JP3865802B2 - 免疫抱合体ｉｉ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍関連標的エレメント、最も好ましくは、ヒト上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）などのヒト腫瘍細胞上で優先的に発現される分子を優先的に認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントとケモカインタンパク質グループ、好ましくはＣ−Ｘ−Ｃ族から選択された生物活性を有するリガンドからなる新規融合タンパク質に関する。得られる融合タンパク質は、特異的標的細胞または組織に生物活性を有するリガンドを運ぶために用いることができる。新規の免疫抱合体(Immunoconjugate)は腫瘍の治療に使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
多様な治療概念が癌患者の治療のために用いられてきた。これまで、悪性細胞上で発現される細胞表面分子を特異的にまたは選択的に認識するモノクローナル抗体を用いて臨床試験が行われてきた。このアプローチのねらいは、癌細胞を排除するために抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体媒介細胞毒性を誘導することである。第二のアプローチは、免疫応答のサイトカイン媒介活性化である。サイトカイン誘導抗腫瘍活性は次のようなもので媒介され得る。すなわち、
１）腫瘍増殖に対するサイトカインの直接的細胞毒性／細胞制圧効果
２）ＬＡＫ活性または単球／顆粒球媒介細胞毒性などの腫瘍抗原非特異的メカニズム
３）ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞によって媒介される腫瘍抗原特異的免疫応答
この場合、腫瘍に対する全身的免疫は動物モデルにおいて観察された。
【０００３】
しかし、サイトカインの大量投与の細胞毒性および腫瘍部位での存在の不充分さから、標的腫瘍療法のコンセプトが導かれる。標的腫瘍療法の原理は、腫瘍関連抗原に特異的なモノクローナル抗体のような標的分子と生物学的に活性のエフェクター分子との物理的結合に基づいている。標的分子によるエフェクター分子の運搬によって、腫瘍中のサイトカインの濃度が上昇し、最大要求量を減少させ得ることが期待される。動物モデルにおいて、腫瘍内注射またはトランスフェクトさせた腫瘍細胞の分泌のいずれかによってサイトカインを腫瘍部位に存在させることによって腫瘍を退行させ得ることが示された（総説としてColombo and Forni、 Immunology Today、 15、 48-51、 1994を参照されたい）。これらの系では、サイトカインは腫瘍の増殖は阻害しないが、迅速で有効な抗腫瘍反応を活性化することができる。したがって、エフェクター分子と標的エレメントとの物理的組み合わせは、生物活性を有するリガンドの周辺部での存在を減らして腫瘍内での利用を促進する手段を意味する。さらに、単一腫瘍細胞またはミクロ転移もまた、これらの分子の標的となり得る。
【０００４】
抗体特異性標的法のための生物活性リガンドは、直接にまたは標的細胞に対して致死的環境をつくり出すことによって標的細胞の破壊を誘導しなければならない。これは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ、ＴＮＦαまたはＣＳＦなどのサイトカインによって達成され得る。これらのサイトカインは、抗腫瘍効果を直接的にあるいは宿主の防護機構を活性化することによって発揮することが示された（Mire-Sluis、 TIBTECH、11、 74-77、 1993、Columbo et al.、 Cancer Res.、 52、 4853-4857、 1992、Thomas and Balkwill、 Pharmac. Ther.、 52、 307-330、 1991）。
【０００５】
しかし、これらサイトカインのほとんどはエフェクター細胞を活性化するが、皆無または微弱の走化能しか示さない。そのため、腫瘍組織における適量のエフェクター細胞が存在しなければ抗腫瘍活性は弱いと考えられる。
【０００６】
しかし、ケモカインは多くのエフェクター細胞に走化性であって、したがって腫瘍部位におけるこれらの存在を強めて、次に種々のエフェクター細胞機能を誘導する（例えば、Miller and Krangel (1992)、 "Biology and Biochemistry of the Chemokines: A Novel Family of Chemotactic and Inflammatory Cytokines"、 Critical Reviews in Immunology、 12、 17を参照されたい）。
【０００７】
ＩＬ−８、ＭＩＰ２α（ＧＲＯ−βとしても知られる）およびＭＩＰ２β（ＧＲＯ−γ）は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン超族（小サイトカイン超族またはインタークリンとしても知られる）に属する。これらは走化因子として作用して、エフェクター細胞機能を活性化し、したがって、最適エフェクター分子であることを示している。このＣ−Ｘ−Ｃケモカイン族は、最近特徴づけされた小タンパク質（８〜１０ｋＤ）の一群で、２０〜５０％のアミノ酸配列相同性を示し、走化性および炎症促進活性を有する。
【０００８】
ＩＬ−８は、確立された立体構造を有し（Clore et al.、 Biochemistry、 29、 1689-1696、 1990）、いくつかのＣＸＣケモカインと Ｎ末端ＥＬＲ部分を共有する。ＣＸＣケモカイン間の配列相同性から、立体構造がきわめて類似することが予測される。これはＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１についてすでに示された（Gronenborn and Clore、 Prot. Eng.、 4、 263-269、 1991）。
【０００９】
溶液では、ＩＬ−８は安定な二量体を形成し（Clore et al.、 Biochemistry、 29、 1689-1696、1990）、Ｆ（ａｂ´）ＩＬ−８融合タンパク質を二つのＩＬ−８モノマーの相互作用によって二量体化して二価の免疫抱合体を形成することが可能である。これは融合タンパク質の抗原との相互作用を強めると考えられる。
【００１０】
これまでに記述されたＣ−Ｘ−Ｃ群はいずれも、主に好中顆粒球上の作用する。遺伝子は染色体４上に位置している。この群には、ＰＦ４、血小板塩基性タンパク質、ｈＩＰ１０、ＩＬ−８、ＭＩＰ２αおよびＭＩＰ２βがある。これらタンパク質の好中球への影響は、走化能、脱顆粒およびレスピラトリーバーストである（Sherry and Cerami、 Current Opinion in Immunology、 3、 56-60、 1991、Oppenheim et al.、 Annu. Rev. Immunol.、 9、 617-648、 1991、Miller and Krangel、 Critical Reviews in Immunology、 12、 17-46、 1992、Clark-Lewis et al.、 J. Biol. Chem.、 266、 23128-23134、 1991）。
【００１１】
ケモカインのＣ−Ｃ族に密接に関連したものは主に単球に作用する。遺伝子は全て染色体１７に位置している。これらタンパク質はＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９およびＲＡＮＴＥＳである。これら分子は単球への強い走化能を示す（Matsushima et al.、 Chem. Immunol.、 51、 236-265、 1992、Oppenheim et al.、 Annu. Rev. Immunol.、 9、 617-648、 1991）。
【００１２】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、表皮および上皮細胞のミトゲンであるポリペプチドホルモンである。ＥＧＦが感受性細胞と相互作用するときには、これは膜レセプター（ＥＧＦＲ）に結合する。ＥＧＦＲは、約１７０ｋＤの貫膜糖タンパク質であって、ｃｅｒｂ−Ｂプロトオンコジーン（癌原遺伝子）の遺伝子産物である。
【００１３】
ネズミモノクローナル抗体ＭＡｂ４２５はヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）に対してつくられたもので、ＥＧＦＲの外側ドメイン上のポ リペプチドエピトープに結合することが見出だされた。これはＥＧＦの結合を阻害し、インビトロで腫瘍細胞毒性を媒介し、インビトロで上皮および結腸直腸癌腫由来の細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出だされた（Rodeck et al.、 Cancer Res.、 47、 3692、 1987）。ＭＡｂ４２５のヒト化されたキメラは、ＷＯ９２／１５６８３から公知である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
このように、本発明の目的は、腫瘍細胞表面のＥＧＦＲ抗原特異性エピトープおよびそれらのエフェクター細胞に対して高い走化能を有する生物学的に活性のリガンドからなり、低毒性標的腫瘍療法を可能にするような抗体またはそれらのフラグメントをつくり出すことであった。したがって、この免疫抱合体は、同様のサイトカイン−抗体免疫抱合体の改善を意味し、これは腫瘍溶解能に関しては同様に効果的であるが、その走化的性質から特異的部位にエフェクター細胞を誘引する能力に関してはそうではない。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、モノクローナル抗体の部分、少なくとも抗原認識部位またはＥＧＦＲのエピトープを認識する完全なモノクローナル抗体を、ケモカイン群、好ましくはＣ−Ｘ−Ｃ族から選択された生物活性を有するリガンド、とくにＩＬ−８と組み合わせた融合タンパク質に関する。これらの融合タンパク質をコードする構築体は、組み換えＤＮＡ技術によって作出される。融合タンパク質は、抗体重鎖の可変部と定常部のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１抱合体、Ｆａｂフラグメント）および適当な軽鎖、または抗体重鎖の可変部と定常部のＣＨ１およびＣＨ２ドメイン、または抗体重鎖の可変部と定常部のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを、生物学的に活性のリガンドとそれぞれ融合して含んでいる。適当な軽鎖との共発現によって、抗原保有細胞を標的として生体の特異的部位へ活性リガンドを運搬するような融合タンパク質を作出することができる。
【００１６】
同様に、ケモカインを抗体のＦｖフラグメントのＣ末端と融合させることによって別の免疫抱合体を得ることができる。この場合、重鎖および軽鎖は、抗原結合部位の正しい折り畳みを確実にするために両エレメントが適当なリンカー配列によって組み合わされた一つのポリペプチド中に発現される。異なる構築体を図１に示す。
【００１７】
免疫抱合体の発現の結果、二機能を合わせた新たな分子ができる。これらは、第一に抗原保有細胞（ＥＧＦＲ）を標的とし、第二に活性リガンドを生体の特異的部位に運搬する。これらリガンドは、強力な走化性誘因物質であって、分子を活性化して、エフェクター細胞の腫瘍部位浸潤および続いての腫瘍の破壊を起し得る。
【００１８】
本発明の免疫抱合体を用いることによって、顕著な一般毒性を呈することなくメラノーマ、神経膠腫および癌腫などの腫瘍を検出して治療することができる。
【００１９】
このように、本発明の目的は、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを保有する腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、および該抗体または抗体フラグメントに融合したケモカインタンパク質リガンドからなる免疫抱合体を提供することである。
【００２０】
Ｃ−Ｘ−ＣおよびＣ−Ｃなどの異なるグループのケモカインがある。
【００２１】
したがって、本発明による好ましい実施態様においては、ケモカインタンパク質はＣ−Ｘ−Ｃ族から選択される。
【００２２】
Ｃ−Ｘ−Ｃ族の中では、ＩＬ−８が本発明の好ましい実施態様である。
【００２３】
したがって、本発明の目的は、ケモカインタンパク質がＣ−Ｘ−Ｃ族から選択され、好ましくはインターロイキン８（ＩＬ−８）である免疫抱合体を提供することである。
【００２４】
本発明に使用可能な抗体は、全抗体またはそのフラグメントである。適当なフラグメントは、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ´）２（本発明においてはＣＨ１抗体フラグメントと称する）、ＣＨ３およびＣＨ２抗体フラグメントである（図１）。好ましい実施態様は、Ｆｖ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３抗体フラグメントである。
