DE69523857T2 - Immunokonjugate - Google Patents

Immunokonjugate

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Immunkonjugate, die aus einem monoklonalen Antikörper oder einem seiner Fragmente, der bzw. das den menschlichen Epidermis- Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) erkennt, sowie IL-8 bestehen. Die gebildeten Immunkonjugate können zur Abgabe des biologisch aktiven Liganden an eine bestimmte Zielzelle bzw. ein bestimmtes Zielgewebe verwendet werden. Die neuen Immunkonjugate lassen sich in der Tumortherapie verwenden.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Zur Behandlung von Krebspatienten bediente man sich verschiedener therapeutischer Konzepte. Früher wurden klinische Versuche mit monoklonalen Antikörpern durchgeführt, die spezifisch oder bevorzugt Zelloberflächenmoleküle, die auf malignen Zellen exprimiert werden, erkennen. Ziel dieses Ansatzes ist die Induktion der antikörperabhängigen Zellcytotoxizität (ADCC) oder komplementvermittelten Cytotoxizität zur Elimination von Tumorzellen. Ein zweiter Ansatz ist die cytokinvermittelte Aktivierung einer Immunreaktion. Die cytokininduzierte Antitumorwirksamkeit kann vermittelt werden durch:
  • 1) eine direkte cytotoxische/cytostatische Wirkung des Cytokins auf das Tumorwachstum,
  • 2) für Tumorantigen unspezifische Mechanismen, wie LAK-Aktivität oder durch Monozyten/Granulozyten vermittelte Cytotoxizität,
  • 3) für Tumorantigen spezifische Immunreaktionen, die durch CD4- und CD8-positive T-Zellen vermittelt werden.
  • In dieser Situation wurde eine systemische Immunität gegen den Tumor im Tiermodell beobachtet.
  • Die Tatsache, daß die Cytokine in hohen Dosen cytotoxisch sind und in situ in ungenügenden Mengen vorliegen, führte zum Konzept der gezielten Tumortherapie. Das Prinzip der gezielten Tumortherapie beruht auf der physischen Verbindung eines Zielsteuerungsmoleküls, wie eines für ein tumorassoziiertes Antigen spezifischen monoklonalen Antikörpers, mit einem biologisch aktiven Effektormolekül. Die Abgabe von Effektormolekülen durch ein Zielsteuerungsmolekül müßte die Cytokinkonzentration im Tumor erhöhen und die erforderliche Maximaldosis verringern. Im Tiermodell wurde nachgewiesen, daß das Vorhandensein des Cytokins in situ entweder durch intratumorale Injektion oder durch Sekretion transfizierter Tumorzellen zu einer Tumorregression führen kann (siehe Reviews bei: Colombo und Form, Immunology Today 15: 48-51, 1994). Bei diesen Systemen hemmen die Cytokine zwar nicht die Tumorproliferation, können jedoch eine rasche und wirksame Antitumorreaktion aktivieren. Die physische Kombination eines Effektormoleküls und eines Zielsteuerungselements stellt daher ein Mittel dar, um das Vorhandensein des biologisch aktiven Liganden in äußeren Bereichen zu verringern und seine Verfügbarkeit innerhalb des Tumors zu erhöhen. Außerdem lassen sich durch diese Moleküle auch einzelne Tumorzellen oder Mikrometastasen ansteuern.
  • Der biologisch aktive Ligand für eine von einem Antikörper dirigierte Zielsteuerung sollte die Zerstörung der Zielzelle entweder direkt oder durch Schaffung einer für die Zielzelle lethalen Umgebung induzieren. Dies läßt sich durch Cytokine wie IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFNs, TNFα sowie CSFs erreichen. Es wurde gezeigt, daß diese Cytokine entweder direkt oder indirekt durch Aktivierung der Abwehrmechanismen des Wirts eine Antitumorwirkung hervorrufen (Mire-Sluis, TIBTECH 11: 74-77, 1993; Colombo et al., Cancer Res. 52: 4853-4857, 1992; Thomas & Balkwill, Pharmac. Ther. 52: 307-330, 1991).
  • Fusionsproteine mit IL-2 und einem gegen EGFR gerichteten monoklonalen Antikörper fördern die durch frisch abgetrennte PBMCs, isolierte natürliche Killerzellen und aktivierte T-Zellen gegen Melanomzellinien vermittelte Cytotoxizität (Naramura et al., Immunol. Lett., Band 39, S. 9).
  • Ein weiteres IL-2/Antikörper-Fusionsprotein wurde in EP 0 439 095 beschrieben. Hier wurde der Antikörper L6 zur Zielsteuerung von IL-2 auf menschliches nichtkleinzelliges Lungenkarzinom und verschiedene andere Karzinome, darunter Brust- und Dickdarmkarzinom, verwendet.
  • Obwohl die meisten dieser Cytokine zwar Effektorzellen aktivieren, weisen sie ihnen gegenüber keine oder nur schwache Chemotaxie auf, so daß die Antitumorwirksamkeit in Abwesenheit geeigneter Mengen an Effektorzellen am Tumorgewebe möglicherweise schwach ist.
  • Chemokine weisen jedoch Chemotaxie für viele Effektorzellen auf und verstärken so ihre Anwesenheit am Ort des Tumorgeschehens; zweitens induzieren sie verschiedene Funktionen der Effektorzellen (siehe zum Beispiel: Miller und Krangel (1992), "Biology and Biochemistry of the Chemokines: A Novel Family of Chemotactic and Inflammatory Cytokines" [Biologie und Biochemie der Chemokine: Eine neue Familie chemotaktischer und inflammatorischer Cytokine], Critical Reviews in Immunology 12, 17).
  • Bei IL-8 handelt es sich um einen Vertreter der Superfamilie der C-X-C-Chemokine (auch unter der Bezeichnung Superfamilie der kleinen Cytokine bzw. Interkrine bekannt). Es wirkt als chemotaktischer Faktor und aktiviert Funktionen von Effektorzellen und könnte daher ein optimales Effektormolekül darstellen. Bei dieser Familie der C-X-C-Chemokine handelt es sich um eine Gruppe von kleinen (8-10-kD) Proteinen, die vor kurzer Zeit charakterisiert wurden, eine 20 bis 50%ige Homologie auf Aminosäuresequenzebene aufweisen und über chemotaktische und proinflammatorische Eigenschaften verfügen. IL-8 weist eine gut definierte dreidimensionale Struktur auf (Clore et al., Biochemistry 29: 1689-1696, 1990) und hat mit einigen CXC-Chemokinen ein N-terminales ELR-Motiv gemeinsam. Es ist zu erwarten, daß die dreidimensionale Struktur aufgrund der Sequenzhomologie zwischen den CXC-Chemokinen untereinander ziemlich ähnlich ist. Dies wurde bereits für MCAF/MCP-1 nachgewiesen (Gronenbom & Clore Prot. Eng. 4, 263-269, 1991).
