HU221989B1 - Tumorellenes hatású ellenanyag-konjugátumok és eljárás előállításukra - Google Patents

Tumorellenes hatású ellenanyag-konjugátumok és eljárás előállításukra Download PDF

Info

Publication number
HU221989B1
HU221989B1 HU9502711A HU9502711A HU221989B1 HU 221989 B1 HU221989 B1 HU 221989B1 HU 9502711 A HU9502711 A HU 9502711A HU 9502711 A HU9502711 A HU 9502711A HU 221989 B1 HU221989 B1 HU 221989B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
antibody
mab
conjugate
fragment
antibody fragment
Prior art date
Application number
HU9502711A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT75836A (en
HU9502711D0 (en
Inventor
Wolfgang Hölzer
Siegfried Matzku
Wolfgang Strittmatter
Ilka Von Hoegen
Original Assignee
Merck Patent Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent Gmbh filed Critical Merck Patent Gmbh
Publication of HU9502711D0 publication Critical patent/HU9502711D0/hu
Publication of HUT75836A publication Critical patent/HUT75836A/hu
Publication of HU221989B1 publication Critical patent/HU221989B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgyát új ellenanyag-konjugátumok képezik, amelyek ahumán EGF-receptor-molekulára specifikus mo- noklonális ellenanyagotvagy ellenanyag-fragmentumot, valamint a kemokinprotein-család egytagját, előnyösen a C-- X-C-család egy tagját, például interleukin–8-at (IL–8-at) tartalmaznak. Az ellenanyag-konjugátumok citotoxikus éskemotaktikus hatással rendelkeznek, és célzott tumorellenes terápiáraalkalmazhatók. ŕ

