JP2019535315A - Ｉｌ２及びｔｎｆ突然変異体のイムノコンジュゲート - Google Patents

Abstract

本出願は、インターロイキン２（ＩＬ２）と、腫瘍壊死因子、例えば腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の突然変異体と、抗体分子とを含むコンジュゲートに関する。抗体分子は、腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原、例えばフィブロネクチンのエキストラドメインＡ（ＥＤＡ）又はエキストラドメインＢ（ＥＤＢ）と結合することが好ましい。このコンジュゲートは、癌の治療に使用することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、インターロイキン２（ＩＬ２）と、腫瘍壊死因子、例えば腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）の突然変異体と、抗体分子とを含むコンジュゲートに関する。抗体分子は、腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原、例えばフィブロネクチンのエキストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエキストラドメインＢ（ＥＤＢ）と結合することが好ましい。このコンジュゲートは、例えば癌の治療に使用することができる。

サイトカインの多くは、前臨床実験にて強力な抗腫瘍活性を示しており、癌療法に有望な作用物質である。しかしながら、動物モデルにおける有望な結果にも関わらず、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ １（ＩＬ２）、Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ１（インターフェロンアルファ−２ａ（ＩＦＮα ２ａ））、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ１（ＩＦＮα ２ｂ）、Ｂｅｒｏｍｕｎ １（組換えＴＮＦα）等の幾つかのサイトカインしか抗癌薬として承認されていない。現時点でのサイトカインの適応症としては、転移腎細胞癌、悪性黒色腫、有毛細胞白血病、慢性骨髄性リンパ腫、肉腫、及び多発性骨髄腫が挙げられる。サイトカインは、単独でも又は化学療法と組み合わせても投与することができる。

特に、炎症誘発性サイトカインには、低用量であってもかなりの毒性があることから、治療効果のある用量へと用量を増加することができず、このことが治療法への使用の妨げとなることが多いという更なる難題がある（非特許文献１）。

或る特定のサイトカインの治療指数を増大させる試みとして、抗体−サイトカイン融合タンパク質（「イムノサイトカイン（immunocytokines）」とも称される）が提案されている。これらのコンジュゲートでは、抗体は、疾患部位への選択的蓄積のための「媒体（vehicle）」として働き、サイトカインペイロードは、治療活性に関与する（非特許文献２）。炎症誘発性サイトカインペイロード（例えば、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ１２、及びＴＮＦα）をベースとする或る特定のイムノサイトカインは、マウスモデルにおいて強力な抗癌活性を呈し（非特許文献３）、固形腫瘍を患う患者及び血液悪性腫瘍を患う患者の両方で有望な結果をもたらしている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。Ｆ８抗体（腫瘍血管新生のマーカーであるフィブロネクチンの選択的スプライシングＥＤＡドメインに特異的；非特許文献９）は、単独、及びＴＮＦ又はＩＬ２のいずれかと融合した形の両方で腫瘍標的化に使用されている（非特許文献１０、非特許文献１、非特許文献１１）。

受容体との活性が低減したＴＮＦスーパーファミリーの単修飾サイトカインの３つのコピーを含む構築物が報告されている（特許文献１）。この構築物は、標的化部分により標的細胞へと特異的に送達される。これらの構築物に使用される修飾サイトカインとしては、野生型ＴＮＦの０．０２％〜５％の範囲の活性を有する突然変異型ＴＮＦが挙げられ、これにはＹ８７Ｑ、Ｉ９７Ｓ、Ｙ１１５Α、Ｙ８７Ｆ、Ｙ１１５Ｇ、又はＩ９７Ａの置換を有する突然変異型ＴＮＦが含まれる。Ｒ３２Ｇの効果も報告されている。

イムノサイトカインは、単剤として使用される場合に、癌のマウスモデルにおいて腫瘍根絶を媒介することができることもあるが（非特許文献６）、殆どの場合、単一のイムノサイトカイン製品では、完全な癌の根絶を誘導することはできない。一方で、イムノサイトカインと、細胞毒性薬（非特許文献１２）、インタクト抗体（非特許文献１３）、及び体外ビーム照射（非特許文献１４）との組合せについて、癌の治癒が報告されている。

加えて、イムノサイトカインの幾つかの組合せが治療法に使用されている。例えば、コンジュゲートＬ１９−ＩＬ２及びＬ１９−ＴＮＦαは、神経芽細胞腫を、該疾患の完全に同系のマウスモデルにて治癒することができたが、個々のイムノサイトカインを単剤として使用しても、疾患の根絶には至らなかった（非特許文献１５）。ＩＬ２とＴＮＦαペイロードとの組合せも、臨床試験にて有望な結果を示している。融合タンパク質Ｌ１９−ＩＬ２及びＬ１９−ＴＮＦは、マウスにおける或る特定の固形腫瘍の病巣内治療に対して強力な相乗作用を示した（非特許文献１６）。これに対応する完全ヒト融合タンパク質をＩＩＩＣ期の黒色腫の患者に病巣内投与したところ（非特許文献８）、インターロイキン−２（非特許文献１７）又はＬ１９−ＩＬ２（非特許文献７）の病巣内投与に比べて良好な結果を示した。しかしながら、サイトカインと抗体との遺伝的融合体が常に効力の増大をもたらすとは限らない。例えば、インターロイキン−１７と標的化抗体との融合体では、腫瘍増殖は低減しなかった（非特許文献１８）。

抗体が２つの異なるサイトカインと遺伝的に融合している「デュアルイムノサイトカイン」を作製することも試みられている。例えば、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）及びＴＮＦαが単分子体に組み込まれた。しかしながら、これらの試みは上手くいかず、臨床開発プログラムには至らなかった。具体的には、（ｉ）ｓｃＦｖ型のＬ１９抗体（腫瘍血管新生のマーカーであるフィブロネクチンの選択的スプライシングＥＤＢドメインに特異的）；（ｉｉ）マウスＴＮＦα；及び（ｉｉｉ）単鎖型のマウスＩＬ１２からなる三元融合体が記載されている（非特許文献１９）。この融合タンパク質は、発現させ、均質に精製することが可能であった。さらに、融合タンパク質は高い親和性及び特異性にて同種抗原と結合したが、腫瘍担持マウスにおける定量的生体内分布研究から明らかなように、（Ｌ１９−ＴＮＦα及びＬ１９−ＩＬ１２とは異なり）ｉｎ ｖｉｖｏでは固形腫瘍に局在化することはなかった。そのため、ｉｎ ｖｉｖｏでのデュアルイムノサイトカインの挙動は極めて予測不能なものである。

サイトカインがインタクトな全抗体（又は抗体のＦｃ部）に連結した二機能性サイトカイン融合タンパク質も記載されている（非特許文献２０）。これらの融合タンパク質は、インターロイキン−２／インターロイキン−１２（ＩＬ２／ＩＬ１２）、又はインターロイキン−４／顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＩＬ４／ＧＭ−ＣＳＦ）を含むものであった。サイトカイン活性は、複数のサイトカインがＦｃ又は抗体重（Ｈ）鎖のカルボキシル末端でタンデムに融合した構築物、及び１つのサイトカインがＨ鎖のカルボキシル末端に融合し、第２のサイトカインがＨ鎖又は軽（Ｌ）鎖の可変領域のいずれかのアミノ末端に融合した構築物において保持されていた。抗体−サイトカイン融合タンパク質の抗原結合は維持されていた。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏでの治療活性は、遺伝子療法用途（すなわち、適切なＩＬ２／ＩＬ１２イムノサイトカインがトランスフェクトされた腫瘍細胞）でのみ報告され、治療タンパク質を用いた場合の報告はなかった。他の種類の標的化部分を含む二機能性サイトカイン融合タンパク質は報告されていない。

上手く発現する、単分子中に２つの異なるサイトカインを含有するイムノコンジュゲート（immunoconjugates：免疫複合体）（「デュアルイムノサイトカイン」とも称される）が本質的に複雑であり、上述のように（例えば非特許文献１９において）このような分子を用いて得られる結果が有望ではないということは、臨床用途にてこれらの分子型が求められていないことを意味している。

国際公開第２０１５／００７９０３号

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本発明者らは、活性が低減した腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）突然変異体を使用することで、効力に影響を及ぼすことなく、ＴＮＦ及びＩＬ２と標的化抗体分子とを含むデュアルイムノサイトカインの忍容性が改善されることを認識している。

本発明の一態様は、インターロイキン−２（ＩＬ２）と、活性が低減したＴＮＦ突然変異体と、腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原に結合する抗体分子とを含むコンジュゲートを提供する。

本発明の別の態様は、かかるコンジュゲートをコードする核酸分子、及びかかる核酸を含む発現ベクターを提供する。かかるベクターを含む宿主細胞も企図される。

本発明の別の態様は、ＩＬ２及びＴＮＦ突然変異体、好ましくはＴＮＦα突然変異体をｉｎ ｖｉｖｏにて新生血管系へと標的化させることにより癌を治療する方法に使用される本明細書に記載のコンジュゲート、並びに患者においてＩＬ２及びＴＮＦ突然変異体、好ましくはＴＮＦα突然変異体を腫瘍の新生血管系に送達する方法に使用される本明細書に記載のコンジュゲートを提供する。

本発明の別の態様は、患者においてＩＬ２及びＴＮＦ突然変異体、好ましくはＴＮＦα突然変異体を新生血管系へと標的化させることにより癌を治療する方法であって、該方法が、治療有効量の本明細書に記載のコンジュゲートを該患者に投与することを含む、方法、並びに患者においてＩＬ２及びＴＮＦ突然変異体、好ましくはＴＮＦα突然変異体を腫瘍の新生血管系に送達する方法であって、本明細書に記載のコンジュゲートを該患者に投与することを含む、方法を提供する。

加えて、本発明の別の態様は、癌を治療する薬剤の作製のための本明細書に記載のコンジュゲートの使用を提供する。ＩＬ２及びＴＮＦ突然変異体、好ましくはＴＮＦα突然変異体を腫瘍の新生血管系に送達する薬剤の作製のための本明細書に記載のコンジュゲートの使用も同様に企図される。

ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦαコンジュゲート及びｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートの細胞致死活性を示す図である。試験したコンジュゲートは、ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα、及び３２位が突然変異しているＴＮＦαとＩＬ２と抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８とを含むｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）であった。この突然変異コンジュゲートの細胞致死活性を、コンジュゲートｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦαの存在下で観察される細胞致死活性と比較した。ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートの細胞致死活性は、ＥＣ５０値から明らかなように、ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦαコンジュゲートに比べて低かった。ＥＣ５０値は最大半量活性に要する薬物濃度を表すものである。 生体内分布分析により評価されるｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ標的化性能を示す図である。Ｆ９奇形癌のマウスモデルにおいて、ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートは腫瘍に選択的に蓄積した。 ＣＴＬＬ−２細胞の増殖に基づく、ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートのＩＬ２生体活性アッセイを示す図である。 ＨＴ１０８０細胞の致死に基づく、ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートのＴＮＦ生体活性アッセイを示す図である。 Ｆ９奇形癌腫瘍を担持する免疫適格（immunocompetent）マウスにおける放射ヨウ素標識したｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートの定量的生体内分布分析を示す図である。

本発明は、（ｉ）インターロイキン−２（ＩＬ２）部分と、（ｉｉ）活性が低減した腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）突然変異体である部分と、（ｉｉｉ）腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原に結合する抗体分子とを含むコンジュゲートに関する。

「抗体分子」という用語は免疫グロブリンを表すものであり、天然であるか、又は部分的に若しくは全体的に合成することで作製されているかは問わない。この用語は、抗体抗原結合部位を含む任意のポリペプチド又はタンパク質にも関する。抗体分子は、天然源からの精製により単離されるか若しくは得られてもよく、又はそうでなければ遺伝子組換え若しくは化学合成により得られてもよく、非天然アミノ酸を含有していてもよい。

抗体は多くの方法で修飾することができることから、「抗体分子」という用語は、必要とされる抗原に対する特異性及び／又は結合性（binding）を持つ抗体抗原結合部位を有する任意の特異的な結合成員又は物質を包含すると解釈するものとする。そのため、この用語は、抗体フラグメント、特に抗原結合フラグメント、及び誘導体を包含するものであり、これには抗体抗原結合部位を含むあらゆるポリペプチドが含まれ、天然であるか、又は全体的に若しくは部分的に合成されているかは問わない。したがって、（例えば、別の抗体クラス又はサブクラスに属する）別のポリペプチドと融合した、抗体抗原結合部位を含むキメラ分子又はその同等物もこの用語に含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許第０１２０６９４号及び欧州特許第０１２５０２３号、並びに続く多くの文献にて記載されている。