  • In Lösung bildet IL-8 stabile Dimere (Clore et al., Biochemistry 29: 1689-1696, 1990) und es ist möglich, daß ein F(ab')-IL-8-Fusionsprotein durch die Wechselwirkung zweier IL-8-Monomere unter Bildung eines bivalenten Immunkonjugats dimerisiert wird. Dies verstärkt die Wechselwirkung zwischen dem Fusionsprotein und dem Antigen.
  • Beim Epidermiswachstumsfaktor (EGF) handelt es sich um ein Polypeptidhormon, das für Epidermis- und Epithelzellen mitogen wirkt. Bei einer Wechselwirkung von EGF mit anfälligen Zellen bindet er an Membranrezeptoren (EGFR). Der EGFR ist ein Transmembranglykoprotein mit einer Größe von ungefähr 170 kD und ein Genprodukt des c-erb-B Protoonkogens.
  • Es wurde gefunden, daß der gegen die Humankarzinomzelllinie A431 (ATCC CRL 1555) hergestellte monoklonale Maus-Antikörper MAb 425 an ein Polypeptidepitop an der äußeren Domäne des EGFR bindet. Es würde gefunden, daß er die Bindung von EGF hemmt, Tumorcytotoxizität in vitro vermittelt und Tumorzellwachstum bei von Epidermis- und Kolorektalkarzinom abgeleiteten Zellinien in vitro supprimiert (Rodeck et al., 1987, Cancer Res. 47, 3692). Humanisierte Versionen und Hybridversionen von MAb 425 sind aus WO 92/15683 bekannt.
  • Ziel der vorliegenden Erfindung war daher die Schaffung von Antikörpern oder ihren Fragmenten mit einem gegen ein EGFR-Antigen an der Oberfläche einer Tumorzelle gerichteten Epitop sowie IL-8, die eine starke Chemotaxie für ihre Effektorzellen aufweisen und daher zu einer gezielten Tumortherapie geringer Toxizität führen. Die Immunkonjugate stellen daher eine Verbesserung gegenüber analogen Cytokin-Antikörper- Immunkonjugaten dar, die in bezug auf ihre Fähigkeit, Tumorlyse zu verursachen, ähnlich wirksam sind, jedoch nicht in bezug auf die Möglichkeit, Effektorzellen aufgrund der chemotaktischen Eigenschaften eines bestimmten Orts spezifisch an diesen Ort zu dirigieren.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft Immunkonjugate, bei denen ein Teil eines monoklonalen Antikörpers, zumindest die Antigen-Erkennungsstelle, oder ein vollständiger monoklonaler Antikörper, der ein Epitop des EGFR erkennt, mit einem biologisch aktiven Chemokin kombiniert ist, wobei es sich bei dem Chemokin um IL-8 handelt. Die für diese Immunkonjugate codierenden Konstrukte werden DNA-rekombinationstechnisch hergestellt. Die Immunkonjugate enthalten die variable Region der schweren Kette des Antikörpers und die CH1-Domäne der konstanten Region (CH1-Konjugate, Fab-Fragment) und die entsprechende leichte Kette, oder die variable Region der schweren Kette des Antikörpers und die CH1- und CH2-Domäne der konstanten Region, oder die variable Region der schweren Kette der Antikörpers und die CH1-, CH2- und CH3-Domäne der konstanten Region, jeweils in Fusion mit IL-8. Durch Koexpression mit der entsprechenden leichten Kette gelangt man zu einem Fusionsprotein, das antigentragende Zellen ansteuert und IL-8 an einen bestimmten Ort im Körper abgibt.
  • Analog dazu kann ein anderes Immunkonjugat dadurch erhalten werden, daß man IL-8 mit dem C-terminalen Ende eines Fv-Fragments des Antikörpers fusioniert. In diesem Fall werden die schwere und die leichte Kette in einem Polypeptid exprimiert, in dem die beiden Elemente durch eine geeignete Linker-Sequenz verbunden werden, um eine ordentliche Faltung der Antigen-Bindungsstelle zu gewährleisten. Die verschiedenen Konstrukte sind in Fig. 1 dargestellt.
  • Die Expression von Immunkonjugaten führt zu neuen Molekülen, bei denen zwei Funktionen vereinigt sind: erstens steuern sie antigentragende Zellen (EGFR) an und zweitens geben sie IL-8 an einen bestimmten Ort im Körper ab. Dieser Ligand wirkt stark chemischanziehend und molekülaktivierend und führt zur Infiltration der Effektorzellen am Ort des Tumorgeschehens, wo er anschließend die Zerstörung des Tumors verursachen kann.
  • Mit den erfindungsgemäßen Immunkonjugaten können Tumore wie Melanom, Gliom und Karzinom ohne wesentliche allgemeine toxische Wirkungen erfolgreich nachgewiesen und behandelt werden.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines Immunkonjugats mit einem monoklonalen Antikörper oder einem seiner Fragmente, der bzw. das gegen eine Tumorzelle gerichtet ist, die ein Antigenepitop des Epidermis-Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) trägt, sowie einem IL-8, das mit diesem Antikörper oder Antikörperfragment fusioniert ist.
  • Bei den Antikörpern, die erfindungsgemäß verwendet werden können, handelt es sich entweder um ganze Antikörper oder um deren Fragmente. Geeignete Fragmente sind Fvs, Fabs oder F(ab')2 s (CH1-Antikörperfragmente in der Terminologie der vorliegenden Anmeldung), CH3- und CH2-Antikörperfragmente (Fig. 1). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fvs, CH1-, CH2- und CH3-Antikörperfragmente.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines Immunkonjugats, bei dem der Antikörper ein Fab-Fragment oder ein F(ab')2-Fragment ist, das im wesentlichen aus der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers, der CH1-Domäne der konstanten Region sowie der entsprechenden leichten Kette besteht (Antikörper-CH1-Konjugat), eines weiteren Immunkonjugats, bei dem der Antikörper ein Antikörperfragment ist, das im wesentlichen aus der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers, der CH1- und CH2-Domäne der konstanten Region sowie der entsprechenden leichten Kette besteht (Antikörper- CH2-Konjugat), eines weiteren Immunkonjugats, bei dem der Antikörper ein vollständiger Antikörper ist, der im wesentlichen aus der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers, der CH1-, CH2- und CH3-Domäne der konstanten Region und der entsprechenden leichten Kette besteht (Antikörper-CH3-Konjugat) und schließlich eines weiteren Immunkonjugats, bei dem der Antikörper im wesentlichen aus der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers, der entsprechenden leichten Kette und einer Polypeptidsequenz, die die leichte und schwere Kette verbindet, besteht (Antikörper-Fv-Konjugat).