Description

A találmány tárgyát olyan új fúziós proteinek (ellenanyag-konjugátumok) képezik, melyek egyrészt egy tumorspecifikus célba juttató elemet - előnyösen valamely, elsősorban emberi tumorsejtek felszínén kifejeződő molekulát, például az emberi epidermális növekedé- 5 si faktor receptorát (EGFR-t) felismerő monoklonális ellenanyagot vagy ellenanyag-fragmentumot -, másrészt pedig egy biológiailag aktív ligandumot, például egy kemokin proteint, előnyösen a C-X-C-családba tartozó proteint tartalmaznak. 10
A találmány szerinti fúziós proteinek alkalmasak arra, hogy a részüket képező biológiailag aktív ligandumot eljuttassák egy meghatározott sejthez vagy szövethez.
A találmány tárgyát képező ellenanyag-konjugá- 15 tumok elsősorban tumorterápiában történő felhasználásra alkalmasak.
A rákos megbetegedésekben szenvedő páciensek kezelésére sok különböző terápiás eljárást alkalmaznak.
Az utóbbi években klinikai vizsgálatokat folytattak 20 olyan monoklonális ellenanyagokkal, melyek specifikusan vagy elsődlegesen malignussejteken kifejeződő sejtfelszíni molekulákat ismernek fel. Ennek a terápiás megközelítési módnak az a célja, hogy a tumorsejtek eltávolítása céljából ellenanyagfüggő celluláris citotoxici- 25 tást (ADCC-t) vagy komplement közvetítette citotoxicitást (CDC-t) idézzen elő. Egy másik megközelítési mód az immunválasz citokinek által közvetített aktiválása. A citokinindukált tumorellenes aktivitás a következő módokon közvetítődhet: 30
1. a citokin közvetlen citotoxikus/citosztatikus hatást fejt ki a tumor növekedésére,
2. valamely tumorantigén-aspecifikus mechanizmuson keresztül, mint például a LAK-aktivitás vagy a monocita/makrofág közvetítette citotoxi- 35 citás,
3. CD4- és CD8-pozitív T-sejtek által közvetített tumorantigén-specifikus immunválaszok útján.
Ebben az esetben az állatkísérletes modelleken szisztémás tumorellenes immunitást figyeltek meg. 40
A citokinek nagy dózisainak citotoxikus hatása, valamint in situ nem megfelelő jelenléte vezetett a célba juttatásos tumorterápiás módszer kifejlesztéséhez.
A célba juttatásos tumorterápiás módszer elve egy célba juttató molekula, például egy tumorral kapcsolatos 45 antigénre specifikus monoklonális ellenanyag és egy biológiailag aktív effektormolekula közti fizikai kötés létrehozásán alapul. Az effektormolekulák célba juttató molekula által történő célba juttatása növeli a tumorban a citokinkoncentrációt és csökkenti a szükséges maxi- 50 mális dózist. Állatkísérletes modelleken igazolták, hogy a citokinek in situ jelenléte a tumorban - akár intratumorális injekciózás, akár transzfektált tumorsejtek általi szekréció idézte elő - a tumor visszafejlődéséhez vezethet [Colombo és Fomi:. Immunology To- 55 day 75, 48 (1994)]. Ezekben a rendszerekben a citokinek nem gátolják a tumorsejtek proliferációját, de képesek gyors és hatásos tumorellenes reakciót indukálni. Ebből következik, hogy egy effektormolekula és egy célba juttató elem fizikai kombinációja lehetőséget 60 nyújt a biológiailag aktív ligandum perifériális jelenlétének csökkentésére, és intratumorális jelenlétének fokozására. Ezenfelül az ilyen molekulák segítségével különálló tumorsejtek és mikrometasztázisok is megcélozhatok.
Az ellenanyag irányította célbajuttatásos módszerhez olyan biológiailag aktív ligandumra van szükség, amely képes közvetlenül vagy a célsejtre nézve letális környezet előidézése útján a célsejt pusztulását okozni. A biológiailag aktív ligandum lehet valamilyen citokin, mint például az IL-1, az IL-2, az IL-4, az IL-6, az IL-7, az IL-10, az IL-13, az IFN-ok, a TNFa vagy a CSF-ek. Ezekről a citokinekről bizonyítottok, hogy képesek tumorellenes hatást kiváltani vagy közvetlenül, vagy a gazdaszervezet valamilyen védekező mechanizmusának aktiválása útján [Mire-Sluis, TIBTECH 77, 74 (1993); Colombo és munkatársai: Cancer Rés. 52, 4853 (1992); Thomas és Balkwill.: Pharmac. Ther. 52, 307(1991)].
A legtöbb felsorolt citokin képes ugyan effektorsejtek aktiválására, de azokra egyáltalán nem fejt ki kemotaktikus aktivitást, vagy csak kismértékű kemotaktikus aktivitást fejt ki, tehát a tumorszövetben megfelelő mennyiségű effektorsejt jelenlétének hiányában a tumorellenes hatás gyenge lehet.
A kemokinek azonban számos effektorsejttel szemben kemotaktikus aktivitást mutatnak, így azok mennyiségét a tumor helyén fokozzák, ezenkívül különböző effektorsejt-funkciókat indítanak be [lásd például: Miller és Krangel: „Biology and Biochemistry of the Chemokines: A Növel Family of Chemotactíc and Inflamatory Cytokines”, Critical Reviews in Immunology 72, 17 (1992)].
Az IL-8, a MIP-2a (amely GRO-b-ként is ismert), valamint a MIP-2b (GRO-g) a C-X-C-elnevezésű kemokin főcsalád tagjai (amelyek kis citokin főcsaládként vagy interkrinekként is ismertek). A fenti molekulák kemotaktikus faktorokként működnek és effektorsejt-funkciókat aktiválnak, ezért optimálisak lehetnek effektormolekulákként történő alkalmazás céljára. A C-X-C-kemokinek fenti családja nemrégiben leírt, kisméretű (8-10 kD) proteineket tartalmaz, amelyek aminosavszekvenciája 20-50%-os homológiát mutat, és amelyek kemotaktikus, valamint gyulladásfokozó hatással rendelkeznek. Az IL-8 jól meghatározott háromdimenziós struktúrával rendelkezik [Core és munkatársai: Biochemistry 29, 1689 (1990)] és több C-X-Ckemokinnel megegyező N-terminális ELR-elemet tartalmaz. Várható, hogy a C-X-C-kemokinek közti szekvenciahomológiának köszönhetően azok háromdimenziós struktúrája igen hasonlónak fog bizonyulni. Ezt a MCAF/MCP-1 esetében már igazolták [Gronenbom és Clore: Prof. Eng. 4, 263 (1991)].
Az IL-8 oldatban stabil dimereket képez [Clore és munkatársai: Biochemistry 29, 1689 (1990)], és lehetséges, hogy két IL-8-monomer kölcsönhatása révén diniért képező F(ab’)-IL-8 fúziós protein bivalens immunkonjugátumot hozzon létre. Ez a dimerképzés erősíti a fúziós protein és az antigén közt létrejövő kölcsönhatást.
HU 221 989 Β1
A C-X-C-csoport ez idáig leírt tagjai elsősorban neutrofil granulocitákra fejtik ki hatásukat. A felelős géneket a 4. kromoszómán lokalizálták. Az említett csoport tagjai közé tartoznak a felsoroltak: a PF4, a vérlemezke bázikus protein, a hIPlO, az IL-8, a MIP-2a, és 5 a MIP-2b. A fenti proteinek hatása a neutrofil granulocitákra kemotaktikus aktivitásban, degranulációban és az oxidáció nagymértékű fokozódásában nyilvánul meg [Sherry és Cerami: Current Opinion in Immunoi.
3, 56 (1991); Oppenheim és munkatársai: Annu. Rév. 10 Immunoi. 9, 617 (1991); Miller és Krangel: Critical Reviews in Immunology 12, 17 (1992); Clark-Lewis és munkatársai: J. Bioi. Chem. 266, 23128 (1991)].
Az előzővel közeli rokonságot mutató C-C-kemokincsalád tagjai elsősorban monocitákra fejtik ki hatású- 15 kát. Valamennyi gént a 17. kromoszómán lokalizálták. Idetartoznak az LD-78-, az Act-2-, a MCAF-, az 1309- és a RANTES-proteinek. A fenti molekulák erős kemotaktikus hatást fejtenek ki monocitákra [Matsushima és munkatársai: Chem. Immunoi. 57, 236 20 (1992); Oppenheim és munkatársai: Annu. Rév. Immunoi. 9, 617 (1991)].
Az epidermális növekedési faktor (EGF) egy epidermális és epiteliális sejtek számára mitogén polipeptidhormon. Amennyiben az EGF kölcsönhatásba kerül szén- 25 zitív sejtekkel, azok membránreceptoraihoz (EGFR) kötődik. Az EGFR egy közelítőleg 170 kD molekulatömegű transzmembrán glikoproteín, mely a c-erb-B-protoonkogén terméke.
A MAb-425 jelű monoklonális egérellenanyagot 30 az A431 jelű humán karcinóma-sejtvonal (ATCC CRL 1555) ellen termeltették, és kimutatták róla, hogy egy, az EGFR-sejten kívüli doménjén található polipeptidepitóphoz kötődik. Azt találták, hogy ez az ellenanyag gátolja az EGF receptorkötődését, valamint, hogy in 35 vitro közvetíti a tumorcitotoxicitást, és in vitro gátolja a sejtek növekedését az epidermális és kolorektális karcinómaeredetű sejtvonalakban [Rodeck és munkatársai: Cancer Rés. 47, 3692 (1987)]. A MAb-425 humanizált és kíméraváltozatai a WO 92/15683 számú 40 közzétételi iratból ismertek.
Az elmondottak alapján célul tűztük ki olyan ellenanyagok vagy ellenanyag-fragmentumok előállítását, melyek tartalmaznak 1. egy tumorsejtek felszínén található EGFR-antigént felismerő epitópot és 2. egy bioló- 45 giailag aktív ligandumot, amely effektorsejtjeire erős kemotaktikus hatást fejt ki, az előbbiek alkalmazása ily módon alacsony toxicitású célzott tumorterápiát tesz lehetővé. Az fenti immunkonjugátumok tehát fejlődést jelentenek a megfelelő citokinellenanyag-immunkonju- 50 gátumokhoz képest, amelyek tumorlízist előidéző hatásuk tekintetében hasonló hatást mutatnak, de abban a tekintetben nem hasonlítanak az előbbiekhez, hogy nem képesek kemotaktikus sajátságaik révén egy adott helyre hatékonyan effektorsejteket vonzani. 55
A találmány tárgyát olyan fúziós proteinek képezik, melyekben egy monoklonális ellenanyag vagy annak egy része - minimálisan az EGFR egy epitópjának felismerésére képes antigénfelismerő hely, vagy a teljes monoklonális ellenanyag - kombinálva van egy bioló- 60 giailag aktív ligandummal, amely valamely kemokin, előnyösen a C-X-C-családba tartozó kemokin, legelőnyösebben IL-8. Az ilyen fúziós proteineket kódoló konstrukciókat rekombináns-DNS-technológiai módszerekkel állítjuk elő. A fúziós proteinek a biológiailag aktív ligandumhoz kapcsolva tartalmazzák az ellenanyag nehéz láncának variábilis régióját, valamint a konstans régió CHl-doménjét (CHl-ellenanyag-konjugátumok, Fab-fragmentum), valamint a megfelelő könnyű láncot, vagy az ellenanyag nehéz láncának variábilis régióját, valamint a konstans régió CHI- és CH2-doménjét, vagy pedig az ellenanyag nehéz láncának variábilis régióját, valamint a konstans régió CH1-, CH2- és CH3-doménjét. A megfelelő könnyű lánc előzővel együtt történő expresszálásával olyan fúziós proteineket állíthatunk elő, melyek az antigénprezentáló sejteket célozzák, és így képesek az aktív ligandumot a szervezet egy meghatározott helyére eljuttatni.
