2002A patent/SK782002A3/sk unknown
-
2000
- 2000-07-21 BR BR0012569-5A patent/BR0012569A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-07-21 PT PT00950483T patent/PT1198250E/pt unknown
- 2000-07-21 DK DK00950483T patent/DK1198250T3/da active
- 2000-07-21 JP JP2001511964A patent/JP4764585B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-21 MX MXPA02000746A patent/MXPA02000746A/es active IP Right Grant
- 2000-07-21 ES ES00950483T patent/ES2292457T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-21 PL PL353344A patent/PL201664B1/pl unknown
- 2000-07-21 CZ CZ2002-182A patent/CZ304884B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-07-21 AU AU63583/00A patent/AU779388B2/en not_active Ceased
- 2000-07-21 KR KR1020027000879A patent/KR100689739B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-07-21 EP EP00950483A patent/EP1198250B8/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-21 CN CNB008131708A patent/CN1308037C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-21 AT AT00950483T patent/ATE374042T1/de active
- 2000-07-21 CA CA2378866A patent/CA2378866C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-21 HU HU0202796A patent/HUP0202796A2/hu unknown
- 2000-07-21 DE DE60036552T patent/DE60036552T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-21 RU RU2002104700/15A patent/RU2248214C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-07-21 WO PCT/US2000/019816 patent/WO2001007081A1/en active IP Right Grant
-
2002
- 2002-01-17 NO NO20020255A patent/NO20020255L/no not_active Application Discontinuation
- 2002-01-21 ZA ZA200200501A patent/ZA200200501B/en unknown
-
2005
- 2005-03-24 US US11/089,426 patent/US7955590B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-03-25 US US12/411,388 patent/US8043608B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1997024137A1 (en) * | 1995-12-28 | 1997-07-10 | Tanox Biosystems, Inc. | HYBRID WITH INTERFERON-α AND AN IMMUNOGLOBULIN Fc LINKED THROUGH A NON-IMMUNOGENIC PEPTIDE |
WO1999033868A2 (en) * | 1997-12-24 | 1999-07-08 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Human papillomavirus vaccine |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LO K-M ET AL: "High level expression and secretion of Fc-X fusion proteins in mammalian cells" 1998 PROTEIN ENGINEERING 11, 495-500, XP002125745, str. 497, pravý sl. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2378866C (en) | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens | |
US7067110B1 (en) | Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens | |
US7118751B1 (en) | DNA vaccines encoding antigen linked to a domain that binds CD40 | |
AU2009326524B2 (en) | Use of Flt3 ligand for strengthening immune responses in RNA immunization | |
US6749856B1 (en) | Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses | |
US20120328640A1 (en) | Methods and compositions for the treatment and prevention of cancer | |
US20130183347A1 (en) | Somatic Transgene Immunization and Related Methods | |
AU757310B2 (en) | Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses | |
JP2009102369A (ja) | 体細胞導入遺伝子免疫および関連方法 | |
US7011833B1 (en) | Enhancing immune responses with B7-1 or B7-2 in the absence of a crosslinking agent | |
US20090074814A1 (en) | DNA Vaccines Encoding Antigen Linked to a Domain That Binds CD40 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20160721 |