  • Die erfindungsgemäßen Immunkonjugate können gegebenenfalls eine Restriktionsstelle zwischen dem Antikörper(-Fragment) und IL-8 enthalten, wodurch man zum Beispiel ein spezifisches Linker-Peptid einfügen kann, um eine optimale Bindung des Konjugats an das Zielepitop zu gewährleisten. Geeignete Linker-Peptide und Verfahren zu ihrer Einfügung sind dem Fachmann gut bekannt und werden unten beschrieben. Erfindungsgemäß wird eine Restriktionsstelle gewählt, die in dem jeweiligen DNA-Konstrukt einzigartig ist. Bevorzugte Restriktionsstellen sind NcoI und BclI.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines Immunkonjugats mit einer Aminosäure (-Sequenz), die von einer DNA- Restriktionsstelle zwischen Antikörper/Antikörperfragment und IL-8 abgeleitet werden kann, wobei diese Restriktionsstelle innerhalb des vollständigen Fusionskonstrukts einzigartig ist.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Immunkonjugats mit einem Linker- Peptid zwischen Antikörper/Antikörperfragment und IL-8.
  • Im Prinzip eignen sich alle Antikörper, die gegen EFG-Rezeptoren an Tumorzellenoberflächen gerichtet sind. Der monoklonale Antikörper 425 ist jedoch eine bevorzugte Ausführungsform.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Immunkonjugats, bei dem der Antikörper bzw. das Antikörperfragment von dem Maus-, humanisierten oder Hybrid-MAb 425 stammt und vorzugsweise aus der Gruppe Mab 425-CH1-IL8, Mab 425- CH2-(NcoI)-IL8, Mab 425-CH2-(BclI)-IL8, Mab 425-Fv-IL8, Mab 425-CH3-IL-8 ausgewählt ist.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht weiterhin in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Immunkonjugats wie oben und unten und in den Ansprüchen definiert, bei dem man die für den Antikörper bzw. das Antikörperfragment und für IL-8 codierenden DNA-Sequenzen miteinander auf einer Einzelstrang-DNA mittels eines Oligonukleotids, das zu der gewünschten Fusions-DNA-Sequenz komplementär ist, fusioniert, das so erhaltene Konstrukt in einen Expressionsvektor, der in den Wirtsorganismus transformiert wird, einführt, die Wirtszellen in einer Nährlösung kultiviert und das Fusionsprotein exprimiert.
  • Die erfindungsgemäßen Immunkonjugate eignen sich als Therapeutika.
  • Ein Ziel der Erfindung besteht daher in der Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit mindestens einem der wie oben, unten und in den Ansprüchen definierten Immunkonjugate sowie einem physiologisch unbedenklichen Träger.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Schaffung eines Fusionsproteins aus einem monoklonalen Antikörper als Zielsteuerungselement und dem Chemokin IL-8 als Effektormolekül mit chemotaktischen und aktivierenden Eigenschaften.
  • Zum ersten Mal konnte nachgewiesen werden, daß IL-8 und andere Chemokine (wie MIPs), wenn ihr N-terminales Ende durch zusätzliche Aminosäuren wie dem Antikörpermolekülteil blockiert ist, ihre biologische Wirksamkeit beibehalten. Dieses Molekül wird daher insofern bei der gezielten Tumortherapie wirksam sein, als. Effektorzellen an die EGF-Rezeptor-positiven Tumorzellen dirigiert und in situ aktiviert werden.
  • Es konnte nachgewiesen werden, daß die für die schwere Kette von MAb 425 und das IL-8-Protein codierenden cDNAs mittels molekularbiologischer Verfahren fusioniert und Proteine in geeigneten Expressionssystemen exprimiert werden können, und daß die Fähigkeit, an den EGF-Rezeptor zu binden, bei den Fusionsproteinen erhalten bleibt (Fig. 2).
  • Die wichtigsten Zielzellen von IL-8 sind neutrophile Granulozyten, die drei biologische Funktionen ausüben:
  • Chemotaktische Bewegung entlang eines chemotaktischen Gradienten.
  • Freisetzung von gespeicherten Körnern mit bereits produzierten proteolytischen Enzymen.
  • Sofortige Produktion von Superoxidanionen (plötzlicher Anstieg der Atmung)
  • Dementsprechend wurden MAb 425/NcoI/IL-8- und MAb 425-BclI/IL-8-Fusionsproteine auf ihre Chemotaxis, Induktion der MPO-Freisetzung und Freisetzung von Superoxid untersucht.
  • Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Fusionsproteine (zum Beispiel MAb 425/NcoI/IL-8 und MAb 425-BclI/IL-8) Chemotaxis, Induktion der MPO-Freisetzung sowie Freisetzung von Superoxid verursachen. Die in Fig. 3a gezeigten Ergebnisse zeigen, daß beide Fusionsproteine chemotaxisch für humane Neutrophile im Bereich von rekombinantem IL-8 sind (Fig. 3b). Zusätzlich zu den MAb 425/NcoI/IL-8- und MAb 425-BclI/IL-8-Fusionsproteinen, bei denen eine Assemblierung zu einer divalenten Form stattfinden müßte, wurde ein monovalentes F(ab')-IL-8-Fusionsprotein geschaffen, das in E. coli exprimiert und gereinigt wurde. Fig. 4 zeigt, daß das F(ab')-IL-8- Fusionsprotein im Vergleich zu einem entsprechend in E. coli exprimierten und gereinigten MAb 425 F(ab') Chemotaxis für humane Neutrophile zeigt.
  • Das MAb 425/BclI/IL-8-Fusionsprotein weist im Vergleich zu freiem IL-8 eine ziemlich ausgeprägte Fähigkeit, Superoxid freizusetzen, auf (Fig. 5); das MAb 425/Ncol/IL-8-Fusionsprotein ist zwar weniger aktiv, aber die Werte sind signifikant höher als die Kontrollwerte (Fig. 5). Bei MAb 425 allein wird keine Aktivität beobachtet. Alle Tests wurden mit Cytochalasin B, bei dem alleine keine Aktivität beobachtet wird, als Enhancer durchgeführt (nicht gezeigt).