Hasonlóképp nyerhetünk más ellenanyag-konjugátumokat oly módon, hogy, a kemokint az ellenanyag Fv-fragmentumának C-terminális végével fuzionáltatjuk. Ebben az esetben, nehéz és könnyű lánc egyetlen polipeptidként expresszálódik, amelyben mindkét elemet megfelelő kapcsolószekvenciával kombináljuk, hogy biztosítsuk az antigénkötő hely megfelelő térszerkezetének kialakulását („folding’’). A különböző konstrukciókat az 1. ábra mutatja.
Az ellenanyag-konjugátumok expresszálódása új molekulákat eredményez, amelyek két funkciót egyesítenek: először, azok antigénprenzentáló (EGFR) sejteket céloznak meg, másodszor, egy aktív ligandumot a szervezetben meghatározott helyre juttatnak el. Ezek a ligandumok hatékony kemoattraktánsok és aktiválómolekulák, amelyek a tumor helyén effektorsejtek beszűrődését eredményezik, és ezt követően a tumor pusztulását okozhatják.
A találmány tárgyát képező ellenanyag-konjugátumokkal olyan tumorok detektálhatok és kezelhetők eredményesen, mint például melanoma, a glioma és a karcinóma, anélkül, hogy számottevő általános toxikus hatások lépnének föl.
Az elmondottak értelmében a találmány tárgyához tartoznak olyan ellenanyag-konjugátumok, melyek tartalmaznak (1) egy monoklonális ellenanyagot vagy annak egy fragmentumát, amely képes felismerni olyan tumorsejteket, melyek az epidermális növekedési faktor receptorának (EGFR) egy antigénepitópját hordozzák, és (2) egy kemokinprotein-ligandumot, amely az ellenanyaghoz vagy ellenanyag-fragmentumhoz van fuzionáltatva.
Különböző kemokincsoportok ismertek, például a C-X-C- és a C-C-kemokinek.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a kemokinprotein a C-X-C-családba tartozik.
A C-X-C-családon belül a találmány szerint előnyös az IL-8 alkalmazása.
A találmány tárgyát képezik tehát olyan ellenanyag-konjugátumok, amelyekben a kemokinprotein a C-X-C-családba tartozik, és előnyösen interleukin-8 (IL-8).
, ι,ψ, 4ϋφ'Ι^)«*»ΙΙ[Μ.ι^> ...............
HU 221 989 Bl
A találmány szerinti megoldásban alkalmazható ellenanyagok vagy teljes ellenanyagok vagy azok fragmentumai. Alkalmazható fragmentumok például az Fv-, az Fab,- vagy F(ab’)2- (a leírásban használt elnevezés szerint CHl-ellenanyag-fragmentumok), CH3- és CH2- 5 ellenanyag-fragmentumok (1. ábra). A találmány szerint előnyösek az Fv-, CH1-, CH2- és CH3-ellenanyag-fragmentumok.
A találmány tárgyát képezik olyan ellenanyag-konjugátumok, melyekben az ellenanyag egy Fab-frag- 10 mentum vagy F(ab’)2-fragmentum, amely legalább tartalmazza az ellenanyag nehéz láncának variábilis régióját, a konstans régió CHl-doménjét, valamint a megfelelő könnyű láncot (CHl-ellenanyag-konjugátum), a találmány tárgyát képezik továbbá olyan ellenanyag-konju- 15 gátumok, amelyekben az ellenanyag egy ellenanyag-fragmentum, amely minimálisan tartalmazza az ellenanyag nehéz láncának variábilis régióját, a konstans régió CH1- és CH2-doménjét, valamint a megfelelő könnyű láncot (CH2-ellenanyag-konjugátum), ezenkívül a talál- 20 mány tárgyát képezik olyan ellenanyag-konjugátumok, amelyekben az ellenanyag egy teljes ellenanyag, amely legalább tartalmazza az ellenanyag nehéz láncának variábilis régióját, a konstans régió CH1- és CH2- és CH3doménjét, valamint a megfelelő könnyű láncot (CH3-el- 25 lenanyag-konjugátum), végül, a találmány tárgyát képezik olyan ellenanyag-konjugátumok, amelyekben az ellenanyag legalább tartalmazza az ellenanyag nehéz láncának variábilis régióját, a megfelelő könnyű láncot, valamint egy, a könnyű és nehéz láncot összekapcsoló poli- 30 peptidszekvenciát (Fv-ellenanyag-konjugátumok).
A találmány szerinti ellenanyag-konjugátumok kívánság szerint az ellenanyag (fragmentum) és a kemokmprotein között tartalmazhatnak egy restrikciós hasítási helyet, amely lehetővé teszi például meghatározott 35 kapcsolópeptid közbeiktatását, abból a célból, hogy biztosítsuk a konjugátumnak a célzott epitóphoz történő optimális kötődését. Alkalmas kapcsolópeptidek és azok közbeiktatására szolgáló eljárások a technika állása szerint jól ismertek, és azokat az alábbiakban ismer- 40 tétjük. A találmány szerinti megoldásban restrikciós hasítási helyként az adott DNS-konstrukcióban egyedi hasítási helyet választunk. Előnyös restrikciós hasítási helyek az Ncol és Bell hasítási helyek.
A találmány tárgyát képezik tehát olyan ellen- 45 anyag-konjugátumok, amelyek az ellenanyag/ellenanyag-fragmentum és a biológiailag aktív ligandum között olyan aminosavat (aminosavszekvenciát) tartalmaznak, amely alapján következtetett DNS-szekvencia egy, a teljes fúziós konstrukción belül egyedi restrik- 50 ciós hasítási helynek felel meg.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan ellenanyag-konjugátumok, amelyek az ellenanyag/ellenanyag-fragmentum és a biológiailag aktív ligandum között egy kapcsolópeptidet tartalmaznak. 55
Lényegében valamennyi ellenanyag alkalmazható, amely tumorsejtek felszínén található EGF-receptorokkal szemben irányul. A találmány szerinti megoldásban előnyös azonban a MAb-425 monoklonális ellenanyag alkalmazása. 60
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan ellenanyag-konjugátumok, amelyekben az ellenanyag vagy ellenanyag-fragmentum egér-, humanizált vagy kiméra-Mab-425-ellenanyagból származik, és előnyösen a következőkben megadott szerkezetek valamelyikével rendelkezik: MAb-425-GHl-IL-8, MAb-425CH2-(NcoI)-IL-8, MAb-425-CH2-(BclI)-IL-8, MAb-425-Fv-IL-8, MAb-425-CH3-IL-8.
A találmány tárgyához tartozik ezenfelül egy eljárás a fentiekben, az alábbiakban és az igénypontokban definiált ellenanyag-konjugátumok előállítására, oly módon, hogy az ellenanyagot vagy ellenanyag-fragmentumot és a biológiailag aktív ligandumot kódoló DNS-szekvenciákat a kívánt fúziós DNS-szekvenciával komplementer oligonukleotid alkalmazásával egyszálú DNS-en egymással fúzionáltatjuk, az eredményül kapott konstrukciót expressziós vektorba illesztjük, az így előállított expressziós vektort a gazdaszervezetbe transzformáljuk, a gazdasejteket tápoldatban tenyésztjük, és a fúziós proteint expresszáltatjuk.
A találmány szerinti ellenanyag-konjugátumok terápiás célra alkalmazhatók.
A találmány tárgyához tartozik ezenfelül egy gyógyászati készítmény is, amely legalább egy, a fentiekben, az alábbiakban és az igénypontokban definiált ellenanyag-konjugátumot, valamint fiziológiásán elfogadható hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokat tartalmaz.
Célul tűztük ki olyan fúziós proteinek előállítását, amelyek célba juttató elemként egy monoklonális ellenanyagot, effektormolekulaként pedig az IL-8-kemokint tartalmazzák, amely kemotaktikus és aktiváló sajátságokkal rendelkezik.
Elsőként mutattuk ki, hogy az IL-8 és más kemokinek (például a ΜΙΡ-ek) megtartják biológiai aktivitásukat abban az esetben is, ha N-terminális végűket további aminosavak hozzáadásával, példád az ellenanyagegység hozzáadásával blokkoljuk. Ez a molekula tehát alkalmazható lehet célzott tumorellenes terápiára, mivel az effektorsejteket az EGF-receptor-pozitív tumorsejtekkel szemben mozgósítja, és azok in situ aktiválódnak.
Kimutattuk, hogy a Mab-425-ellenanyag nehéz láncát és az IL-8-proteint kódoló cDNS-ek molekuláris biológiai eljárásokkal fúzionáltathatók, a proteinek megfelelő expressziós rendszerben expresszáltathatók, és a fúziós proteinben az EGF-receptorhoz történő kötődés képessége megmarad (2. ábra).
Az IL-8 első számú célpontját neutrofil granulociták képezik, amelyek három biológiai funkcióval rendelkeznek:
1. kemotaktikus mozgásra képesek egy kemotaktikus gradiensen keresztül,
2. proteolitikus enzimeket tároló granulákat ürítenek a környezetbe,
3. szuperoxidanionok közvetlen termelése (az oxidáció nagymértékű fokozódása).
Az elmondottak értelmében, vizsgáltuk a MAb-425/NcoI/IL-8 és MAb-425/BclI/IL-8 fúziós proteinek kemotaktikus aktivitását, valamint azok MPO-felszabadulásra és szuperoxidkibocsátásra kifejtett hatását.
HU 221 989 Β1
Kimutattuk továbbá, hogy a találmány szerinti fúziós proteinek (például az MAb-425/NcoI/IL-8 és MAb-425/BclI/IL-8) kemotaktikus aktivitással rendelkeznek, valamint fokozzák az MPO-felszabadulást és a szuperoxidkibocsátást. A 3a. ábrán bemutatott eredmé- 5 nyék szerint mindkét fúziós protein kemotaktikus aktivitást fejt ki humán neutrofil sejtekre, a rekombináns IL-8-nak megfelelő nagyságrendben (3b. ábra).
A MAb-425-NcoI-IL-8 és MAb-425/BclI/IL-8 fúziós proteineken felül, amelyek divalens formában épül- 10 nek össze, monovalens F(ab’)-IL-8 fúziós proteint is előállítottunk, amelyet E. coft-ban expresszáltattunk, majd tisztítottunk. A 4. ábra azt mutatja, hogy az F(ab’)-IL-8 fúziós protein a fentiek szerint, E. coli-ban expresszáltatott és tisztított MAb-425F(ab’)-protein- 15 hez képest kemotaktikus hatást fejt ki humán neutrofil sejtekre.