【００２５】
したがって、本発明の目的は、抗体が本質的に抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメインおよび適当な軽鎖からなるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ´）２フラグメントである免疫抱合体（抗体−ＣＨ１抱合体）、抗体が本質的に抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１およびＣＨ２ドメインおよび適当な軽鎖からなる抗体フラグメントである別の免疫抱合体（抗体−ＣＨ２抱合体）、抗体が抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインおよび適当な軽鎖からなる完全な抗体である別の免疫抱合体（抗体−ＣＨ３抱合体）、最後に、抗体が本質的に抗体重鎖の可変部、適当な軽鎖および軽鎖と重鎖をつなぐポリペプチド配列物からなるさらなる免疫抱合体（抗体−Ｆｖ抱合体）を提供することである。
【００２６】
本発明による免疫抱合体は、適宜、抱合体の標的エピトープへの最適結合を確実にするために例えば特異的リンカーペプチドの導入を可能にするような制限部位を、抗体（フラグメント）とケモカインタンパク質との間に包含していてもよい。適当なリンカーペプチドおよびそれらの導入法は、当業者に広く公知であり、以下に記述される。本発明において、制限部位は特定ＤＮＡ構築体において単一特異となるように選択される。好ましい制限部位はＮｃｏＩおよびＢｃｌＩである。
【００２７】
したがって、本発明のさらなる目的は、抗体／抗体フラグメントと生物学的に活性のリガンドとの間にＤＮＡ制限部位を推定し得るアミノ酸（配列物）を含んでなる免疫抱合体を提供することである。該制限部位は完全融合構築体内で単一特異である。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、抗体／抗体フラグメントと生物学的に活性のリガンドとの間にリンカーペプチドを含んでなる免疫抱合体を提供することである。
【００２９】
一般に、腫瘍細胞表面のＥＧＦレセプターに対する全ての抗体が適している。しかし、モノクローナル抗体４２５が好ましい実施態様である。
【００３０】
さらに本発明の目的は、抗体または抗体フラグメントがネズミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５に由来し、好ましくはＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ８、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ８、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ８、ＭＡｂ２５−Ｆｖ−ＩＬ８、ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ−８からなる群から選択されることを特徴とする免疫抱合体を提供することである。
【００３１】
さらに、本発明の目的は上記、下記および請求の範囲に定義した免疫抱合体の製造法を提供することであって、抗体または抗体フラグメントと生物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ配列物とを所望の融合ＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて一本鎖ＤＮＡ上で互いに融合させて、得られる構築体を発現ベクターに導入して、これで宿主生物を形質転換させて、この宿主細胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパク質を発現させることによって行われる。
【００３２】
本発明の免疫抱合体は治療的使用に適している。
【００３３】
したがって、本発明の目的は、上記、下記および請求の範囲に定義した少なくとも一つの免疫抱合体および生物学的に容認し得る担体を含んでなる薬剤組成物を提供することである。
【００３４】
本発明のねらいは標的エレメントとしてのモノクローナル抗体および走化性および活性化の性質を有するエフェクター分子としてのケモカインＩＬ−８からなる融合タンパク質を作出することである。
【００３５】
ＩＬ−８および他のケモカイン（ＭＩＰなど）がＮ末端を抗体部分などの追加のアミノ酸によってブロックされた場合にその生物活性が保持されることを初めて示すことができた。したがって、この分子は、エフェクター細胞がＥＧＦレセプター陽性腫瘍細胞であってその場で活性化されるような標的腫瘍療法において有用であると考えられる。
【００３６】
ＭＡｂ４２５重鎖およびＩＬ−８タンパク質をコードするｃＤＮＡを分子生物学的方法および適当な発現系において発現されたタンパク質によって融合され得ること、およびＥＧＦレセプター結合能が融合タンパク質において保存されることを示すことができた（図２）。
【００３７】
ＩＬ−８の主標的細胞は好中顆粒球であって、次の三つの生物学的機能を有する。
【００３８】
走化性勾配に沿った走化性移動
予め産生されたタンパク分解酵素を伴う貯蔵顆粒の放出
スーパーオキシドアニオンの即時産生（レスピラトリーバースト）
したがって、ＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８およびＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質の走化能、ＭＰＯ放出の誘導およびスーパーオキシド放出について調べた。
【００３９】
さらに、本発明の融合タンパク質（例えばＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８およびＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８）は、走化能、ＭＰＯ放出の誘導およびスーパーオキシド放出を起こすことを示すことができた。図３の結果は、両融合タンパク質が組み換えＩＬ−８の範囲でヒト好中球に対して走化性であることを示している（図４）。二価のかたちに組み立てなければならないＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８およびＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質に加えて、一価のＦ（ａｂ´）−ＩＬ−８融合タンパク質が作出され、これは大腸菌中で発現されて精製された。図５は、Ｆ（ａｂ´）−ＩＬ−８融合タンパク質がＭＡｂ４２５Ｆ（ａｂ´）と比較した場合にヒト好中球に対して走化性であって、したがって大腸菌中で発現されて精製されることを示す。
【００４０】
ＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質は、遊離のＩＬ−８と比較してかなり強いスーパーオキシド放出能を有する（図６）。ＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８融合タンパク質の活性はより低いが、その値は対照値よりは有意に高い（図６）。ＭＡｂ４２５単独では活性を示さない。全試験は、単一では無活性のシトカラシンＢをエンハンサー物質として用いて行った（データ表示なし）。
【００４１】
両融合タンパク質はミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）放出を誘導するが、ＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８融合タンパク質はＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質よりも活性である（図７）。全データは、トリトン溶解細胞のデータに従って計算し、これを１００％酵素含量とする。全データはシトカラシンＢをエンハンサー物質として用いて得られた。
【００４２】
高度に保存されたＥ−Ｌ−Ｒ部分を有するＩＬ−８分子のＮ末端部分がレセプター結合およびシグナルトランスダクションに要求されることが以前に明らかにされた。ＩＬ−８の立体構造は、両Ｎ末端が露出構造中にあるホモ二量体である。Ｎ末端が追加のアミノ酸によってブロックされる場合に、ＩＬ−８の生物活性が阻害される可能性があった。したがって、制限部位（ＮｃｏＩ／ＢｃｌＩ）を二つのｃＤＮＡ間に導入してリンカーペプチドを導入し、それによってＮ末端のアクセス能を修復した。
【００４３】
両エレメントの化学的カップリングのような融合タンパク質作出のための他のアプローチでは、バッチ間で変動するおそれのある不確かな構築体が得られた。加えて、化学的カップリングではリガンドの二次構造が破壊されるとかアクセス不能のためにレセプター結合に関してほとんどのタンパク質が不活性であるという状態を生じ得る。これに対して、本発明のアプローチでは、ほとんど無制限で再現可能な質で発現され得る確定した構造の融合タンパク質を作出することができる。
【００４４】
要約すると、本発明による融合タンパク質は次のような性質を有する。
【００４５】
ＥＧＦＲ陽性細胞に結合する。
【００４６】
走化能を誘起する。
【００４７】
ＭＰＯおよびスーパーオキシド放出を誘導する。
【００４８】
その場での腫瘍溶解を誘導する。
【００４９】
したがって、本発明の免疫抱合体は、腫瘍の治療に適している。
【００５０】
【発明の実施の形態】
一般的注記
本出願に記述の全ての微生物、細胞系、プラスミド、プロモーター、耐性マーカー、複製開始点、制限部位またはベクターの他のフラグメントは、市販されているかあるいは一般に入手可能である。とくに記載がない限り、これらは例として使用されるのみであって、本発明に必須ではなく、それぞれ他の適当な手段および生物学的材料によって置き換えることができる。
【００５１】
本発明に必須の方法技術を以下に詳細に記述する。詳記されない他の方法技術は、当業者によく知られた公知の標準法または引用参考文献および特許出願明細書および標準的文献に記載のある方法技術である（例えば、"Antibodies、 A Laboratory Manual"、 Harlow、 Lane、 Cold Spring Harbor、 1988）。
モノクローナル抗体
ＭＡｂ４２５は、ヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）に対 するＩｇＧ１ネズミモノクローナル抗体である。ＭＡｂ４２５は、ヒトＥＧＦレセプターの外側ドメインのポリペプチドエピトープと結合し、ＥＧＦの結合と競合する。ＭＡｂ４２５は、インビトロで腫瘍細胞毒性を媒介することおよびインビトロで類表皮腫および結腸直腸癌腫由来細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出だされた（Rodeck et al.、 Cancer Res、 47、 3692、1987）。ヒト化およびキメラ型ＭＡｂ４２５はＷＯ９２／１５６８３に開示されている。
ケモカイン
ケモカインをコードするｃＤＮＡは、British Biotechnology Limited (ヒト ＩＬ−８ ＢＢＧ４４、Herrmann Biermann GmbH、 Bad Nauheim、独国）から購入するか、またはサイトカイン産生ヒト細胞系Ｕ９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）から分離されるｍＲＮＡから作出する。ケモカイン産生細胞からの全ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌ（WAK-Chemie、独国）を製造者の指示にしたがって用いて分離した。次いでＲＮＡをｃＤＮＡに転写して、公表されたＤＮＡ配列から推定した適当なプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
ベクター
ｐＵＣ１９は一連の多重コピー数大腸菌プラスミドクローニングベクターのひとつであって、ｐＢＲ３２２およびＭ１３ｍｐ１９の部分を含む。ｐＵＣ１９は、誘導性細菌性ｌａｃプロモーター−オペレーターおよびそれに続く多クローニング部位を含む（Yanisch-Perron et al.、 Gene、 33、 103-109、 1985）。ｐＵＣベクターは、市販されている（例えばNew England Biolabsなど）。
【００５２】
ｐBluescriptＫＳ／ＳＫ＋およびＫＳ／ＳＫ−ファージミドベクターはｐＵＣ１９に由来する。ベクターは市販されている（Stratagene、ハイデルベルグ）。