  • Obwohl beide Fusionsproteine die Freisetzung von Myeloperoxidase (MPO) induzieren, ist das MAb 425/NcoI/IL-8-Fusionsprotein aktiver als das MAb 425/BclI/IL-8-Fusionsprotein (Fig. 6). Alle Werte werden entsprechend der mit Triton lysierten Zellen, die als 100% Enzymgehalt bezeichnet werden, berechnet. Man gelangte zu allen Werten mit Cytochalasin B als Enhancer.
  • Es wurde bereits gezeigt, daß der N-terminale Teil des IL-8-Moleküls mit dem stark konservierten E-L-R-Motiv für die Rezeptorbindung und Signaltransduktion erforderlich ist. Die dreidimensionale Struktur von IL-8 ist eine Homodimer, in dem beide N-terminale Enden exponiert sind. Wurden die N-terminalen Enden durch zusätzliche Aminosäuren blockiert, so konnte die biologische Aktivität von IL-8 außer Kraft gesetzt werden. Deshalb wurden zwischen die beiden cDNAs Restriktionsstellen (NcoI/BclI) eingeführt, um Linker-Peptide einzuführen und so das N-terminale Ende wieder zugänglich zu machen.
  • Weitere Ansätze zur Schaffng von Fusionsproteinen, wie die chemische Kopplung der beiden Elemente, führten zu ziemlich undefinierten Strukturen, bei denen Variationen zwischen den einzelnen Chargen möglich waren. Außerdem könnte eine chemische Kopplung die Sekundärstruktur des Liganden zerstören oder zu einer Situation führen, in der die meisten Proteine in bezug auf die Rezeptorbindung aufgrund fehlender Zugänglichkeit inaktiv sind. Im Gegensatz dazu werden mit dem erfindungsgemäßen Ansatz Fusionsproteine mit einer definierten Struktur geschaffen, die reproduzierbar beinahe unbegrenzt exprimiert werden können.
  • Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die erfindungsgemäßen Fusionsproteine die folgenden Eigenschaften aufweisen:
  • - sie binden an EGFR-positive Zellen,
  • - sie führen zu Chemotaxie,
  • - sie induzieren die Freisetzung von MPO und Superoxid, und
  • - sie induzieren Tumorlyse in situ.
  • Die erfindungsgemäßen Immunkonjugate eignen sich daher zur Tumortherapie.
    • Kurzbeschreibung der Tabellen und Figuren Tab. 1:
  • In Tabelle I ist die Sequenz der für die PCR zur Schaffung entweder einer NcoI- oder einer BclI- Spaltstelle verwendeten Primer zur Schaffung Von Fusionsproteinen für die Expression in Eukaryonten gezeigt.
    • Fig. 1:
  • Modelle von Antikörper-Cytokin-Immunkonjugaten.
  • C = Cytokin, VH = variable Region der schweren Kette, VL = variable Region der leichten Kette, CH = konstante Region der schweren Kette, CL = konstante Region der leichten Kette.
    • Fig. 2:
  • Nachweis von MAb 425 in COS-7-Transfektionsüberständen mit Anti-EGFR-ELISA:
  • Quadrate: MAb 425-CH3-Überstand
  • Dreiecke: MAb 425-CH2-(NocI)-IL-8-Überstand
  • Umgekehrte Dreiecke: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8-Überstand
  • Kreise: pHCMV-Überstand
  • Abszisse: Verdünnung - Überstände
  • Ordinate: optische Dichte bei 490 nm.
    • Fig. 3a
  • Induktion von Chemotaxie durch COS-7-Transfektionsüberstände:
  • Spalte 1: Kontrolle DMEM/PS
  • Spalte 2: pHCMV-Überstand, unverdünnt
  • Spalte 3: MAb 425-CH3-Überstand, Verdünnung 1 : 14 (gemäß den EGFR-ELISA-Ergebnissen)
  • Spalte 4: MAb 425-CH3-Überstand, Verdünnung 1 : 28 (gemäß den EGFR-ELISA-Ergebnissen)
  • Spalte 5: MAb 425-CH2-(Bchl)-IL-8-Überstand, unverdünnt (1,76 · 10&supmin;¹&sup0; Mol/l*)
  • Spalte 6: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8-Überstand, Verdünnung 1 : 2
  • Spalte 7: MAb 425-CH2-(Ncol)-IL-8-Überstand, unverdünnt (2,0 · 10&supmin;¹&sup0; Mol/l*)
  • Spalte 8: MAb 425-CH2-(NcoI)-IL-8-Überstand, Verdünnung* 1 : 2 die IL-8-Konzentration wurde mittels ELISA (Amersham) bestimmt
  • Ordinate: Anzahl Zellen pro ausgezähltes Feld.
    • Fig. 3b:
  • Induktion von Chemotaxie durch gereinigtes IL-8
  • Ordinate: Anzahl Zellen pro ausgezähltes Feld.
  • Abszisse: IL-8-Konzentration (Mol/l)
    • Fig. 4:
  • Induktion von Chemotaxie durch MAb 425-CH1-IL-8 (E. coli):
  • Kreise: in E. coli exprimiertes MAb 425-CH1-IL-8
  • Quadrate: in E. coli exprimiertes MAb 425-F(ab')
  • Dreiecke: Kontrolle: Dulbeccos/BSA
  • Ordinate: Anzahl Zellen pro ausgezähltes Feld.
  • Abszisse: Konzentration (Mol/l)
    • Fig. 5:
  • Induktion der Freisetzung von Superoxid durch COS-7- Transfektionsüberstände:
  • Spalte 1: nichtstimulierte Zellen
  • Spalte 2: IL-8 10&supmin;&sup7; M
  • Spalte 3: MAb 425-CH2-(NcoI)-IL-8-Überstand, unverdünnt (2,0 · 10&supmin;¹&sup0; Mol/l*)
  • Spalte 4: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8-Überstand, unverdünnt (1,76 · 10&supmin;¹&sup0; Mol/l*)
  • Spalte 5: MAb 425-CH3-Überstand, unverdünnt (0 Mol IL-8-Konzentration wurde mittels ELISA (Amersham) bestimmt.
  • Ordinate: optische Dichte bei 550 nm
    • Fig. 6:
  • Induktion der Freisetzung von MPO durch COS-7-Transfektionsüberstände:
  • Spalte 1: nichtstimulierte Zellen
  • Spalte 2: mit Cytochalasin B stimulierte Zellen
  • Spalte 3: IL-8 10&supmin;&sup7;M
  • Spalte 4: MAb 425-CH3-Überstand, unverdünnt
  • Spalte 5: MAb 425-CH3-Überstand, verdünnt 1 : 2
  • Spalte 6: MAb 425-CH2-(NcoI)-IL-8-Überstand, unverdünnt
  • Spalte 7: MAb 425-CH2-(NcoI)-IL-8-Überstand, verdünnt 1 : 2
  • Spalte 8: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8-Überstand, unverdünnt
  • Spalte 9: MAb 425-CH2-(BclI)-IL-8-Überstand, verdünnt 1 : 2
  • Ordinate: % MPO-Aktivität im Vergleich zur MPO-Gesamtmenge (100%).