A MAb-425/BclI/IL-8 fúziós protein, összehasonlítva a szabad IL-8-cal fokozottan képes a szuperoxidfelszabadulás fokozására (5. ábra), a MAb-425-NcoI- 20 IL-8 fúziós protein kevésbé aktív, de az értékek ebben az esetben is szignifikánsan magasabbak a kontrollértékeknél (5. ábra). Az Mab-425 egymagában nem mutatott aktivitást. Valamennyi vizsgálatban a aktivitásfokozó szerként citokalazin-B-t alkalmaztunk, amely önma- 25 gában nem rendelkezik aktivitással (az adatokat nem tüntettük fel).
Mindkét fúziós protein mieloperoxidáz (MPO)felszabadulást váltott ki, de a MAb-425-NcoIIL-8 fúziós protein aktívabbnak bizonyult, mint a 30 MAb-425/BclI/IL-8 fúziós protein (6. ábra). Valamennyi adatot tritonnal lizáltatott sejtekkel kapott értékekre vonatkoztattunk, melyeket 100% enzimtartalomnak megfelelő értékeknek tekintettünk. Valamennyi adatot úgy kaptuk, hogy a aktivitásfokozó szerként cito- 35 kalazin-B-t alkalmaztunk.
A korábbiakban kimutatták, hogy az IL-8-molekula nagymértékben konzervált E-L-R-elemet hordozó N-terminális vége szükséges a receptorkötődéshez és a szignáltranszdukcióhoz. Az IL-8 háromdimenziós 40 struktúrája olyan homodimert mutat, amelyben mindkét N-terminális vég hozzáférhető pozícióban található. Feltehető volt, hogy amennyiben az N-terminális végeket további aminosavak hozzáadásával blokkoljuk, az hatással lesz az IL-8 biológiai aktivitására. Ezért, a két 45 cDNS közé restrikciós hasítási helyeket (Ncol/Bcll) iktattunk be, hogy azok közé kapcsolópeptideket építsünk be, és ezáltal az N-terminális vég hozzáférhetőségét visszaállítsuk.
Egyéb eljárások alkalmazása a fúziós proteinek elő- 50 állítására, például a két elem kémiai összekapcsolása, nem kielégítően meghatározott, tételről tételre változó struktúrák létrejöttéhez vezethet. Ezenkívül, a kémiai összekapcsolás hátrányosan megváltoztathatja a ligandum másodlagos szerkezetét, vagy olyan helyzet állhat 55 elő, amelyben a legtöbb protein a receptorkötés vonatkozásában inaktív, mivel a szükséges struktúrák nem hozzáférhetőek. A találmány szerinti megoldás ezzel szemben jól meghatározott struktúrával rendelkező fúziós proteineket eredményez, amelyek reprodukálható 60 minőségben, csaknem korlátozás nélkül expresszáltathatók.
Összefoglalva, a találmány szerinti fúziós proteinek az alább felsorolt sajátságokkal rendelkeznek:
- EGFR-pozitív sejtekhez kötődnek;
- kemotaktikus aktivitást hoznak létre;
- MPO- és szuperoxidfelszabadulást váltanak ki;
- in situ tumorlízist hoznak létre.
A találmány szerinti ellenanyag-konjugátumok tehát alkalmazhatók tumorellenes terápiára.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt táblázatot és ábrákat.
1. táblázat: Ncol vagy Bell hasítási helyek előállításához használt PCR-láncinditók szekvenciája (eukarióta expresszió céljára felhasználható fúziós proteinek előállítása).
1. ábra: Az ellenanyag-citokin-konjugátumok modellje
C=citokin; VH=a nehéz lánc variábilis régiója;
VL=a könnyű lánc variábilis régiója; CH=a nehéz lánc konstans régiója; CL=a könnyű lánc konstans régiója;
2. ábra: Mab-425 kimutatása transzfektált COS-7sejtek felülúszójában EGFR-specifikus ELISA-teszttel mérve:
négyzetek: MAb-425-CH3-felúszó háromszögek: MAb-425-CH2-(NcoI)-IL- 8-felülúszó csúcsukon álló háromszögek: MAb-425-CH2(BclI)-IL-8-felülúszó pontok: pHCMV-felülúszó
A vízszintes tengelyen a felülúszó hígítását ábrázoltuk, a függőleges tengelyen pedig a 490 nm-en mért abszorbanciát.
3a. ábra: kemotaxis kiváltása transzfektált COS-7sejtek felülúszójával:
1. oszlop: kontroll DMEM/PS
2. oszlop: hígítatlan pHCMV-felülúszó
3. oszlop: 1:14 arányban hígított MAb-425-CH3felülúszó (az EGF-r-ELISA eredményeinek megfelelően)
4. oszlop :1:28 arányban hígított MAb-425-CH3-felülúszó (az EGF-r-ELISA eredményeinek megfelelően)
5. oszlop: hígítatlan MAb-425-CH2-(BclI)-IL-8felülúszó (1,76 x 10->θ mol/1*)
6. oszlop: 1:2 arányban hígított MAb-425-CH2(BclI)-IL-8-felülúszó
7. oszlop: hígítatlan MAb-425-CH2-(NcoI)-IL-8felülúszó (2,0 x 10-10 mol/1*)
8. oszlop: 1:2 arányban hígított MAb-425-CH2(NcoI)-IL-8-felülúszó. Az IL-8-koncentrációkat ELISA-eljárással határoztuk meg (Amersham).
A függőleges tengelyen a vizsgált mezőkben található sejtek számát ábrázoltuk.
3b. ábra: kemotaxis kiváltása tisztított IL-8-cal.
A függőleges tengelyen a vizsgált mezőkben található sejtek számát, a vízszintes tengelyen pedig az IL-8koncentrációt ábrázoltuk (mol/1).
4. ábra: kemotaxis kiváltása MAb-425-CHl- |=
IL-8-cal (E. coli):
pontok: E. coli-baa expresszáltatott MAb-425- r
CH1-IL-8
HU 221 989 Β1 négyzetek: E. coli-ban expresszáltatott MAb-425F(ab’) háromszögek: kontroll, BSA-tartalmú Dulbeccoféle oldat.
A függőleges tengelyen a vizsgált mezőkben találha- 5 tó sejtek számát, a vízszintes tengelyen pedig a koncentrációt ábrázoltuk (mol/1).
5. ábra: szuperoxidfelszabadulás kiváltása transzfektált COS-7-sejtek felülúszójával
1. oszlop: kezeletlen sejtek 10
2. oszlop: 10-7 mol/1 IL-8
3. oszlop: hígítatlan MAb-425-CH2-(NcoI)-IL-8felülúszó (2,0 χ 10-·° mol/1*)
4. oszlop: hígítatlan MAb-425-CH2-(BclI)-IL-8felülúszó (1,76 χ 10~1θ mol/1*) 15
5. oszlop: hígítatlan MAb-425-CH3-felülúszó (0 mol/1).
♦: Az IL-8-koncentrációt ELISA-eljárással határoztuk meg (Amersham).
A függőleges tengelyen az 550 nm-en mért abszor- 20 banciát ábrázoltuk.
6. ábra: MPO-felszabadulás kiváltása transzfektált COS-7-sejtek felülúszójával
1. oszlop: kezeletlen sejtek
2. oszlop: citokalazin-B-vel stimulált sejtek 25
3. oszlop: 10~7 mol/1 IL-8
4. oszlop: hígítatlan MAb-425-CH3-felülúszó
5. oszlop: 1:2 arányban hígított MAb-425-CH3-felülúszó
6. oszlop: hígítatlan MAb-425-CH2-(NcoI)-IL-8- 30 felülúszó
7. oszlop: 1:2 arányban hígított MAb-425-CH2(NcoI)-IL-8-felülúszó
8. oszlop: hígítatlan MAb-425-CH2-(BclI>IL-8felülúszó 35
9. oszlop: 1:2 arányban hígított MAb-425-CH2(BclI)-IL-8-felülúszó
A függőleges tengelyen a teljes MPOmennyiséghez (100%) viszonyított, %-ban kifejezett MPO-aktivitást ábrázoltuk. 40
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.
A leírásban említett egyéb mikroorganizmusok, sejtvonalak, plazmidok, promoterek, rezisztenciamarkerek, ieplikációs origók, restrikciós hasítóhelyeket tartalmazó 45 és egyéb vektorfragmentumok kereskedelmileg vagy máshogy általánosan hozzáférhetők. Ellenkező értelmű megjegyzés hiányában ezeket az eszközöket és anyagokat kizárólag példaként alkalmazzuk, a találmány megvalósítása szempontjából nem esszenciálisak, és más megfelelő 50 eszközzel vagy biológiai anyaggal helyettesíthetők.
A találmány megvalósítása szempontjából esszenciális módszereket az alábbiakban részletezzük. Az alkalmazott egyéb módszerek - melyeket az alábbiakban nem részletezünk - szakember számára jól ismertek, 55 vagy részletesen ismertetve vannak az idézett publikációkban és szabadalmi bejelentésekben, valamint az alapvető szakirodalomban [mint például: „Antibodies,
A Laboratory Manual”, Harlow, Lane, Cold Spring Harbor (1988)]. 60
Monoklonális ellenanyagok
A MAb-425 egy egéreredetű monoklonális IgGlellenanyag, melyet a humán A431 jelű karcinóma-sejtvonal (ATCC CRL 1555) ellen termeltettek. A MAb-425 a humán EGF-receptor sejten kívüli doménjének egy polipeptidepitópjához kötődik, az EGF-kötődéssel kompetícióban. A MAb-425-ről kimutatták, hogy ír vitro tumorcitotoxicitás-közvetítő és in vitro az epidermális és kolorektális eredetű sejtvonalakban a tumorsejtek növekedésének szuppresszora [Rodeck és munkatársai: Cancer Rés. 47, 3692 (1987)]. A MAb-425 humanizált és kiméraváltozatait a WO 92/15683 számú közzétételi irat ismerteti.
Kemokínek
A kemokinkódoló cDNS-eket a „British Biotecnology Limited”-től, a „Herrman Bierman GmbH”n keresztül (Bad Nauheim FRG; humán IL-8 BBG44) szereztük be, vagy U-937 jelű, humán, citokintermelő sejtvonalból (ATCC CRL 1593) izolált mRNS-ről állítottuk elő. Kemokintermelő sejtekből RNAzol reagenskészlettel (WAK-Chemie, Németország) össz-RNS-t izoláltunk a gyártó utasításai szerint. Ezt követően az RNS-t cDNS-sé irtuk át, és a kemokinkódoló szekvenciát PCR-eljárással, publikált DNS-szekvenciák alapján következtetett láncindító oligonukleotidok alkalmazásával amplifikáltuk.
Vektorok
A pUCl9-plazmid egy nagy kópiaszámú E. coli klónozó plazmidvektorcsalád tagja, és tartalmaz részleteket mind a pBR322-ből, mind pedig az M13mpl9ből. A pUC19 tartalmazza az indukálható bakteriális lac-promoter-operátor-rendszert, amit egy többszörös klónozóhely követ [Yanisch-Perron és munkatársai: Gene 33, 103 (1985)]. A pUC-vektorok kereskedelmileg beszerezhetők (például a „New England Biolabs”től).
A pBluescriptKS/SK+ és -K.S/SK- elnevezésű fágmidvektorok (fág- és plazmidsajátságokkal egyaránt rendelkező vektorok) a pUC 19-ből származnak. Ezek a vektorok is kereskedelmi forgalomban vannak („Stratagene”, Heidelberg). A prokarióta expressziós vektorok pSWl-vektoron alapulnak [Ward és munkatársai: Natúré 341, 544 (1989)], amely a pUC19-vektor származéka. A pSWl tartalmazza az Erwinia carotovora baktériumból származó bakteriális pelB-gén vezetőpeptidjét kódoló szekvenciát [Lei és munkatársai: J. Bact. 169, 4379 (1987)]. A pelB-szignálszekvenciát követően, a leolvasási fázisba illeszkedően idegen DNS-ek építhetők be a proteinexpresszió periplazmába történő irányítása céljából.
A pHCMV jelű eukarióta expressziós vektor [Gillies és munkatársai: Cell 33, 717 (1983)] az SV40-vírus replikációs origóját és a humán citomegalovírus promoter/enhanszer régióját tartalmazza. A promoter/enhanszer régiót többszörös klónozóhely („multiple cloning site: mes) követi, az expresszálandó gének beinszertálásának céljára. Ebben a vektorban a MAb-425 nehéz lánc variábilis régiójának kiméraformáját, valamint CH2-domén végénél a kemokinnel fúzionáltatott cylCH2-régiót kombináltuk a MAb-425 nehéz lánc-fúziós