上述のように、全抗体のフラグメントが抗原結合機能を示すこともある。結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメイン又はＶＬドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546、McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554、Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490)；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結したＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）ＶＨドメインとＶＬドメインとがペプチドリンカーにより繋がっており、２つのドメインが結び付くことで、抗原結合部位を形成する単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Bird et al. (1988) Science, 242, 423-426、Huston et al. (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号）；（ｉｘ）遺伝子融合体で構築された多価又は多重特異性フラグメントである「ダイアボディ（diabodies）」（国際公開第９４／１３８０４号、Holliger et al. (1993a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448）、並びに（ｘ）セット内のＶＨドメイン及びＶＬドメインがそれぞれ、短ペプチドリンカー又は「非可動性」ペプチドリンカーによって結ばれている単鎖ダイアボディ型である。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、又はダイアボディ分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインとを繋ぐジスルフィド架橋を組み込むことにより安定化することができる（Reiter et al. (1996), Nature Biotech, 14, 1239-1245）。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、例えば、（Li et al., (1997), Protein Engineering, 10: 731-736）に記載されるように、ミニ免疫グロブリン又は小免疫タンパク質（ＳＩＰ）内に含まれていることもある。ＳＩＰは、ホモ二量体ミニ免疫グロブリン抗体分子を形成する、ヒトＩｇＥ分泌アイソフォームＩｇＥ−Ｓ２のＣＨ４ドメイン（ε_Ｓ２−ＣＨ４；Batista et al., (1996), J. Exp. Med., 184: 2197-205）に融合したｓｃＦｖ分子を含み得る。ＣＨ３ドメインに繋がったｓｃＦｖを含むミニボディ（Minibodies）を作製することもできる（Hu et al. (1996), Cancer Res., 56(13):3055-61）。結合フラグメントの他の例は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含み、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が付加されているという点でＦａｂフラグメントと異なるＦａｂ’、及び定常ドメインのシステイン残基（複数の場合もある）が遊離チオール基を担持しているＦａｂ’フラグメントであるＦａｂ’−ＳＨである。

本明細書に記載のコンジュゲートに使用される抗体分子の半減期は、化学修飾、特にペグ化、又はリポソームへの組込みにより増大させることができる。

本明細書に記載のコンジュゲートに使用されるのに適した抗体分子としては、ダイアボディ、又はより好ましくはｓｃＦｖが挙げられる。ダイアボディ及びｓｃＦｖは抗体Ｆｃ領域を含まないことから、抗イディオタイプ反応の影響を低減させる可能性がある。本明細書に記載のコンジュゲートに使用される抗体分子はｓｃＦｖであるのが好ましい。

抗体分子がｓｃＦｖである場合、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとが、１０アミノ酸〜２０アミノ酸のリンカー、１４アミノ酸〜２０アミノ酸のリンカー、好ましくは１０アミノ酸〜１４アミノ酸のリンカーによって繋がっているのが好ましい。好適なリンカーは当該技術分野にて知られており、当業者に利用可能である。例えば、リンカーは、配列番号３、配列番号５０、又は配列番号５１に示されている配列を有し得る。

抗体分子がダイアボディである場合、ＶＨドメインとＶＬドメインとが５アミノ酸〜１２アミノ酸のリンカーによって繋がり得る。ダイアボディは、結び付くことで二量体を形成する２つのＶＨ−ＶＬ分子を含む。それぞれのＶＨ−ＶＬ分子のＶＨドメインとＶＬドメインとが５アミノ酸〜１２アミノ酸のリンカーによって繋がり得る。

本発明者らは、ＩＬ２と、ＴＮＦαの突然変異体と、フィブロネクチンのエキストラドメインＡ（ＥＤ−Ａ）に結合する抗体分子とを含むコンジュゲートが、ＩＬ２と、ＴＮＦαと、フィブロネクチンのエキストラドメインＡ（ＥＤ−Ａ）に結合する抗体分子とを含むコンジュゲートに比べて低減した毒性を呈することを示している。さらに、本発明者らは、ＩＬ２と、ＴＮＦαの突然変異体と、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）アイソフォームに結合する抗体分子とを含むコンジュゲートが、組換えＴＮＦαに比べて低減した毒性を呈することも示している。ＩＬ２と、ＴＮＦ、好ましくはＴＮＦαの突然変異体と、腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原に結合する抗体分子とを含む他のコンジュゲートも同様に低減した毒性を有する。

本明細書に記載のＴＮＦ突然変異体を含むコンジュゲートの毒性は、野生型ＴＮＦを含む対応するコンジュゲートの毒性に比べて低減し得る。毒性の低減には、患者の忍容性の改善、例えばコンジュゲート（複数の場合もある）の患者への投与に関連した１つ以上の有害症状の低減が含まれ得る。毒性の低減により低減される有害症状には、体重減少、吐き気、嘔吐、発熱、寒気、顔面紅潮、掻痒、発疹、肺毒性、呼吸困難、高血圧、アナフィラキシー、血清病、クレアチニンの増加、頭痛が含まれ得る。

さらに、コンジュゲートにおけるＴＮＦ突然変異体の毒性の低減は、ＩＬ２部分の相乗効果を高め、ＴＮＦ突然変異体の活性がより低いことから、より高い用量で投与することができる。したがって、コンジュゲートにおいて効力を適合させたサイトカインは、治療用途に有用であり得る。

本発明者らは、ＩＬ２と、ＴＮＦαの突然変異体と、フィブロネクチンのエキストラドメインＡ（ＥＤ−Ａ）に結合する抗体分子とを含むコンジュゲートが、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍の新生血管系を上手く標的化することができることも示している。さらに、本発明者らは、ＩＬ２と、ＴＮＦαの突然変異体と、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に結合する抗体分子とを含むコンジュゲートが、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍の新生血管系を上手く標的化することができることも示している。ＩＬ２と、ＴＮＦ、好ましくはＴＮＦαの突然変異体と、腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原に結合する抗体分子とを含む他のコンジュゲートも同様に、腫瘍の新生血管系に対してＩＬ２及びＴＮＦの突然変異体を標的化するのに適しており、そのため癌治療に適用されることになる。ＩＬ２と、ＴＮＦαと、フィブロネクチンのエキストラドメインＡ（ＥＤ−Ａ）に結合する抗体分子とを含むコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍の新生血管系を標的化することも示されている（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０６０１２８号）。

腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する多くの抗原が、かかる抗原に結合することが可能な抗体と同様、当該技術分野にて知られている。加えて、所与の抗原に対する抗体を、本出願に記載のもの等の既知の方法を用いて生成することができる。幾つかの実施形態では、抗原は、フィブロネクチンのような腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する細胞外基質の構成要素であり得て、この抗原には、フィブロネクチンのエキストラドメインＡ（ＥＤ−Ａ）アイソフォーム（Ａ−ＦＮ）、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）アイソフォーム（Ｂ−ＦＮ）、テネイシンＣ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインが含まれる。フィブロネクチンのＥＤ−Ａ、ひいてはＡ−ＦＮに結合する抗体が当該技術分野にて知られており、これには抗体Ｆ８が含まれる。フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、又はテネイシンＣのＡ１ドメイン（ひいては、Ｂ−ＦＮ及びテネイシンＣ）に結合する抗体も当該技術分野にて知られており、これにはそれぞれ抗体Ｌ１９及びＦ１６が含まれる。抗体Ｌ１９及びＦ１６を含む、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインに結合する抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍の新生血管系を特異的に標的化することが可能であることが示されている。このため、ＩＬ２と、ＴＮＦ、好ましくはＴＮＦαの突然変異体と、腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原に結合する抗体分子とを含む、本明細書に記載のコンジュゲートは、ＩＬ２とＴＮＦと抗体分子とを含むコンジュゲートの患者への投与に比べて、患者に投与する場合に毒性の低減を呈することが好ましい。

腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する他の抗原としては、炭酸脱水酵素ＩＸ（腎細胞癌のマーカー）、Ａ３３及びＣＥＡ（結腸直腸癌の良好なマーカー）、ＨＥＲ２（乳癌のマーカー）、ＰＳＭＡ（前立腺癌のマーカー）、及び線維芽細胞活性化タンパク質（活性化線維芽細胞及び或る特定の種類の腫瘍細胞に対する膜結合タンパク質及びシェディング（shed）タンパク質の両方として存在するプロテアーゼ）が挙げられる。ＩＬ２と、ＴＮＦ、好ましくはＴＮＦαの突然変異体と、炭酸脱水酵素ＩＸ、Ａ３３、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、又は線維芽細胞活性化タンパク質等の抗原に結合する抗体分子とを含むコンジュゲートも同様に、腫瘍の新生血管系に対してＩＬ２及びＴＮＦを標的化するのに適しているため、癌治療に適用されることになり、毒性の低減を呈することになる。

幾つかの好ましい実施形態では、本明細書に記載の使用のための抗体分子は、本明細書に記載の抗体Ｆ８、Ｌ１９、又はＦ１６のＣＤＲｓ、及び／又はＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを有し得る。本明細書に記載の使用のための抗体分子は、配列番号６〜配列番号１１に示される抗体Ｆ８のＣＤＲｓを有するのが好ましい。より好ましくは、本明細書に記載の使用のための抗体は、配列番号２及び配列番号４に示される抗体Ｆ８のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含み得る。更に好ましくは、本明細書に記載の使用のための抗体は、配列番号２及び配列番号４に示される抗体Ｆ８のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。Ｆ８抗体は、ｓｃＦｖ又はダイアボディ型、最も好ましくはｓｃＦｖ型であるのが好ましい。Ｆ８抗体がｓｃＦｖ型である場合、本明細書に記載の使用のための抗体分子は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するのが好ましい。

本明細書に記載の使用のための他の抗体分子は、配列番号１８〜配列番号２３に示される抗体Ｌ１９のＣＤＲｓを有するのが好ましい。より好ましくは、本明細書に記載の使用のための抗体は、配列番号２４及び配列番号２５に示される抗体Ｌ１９のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含み得る。更に好ましくは、本明細書に記載の使用のための抗体は、配列番号２４及び配列番号２５に示される抗体Ｌ１９のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。Ｌ１９抗体は、ｓｃＦｖ又はダイアボディ型、最も好ましくはｓｃＦｖ型であるのが好ましい。Ｌ１９抗体がｓｃＦｖ型である場合、本明細書に記載の使用のための抗体分子は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するのが好ましい。

本明細書に記載の使用のための抗体分子は、抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８、例えばｓｃＦｖ型の抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８と同じ親和性で、又はより良好な親和性でＡ−ＦＮ及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合することができる。本明細書に記載の使用のための抗体分子は、抗ＥＤ−Ｂ抗体Ｌ１９、例えばｓｃＦｖ型の抗ＥＤ−Ｂ抗体Ｌ１９と同じ親和性で、又はより良好な親和性でＢ−ＦＮ及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂに結合することができる。本明細書に記載の使用のための抗体分子は、抗テネイシンＣ抗体Ｆ１６、例えばｓｃＦｖ型の抗テネイシンＣ抗体Ｆ１６と同じ親和性で、又はより良好な親和性でテネイシンＣ及び／又はテネイシンＣのＡ１ドメインに結合することができる。

本明細書に記載の使用のための抗体分子は、Ａ−ＦＮ及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ａ上にある、抗ＥＤ−Ａ抗体Ｆ８と同じエピトープと結合することができる。本発明の抗体分子は、Ｂ−ＦＮ及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂ上にある、抗ＥＤ−Ｂ抗体Ｌ１９と同じエピトープと結合することができる。本発明の抗体分子は、テネイシンＣ及び／又はテネイシンＣのＡ１ドメイン上にある、抗体Ｆ１６と同じエピトープと結合することができる。

本明細書に開示の抗体分子の変異体を本発明にて作製及び使用することができる。ＣＤＲｓ、抗体のＶＨドメイン又はＶＬドメイン、特にＶＨドメイン及びＶＬドメインのフレームワーク領域、並びに抗体分子のアミノ酸配列内に置換を生じるのに必要とされる技法は概して、当該技術分野にて利用可能である。変異体配列は、活性に対して最小の又は有益な効果を有すると予測され得る、又は予測され得ない置換を含んで作製することができ、Ａ−ＦＮ及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ａ、Ｂ−ＦＮ及び／又はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ及び／又はテネイシンＣのＡ１ドメインに結合する能力、及び／又は任意の他の所望の特性について試験することができる。