    • Genaue Beschreibung der Erfindung Allgemeines
  • Alle in der Anmeldung erwähnten Mikroorganismen, Zellinien, Plasmide, Promoter, Resistenzmarker, Replikationsursprünge, Restriktionsstellen oder andere Fragmente von Vektoren sind entweder als Handelsware oder andersartig allgemein verfügbar. Falls nicht anders angegeben, dienen sie nur als Beispiele und sind nicht wesentlich für die Erfindung; sie können durch andere geeignete Mittel bzw. biologische Materialien ersetzt werden.
  • Die Techniken, die erfindungswesentlich sind, sind unten ausführlich beschrieben. Andere Techniken, die nicht ausführlich beschrieben sind, entsprechen bekannten Standardverfahren, die einem Fachmann gut bekannt sind, oder sind ausführlicher in den Literaturangaben, Patentanmeldungen und der einschlägigen Literatur beschrieben (z.B. "Antibodies, A Laboratory Manual" [Antikörper: Ein Laborhandbuch], Harlow, Lane, Cold Spring Harbor, 1988).
    • Monoklonale Antikörper
  • Bei MAb 425 handelt es sich um einen gegen die Humankarzinomzellinie A 431 (ATCC CRL 1555) hergestellten monoklonalen Maus-IgG1-Antikörper. MAb 425 bindet an ein Polypeptidepitop der externen Domäne des menschlichen EFG-Rezeptors und konkurriert mit der Bindung von EGF. Es wurde gefunden, daß MAb 425 eine Tumorcytotoxizität in vitro vermittelt und das Tumorzellenwachstum bei von Epidermis- und Kolorektalkarzinom abgeleiteten Zellinien in-vitro supprimiert (Rodeck et al., Cancer Res. 47: 3692, 1987). Humanisierte Versionen und Hybridversionen von MAb 425 sind aus WO 92/15683 bekannt.
    • Chemokine
  • Für Chemokin codierende cDNAs wurden entweder von British Biotechnology Limited (Human-IL-8 BBG 44: Herrmann Biermann GmbH, Bad Nauheim, BRD) bezogen oder von aus der cytokinproduzierenden Humanzellinie U 937 (ATCC CRL 1593) isolierten mRNA produziert. Die Gesamt- RNA aus chemokinproduzierenden Zellen wurde mit RNAzol (WAK-Chemie, Deutschland) nach den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die RNA wurde anschließend in cDNA transkribiert, und für Chemokin codierende Sequenzen wurden mit PCR unter Verwendung geeigneter Primer, die von veröffentlichten DNA-Sequenzen abgeleitet wurden, amplifiziert.
    • Vektoren
  • pUC19 zählt zu einer Reihe von verwandten E. coli- Plasmidkloniervektoren mit hoher Kopienzahl und enthält Teile von pBR322 und M13mp19. pUC19 enthält den induzierbaren bakteriellen Lac-Promoter-Operator und anschließend daran eine multiple Klonierstelle (Yanisch-Perron et al. Gene 33: 103-109, 1985). pUC-Vektoren sind im Handel erhältlich (z.B. New England Biolabs).
  • Die pBluescript KS/SK+ und KS/SK- Phagemid-Vektoren sind pUC19-Abkömmlinge. Die Vektoren sind im Handel erhältlich (Stratagene, Heidelberg). Die prokaryontischen Expressionsvektoren beruhen auf dem pSW1-Vektor (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989), der ein Abkömmling des Vektors pUC19 ist. pSW1 enthält eine Sequenz, die für das Leader-Peptid des bakteriellen pelB-Gens aus Erwinia carotovora codiert (Lei et al., J. Bact 169: 4379-4383, 1987). Fremd-DNA kann leserastergerecht hinter die pelB-Leader-Sequenz eingebracht werden, um die Proteinexpression in das Periplasma zu dirigieren.
  • Der eukaryontische Expressionsvektor pHCMV (Gillies et al., Cell 33: 717, 1983) enthält den Replikationsursprung des, Simian Virus 40 (SV40) und die Promotor- und Enhancer-Region des menschlichen Zytomegalievirus. An die Promotor/Enhancer-Region schließt sich eine multiple Klonierstelle für die Einführung der zu exprimierenden Gene an. Bei diesem Vektor wurde die Hybridform der variablen Region der schweren Kette von MAb 425 und die cγ1CH2-Region in Fusion mit dem Chemokin am Ende der CH2-Domäne kombiniert, wodurch man ein Fusionsprotein der schweren Kette von MAb 425 erhält. Die Ig-Kette der Fusion kann dadurch in das Immunkonjugat assembliert werden, daß sie mit der entsprechenden leichten Kette unter Bildung einer monovalenten Antigenbindungsregion kombiniert wird, die dann unter Bildung eines divalenten Immunkonjugats, das für das Zielantigen spezifisch ist, assoziert werden kann. Die Konstrukte der schweren und der leichten Kette können in denselben oder in separate Vektoren eingebracht werden.
    • Expression von Fusionsproteinen in eukaryontischen Zellen Konstruktion der eukaryontischen Expressionsvektoren für die Expression von Fab 425-Chemokin-Fusionsprotein Fusion von Mab-425 und Chemokinen mittels PCR-Technik
  • Die konstante Region von Human-cγ1 wurde in pUC19 als BamHI/BamHI-Fragment eingeführt. Die konstante Region von cγ1 enthält zwei SacII-Spaltstellen, eine im 5'-Intron, 40 bp stromabwärts der 5' BamHI-Spaltstelle, und eine zweite 580 bp stromabwärts der 5' BamHI-Spaltstelle und 140 bp stromaufwärts des Anfangs der CH3-Domäne. Die zweite SacII-Spaltstelle eignet sich zum weiteren Subklonieren, und daher wurde die erste SacII-Spaltstelle durch Einführung einer SnaBI-Spaltstelle mit einem Adaptor zerstört. In diesem Konstrukt (ΔSacII cγ1) können Fragmente stromabwärts der SacII-Spaltstelle leicht ausgetauscht werden.