HU 221 989 Bl protein előállítása céljából. A fúziós Ig-láncot a megfelelő könnyű lánccal kombinálva monovalens antigénkötő régiót képző ellenanyag-konjugátummá alakíthatjuk, amit azután a célantigénre specifikus bivalens ellenanyag-konjugátummá asszociáltathatunk. A nehéz- és 5 könnyűlánc-konstrukciókat elhelyezhetjük egyazon vagy különböző vektorokban is.
A fúziós proteinek expressziója eukariótasejtekben
Eukarióta expressziós vektor előállítása Fab425kemokin fúziós protein expresszálására 10
A humán cgl jelű konstans régiót egy
BamHI/BamHI-ffagmentumként pUC19-plazmidba inszertáltuk. A cgl jelű konstans régió két SacII hasítási helyet tartalmaz: ezek egyike az 5’-intronon belül, az 5’-végi BamHI hasítási helytől 3’-irányban, attól 40 bá- 15 zispár távolságra található, a második az 5’-végi BamHI hasítási helytől 3’-irányban, attól 580 bázispár távolságra, és a CH3-domén kezdetétől 5’-irányban, attól 140 bázispár távolságra található. A második SacII hasítási hely alkalmas további szubklónozásra, ezért az 20 első SacII hasítási helyet egy adapter segítségével, egy SnaBI hasítási hely beiktatásával megszüntettük. Ebben a konstrukcióban (DSacII-cgl) a SacII hasítási helytől 3 ’-irányban található fragmentumok könnyen kicserélhetőek. 25
A humán IL-8-at a pUC18-vektorból kivágtuk (BglII/EcoRI), és pBluescript-SK(+)-plazmidba inszertáltuk (Stratagene GmbH, Heidelberg) (Smal/EcoRI), úgy, hogy ezzel a BglII és Smal hasítási helyeket megszűntettük. A DSacII-cgl-klónból a SacII/Xbal frag- 30 mentumot pBluescript-SK(+)-plazmidba inszertáltuk. Mindkét gént PCR-technológiával, az alábbi láncinditó oligonukleotidok alkalmazásával amplifíkáltuk:
- a DSacII-cgl-gén amplifikációjához a 3’-végi láncindító oligonukleotid a CH2-domén végének meg- 35 felelő szekvenciát, valamint egy Ncol hasítási helyet tartalmazott, 5’-végi láncinditó oligonukleotidként pedig reverz szekvenáló láncindítót használtunk.
- az IL-8-gén amplifikációjához 3’-végi láncinditó oligonukleotidként univerzális szekvenáló láncinditó 40 oligonukleotidot, 5’-végi láncinditó oligonukleotidként pedig egy Ncol hasítási helyet és az IL-8 startszekvenciájának megfelelő szekvenciát tartalmazó láncmditót használtunk.
A PCR-termékeket hasítottuk és SK(+)SacII/EcoRI- 45 fragmentummal ligáitok. A kapott peptidszekvenciában a CH2-domén C-terminális lizinjét metionin, az IL-8fragmentum N-terminális szerinjét glicin helyettesíti.
A két polipeptid érintkezésénél az alábbi szekvenciajött létre: 50
5’-AAA GCC ATG GGT GCT-3’
Lys, Ala, Met, Gly, Ala cglCH2 IL-8 (2-72)
A fentivel megegyező eljárás alkalmazásával, az 1. táblázat szerinti láncinditó oligonukleotidok felhaszná- 55 lásával a két gén közé egy Bell hasítási helyet iktattunk. Az így kapott fúziós gén, amely a konstans régiót kódoló cgl-gén és az IL-8-gén között egy Bell hasítási helyet tartalmaz, kódolja a teljes CH2-doménnak megfelelő szekvenciát, két további aminosavat (valint 60 és izoleucint), valamint az első két aminosav (szerin és alanin) kivételével az IL-8-szekvenciát.
A két polipeptid érintkezésénél az alábbi szekvencia jött létre:
’ -GCC AAA GTG ATC AAA GAA- 3 ’ Ala Lys Val Ile Lys Glu cglCH2 IL-8 (3-72)
A PCR-eljárással kapott termékeket a SacII és EcoRI hasítási helyek felhasználásával SK(+)-plazmidba klónoztok. Eukariótasejtekben történő expresszió céljára a fenti a fúziós géneket pHCMV-vektorba klónoztuk
1. táblázat
Konstrukció Láncinditó oligonukleotid DNS-szekvencia
CH2/NcoI cgl 5’-vég 5’-CAGGAAACAG CTATGAC-3’
cgl 3’-vég 5’-TGATCCATGGCT TTGGAGATGGTTTT CTCG-3’
IL-8/NcoI IL-8 5’-vég 5’-GATCTACCTGC CATGGGTGCTAAA GAA-3’
IL-8 3’-vég 5’-GTAAAACGAC GGCCAGT-3’
CH2/BclI cgl 5’-vég 5’-CAGGAAACAG CTATGAC-3’
cgl 3’-vég 5’-CGCGTGATCAC TTTGGCTTTGGAGA TGGTT-3’
IL-8/BclI IL-8 5’-vég 5’-CTCGTGATCA AAGAACTTAGATG TCAATGC-3’
IL-8 3’-vég 5’-GTAAAACGAC GGCCAGT-3’
Az ellenanyag-konjugátumok expressziója eukariótasejtekben
Ahhoz, hogy az ellenanyag-konjugátumokat eukariótasejtekben expresszáltassuk, a nehéz és könnyű láncokat tartalmazó vektor-DNS-t a megfelelő gazdasejtekbe kell juttatnunk. Erre a célra különböző ismert eljárásokat alkalmazhatunk, a vektor-DNS-t például elektroporációval, DEAE-dextránnal, kalcium-foszfáttal, Lipofectinnel vagy protoplasztfuzióval juttathatjuk a gazdasejtekbe. Minden olyan gazdasejt alkalmazható, amelyben az ellenanyag-konjugátumot kódoló rekombináns DNS-szekvenciák megfelelően átíródnak mRNS-sé. A gazdasejtek lehetnek például olyan egér-mielomasejtek, melyek nem termelnek immunglobulinokat, mint például az Sp2/0-AG14- (ATCC CRL 1581) és a P3X63Ag8.653-sejtek (ATCC CRL 1580) vagy lehetnek hörcsögsejtek, mint például a CHO-K1- (ATCC CCL 61), a CHO/dhFr- (ATCC CRL 9096) vagy a ΒΗΚ-21-sejtek (ATCC CCL 10). Tranziens expresszálás céljára alkalmazhatunk például COS-17
HU 221 989 Β1 (ATCC CRL 1650) vagy COS-7-sejteket (ATCC CRL 1651).
Az ellenanyag-konjugátumok tranziens expresszálása
A pHCMV expressziós vektor az SV40 majomvírus replikációs origóját tartalmazza. A COS-7-sejtvonal a CV-1 jelű majomsejtvonal származéka, amelyet replikációsorigó-deffektív SV40-vírussal transzformáltak. Ezekben a sejtekben tehát az SV40-replikációs origót tartalmazó plazmidok amplifikálódni fognak, és ezáltal fokozott ellenanyagkonjugátum-termelődés érhető el. A sejtek felűlúszóit 72 órával a transzformáció után gyűjtöttük be és a felülúszókat ELISA-eljárással EGFreceptor-kötódésre és kemokinkoncentrációra vizsgáltuk.
Az ellenanyag-konjugátumok permanens expresszálása
Az ellenanyag-konjugátumok expresszálására készített rekombináns konstrukciókat tartalmazó vektorokat megfelelő gazdasejtekbe juttatjuk. A nehéz- és könnyűlánc-konstrukciókat elhelyezhetjük egyazon vagy különböző vektorokban; az utóbbi esetben mindkét vektor tartalmazhat azonos szelekciós markert, mint például a Neomycin-rezisztencia-gént vagy a dihidrofolát reduktáz gént (dhFr-gént), de alkalmazhatunk két különböző szelekciós markert is, hogy a két vektor jelenlétére külön-külön is tudjunk szelektálni. A dhFr-markerre történő szelekció csak dhFr-negatív sejtvonalban, például CHO/dhFr--sejtvonalban hajtható végre. Az összegyűjtött kiónokat ellenanyagkonjugátum-expresszióra EGF-receptor-specifikus ELISA-val teszteljük. A pozitív kiónokat később tovább tisztítjuk határhígításos klónozással.
A Mab-425 kemokin ellenanyag-konjugátumok tisztítása
A gazdasejtekben termelődött Mab-425 ellenanyagkonjugátumok bármely alkalmas módszerrel összegyűjthetők és tisztíthatók, például affinitásos kromatográfiás eljárással, célantigén, anticitokin ellenanyag vagy antiidiotípusos ellenanyagok (például Harlow, Lane stb.) alkalmazásával.
A jelen esetben a tisztítást antiidiotípusos ellenanyagok alkalmazásával végeztük, amelyeket Mab-425ből, ismert eljárásokkal állítottunk elő (lásd például: Kostelny és munkatársai: J. Immunoi. 148, 1547 (1992)].
Tiszta Fv-ellenanyag-konjugátumok előállítása céljából fehérjetermeltetésre alkalmas E. coli-törzseket transzformáltunk az expressziós plazmidokkal (lásd az alábbiakban). A sejteket OD578=0,5 sűrűségig növesztettük, majd izopropil-p-D-tiogalaktopiranoziddal (IPTG-vel) (1 mmol/1) indukáltuk. A sejteket ezután egy éjszakán át növesztettük, majd mind a sejteket, mind a felülúszókat begyűjtöttük. A felülúszókat szokásos eljárásokkal előkészített anti-MAb-425-antiidiotípus-oszlopra vittük fel. Az oszlopot foszfáttal puffereit 0,5 mol/1 koncentrációjú NaCl-oldattal mostuk, majd a megkötött proteineket 100 mmol/1 glicin- és 0,5 mol/1 NaCl- (pH=2,5) tartalmú pufferrel eluáltuk. Az eluátumot 2,5 mol/l-es, pH=8,0-as Tris-puffer hozzáadásával azonnal semlegesítettük. A Mab-425-CHl-IL-8tartalmú frakciókat összeöntöttük, bekoncentráltuk és
PBS-sel szemben dializáltuk.
Prokarióta expressziós vektorok előállítása Fab425-kemokin és Fv-kemokin ellenanyag-konjugátumok expressziójára
Az Fv-fragmentumot Glockhuber és munkatársai szerint állítottuk elő [Biochemistry 29, 1362 (1990)].
A könnyű láncot és a nehéz lánc Fd-ffagmentumát vagy az Fv-fragmentumot kódoló DNS-szekvenciákat pSWl-vektor többszörös klónozóhelyébe építettük be.
Az érett könnyű és nehéz láncokat kódoló szekvenciákat, valamint Fv kódolószekvenciát megelőzte a bakteriális eredetű pelB-gén szignálpeptidjét kódoló szekvencia. A nehéz láncot kódoló szekvencia tartalmazott egy 3’-végi Ncol-helyet. A kemokinkódoló cDNS-szekvenciákat PCR-eljárással úgy módosítottuk, hogy tartalmazzanak egy (5’-végi) Ncol- és egy (3’-végi) Notlvagy (az Fv-fúzióhoz) EcoRI-hasítóhelyet. A citokingéneket megfelelő leolvasási fázisban közvetlenül a nehéz lánc CHl-doménjéhez vagy az Fv-ffagmentumhoz fúzionáltattuk. Másképp eljárva, a CH1-dómén és a kemokingén közé egy kapcsolópeptidet építhetünk be, például a (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)x kapcsolópeptidet építhetjük be, ahol x=l-4 lehet. Alkalmas kapcsolók és beépítésükre szolgáló eljárások a szakirodalomból ismertek [lásd például, Curtis és munkatársai: Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88, 5809 (1991)].
Az előállított vektorok lehetővé teszik a funkcioná- · lis F(ab’)-(=CH1) és Fv-kemokin típusú fúziós pro- teinek E. coli-bon történő hatékony kifejezését. i
A könnyűlánc- és a nehézlánc-kemokin fúziós protein- ϊ génjei egy kétcisztronos mRNS-en helyezkednek el, amely az indukálható lac-promoter szabályozása alatt áll [Skerra és Plückthun: Science 242, 1038 (1988)].