原核細胞発現ベクターはｐＳＷ１ベクター（Ward et al.、 Nature、 341、544-546、 1989）に基づき、これはｐＵＣ１９ベクターに由来する。ｐＳＷ１は、Erwinia carotovoraからの細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチドをコードする配列を含む（Lei et al.、 J.Bact.、 169、 4379-4383、 1987）。外来性ＤＮＡをｐｅｌＢリーダー配列の後に枠内に導入して、ペリプラズム中へのタンパク質発現を指示することができる。
【００５３】
真核細胞発現ベクターｐＨＣＭＶ（Gillies et al., Cell、 33、 717、 1983） は、シミアン（アカゲザル）ウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始点およびヒトサイトメガウイルスのプロモーターおよびエンハンサー領域を含む。プロモーター／エンハンサー領域の後には、発現されるべき遺伝子導入のための多クローニング部位が続く。このベクターにおいて、ＭＡｂ４２５重鎖可変部のキメラ型およびＣＨ２ドメインの末端でケモカインと融合したｃγ１ＣＨ２領域とを組合わせてＭＡｂ４２５重鎖融合タンパク質がつくり出された。この融合Ｉｇ鎖を適当な軽鎖と組み合わせることによって一価の抗原結合領域を形成してこれを免疫抱合体に組み立てることができ、これを会合させて標的抗原に特異的な二価の免疫抱合体を産生するができる。重鎖および軽鎖構築体は、ひとつのまたは別々のベクターに導入することができる。
【００５４】
【実施例】
融合タンパク質の真核細胞における発現
Ｆａｂ４２５−ケモカイン融合タンパク質発現のための真核細胞発現ベクターの構築
ＭＡｂ４２５およびケモカインのＰＣＲ手法による融合：
ヒトｃγ１定常部を、ｐＵＣ１９にＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして挿入した。ｃγ１定常部は二つのＳａｃＩＩ部位を含む。一つは５´ＢａｍＨＩ部位の４０ｂｐ下流の５´イントロンに位置し、もう一つは５´ＢａｍＨＩ部位の５８０ｂｐ下流でＣＨ３ドメイン開始部の１４０ｂｐ上流に位置している。二番目のＳａｃＩＩ部位は、さらなるサブクローニングに適しており、したがって最初のＳａｃＩＩ部位をアダプターを用いてＳｎａＢＩ部位を導入することによって破壊した。この構築物（ΔＳａｃＩＩｃγ１）において、ＳａｃＩＩ部位の下流のフラグメントは容易に交換され得る。
【００５５】
ヒトＩＬ−８をｐＵＣ１８ベクター（ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ）から切り出して、ｐBluescriptＳＫ＋（Stratagene GmbH、ハイデルベルグ）（ＳｍａＩ／Ｅ ｃｏＲＩ）にＢｇｌＩＩおよびＳｍａＩ部位が除去されるように挿入した。ΔＳａｃＩＩｃγ１クローンのＳａｃＩＩ／ＸｂａＩフラグメントをｐBluescriptＳＫ＋に挿入した。両遺伝子を適当なプライマーを用いてＰＣＲ手法で増幅した。
ΔＳａｃＩＩｃγ１用
３´プライマー：ＣＨ２ドメインの末端配列およびＮｃｏＩ部位
５´プライマー：逆配列決定プライマー
ＩＬ−８用
３´プライマー：汎用配列決定プライマー
５´プライマー：Ｎｃｏｌ部位およびＩＬ−８の開始配列
生成物を切断して、ＳＫ＋ＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩと結合させる。得られたペプチド配列において、ＣＨ２ドメインのＣ末端リジンをメチオニンに変え、ＩＬ−８部分のＮ末端セリンをグリシンに変える。
【００５６】
二つのポリペプチド間の接合部に新たにつくられる配列は以下の通りである。
５’ＡＡＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＣＴ３’
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ
ｃγ１ＣＨ２ ＜＝ ＝＞ＩＬー８（２ー７２）
同様の操作をプライマー（表１）を用いて行い、二つの遺伝子間にＢｃｌＩ部位を導入した。得られる融合遺伝子は、ＢｃｌＩ部位をｃγ１定常部遺伝子とＩＬ−８遺伝子間に有し、ＣＨ２ドメインの全配列、二つの追加のアミノ酸（バリン、イソロイシン）をコードしそして最初の二つのアミノ酸（セリン、アラニン）を含まないＩＬ−８配列をコードする。
【００５７】
二つのポリペプチド間の接合部に新たにつくられる配列は以下の通りである。
５’ＧＣＣ ＡＡＡ ＧＴＧ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＡＡ３’
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
ｃγ１ＣＨ２ ＜＝ ＝＞ＩＬー８（３ー７２）
ＰＣＲによる生成物を、ＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いてＳＫ＋にサブクローニングした。真核細胞発現のために、これら融合遺伝子をｐＨＣＭＶベクターにクローニングした。
【００５８】
【表１】
免疫抱合体の真核細胞における発現
真核細胞における免疫抱合体の発現には、重鎖および軽鎖を含むベクターＤＮＡの宿主細胞への導入が要求される。種々の異なる方法、例えば電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン、燐酸カルシウム、リポフェクチンまたはプロトプラスト融合などが記述されている。免疫抱合体をコードする組み換えＤＮＡ配列がその細胞型においてｍＲＮＡに正しく転写される限り、いかなる宿主細胞型を用いてもよい。宿主細胞としては、免疫グロブリンを産生しないマウスミエローマ細胞、例えばＳｐ２／０−ＡＧ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）またはハムスター細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、またはＣＨＯ／ＤＨＦＲ−（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９０９６）、またはＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）が用いられる。過渡的発現には、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）またはＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）を用いてもよい。
免疫抱合体の過渡的発現
発現ベクターｐＨＣＭＶは、アカゲザルウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始点を含む。細胞系ＣＯＳ−７は、開始点欠失ＳＶ４０ウイルスで形質転換されたアカゲザル細胞系ＣＶ−１から誘導されたものである。したがって、ＳＶ４０複製開始点を含むプラスミドは増幅されて、免疫抱合体の産生が向上すると考えられる。上清を７２時間後に集めて、ＥＧＦ−レセプター結合およびケモカイン濃度についてＥＬＩＳＡによって調べた。
免疫抱合体の恒常的発現
免疫抱合体の発現のための組み換え構築体を含むベクターを、適当な宿主細胞に導入する。重鎖および軽鎖構築体を同一または別々のベクターに入れることができる。後者の場合は、両ベクターはネオマイシン耐性またはデヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）などの同一の選択マーカーまたは二つの異なる選択マーカーを両ベクターの選択検出のために含ませればよい。ＤＨＦＲマーカーの選択は、ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−などのＤＨＦＲ陰性細胞系においてのみ可能である。混合細胞集団を、ＥＧＦ−レセプター特異性ＥＬＩＳＡを用いて免疫抱合体の発現について分析する。陽性モノクローナルについてのさらなる選択を限定希釈クローニングによって行う。
ＭＡｂ４２５ケモカイン免疫抱合体の精製
宿主細胞によって産生されたＭＡｂ４２５免疫抱合体を集めて、例えば標的抗原、抗サイトカイン抗体または抗イディオタイプ抗体などを用いるアフィニティークロマトグラフィーなどの適当な方法によって精製することができる（例えばHarlow、 Lane、前出）。
【００５９】
本発明では、精製は、標準法（例えば、Kostelny et al.、 J. Immunol.、 148、 1547、 1992）によってＭＡｂ４２５から生成された抗イディオタイプ抗体によ って達成された。
【００６０】
純正のＦｖ免疫抱合体を得るために、タンパク質発現に適する大腸菌株を発現プラスミドによって形質転換させた（以下を参照されたい）。細胞をＯＤ578＝ ０．５になるまで増殖させて、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）で誘導した。細胞を一晩増殖させて、上清および細胞を回収した。上清を標準法で調製した抗ＭＡｂ４２５抗イディオタイプカラムに供する。カラムを０．５Ｍ ＮａＣｌ−燐酸塩緩衝溶液で洗浄して、結合したタンパク質を１００ｍＭグリシン−０．５Ｍ ＮａＣｌを用いてｐＨ２．５で溶出した。溶出された液を２．５Ｍトリス（ｐＨ８．０）で直ちに中和した。ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８を含むフラクションを集めて、濃縮して、ＰＢＳに対して透析した。
Ｆａｂ４２５−ケモカインおよびＦｖ−ケモカイン融合タンパク質発現のための原核細胞発現ベクターの構築
ＦｖフラグメントをGlockshuberら（Biochemistry 29、 1362-1367、 1990）の 記述にしたがって作出した。軽鎖および重鎖ＦｄフラグメントまたはＦｖフラグメントをコードするＤＮＡ配列物を、ｐＳＷ１ベクターの多クローニング部位に導入した。成熟軽鎖コード配列、および重鎖成熟コード配列およびＦｖコード配列は、細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチドの後に位置する。重鎖コード配列は、ＮｃｏＩ（３´末端）部位を含む。ケモカインをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって修飾して、ＮｃｏＩ（５′末端）およびＮｏｔＩ（３′末端）またはＥｃｏＲＩ（Ｆｖ融合のため）制限部位を導入した。ケモカイン遺伝子を枠内で重鎖のＣＨ１ドメインまたはＦｖフラグメントに直接に融合させた。別法として、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｘ（ｘは１〜４の数値）などのリンカーペプチドをＣＨ１ドメインとケモカイン遺伝子との間に導入することができる。これらのリンカーおよびそれらの調製法については文献で公知である（例えば、Curtis et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、 88、 5809、 1991）。
【００６１】
これらのベクターによって、機能的Ｆ（ａｂ´）（＝ＣＨ１）およびＦｖケモカイン融合タンパク質の大腸菌における効率的な発現が可能になる。軽鎖および重鎖−ケモカイン融合タンパク質は、誘導性ｌａｃプロモーターのコントロール下にある単一のジシストロンメッセンジャーＲＮＡ（Skerra and Plueckthun、 Science、 242、 1038-1040、 1988）上に位置する。したがって、Ｆａｂ／Ｆｖ−融合タンパク質の発現は、培養条件の要求に従って誘導することができる。両タンパク質のジシストロンメッセンジャーＲＮＡからの翻訳は等量のＦｄ−ケモカイン融合タンパク質および軽鎖の合成にくみするので、その結果、機能性Ｆａｂ／Ｆｖ−融合タンパク質への正しい組立の確率が大きくなる。二つのポリペプチドは大腸菌のペリプラズム中に分泌され、ここで折り畳み、ジスルフィド結合の形成および機能性Ｆａｂ４２５−ＣＨ１／Ｆｖ融合タンパク質への組立がなされる。細菌培養の延長によって、大腸菌の外膜が部分的に透過性となり、タンパク質は培養培地中に分泌される。
ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性
ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性を、ＥＧＦレセプター特異性ＥＬＩＳＡによって決定した。すなわち、マイクロタイタープレートを精製ＥＧＦレセプターを用いて４℃で一晩被覆した。プレートを、融合タンパク質を含む上清または非抱合ＭＡｂフラグメントを含む上清ともにインキュベートした。プレートを洗浄して非結合物質を除去してから、ペルオキシダーゼと抱合させたヤギ抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（重鎖および軽鎖）、次いで基質とともにインキュベートすることによって、ＥＧＦレセプターに結合した抗体を検出した。結合したＥＧＦレセプター特異性タンパク質の量を４９０ｎｍで測定して決定した。
ＭＡｂ４２５−ＩＬ−８免疫抱合体の生物学的活性
エフェクター細胞の分離
生物学的活性を決定するために、新鮮ヒト末梢血好中顆粒球を健康な供血者からの全血からHaslettら（Am. J. Pathol.、 119、 101-110、 1985）が既述した方 法で分離した。血漿を遠心分離して、赤血球をデキストラン沈殿によって分離して、最後にリンパ球および白血球をパーコール勾配遠心分離によって分離した。
分離した好中球を直ちに使用した。
走化能の決定
走化性の決定はFalkら（J. Immunol. Methods、 33、 239-247、 1980）の記述に従って行った。すなわち、４８ウェルボイデンチャンバーおよび５μｍ膜を用いた。精製した好中球を、ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリ ウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に１×１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。下方のウェルに上清または対照上清を含む融合タンパク質を入れて、膜で被覆して、最後に上方のウェルに細胞懸濁液を加える。３７℃で３０分間インキュベーションした後、膜を除去して、２％グルタルジアルデヒド中で１０分間固定した。次いで、膜に付着した細胞をウェイゲルトの鉄ヘマトキシリン（シグマ診断薬）中で３分間染色した。膜に結合した細胞数を顕微鏡下で決定した。
好中球における酵素放出誘導能の決定
免疫抱合体の好中球での顆粒放出誘導能を評価するために、上清中のミエロペルオキシダーゼ活性をモニターした（Henson et al.、 J. Immunol.、 121、 851、 1978）。アッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレート中で５×１０5細胞 ／ウェルを用いて行った。刺激剤とともにインキュベート（３７℃）した後、プレートを遠心分離して、無細胞上清を別の９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。無細胞上清をジアニシジン（基質として）とともにインキュベートして、吸光度を４９２ｎｍで測定した。陽性の対照として、ＦＭＬＰを１０ー7Ｍ濃度で用いた。全酵素含量を決定するために、刺激剤なしの細胞をトリトンを用いて溶解した。活性を全酵素含量に対するパーセントとして算出した（溶解）。
スーパーオキシド放出能の決定
チトクロムＣをＯ2ーで還元して、その吸光度を変化させる。吸光度の変化は、スパーオキシド活性の推定のための有用なマーカーとなる。アッセイはGuthrie ら（J. Exp. Med.、 160、 1656-1671、 1984）の記述に従って５×１０5細胞／ウ ェルを用いて９６ウェルマイクロタイタープレート中で行った。刺激剤およびチトクロームＣとともにインキュベートした後、プレートを遠心分離して、上清の吸光度を５５０ｎｍで決定した。
さらなる免疫抱合体
上記のようにして、ケモカイン成分としてＭＩＰ−２αおよびＭＩＰ−２βを含んでなる抗ＥＧＦＲ−ＣＨ１、−ＣＨ２、−ＣＨ３および−Ｆｖ免疫抱合体（制限部位およびリンカーを有するもの／有しないもの）を調製して試験した。これらの構築体は、ＩＬ−８誘導体と同様の性質を示す。
免疫抱合体の治療的使用
本発明の免疫抱合体は、治療のためにヒト患者に投与することができる。したがって、本発明の目的は、上記および請求項に記載の少なくとも一つの融合タンパク質を活性組成分として、一つまたはそれ以上の薬剤学的に容認し得る担体、賦形剤または希釈剤とともに含んでなる薬剤調製物を提供することにある。
【００６２】
通常、本発明の免疫抱合体は静脈注射によってまたは非経口的に投与される。一般に、免疫抱合体の投与量範囲は、所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果が得られるに十分の量である。投与量は、患者の年齢、状態、性別、病気の程度によって異なり、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で１日１回またはそれ以上を１日または数日間投与することができる。
【００６３】
非経口的投与のための調製物には、滅菌水性溶液または非水性溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよび当業者に公知のこれらの目的に適した他の溶媒があげられる。本発明の免疫抱合体は、生理学的に容認し得る担体からなる組成物において使用することができる。それら適当な担体の例としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液または乳酸リンゲル溶液があげられる。保存剤および他の添加剤、例えば抗生物質、抗酸化剤およびキレート剤などを薬剤調製物に加えることも可能である。
【００６４】
本発明の薬剤調製物は、メラノーマ、神経膠腫および癌腫、さらに血液腫瘍および固形腫瘍を含むあらゆる種類の腫瘍の治療に適している。
（図面および表についての説明）
表１ 真核細胞発現のための融合タンパク質を作出するための、ＮｃｏＩまたはＢｃｌＩ部位をつくるためのＰＣＲに使用するプライマーの配列を示す。
【００６５】
図１ 抗体−サイトカイン免疫抱合体のモデルを示す説明図である。
【００６６】
Ｃ＝サイトカイン、ＶＨ＝重鎖可変部、ＶＬ＝軽鎖可変部、ＣＨ＝重鎖定常部、ＣＬ＝軽鎖定常部
図２ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清におけるＭＡｂ４２５を抗ＥＧＦ−Ｒ ＥＬＩＳＡによって示した説明図である。
【００６７】
四角：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清
三角：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清
逆三角：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清
丸：ｐＨＣＭＶ上清
横軸：希釈は上清
縦軸：４９０ｎｍにおける吸光度
図３ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清による走化性の誘導を示す説明図である。
【００６８】
カラム１：対照ＤＭＥＭ／ＰＳ
カラム２：非希釈ｐＨＣＭＶ上清
カラム３：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清１：１４希釈（ＥＧＦ−ｒ−ＥＬＩＳＡの結果による）
カラム４：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清１：２８希釈（ＥＧＦ−ｒ−ＥＬＩＳＡの結果による）
カラム５：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清（１．７６×１０ー10モル／Ｌ*）
カラム６：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清１：２希釈
カラム７：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清（２．０×１０ー10モル／Ｌ*）
カラム８：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清１：２希釈*
ＩＬ−８濃度をＥＬＩＳＡ（アメルシャム）によって決定
縦軸：計数フィールド当たりの細胞数
図４ 精製ＩＬ−８による走化性の誘導を示す説明図である。
【００６９】
縦軸：計数フィールド当たりの細胞数
横軸：ＩＬ−８濃度（モル／Ｌ）
図５ ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８（大腸菌）による走化性の誘導を示す説明図である。
【００７０】
丸：大腸菌中で発現されたＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８
四角：大腸菌中で発現されたＭＡｂ４２５−Ｆ（ａｂ´）
三角：対照デュルベッコ培地／ＢＳＡ
縦軸：計数フィールド当たりの細胞数
横軸：濃度（モル／Ｌ）
図６ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるスーパーオキシド放出の誘導を示す説明図である。
【００７１】
カラム１：非刺激細胞
カラム２：ＩＬ−８ １０ー7Ｍ
カラム３：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清（２．０×１０ー10モル／Ｌ*）
カラム４：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清（１．７６×１０ー10モル／Ｌ*）
カラム５：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清（０モル／Ｌ*）
* ＩＬ−８濃度はＥＬＩＳＡ（アメルシャム）によって決定した。
【００７２】
縦軸：５５０ｎｍにおける吸光度
図７ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるＭＰＯ放出の誘導を示す説明図である。
【００７３】
カラム１：非刺激細胞
カラム２：シトカラシンＢ刺激細胞
カラム３：ＩＬ−８ １０ー7Ｍ
カラム４：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清
カラム５：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清１：２希釈
カラム６：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清
カラム７：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清１：２希釈
カラム８：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清
カラム９：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清１：２希釈
縦軸：全ＭＰＯ量（１００％）と比較した％ＭＰＯ活性
【図面の簡単な説明】
【図１】抗体−サイトカイン免疫抱合体のモデルを示す説明図である。
【図２】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清におけるＭＡｂ４２５を抗ＥＧＦ−Ｒ ＥＬＩＳＡによって示した説明図である。
【図３】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清による走化性の誘導を示す説明図である。
【図４】精製ＩＬ−８による走化性の誘導を示す説明図である。
【図５】ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８（大腸菌）による走化性の誘導を示す説明図である。
【図６】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるスーパーオキシド放出の誘導を示す説明図である。
【図７】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるＭＰＯ放出の誘導を示す説明図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍関連標的エレメント、最も好ましくは、ヒト上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）などのヒト腫瘍細胞上で優先的に発現される分子を優先的に認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントとケモカインタンパク質グループ、好ましくはＣ−Ｘ−Ｃ族から選択された生物活性を有するリガンドからなる新規融合タンパク質に関する。得られる融合タンパク質は、特異的標的細胞または組織に生物活性を有するリガンドを運ぶために用いることができる。新規の免疫抱合体(Immunoconjugate)は腫瘍の治療に使用することができる。
【０００２】
【従来の技術】
多様な治療概念が癌患者の治療のために用いられてきた。これまで、悪性細胞上で発現される細胞表面分子を特異的にまたは選択的に認識するモノクローナル抗体を用いて臨床試験が行われてきた。このアプローチのねらいは、癌細胞を排除するために抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体媒介細胞毒性を誘導することである。第二のアプローチは、免疫応答のサイトカイン媒介活性化である。サイトカイン誘導抗腫瘍活性は次のようなもので媒介され得る。すなわち、
１）腫瘍増殖に対するサイトカインの直接的細胞毒性／細胞制圧効果
２）ＬＡＫ活性または単球／顆粒球媒介細胞毒性などの腫瘍抗原非特異的メカニズム
３）ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞によって媒介される腫瘍抗原特異的免疫応答
この場合、腫瘍に対する全身的免疫は動物モデルにおいて観察された。
【０００３】
しかし、サイトカインの大量投与の細胞毒性および腫瘍部位での存在の不充分さから、標的腫瘍療法のコンセプトが導かれる。標的腫瘍療法の原理は、腫瘍関連抗原に特異的なモノクローナル抗体のような標的分子と生物学的に活性のエフェクター分子との物理的結合に基づいている。標的分子によるエフェクター分子の運搬によって、腫瘍中のサイトカインの濃度が上昇し、最大要求量を減少させ得ることが期待される。動物モデルにおいて、腫瘍内注射またはトランスフェクトさせた腫瘍細胞の分泌のいずれかによってサイトカインを腫瘍部位に存在させることによって腫瘍を退行させ得ることが示された（総説としてColombo and Forni、 Immunology Today、 15、 48-51、 1994を参照されたい）。これらの系では、サイトカインは腫瘍の増殖は阻害しないが、迅速で有効な抗腫瘍反応を活性化することができる。したがって、エフェクター分子と標的エレメントとの物理的組み合わせは、生物活性を有するリガンドの周辺部での存在を減らして腫瘍内での利用を促進する手段を意味する。さらに、単一腫瘍細胞またはミクロ転移もまた、これらの分子の標的となり得る。
【０００４】
抗体特異性標的法のための生物活性リガンドは、直接にまたは標的細胞に対して致死的環境をつくり出すことによって標的細胞の破壊を誘導しなければならない。これは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ、ＴＮＦαまたはＣＳＦなどのサイトカインによって達成され得る。これらのサイトカインは、抗腫瘍効果を直接的にあるいは宿主の防護機構を活性化することによって発揮することが示された（Mire-Sluis、 TIBTECH、11、 74-77、 1993、Columbo et al.、 Cancer Res.、 52、 4853-4857、 1992、Thomas and Balkwill、 Pharmac. Ther.、 52、 307-330、 1991）。
【０００５】
しかし、これらサイトカインのほとんどはエフェクター細胞を活性化するが、皆無または微弱の走化能しか示さない。そのため、腫瘍組織における適量のエフェクター細胞が存在しなければ抗腫瘍活性は弱いと考えられる。
【０００６】
しかし、ケモカインは多くのエフェクター細胞に走化性であって、したがって腫瘍部位におけるこれらの存在を強めて、次に種々のエフェクター細胞機能を誘導する（例えば、Miller and Krangel (1992)、 "Biology and Biochemistry of the Chemokines: A Novel Family of Chemotactic and Inflammatory Cytokines"、 Critical Reviews in Immunology、 12、 17を参照されたい）。
【０００７】
ＩＬ−８、ＭＩＰ２α（ＧＲＯ−βとしても知られる）およびＭＩＰ２β（ＧＲＯ−γ）は、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン超族（小サイトカイン超族またはインタークリンとしても知られる）に属する。これらは走化因子として作用して、エフェクター細胞機能を活性化し、したがって、最適エフェクター分子であることを示している。このＣ−Ｘ−Ｃケモカイン族は、最近特徴づけされた小タンパク質（８〜１０ｋＤ）の一群で、２０〜５０％のアミノ酸配列相同性を示し、走化性および炎症促進活性を有する。
【０００８】
ＩＬ−８は、確立された立体構造を有し（Clore et al.、 Biochemistry、 29、 1689-1696、 1990）、いくつかのＣＸＣケモカインと Ｎ末端ＥＬＲ部分を共有する。ＣＸＣケモカイン間の配列相同性から、立体構造がきわめて類似することが予測される。これはＭＣＡＦ／ＭＣＰ−１についてすでに示された（Gronenborn and Clore、 Prot. Eng.、 4、 263-269、 1991）。
【０００９】
溶液では、ＩＬ−８は安定な二量体を形成し（Clore et al.、 Biochemistry、 29、 1689-1696、1990）、Ｆ（ａｂ´）ＩＬ−８融合タンパク質を二つのＩＬ−８モノマーの相互作用によって二量体化して二価の免疫抱合体を形成することが可能である。これは融合タンパク質の抗原との相互作用を強めると考えられる。
【００１０】
これまでに記述されたＣ−Ｘ−Ｃ群はいずれも、主に好中顆粒球上の作用する。遺伝子は染色体４上に位置している。この群には、ＰＦ４、血小板塩基性タンパク質、ｈＩＰ１０、ＩＬ−８、ＭＩＰ２αおよびＭＩＰ２βがある。これらタンパク質の好中球への影響は、走化能、脱顆粒およびレスピラトリーバーストである（Sherry and Cerami、 Current Opinion in Immunology、 3、 56-60、 1991、Oppenheim et al.、 Annu. Rev. Immunol.、 9、 617-648、 1991、Miller and Krangel、 Critical Reviews in Immunology、 12、 17-46、 1992、Clark-Lewis et al.、 J. Biol. Chem.、 266、 23128-23134、 1991）。
【００１１】
ケモカインのＣ−Ｃ族に密接に関連したものは主に単球に作用する。遺伝子は全て染色体１７に位置している。これらタンパク質はＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９およびＲＡＮＴＥＳである。これら分子は単球への強い走化能を示す（Matsushima et al.、 Chem. Immunol.、 51、 236-265、 1992、Oppenheim et al.、 Annu. Rev. Immunol.、 9、 617-648、 1991）。
【００１２】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、表皮および上皮細胞のミトゲンであるポリペプチドホルモンである。ＥＧＦが感受性細胞と相互作用するときには、これは膜レセプター（ＥＧＦＲ）に結合する。ＥＧＦＲは、約１７０ｋＤの貫膜糖タンパク質であって、ｃｅｒｂ−Ｂプロトオンコジーン（癌原遺伝子）の遺伝子産物である。
【００１３】
ネズミモノクローナル抗体ＭＡｂ４２５はヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）に対してつくられたもので、ＥＧＦＲの外側ドメイン上のポ リペプチドエピトープに結合することが見出だされた。これはＥＧＦの結合を阻害し、インビトロで腫瘍細胞毒性を媒介し、インビトロで上皮および結腸直腸癌腫由来の細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出だされた（Rodeck et al.、 Cancer Res.、 47、 3692、 1987）。ＭＡｂ４２５のヒト化されたキメラは、ＷＯ９２／１５６８３から公知である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
このように、本発明の目的は、腫瘍細胞表面のＥＧＦＲ抗原特異性エピトープおよびそれらのエフェクター細胞に対して高い走化能を有する生物学的に活性のリガンドからなり、低毒性標的腫瘍療法を可能にするような抗体またはそれらのフラグメントをつくり出すことであった。したがって、この免疫抱合体は、同様のサイトカイン−抗体免疫抱合体の改善を意味し、これは腫瘍溶解能に関しては同様に効果的であるが、その走化的性質から特異的部位にエフェクター細胞を誘引する能力に関してはそうではない。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、モノクローナル抗体の部分、少なくとも抗原認識部位またはＥＧＦＲのエピトープを認識する完全なモノクローナル抗体を、ケモカイン群、好ましくはＣ−Ｘ−Ｃ族から選択された生物活性を有するリガンド、とくにＩＬ−８と組み合わせた融合タンパク質に関する。これらの融合タンパク質をコードする構築体は、組み換えＤＮＡ技術によって作出される。融合タンパク質は、抗体重鎖の可変部と定常部のＣＨ１ドメイン（ＣＨ１抱合体、Ｆａｂフラグメント）および適当な軽鎖、または抗体重鎖の可変部と定常部のＣＨ１およびＣＨ２ドメイン、または抗体重鎖の可変部と定常部のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを、生物学的に活性のリガンドとそれぞれ融合して含んでいる。適当な軽鎖との共発現によって、抗原保有細胞を標的として生体の特異的部位へ活性リガンドを運搬するような融合タンパク質を作出することができる。
【００１６】
同様に、ケモカインを抗体のＦｖフラグメントのＣ末端と融合させることによって別の免疫抱合体を得ることができる。この場合、重鎖および軽鎖は、抗原結合部位の正しい折り畳みを確実にするために両エレメントが適当なリンカー配列によって組み合わされた一つのポリペプチド中に発現される。異なる構築体を図１に示す。
【００１７】
免疫抱合体の発現の結果、二機能を合わせた新たな分子ができる。これらは、第一に抗原保有細胞（ＥＧＦＲ）を標的とし、第二に活性リガンドを生体の特異的部位に運搬する。これらリガンドは、強力な走化性誘因物質であって、分子を活性化して、エフェクター細胞の腫瘍部位浸潤および続いての腫瘍の破壊を起し得る。
【００１８】
本発明の免疫抱合体を用いることによって、顕著な一般毒性を呈することなくメラノーマ、神経膠腫および癌腫などの腫瘍を検出して治療することができる。
【００１９】
このように、本発明の目的は、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを保有する腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体またはそのフラグメント、および該抗体または抗体フラグメントに融合したケモカインタンパク質リガンドからなる免疫抱合体を提供することである。
【００２０】
Ｃ−Ｘ−ＣおよびＣ−Ｃなどの異なるグループのケモカインがある。
【００２１】
したがって、本発明による好ましい実施態様においては、ケモカインタンパク質はＣ−Ｘ−Ｃ族から選択される。
【００２２】
Ｃ−Ｘ−Ｃ族の中では、ＩＬ−８が本発明の好ましい実施態様である。
【００２３】
したがって、本発明の目的は、ケモカインタンパク質がＣ−Ｘ−Ｃ族から選択され、好ましくはインターロイキン８（ＩＬ−８）である免疫抱合体を提供することである。
【００２４】
本発明に使用可能な抗体は、全抗体またはそのフラグメントである。適当なフラグメントは、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ´）２（本発明においてはＣＨ１抗体フラグメントと称する）、ＣＨ３およびＣＨ２抗体フラグメントである（図１）。好ましい実施態様は、Ｆｖ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３抗体フラグメントである。
【００２５】
したがって、本発明の目的は、抗体が本質的に抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメインおよび適当な軽鎖からなるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ´）２フラグメントである免疫抱合体（抗体−ＣＨ１抱合体）、抗体が本質的に抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１およびＣＨ２ドメインおよび適当な軽鎖からなる抗体フラグメントである別の免疫抱合体（抗体−ＣＨ２抱合体）、抗体が抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインおよび適当な軽鎖からなる完全な抗体である別の免疫抱合体（抗体−ＣＨ３抱合体）、最後に、抗体が本質的に抗体重鎖の可変部、適当な軽鎖および軽鎖と重鎖をつなぐポリペプチド配列物からなるさらなる免疫抱合体（抗体−Ｆｖ抱合体）を提供することである。
【００２６】
本発明による免疫抱合体は、適宜、抱合体の標的エピトープへの最適結合を確実にするために例えば特異的リンカーペプチドの導入を可能にするような制限部位を、抗体（フラグメント）とケモカインタンパク質との間に包含していてもよい。適当なリンカーペプチドおよびそれらの導入法は、当業者に広く公知であり、以下に記述される。本発明において、制限部位は特定ＤＮＡ構築体において単一特異となるように選択される。好ましい制限部位はＮｃｏＩおよびＢｃｌＩである。
【００２７】
したがって、本発明のさらなる目的は、抗体／抗体フラグメントと生物学的に活性のリガンドとの間にＤＮＡ制限部位を推定し得るアミノ酸（配列物）を含んでなる免疫抱合体を提供することである。該制限部位は完全融合構築体内で単一特異である。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、抗体／抗体フラグメントと生物学的に活性のリガンドとの間にリンカーペプチドを含んでなる免疫抱合体を提供することである。
【００２９】
一般に、腫瘍細胞表面のＥＧＦレセプターに対する全ての抗体が適している。しかし、モノクローナル抗体４２５が好ましい実施態様である。
【００３０】
さらに本発明の目的は、抗体または抗体フラグメントがネズミ、ヒト化またはキメラＭＡｂ４２５に由来し、好ましくはＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ８、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ８、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ８、ＭＡｂ２５−Ｆｖ−ＩＬ８、ＭＡｂ４２５−ＣＨ３−ＩＬ−８からなる群から選択されることを特徴とする免疫抱合体を提供することである。
【００３１】
さらに、本発明の目的は上記、下記および請求の範囲に定義した免疫抱合体の製造法を提供することであって、抗体または抗体フラグメントと生物活性を有するリガンドをコードするＤＮＡ配列物とを所望の融合ＤＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドを用いて一本鎖ＤＮＡ上で互いに融合させて、得られる構築体を発現ベクターに導入して、これで宿主生物を形質転換させて、この宿主細胞を栄養溶液中で培養して、融合タンパク質を発現させることによって行われる。
【００３２】
本発明の免疫抱合体は治療的使用に適している。
【００３３】
したがって、本発明の目的は、上記、下記および請求の範囲に定義した少なくとも一つの免疫抱合体および生物学的に容認し得る担体を含んでなる薬剤組成物を提供することである。
【００３４】
本発明のねらいは標的エレメントとしてのモノクローナル抗体および走化性および活性化の性質を有するエフェクター分子としてのケモカインＩＬ−８からなる融合タンパク質を作出することである。
【００３５】
ＩＬ−８および他のケモカイン（ＭＩＰなど）がＮ末端を抗体部分などの追加のアミノ酸によってブロックされた場合にその生物活性が保持されることを初めて示すことができた。したがって、この分子は、エフェクター細胞がＥＧＦレセプター陽性腫瘍細胞であってその場で活性化されるような標的腫瘍療法において有用であると考えられる。
【００３６】
ＭＡｂ４２５重鎖およびＩＬ−８タンパク質をコードするｃＤＮＡを分子生物学的方法および適当な発現系において発現されたタンパク質によって融合され得ること、およびＥＧＦレセプター結合能が融合タンパク質において保存されることを示すことができた（図２）。
【００３７】
ＩＬ−８の主標的細胞は好中顆粒球であって、次の三つの生物学的機能を有する。
【００３８】
走化性勾配に沿った走化性移動
予め産生されたタンパク分解酵素を伴う貯蔵顆粒の放出
スーパーオキシドアニオンの即時産生（レスピラトリーバースト）
したがって、ＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８およびＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質の走化能、ＭＰＯ放出の誘導およびスーパーオキシド放出について調べた。
【００３９】
さらに、本発明の融合タンパク質（例えばＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８およびＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８）は、走化能、ＭＰＯ放出の誘導およびスーパーオキシド放出を起こすことを示すことができた。図３の結果は、両融合タンパク質が組み換えＩＬ−８の範囲でヒト好中球に対して走化性であることを示している（図４）。二価のかたちに組み立てなければならないＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８およびＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質に加えて、一価のＦ（ａｂ´）−ＩＬ−８融合タンパク質が作出され、これは大腸菌中で発現されて精製された。図５は、Ｆ（ａｂ´）−ＩＬ−８融合タンパク質がＭＡｂ４２５Ｆ（ａｂ´）と比較した場合にヒト好中球に対して走化性であって、したがって大腸菌中で発現されて精製されることを示す。
【００４０】
ＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質は、遊離のＩＬ−８と比較してかなり強いスーパーオキシド放出能を有する（図６）。ＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８融合タンパク質の活性はより低いが、その値は対照値よりは有意に高い（図６）。ＭＡｂ４２５単独では活性を示さない。全試験は、単一では無活性のシトカラシンＢをエンハンサー物質として用いて行った（データ表示なし）。
【００４１】
両融合タンパク質はミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）放出を誘導するが、ＭＡｂ４２５／ＮｃｏＩ／ＩＬ−８融合タンパク質はＭＡｂ４２５／ＢｃｌＩ／ＩＬ−８融合タンパク質よりも活性である（図７）。全データは、トリトン溶解細胞のデータに従って計算し、これを１００％酵素含量とする。全データはシトカラシンＢをエンハンサー物質として用いて得られた。
【００４２】
高度に保存されたＥ−Ｌ−Ｒ部分を有するＩＬ−８分子のＮ末端部分がレセプター結合およびシグナルトランスダクションに要求されることが以前に明らかにされた。ＩＬ−８の立体構造は、両Ｎ末端が露出構造中にあるホモ二量体である。Ｎ末端が追加のアミノ酸によってブロックされる場合に、ＩＬ−８の生物活性が阻害される可能性があった。したがって、制限部位（ＮｃｏＩ／ＢｃｌＩ）を二つのｃＤＮＡ間に導入してリンカーペプチドを導入し、それによってＮ末端のアクセス能を修復した。
【００４３】
両エレメントの化学的カップリングのような融合タンパク質作出のための他のアプローチでは、バッチ間で変動するおそれのある不確かな構築体が得られた。加えて、化学的カップリングではリガンドの二次構造が破壊されるとかアクセス不能のためにレセプター結合に関してほとんどのタンパク質が不活性であるという状態を生じ得る。これに対して、本発明のアプローチでは、ほとんど無制限で再現可能な質で発現され得る確定した構造の融合タンパク質を作出することができる。
【００４４】
要約すると、本発明による融合タンパク質は次のような性質を有する。
【００４５】
ＥＧＦＲ陽性細胞に結合する。
【００４６】
走化能を誘起する。
【００４７】
ＭＰＯおよびスーパーオキシド放出を誘導する。
【００４８】
その場での腫瘍溶解を誘導する。
【００４９】
したがって、本発明の免疫抱合体は、腫瘍の治療に適している。
【００５０】
【発明の実施の形態】
一般的注記
本出願に記述の全ての微生物、細胞系、プラスミド、プロモーター、耐性マーカー、複製開始点、制限部位またはベクターの他のフラグメントは、市販されているかあるいは一般に入手可能である。とくに記載がない限り、これらは例として使用されるのみであって、本発明に必須ではなく、それぞれ他の適当な手段および生物学的材料によって置き換えることができる。
【００５１】
本発明に必須の方法技術を以下に詳細に記述する。詳記されない他の方法技術は、当業者によく知られた公知の標準法または引用参考文献および特許出願明細書および標準的文献に記載のある方法技術である（例えば、"Antibodies、 A Laboratory Manual"、 Harlow、 Lane、 Cold Spring Harbor、 1988）。
モノクローナル抗体
ＭＡｂ４２５は、ヒトＡ４３１癌腫細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５５５）に対 するＩｇＧ１ネズミモノクローナル抗体である。ＭＡｂ４２５は、ヒトＥＧＦレセプターの外側ドメインのポリペプチドエピトープと結合し、ＥＧＦの結合と競合する。ＭＡｂ４２５は、インビトロで腫瘍細胞毒性を媒介することおよびインビトロで類表皮腫および結腸直腸癌腫由来細胞系の腫瘍細胞増殖を抑制することが見出だされた（Rodeck et al.、 Cancer Res、 47、 3692、1987）。ヒト化およびキメラ型ＭＡｂ４２５はＷＯ９２／１５６８３に開示されている。
ケモカイン
ケモカインをコードするｃＤＮＡは、British Biotechnology Limited (ヒト ＩＬ−８ ＢＢＧ４４、Herrmann Biermann GmbH、 Bad Nauheim、独国）から購入するか、またはサイトカイン産生ヒト細胞系Ｕ９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）から分離されるｍＲＮＡから作出する。ケモカイン産生細胞からの全ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌ（WAK-Chemie、独国）を製造者の指示にしたがって用いて分離した。次いでＲＮＡをｃＤＮＡに転写して、公表されたＤＮＡ配列から推定した適当なプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
ベクター
ｐＵＣ１９は一連の多重コピー数大腸菌プラスミドクローニングベクターのひとつであって、ｐＢＲ３２２およびＭ１３ｍｐ１９の部分を含む。ｐＵＣ１９は、誘導性細菌性ｌａｃプロモーター−オペレーターおよびそれに続く多クローニング部位を含む（Yanisch-Perron et al.、 Gene、 33、 103-109、 1985）。ｐＵＣベクターは、市販されている（例えばNew England Biolabsなど）。
【００５２】
ｐBluescriptＫＳ／ＳＫ＋およびＫＳ／ＳＫ−ファージミドベクターはｐＵＣ１９に由来する。ベクターは市販されている（Stratagene、ハイデルベルグ）。
原核細胞発現ベクターはｐＳＷ１ベクター（Ward et al.、 Nature、 341、544-546、 1989）に基づき、これはｐＵＣ１９ベクターに由来する。ｐＳＷ１は、Erwinia carotovoraからの細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチドをコードする配列を含む（Lei et al.、 J.Bact.、 169、 4379-4383、 1987）。外来性ＤＮＡをｐｅｌＢリーダー配列の後に枠内に導入して、ペリプラズム中へのタンパク質発現を指示することができる。
【００５３】
真核細胞発現ベクターｐＨＣＭＶ（Gillies et al., Cell、 33、 717、 1983） は、シミアン（アカゲザル）ウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始点およびヒトサイトメガウイルスのプロモーターおよびエンハンサー領域を含む。プロモーター／エンハンサー領域の後には、発現されるべき遺伝子導入のための多クローニング部位が続く。このベクターにおいて、ＭＡｂ４２５重鎖可変部のキメラ型およびＣＨ２ドメインの末端でケモカインと融合したｃγ１ＣＨ２領域とを組合わせてＭＡｂ４２５重鎖融合タンパク質がつくり出された。この融合Ｉｇ鎖を適当な軽鎖と組み合わせることによって一価の抗原結合領域を形成してこれを免疫抱合体に組み立てることができ、これを会合させて標的抗原に特異的な二価の免疫抱合体を産生するができる。重鎖および軽鎖構築体は、ひとつのまたは別々のベクターに導入することができる。
【００５４】
【実施例】
融合タンパク質の真核細胞における発現
Ｆａｂ４２５−ケモカイン融合タンパク質発現のための真核細胞発現ベクターの構築
ＭＡｂ４２５およびケモカインのＰＣＲ手法による融合：
ヒトｃγ１定常部を、ｐＵＣ１９にＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして挿入した。ｃγ１定常部は二つのＳａｃＩＩ部位を含む。一つは５´ＢａｍＨＩ部位の４０ｂｐ下流の５´イントロンに位置し、もう一つは５´ＢａｍＨＩ部位の５８０ｂｐ下流でＣＨ３ドメイン開始部の１４０ｂｐ上流に位置している。二番目のＳａｃＩＩ部位は、さらなるサブクローニングに適しており、したがって最初のＳａｃＩＩ部位をアダプターを用いてＳｎａＢＩ部位を導入することによって破壊した。この構築物（ΔＳａｃＩＩｃγ１）において、ＳａｃＩＩ部位の下流のフラグメントは容易に交換され得る。
【００５５】
ヒトＩＬ−８をｐＵＣ１８ベクター（ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ）から切り出して、ｐBluescriptＳＫ＋（Stratagene GmbH、ハイデルベルグ）（ＳｍａＩ／Ｅ ｃｏＲＩ）にＢｇｌＩＩおよびＳｍａＩ部位が除去されるように挿入した。ΔＳａｃＩＩｃγ１クローンのＳａｃＩＩ／ＸｂａＩフラグメントをｐBluescriptＳＫ＋に挿入した。両遺伝子を適当なプライマーを用いてＰＣＲ手法で増幅した。
ΔＳａｃＩＩｃγ１用
３´プライマー：ＣＨ２ドメインの末端配列およびＮｃｏＩ部位
５´プライマー：逆配列決定プライマー
ＩＬ−８用
３´プライマー：汎用配列決定プライマー
５´プライマー：Ｎｃｏｌ部位およびＩＬ−８の開始配列
生成物を切断して、ＳＫ＋ＳａｃＩＩ／ＥｃｏＲＩと結合させる。得られたペプチド配列において、ＣＨ２ドメインのＣ末端リジンをメチオニンに変え、ＩＬ−８部分のＮ末端セリンをグリシンに変える。
【００５６】
二つのポリペプチド間の接合部に新たにつくられる配列は以下の通りである。
５’ＡＡＡ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＣＴ３’
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ
ｃγ１ＣＨ２ ＜＝ ＝＞ＩＬー８（２ー７２）
同様の操作をプライマー（表１）を用いて行い、二つの遺伝子間にＢｃｌＩ部位を導入した。得られる融合遺伝子は、ＢｃｌＩ部位をｃγ１定常部遺伝子とＩＬ−８遺伝子間に有し、ＣＨ２ドメインの全配列、二つの追加のアミノ酸（バリン、イソロイシン）をコードしそして最初の二つのアミノ酸（セリン、アラニン）を含まないＩＬ−８配列をコードする。
【００５７】
二つのポリペプチド間の接合部に新たにつくられる配列は以下の通りである。
５’ＧＣＣ ＡＡＡ ＧＴＧ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＡＡ３’
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ
ｃγ１ＣＨ２ ＜＝ ＝＞ＩＬー８（３ー７２）
ＰＣＲによる生成物を、ＳａｃＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いてＳＫ＋にサブクローニングした。真核細胞発現のために、これら融合遺伝子をｐＨＣＭＶベクターにクローニングした。
【００５８】
【表１】
真核細胞における免疫抱合体の発現には、重鎖および軽鎖を含むベクターＤＮＡの宿主細胞への導入が要求される。種々の異なる方法、例えば電気穿孔法、ＤＥＡＥデキストラン、燐酸カルシウム、リポフェクチンまたはプロトプラスト融合などが記述されている。免疫抱合体をコードする組み換えＤＮＡ配列がその細胞型においてｍＲＮＡに正しく転写される限り、いかなる宿主細胞型を用いてもよい。宿主細胞としては、免疫グロブリンを産生しないマウスミエローマ細胞、例えばＳｐ２／０−ＡＧ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）またはハムスター細胞、例えばＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１）、またはＣＨＯ／ＤＨＦＲ−（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９０９６）、またはＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）が用いられる。過渡的発現には、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）またはＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）を用いてもよい。
免疫抱合体の過渡的発現
発現ベクターｐＨＣＭＶは、アカゲザルウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始点を含む。細胞系ＣＯＳ−７は、開始点欠失ＳＶ４０ウイルスで形質転換されたアカゲザル細胞系ＣＶ−１から誘導されたものである。したがって、ＳＶ４０複製開始点を含むプラスミドは増幅されて、免疫抱合体の産生が向上すると考えられる。上清を７２時間後に集めて、ＥＧＦ−レセプター結合およびケモカイン濃度についてＥＬＩＳＡによって調べた。
免疫抱合体の恒常的発現
免疫抱合体の発現のための組み換え構築体を含むベクターを、適当な宿主細胞に導入する。重鎖および軽鎖構築体を同一または別々のベクターに入れることができる。後者の場合は、両ベクターはネオマイシン耐性またはデヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）などの同一の選択マーカーまたは二つの異なる選択マーカーを両ベクターの選択検出のために含ませればよい。ＤＨＦＲマーカーの選択は、ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−などのＤＨＦＲ陰性細胞系においてのみ可能である。混合細胞集団を、ＥＧＦ−レセプター特異性ＥＬＩＳＡを用いて免疫抱合体の発現について分析する。陽性モノクローナルについてのさらなる選択を限定希釈クローニングによって行う。
ＭＡｂ４２５ケモカイン免疫抱合体の精製
宿主細胞によって産生されたＭＡｂ４２５免疫抱合体を集めて、例えば標的抗原、抗サイトカイン抗体または抗イディオタイプ抗体などを用いるアフィニティークロマトグラフィーなどの適当な方法によって精製することができる（例えばHarlow、 Lane、前出）。
【００５９】
本発明では、精製は、標準法（例えば、Kostelny et al.、 J. Immunol.、 148、 1547、 1992）によってＭＡｂ４２５から生成された抗イディオタイプ抗体によ って達成された。
【００６０】
純正のＦｖ免疫抱合体を得るために、タンパク質発現に適する大腸菌株を発現プラスミドによって形質転換させた（以下を参照されたい）。細胞をＯＤ578＝ ０．５になるまで増殖させて、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）で誘導した。細胞を一晩増殖させて、上清および細胞を回収した。上清を標準法で調製した抗ＭＡｂ４２５抗イディオタイプカラムに供する。カラムを０．５Ｍ ＮａＣｌ−燐酸塩緩衝溶液で洗浄して、結合したタンパク質を１００ｍＭグリシン−０．５Ｍ ＮａＣｌを用いてｐＨ２．５で溶出した。溶出された液を２．５Ｍトリス（ｐＨ８．０）で直ちに中和した。ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８を含むフラクションを集めて、濃縮して、ＰＢＳに対して透析した。
Ｆａｂ４２５−ケモカインおよびＦｖ−ケモカイン融合タンパク質発現のための原核細胞発現ベクターの構築
ＦｖフラグメントをGlockshuberら（Biochemistry 29、 1362-1367、 1990）の 記述にしたがって作出した。軽鎖および重鎖ＦｄフラグメントまたはＦｖフラグメントをコードするＤＮＡ配列物を、ｐＳＷ１ベクターの多クローニング部位に導入した。成熟軽鎖コード配列、および重鎖成熟コード配列およびＦｖコード配列は、細菌性ｐｅｌＢ遺伝子のリーダーペプチドの後に位置する。重鎖コード配列は、ＮｃｏＩ（３´末端）部位を含む。ケモカインをコードするｃＤＮＡをＰＣＲによって修飾して、ＮｃｏＩ（５′末端）およびＮｏｔＩ（３′末端）またはＥｃｏＲＩ（Ｆｖ融合のため）制限部位を導入した。ケモカイン遺伝子を枠内で重鎖のＣＨ１ドメインまたはＦｖフラグメントに直接に融合させた。別法として、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｘ（ｘは１〜４の数値）などのリンカーペプチドをＣＨ１ドメインとケモカイン遺伝子との間に導入することができる。これらのリンカーおよびそれらの調製法については文献で公知である（例えば、Curtis et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、 88、 5809、 1991）。
【００６１】
これらのベクターによって、機能的Ｆ（ａｂ´）（＝ＣＨ１）およびＦｖケモカイン融合タンパク質の大腸菌における効率的な発現が可能になる。軽鎖および重鎖−ケモカイン融合タンパク質は、誘導性ｌａｃプロモーターのコントロール下にある単一のジシストロンメッセンジャーＲＮＡ（Skerra and Plueckthun、 Science、 242、 1038-1040、 1988）上に位置する。したがって、Ｆａｂ／Ｆｖ−融合タンパク質の発現は、培養条件の要求に従って誘導することができる。両タンパク質のジシストロンメッセンジャーＲＮＡからの翻訳は等量のＦｄ−ケモカイン融合タンパク質および軽鎖の合成にくみするので、その結果、機能性Ｆａｂ／Ｆｖ−融合タンパク質への正しい組立の確率が大きくなる。二つのポリペプチドは大腸菌のペリプラズム中に分泌され、ここで折り畳み、ジスルフィド結合の形成および機能性Ｆａｂ４２５−ＣＨ１／Ｆｖ融合タンパク質への組立がなされる。細菌培養の延長によって、大腸菌の外膜が部分的に透過性となり、タンパク質は培養培地中に分泌される。
ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性
ＭＡｂ４２５免疫抱合体の結合特性を、ＥＧＦレセプター特異性ＥＬＩＳＡによって決定した。すなわち、マイクロタイタープレートを精製ＥＧＦレセプターを用いて４℃で一晩被覆した。プレートを、融合タンパク質を含む上清または非抱合ＭＡｂフラグメントを含む上清ともにインキュベートした。プレートを洗浄して非結合物質を除去してから、ペルオキシダーゼと抱合させたヤギ抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（重鎖および軽鎖）、次いで基質とともにインキュベートすることによって、ＥＧＦレセプターに結合した抗体を検出した。結合したＥＧＦレセプター特異性タンパク質の量を４９０ｎｍで測定して決定した。
ＭＡｂ４２５−ＩＬ−８免疫抱合体の生物学的活性
エフェクター細胞の分離
生物学的活性を決定するために、新鮮ヒト末梢血好中顆粒球を健康な供血者からの全血からHaslettら（Am. J. Pathol.、 119、 101-110、 1985）が既述した方 法で分離した。血漿を遠心分離して、赤血球をデキストラン沈殿によって分離して、最後にリンパ球および白血球をパーコール勾配遠心分離によって分離した。
分離した好中球を直ちに使用した。
走化能の決定
走化性の決定はFalkら（J. Immunol. Methods、 33、 239-247、 1980）の記述に従って行った。すなわち、４８ウェルボイデンチャンバーおよび５μｍ膜を用いた。精製した好中球を、ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリ ウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に１×１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。下方のウェルに上清または対照上清を含む融合タンパク質を入れて、膜で被覆して、最後に上方のウェルに細胞懸濁液を加える。３７℃で３０分間インキュベーションした後、膜を除去して、２％グルタルジアルデヒド中で１０分間固定した。次いで、膜に付着した細胞をウェイゲルトの鉄ヘマトキシリン（シグマ診断薬）中で３分間染色した。膜に結合した細胞数を顕微鏡下で決定した。
好中球における酵素放出誘導能の決定
免疫抱合体の好中球での顆粒放出誘導能を評価するために、上清中のミエロペルオキシダーゼ活性をモニターした（Henson et al.、 J. Immunol.、 121、 851、 1978）。アッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレート中で５×１０5細胞 ／ウェルを用いて行った。刺激剤とともにインキュベート（３７℃）した後、プレートを遠心分離して、無細胞上清を別の９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。無細胞上清をジアニシジン（基質として）とともにインキュベートして、吸光度を４９２ｎｍで測定した。陽性の対照として、ＦＭＬＰを１０ー7Ｍ濃度で用いた。全酵素含量を決定するために、刺激剤なしの細胞をトリトンを用いて溶解した。活性を全酵素含量に対するパーセントとして算出した（溶解）。
スーパーオキシド放出能の決定
チトクロムＣをＯ2ーで還元して、その吸光度を変化させる。吸光度の変化は、スパーオキシド活性の推定のための有用なマーカーとなる。アッセイはGuthrie ら（J. Exp. Med.、 160、 1656-1671、 1984）の記述に従って５×１０5細胞／ウ ェルを用いて９６ウェルマイクロタイタープレート中で行った。刺激剤およびチトクロームＣとともにインキュベートした後、プレートを遠心分離して、上清の吸光度を５５０ｎｍで決定した。