  • Human-IL-8 wurde aus dem Vektor pUC18 herausgeschnitten (BglII/EcoRI) und in pBluescript SK+ (Stratagene GmbH, Heidelberg) insertiert (SmaI/EcoRI) so daß die BglII- und die SmaI-Spaltstelle deletiert wurden. Das SacII/XbaI-Fragment des Klons ΔSacIIcγ1 wurde in pBluescript SK+ insertiert. Beide Gene wurden mittels PCR-Technik mit geeigneten Primern amplifiziert:
  • - für ΔSacIIcγ1: 3'-Primer: terminale Sequenz der CH2-Domäne und eine NcoI-Spaltstelle 5'-Primer: reverser Sequenzierprimer
  • - für IL-8 3'-Primer: universeller Sequenzierprimer 5'-Primer: eine NcoI-Spaltstelle und die Startsequenz von IL-8
  • Die Produkte wurden geschnitten und mit SK+ SacII/EcoRI ligiert. In der entstandenen Peptidsequenz ist das C-terminale Lysin der CH2-Domäne durch Methionin ersetzt, und das N-terminale Serin des IL-8-Teils durch Glycin.
  • Die neu geschaffene Sequenz an der Verbindungsstelle zwischen den beiden Polypeptiden lautet:
  • Das gleiche Verfahren wurde mit Primern (Tab. 1) durchgeführt, um eine BclI-Spaltstelle zwischen die beiden Gene einzufügen. Das entstandene Fusionsgen weist eine Bchl-Spaltstelle zwischen dem Gen für die konstante Region von cγ1 und dem IL-8-Gen auf; es werden die vollständige Sequenz der CH2-Domäne, zwei zusätzliche Aminosäuren (Valin, Isoleucin) und die IL-8-Sequenz ohne die ersten beiden Aminosäuren (Serin, Alanin) codiert.
  • Die neu geschaffene Sequenz an der Verbindungsstelle zwischen den beiden Polypeptiden lautet:
  • Die PCR-Produkte wurden in SK+ mittels der SacII- und EcoRI-Restriktionsspaltstellen subkloniert. Zur Expression in Eukaryonten wurden diese Fusionsgene in den pHCMV-Vektor kloniert. Tab. 1
    • Expression der Inuuunkonjugate in Eukaryontenzellen
  • Zur Expression von Immunkonjugaten in Eukaryontenzellen muß Vektor-DNA, die die schwere und leichte Kette enthält, in die Wirtszellen eingebracht werden. Es wurden viele verschiedene Verfahren beschrieben, wie zum Beispiel Elektroporation, DEAE-Dextran, Calciumphosphat, Lipofektin oder die Protoplastenfusion. Es können Wirtszellen beliebiger Art verwendet werden, solange die rekombinanten DNA-Sequenzen, die für das Immunkonjugat codieren, in diesem Zelltyp korrekt in mRNA transkribiert werden können. Bei den Wirtszellen kann es sich um Maus-Myelomzellen handeln, die kein Immunglobulin produzieren, wie Sp2/0-AG14 (ATCC CRL 1581), P3X63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) oder um Hamsterzellen wie CHO-K1 (ATCC CCL 61) oder CHO/DHFR- (ATCC CRL 9096) oder BHK-21 (ATCC CCL 10). Zur transienten Expression eignen sich COS-1 (ATCC CRL 1650) oder COS-7 (ATCC CRL 1651).
    • Transiente Expression von Immunkonjugaten
  • Der Expressionsvektor pHCMV enthält den Replikationsursprung des Simian Virus 40 (SV40). Die Zellinie COS-7 leitet sich von der Simian-Zellinie CV-1 ab, die mit einem für den Replikationsursprung defizienten SV40- Virus transformiert worden ist. Plasmide, die den SV40-Replikationsursprung enthalten, werden daher amplifiziert und die Produktion von Immunkonjugaten wird verbessert sein. Die Überstände wurden nach 72 Stunden geerntet und mittels ELISA auf EGF-Rezeptorbindung sowie Chemokinkonzentration untersucht.
    • Permanente Expression von Immunkonjugaten
  • Vektoren mit rekombinanten Konstrukten zur Expression von Immunkonjugaten werden in geeignete Wirtszellen eingebracht. Die Konstrukte mit der schweren und der leichten Kette können in denselben Vektor oder in separate Vektoren eingebracht werden; im letztgenannten Fall können die beiden Vektoren identische Selektionsmarker, wie Neomycinresistenz oder Dehydrofolatreduktase (DHFR), oder zwei unterschiedliche Selektionsmarker tragen, um auf das Vorhandensein beider Vektoren zu selektieren. Die Selektion auf den DHFR-Marker kann nur in DHFR-Negativzellinien wie CHO/DHFR- durchgeführt werden. Mischpopulationen werden mittels EGF-Rezeptor-spezifischem ELISA auf die Expression von Immunkonjugaten analysiert. Die weitere Selektion auf positive monoklonale Antikörper wird mittels Grenzverdünnungsklonierung durchgeführt.
    • Aufreinigung von MAb 425/Chemokin-Immunkonjugaten
  • Von der Wirtszelle produzierte MAb 425-Immunkonjugate lassen sich nach einem beliebigen Verfahren, wie der Affinitätschromatographie unter Verwendung von Zielantigen, Anti-Cytokin-Antikörpern oder anti-idiotypischen Antikörpern gewinnen und aufreinigen (z.B. Harlow, Lane, Zitat oben)
  • Im vorliegenden Fall wurde mit Antiidiotyp-Antikörpern, die von MAb 425 nach Standardverfahren produziert wurden, aufgereinigt (z.B. Kostelny et al., (1992), J. Immunol. 148, 1547).
  • Um zu reinen Fv-Immunkonjugaten zu gelangen, wurden für die Proteinexpression geeignete E. coli-Stämme mit den Expressionsplasmiden transformiert (siehe unten). Die Zellen wurden bis zu einer OD&sub5;&sub7;&sub8; = 0,5 gezüchtet und mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) (1 mM) induziert. Die Zellen wurden über Nacht gezüchtet, und die Überstände und Zellen wurden geerntet. Der Überstand wurde auf eine Anti-MAb 425-Anti-Idiotyp-Säule, die nach den üblichen Verfahren vorbereitet wurde, aufgetragen. Die Säule wurde mit phosphatgepufferter 0,5 M NaCl-Lösung gespült, und die gebundenen Proteine wurden mit 100 mM Glycin 0,5 M NaCl bei pH 2,5 eluiert. Das Eluat wurde sofort mit Tris 2,5 M pH 8,0 neutralisiert. Fraktionen, die MAb 425-CH1-IL8 enthielten, wurden gepoolt, eingeengt und gegen PBS dialysiert.