Éppen ezért az Fab/Fv fúziós proteinek expresszióját a tenyésztés körülményeinek figyelembevételével indukálhatjuk. Mivel a mindkét protein transzlációja egy- * azon kétcisztronos mRNS-ről történik, előnyösen egyforma mennyiségű Fd-kemokin fúziós protein és könnyű lánc keletkezik, ami fokozza a funkcionális Fab/Fv fúziós proteinekké történő korrekt összeszerelődés esélyét. A két polipeptid az E. coli periplazmájába szekretálódik, ahol végbemegy a hajtogatódás (folding), a diszulfidhidak kialakulása és a funkcionális Fab-425-CHl/Fv fúziós proteinné történő összeszerelődés. A baktériumok hosszan tartó tenyésztése az E. coli külső membránja áteresztőképességének részleges megnövekedéséhez vezet, ami elősegíti a fúziós proteinek táptalajba történő diffúzióját.
A MAb-425-ellenanyag-konjugátumok kötődési sajátságai
A MAb-425-ellenanyag-konjugátumok kötődési sajátságait EGF-receptor-specifikus ELISA-val vizsgáltuk. Röviden: a mikrotitertálcákat egy éjszakán keresztül 4 °C-on tisztított EGF-receptorral burkoltuk („coat ”-oltuk). A tálcákat ezután fúziós proteintartalmú felülúszókkal vagy konjugálatlan MAb-tartalmú felülúszókkal inkubáltuk. A tálcákat ezután a nem kötődött anyagok eltávolítása céljából mostuk, majd az ;
EGF-receptorhoz kötődött ellenanyag mennyiségét oly
HU 221 989 Β1 módon határoztuk meg, hogy a mérőhelyeket peroxidázzal konjugált, kecskeeredetű anti-humán-IgG- és IgM-(könnyű és nehéz láncok) ellenanyagokkal, majd szubsztráttal inkubáltuk. Ezután a mérőhelyekbe peroxidázszubsztrátot adtunk. A kötődött EGF-receptorspecifikus protein mennyiségét 450 nm-en végzett abszorbanciaméréssel határoztuk meg.
A Mab-425 ellenanyag-konjugátumok biológiai aktivitása
Effektorsejtek izolálása
A biológiai aktivitás meghatározása céljából egészséges véradók teljes véréből humán perifériás véreredetű neutrofil granulocitákat izoláltunk frissen, a korábbiakban Haslett és munkatársai által leírtak szerint [Am. J. Pathol. 119, 101 (1985)]. A plazmát centrifugálással, a vörösvértesteket dextránon történő szedimentáció alapján, végül a limfocitákat és leukocitákat percollgradiensen végzett centrifugálással különválasztottuk. A neutrofil sejteket az izolálást követően azonnal felhasználtuk.
A kemotaktikus aktivitás meghatározása
A kemotaktikus aktivitást Fáik és munkatársai eljárása szerint vizsgáltuk [J. Immunoi. Methods 33, 239 (1980)]. Röviden: 48 mélyületű boydenkamrákat és 5 pm-es membránokat alkalmaztunk. Tisztított neutrofil sejteket lxlO6 sejt/ml koncentrációban DMEMtápfolyadékban szuszpendáltunk (DMEM, 1% Penicillin, 1% Streptomycin, 10% FCS, 2 mmol/1 L-glutamin, 1 mmol/1 Na-piruvát, 10 mmol/1 HEPES). Az alsó mélyületekbe fúziós proteint tartalmazó felülúszókat vagy kontrollfelülúszót töltöttünk, azokat membránnal fedtük, végül a felső mélyületekbe a sejtszuszpenziót tettük. Miután a kamrákat 30 percig, 37 °C-on inkubáltuk a membránokat eltávolítottuk, és 10 percig, 2% glutáraldehidben fixáltuk. Ezt követően a membránhoz tapadt sejteket három percig Weigert-féle vas-hematoxilinnal festettük (Sigma Diagnostic). A membránhoz tapadt sejtek számát mikroszkóp segítségével határoztuk meg.
Az ellenanyag-konjugátumok által indukált enzimfelszabadulás meghatározása neutrofil sejtekben
Abból a célból, hogy az ellenanyag-konjugátumok által indukált enzimfelszabadulást a neutrofil sejtek granuláiból meghatározzuk, a felülúszóban mértük a mieloperoxidázaktivitást [Henson és munkatársai: J. Immunoi. 121, 851 (1978)]. A vizsgálatot 96 mélyületű mikrotitrálótálcákon végeztük, egy-egy mélyületbe 5 x1ο5 sejtet tettünk. A stimulálás mellett, 37 °C-on végzett inkubálást követően a tálcákat centrifugáltuk, és a sejtmentes felülúszókat egy másik 96 mélyületű mikrotitráló tálcára vittük át. A sejtmentes felülúszókat (szubsztrátként) dianisidinnel inkubáltuk, és a fényelnyelés mértékét 492 nm-en mértük. Pozitív kontrollként 10~7 koncentrációban FMLP-t használtunk. A teljes enzimtartalom meghatározására a sejteket stimulálókezelés nélkül, tritonnal lizáltattuk. Az aktivitást a teljes enzimtartalom (lízis) százalékában fejeztük ki.
Az ellenanyag-konjugátumok által indukált szuperoxidfelszabadulás meghatározása
A citokróm-C-t az O2~ redukálja, ezáltal annak fényelnyelése megváltozik. A fényelnyelés megváltozása a szuperoxidaktivitás meghatározására jól felhasználható marker. A vizsgálatot Guthrie és munkatársai által leírt eljárás szerint [J. Exp. Med. 160, 1656 (1984)], 96 mélyületű mikrotitrálótálcákon végeztük, egy-egy mélyületbe 5 χ 105 sejtet tettünk. A stimuláló hatású ellenanyag-konjugátumok és citokróm-C jelenlétében történő inkubálást követően a tálcákat centrifugáltuk, és a felülúszók fényelnyelését 550 nm-en mértük.
További ellenanyag-konjugátumok
A fenti leírás szerint, kemokin-összetevőként MIP-2a-t és MIP-2b-t tartalmazó anti-EGFR-CHl-, -CH2-, -CH3- és -Fv-ellenanyag-konjugátumokat állítottunk elő (restrikciós helyek és kapcsoló közbeiktatásával vagy anélkül), és azokat vizsgáltuk. Ezek a konstrukciók hasonló tulajdonságokkal rendelkeztek, mint az IL-8-származékok.
Az ellenanyag-konjugátumok terápiás alkalmazása
A találmány tárgyát képező ellenanyag-konjugátumokat alkalmazhatjuk terápiás céllal, humán pácienseknek beadva. Éppen ezért a találmány tárgyához tartoznak olyan gyógyászati készítmények, melyek hatóanyagként legalább egy, a fentiekben és az igénypontokban definiált fúziós proteint és egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagot tartalmaznak.
A találmány szerinti ellenanyag-konjugátumokat tipikusan intravénás vagy parenterális injektálással adagoljuk. Általánosan fogalmazva az ellenanyag-konjugátumokat olyan dózisban alkalmazzuk, ami elég nagy a kívánt tumorszuppresszív vagy tumorlizáltató hatás kialakulásához. Az alkalmazott dózis nagysága függ a páciens korától, általános állapotától, nemétől és a betegség előrehaladottságának mértékétől, és általában 0,1 mg/kg és 200 mg/kg, előnyösen pedig 0,1 mg/kg és 100 mg/kg között van, naponta egyszer vagy többször beadva, egy vagy néhány napon keresztül.
A parenterális adagolásra szánt készítmények például steril vizes vagy nemvizes oldat, szuszpenzió vagy emulzió formájában lehetnek kiszerelve. Az alkalmazható nemvizes oldószerek példáiként megemlíthetjük a propilénglikolt, a polietilénglikolt, a növényi olajokat, mint például az olívaolajat, az injektálható szerves észtereket, mint például az etil-oleátot, valamint a szakirodalomból ismert egyéb oldószereket, melyek az ismertetett célokra alkalmasak. A találmány tárgyát képező ellenanyag-konjugátumok alkalmazhatóak fiziológiásán elfogadható hordozókat tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására. Az ilyen hordozók példáiként megemlíthetjük a sóoldatot, a PBS-t, a Ringer-oldatot vagy a laktált Ringer-oldatot. A megfelelő gyógyászati készítmények tartalmazhatnak tartósítószereket és egyéb adalék anyagokat, mint például antibiotikumokat, antioxidánsokat és kelátorokat.
A találmány tárgyát képező gyógyászati készítmények valamennyi tumorféleség kezelésére alkalmasak, többek között melanomák, gliomák, karcinómák, vérrákok és szilárd tumorok kezelésére is.
HU 221 989 Bl
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: N-terminális
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: c-gammal 5’-láncindító
TÖRZS: E. coli
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGGAAACAG CTATGAC 17
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 30 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: N-tenninális
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: c-gammal 3’-láncinditó
TÖRZS: E. coli
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGATCCATGG CTTTGGAGAT GGTTTTCTCG 30
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 27 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: N-terminális
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: IL-8 5’-láncinditó
TÖRZS: E. coli
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATCTACCTG CCATGGGTGC TAAAGAA 27
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: N-terminális
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: IL-8 3’-láncindító
TÖRZS: E. coli
HU 221 989 Bl
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTAAAACGAC GGCCAGT 17
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: N-terminális
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: c-gammal 5’-láncindító
TÖRZS: E. coli
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CAGGAAACAG CTATGAC 17
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 30 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: N-terminális
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: c-gammal 3’-láncindító
TÖRZS: E. coli
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCGTGATCA CTTTGGCTTT GGAGATGGTT 30
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 30bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: N-terminális
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: IL-8 5’-láncindító
TÖRZS: E. coli
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCGTGATCA AAGAACTTAG ATGTCAATGC 30
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
HIPOTETIKUS: nem
ANTISZENSZ: nem
FRAGMENSTÍPUS: N-terminális
EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS: IL-8 3’-láncindító
HU 221 989 Bl
TÖRZS: E. coli
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GTAAAACGAC GGCCAGT