さらなる免疫抱合体
上記のようにして、ケモカイン成分としてＭＩＰ−２αおよびＭＩＰ−２βを含んでなる抗ＥＧＦＲ−ＣＨ１、−ＣＨ２、−ＣＨ３および−Ｆｖ免疫抱合体（制限部位およびリンカーを有するもの／有しないもの）を調製して試験した。これらの構築体は、ＩＬ−８誘導体と同様の性質を示す。
免疫抱合体の治療的使用
本発明の免疫抱合体は、治療のためにヒト患者に投与することができる。したがって、本発明の目的は、上記および請求項に記載の少なくとも一つの融合タンパク質を活性組成分として、一つまたはそれ以上の薬剤学的に容認し得る担体、賦形剤または希釈剤とともに含んでなる薬剤調製物を提供することにある。
【００６２】
通常、本発明の免疫抱合体は静脈注射によってまたは非経口的に投与される。一般に、免疫抱合体の投与量範囲は、所望の腫瘍抑制および腫瘍溶解効果が得られるに十分の量である。投与量は、患者の年齢、状態、性別、病気の程度によって異なり、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／用量の範囲で１日１回またはそれ以上を１日または数日間投与することができる。
【００６３】
非経口的投与のための調製物には、滅菌水性溶液または非水性溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルおよび当業者に公知のこれらの目的に適した他の溶媒があげられる。本発明の免疫抱合体は、生理学的に容認し得る担体からなる組成物において使用することができる。それら適当な担体の例としては、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液または乳酸リンゲル溶液があげられる。保存剤および他の添加剤、例えば抗生物質、抗酸化剤およびキレート剤などを薬剤調製物に加えることも可能である。
【００６４】
本発明の薬剤調製物は、メラノーマ、神経膠腫および癌腫、さらに血液腫瘍および固形腫瘍を含むあらゆる種類の腫瘍の治療に適している。
（図面および表についての説明）
表１ 真核細胞発現のための融合タンパク質を作出するための、ＮｃｏＩまたはＢｃｌＩ部位をつくるためのＰＣＲに使用するプライマーの配列を示す。
【００６５】
図１ 抗体−サイトカイン免疫抱合体のモデルを示す説明図である。
【００６６】
Ｃ＝サイトカイン、ＶＨ＝重鎖可変部、ＶＬ＝軽鎖可変部、ＣＨ＝重鎖定常部、ＣＬ＝軽鎖定常部
図２ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清におけるＭＡｂ４２５を抗ＥＧＦ−Ｒ ＥＬＩＳＡによって示した説明図である。
【００６７】
四角：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清
三角：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清
逆三角：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清
丸：ｐＨＣＭＶ上清
横軸：希釈は上清
縦軸：４９０ｎｍにおける吸光度
図３ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清による走化性の誘導を示す説明図である。
【００６８】
カラム１：対照ＤＭＥＭ／ＰＳ
カラム２：非希釈ｐＨＣＭＶ上清
カラム３：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清１：１４希釈（ＥＧＦ−ｒ−ＥＬＩＳＡの結果による）
カラム４：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清１：２８希釈（ＥＧＦ−ｒ−ＥＬＩＳＡの結果による）
カラム５：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清（１．７６×１０ー10モル／Ｌ*）
カラム６：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清１：２希釈
カラム７：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清（２．０×１０ー10モル／Ｌ*）
カラム８：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清１：２希釈*
ＩＬ−８濃度をＥＬＩＳＡ（アメルシャム）によって決定
縦軸：計数フィールド当たりの細胞数
図４ 精製ＩＬ−８による走化性の誘導を示す説明図である。
【００６９】
縦軸：計数フィールド当たりの細胞数
横軸：ＩＬ−８濃度（モル／Ｌ）
図５ ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８（大腸菌）による走化性の誘導を示す説明図である。
【００７０】
丸：大腸菌中で発現されたＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８
四角：大腸菌中で発現されたＭＡｂ４２５−Ｆ（ａｂ´）
三角：対照デュルベッコ培地／ＢＳＡ
縦軸：計数フィールド当たりの細胞数
横軸：濃度（モル／Ｌ）
図６ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるスーパーオキシド放出の誘導を示す説明図である。
【００７１】
カラム１：非刺激細胞
カラム２：ＩＬ−８ １０ー7Ｍ
カラム３：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清（２．０×１０ー10モル／Ｌ*）
カラム４：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清（１．７６×１０ー10モル／Ｌ*）
カラム５：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清（０モル／Ｌ*）
* ＩＬ−８濃度はＥＬＩＳＡ（アメルシャム）によって決定した。
【００７２】
縦軸：５５０ｎｍにおける吸光度
図７ ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるＭＰＯ放出の誘導を示す説明図である。
【００７３】
カラム１：非刺激細胞
カラム２：シトカラシンＢ刺激細胞
カラム３：ＩＬ−８ １０ー7Ｍ
カラム４：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清
カラム５：ＭＡｂ４２５−ＣＨ３上清１：２希釈
カラム６：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清
カラム７：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８上清１：２希釈
カラム８：非希釈ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清
カラム９：ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８上清１：２希釈
縦軸：全ＭＰＯ量（１００％）と比較した％ＭＰＯ活性
【図面の簡単な説明】
【図１】抗体−サイトカイン免疫抱合体のモデルを示す説明図である。
【図２】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清におけるＭＡｂ４２５を抗ＥＧＦ−Ｒ ＥＬＩＳＡによって示した説明図である。
【図３】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清による走化性の誘導を示す説明図である。
【図４】精製ＩＬ−８による走化性の誘導を示す説明図である。
【図５】ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８（大腸菌）による走化性の誘導を示す説明図である。
【図６】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるスーパーオキシド放出の誘導を示す説明図である。
【図７】ＣＯＳ−７トランスフェクション上清によるＭＰＯ放出の誘導を示す説明図である。
Claims (10)
- 上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の抗原エピトープを有する腫瘍細胞に対するモノクローナル抗体のフラグメントと、ケモカインタンパク質とからなる免疫抱合体であり、該免疫抱合体においては、該ケモカインタンパク質に対するＮ末融合パートナーとして使用される前記抗体フラグメントのＣ末に、該ケモカインタンパク質が融合されており、
該免疫抱合体内に含まれる該ケモカインは、天然のＩＬ−８と同じ生物学的な活性の発現に適する三次元的な構造を保持するＩＬ−８であり、
前記抗体フラグメントは、
・該抗体フラグメントは、それに対応する全抗体分子に由来する、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメインから本質的になる抗体重鎖のフラグメント、ならびに抗体軽鎖からなるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’） 2 フラグメントである；
・該抗体フラグメントは、それに対応する全抗体分子に由来する、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１およびＣＨ２ドメインから本質的になる抗体重鎖のフラグメント、ならびに抗体軽鎖からなる抗体フラグメントであり、かかる抗体フラグメントは、二価の形状に組み立てられている；
のいずれかである
ことを特徴とする免疫抱合体。 - 該抗体フラグメントは、それに対応する全抗体分子に由来する、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１ドメインから本質的になる抗体重鎖のフラグメント、ならびに抗体軽鎖からなるＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）2フラグメントである
ことを特徴とする請求項１に記載の免疫抱合体（抗体−ＣＨ１抱合体）。 - 該抗体フラグメントは、それに対応する全抗体分子に由来する、抗体重鎖の可変部、定常部のＣＨ１およびＣＨ２ドメインから本質的になる抗体重鎖のフラグメント、ならびに抗体軽鎖からなる抗体フラグメントであり、かかる抗体フラグメントは、二価の形状に組み立てられている
ことを特徴とする請求項１に記載の免疫抱合体（抗体−ＣＨ２抱合体）。 - 抗体フラグメントとケモカインタンパク質との間に、ＤＮＡ制限部位を推定できるアミノ酸（配列）を含んでなり、
該制限部位は、完全な融合構築体中で唯一特異である
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫抱合体。 - 抗体フラグメントとケモカインタンパク質との間に、リンカーペプチドを含んでなる
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫抱合体。 - 該抗体フラグメントは、ネズミ、ヒト化またはキメラ化のＭＡｂ４２５に由来する
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫抱合体。 - ＭＡｂ４２５−ＣＨ１−ＩＬ−８、ＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＮｃｏＩ）−ＩＬ−８、およびＭＡｂ４２５−ＣＨ２−（ＢｃｌＩ）−ＩＬ−８からなる群から選択される免疫抱合体。
- 請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫抱合体の調製法であって、
該抗体フラグメント、およびＩＬ−８をそれぞれコードするＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを用いて、所望の融合ＤＮＡ配列と相補的な一本鎖ＤＮＡ上に融合させ、
得られる構築体を発現ベクター中に導入して、それで宿主細胞を形質転換し、
その宿主細胞を栄養溶液中で培養して、該融合タンパク質を発現させる、工程を含んでなり、
前記所望の融合ＤＮＡ配列は、ＩＬ−８に対するＮ末融合パートナーとして使用する、前記抗体フラグメントのＣ末に、ＩＬ−８が融合されている、融合タンパク質のアミノ酸配列をコードしている
ことを特徴とする調製法。 - 請求項１〜７のいずれか一項に記載の少なくとも一つの免疫抱合体、および生物学的に容認し得る担体を含んでなる、腫瘍療法において使用可能な薬剤組成物。
- 腫瘍を標的とした薬物の調製のために、その活性成分として、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫抱合体を使用する方法。
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