    • Konstruktion der prokaryontischen Expressionsvektoren für die Expression von Fab425-Chemokin- und Fv-Chemokin- Fusionsprotein
  • Das Fv-Fragment wurde nach Glockshuber et al. (Biochemistry 29: 1362-1367, 1990) hergestellt. Die DNA-Sequenzen, die für die leichte Kette und das Fd-Fragment der schweren Kette oder das Fv-Fragment codieren, wurden in die multiple Klonierstelle des Vektors pSW1 eingebracht. Die Codiersequenz für die reife leichte Kette, die Codiersequenz für die reife schwere Kette und die Codiersequenz für Fv stehen hinter dem Leader-Peptid des bakteriellen pelB-Gens. Die Codiersequenz für die schwere Kette enthält eine am 3'-Ende gelegene NcoI-Spaltstelle. Die für Chemokin codierenden cDNAs wurden mittels PCR so modifiziert, daß die NcoI-Spaltstelle (5'-Ende) und die NotI- Spaltstelle (3'-Ende) oder EcoRI-Spaltstelle (für die Fv-Fusion) eingeführt wurden. Die Chemokingene wurden leserastergerecht direkt in die CH1-Domäne der schweren Kette oder des Fv-Fragments fusioniert. Man kann jedoch auch ein Linker-Peptid, wie (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x, wobei x Werte von 1 bis 4 annehmen kann, zwischen die CH1-Domäne und das Chemokingen einführen. Solche Linker und Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus der Literatur bekannt (z.B. Curtis et al. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5809).
  • Diese Vektoren ermöglichen die wirksame Expression von funktionellen F(ab')- (= CH1) und Fv-Chemokin-Fusionsproteinen in E. coli. Das Leichte-Kette- und das Schwere-Kette-Chemokin-Fusionsprotein befinden sich auf einer Messenger-RNA mit zwei Cistrons unter der Kontrolle des induzierbaren Lac-Promotors (Skerra und Plückthun, Science 242: 1038-1040, 1988). Die Expression des Fab/Fv-Fusionsproteins kann daher entsprechend den Anforderungen für die Kulturbedingungen induziert werden. Die Translation der beiden Proteine von einer Messenger-RNA mit zwei Cistrons begünstigt die Synthese gleicher Mengen von Fd-Chemokin-Fusionsprotein und leichter Kette und erhöht so die Wahrscheinlichkeit, daß diese korrekt zu funktionellen Fab/Fv-Fusionsproteinen assembliert werden. Die beiden Polypeptide werden in das Periplasma von E. coli sezerniert, wo die Faltung, Ausbildung von Disulfidbrücken und Assemblierung zu einem funktionellen Fab 425-CH1/Fv-Fusionsprotein stattfindet. Eine längere Kultur der Bakterien führt zu einer teilweisen Permeabilisierung der äußeren Membran von E. coli und dadurch zur Diffusion der Fusionsproteine in das Kulturmedium.
    • Bindungseigenschaften der MAb 425-Immunkonjugate
  • Die Bindungseigenschaften der MAb 425-Immunkonjugate wurden in einem EGF-Rezeptor-spezifischen ELISA bestimmt. Kurz gesagt wurden Mikrotiterplatten über Nacht bei 4ºC mit gereinigtem EGF-Rezeptor beschichtet. Die Platten wurden mit fusionsproteinhaltigen Überständen bzw. Überständen, die nichtkonjugierte MAb-Fragmente enthielten, inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen, und an dem EGF-Rezeptor gebundener Antikörper wurde durch Inkubation mit Ziege-Anti-Mensch-IgG und -IgM (schwere und leichte Kette), die mit Peroxidase konjugiert waren, und anschließend mit Substrat nachgewiesen. Die Menge an gebundenem EGF-Rezeptor-spezifischem Protein wurde durch Messung bei 490 nm bestimmt.
    • Biologische Aktivität der MAb 425/IL-8-Immunkonjugate Isolation der Effektorzellen
  • Zur Bestimmung der biologischen Aktivität wurden menschliche neutrophile Granulozyten des peripheren Bluts aus Vollblut gesunder Spender wie zuvor bei Haslett et al. beschrieben (Am. J. Pathol. 119: 101-110, 1985) frisch isoliert. Das Plasma wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, die roten Blutkörperchen durch Dextran-Sedimentation und schließlich wurden die Lymphozyten und Leukozyten durch Zentrifugation in einem Perkoll-Gradienten abgetrennt. Die isolierten Neutrophile wurden sofort verwendet.
    • Chemotaxiebestimmung
  • Die Chemotaxie wurde nach Falk et al. (J. Immunol. Methods 33: 239-247, 1980) bestimmt. Kurz gesagt wurde eine 48-Well-Boyden-Kammer und 5 um-Membranen verwendet. Die gereinigten Neutrophile wurden in DMEM-Medium (DMEM, 1% Penicillin, 1% Streptomycin, 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES) in einer Konzentration von 1 · 10&sup6; Zellen/ml resuspendiert. Die unteren Näpfchen wurden mit den fusionsproteinhaltigen Überständen oder mit Kontrollüberständen befüllt und mit der Membran abgedeckt, und schließlich wurden die oberen Näpfchen mit der Zellsuspension befüllt. Nach 30minütiger Inkubation bei 37ºC wurden die Membranen entfernt und 10 Minuten lang in 2% Glutardialdehyd fixiert. Dann wurden die an der Membran haftenden Zellen 3 Minuten lang mit Weigertschem Eisenhämatoxylin (Sigma- Diagnostikum) gefärbt. Die Anzahl der an der Membran gebundenen Zellen wurde mikroskopisch bestimmt.
    • Bestimmung der Fähigkeit, die Enzymfreisetzung in Neutrophilen zu induzieren
  • Um die Fähigkeit der Immunkonjugate, bei Neutrophilen Granula freizusetzen, auszuwerten, wurde die Myeoloperoxidaseaktivität im Überstand verfolgt (Henson et al. J. Immunol. 121: 851, 1978). Der Assay wurde in 96-Well-Mikrotiterplatten mit 5 · 10&sup5;-Zellen pro Näpfchen durchgeführt. Nach der Inkubation (37ºC) mit den Stimulantien wurden die Platten zentrifugiert, und der zellfreie Überstand wurde auf eine andere 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben. Die zelifreien Überstände wurden mit Dianisidin (als Substrat) inkubiert und die Extinktion wurde bei 492 nm gemessen. Als positive Kontrolle wurde FMLP in einer Konzentration von 10&supmin;&sup7; M verwendet. Zur Bestimmung des Gesamtenzymgehalts wurden Zellen ohne Stimulantien mit Triton lysiert. Die Aktivität wurde als Prozentsatz des Gesamtenzymgehalts berechnet (Lyse).
    • Bestimmung der Fähigkeit, Superoxid freizusetzen
  • Cytochrom c wird durch O²&supmin; reduziert und verändert daher seine Extinktion. Die Veränderung der Extinktion stellt einen wichtigen Marker für die Schätzung der Superoxidaktivität dar. Der Assay wurde nach Guthrie et al. (J. Exp. Med. 160: 1656-1671, 1984) in 96-Well- Mikrotiterplatten mit 5 · 10&sup5; Zellen pro Näpfchen durchgeführt. Nach der Inkubation mit Stimulantien und Cytochrom c wurden die Platten zentrifugiert, und die Extinktion des Überstands wurde bei 550 nm bestimmt.
    • Sonstige Immunkonjugate
  • Anti-EGFR-CH1-, -CH2-, -CH3- und -Fv-Immunkonjugate (mit bzw. ohne Restriktionsstelle und Linker) wurden wie oben beschrieben hergestellt und untersucht, wobei MIP-2α und MIP-2ß als Chemokinbestandteil verwendet wurden. Diese Konstrukte weisen ähnliche Eigenschaften wie die IL-8-Derivate auf.
    • Therapeutische Anwendung der Immunkonjugate
  • Die erfindungsgemäßen Immunkonjugate lassen sich an menschliche Patienten für Therapiezwecke verabreichen. Ein Ziel der Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines pharmazeutischen Präparats mit mindestens einem wie oben und in den Ansprüchen definierten Fusionsprotein als Wirkstoff in Assoziation mit einem oder mehreren pharmazeutisch unbedenklichen Trägern, Exzipientien oder Streckmitteln für diesen Wirkstoff.
  • Die erfindungsgemäßen Immunkonjugate werden typischerweise intravenös oder parenteral injiziert. Im allgemeinen sind die Dosierbereiche für die Verabreichung der Immunkonjugate weit genug, um die erwünschte tumorsupprimierende und tumorlysierende Wirkung hervorzurufen. Die Dosierung hängt vom Alter, Zustand, Geschlecht bzw. der Schwere der Krankheit des Patienten ab und kann zwischen 0,1 mg/kg und 200 mg/kg, bevorzugt zwischen 0,1 mg/kg und 100 mg/kg pro Dosis in einer oder mehreren Verabreichungen pro Tag über einen oder mehrere Tage liegen.
  • Zu den Präparaten zur parenteralen Verabreichung zählen sterile wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Nichtwäßrige Lösungsmittel sind zum Beispiel Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie Olivenöl, sowie injizierbare organische Ester wie Ölsäureethylester und andere fachbekannte Lösungsmittel, die sich für diese Zwecke eignen. Die erfindungsgemäßen Immunkonjugate können in einer Zusammensetzung mit einem physiologisch unbedenklichen Träger verwendet werden. Zu solchen geeigneten Trägern zählen Kochsalzlösung, PBS, Ringersche Lösung oder Ringerlaktatlösung. Konservierungsstoffe und andere Zusatzstoffe wie Antibiotika, Antioxidantien sowie Cheliermittel können ebenfalls in den pharmazeutischen Präparaten vorliegen.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate eignen sich zur Behandlung von Tumoren verschiedenster Art, darunter Melanomen, Gliomen und Karzinomen, sowie festen Tumoren.

Claims (12)

1. Immunkonjugat mit einem monoklonalen Antikörper oder einem seiner Fragmente, der bzw. das gegen eine Tumorzelle gerichtet ist, die ein Antigenepitop des Epidermis-Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) trägt, sowie mit einem Chemokin- Protein, das mit dem Antikörper bzw. Antikörperfragment fusioniert ist, wobei es sich bei dem Chemokin um IL-8 handelt.
2. Immunkonjugat nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Antikörper um ein Fab-Fragment oder ein F(ab')&sub2;-Fragment handelt, das im wesentlichen aus der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers, der CH1-Domäne der konstanten Region sowie der entsprechenden leichten Kette besteht (Antikörper-CH1-Konjugat).
3. Immunkonjugat nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Antikörper um ein Antikörperfragment handelt, das im wesentlichen aus der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers, der CH1- und CH2-Domäne der konstanten Region sowie der entsprechenden leichten Kette besteht (Antikörper- CH2-Konjugat).
4. Immunkonjugat nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Antikörper um ein Antikörperfragment handelt, das im wesentlichen aus der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers, der CH1-, CH2- und CH3-Domäne der konstanten Region sowie der entsprechenden leichten Kette besteht (Antikörper- CH3-Konjugat).
5. Immunkonjugat nach Anspruch 1, wobei der Antikörper im wesentlichen aus der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers, der entsprechenden leichten Kette sowie einer Polypeptidsequenz, die die leichte und die schwere Kette verbindet, besteht (Antikörper-Fv-Konjugat).
6. Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 1-4 mit einer von einer DNA-Restriktionsstelle zwischen Antikörper/Antikörperfragment und IL-8 ableitbaren Aminosäure(-Sequenz), wobei innerhalb des vollständigen Fusionskonstrukts nur eine solche Restriktionsstelle vorliegt.
7. Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 1-5 mit einem Linker-Peptid zwischen Antikörper/Antikörperfragment und IL-8.
8. Immunkonjugat nach einem der Ansprüche 1-6, wobei der Antikörper bzw. das Antikörperfragment von einem Maus-, einem humanisierten oder einem Hybrid-MAb 425 stammt.
9. Immunkonjugat aus der Gruppe MAb 425-CH1-ILB, MAb 425-CH2-(NcoII)-IL8, MAb 425-CH2-(Bchl)-IL8, MAb 425-FV-IL8, MAb 425-CH3-IL8.
10. Verfahren zur Herstellung eines Immunkonjugats nach einem der Ansprüche 1-9 durch Fusionierung der für den Antikörper bzw. das Antikörperfragment und für IL-8 codierenden DNA-Sequenzen auf einer Einzelstrang-DNA mittels eines Oligonukleotids, das zu der gewünschten Fusions-DNA-Sequenz komplementär ist, Einbringen des erhaltenen Konstrukts in einen Expressionsvektor, der in den Wirtsorganismus transformiert wird, Züchten der Wirtszelle in einer Nährlösung und Exprimieren des Fusionsproteins.
11. Arzneimittelzusammensetzung mit mindestens einem der Immunkonjugate nach Anspruch 1-9 sowie einem physiologisch unbedenklichen Träger.
12. Verwendung eines Immunkonjugats nach einem der Ansprüche 1-9 zur Herstellung eines Arzneimittels gegen Tumore.
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