Claims (14)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Ellenanyag-konjugátum, amely tartalmaz egy, az epidermális növekedési faktor receptorának (EGFR) egy tumorsejten található antigéndetermináns 10 epitópjára specifikus monoklonális ellenanyagot vagy ellenanyag-fragmentumot, valamint egy, az ellenanyaghoz vagy ellenanyag-fragmentumhoz fuzionáltatott kemokinproteint.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti ellenanyag-konjugátum, 15 amely kanokinként a C-X-C-családba tartozó kemokint tartalmaz.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti ellenanyag-konjugátum, amely kemokinként IL-8-at tartalmaz.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti ellen- 20 anyag-konjugátum, amely ellenanyag-fragmentumként Fab- vagy F(ab’)2-fragmentumot tartalmaz, amely lényegében az ellenanyag nehéz láncának variábilis régiójából, a konstans régió CHl-doménjéből és a megfelelő könnyű láncból áll (ellenanyag-CHl-konjugátum). 25
  5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag-konjugátum, amely ellenanyag-fragmentumként egy lényegében az ellenanyag nehéz láncának variábilis régiójából, a konstans régió CH1- és CH2-doménjéből, valamint a megfelelő könnyű láncból álló ellenanyag- 30 fragmentumot tartalmaz (ellenanyag-CH2-konjugátum).
  6. 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag-konjugátum, amely ellenanyag-fragmentumként egy lényegében az ellenanyag nehéz láncának variábilis régiójából, a konstans régió CH1-, CH2- és CH3- 35 doménjéből, valamint a megfelelő könnyű láncból álló ellenanyag-fragmentumot tartalmaz (ellenanyag-CH3konjugátum).
  7. 7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag-konjugátum, amely ellenanyag-fragmentumként 40 egy lényegében az ellenanyag nehéz láncának variábilis régiójából, a megfelelő könnyű láncból, valamint a könnyű és nehéz láncot összekapcsoló polipeptidszekvenciából álló ellenanyag-fragmentumot tartalmaz (ellenanyag-Fv-konjugátum). 45
  8. 8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag-konjugátum, amely az ellenanyag vagy ellenanyag-ffagmentum és a biológiailag aktív ligandum között olyan aminosavat (aminosavszekvenciát) tartalmaz, amelynek következtetett DNS-szekvenciája egy 50 restrikciós helynek felel meg, és a fenti restrikciós hely egyedi a teljes fúziós konstrukción belül.
  9. 9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag-konjugátum, amely az ellenanyag vagy ellenanyag-fragmentum és a biológiailag aktív ligandum között egy kapcsolópeptidet tartalmaz.
  10. 10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag-konjugátum, amely ellenanyagként vagy ellenanyag-fragmentumként egéreredetű, humanizált vagy kiméra MAb-425-ellenanyagból származtatható ellenanyagot vagy ellenanyag-fragmentumot tartalmaz.
  11. 11. Ellenanyag-konjugátum, melynek szerkezete a felsorolt képletek bármelyikével jellemezhető: MAb-425-CHl-IL-8, MAb-425-CH2-(NcoI)-IL-8, MAb-425-CH2-(BclI)-IL-8, MAb-425-Fv-IL-8, MAb-425-CH3-IL-8;
    ahol MAb-425 egy humán A431 karcinóma-sejtvonal (ATCC CRL 1555) ellen termeltetett egéreredetű IgGl ellenanyagot jelöl;
    CH1, CH2 és CH3 az ellenanyag nehéz láncának konstans régióit jelenti;
    Ncol és Bell a megfelelő restrikciós enzimek hasítóhelyeit jelenti;
    Fv jelentése pedig: a nehéz és könnyű láncok variábilis régióiból álló ellenanyag-fragmentum.
  12. 12. Eljárás az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag-konjugátumok előállítására, azzal jellemezve, hogy az ellenanyagot vagy ellenanyag-fragmentumot és a biológiailag aktív ligandumot kódoló DNS-szekvenciákat a kívánt fúziós DNS-szekvenciával komplementer oligonukleotid alkalmazásával egyszálú DNS-en egymással fuzionáltatjuk;
    az így kialakított konstrukciót expressziós vektorba építjük;
    a kapott vektort gazdasejtekbe transzformáljuk; a gazdasejteket tápoldatban tenyésztjük, és a fúziós proteint expresszáltatjuk.
  13. 13. Gyógyászati készítmény, amely legalább egy, az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyagkonjugátumot, valamint fiziológiailag elfogadható hordozót és/vagy egyéb segédanyagokat tartalmaz.
  14. 14. Az 1 -10. igénypontok bármelyike szerinti ellenanyag-konjugátum alkalmazása tumorellenes gyógyászati készítmény előállítására.
HU9502711A 1994-09-16 1995-09-15 Tumorellenes hatású ellenanyag-konjugátumok és eljárás előállításukra HU221989B1 (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP94114572 1994-09-16