１個〜５個、例えば１個〜４個（これには、１個〜３個、又は１個若しくは２個若しくは３個若しくは４個が含まれる）のアミノ酸の改変（アミノ酸残基の付加、欠失、置換、及び／又は挿入）を、本明細書に記載の抗体分子のＣＤＲｓ、及び／又はＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインの１つ以上にて生じさせることができることが企図される。このため、ＦＮ−Ａ、ＦＮ−Ｂ、又はテネイシンＣに結合する抗体分子は、ＣＤＲｓ、及び／又はＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン内に５個以下、例えば５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸の改変を有する本明細書に記載の抗体Ｆ８、Ｌ１９、又はＦ１６のＣＤＲｓ、及び／又はＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含んでいてもよい。例えば、ＦＮ−Ａ、ＦＮ−Ｂ、又はテネイシンＣに結合する抗体分子は、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインのフレームワーク領域内に５個以下、例えば５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸の改変を有する本明細書に記載の抗体Ｆ８、Ｌ１９、又はＦ１６のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含んでいてもよい。そのため、本明細書に言及されるように、ＦＮ−Ａ、又はフィブロネクチンのＥＤ−Ａに結合する抗体分子は、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインのフレームワーク領域内に５個以下、例えば５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸の改変を有する配列番号２に示されるＶＨドメイン及び／又は配列番号４に示されるＶＬドメインを含んでいてもよい。かかる抗体分子は、配列番号２に示されるＶＨドメインと配列番号４に示されるＶＬドメインとを含む抗体分子と同じ若しくは実質的に同じ親和性でフィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム若しくはＥＤ−Ａに結合してもよく、又は配列番号２に示されるＶＨドメインと配列番号４に示されるＶＬドメインとを含む抗体分子よりも高い親和性でフィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム若しくはＥＤ−Ａに結合してもよい。そのため、本明細書に言及されるように、ＦＮ−Ｂ、又はフィブロネクチンのＥＤ−Ｂに結合する抗体分子は、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインのフレームワーク領域内に５個以下、例えば５個、４個、３個、２個、又は１個のアミノ酸の改変を有する配列番号２４に示されるＶＨドメイン及び／又は配列番号２５に示されるＶＬドメインを含んでいてもよい。かかる抗体分子は、配列番号２４に示されるＶＨドメインと配列番号２５に示されるＶＬドメインとを含む抗体分子と同じ若しくは実質的に同じ親和性でフィブロネクチンのＥＤ−Ｂアイソフォーム若しくはＥＤ−Ｂに結合してもよく、又は配列番号２４に示されるＶＨドメインと配列番号２５に示されるＶＬドメインとを含む抗体分子よりも高い親和性でフィブロネクチンのＥＤ−Ｂアイソフォーム若しくはＥＤ−Ｂに結合してもよい。

本明細書に記載の使用のための抗体分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３３、及び配列番号３４に示される抗体Ｆ８、Ｌ１９、又はＦ１６のＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン（適用可能な場合）に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のうちの１つの配列同一性を有するＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含み得る。本明細書に記載の使用のための抗体分子は、配列番号５、配列番号２６、配列番号３５、及び配列番号４６それぞれに示されるＦ８、Ｌ１９、又はＦ１６抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のうちの１つの配列同一性を有し得る。

抗原結合部位は、標的抗原の全体又は一部を認識し、それと結合する分子部分である。抗体分子において、抗原結合部位は、抗体抗原結合部位又はパラトープと称され、標的抗原の全体又は一部を認識し、それと結合する抗体部分を含む。抗原が大型である場合、抗体は、エピトープと呼ばれる、抗原の特定部分にのみ結合し得る。抗体抗原結合部位は、１つ以上の抗体可変ドメインにより提示され得る。抗体抗原結合部位は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含むのが好ましい。

抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の編成を用いて提示され得る。ＣＤＲ又はＣＤＲｓ組を有するための構造は概して、再編成免疫グロブリン遺伝子によりコードされる自然発生的なＶＨ及びＶＬの抗体可変ドメインのＣＤＲ又はＣＤＲｓ組に対応する位置にＣＤＲ又はＣＤＲｓ組が位置している抗体重鎖若しくは軽鎖の配列、又はその相当部分であると考えられる。免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、現在インターネット上で（immuno.bme.nwu.eduにて、又は任意の検索エンジンを用いて「Kabat」を探すことで）利用可能なKabat et al. (1987)（Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4^th Edition. US Department of Health and Human Services.）及びその改訂版を参照することにより決定することができる。

ＣＤＲ領域又はＣＤＲは、Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4^th Edition, US Department of Health and Human Services （Kabat et al., (1991a), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Edition, US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington、及び新版）により規定されるように、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超可変領域を示すことが意図される。抗体は通例、３つの重鎖ＣＤＲｓと３つの軽鎖ＣＤＲｓとを含有する。「ＣＤＲ（"CDR" or "CDRs"）」という用語は、場合によって、認識される抗原又はエピトープに対する抗体の親和性による結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含有するこれらの領域の１つ、又はこれらの領域の幾つか若しくは更には全体を示すことがある。

６つの短いＣＤＲ配列の中でも、重鎖の第３のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、サイズ変動がより大きい（ＨＣＤＲ３を生じる遺伝子の編成機構に本質的に起因して多様性が大きくなる）。ＨＣＤＲ３は、２アミノ酸と短いこともあるが、知られている最長サイズは２６アミノ酸である。機能的には、ＨＣＤＲ３は抗体の特異性の決定の役割に一部関わっている（Segal et al., (1974), PNAS, 71:4298-4302、Amit et al., (1986), Science, 233:747-753、Chothia et al., (1987), J. Mol. Biol., 196:901-917、Chothia et al., (1989), Nature, 342:877-883、Caton et al., (1990), J. Immunol., 144:1965-1968、Sharon et al., (1990a), PNAS, 87:4814-4817、Sharon et al., (1990b), J. Immunol., 144:4863-4869、Kabat et al., (1991b), J. Immunol., 147:1709-1719）。

本明細書に記載の使用のための抗体分子の抗原結合部位は、配列番号６〜配列番号１１に示される抗体Ｆ８のＣＤＲ、配列番号１８〜配列番号２３に示される抗体Ｌ１９のＣＤＲ、又は配列番号２７〜配列番号３２に示される抗体Ｆ１６のＣＤＲを有するのが好ましい。本明細書に記載の使用のための抗体分子の抗原結合部位は、配列番号６〜配列番号１１に示される抗体Ｆ８のＣＤＲ又は配列番号１８〜配列番号２３に示される抗体Ｌ１９のＣＤＲを有するのが最も好ましい。

標的抗原に対する抗体分子を得るのに、当該技術分野では様々な方法が利用可能である。本明細書に記載のコンジュゲートに使用される抗体分子は、モノクローナル抗体、特にヒト、マウス、キメラ又はヒト化起源のモノクローナル抗体であるのが好ましく、この抗体分子は、当業者に既知の標準方法に従って得ることができる。本明細書に記載のコンジュゲートに使用される抗体分子は、ヒト抗体分子であるのが最も好ましい。

モノクローナル抗体及び他の抗体を得てから、組換えＤＮＡ技術の技法を用いることで、標的抗原に結合する他の抗体又はキメラ分子を作製することが可能である。このような技法は、抗体分子の免疫グロブリン可変領域、又はＣＤＲをコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、又は定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含み得る（例えば、欧州特許第１８４１８７号、英国特許第２１８８６３８号、又は欧州特許第２３９４００号、及び続く多くの文献を参照されたい）。抗体を産生するハイブリドーマ又は他の細胞に遺伝子突然変異又は他の変更を行ってもよく、これにより産生される抗体の結合特異性が変わっても又は変わらなくてもよい。

抗体工学分野で利用可能な技法により、ヒト抗体及びヒト化抗体を単離することが可能となっている。例えば、ヒトハイブリドーマを、Kontermann & Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545に記載のように作製することができる。特異的な結合成員を生成するための別の確立された技法であるファージディスプレイは、多くの公報、例えば国際公開第９２／０１０４７号（下記で更に論考される）、及び米国特許第５９６９１０８号、米国特許第５５６５３３２号、米国特許第５７３３７４３号、米国特許第５８５８６５７号、米国特許第５８７１９０７号、米国特許第５８７２２１５号、米国特許第５８８５７９３号、米国特許第５９６２２５５号、米国特許第６１４０４７１号、米国特許第６１７２１９７号、米国特許第６２２５４４７号、米国特許第６２９１６５０号、米国特許第６４９２１６０号、米国特許第６５２１４０４号、及びKontermann & Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545にて詳細に記載されている。マウス抗体遺伝子を不活性化し、マウス免疫系の他の構成要素を損なわずにヒト抗体遺伝子へと機能的に置き換えたトランスジェニックマウスをヒト抗体の単離に使用することができる（Mendez et al., (1997), Nature Genet, 15(2): 146-156）。

概して、モノクローナル抗体又はその機能的フラグメント、特にマウス起源のものの作製について、特にマニュアル「抗体（Antibodies）」（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988）に記載されている技法、又はKohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497に記載されているハイブリドーマからの作製法を参照することが可能である。

モノクローナル抗体は、例えば腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原、例えばＡ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、テネイシンＣ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインに対して免疫化した動物細胞から、通常の作業方法に従って、Ａ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ若しくはテネイシンＣ、若しくはそのフラグメントをコードするｃＤＮＡ配列に含有される核酸配列から始める遺伝子組換え、又はＡ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ若しくはテネイシンＣ、及び／又はそのフラグメントのペプチド配列に含まれるアミノ酸の配列から始めるペプチド合成により得ることができる。

合成抗体分子は、例えば、Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296, 57-86、又はKrebs et al. (2001) Journal of Immunological Methods, 254 67-84に記載されるように、合成され、好適な発現ベクター内にアセンブリングされたオリゴヌクレオチドを用いて生成された遺伝子からの発現により作製することができる。

代替的には、腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原、例えばＡ−ＦＮ、ＥＤ−Ａ、Ｂ−ＦＮ、ＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインに対する１つ以上の抗体分子は、抗体分子のライブラリと、抗原、又はそのフラグメント、例えばＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ若しくはテネイシンＣのＡ１ドメインを含むか、若しくはそれらからなるフラグメント、若しくはそれらのペプチドフラグメントとを接触させること、及び抗原に結合することが可能なライブラリの１つ以上の抗体分子を選択することにより得ることができる。

抗体ライブラリは、反復コロニーフィルタースクリーニング（Iterative Colony Filter Screening）（ＩＣＦＳ）を用いてスクリーニングすることができる。ＩＣＦＳでは、幾つかの結合特異性をコードするＤＮＡを含有する細菌を液体培地中で増殖させ、対数増殖期に達したら、数十億の細菌を好適に前処理した膜フィルターからなる増殖支持体上に分配させ、この支持体を完全にコンフルエントな細菌コロニーが現れるまでインキュベートする。第２の捕捉基体は、予め湿らせ、所望の抗原で被覆させた別の膜フィルターからなるものである。

次いで、捕捉膜フィルターを好適な培養培地を含有するプレート上に置き、細菌コロニーで被覆された面を上向きにして増殖フィルターで被覆する。このようにして得られたサンドイッチを室温で約１６時間インキュベートする。このように、拡散作用を有する抗体フラグメント、例えばｓｃＦｖをコードする遺伝子の発現を得ることで、捕捉膜上に存在する抗原と特異的に結合するフラグメントを捕捉することが可能である。それから、捕捉膜を、例えばこの目的に一般的に用いられる比色法を用いて処理することで、ｓｃＦｖ等の結合した抗体フラグメントを同定することができる。

捕捉フィルター上に、例えば色の付いたスポットとして同定されるフラグメントの位置は、増殖膜上に存在し、捕捉された抗体フラグメントを産生する対応する細菌コロニーへと遡ることが可能である。コロニーを集め、増殖させ、細菌を新たな培養膜上に分配させ、上記の手順を繰り返す。次いで、捕捉膜上の正のシグナルが、選択に使用される抗原に対するモノクローナル抗体フラグメントの潜在的供給源をそれぞれが表す単一の正のコロニーに対応するようになるまで、同様のサイクルが行われる。ＩＣＦＳは、例えば国際公開第０２／４６４５５号に記載されている。

ライブラリは、粒子又は分子複合体、例えばバクテリオファージ（例えばＴ７）粒子等の複製可能な遺伝子パッケージ又は他のｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイシステム上に提示することもでき、粒子又は分子複合体はそれぞれ、その上に提示される抗体ＶＨ可変ドメイン、また任意に存在する場合には提示されたＶＬドメインをコードする核酸を含有する。ファージディスプレイは、国際公開第９２／０１０４７号、並びに例えば米国特許第５９６９１０８号、米国特許５５６５３３２号、米国特許５７３３７４３号、米国特許５８５８６５７号、米国特許５８７１９０７号、米国特許５８７２２１５号、米国特許５８８５７９３号、米国特許５９６２２５５号、米国特許６１４０４７１号、米国特許６１７２１９７号、米国特許６２２５４４７号、米国特許６２９１６５０号、米国特許６４９２１６０、及び米国特許第６５２１４０４号に記載されている。

抗原に結合することが可能であり、バクテリオファージ、又は他のライブラリ粒子若しくは分子複合体上に提示される抗体分子を選択した後に、上記の選択された抗体分子を提示するバクテリオファージ、又は他の粒子若しくは分子複合体から核酸を得ることができる。かかる核酸は、上記の選択された抗体分子を提示するバクテリオファージ、又は他の粒子若しくは分子複合体から得られた核酸の配列を有する核酸からの発現により、続く抗体分子、又は抗体ＶＨ若しくはＶＬ可変ドメインの生成に使用することができる。

腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原、例えばＡ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ若しくはＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、若しくはテネイシンＣのＡ１ドメイン、又は他の標的抗原若しくはアイソフォームに結合する能力、例えばＡ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ若しくはＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインに特異的な抗体、例えば抗体Ｆ８、Ｌ１９、又はＦ１６に競合する能力を更に試験することができる。

本明細書に記載の使用のためのＣＤＲ由来配列を持つ新規のＶＨ又はＶＬ領域は、１つ以上の選択されたＶＨ及び／又はＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を用いて、可変ドメイン全体に突然変異を生じさせることにより生成することもできる。幾つかの実施形態では、１つ又は２つのアミノ酸置換を可変ドメイン全体又はＣＤＲｓ組内で生じさせる。用いることができる別の方法は、突然変異誘発をＶＨ又はＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に指向させることである。

本明細書に記載のように用いられる可変ドメインは、任意の生殖系列若しくは再編成されたヒト可変ドメインから得られるか、若しくはそれらに由来するものであっても、又は既知のヒト可変ドメインのコンセンサス配列若しくは実際の配列に基づく合成可変ドメインであってもよい。可変ドメインは、非ヒト抗体に由来するものであってもよい。本明細書に記載の使用のためのＣＤＲ配列（例えば、ＣＤＲ３）は、組換えＤＮＡ技術を用いて、ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ３）を欠いた可変ドメインのレパートリーへと導入してもよい。例えば、Marks et al. (1992)には、可変ドメイン域の５’末端に指向する、又はその５’末端と隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーとともに使用して、ＣＤＲ３を欠いたＶＨ可変ドメインのレパートリーを得るという抗体可変ドメインのレパートリーを作製する方法が記載されている。さらに、Marks et al.には、このレパートリーを特定の抗体のＣＤＲ３とどのように組み合わせることができるかが記載されている。同様の技法を用いて、本発明のＣＤＲ３由来配列を、ＣＤＲ３を欠いたＶＨドメイン又はＶＬドメインのレパートリーとシャッフルして、シャッフルした完全なＶＨ又はＶＬドメインを同系のＶＬドメイン又はＶＨドメインと合わせることで、本明細書に記載の使用のための抗体分子を得ることができる。次いで、このレパートリーを、国際公開第９２／０１０４７号、又はKay, Winter & McCafferty (1996)を含む続く多くの文献のいずれかのファージディスプレイシステム等の好適な宿主系に提示させることで、好適な抗体分子を選択することができる。レパートリーは、いずれも１０^４の個々の成員を超えて、例えば少なくとも１０^５、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、又は少なくとも１０^１０の成員からなり得る。

腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原、例えばＡ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ若しくはＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインを抗体分子、例えば本明細書に記載の使用のための抗体分子についてのスクリーニングに使用することができる。スクリーニングは、本明細書の他の箇所に開示されるレパートリーのスクリーニングであり得る。

同様に、１つ以上、又は３つ全てのＣＤＲｓをＶＨ又はＶＬドメインのレパートリーにグラフトすることができ、次いでそれを腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原、例えばＡ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ若しくはＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、若しくはテネイシンＣのＡ１ドメインに対する抗体分子（単数又は複数）についてスクリーニングする。抗体Ｆ８、Ｌ１９若しくはＦ１６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の１つ以上、又は抗体Ｆ８、Ｌ１９若しくはＦ１６のＨＣＤｓＲ組を用いても、及び／又は抗体Ｆ８、Ｌ１９若しくはＦ１６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の１つ以上、又は抗体Ｆ８、Ｌ１９若しくはＦ１６のＬＣＤＲｓ組を用いてもよい。

免疫グロブリン可変ドメインの相当部分が少なくとも、介在するフレームワーク領域とともに、３つのＣＤＲ領域を含んでいてもよい。この部分は、第１のフレームワーク領域及び第４のフレームワーク領域のいずれか又は両方の少なくとも約５０％を含んでいてもよく、この５０％は第１のフレームワーク領域のＣ末端の５０％であり、第４のフレームワーク領域のＮ末端の５０％である。可変ドメインの相当部分のＮ末端又はＣ末端の更なる残基は、天然可変ドメイン領域に通常関連しないものであり得る。例えば、組換えＤＮＡ技法により作製される本発明の抗体分子の構築により、クローニング又は他の操作工程を促すために導入されたリンカーによりコードされるＮ末端又はＣ末端の残基の導入が起こり得る。他の操作工程としては、本明細書の他の箇所に開示される可変ドメインを繋ぐリンカーを、抗体定常領域、他の可変ドメイン（例えば、ダイアボディの作製における）、又は本明細書の他の箇所にてより詳細に論述される検出可能な／機能的な標識を含む更なるタンパク質配列に導入することが挙げられる。

抗体分子はＶＨドメイン及びＶＬドメインの対を含み得るが、本明細書に記載のように、ＶＨドメイン配列又はＶＬドメイン配列のいずれかに基づく単一結合ドメインを使用することもできる。単一免疫グロブリンドメイン、特にＶＨドメインは、特異的に標的抗原に結合することが可能であることが知られている。例えば、上記のｄＡｂの論述を参照されたい。

単一結合ドメインのいずれかの場合、これらのドメインを用いて、腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原、例えばＡ−ＦＮ、Ｂ−ＦＮ、フィブロネクチンのＥＤ−Ａ若しくはＥＤ−Ｂ、テネイシンＣ、又はテネイシンＣのＡ１ドメインに結合することが可能な２ドメインの抗体分子を形成することが可能である相補性ドメインについてスクリーニングすることができる。これは、国際公開第９２／０１０４７号に開示されるような、いわゆる階層的なデュアルコンビナトリアルアプローチを用いるファージディスプレイスクリーニング法により達成することができ、ここで、Ｈ鎖クローン又はＬ鎖クローンのいずれかを含有する個々のコロニーを用いて、他の鎖（Ｌ又はＨ）をコードするクローンの完全ライブラリに感染させ、この参照文献に記載のもののようなファージディスプレイ技法に従って、得られる二本鎖抗体分子が選択される。この技法は、Marks 1992にも開示されている。

本明細書に記載の使用のための全抗体のフラグメントは、本明細書に記載の抗体分子のいずれか、例えば本明細書に記載の抗体のいずれかのＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン又はＣＤＲを含む抗体分子から始めて、ペプシン若しくはパパイン等の酵素による消化等の方法により、及び／又は化学的還元によるジスルフィド架橋の切断により得ることができる。別の方法では、抗体フラグメントは、同様に当業者に既知の遺伝子組換え技法により、又は更には例えばApplied Biosystems等により供給されるもののような自動ペプチド合成装置を用いたペプチド合成により、若しくは核酸合成及び発現により得ることができる。

本明細書に記載のコンジュゲートは、ＩＬ２と、ＴＮＦ、好ましくはＴＮＦαの突然変異体と、本明細書に記載の腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原に結合する抗体分子とを含む。抗体分子は、好ましくは本明細書に記載のようにｓｃＦｖ又はダイアボディ、最も好ましくはｓｃＦｖである。

ＩＬ２はヒトＩＬ２であるのが好ましい。

ＩＬ２は、配列番号１２に示される配列を含むか、又は該配列からなるのが好ましい。通例、ＩＬ２は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のうちの１つの配列同一性を有する。本発明のコンジュゲートにおけるＩＬ２は、ヒトＩＬ２の生体活性、例えば細胞増殖の阻害能を保持している。

ＴＮＦはヒトＴＮＦであるのが好ましい。腫瘍壊死因子がＴＮＦαである場合、ＴＮＦαはヒトＴＮＦαであるのが好ましい。

本明細書に記載のコンジュゲートにおけるＴＮＦ突然変異体は、ヒトＴＮＦの生体機能、例えば細胞増殖の阻害能を保持しているが、活性が低減したＴＮＦの突然変異体である。

ＴＮＦ突然変異体は、１つ以上の突然変異を欠いた野生型ＴＮＦに比べて活性を低減させる１つ以上の突然変異を含み得る。すなわち、ＴＮＦ突然変異体は野生型ＴＮＦよりも効力が低い。例えば、ＴＮＦ突然変異体は、配列番号１５の３２位又は配列番号１７の５２位に対応する位置に突然変異を含み得る。幾つかの実施形態では、上記位置のＲは、異なるアミノ酸、好ましくはＧ以外のアミノ酸、例えば非極性アミノ酸、好ましくはＡ、Ｆ、又はＶ、最も好ましくはＡへと置換され得る。好適なＴＮＦ突然変異体の配列例は、それぞれ配列番号３７、３９、５４〜５５、５６〜５７に示される。

配列番号１５の３２位又は配列番号１７の５２位に対応するＴＮＦ突然変異体の位置にある残基のアイデンティティが、組換え系における発現に対するタンパク質収率に影響を及ぼすことが本明細書にて示されている。例えば、この位置でのＷの存在により、組換え系にて実質的に発現が行われなくなり、この位置でのＡの存在により、組換え系にて予想外に高い収率がもたらされる。

ヒトＴＮＦαは、３５アミノ酸の細胞質ドメイン、２０アミノ酸の膜貫通ドメイン及び１７７アミノ酸の細胞外ドメインからなる。１７７アミノ酸の細胞外ドメインが切断され、生物学的に活性である１５７アミノ酸の可溶化形態が生じ、溶液中で非共有結合した三量体が形成される。本発明の文脈では、ヒトＴＮＦαはＴＮＦαの突然変異体であり、好ましくはヒトＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態、又はヒトＴＮＦαの細胞外ドメインであるのが好ましい。ヒトＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態の配列を配列番号１５に示す。通例、突然変異型ＴＮＦαは、活性を低減させる１つ以上の突然変異、例えば配列番号１５における３２位に対応する位置に突然変異を有する配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％のうちの１つの配列同一性を有する。ヒトＴＮＦαの細胞外ドメインの配列を配列番号１７に示す。この場合、突然変異型ＴＮＦαは、活性を低減させる１つ以上の突然変異、例えば配列番号１７における５２位に対応する位置に突然変異を有する配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％のうちの１つの配列同一性を有し得る。

本発明者らにより、本発明のコンジュゲート、特に配列番号１５の３２位又は配列番号１７の５２位のＴＮＦαのアルギニン残基がアラニンに置換された、本発明のコンジュゲートに存在するＴＮＦαが活性の低減を呈することが示されている。そのため、ＴＮＦαの突然変異体は、配列番号１５の３２位又は配列番号１７の５２位の残基がアルギニン残基ではなくアラニン残基であることを除けば、配列番号１５又は配列番号１７に示される配列を含み得るか、又は該配列からなり得る。この配列を配列番号３７又は配列番号３９に示す。そのため、ＴＮＦαの突然変異体は、配列番号３７に示される配列を含むか、又は該配列からなるのが好ましい。通例、ＴＮＦαの突然変異体は、配列番号３７における３２位に対応する位置にＡを有する配列番号３７に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のうちの１つの配列同一性を有する。また代替的には、ＴＮＦαの突然変異体は、配列番号３９に示される配列を含み得るか、又は該配列からなり得る。この場合、ＴＮＦαは、配列番号３９における５２位に対応する位置にＡを有する配列番号３９に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のうちの１つの配列同一性を有し得る。

ＩＬ２が配列番号１２に示される配列を含み、及び／又はＴＮＦαが配列番号３７に示される配列を含むのが最も好ましい。

ＴＮＦαタンパク質の突然変異体をｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイで試験することができる。好適なアッセイとしては、活性アッセイ及び結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。３２位のアルギニン残基（Ａｒｇ３２）の置換又は欠失は従来技術に記載されている。例えば、アルギニン残基が、セリン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、トリプトファン、スレオニン又はチロシンにより置換されることが提案されている（米国特許第７１０１９７４号、米国特許第５４２２１０４号、国際公開第１９８８／００６６２５号、Yamagishi et al., Protein Eng. (1990) 3:713-9）。さらに、Ａｒｇ３２はまた、欧州特許第１５８２８６号では欠失されることが提案されている。Ａｒｇ３２がトリプトファンにより置換されている突然変異体は、細胞毒性作用の喪失を示している（Van Ostade et al.The Embo Journal (1991) 10:827-836）。２９位及び／又は３１位及び／又は３２位のアルギニンがトリプトファン又はチロシンにより置換されている突然変異体は、ヒトｐ７５ ＴＮＦ受容体に対する結合親和性と、ヒトｐ５５−ＴＮＦ受容体に対する結合親和性との間で大きな相違を示す（米国特許第５，４２２，１０４号）。米国特許第７，１０１，９７４号には、野生型ＴＮＦαと相互作用して、受容体シグナル伝達を活性化することが不可能な混合三量体を形成するＴＮＦα変異体が記載されていた。この最後の例では、Ａｒｇ３２はアスパラギン酸、グルタミン酸又はヒスチジンにより置換されている。

抗体分子は、リンカー、例えばペプチドリンカーを介して、ＩＬ２及びＴＮＦ突然変異体、好ましくはＴＮＦα突然変異体に結び付くのが好ましい。代替的には、抗体分子と、ＩＬ２及び／又は腫瘍壊死因子の突然変異体とが、直接、例えば化学結合を介して結び付き得る。抗体分子が、１つ以上のペプチドリンカーを用いて、ＩＬ２及び腫瘍壊死因子の突然変異体に連結する場合、コンジュゲートは融合タンパク質であり得る。「融合タンパク質」は、２つ以上の遺伝子又は核酸コード配列の１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）への融合により生じる翻訳産物であるポリペプチドを意味する。

化学結合は例えば、共有結合又はイオン結合であり得る。共有結合の例としては、ペプチド結合（アミド結合）及びジスルフィド結合が挙げられる。抗体分子及びＩＬ２及び／又はＴＮＦ突然変異体、好ましくは、ＴＮＦα突然変異体は、例えばペプチド結合（アミド結合）により共有結合的に連結し得る。このため、抗体分子、特に抗体分子のｓｃＦｖ部分及びＩＬ２及び／又はＴＮＦ突然変異体、好ましくはＴＮＦα突然変異体を融合タンパク質として生成することができる。

抗体分子が二本鎖又は多重鎖分子（例えば、ダイアボディ）である場合、ＩＬ２及び／又はＴＮＦ突然変異体を抗体分子にて１つ以上のポリペプチド鎖を有する融合タンパク質としてコンジュゲートすることができる。

抗体分子とＩＬ２及び／又はＴＮＦ突然変異体とを結び付けるペプチドリンカーは、可動性ペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカー配列の好適な例は当該技術分野にて知られている。リンカーは、１０アミノ酸〜２０アミノ酸、好ましくは１０アミノ酸〜１５アミノ酸の長さであり得る。リンカーは１１アミノ酸〜１５アミノ酸の長さであるのが最も好ましい。リンカーは配列番号１３、配列番号１４又は配列番号４９に示される配列を有し得る。幾つかの好ましい実施形態では、ＩＬ２及びＴＮＦ突然変異体は、それぞれ配列番号１３及び配列番号１４に示されるリンカーにより、抗体分子に連結され得る。他の好ましい実施形態では、ＩＬ２及びＴＮＦ突然変異体は、それぞれ配列番号４９及び配列番号１４に示されるリンカーにより、抗体分子に連結され得る。

例えば、実施例２に例示されるコンジュゲートでは、ＩＬ２をＦ８ ｓｃＦｖのＶＨドメインに、またＴＮＦα又はＴＮＦα突然変異体をＦ８ ｓｃＦｖのＶＬドメインに、それぞれ配列番号１及び配列番号３６に示されるペプチドリンカーを介してコンジュゲートさせた。実施例４に例示されるコンジュゲートでは、ＩＬ２をＬ１９ ｓｃＦｖのＶＨドメインに、またＴＮＦα又はＴＮＦα突然変異体をＬ１９ ｓｃＦｖのＶＬドメインに、それぞれ配列番号７０及び配列番号４４に示されるペプチドリンカーを介してコンジュゲートさせた。

しかしながら、ＩＬ２と、ＴＮＦ突然変異体、好ましくはＴＮＦα突然変異体と、腫瘍性増殖及び／又は血管新生と関連する抗原に結合する抗体分子とを含むコンジュゲートは、腫瘍壊死因子及びＩＬ２が抗体分子にコンジュゲートしたものと同じ又は同程度の腫瘍標的化特性及び／又は治療効力を示すと予測される。このため、抗体分子がｓｃＦｖであるか、又はｓｃＦｖを含む場合、ＩＬ２は、ペプチドリンカーを介して、ｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端に連結し得て、ＴＮＦの突然変異体は、ペプチドリンカーを介して、ｓｃＦｖのＶＬドメインのＣ末端に連結し得る。代替的には、抗体分子がｓｃＦｖであるか、又はｓｃＦｖを含む場合、ＴＮＦの突然変異体は、ペプチドリンカーを介して、ｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端に連結し得て、ＩＬ２は、ペプチドリンカーを介して、ｓｃＦｖのＶＬドメインのＣ末端に連結し得る。コンジュゲートは、ＩＬ２及びＴＮＦ、好ましくはＴＮＦαの突然変異体の両方が抗体のＶＨドメインにコンジュゲートする場合、同じ又は同程度の腫瘍標的化特性及び／又は治療効力及び／又は細胞致死活性を有すると予測される。したがって、更なる代替形態として、ＩＬ２及びＴＮＦ突然変異体、好ましくは、ＴＮＦα突然変異体は、抗体のＶＬドメインのＣ末端に、例えばｓｃＦｖ型にて、ペプチドリンカーを介して連結し得る。また更なる代替形態として、ＩＬ２及びＴＮＦ突然変異体、好ましくは、ＴＮＦα突然変異体は、抗体のＶＨドメインのＮ末端に、例えばｓｃＦｖ型にて、ペプチドリンカーを介して連結し得る。最後の２つのコンジュゲートでは、ＩＬ２及びＴＮＦは任意の順序であってもよく、及び／又は任意にペプチドリンカーを介して互いに連結されていてもよい。好適なペプチドリンカーを本明細書に記載する。

本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号３６に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、参照配列、例えば配列番号３６に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。配列番号３６の４３２位に対応する変異体における位置の残基はＡであるのが好ましい。例えば、配列番号３６の変異体であるコンジュゲートは、４３２位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、４３２位にＲ→Ａ突然変異を有する配列番号１、若しくは４５２位にＲ→Ａ突然変異を有する配列番号１６に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はこれらの配列の１つの変異体であり得る。変異体は、参照配列、例えば配列番号１又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。配列番号１の変異体における４３２位に対応する位置の残基がＡであり、配列番号１６の変異体における４５２位に対応する位置の残基がＡであるのが好ましい。例えば、配列番号１又は配列番号１６の変異体であるコンジュゲートは、それぞれ４３２位又は４５２位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号３８に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、参照配列、例えば配列番号３８に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。配列番号３８の４５２位に対応する変異体における位置の残基がＡであるのが好ましい。例えば、配列番号３８の変異体であるコンジュゲートは、４５２位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号５８〜配列番号６３に示される配列の１つを含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、参照配列、例えば配列番号５８〜配列番号６３に示されるアミノ酸配列の１つに対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。配列番号５８、配列番号６０、又は配列番号６２の変異体における４３２位に対応する位置の残基がそれぞれＷ、Ｆ、又はＶであるのが好ましい。配列番号５９、配列番号６１、又は配列番号６３の変異体における４５２位に対応する位置の残基がそれぞれＷ、Ｆ、又はＶであるのが好ましい。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号４０に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。配列番号４０の４２７位に対応する変異体における位置の残基がＡであるのが好ましい。例えば、配列番号４０の変異体であるコンジュゲートは、４２７位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号４１に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、参照配列、例えば配列番号４１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のうちの１つの配列同一性を有し得る。配列番号４１の４４７位に対応する変異体における位置の残基がＡであるのが好ましい。例えば、配列番号４１の変異体であるコンジュゲートは、４４７位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号４２に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、配列番号４２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のうちの１つの配列同一性を有し得る。配列番号４２の４２８位に対応する変異体における位置の残基がＡであるのが好ましい。例えば、配列番号４２の変異体であるコンジュゲートは、４２８位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号４３に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、配列番号４３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のうちの１つの配列同一性を有し得る。配列番号４３の４４８位に対応する変異体における位置の残基がＡであるのが好ましい。例えば、配列番号４３の変異体であるコンジュゲートは、４４８位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号４４に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のうちの１つの配列同一性を有し得る。配列番号４４の４３０位に対応する変異体における位置の残基がＡであるのが好ましい。例えば、配列番号４４の変異体であるコンジュゲートは、４３０位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号４５に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、配列番号４５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のうちの１つの配列同一性を有し得る。配列番号４５の４５０位に対応する変異体における位置の残基がＡであるのが好ましい。例えば、配列番号４５の変異体であるコンジュゲートは、４５０位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、４３０位にＲ→Ａ突然変異を有する配列番号７０、若しくは４５０位にＲ→Ａ突然変異を有する配列番号７１に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はこれらの配列の１つの変異体であり得る。変異体は、参照配列、例えば配列番号７０又は配列番号７１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。

配列番号７０の変異体における４３０位に対応する位置の残基がＡであり、配列番号７１の変異体における４５０位に対応する位置の残基がＡであるのが好ましい。例えば、配列番号７０又は配列番号７１の変異体であるコンジュゲートは、それぞれ４３０位又は４５０位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号６４〜配列番号６９に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、配列番号６４〜配列番号６９に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のうちの１つの配列同一性を有し得る。配列番号６４、配列番号６６、又は配列番号６８の変異体における４３０位に対応する位置の残基がそれぞれＷ、Ｆ、又はＶであるのが好ましい。配列番号６５、配列番号６７、又は配列番号６９の変異体における４５０位に対応する位置の残基がそれぞれＷ、Ｆ、又はＶであるのが好ましい。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号４７に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、配列番号４７に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。配列番号４７の４３１位に対応する変異体における位置の残基がＡであるのが好ましい。例えば、配列番号４７の変異体であるコンジュゲートは、４３１位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号４８に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、参照配列、例えば配列番号４８に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のうちの１つの配列同一性を有し得る。配列番号４８の４５１位に対応する変異体における位置の残基がＡであるのが好ましい。例えば、配列番号４８の変異体であるコンジュゲートは、４５１位にＡ残基を含み得る。

代替的には、本明細書に記載のコンジュゲートは、配列番号７２〜配列番号７７に示される配列を含み得るか、若しくは該配列からなり得るか、又はその変異体であり得る。変異体は、参照配列、例えば配列番号７２〜配列番号７７に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のうちの１つの配列同一性を有し得る。配列番号７２、配列番号７４、又は配列番号７６の変異体における４３１位に対応する位置の残基がそれぞれＷ、Ｆ、又はＶであるのが好ましい。配列番号７３、配列番号７５、又は配列番号７７の変異体における４５１位に対応する位置の残基がそれぞれＷ、Ｆ、又はＶであるのが好ましい。

何ら理論的説明に限定されるものではないが、ＴＮＦ突然変異体を含む本明細書に記載のコンジュゲートは、溶液中でホモ三量体を形成し得る。このような三量体コンジュゲートは、（三量体構造中に）活性が低減した活性ＴＮＦ１分子に対して活性ＩＬ２を３分子含む。このことは、臨床ではＩＬ２をベースとするイムノサイトカインは、ＴＮＦαをベースとするイムノサイトカインに比べてより高い用量で使用されるのが通例であることから、有益であり得る。例えば、Ｌ１９−ＩＬ２の推奨用量は、癌患者で４ｍｇであることが分かっているが（Johannsen et al. (2010) Eur. J. Cancer）、Ｌ１９−ＴＮＦαの推奨用量は、１ｍｇ〜１．５ｍｇの用量範囲である（Spitaleri et al. (2012) J. Clin. Oncol. Cancer Res.）。さらに、ＴＮＦの突然変異体は、野生型ＴＮＦとＩＬ２とを含むコンジュゲートに比べて活性が低減していることから、より高い用量の本明細書に記載のコンジュゲートを使用することができる。そのため、本明細書に記載のコンジュゲートは、投与計画に関して有益な特性を有し得る。

本明細書に記載のコンジュゲートをコードする単離核酸分子も提供される。核酸分子は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含み得て、部分的に又は完全に合成されたものであってもよい。本明細書で述べられるヌクレオチド配列に対する言及は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、特定の配列を有するＤＮＡ分子を包含するものであり、ＴをＵに置き換えた特定配列を有するＲＮＡ分子を包含するものである。

このような核酸を含む、プラスミド、ベクター（例えば、発現ベクター）、転写又は発現カセットの形態の構築物が更に提供される。プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含有する好適なベクターを選ぶ又は構築することができる。ベクターは、プラスミド、例えばファージミド、又は必要に応じてウイルスベクター、例えばウイルスファージ（'phage）とすることができる。更なる詳細については、例えばSambrook & Russell (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。核酸を操作するための、例えば核酸構築物の調製、突然変異誘発、シークエンシング、ＤＮＡの細胞への導入及び遺伝子発現、並びにタンパク質の分析における多くの既知の技法及びプロトコルが、Ausubel et al. (1999) 4^th eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sonsに詳細に記載されている。

上記の１つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞も提供される。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、糸状菌、酵母及びバキュロウイルス系、並びにトランスジェニック植物及び動物が挙げられる。

本明細書に記載のコンジュゲートは、かかる組換え宿主細胞を用いて産生することができる。この産生方法は、上記の核酸又は構築物を発現させることを含み得る。発現は、コンジュゲートの産生に適切な条件下にて組換え宿主細胞を培養することにより都合よく達成することができる。産生後、コンジュゲートを、必要に応じて任意の好適な技法を用いて単離及び／又は精製した後に使用してもよい。コンジュゲートを、少なくとも１つの更なる成分、例えば薬学的に許容可能な添加剤を含む組成物へと配合させることができる。

多種多様な宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現のためのシステムが既知である。原核細胞における抗体（そのコンジュゲートを含む）の発現は当該技術分野にて十分に確立されている。総説については、例えばPlueckthun (1991), Bio/Technology 9: 545-551を参照されたい。一般的な細菌宿主は大腸菌（E.coli）である。

培養物中での真核生物における発現も、コンジュゲートの産生の選択肢として当業者に利用可能である（例えば、Chadd et al. (2001), Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194)、Andersen et al. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117、Larrick & Thomas (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418）。異種ポリペプチドの発現のための当該技術分野にて利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス黒色腫細胞、ＹＢ２／０ラット骨髄腫細胞、ヒト胚性腎臓細胞、ヒト胚性網膜細胞、及び多くの他の細胞が挙げられる。

本明細書に開示の核酸又は構築物の宿主細胞への導入を含む方法も記載されている。この導入には、任意の利用可能な技法を用いることができる。真核細胞に適した技法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法、リポソームを介したトランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えばワクシニア若しくは昆虫細胞の場合、バキュロウイルスを用いたトランスダクションが挙げられ得る。宿主細胞、特に真核細胞における核酸の導入には、ウイルス又はプラスミドをベースとするシステムを用いることができる。プラスミドシステムは、エピソームとして（episomally）維持され得るか、又は宿主細胞若しくは人工染色体に組み込まれ得る。組込みは、１つ以上のコピーを単一又は複数の遺伝子座にランダムに又は標的化して組み入れることにより行われ得る。細菌細胞に適した技法としては、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔法、及びバクテリオファージを用いたトランスフェクションが挙げられ得る。

核酸又は構築物を宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み入れることができる。組入れは、標準技法に従ってゲノムによる組換えを促す配列を含ませることにより促すことができる。

「単離（isolated）」という用語は、本明細書に記載のコンジュゲート、本明細書に記載の使用のための抗体、又はかかるコンジュゲートをコードする核酸が概して、本発明によるものである状態を指す。このため、本明細書に記載のコンジュゲート、本明細書に記載の使用のための抗体、又はかかるコンジュゲートをコードする核酸は、単離及び／又は精製された形態で、例えばそれらを調製する環境（細胞培養物等）から単離及び／又は精製された形態で、実質的に純粋な若しくは均質な形態で、又は核酸の場合、要求される機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸を含まず、若しくは実質的に含まず提供され得る。単離成員及び単離核酸は、かかる調製がｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施される組換えＤＮＡ技術によるものである場合、それらを調製する環境（例えば、細胞培養物）に見られる物質を含まない、又は実質的に含まないと考えられる。特定のコンジュゲート及び核酸は、希釈剤又は助剤を用いて配合してもよく、更には実用目的のために単離されていてもよく、例えば、治療法に用いる場合、成員を薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と混合してもよい。特定のコンジュゲートは、自然に、若しくは異種真核細胞（例えば、ＣＨＯ又はＮＳ０（ＥＣＡＣＣ ８５１１０５０３）細胞）系によりグリコシル化していても、又は（例えば、原核細胞における発現により産生される場合）グリコシル化していなくてもよい。

コンジュゲートの異種調製物を本明細書に記載のように使用することもできる。例えば、このような調製物は、様々な程度のグリコシル化、及び／又はピログルタミン酸残基を形成するＮ末端グルタミン酸の環化等のアミノ酸の誘導体化（derivatized amino acids）を伴う、完全長重鎖を有する抗体分子と、Ｃ末端リジンを欠いた重鎖を有する抗体分子とを含むコンジュゲートの混合物であり得る。

フィブロネクチンは、選択的スプライシングを受ける抗原であり、血管新生の既知のマーカーである、ドメインＥＤ−Ａ又はＥＤ−Ｂをそれぞれ含む選択的スプライシングアイソフォームＡ−ＦＮ及びＢ−ＦＮを含むフィブロネクチンの選択的アイソフォームが数多く知られている。抗体分子は、本明細書で言及されているように、新生血管系にて選択的に発現されるフィブロネクチンのアイソフォームと選択的に結合し得る。抗体分子は、フィブロネクチンアイソフォームＡ−ＦＮに結合し得る、例えばドメインＥＤ−Ａ（エキストラドメインＡ）に結合し得る。抗体分子はＥＤ−Ｂ（エキストラドメインＢ）に結合し得る。

フィブロネクチンエキストラドメイン−Ａ（ＥＤＡ又はＥＤ−Ａ）は、ＥＤ、エキストラタイプＩＩＩリピートＡ（ＥＩＩＩＡ）又はＥＤＩとしても知られている。ヒトＥＤ−Ａの配列は、Kornblihtt et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868及びPaolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557に公開されている。ヒトＥＤ−Ａの配列は、アクセッション番号Ｐ０２７５１で寄託されたアミノ酸配列のアミノ酸１６３１〜１７２０（フィブロネクチンタイプＩＩＩ １２；エキストラドメイン２）としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースでも入手可能である。マウスＥＤ−Ａの配列は、アクセッション番号Ｐ１１２７６で寄託されたアミノ酸配列のアミノ酸１７２１〜１８１０（フィブロネクチンタイプＩＩＩ １３；エキストラドメイン２）としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにて入手可能である。

フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム（Ａ−ＦＮ）は、エキストラドメイン−Ａ（ＥＤ−Ａ）を含有する。ヒトＡ−ＦＮの配列は、アクセッション番号Ｐ０２７５１でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにて入手可能な対応するヒトフィブロネクチン前駆配列から推測することができる。マウスＡ−ＦＮの配列は、アクセッション番号Ｐ１１２７６でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにて入手可能な対応するマウスフィブロネクチン前駆配列から推測することができる。Ａ−ＦＮは、フィブロネクチンのヒトＥＤ−Ａアイソフォームであり得る。ＥＤ−Ａは、ヒトフィブロネクチンのエキストラドメイン−Ａであり得る。

ＥＤ−Ａは、選択的スプライシングによりフィブロネクチン（ＦＮ）に挿入される９０アミノ酸の配列であり、ＦＮのドメイン１１とドメイン１２との間に位置する（Borsi et al. (1987), J. Cell. Biol., 104, 595-600）。ＥＤ−Ａは主として、血漿形態のＦＮには存在しないが、胚形成、組織リモデリング、線維化、心臓移植、及び固形腫瘍増殖時には豊富に含まれる。

フィブロネクチンアイソフォームＢ−ＦＮは、よく知られる血管新生のマーカーの１つである（米国特許出願公開第１０／３８２，１０７号、国際公開第０１／６２２９８号）。９１アミノ酸のエキストラドメイン「ＥＤ−Ｂ」は、Ｂ−ＦＮアイソフォームに見られ、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、及びヒトにて同一である。Ｂ−ＦＮは、浸潤性腫瘍、並びに血管新生を受ける他の組織、例えば増殖期の子宮内膜及び病的状態の幾つかの眼構造における新生血管構造の周りに蓄積するが、それ以外の正常な成体組織では検出不能である。

テネイシン−Ｃは、細胞接着を調節する細胞外基質の大型の六量体糖タンパク質である。テネイシン−Ｃは、細胞増殖及び細胞移動等の過程に関わるものであり、形態形成及び胚形成時、並びに腫瘍形成又は血管新生下で起こる組織構造の変化に関与する。テネイシン−Ｃの幾つかのアイソフォームは、ドメインＡ１〜ドメインＤの範囲のこのタンパク質の中心部分にある（複数の）ドメインの包含をもたらし得る選択的スプライシングの結果として生じる場合もある（Borsi L et al Int J Cancer 1992; 52:688-692、Carnemolla B et al. Eur J Biochem 1992; 205:561-567、国際公開第２００６／０５０８３４号）。抗体分子は、本明細書に言及されるように、テネイシン−Ｃに結合し得る。抗体分子は、テネイシン−ＣのドメインＡ１に結合し得る。

癌は、本明細書に言及されるように、腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原、例えば腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する細胞外基質成分を発現するか、又は発現することが示されている癌であり得る。癌は、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォーム、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂアイソフォーム、及び／又は選択的スプライシングテネイシンＣを発現するか、又は発現することが示されている癌であるのが好ましい。癌は、フィブロネクチンのＥＤ−Ａアイソフォームを発現するのがより好ましい。例えば、癌は、任意の型の固形若しくは非固形の癌、又は悪性リンパ腫であり得る。癌は、皮膚癌（特に、黒色腫）、頭頸部癌、腎臓癌、肉腫、胚細胞癌（奇形癌等）、肝臓癌、リンパ腫（ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫等）、白血病（例えば、急性骨髄性白血病）、皮膚癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、食道癌、膵臓癌、胃癌、及び脳癌からなる群から選択され得る。癌は、家族性又は散発性であり得る。癌は、転移性又は非転移性であり得る。癌は、黒色腫、頭頸部癌、腎臓癌及び肉腫からなる群から選択される癌であるのが好ましい。上述のような癌に対する言及は、通常、対象の細胞の悪性形質転換を指す。そのため例えば、腎臓癌は、腎臓における細胞の悪性形質転換を指す。癌は、腎臓癌の場合の腎臓のような原発位置に位置していても、又は転移の場合には遠隔位置に位置していてもよい。本明細書に言及される腫瘍は、上述の癌のいずれかの結果であり得る。腫瘍は、黒色腫、頭頸部癌、腎臓癌、又は肉腫の結果であるのが好ましい。特定の癌の結果である腫瘍には、原発腫瘍及び上記癌の腫瘍転移の両方が含まれる。そのため、頭頸部癌の結果である腫瘍には例えば、頭頸部癌の原発腫瘍及び患者の身体の他の部位に見られる頭頸部癌の転移の両方が含まれる。

本明細書に記載のコンジュゲートは、抗腫瘍活性を有し得るため、癌治療に有用である。何ら理論的説明に限定されるものではないが、下記の実施例３及び実施例４に示されるように、上記コンジュゲートは、優れた腫瘍標的化特性の結果として強力な抗腫瘍活性を呈することが予測される。このため、本明細書に記載のコンジュゲートを、患者、好ましくはヒト患者の治療方法に使用するように設計する。本発明のコンジュゲートは特に、癌の治療に使用することができる。

したがって、本発明は、上記のコンジュゲート、かかるコンジュゲートを含む医薬組成物の投与を含む治療方法、及び薬学的に許容可能な添加剤を用いてコンジュゲートを配合することを含む、投与のための薬剤の製造、例えば薬剤又は医薬組成物を作製する方法におけるかかるコンジュゲートの使用を提供する。薬学的に許容可能なビヒクルが既知であり、選ばれる活性化合物（複数の場合もある）の性質及びその投与様式に応じて当業者により適合される。

本明細書に記載のコンジュゲートは、通常、医薬組成物の形態で投与する。この医薬組成物は、抗体分子に加えて、少なくとも１つの成分を含み得る。そのため、本明細書に記載され、本発明に従って使用される医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容可能な添加剤、担体、バッファー、安定化剤、又は当業者に既知の他の材料を含み得る。このような材料は、非毒性であるとともに、有効成分の効力を妨げないものとする。担体又は他の材料の正確な性質は投与経路により決まり、投与経路は、注射によるもの、例えば静脈内、腫瘍内、又は皮下の経路であり得る。本発明のコンジュゲートは腫瘍内に投与されるのが好ましい。

液体医薬組成物は、概して水、石油類、動物油若しくは植物油、鉱油、又は合成油等の液体担体を含む。生理食塩水、デキストロース若しくは他の糖類溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール等のグリコールが含まれ得る。

静脈内注射、又は罹患部位への注射のために、有効成分は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態であり得る。関連の当業者は、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液等の等張ビヒクルを用いて、好適な溶液を調製することができる。防腐剤、安定化剤、バッファー、酸化防止剤及び／又は他の添加物を所望に応じて用いることができる。医薬配合物の調製方法の多くは、当業者に知られている。例えば、Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。

本明細書に記載のコンジュゲートを含む組成物は、癌治療のために、単独で、又は他の癌治療と組み合わせて、同時に又は逐次的に又は別の治療剤（単数又は複数）との複合調製物として投与することができる。例えば、本発明のコンジュゲートを既存の癌の治療剤と組み合わせて使用することができる。

本明細書に記載のコンジュゲートを薬剤の製造に使用することができる。薬剤は、個体に別々に又は組み合わせて投与するものであってもよく、したがってコンジュゲートと、複合調製物として、又は別々の調製物としての更なる成分とを含み得る。別々の調製物を用いて、別々の逐次的な投与又は同時投与を促してもよく、異なる経路により成分を投与してもよい。

提供される組成物を哺乳動物、好ましくはヒトに投与することができる。投与は、「治療的に有効な量」で行われ得て、この量は患者に対して有益性を示すのに十分なものである。かかる有益性は少なくとも、少なくとも１つの症状の改善であり得る。そのため、特定疾患の「治療」は、少なくとも１つの症状の改善を指す。実際の投与量、並びに投与の速度及び時間経過は、治療対象の性質及び重症度、治療される特定の患者、個々の患者の臨床状態、障害の原因、組成物の送達部位、コンジュゲートの種類、投与方法、投与スケジュール、並びに診療医に既知の他の因子によって決まる。治療の処方、例えば投与量の決定等は、総合診療医及び他の医師の責任の範囲内であり、治療対象の疾患の症状の重症度及び／又は進行に応じて決まる。抗体の適切な用量は、当該技術分野にて既知である（Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664、及びBagshawe et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922）。本明細書又は投与される薬剤の種類によっては必要に応じてPhysician's Desk Reference (2003)に示される特定の投与量を使用することができる。本明細書に記載の使用のためのコンジュゲートの治療的に有効な量又は好適な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性と、動物モデルでのｉｎ ｖｉｖｏ活性とを比較することにより決定することができる。マウス及び他の試験動物における有効投与量をヒトに外挿する方法が知られている。正確な用量は、抗体が診断用、予防用、又は治療用であるか、治療域のサイズ及び位置、コンジュゲートの正確な性質を含む多くの因子によって決まる。通例のコンジュゲート用量は、全身適用にて１０μｇ〜５００μｇ／ｋｇの範囲である。初期のより高い負荷用量、続いて１以上のより低い用量を投与してもよい。これは、成人患者の単剤治療についての用量であり、乳幼児に合わせて調整することができ、また分子量に合わせてコンジュゲート型に従って調整することができる。治療は、医師の裁量で毎日、週に２回、毎週、又は毎月の間隔で繰り返すことができる。治療は、皮下投与では２週間〜４週間毎、及び静脈内投与では４週間〜８週間毎に行われ得る。本発明の幾つかの実施形態では、治療は定期的なものであり、投与間隔は、約２週間以上、例えば約３週間以上、約４週間以上、又は約１ヶ月に１度である。本発明の他の実施形態では、治療は、手術の前及び／又は後に行われ得て、外科的治療の解剖学的部位に直接投与又は適用することができる。

本発明の更なる態様及び実施形態は、以下の実験的実例を含む本開示を考慮することで当業者に明らかである。

本明細書において言及される全ての文献は、その全体が全ての目的で引用することにより本明細書の一部をなす。

「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、他方を含む又は含まない２つの指定の特徴又は構成成分の各々の具体的な開示とみなされる。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、各々が本明細書に個別に提示されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示とみなされる。

文脈により他に指示されない限り、上に提示される特徴の説明及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に同様に当てはまる。

ここで、或る特定の本発明の態様及び実施形態を、例として、上に記載される図面を参照して説明する。

実施例１−ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦαコンジュゲート、ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα突然変異体コンジュゲート、ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦαコンジュゲート、及びｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα突然変異体コンジュゲートの作製及び分析
ヒトＴＮＦα突然変異体を有する様々なコンジュゲートを作製し、ＦＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＳにより特性評価した。結果を表１にまとめる。Ｒ３２Ｗ突然変異体の発現は、ＩＬ２−Ｌ１９−ＴＮＦα又はＩＬ２−Ｆ８−ＴＮＦαイムノサイトカインのいずれでも殆ど又は全く観察されなかった。Ｒ３２Ａ突然変異体の収率は両方のイムノサイトカインで予想外に高かった。

実施例２−細胞致死活性に対するコンジュゲート型の効果
融合タンパク質を、発現させ、均質に精製することができた。精製されたｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦαコンジュゲート（配列番号１）及びｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲート（配列番号３６）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ＨＲ １０／３０カラムを備えたＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステムにて通常の実験により分析し、非還元条件及び還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により特性評価した。

細胞致死活性に対するコンジュゲートにおけるＴＮＦα突然変異の重要性を試験するために、２つの融合タンパク質の活性を、Ｌ Ｍ線維芽細胞株を用いた細胞致死アッセイにて試験した。このアッセイを２μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤ（Sigma-Aldrich）の存在下で行った。細胞を、図１に示されるように、漸増濃度のｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（配列番号１）、又はｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）（配列番号３６）を加えた培養培地の入った９６ウェルプレートに播種した。Ｆ８抗体は、試験したコンジュゲート全てでｓｃＦｖ型であった。結果を図１に示す。結果は、アクチノマイシンＤのみで処理した細胞（陰性対照として使用される）と比較した細胞生存率パーセントとして表す。この結果から、図１で報告されるＥＣ５０値から分かるように、ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートの細胞致死活性がｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦαコンジュゲートに比べて低かったことが明らかとなる。ＥＣ５０値は、最大半量活性に要する薬物濃度を表す。

実施例３−ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦ（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートの生体内分布分析
ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦ（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ標的化性能を生体内分布分析により評価した。融合タンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーにて精製した後、ヨウ素１２５で放射ヨウ素標識した。総量１２μｇ（約９．６μＣｉ）の融合タンパク質調製物を皮下移植されたＦ９マウス奇形癌を保有する免疫適格１２９Ｓｖマウスの尾静脈に注射した。マウスを注射の２４時間後に屠殺した。臓器を秤量し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａガンマカウンターを用いて放射活性を計測した。代表臓器の放射活性含有量を記録し、組織１グラム当たりの注射用量パーセント（％ＩＤ／ｇ）として表した。この結果から、腫瘍におけるｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートの優先的かつ選択的な蓄積が示される（図２）。

実施例４−ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートの作製及び分析
タンパク質の特性評価
融合タンパク質ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）（配列番号４４）をプロテインＡクロマトグラフィーにより、細胞培養培地から均質に精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＥＳＩ−ＭＳ及びサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬ、GE Healthcare）により分析した。

ＴＮＦ及びＩＬ２の生体活性は、それぞれＨＴ１０８０細胞及びＣＴＬＬ２細胞にて求めた。

ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートは、生化学アッセイにて、ｉｎ ｖｉｖｏで固形腫瘍に選択的に局在するような良好な挙動を示し、マウスＣＴＬＬ−２リンパ球の増殖（図３）及びヒトＨＴ−１０８０腫瘍細胞株の致死（図４）に基づく細胞アッセイを用いたＩＬ２部分及びＴＮＦ部分のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性との一致を示した。

生体内分布研究
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦ（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ ＥＤＢ標的化性能を生体内分布分析により評価した。１０μｇの放射ヨウ素標識した融合タンパク質を腫瘍担持Ｆ９マウスの側尾静脈に注射した。マウスを注射の２４時間後に屠殺し、臓器を摘出し、秤量して、Ｃｏｂｒａ γカウンターを用いて臓器及び腫瘍の放射活性を測定し、組織１グラム当たりの注射用量パーセント（％ＩＤ／ｇ±ＳＥＭ）として表した（ｎ＝１群当たり３匹のマウス）。この結果から、腫瘍におけるｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体コンジュゲートの優先的かつ選択的な蓄積が示される（図５）。

配列表
１．ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号１）
ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ８ ＶＨ−リンカー−Ｆ８ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦαはＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

２．Ｆ８ ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２）

３．抗体のＶＨドメインと−ＶＬドメインとを繋ぐリンカーのアミノ酸配列（配列番号３）

４．Ｆ８ ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号４）

５．Ｆ８ ｓｃＦｖのアミノ酸配列（配列番号５）

６．Ｆ８ ＣＤＲのアミノ酸配列

７．コンジュゲートにおけるヒトＩＬ２（ｈｕＩＬ２）のアミノ酸配列（配列番号１２）

８．抗体分子と、ＩＬ２及び／又はＴＮＦ突然変異体とを繋ぐリンカーのアミノ酸配列（配列番号１３）

９．抗体分子と、ＩＬ２及び／又はＴＮＦ突然変異体とを繋ぐリンカーのアミノ酸配列（配列番号１４）

１０．ヒトＴＮＦα（ｈｕＴＮＦα）の細胞外ドメインの可溶化形態のアミノ酸配列（配列番号１５）

１１．ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号１６）
ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ８ ＶＨ−リンカー−Ｆ８ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα［細胞外ドメイン］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦαはＴＮＦαの細胞外ドメインである。

１２．ヒトＴＮＦα（ｈｕＴＮＦα）の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号１７）

１３．Ｌ１９ ＣＤＲのアミノ酸配列

１４．Ｌ１９ ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）

１５．Ｌ１９ ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２５）

１６．ｓｃＦｖ（Ｌ１９）のアミノ酸配列（配列番号２６）

１７．Ｆ１６ ＣＤＲのアミノ酸配列

１８．Ｆ１６ ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号３３）

１９．Ｆ１６ ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号３４）

２０．ｓｃＦｖ（Ｆ１６）のアミノ酸配列（配列番号３５）
ＶＨ及びＶＬドメインリンカー配列は下線で示している。

２１．ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号３６）
ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ８ ＶＨ−リンカー−Ｆ８ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ａは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）の突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

２２．ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ３２Ａ）の細胞外ドメインの可溶化形態のアミノ酸配列（配列番号３７）。Ｒ３２Ａは太字下線処理している。

２３．ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ５２Ａ）［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号３８）
ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ８ ＶＨ−リンカー−Ｆ８ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体［細胞外ドメイン］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ａは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

２４．ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ５２Ａ）［細胞外ドメイン］の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号３９）。Ｒ５２Ａは太字下線処理している。

２５．ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号４０）
ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ１６ ＶＨ−リンカー−Ｆ１６ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ａは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

２６．ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号４１）
ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ１６ ＶＨ−リンカー−Ｆ１６ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ａは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

２７．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号４２）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ａは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

２８．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号４３）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ａは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

２９．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号４４）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ａは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

３０．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号４５）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ａは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

３１．ｓｃＦｖ（Ｆ１６）のアミノ酸配列（配列番号４６）
ＶＨ及びＶＬドメインリンカー配列は下線で示している。

３２．ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号４７）
ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ１６ ＶＨ−リンカー−Ｆ１６ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ａ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ａは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

３３．ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号４８）
ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ１６ ＶＨ−リンカー−Ｆ１６ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ａ）突然変異体）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ａは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

３４．抗体分子とＩＬ２及び／又はＴＮＦ突然変異体とを繋ぐリンカーのアミノ酸配列（配列番号４９）

３５．抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとを繋ぐリンカーのアミノ酸配列（配列番号５０）

３６．抗体のＶＨドメインとＶＬドメインとを繋ぐリンカーのアミノ酸配列（配列番号５１）

３７．ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｗ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ３２Ｗ）の細胞外ドメインの可溶化形態のアミノ酸配列（配列番号５２）。Ｒ３２Ｗは太字下線処理している。

３８．ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｗ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ５２Ｗ）の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号５３）。Ｒ５２Ｗは太字下線処理している。

３９．ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｆ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ３２Ｆ）の細胞外ドメインの可溶化形態のアミノ酸配列（配列番号５４）。Ｒ３２Ｆは太字下線処理している。

４０．ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｆ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ５２Ｆ）の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号５５）。Ｒ５２Ｆは太字下線処理している。

４１．ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｖ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ３２Ｖ）の細胞外ドメインの可溶化形態のアミノ酸配列（配列番号５６）。Ｒ３２Ｖは太字下線処理している。

４２．ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｖ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ５２Ｖ）の細胞外ドメインのアミノ酸配列（配列番号５７）。Ｒ５２Ｖは太字下線処理している。

４３．ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｗ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号５８）
ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｗ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ８ ＶＨ−リンカー−Ｆ８ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｗ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ｗは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｗ）の突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

４４．ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｗ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ５２Ｗ）［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号５９）
ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｗ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ８ ＶＨ−リンカー−Ｆ８ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｗ）突然変異体［細胞外ドメイン］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ｗは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｗ）突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

４５．ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｆ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号６０）
ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｆ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ８ ＶＨ−リンカー−Ｆ８ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｆ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ｆは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｆ）の突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

４６．ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｆ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ５２Ｆ）［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号６１）
ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｆ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ８ ＶＨ−リンカー−Ｆ８ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｆ）突然変異体［細胞外ドメイン］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ｆは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｆ）突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

４７．ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｖ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号６２）
ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｖ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ８ ＶＨ−リンカー−Ｆ８ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｖ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ｖは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｖ）の突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

４８．ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｖ）突然変異体（ｈｕＴＮＦα Ｒ５２Ｖ）［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号６３）
ｈｕＩＬ２−Ｆ８−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｖ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ８ ＶＨ−リンカー−Ｆ８ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｖ）突然変異体［細胞外ドメイン］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ｖは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｖ）突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

４９．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｗ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号６４）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｗ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｗ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ｗは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

５０．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｗ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号６５）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｗ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｗ）突然変異体）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ｗは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

５１．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｆ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号６６）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｆ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｆ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ｆは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

５２．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｆ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号６７）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｆ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｆ）突然変異体）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ｆは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

５３．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｖ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号６８）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｖ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｖ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ｖは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

５４．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｖ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号６９）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｖ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｖ）突然変異体）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ｖは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

５５．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号７０）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦαはＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

５６．ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号７１）
ｈｕＩＬ２−Ｌ１９−ｈｕＴＮＦα［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｌ１９ ＶＨ−リンカー−Ｌ１９ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦαはＴＮＦαの細胞外ドメインである。

５７．ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｗ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号７２）
ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｗ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ１６ ＶＨ−リンカー−Ｆ１６ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｗ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ｗは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

５８．ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｗ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号７３）
ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｗ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ１６ ＶＨ−リンカー−Ｆ１６ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｗ）突然変異体）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ｗは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

５９．ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｆ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号７４）
ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｆ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ１６ ＶＨ−リンカー−Ｆ１６ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｆ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ｆは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

６０．ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｆ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号７５）
ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｆ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ１６ ＶＨ−リンカー−Ｆ１６ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｆ）突然変異体）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ｆは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

６１．ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｖ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号７６）
ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ３２Ｖ）突然変異体［可溶化形態］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ１６ ＶＨ−リンカー−Ｆ１６ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ３２Ｖ）突然変異体［可溶化形態］）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ３２Ｖは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインの可溶化形態である。

６２．ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｖ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲートのアミノ酸配列（配列番号７７）
ｈｕＩＬ２−Ｆ１６−ｈｕＴＮＦα（Ｒ５２Ｖ）突然変異体［細胞外ドメイン］コンジュゲート（ヒトＩＬ２−リンカー−Ｆ１６ ＶＨ−リンカー−Ｆ１６ ＶＬ−リンカー−ヒトＴＮＦα（Ｒ５２Ｖ）突然変異体）のアミノ酸配列を以下に示す。リンカー配列は下線処理し、Ｒ５２Ｖは太字下線処理している。このコンジュゲートにおけるヒトＴＮＦα突然変異体はＴＮＦαの細胞外ドメインである。

１３．Ｌ１９ ＣＤＲのアミノ酸配列

１４．Ｌ１９ ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号２４）

Claims (52)

1. インターロイキン−２（ＩＬ２）と、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）突然変異体と、腫瘍性増殖及び／又は血管新生に関連する抗原に結合する抗体分子とを含むコンジュゲートであって、該ＴＮＦ突然変異体が野生型ＴＮＦに比べて低減した活性を有する、コンジュゲート。
2. 前記ＴＮＦ突然変異体が、野生型ＴＮＦに比べて該ＴＮＦ突然変異体の活性を低減させる１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入を有する野生型ＴＮＦのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
3. 前記ＴＮＦがＴＮＦαである、請求項１又は２に記載のコンジュゲート。
4. 前記ＴＮＦαがヒトＴＮＦαである、請求項３に記載のコンジュゲート。
5. 前記ＴＮＦ突然変異体が、配列番号１５のＲ３２又は配列番号１７のＲ５２に相当する位置に突然変異を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
6. 前記位置のＲが非極性アミノ酸へと置換されている、請求項５に記載のコンジュゲート。
7. 前記ＴＮＦ突然変異体が、前記位置にＲ→Ａ突然変異を有する、請求項６に記載のコンジュゲート。
8. 前記ＴＮＦ突然変異体が、配列番号３７若しくは配列番号３９のアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
9. 前記ＴＮＦαがペプチドリンカーを介して前記抗体分子に連結している、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
10. 前記ペプチドリンカーが、配列番号１４のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載のコンジュゲート。
11. 前記ＩＬ２がヒトＩＬ２である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
12. 前記ＩＬ２が配列番号１２の配列を含む、請求項１１に記載のコンジュゲート。
13. 前記ＩＬ２がペプチドリンカーによって前記抗体分子に連結している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
14. 前記ペプチドリンカーが、配列番号１３又は配列番号４９のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載のコンジュゲート。
15. 前記抗体分子が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
16. 前記抗体分子がダイアボディを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
17. 前記抗体分子がフィブロネクチンに結合する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
18. 前記抗体分子が、フィブロネクチンのエキストラドメイン−Ａ（ＥＤ−Ａ）に結合する、請求項１７に記載のコンジュゲート。
19. 前記抗体分子が、配列番号６〜配列番号１１に示される抗体Ｆ８の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有する抗原結合部位を含む、請求項１８に記載のコンジュゲート。
20. 前記抗体分子が、配列番号２及び配列番号４に示される抗体Ｆ８のＶＨドメイン及びＶＬドメイン又はそれらの変異体を含む、請求項１９に記載のコンジュゲート。
21. 前記抗体分子がｓｃＦｖであり、該ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインとが１０アミノ酸〜２０アミノ酸のリンカーによって繋がっている、請求項２０に記載のコンジュゲート。
22. 前記抗体分子が、配列番号５に示されるｓｃＦｖ Ｆ８のアミノ酸配列、又はその変異体を含む、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
23. 前記抗体分子が、フィブロネクチンのエキストラドメイン−Ｂ（ＥＤ−Ｂ）に結合する、請求項１７に記載のコンジュゲート。
24. 前記抗体分子が、配列番号１８〜配列番号２３に示される抗体Ｌ１９の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有する抗原結合部位を含む、請求項２３に記載のコンジュゲート。
25. 前記抗体分子が、配列番号２４及び配列番号２５に示される抗体Ｌ１９のＶＨドメイン及びＶＬドメイン又はそれらの変異体を含む、請求項２４に記載のコンジュゲート。
26. 前記抗体分子がｓｃＦｖであり、該ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインが１０アミノ酸〜２０アミノ酸のリンカーによって繋がっている、請求項２５に記載のコンジュゲート。
27. 前記抗体分子が、配列番号２６に示されるｓｃＦｖ Ｌ１９のアミノ酸配列、又はその変異体を含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
28. 前記抗体分子がテネイシンＣのＡ１ドメインに結合する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
29. 前記抗体分子が、配列番号２７〜配列番号３２に示される抗体Ｆ１６の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を有する抗原結合部位を含む、請求項２８に記載のコンジュゲート。
30. 前記抗体分子が、配列番号３３及び配列番号３４に示される抗体Ｆ１６のＶＨドメイン及びＶＬドメイン又はそれらの変異体を含む、請求項２９に記載のコンジュゲート。
31. 前記抗体分子がｓｃＦｖであり、該ｓｃＦｖのＶＨドメイン及びＶＬドメインが１０アミノ酸〜２０アミノ酸のリンカーによって繋がっている、請求項３０に記載のコンジュゲート。
32. 前記抗体分子が、配列番号３５若しくは配列番号４６に示されるｓｃＦｖ Ｆ１６のアミノ酸配列、又はその変異体を含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
33. 前記抗体分子が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であるか、又はｓｃＦｖを含み、前記ＩＬ２が、ペプチドリンカーを介して該ｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端に連結しており、前記ＴＮＦ突然変異体が、ペプチドリンカーを介して該ｓｃＦｖのＶＬドメインのＣ末端に連結している、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
34. 前記抗体分子が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であるか、又はｓｃＦｖを含み、前記ＴＮＦ突然変異体が、ペプチドリンカーを介して該ｓｃＦｖのＶＨドメインのＮ末端に連結しており、前記ＩＬ２が、ペプチドリンカーを介して該ｓｃＦｖのＶＬドメインのＣ末端に連結している、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
35. 前記抗体分子が、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であるか、又はｓｃＦｖを含み、前記ＩＬ２及び前記ＴＮＦ突然変異体が、ペプチドリンカーを介して該ｓｃＦｖのＶＬドメインのＣ末端に連結しているか、又は前記ＩＬ２及び前記ＴＮＦαが、ペプチドリンカーを介して該ｓｃＦｖのＮ末端に連結している、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
36. 前記ペプチドリンカーが１０アミノ酸〜２０アミノ酸の長さである、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
37. ４３２位にＲ→Ａ突然変異を有する配列番号１のアミノ酸配列、又は４５２位にＲ→Ａ突然変異を有する配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
38. 配列番号３６、配列番号３８のアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
39. ４３０位にＲ→Ａ突然変異を有する配列番号７０のアミノ酸配列、又は４５０位にＲ→Ａ突然変異を有する配列番号７１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７及び請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
40. 配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５のアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含む、請求項１〜１７及び請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
41. 配列番号４０、配列番号４１、配列番号４７、配列番号４８のアミノ酸配列、又はそれらの変異体を含む、請求項１〜１６及び請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
42. 請求項１〜４１のいずれか一項に記載のコンジュゲートをコードする核酸分子。
43. 請求項４２に記載の核酸を含む発現ベクター。
44. 請求項４３のベクターを含む宿主細胞。
45. 請求項１〜４１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを作製する方法であって、該方法が、該コンジュゲートの発現条件下で請求項４４に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
46. 前記コンジュゲートを単離及び／又は精製することを更に含む、請求項４５に記載の方法。
47. ＩＬ２及びＴＮＦをｉｎ ｖｉｖｏにて新生血管系へと標的化させることにより癌を治療する方法に使用される、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
48. 患者においてＩＬ２及びＴＮＦを腫瘍の新生血管系に送達する方法に使用される、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
49. 患者においてＩＬ２及びＴＮＦを新生血管系へと標的化させることにより癌を治療する方法であって、該方法が、治療有効量の請求項１〜４１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを該患者に投与することを含む、方法。
50. 患者においてＩＬ２及びＴＮＦを腫瘍の新生血管系に送達する方法であって、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを該患者に投与することを含む、方法。
51. 前記癌が黒色腫、頭頸部癌、腎臓癌、又は肉腫である、請求項４７に記載の使用のためのコンジュゲート又は請求項４９に記載の方法。
52. 前記腫瘍が黒色腫、頭頸部癌、腎臓癌、又は肉腫の結果によるものである、請求項４８に記載の使用のためのコンジュゲート又は請求項５０に記載の方法。

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