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9502711D0 HU9502711D0 (en) 1995-11-28
HUT75836A HUT75836A (en) 1997-05-28
HU221989B1 true HU221989B1 (hu) 2003-03-28

Family

ID=8216289

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9502711A HU221989B1 (hu) 1994-09-16 1995-09-15 Tumorellenes hatású ellenanyag-konjugátumok és eljárás előállításukra

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5824782A (hu)
EP (1) EP0706799B1 (hu)
JP (2) JP3865802B2 (hu)
KR (1) KR100386171B1 (hu)
CN (1) CN1123185A (hu)
AT (1) ATE208633T1 (hu)
AU (1) AU702184B2 (hu)
CA (1) CA2158322C (hu)
CZ (1) CZ289641B6 (hu)
DE (1) DE69523857T2 (hu)
DK (1) DK0706799T3 (hu)
ES (1) ES2167391T3 (hu)
HU (1) HU221989B1 (hu)
NO (1) NO315976B1 (hu)
PL (1) PL182636B1 (hu)
PT (1) PT706799E (hu)
RU (1) RU2157701C2 (hu)
SK (1) SK282263B6 (hu)
UA (1) UA40611C2 (hu)
ZA (1) ZA957808B (hu)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7276488B2 (en) * 1997-06-04 2007-10-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
CN1224712C (zh) * 1997-06-04 2005-10-26 牛津生物医学（英国）有限公司 载体
WO2001036486A2 (en) * 1999-11-18 2001-05-25 Oxford Biomedica (Uk) Limited Scfv antibodies against disease associated molecules
US7635687B2 (en) * 1997-06-04 2009-12-22 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
EP1037927B1 (en) 1997-12-08 2004-05-19 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation
AU2903999A (en) 1998-03-12 1999-09-27 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods and compositions of chemokine-tumor antigen fusion proteins as cancer vaccines
KR100388506B1 (ko) * 1998-03-31 2003-06-25 다나베 세이야꾸 가부시키가이샤 배뇨장애의 예방·치료제
ES2267263T3 (es) * 1998-04-15 2007-03-01 Emd Lexigen Research Center Corp. Coadministracion de un inhibidor de la angiogenesis para reforzar la respuesta inmunologica por medio de la mediacion de una proteina de fusion de una citoquina con un anticuerpo.
HUP0101343A3 (en) * 1998-04-17 2003-10-28 Lexigen Pharmaceuticals Corp L Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by co-administration with prostaglandin inhibitor
US6869606B1 (en) 1999-02-22 2005-03-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Biotinylated-chemokine antibody complexes
WO2000078334A1 (en) * 1999-06-17 2000-12-28 University Of Maryland Biotechnology Institute Chimeric chemokine-antigen polypeptides and uses therefor
GB9915074D0 (en) * 1999-06-28 1999-08-25 Cortecs Plc Ligand-binding composition
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
DK1200479T3 (da) 1999-08-09 2006-05-15 Emd Lexigen Res Ct Corp Multiple cytokin-antistof-komplekser
US7208152B2 (en) * 1999-11-24 2007-04-24 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Antibodies for “Bonzo” chemokine receptor and therapeutic uses thereof
US6319675B1 (en) 1999-11-24 2001-11-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for detecting and/or identifying agents which bind and/or modulate function of “bonzo” chemokine receptor
CA2399832C (en) 2000-02-11 2011-09-20 Stephen D. Gillies Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
DE10019157A1 (de) * 2000-04-18 2001-11-15 Stefan Duebel Verfahren zum Einbringen von Liganden in lebende Zellen
AU2001258567A1 (en) * 2000-05-19 2001-11-26 Scancell Limited Humanised antibodies to the epidermal growth factor receptor
AU2001291049A1 (en) 2000-09-15 2002-03-26 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, National Institutes Of Health, Office Of Technology Transfer Defensin-antigen fusion proteins
WO2002022687A2 (en) 2000-09-15 2002-03-21 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Viral chemokine-tumur antigen fusion proteins
GB0029407D0 (en) * 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
AU2002248571B2 (en) 2001-03-07 2007-01-18 Merck Patent Gmbh Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002079415A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
BR0209177A (pt) 2001-05-03 2004-10-05 Merck Patent Gmbh Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo
EP1256354A1 (en) * 2001-05-11 2002-11-13 Schering Corporation Methods for treating cancer
US20020193569A1 (en) * 2001-06-04 2002-12-19 Idec Pharmaceuticals Corporation Bispecific fusion protein and method of use for enhancing effector cell killing of target cells
CA2450285C (en) 2001-06-13 2016-08-02 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (egfr)
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
EP1399484B1 (en) * 2001-06-28 2010-08-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
GB0126378D0 (en) * 2001-11-02 2002-01-02 Oxford Biomedica Ltd Antigen
EP2354791A1 (en) 2001-12-04 2011-08-10 Merck Patent GmbH Immunocytokines with modulated selectivity
JP4212921B2 (ja) 2002-03-29 2009-01-21 独立行政法人科学技術振興機構 抗体を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤およびタンパク質中空ナノ粒子
ATE328906T1 (de) * 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
US9321832B2 (en) * 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
US20040110929A1 (en) * 2002-07-12 2004-06-10 Bjorn Soren E. TF binding compound
WO2004035537A2 (en) 2002-10-16 2004-04-29 Euro-Celtique S.A. Antibodies that bind cell-associated ca 125/o772p and methods of use thereof
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
BRPI0317376B8 (pt) 2002-12-17 2021-05-25 Merck Patent Gmbh proteína de fusão de anticorpo-il2 designada como hu14.18-il2, usos da mesma, vetor e composição farmacêutica
EP1578801A2 (en) * 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
CA2516028C (en) * 2003-02-14 2012-10-16 University Of Southern California Conjugates comprising a cancer targeting molecule linked to a liver-expressed chemokine
RU2369616C2 (ru) 2003-12-30 2009-10-10 Мерк Патент Гмбх Слитые белки il-7
WO2005066348A2 (en) 2004-01-05 2005-07-21 Emd Lexigen Research Center Corp. Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
GB2424886A (en) * 2005-04-04 2006-10-11 Dxs Ltd Polynucleotide primers against epidermal growth factor receptor and method of detecting gene mutations
US8142781B2 (en) * 2005-10-07 2012-03-27 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for blood-brain barrier delivery
US8124095B2 (en) * 2005-10-07 2012-02-28 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
AU2006321364B2 (en) * 2005-12-01 2011-11-10 Domantis Limited Noncompetitive domain antibody formats that bind Interleukin 1 Receptor type 1
US8497246B2 (en) * 2006-08-18 2013-07-30 Armagen Technologies, Inc. Methods for diagnosing and treating CNS disorders by trans-blood-brain barrier delivery of protein compositions
CN101173008B (zh) * 2006-11-01 2011-06-22 复旦大学 一种双功能融合蛋白及其制备方法和应用
US20090011040A1 (en) * 2007-05-02 2009-01-08 Naash Muna I Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
JP2010528647A (ja) 2007-06-06 2010-08-26 ドマンティス リミテッド ポリペプチド、抗体可変ドメインおよびアンタゴニスト
JP5901877B2 (ja) 2007-07-27 2016-04-13 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 中枢神経系のα−Ｌ−イデュロニダーゼ活性を増加させるための方法および組成物
CN108129573B (zh) 2007-09-21 2021-10-08 加利福尼亚大学董事会 被导靶的干扰素显示强的细胞凋亡和抗肿瘤活性
WO2009114110A1 (en) * 2008-03-08 2009-09-17 Immungene, Inc. Engineered fusion molecules immunotherapy in cancer and inflammatory diseases
US20100098693A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-22 Pardridge William M Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of organophosphatases
EP3543256A1 (en) 2009-01-12 2019-09-25 Cytomx Therapeutics Inc. Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
JP5873003B2 (ja) 2009-03-18 2016-03-01 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． ＩｇＧデコイ受容体融合タンパク質の血液脳関門送達のための組成物および方法
MX2011011044A (es) 2009-04-22 2011-11-04 Merck Patent Gmbh Proteinas de fusion de anticuerpos con sitios de enlace de receptor fc neonatal (fcrn) modificados.
EP2485761B1 (en) 2009-10-09 2019-02-27 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing iduronate 2-sulfatase activity in the cns
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
BR112014009925B1 (pt) 2011-10-28 2022-09-20 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Construtores de polipeptídeos e seus usos
WO2013081706A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
WO2014089354A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 The Regents Of The University Of California Cd138-targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
IL275376B2 (en) * 2013-03-11 2024-01-01 Genzyme Corp Polypeptides with hyperglycosidic bonds
PL3677591T3 (pl) 2013-04-29 2023-06-26 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Przeciwciała anty-cd38 i fuzje z interferonem alfa-2b o osłabionej aktywności
US11117975B2 (en) 2013-04-29 2021-09-14 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B
US10093745B2 (en) 2013-05-29 2018-10-09 The Regents Of The University Of California Anti-CSPG4 fusions with interferon for the treatment of malignancy
US10995148B2 (en) 2014-03-19 2021-05-04 Genzyme Corporation Site-specific glycoengineering of targeting moieties
UA119352C2 (uk) 2014-05-01 2019-06-10 Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину
WO2016057769A2 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Genzyme Corporation Glycoengineered antibody drug conjugates
CA2965414C (en) 2014-10-29 2024-01-09 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Interferon .alpha.2.beta. variants
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
EP3359962B1 (en) * 2015-10-07 2021-11-17 Sangui Bio Pty. Ltd Blood preparation and profiling
WO2018014067A1 (en) 2016-07-19 2018-01-25 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-cd47 combination therapy
EP3688022A4 (en) * 2017-09-29 2021-09-22 NantCell, Inc. ANTIGEN PROTEINS AND PROCEDURES FOR THEREFORE
US20220041579A1 (en) 2018-12-19 2022-02-10 Array Biopharma Inc. Substituted quinoxaline compounds as inhibitors of fgfr tyrosine kinases
CN113490666A (zh) 2018-12-19 2021-10-08 奥瑞生物药品公司 作为fgfr酪氨酸激酶的抑制剂的取代的吡唑并[1,5-a]吡啶化合物

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5470571A (en) * 1988-01-27 1995-11-28 The Wistar Institute Method of treating human EGF receptor-expressing gliomas using radiolabeled EGF receptor-specific MAB 425
IE63847B1 (en) * 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5112946A (en) * 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5314995A (en) * 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
JP3319594B2 (ja) * 1990-03-20 2002-09-03 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク 定常領域の代わりに受容体結合性リガンドを有するキメラ抗体
ATE218889T1 (de) * 1990-11-09 2002-06-15 Stephen D Gillies Cytokine immunokonjugate
SK281142B6 (sk) * 1991-03-06 2000-12-11 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschr�Nkter Haftung Humanizovaná monoklonálna protilátka, expresné vektory a farmaceutický prostriedok
WO1993000917A1 (en) * 1991-07-05 1993-01-21 Seragen, Inc. Epidermal growth factor receptor targeted molecules for treatment of inflammatory arthritis
ES2144440T3 (es) * 1992-08-18 2000-06-16 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor del factor de crecimiento epidermico, celulas y metodos para su produccion y compuestos que los contienen.

Also Published As

Publication number Publication date
UA40611C2 (uk) 2001-08-15
AU3053395A (en) 1996-03-28
EP0706799A2 (en) 1996-04-17
PL310493A1 (en) 1996-03-18
JPH0899901A (ja) 1996-04-16
AU702184B2 (en) 1999-02-18
US5824782A (en) 1998-10-20
ES2167391T3 (es) 2002-05-16
PT706799E (pt) 2002-05-31
ZA957808B (en) 1996-05-07
NO953650D0 (no) 1995-09-15
CA2158322C (en) 2009-06-16
DE69523857D1 (de) 2001-12-20
ATE208633T1 (de) 2001-11-15
CZ237595A3 (en) 1996-04-17
NO953650L (no) 1996-03-18
HUT75836A (en) 1997-05-28
DK0706799T3 (da) 2002-02-25
KR100386171B1 (ko) 2003-08-21
CN1123185A (zh) 1996-05-29
KR960010023A (ko) 1996-04-20
SK282263B6 (sk) 2001-12-03
EP0706799A3 (en) 1996-12-04
NO315976B1 (no) 2003-11-24
CZ289641B6 (cs) 2002-03-13
CA2158322A1 (en) 1996-03-17
JP3865802B2 (ja) 2007-01-10
PL182636B1 (pl) 2002-02-28
RU2157701C2 (ru) 2000-10-20
EP0706799B1 (en) 2001-11-14
HU9502711D0 (en) 1995-11-28
JP2006117684A (ja) 2006-05-11
DE69523857T2 (de) 2002-06-13
SK114595A3 (en) 1997-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU221989B1 (hu) Tumorellenes hatású ellenanyag-konjugátumok és eljárás előállításukra
RU2129018C1 (ru) Иммуноконьюгат, способ получения иммуноконьюгата и фармацевтическая композиция
CA2411470C (en) T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
RU2263118C2 (ru) Комплексы антител с несколькими цитокинами
US20110070191A1 (en) T cell receptor fusions and conjugates and methods of use there of
AU2001275246A1 (en) T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
KR20010022075A (ko) T세포활성화를유도하는슈퍼항원접합체에의한표적세포의세포용해
CN117042806A (zh) 抗体-免疫激动剂缀合物及其应用
KR20010089364A (ko) 강화 백신
CN117042809A (zh) 抗her2抗体-免疫激动剂缀合物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20030116

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees