EA013537B1 - Антитела к тенасцину-с человека и их применение - Google Patents

Антитела к тенасцину-с человека и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA013537B1
EA013537B1 EA200700991A EA200700991A EA013537B1 EA 013537 B1 EA013537 B1 EA 013537B1 EA 200700991 A EA200700991 A EA 200700991A EA 200700991 A EA200700991 A EA 200700991A EA 013537 B1 EA013537 B1 EA 013537B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
variable region
heavy chain
light chain
amino acid
Prior art date
Application number
EA200700991A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200700991A1 (ru
Inventor
Симон Брак
Мичела Силачи
Дарио Нери
Original Assignee
Филоген Спа
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Филоген Спа filed Critical Филоген Спа
Publication of EA200700991A1 publication Critical patent/EA200700991A1/ru
Publication of EA013537B1 publication Critical patent/EA013537B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к связывающим элементам, специфичным к белку внеклеточного матрикса - тенасцину-С, в частности к scFv антителам против домена А1, домена С, домена D тенасцина-С. Настоящее изобретение также охватывает специфично связывающие тенасцин-С элементы, конъюгированные с меткой, цитотоксической молекулой или цитокином, и применение специфично связывающих тенасцин-С элементов в диагностике и лечении в особенности рака.

Description

Настоящее изобретение относится к специфичным к тенасцину-С связывающим элементам, в частности к антителам человека против тенасцина-С человека. Данные специфичные связывающие элементы имеют ряд терапевтических применений, например в диагностике и лечении рака.
Тенасцин-С представляет собой крупный гексамерный гликопротеин внеклеточного матрикса, который регулирует адгезию клеток. Он участвует в таких процессах, как пролиферация и миграция клеток, и ассоциирован с изменениями в архитектуре тканей, которые происходят в процессе морфогенеза и эмбриогенеза, а также при образовании опухолей (онкогенезе) или ангиогенезе.
Доменная структура тенасцина-С схематически изображена на фиг. 1. В результате альтернативного сплайсинга, который может приводить к включению (множественных) доменов - от домена А1 до домена Ό - в центральную часть этого белка, может образовываться несколько изоформ тенасцина-С. [Вог81 Ь. е! а1. Ιηΐ 1 Сапсег 1992; 52:688-692, Сагпето11а В. е! а1. Еиг 1 Вюсйет 1992; 205:561-567]. Ранее предполагали, что домены Α1-Ό или входят в молекулу тенасцина-С, или не включаются в нее блоком (т.е. все сразу) по механизму альтернативного сплайсинга, в результате чего образуются молекулы большого тенасцина-С и малого тенасцина-С [ВотД Ь. е! а1. 1 Вю1 Сйет 1995; 270:6243-6245]. Имеются сообщения о значительно повышенной экспрессии большой изоформы тенасцина-С в ряде опухолей [ВотД 1992 выше]; в клинике подробно описаны два моноклональных антитела, специфичных к доменам А1 и Ό соответственно [Ктуа Р. е! а1. Ιη! 1 Сапсег 1992; 51:7-13, Ктуа Р. е! а1. Сапсег Кек 1995; 55:59528-59568, РадапеШ 6. е! а1. Еиг 1 Хис1 Меб 1994; 21:314-321, Кеагбоп Ό.Α. е! а1. 1 С11п Опсо1 2002; 20:1389-1397, В1дпег Ό.Ό. е! а1. 1 С1ш Опсо1 1998; 16:2202-2212].
Однако недавно стало очевидным, что имеет место более сложная регуляция механизма альтернативного сплайсинга, приводящая к повышенной гетерогенности молекул больших изоформ тенасцинаС. Например, сообщалось о том, что дополнительный домен С тенасцина-С демонстрирует более ограниченный по сравнению с другими подвергающимися альтернативному сплайсингу доменами тенасцина-С рисунок экспрессии [Сагпето11а В. е! а1. Ат 1 Ра1йо1 1999; 154:1345-1352], при котором иммуногистохимический анализ показывает, в основном, периваскулярное окрашивание.
Домен С тенасцина-С не удается обнаружить в большинстве нормальных взрослых тканей, однако его экспрессия повышена в астроцитомах высокой степени злокачественности (Ыдй-дтабе) [Сагпето11а В. е! а1. Ат 1 Ра1йо1 1999; 154:1345-1352] и других типах опухолей. Дальнейшее подтверждение существования гетерогенности среди больших изоформ тенасцина-С дал анализ транскрипции, который подтвердил, что транскрипты большого тенасцина-С имеют гетерогенный состав [Ка!епкатр К. е! а1. 1 Ра1йо1 2004; 203:771-779]. Дополнительный уровень сложности обусловлен присутствием или отсутствием посттрансляционных модификаций (например, гликозилирования), которые могут изменить определенные эпитопы на поверхности отдельных доменов белка и сделать их недоступными для специфичного молекулярного распознавания специфичными моноклональными антителами ш уйго или ш у1уо.
Несмотря на то, что существующие ш уйго методики позволяют быстро выделить антитела, специфичные практически к любому белку, что такие антитела не обязательно будут распознавать данный эпитоп в биологических образцах или в модели болезни на животном. Возможные причины отсутствия связывания ш у1уо включают посттрансляционные модификации эпитопа, маскирование эпитопа и недостаточные специфичность или стабильность антитела. Поэтому трудно оценивать пригодность моноклональных антител для практического применения, основываясь лишь на их способности реагировать с рекомбинантыми антигенами (или фрагментами антигенов) при обычных способах твердофазного анализа, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А), который обычно применяют для скрининга моноклональных антител.
Следовательно, чтобы оценить пригодность для применения в диагностике и терапии, моноклональные антитела к отдельным доменам больших изоформ тенасцина-С необходимо анализировать отдельно.
Авторы настоящего изобретения выделили фрагменты моноклонального антитела человека, специфичные к разным эпитопам, которые находятся в пределах области тенасцина-С, подвергающейся альтернативному сплайсингу. Эти антитела характеризуются способностью распознавать большие изоформы тенасцина-С в биологических образцах, а также высокоспецифичным связыванием при исследовании способом твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А), и при этом прекрасно различают друг от друга близкородственные антигены.
Один из аспектов настоящего изобретения обеспечивает элемент, который связывает тенасцин-С человека, в частности большую изоформу тенасцина-С.
Предпочтительные специфично связывающие элементы специфичны к опухолям и связывают опухоли предпочтительнее, чем нормальные ткани. Специфично связывающие элементы могут, например, связывать строму и/или нео- и периваскулярные структуры опухолевых тканей предпочтительнее, чем нормальные ткани.
Специфично связывающий элемент может связывать большую изоформу тенасцина-С предпочтительнее, чем малую изоформу тенасцина-С.
В некоторых способах реализации специфично связывающий элемент может связывать домен А1 тенасцина-С. Подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область
- 1 013537 тяжелой цепи (УН-домен), выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи 4Α1-Ρ16, которая имеет последовательность 8ЕО ГО N0: 2, вариабельной области тяжелой цепи 3Α1-Ό5, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 12, и вариабельной области тяжелой цепи, содержащей один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей 8Е0 ГО N0: 5, 8Е0 ГО N0: 6, 8Е0 ГО N0: 7 и 8Е0 ГО N0: 13; и/или вариабельную область легкой цепи антитела (УЪ-домен), которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 4 или 8Е0 ГО N0: 50, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок легкой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей 8Е0 ГО N0: 8, 8Е0 ГО N0: 9 и 8Е0 ГО N0: 10.
Например, подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область легкой цепи 4Α1-Ρ16/3Α1-Ό5, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 4 или 8Е0 ГО N0: 50, и/или вариабельную область тяжелой цепи 4Α1-Ρ16, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 2, или вариабельную область тяжелой цепи 3Α1-Ό5, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 12.
В других способах реализации специфично связывающий элемент может связывать домен С тенасцина-С. Подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи Е10 (последовательность перечня 8Е0 ГО N0: 15 или 8Е0 ГО N0: 48), вариабельной области тяжелой цепи А12 (8Е0 ГО N0: 25), вариабельной области тяжелой цепи Ρ4 и 611 (8Е0 ГО N0: 29 или 8Е0 ГО N0: 45) и вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей 8Е0 ГО N0: 18, 8Е0 ГО N0: 19, 8Е0 ГО N0: 20, 8Е0 ГО N0: 26 и 8ЕО ГО N0: 27; и/или вариабельную область легкой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области легкой цепи, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 17 или 8Е0 ГО N0: 81, вариабельной области легкой цепи Ρ4, которая имеет последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 31 или 8Е0 ГО N0: 83, вариабельной области легкой цепи 611, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 35 или 8Е0 ГО N0: 47, и вариабельной области легкой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей 8Е0 ГО N0: 21, 8Е0 ГО N0: 22, 8Е0 ГО N0: 23, 8Е0 ГО N0: 32 и 8Е0 ГО N0: 33.
Так, в одном из примеров специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи антитела, выбранную из группы, включающей вариабельную область тяжелой цепи Е10 (8Е0 ГО N0: 15 или 8Е0 ГО N0: 48), вариабельную область тяжелой цепи А12 (8Е0 ГО N0: 25) и вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, имеющий последовательность аминокислот, выбранную из 8ЕО ГО N0: 18, 8ЕО ГО N0: 19, 8ЕО ГО N0: 20, 8ЕО ГО N0: 26 и 8ЕО ГО N0: 27; и/или вариабельную область легкой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области легкой цепи, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 17 или 8Е0 ГО N0: 81, и вариабельной области легкой цепи, содержащей один или более гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей 8ЕО ГО N0: 21, 8ЕО ГО N0: 22 и 8ЕО ГО N0: 23.
Например, подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область легкой цепи Е10/А12 (8Е0 ГО N0: 17 или 8Е0 ГО N0: 81), и/или вариабельную область тяжелой цепи Е10 (8Е6 ГО N0: 15 или 8Е0 ГО N0: 48), или вариабельную область тяжелой цепи А12 (8Е0 ГО N0: 25).
В другом примере специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи Ρ4 и 611 (8Е0 ГО N0: 29 или 8Е0 ГО N0: 45) и вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей 8Е0 ГО N0: 18, 8ЕО ГО N0: 19 и 8ЕО ГО N0: 20; и/или вариабельную область легкой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области легкой цепи Ρ4 (8Е0 ГО N0: 31 или 8Е0 ГО N0: 83), вариабельной области легкой цепи 611 (8Е6 ГО N0: 35 или 8Е0 ГО N0: 47) и вариабельной области легкой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей 8Е0 ГО N0: 32, 8Е0 ГО N0: 33, 8Е0 ГО N0: 22 и 8Е0 ГО N0: 23.
Например, подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи Ρ4/611, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 29 или 8Е0 ГО N0: 45, и/или вариабельную область легкой цепи Ρ4, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 31 или 8Е0 ГО N0: 83, или вариабельную область легкой цепи 611, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 35 или 8ЕО ГО N0: 47.
В другом способе реализации специфично связывающий элемент связывает домен Ό тенасцина-С. Предпочтительно специфично связывающий элемент связывает домен Ό тенасцина человека. Он может
- 2 013537 давать перекрестную реакцию с изоформой тенасцина мыши. Мы выделили молекулы антител, специфичных к домену Ό. Обозначение исходного клона - Г48. Мы также разработали вариант Г48 с улучшенной афинностью (α.ΓΓίηίΙν таШгсб). обозначенный Ό11. Кроме того, мы разработали вариант Ό11 с улучшенной аффинностью, обозначенный Р12.
Соответственно, подходящий специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи Г48, которая имеет последовательность 8ЕО ГО N0: 58, вариабельной области тяжелой цепи Ό11, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 55, вариабельной области тяжелой цепи Р12, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 52, и вариабельной области тяжелой цепи, которая содержит один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 61, 8Е0 ΙΌ N0: 62, 8Е0 ΙΌ N0: 63, 8ЕО ГО N0: 64, 8Ер ГО N0: 65 и 8ЕО ГО N0: 66, и/или вариабельную область легкой цепи антитела, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области легкой цепи Р12 и Ό11 с последовательностью 8Е0 ГО N0: 53, вариабельной области легкой цепи Г48, которая имеет последовательность 8Е0 ГО N0: 60, и вариабельной области легкой цепи, содержащей один или более гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, который имеет последовательность аминокислот, выбранную из последовательностей перечня 8Е0 ГО N0: 67, 8Е0 ГО N0: 68, 8ЕО ГО N0: 69, 8ЕО ГО N0: 70 и 8ЕО ГО N0: 71.
Обычно вариабельную область тяжелой цепи соединяют с вариабельной областью легкой цепи и получают антигенсвязывающий сайт антитела, хотя, как будет обсуждаться ниже, вариабельную область тяжелой цепи можно применять отдельно для связывания антигена. В одном предпочтительном способе реализации описанную в настоящей заявке вариабельную область тяжелой цепи (т.е. последовательности 8Е0 ГО N08. 2, 12, 15, 25, 29, 45, 48, 52, 56 или 58) соединяют с соответствующей вариабельной областью легкой цепи (т.е. с последовательностями 8Е0 ГО N0: 4 или 8Е0 ГО N0: 50 (для 4Л1-Е16 и 3А1Ό5), 8ЕО ГО N0: 17 или 8ЕО ГО N0: 81 (для А12 и Е10), 8ЕО ГО N0: 31, 8ЕО ГО N0: 83, 8ЕО ГО N0: 35 или 8Е0 ГО N0: 47 для Е4 и 011), 8Е0 ГО N0: 54 для Р12 и Ό11 или 8Е0 ГО N0: 60 для Е48), чтобы сформировать антигенсвязывающий сайт антитела, который содержит обе области: вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи (например, сайт, содержащий обе вариабельные области - тяжелой и легкой цепей - антитела 4А1-Е16, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи 3А1-Э5, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи Е10, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи А12, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи Е4, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи 011, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи Р12, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи Ό11 или вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи Е48). В других способах реализации вариабельную область тяжелой цепи можно соединить с вариабельной областью легкой цепи, отличной от соответствующей (родственной) вариабельной области легкой цепи, предпочтительно с вариабельной областью легкой цепи от специфичного связывающего элемента, который связывает тот же домен тенасцина-С. Многообразие легких цепей хорошо известно в данной области.
Можно взять один или более гипервариабельный участок из вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, описанных в настоящей заявке, и встроить их в подходящий каркас. Подробнее это будет обсуждаться ниже. Гипервариабельные участки (СЭЯ) обычно определяют по Кэботу (КаЬа!). Предпочтительно вариабельная область тяжелой цепи и/или вариабельная область легкой цепи содержит СЭК.1, СГОВ2 и СГОВ3. Гипервариабельный участок СГОВ1 вариабельной области тяжелой цепи 4А1-Е16 представлен последовательностью 8Е0 ГО N0: 5. Гипервариабельный участок СЭК.1 вариабельной области тяжелой цепи 3А1-Э5 представлен 8Е0 ГО N0: 13. Гипервариабельные участки СЭК.2 и СГОР3 вариабельных областей тяжелых цепей 4А1-Е16 и 3А1-Э5 представлены 8Е0 ГО N08. 6 и 7 соответственно. Гипервариабельные участки СЭК.1, СГОВ2 и СЭК.3 вариабельных областей легких цепей 4А1-Е16 и 3А1-Э5 представлены 8Е0 ГО N08. 8, 9 и 10 соответственно. Гипервариабельные участки 0ΌΚ.1 и СГОР2 вариабельной области тяжелой цепи Е10 представлены 8Е0 ГО N08. 18 и 19. Гипервариабельные участки 0ΌΚ.1 и СЭР2 вариабельной области тяжелой цепи А12 представлены 8Е0 ГО N08. 26 и 27. Гипервариабельный участок СЭК.3 вариабельной области тяжелой цепи Е10 и А12 представлен 8Е0 ГО N0: 23. Гипервариабельные участки СГОРЕ СГОВ2 и СГОР3 вариабельной области легкой цепи Е10 и А12 представлены 8Е0 ГО N08. 21, 22 и 23 соответственно. Гипервариабельные участки СГОРЕ СЭК.2 и СГОР3 вариабельной области тяжелой цепи Е4 и 011 представлены 8Е0 ГО N08. 18, 19 и 20 соответственно. Гипервариабельные участки СЭК.1, СГОВ2 и СЭК.3 вариабельной области легкой цепи Г4 представлены 8Е0 ГО N08. 32, 33 и 23 соответственно. Гипервариабельные участки СГОРЕ СГОР2 и 0ΌΚ.3 вариабельной области легкой цепи 011 представлены 8Е0 ГО N08. 32, 22 и 23 соответственно. Гипервариабельные участки вариабельной области тяжелой цепи Р12 представлены 8Е0 ГО N08. 61, 63 и 66 соответственно. Гипервариабельные участки вариабельной области легкой цепи Р12 представлены 8Е0 ГО N08. 67, 69 и 71 соответственно. Гипервариабельные участки вариабельной области тяжелой цепи Ό11 представлены 8Е0 ГО N08. 62, 64 и 66 соответственно. Гипервариабельные участки вариа
- 3 013537 бельной области легкой цепи Ό11 представлены последовательностями 8Е0 Ш N08. 67, 69 и 71 соответственно. Гипервариабельные участки вариабельной области тяжелой цепи Г48 представлен 8Е0 ГО N08. 62, 65 и 66 соответственно. Гипервариабельные участки вариабельной области легкой цепи Г48 представлены 81:0 ГО N08. 68, 70 и71 соответственно.
В некоторых способах реализации специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область легкой цепи антитела, которая содержит один или более СИК3, который имеет последовательность аминокислот, соответствующую последовательности 8Е0 ГО N0: 7, СИК2, который имеет последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 6, и СИК1, который имеет последовательность аминокислот 81:0 ГО N0: 5 или более предпочтительно 81:0 ГО N0: 13.
В других способах реализации специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую один или более СГОКЗ, который имеет последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 20, СИК2, который имеет последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 27 или более предпочтительно 8Е0 ГО N0: 19, и СИК1, который имеет последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 26 или более предпочтительно 81:0 ГО N0: 18.
Специфично связывающий элемент может содержать вариабельную область легкой цепи антитела, которая содержит один или более гипервариабельный участок СИК3, который имеет последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 23, участок СИК2, который имеет последовательность аминокислот 8Е0 ГО N0: 22 или 81:0 ГО N0: 33, и СИК1, который имеет последовательность аминокислот 81:0 ГО N0: 21 или 8ЕО ГО N0: 32.
Предпочтительно специфично связывающий элемент представляет собой молекулу одноцепочечного антитела (зеГу), описанного более подробно далее. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей можно соединить через пептидный линкер, например линкер, имеющий последовательность аминокислот, соответствующую последовательности 8Е0 ГО N0: 37. Обычно линкер имеет последовательность аминокислот, содержащую один или более тандемных повторов какого-либо мотива. Обычно такой мотив представляет собой последовательность из пяти остатков, и предпочтительно по меньшей мере 4 из этих остатков представляют собой О1у или 8ег. Если четыре из пяти остатков представляют собой О1у или 8ег, оставшийся остаток может представлять собой А1а. Более предпочтительно, чтобы каждый из пяти остатков представлял собой О1у или 8ег. Предпочтительными мотивами являются 00008, 88880, О8О8А и 00800 (последовательности 81:0 ГО N08. 76, 77, 78 и 79 соответственно). Предпочтительно такие мотивы в последовательности располагаются рядом, таким образом, чтобы между повторами не было промежуточных остатков. Последовательность линкера может содержать или состоять из одногопяти, предпочтительно трех или четырех повторов такого мотива. Например, линкер с тремя тандемными повторами может иметь одну из следующих последовательностей аминокислот:
666686666866668 - 8ΕΩ Ю N0: 39
888868888688886 - 8ΕΩ Ю N0: 41
6868А6868А6868А-8ΕΩ Ю N0: 42
668666686666866 - 8Е0 ГО N0: 43.
Варианты вариабельных областей тяжелых и легких цепей и гипервариабельных участков, последовательности которых представлены в настоящем описании и которые можно применять для специфично связывающих тенасцин-С элементов, можно получить способами модификации последовательностей или мутации и скрининга. Настоящее изобретение обеспечивает также и такие способы.
Варианты последовательностей аминокислот любых вариабельных областей легких и тяжелых цепей, последовательности которых конкретно указаны в настоящей заявке, также можно применять в соответствии с настоящим изобретением, как указанно в настоящем описании. Конкретные варианты могут включать одно или более изменение в последовательности аминокислот (добавление, делецию, замену и/или вставку остатка аминокислоты), возможно, менее 20 изменений, менее 15 изменений, менее приблизительно 10 изменений или менее приблизительно 5 изменений, 4, 3, 2 или 1 изменение. Изменения можно сделать в одной или нескольких каркасной области и/или одном или более гипервариабельном участке. В частности, можно внести изменения в СИК1 вариабельной области тяжелой цепи, СИК2 вариабельной области тяжелой цепи и/или СИК3 вариабельной области тяжелой цепи, особенно в СИК3 вариабельной области тяжелой цепи.
Специфично связывающий элемент согласно настоящему изобретению может представлять собой элемент, который конкурирует за связывание антигена с каким-либо специфично связывающим элементом, каждый из которых также связывает большую изоформу тенасцина С, в частности ее домены А1 или С, и включает (охватывает) специфично связывающий элемент, вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, либо гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, описанный в настоящей заявке, либо вариант любого из них. Конкуренцию между связывающими элементами можно легко оценить ίη νίΐίο, например посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ЕБ18А) и/или мечения специфичной по отношению к одному из связывающих элементов
- 4 013537 молекулой-репортером, которую можно детектировать в присутствии другого немеченого элемента(ов), чтобы обеспечить идентификацию специфичных связывающих элементов, которые связывают один и тот же эпитоп или перекрывающиеся эпитопы.
Соответственно, еще в одном своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает специфично связывающий элемент, который содержит антигенсвязывающий сайт антитела человека, который конкурирует за связывания тенасцина-С с одним или более из 4Λ1-Ε16, 3Ά1-Ό5, Е10, А12, Е4, 611, Р12, Ό11 и Е48.
В данной области доступны различные способы получения антител против большой формы тенасцина-С, которые могут конкурировать с 4А1-Р16, 3Α1-Ό5, Е10, А12, Е4, 611, Р12, Ό11 или Е48. Такие антитела связывают большую изоформу тенасцина-С предпочтительнее, чем малую изоформу тенасцина-С.
Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения одного или более специфичных связывающих элементов, способных связывать антиген, который включает приведение в контакт с указанным антигеном библиотеки специфичных связывающих элементов согласно настоящему изобретению и отбор одного или более специфичного связывающего элемента из этой библиотеки, способного связывать указанный антиген.
Библиотеку можно разместить на поверхности частиц бактериофага (рйаде Й1кр1ау), каждая из которых содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, расположенную на ее поверхности и, факультативно, вариабельную область легкой цепи, если она также присутствует на поверхности.
После отбора специфично связывающих элементов, способных связывать антиген и расположенных на поверхности частиц бактериофага, можно получить нуклеиновую кислоту из частиц бактериофага, на которых расположен указанный специфично связывающий элемент. Такую нуклеиновую кислоту можно затем применять для получения специфического связывающего элемента или вариабельной области тяжелой цепи антитела (факультативно, вариабельной области легкой цепи антитела) путем экспрессии нуклеиновой кислоты, которая имеет последовательность, аналогичную последовательности нуклеиновой кислоты, полученной из частицы бактериофага, несущей указанный отобранный специфично связывающий элемент.
Вариабельная область тяжелой цепи антитела, которая имеет последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи указанного специфично связывающего элемента, можно получить в выделенном (изолированном) виде, так же как и специфично связывающий элемент, который содержит такую вариабельную область тяжелой цепи.
Затем можно исследовать способность указанного элемента связывать тенасцин-С, а также конкурировать с 4Α1-Ρ16, 3Α1-Ό5, Е10, А12, Е4, 611, Р12, Ό11 или Е48 за связывание тенасцина-С.
Специфично связывающий элемент согласно настоящему изобретению может связывать тенасцинС с аффинностью, равной афинности одного или более из 4Α1-Ρ16, 3Α1-Ό5, Е10, А12, Е4, 611, Р12, Ό11 или Е48, или с большей или меньшей аффинностью.
Аффинность связывания различных специфичных связывающих элементов можно сравнить в подходящих условиях.
В дополнение к последовательностям антител, специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению могут содержать другие аминокислоты, например образующие пептид или полипептид, такой как домен складки, или придающие молекуле другую функциональную характеристику в дополнение к способности связывать антиген.
Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению могут нести детектируемую метку, например, агент, который облегчает выявление опухолей, такой как радионуклид или флюорофор, либо специфичные связывающие элементы можно конъюгировать с агентом, способным запускать какое-либо биологическое событие, таким как радионуклид, фотосенсибилизатор, лекарственное средство, цитокин, предшественник фактора свертывания (крови), токсин или фермент (например, через пептидильную связь или линкер), для применения в способе терапии.
В других своих аспектах настоящее изобретение обеспечивает изолированную нуклеиновую кислоту, которая содержит последовательность, кодирующую специфично связывающий элемент, вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи согласно настоящему изобретению, и способы приготовления специфического связывающего элемента, вариабельной области легкой цепи и/или вариабельной области тяжелой цепи, которые включают экспрессию указанной нуклеиновой кислоты в условиях, обеспечивающих получение указанного специфичного связывающего элемента, вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи, и его выделение.
Описанные в настоящей заявке специфичные связывающие элементы можно применять в способах лечения или диагностики в организме человека или животного, таком как способ лечения (которое может включать профилактическое лечение) расстройства или заболевания, в частности пролиферативного заболевания, такого как рак, у пациента, который представляет собой человека, указанный способ включает введение указанному пациенту эффективного количества специфично связывающего элемента.
Дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту, обычно изолиро
- 5 013537 ванную, кодирующую раскрытую в настоящем описании вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи.
Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту, обычно выделенную, кодирующую раскрытую в настоящем описании последовательность гипервариабельного участка вариабельной области тяжелой цепи или гипервариабельного участка вариабельной области легкой цепи, в частности гипервариабельного участка вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из последовательностей 8ЕО ΙΌ N08. 5, 6, 7, 13, 18, 19, 20, 26 и 27 или гипервариабельного участка вариабельной области легкой цепи, выбранную из 8Е0 ΙΌ N08. 8, 9, 10, 21, 22, 23, 32 и 33.
В другом своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяин, трансформированную нуклеиновой кислотой согласно настоящему изобретению.
Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения вариабельной области тяжелой цепи антитела, который включает осуществление экспрессии с кодирующей нуклеиновой кислотой. Данный способ может включать культивирование клетки-хозяин в условиях, подходящих для получения указанной вариабельной области тяжелой цепи антитела.
Аналогичные способы получения вариабельных областей легкой цепи и специфичных связывающих элементов, содержащих вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи, обеспечены в качестве дополнительных аспектов настоящего изобретения.
Способ получения может включать этап выделения и/или очистки продукта.
Способ получения может включать приготовление продукта в форме композиции, которая содержит по меньшей мере один дополнительный компонент, такой как фармацевтически приемлемый наполнитель.
Ниже эти и другие аспекты настоящего изобретения описаны подробнее.
Терминология
Специфично связывающий элемент.
Этот термин описывает одну молекулу (элемент, составляющую) из пары молекул, которые обладают специфичностью связывания по отношению друг к другу. Элементы специфично связывающейся пары могут быть природного происхождения либо быть полностью или частично синтезированы. Поверхность одного из элементов пары молекул обладает областью или полостью, которая специфично связывает определенную пространственную и полярную структуру другого элемента такой пары молекул, и, следовательно, комплементарна ей. Таким образом, элементы пары обладают свойством специфичного связывания (взаимодействия) друг с другом. Примерами типов специфично связывающих пар являются пары антиген/антитело, биотин/авидин, гормон-рецептор/гормон, рецептор/лиганд, фермент/субстрат. Данная заявка относится к реакциям типа антиген-антитело.
Антитело.
Этот термин описывает иммуноглобулин, природный либо полученный частично или полностью путем синтеза. Данный термин также относится к полипептиду или белку, имеющему связывающую область (домен), которая представляет собой связывающую область антитела или в значительной степени гомологична связывающей области антитела.
Примерами антител являются классы (изотипы) иммуноглобулинов, а также их подклассы, фрагменты, которые содержат антигенсвязывающую область, такие как ЕаЬ, 5сЕу. Εν, 6ЛЬ. Ε6; и бивалентные антитела (61аЬо61е§). Можно использовать моноклональные и другие антитела и применить методики технологии рекомбинантных ДНК, чтобы получить другие антитела или химерные молекулы, которые сохраняют специфичность исходного антитела.
Такие методики могут включать присоединение ДНК, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина или гипервариабельный участок (участок, определяющий комплементарность, СЭЯ) антитела, к константным областям либо к константным областям и каркасным областям другого иммуноглобулина. См., например, ЕР-А-184187, ОБ 2188638А или ЕР-А-239400. Гибридому или другую клетку, продуцирующую антитело, можно подвергнуть генетической мутации или другим модификациям, которые могут привести или не привести к изменению специфичности продуцируемых антител.
Следует иметь в виду, что поскольку антитела можно модифицировать несколькими способами, термин антитело охватывает любой специфично связывающий элемент или вещество, имеющие связывающую область (домен) требуемой специфичности. Следовательно, этот термин охватывает фрагменты, производные и функциональные эквиваленты антител, а также гомологи антител, включая любой полипептид, содержащий связывающую область иммуноглобулина, природную, либо полностью или частично синтетическую. Следовательно, в объем понятия включены и химерные молекулы, содержащие связывающую область иммуноглобулина, либо ее эквивалент, соединенные с другим полипептидом. Клонирование и экспрессия химерных антител описаны в европейских патентах ЕР-А-0120694 и ЕР-А-0125023.
Было показано, что фрагменты целого антитела могут выполнять функцию связывания антигенов. Примерами связывающих фрагментов являются: (ί) фрагменты ЕаЬ, состоящие из следующих областей: вариабельная область легкой цепи (УЪ), вариабельная область тяжелой цепи (УН), константная область легкой цепи (СЬ) и константная область 1 тяжелой цепи (СН1); (и) Εά-фрагмент, состоящий из вариабельной области тяжелой цепи и константной области 1 тяжелой цепи; (ίίί) Εν-фрагмент, состоящий из
- 6 013537 областей вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи одного антитела; (ίν) бАЬ-фрагмент (Шагб, Ε.δ. е! а1., №ш.1ге 341, 544-546 (1989)), который состоит из вариабельной области тяжелой цепи; (ν) изолированные гипервариабельные участки (СЭР); (νί) Е(аЬ')2-фрагменты-бивалентые фрагменты, содержащие два связанных ЕаЬ-фрагмента; (νίί) одноцепочечные молекулы Εν (8θΓν). в которых вариабельные области легкой и тяжелой цепей связаны пептидным линкером, который обеспечивает объединение этих двух областей с образованием антигенсвязывающего сайта (Вйб е! а1., 8с1еисе, 242, 423-426, 1988; Ник!оп е! а1., ΡΝΆ8 υδΑ, 85, 5879-5883, 1988); (νίίί) биспецифичные димеры одноцепочечных Εν (РСТ/υδ 92/09965) и (ίχ) бивалентные фрагменты антител (б1аЬоб1ек), мультивалентные или мультиспецифичные фрагменты, полученные путем соединения генов (ШО 94/13804; Р. НоШдег е! а1., Ргос. №!1. Асаб. δα. υδΑ 90, 6444-6448, 1993). Молекулы Εν, ксЕу или мультиспецифичных фрагментов можно стабилизировать посредством введения дисульфидных мостиков, соединяющих вариабельные области легких и тяжелых цепей (Υ. Вейег е! а1. №ш.1ге В1о!есй 14, 1239-1245, 1996). Также можно получить миниантитела (М1шЬоб1ек), содержащие ксЕу, объединенные с доменом СН3 (δ. Ни е! а1., Сапсег Век. 56, 3055-3061, 1996).
Мультиспецифичные фрагменты антител представляют собой мультимеры полипептидов, где каждый полипептид содержат одну область, содержащую связывающий участок легкой цепи иммуноглобулина, и вторую область, содержащую связывающий участок тяжелой цепи иммуноглобулина, причем эти две области связаны (например, пептидным линкером), но не способны ассоциировать друг с другом с образованием антигенсвязывающего сайта: антигенсвязывающий сайт образуется при ассоциации первой области одного полипептида в составе мультимера со второй областью другого полипептида в составе этого мультимера (ШО 94/13804).
В случае применения биспецифичных антител они могут представлять собой обычные биспецифичные антитела, которые можно получить разнообразными способами (НоШдег, Р. апб Шш1ег 6. Сштеп! Оршшп Вю1ес11по1. 4, 446-449 (1993)), например приготовить химическим способом или из гибридных гибридом, либо они могут представлять собой любой из упомянутых выше биспецифичных фрагментов антител. Можно сконструировать мультиспецифичные фрагменты антител и ксЕу без участка Ес, используя только вариабельные области, что может позволить снизить эффекты антиидоптипической реакции.
Биспецифичные фрагменты (б1аЬоб1ек) в отличие от полных биспецифичных антител также могут быть особенно полезны, поскольку их можно легко сконструировать и экспрессировать в Е.соН. Мультиспецифичные фрагменты антител (и многие другие полипептиды, такие как фрагменты антител) с подходящей специфичностью связывания можно легко выбрать из библиотек при помощи фагового дисплея (ШО 94/13804). Если одно плечо мультиспецифичного фрагмента антитела должно остаться неизменным, например со специфичностью, направленной против антигена X, то можно создать библиотеку, в которой варьируется другое плечо, и выбрать антитело подходящей специфичности. Полные биспецифичные антитела можно получить путем изменения пространственной укладки цепей антител (кпоЬкш!о-йо1ек епдшеегшд 1.В.В. Кзбде^ау е! а1., Рго!еш Епд. 9, 616-621, 1996).
Антигенсвязывающая область.
Этот термин описывает часть антитела, которая содержит область, которая специфичным образом связывает часть антигена или целый антиген и является им комплементарной. Если антиген крупный, антитело может связывать только определенную часть этого антигена, которая называется эпитопом. Антигенсвязывающую область может образовывать одна или более вариабельных областей антитела (например, так называемый Еб-фрагмент антитела, состоящий из вариабельной области тяжелой цепи). Предпочтительно антигенсвязывающая область содержит вариабельную область легкой цепи антитела (УЪ) и вариабельную область тяжелой цепи антитела (УН).
Специфично (специфичный).
Этот термин можно применять к ситуации, в которой один элемент специфично связывающей пары не демонстрирует значительного связывания с молекулами, отличными от его специфично связыва(ющего/емого) партнера(ов). Например, антитело, специфичное к тенасцину-С, либо демонстрирует незначительное связывание, либо не демонстрирует связывания с другими компонентами внеклеточного матрикса, такими как фибронектин. Аналогично антитело, специфичное к большой изоформе тенасцина-С, может либо демонстрировать незначительное связывание, либо не демонстрировать связывания с малой изоформой тенасцина-С. Данный термин применим также в случае, если, например, антигенсвязывающая область специфична к конкретному эпитопу, который несет несколько антигенов. В таком случае специфично связывющий элемент, несущий антигенсвязывающую область, будет способен связывать различные антигены, несущие такой эпитоп.
Содержать.
Этот термин обычно используют в значении включать, другими словами допускать присутствие одного или более свойств или компонентов.
Изолированный/выделенный.
Этот термин относится к состоянию, в котором специфично связывающие элементы согласно настоящему изобретению или нуклеиновые кислоты, кодирующие такие связывающие элементы, будут находиться в соответствии с настоящим изобретением. Элемент и нуклеиновая кислота будут свободны
- 7 013537 или практически свободны от материала, с которым они обычно связаны (ассоциированы), такого как другие полипептиды или нуклеиновые кислоты, с которыми их обычно обнаруживают в их природном окружении, либо в окружении (среде), в котором их получают (например, в культуре клеток) в случае получения по технологии рекомбинантных ДНК, осуществляемой ίη νίίτο или ίη νίνο. Элементы и нуклеиновые кислоты могут быть приготовлены с разбавителями или адъювантами, но для практических целей все равно оставаться изолированными (выделенными). Например, элементы обычно будут смешивать с желатином или другими носителями в случае применения для покрытия микротитрационных планшетов для применения в иммунологическом анализе, либо смешивать с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями для применения в диагностике или терапии. Специфичные связывающие элементы могут быть гликозилированы, либо естественным образом, либо системами гетерологичных эукариотических клеток (например, СНО или N80 (ЕСАСС 85110503), либо они могут быть негликозилированными (например, в случае их получения путем экспрессии в прокариотической клетке).
Под практически соответствующим указанному понимают, что соответствующий гипервариабельный участок или вариабельная область тяжелой или легкой цепи согласно настоящему изобретению либо идентична, либо очень близка указанным участкам, последовательности которых приведены в настоящем описании. Под очень близка подразумевают, что в гипервариабельном участке и/или вариабельной области легкой или тяжелой цепи может быть сделано от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например от 1 до 3, или 1, или 2, или 3, или 4 замен.
Структура, которая будет нести гипервариабельный участок согласно настоящему изобретению, обычно будет состоять из последовательности тяжелой или легкой цепи антитела, либо ее значительной части, в которой гипервариабельный участок расположен в положении, соответствующем положению гипервариабельного участка во встречающихся в природе вариабельных областях тяжелой или легкой цепей (УН и УЪ) антител, кодируемых модифицируемыми генами иммуноглобулина. Структуры и расположение вариабельных областей можно определить, обратившись к КаЬа1, Е.А. е! а1., 8>сс.|испес5 οί Рго1еш8 οί 1ттипо1ощса1 1п1сгс51. 4-е изд., Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, 1987, или к более поздним версиям, доступным в сети Интернет (1ιΙΙρ://ίιηιηι.ιηοΕιικ.η\νιι^6ιι)).
Предпочтительно последовательность аминокислот гипервариабельного участка, практически соответствующую указанной, несет в качестве гипервариабельного участка вариабельная область [иммуноглобулина] человека или ее значительную часть.
Вариабельные области, задействованные в настоящем изобретении, можно получить из любой зародышевой линии или перестройкой вариабельной области человека, либо она может представлять собой синтетическую вариабельную область, в основе которой лежит консенсусная последовательность известной вариабельной области человека. Последовательность гипервариабельного участка согласно настоящему изобретению (например, СЭК.1, СЭР2 или СЭР3) можно встроить в набор вариабельных областей, в которых отсутствует гипервариабельный участок (например, соответствующий СЭК.1, СЭК2 или СЭК.3), при помощи технологии рекомбинантных ДНК.
Например, Магкк е! а1. (Вю/Тескш^^у, 1992, 10:779-783) описывает способы получения наборов вариабельных областей антитела, в которых консенсусные праймеры, направленные к или расположенные рядом с 5'-концом вариабельной области, применяют вместе с консенсусными праймерами к третьей каркасной области генов вариабельной области тяжелой цепи человека, чтобы получить набор вариабельных областей УН без гипервариабельного участка СЭК.3. Магкк е! а1. описывают также, как можно совместить этот набор с СЭК.3 конкретного антитела. При помощи аналогичных методик можно перетасовать ШшГПе) полученные из гипервариабельных участков последовательности согласно настоящему изобретению с наборами вариабельных областей легкой или тяжелой цепи без гипервариабельных участков, и совместить перетасованные вариабельные области легкой или тяжелой цепи с родственной вариабельной областью тяжелой или легкой цепи для получения специфично связывающих элементов согласно настоящему изобретению. Этот набор можно затем ввести в подходящую систему-хозяин, например в систему фагового дисплея согласно XV0 92/01047, для отбора подходящих специфично связывающих элементов. Набор может состоять из любого числа индивидуальных членов, начиная с 104 и выше, например из от 106 до 108 или 1010 членов.
Аналогичные методики перетасовки или комбинаторные методики раскрывает 81еттег (№1иге, 1994, 370:389-391), который описывает такую методику применительно к гену β-лактамазы, но отмечает, что этот подход можно применять для получения антител.
Другая альтернатива - создать не существовавшие ранее вариабельные области легкой или тяжелой цепи, несущие последовательности согласно настоящему изобретению, полученные из гипервариабельных участков, путем случайного мутагенеза одного или более отобранных генов вариабельных областей легкой или тяжелой цепи, чтобы получить мутации во всей вариабельной области. Такая методика описана Сгат е1 а1. (1992, Ргос. №б. Асаб. 8с1. И8А, 9:3576-3580), которые применяли ПЦР-мутагенез (еггогргопе РСК).
Другой способ, который можно применять, - направленный мутагенез гипервариабельных участков генов вариабельной области тяжелой или легкой цепи. Такие методики раскрыты в ВагЬак е! а1. (1994, Ргос. №б. Асаб. 8ск, И8А, 91:3809-3813) и 8сЫег е!а1. (1996, 1. Μο1. Βίο1. 263:551-567).
- 8 013537
Все описанные выше методики как таковые известны в данной области и сами по себе не являются частью настоящего изобретения. Опытный специалист сможет применить такие методики для получения специфично связывающих элементов согласно настоящему изобретению при помощи стандартной методологии данной области.
Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает способ получения антигенсвязывающей области антитела, специфичной к тенасцину-С, которая представляет собой вариант указанной вариабельной области тяжелой цепи, который включает получение посредством добавления делеции, замены или вставки одной или более аминокислот в последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи, соответствующей описанной в настоящей заявке, вариабельной области тяжелой цепи, факультативное совмещение полученной таким образом вариабельной области тяжелой цепи с одной или более вариабельными областями легкой цепи и исследование вариабельной области тяжелой цепи или комбинации или комбинаций вариабельной области тяжелой цепи с вариабельной областью легкой цепи с целью выявления специфического связывающего элемента или антигенсвязывающей области антитела, специфичных к тенасцину-С. Указанная вариабельная область легкой цепи может иметь последовательность аминокислот, которая практически соответствует указанной в настоящей заявке.
В некоторых способах реализации один или более гипервариабельных участков вариабельной области тяжелой цепи, например ΟΌΚ.1, СЭВ2 и/или ΟΌΒ3, может содержать добавление, делецию, вставку или замену одной или более аминокислот.
Можно применять аналогичный способ, включающий получение вариабельной области легкой цепи, которая представляет собой вариант последовательности аминокислот вариабельной области легкой цепи, описанной в настоящей заявке, посредством добавления, делеции, замены или вставки одной или более аминокислот в описанную в настоящей заявке последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи, совмещение полученной таким образом вариабельной области легкой цепи с одной или более вариабельными областями тяжелой цепи и исследование комбинации или комбинаций вариабельной области тяжелой цепи с вариабельной областью легкой цепи с целью выявить специфично связывающий элемент или антигенсвязывающую область антитела, специфичные к тенасцину-С. Указанная вариабельная область тяжелой цепи может иметь последовательность аминокислот, которая практически соответствует указанной в настоящей заявке, или может предоставлять собой вариант последовательности аминокислот вариабельной области тяжелой цепи, которая описана в настоящей заявке, полученный, как описано выше.
В некоторых способах реализации один или более гипервариабельных участков вариабельной области легкой цепи может содержать добавление, делецию, вставку или замену одной или более аминокислот.
Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает способ приготовления специфично связывающего элемента, специфичного к тенасцину-С, который включает:
(a) обеспечение исходного набора нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи, которые либо содержат гипервариабельный участок, который предстоит заменить, либо не имеют области, кодирующей гипервариабельный участок;
(b) объединение такого набора с донорской нуклеиновой кислотой, кодирующей последовательность аминокислот, практически соответствующую указанной в настоящей заявке последовательности гипервариабельного участка вариабельной области тяжелой цепи, для введения указанной донорской нуклеиновой кислоты в гипервариабельный участок в наборе, с целью обеспечить конечный набор нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи;
(c) экспрессию нуклеиновых кислот указанного конечного набора;
(б) отбор специфического связывающего элемента, специфичного к антигену тенасцин-С; и (е) выделение указанного специфического связывающего элемента или кодирующей его нуклеиновой кислоты.
Гипервариабельный участок может представлять собой СЭВ1. СЭВ2 или СЭВ3 вариабельной области тяжелой цепи.
Опять же можно применить аналогичный способ, в котором гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи объединяют с набором нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельную область легкой цепи, которые либо содержат гипервариабельный участок, который следует заменить, либо не содержат область, кодирующую гипервариабельный участок.
Гипервариабельный участок может представлять собой СОК.1, СЭВ2 или СЭВ3 вариабельной области легкой цепи.
Аналогично, можно привить один или более либо все три гипервариабельных участка в набор вариабельных областей тяжелой или легкой цепей, среди которых затем проводят скрининг на специфично связывающий элемент или специфично связывающие элементы, специфичные к тенасцину-С, в частности к большим изоформам тенасцина-С.
Значительная часть вариабельной области иммуноглобулина будет содержать по меньшей мере три гипервариабельных участка вместе с промежуточными каркасными участками. Предпочтительно эта часть будет также содержать по меньшей мере приблизительно 50% первого и четвертого каркасных
- 9 013537 участков (любого из них или обоих), где эти 50% представляют собой С-концевые 50% первого каркасного участка и Ν-концевые 50% четвертого каркасного участка. Дополнительные остатки Ν-концевого или С-концевого конца значительной части вариабельной области могут представлять собой те остатки, которые обычно не ассоциированы с встречающимися в природе участками вариабельных областей. Например, результатом создания специфичных связывающих элементов согласно настоящему изобретению, полученных по технологиям рекомбинантных ДНК, может быть введение Ν- или С-концевых остатков, кодируемых линкерами, введенными с целью облегчить клонирование или другие этапы манипуляций. Другие этапы манипуляций включают введение линкеров для соединения вариабельных областей согласно настоящему изобретению с другими последовательностями белков, включающими тяжелые цепи иммуноглобулина, другие вариабельные области (например, при получении мультиспецифичных фрагментов антител) или белковыми метками, описанное подробнее ниже.
Хотя в предпочтительном аспекте настоящего изобретения предпочтительны специфичные связывающие элементы, содержащие пару вариабельных областей легкой и тяжелой цепи, связывающие области, содержащие либо вариабельную область легкой цепи, либо вариабельную область тяжелой цепи, представляют собой другие аспекты настоящего изобретения. Известно, что отдельные области иммуноглобулина, в частности вариабельные области тяжелой цепи, способны связывать антигены специфичным образом.
Что касается любой из одноцепочечных специфичных связывающих областей, эти области можно использовать для проведения скрининга на комплементарные области, способные образовывать двухдоменный специфично связывающий элемент, способный связывать тенасцин-С.
Этого можно достигнуть способами скрининга с использованием фагового дисплея, в которых применяют так называемый иерархический двойной комбинаторный подход, раскрытый в \УО 92/01047, где индивидуальную колонию, содержащую клон либо с легкой, либо с тяжелой цепью (Н или Ь), применяют, чтобы заразить полную библиотеку клонов, кодирующих другую цепь (легкую или тяжелую, Ь или Н), и полученные в результате двухцепочечные связывающие элементы отбирают по методикам фагового дисплея, описанным в указанном источнике. Эта методика также раскрыта в Магкк е1 а1., там же.
Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать константные области антитела или их части. Например, вариабельную область легкой цепи можно по ее С-концу присоединить к константным областям легкой цепи, включая цепи Ск или Сл антител человека, предпочтительно цепи Ск. Аналогично, специфично связывающий элемент на основе вариабельной области тяжелой цепи можно присоединить по его С-концу к полной тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, полученным из иммуноглобулина любого класса, например 1дС. 1дА, 1дЕ и 1дМ, и из любого подкласса этих классов, в частности 1дО1 и 1дО4.
Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению можно снабжать детектируемой или функциональной меткой.
Детектируемые метки могут включать радионуклиды, такие как йод-131, иттрий-90, индий-111 и технеций-99, которые можно присоединять к антителам согласно настоящему изобретению, применяя стандартные реагенты, известные в области визуализации антител. Специфично связывающий элемент, помеченный радиоактивным изотопом, можно применять для того, чтобы селективно направлять излучение на конкретную мишень, такую как опухоль. Это может быть полезно для визуализации опухолей или доставки цитотоксической дозы излучения, как описано ниже.
Другие детектируемые метки могут включать ферментные метки, такие как пероксидаза хрена, химические элементы, такие как биотин, которые можно детектировать посредством связывания со специфическим когнатным детектируемым компонентом, например меченым авидином, флюорохромами, такими как флюоресцеин, родамин, фикоэритрин и техасский красный (Техак Кеб), а также флюорофорами ближнего инфракрасного диапазона, включая производные цианинового красителя, такие как Су 7 (Атегзйат Рйагтае1а) и А1еха750 (Мо1еси1аг ргоЬек).
В других способах реализации детектируемая метка может содержать производное микропузырьков, которое определяется при (бокерй 8. е1 а1. Рйагт Кек. 2004 1ип; 21(6):920-6), или магнитную частицу (8сйе11епЬегдег Е.А. е1 а1. Вюсоищд. СЬет. 2004 8ер-Ос1; 15(5): 1062-7).
Функциональная метка может включать агент, который способен запускать какое-либо биологическое событие или обладает противораковым действием. Подходящие метки включают радионуклиды, фотосенсибилизаторы, полипептиды-токсины, токсичные синтетические молекулы и другие лекарственные средства, цитокины (например, 1Ь2, 1Ь12, ΤΝΡ), хемокины, предшественники факторов свертывания (например, тканевой фактор), ферменты, липосомы и факторы иммунного ответа (см., например, Ό. Νοπ (2004) СН1М1А Титог Тагдебпд (нацеливание на опухоли), т. 58, стр. 723-726).
Радионуклиды включают йод-131, иттриум-90, индий-111 и технеций-99. Они более подробно описаны выше.
Токсин, представляющий собой полипептид или пептид, обладает цитотоксической или апоптотической активностью и может быть получен из источника, представляющего собой микроорганизм, растение, животное или человека. В некоторых способах реализации токсин-полипептид можно ввести непо- 10 013537 средственно в константные области специфично связывающего элемента. Примеры токсинаполипептида включают экзотоксин Ркеиботопак, α-цепь рицина и ангиогенин.
Синтетические токсические молекулы включают химические соединения, обладающие цитотоксической активностью, включая, например, агенты, образующие комплексы с ДНК, агенты или ингибиторы клеточного цикла. В некоторых способах реализации высвобождение токсической молекулы может происходить вблизи клетки-мишени благодаря расщеплению рН- или ферментчувствительного линкера (например, линкеров, содержащих иминовые связи). Примеры токсических синтетических молекул включают мейтанзин (тау1ап81пе), калдихимицин (сайсйеатюш), эпотилон (ероЛЛопе) и тубулизин (1иЬи1укт), а также их производные.
Факторы иммунного ответа могут включать специфичные связывающие элементы, которые связываются с иммунными клетками-эффекторами. Связывание специфического связывающего элемента может вызывать клеточный иммунный ответ против клетки-мишени.
В предпочтительных способах реализации специфично связывающий элемент согласно настоящему изобретению конъюгируют с цитокином. Можно получить рекомбинантный белок, содержащий специфично связывающий элемент или полипептид, являющийся его компонентом (например, тяжелую цепь или легкую цепь состоящего из нескольких цепей фрагмента антитела, такого как ЕаЬ), и цитокин. Так, например, можно объединить вариабельную область легкой или тяжелой цепи специфичного связывающего элемента согласно настоящему изобретению с цитокином. Обычно специфично связывающий элемент и цитокин соединяют посредством пептидного линкера, например пептида, из приблизительно 5-25 остатков, например 10-20 остатков, предпочтительно 15 остатков. В настоящем описании приведены подходящие примеры пептидных линкеров. Предпочтительно цитокин представляет собой 1Ь2, более предпочтительно - 1Ь2 человека. Цитокин можно присоединять в направлении, обратном транскрипции (Ν-конец), или в направлении, совпадающем с направлением транскрипции (С-конец) (ирйгеат или 6о\уп51геат). от специфичного связывающего элемента или полипептида, являющегося его компонентом. Предпочтительный способ реализации представляет собой рекомбинантный белок, содержащий специфично связывающий элемент (в частности, молекулу антитела, например молекулу 5сЕ\г) согласно настоящему изобретению и 1Ь2. Последовательности аминокислот таких рекомбинантных белков и нуклеиновые кислоты, содержащие кодирующие их последовательности нуклеотидов, составляют часть настоящего изобретения.
Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению могут быть полезными в способах диагностики, таких как визуализация опухолей, или в лечении пациентов - животных или людей, например, при раковых заболеваниях.
Соответственно, дальнейшие аспекты настоящего изобретения обеспечивают способы лечения, включающие введение предусмотренного специфичного связывающего элемента, фармацевтической композиции, содержащей такой специфично связывающий элемент, и применение такого специфично связывающего элемента в производстве лекарственного средства для введения, например, в способе изготовления лекарственного средства или фармацевтической композиции, включающем разработку рецептуры специфичного связывающего элемента с фармацевтически приемлемым носителем.
Специфично связывающий элемент для применения в способе лечения предпочтительно конъюгируют или связывают с функциональной меткой, которая обеспечивает противоопухолевый эффект. В предпочтительных способах реализации, как упоминалось выше, специфично связывающий элемент конъюгирован с цитокином, например 1Ь2.
Клинические показания, при которых можно применять описанный в настоящей заявке специфично связывающий элемент для обеспечения полезного терапевтического действия, включают пролиферативные заболевания, такие как предраковые и злокачественные новообразования и опухоли (например, гистоцитома, астроцитома, остеома), рак (например, рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак желудочно-кишечного тракта, рак кишечника, колоректальный рак, карцинома молочной железы, карцинома яичников, рак простаты, рак яичка, рак печени, рак почки, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак мозга, саркома, остеосаркома, саркома Капоши, меланома), лейкемии и ангиогенные заболевания.
Предраковые или злокачественные заболевания могут возникать в любых типах клеток, включая, без ограничения, легкое, толстую кишку, молочную железу, яичник, предстательную железу, печень, мозг и кожу.
Пролиферативное заболевание, подходящее для описанного в настоящей заявке лечения, может характеризоваться присутствием клеток или тканей, в которых повышена или увеличена экспрессия крупных изоформ тенасцина-С, в частности больших изоформ, содержащих домены А1 или С.
В соответствии с настоящим изобретением предусмотренные композиции можно вводить индивидуумам. Предпочтительно осуществляют введение терапевтически эффективного количества, достаточного для того, чтобы продемонстрировать благоприятное для пациента действие. Такое благоприятное действие может представлять собой, по меньше мере, облегчение одного из симптомов.
Фактически вводимое количество, доза и время введения будут зависеть от природы и тяжести состояния, которое лечат. Ответственность за предписания лечения, например решения относительно дози- 11 013537 ровок и т.д., несут врачи общей практики (терапевты) и другие врачи. Подходящие дозы антитела хорошо известны в данной области; см. Ьебегтапп ЕЛ. е! а1. (1991) Ιηΐ 1. Сапсег 47: 659-664; Вадкйате Κ.Ό. е! а1. (1991) АпбЬобу, 1ттипосои)ида1ек апб Вабюрйагтасеибсак (Антитело, иммуноконъюгаты и радиофармацевтические препараты) 4: 915-922.
Точная доза будет зависеть от ряда факторов, включая следующие: предназначено ли антитело для диагностики или лечения, размер и положение участка, который предстоит лечить, конкретная природа антитела (например, целое антитело, фрагмент или мультиспецифическое антитело) и природа любой детектируемой метки или другой молекулы, присоединенной к антителу. Обычно доза антитела будет лежать в диапазоне от 0,5 мг до 100 г для систематического применения и от 10 мкг до 1 мг для местного применения. Обычно антитело будет представлять собой целое антитело предпочтительно класса 1дО1 или 1дС4. Доза дана для самостоятельного лечения (только антителом) взрослого пациента, ее можно пропорционально изменять для детей и младенцев, а также для других форматов антител пропорционально молекулярной массе. Применение можно повторять ежедневно, дважды в неделю, еженедельно или с месячными интервалами, согласно решению врача.
Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению обычно будут вводить в форме фармацевтической композиции, которая может содержать по меньшей мере один компонент в дополнение к специфично связывающему элементу.
Соответственно, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению и для применения в соответствии с настоящим изобретением могут содержать, в дополнение к активному компоненту, фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, известные специалистам в данной области. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны снижать эффективность активного компонента. Точная природа носителя или другого материала будет зависеть от пути введения, который может представлять собой пероральное ведение или введение путем инъекции, например внутривенной.
Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть в форме таблетки, капсулы, порошка или в жидкой форме. Таблетка может содержать твердый носитель, такой как желатин, или адъювант. Жидкие фармацевтические композиции обычно содержат жидкий носитель, такой как вода, петролейные, животные или растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. Такие композиции могут содержать физиологический раствор, раствор декстрозы или другого сахарида, либо гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.
Для внутривенных инъекций или инъекций в очаг поражения активный компонент будет иметь форму пригодного для парентерального введения раствора, который является апирогенным и имеет подходящие рН, изотоничность и стабильность. Лица, обладающие соответствующим опытом в данной области, смогут приготовить подходящие растворы, используя, например, изотонические разбавители, такие как 8обшт СЫопбе 1п)ес1юп (раствор хлорида натрия для инъекций), Втдег'к 1п)ес1юп (раствор Рингера для инъекций), Ьас1а1еб Втдег'к 1п)ес1юп (лактатный раствор Рингера). При необходимости можно включить в композицию консерванты, стабилизаторы, буферы и/или другие добавки.
Композицию можно вводить отдельно или в комбинации с другими способами лечения либо одновременно, либо последовательно, в зависимости от заболевания, которое следует лечить. Другие способы лечения могут включать введение обезболивающих лекарств, таких как нестероидные противовоспалительные лекарства (например, аспирин, парацетамол, ибупрофен или кетопрофен), или опиаты, такие как морфин, либо противорвотных средств.
Дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает способ обнаружения и/или визуализации опухолевых клеток, включающий введение описанного в настоящей заявке антитела индивидууму и детектирование связывания указанного антитела с опухолевыми клетками в организме указанного индивидуума.
Предпочтительные антитела для применения в таких способах можно конъюгировать или связывать с детектируемой меткой, такой как радионуклид или флюорофор.
Способ согласно настоящему изобретению может включать стимуляцию или допущение связывания обеспеченного настоящим изобретением специфично связывающего элемента с тенасцином-С. Как уже отмечалось, такое связывание может иметь место ш у1уо, например, после введения специфического связывающего элемента или нуклеиновой кислоты, кодирующей специфично связывающий элемент.
Можно определять параметры (количественные характеристики) связывания специфично связывающего элемента с тенасцином-С. В некоторых способах реализации можно определять связывание специфично связывающего элемента с образцом, взятым у пациента. В других способах реализации можно определять связывание специфичного связывающего элемента с антигеном т у1уо, например, в визуализации или детектировании опухолей в организме индивидуума.
Можно осуществлять количественную оценку количества антигена, что может представлять диагностический интерес.
Связывание антител можно определять любыми подходящими средствами. Например, антитело можно связать или конъюгировать с молекулой-репортером или детектируемой меткой и определять присутствие, количество или локализацию метки или репортера в образце.
- 12 013537
Связывание антитела ίη νίνο, например, в способе визуализации молекул можно определять путем радиоактивного детектирования (например, РЕТ (позитронно-эмиссионная томография), БРЕСТ (однофотонная эмиссионная компьютерная томография)), визуализации способом флюоресценции в ближнем диапазоне инфракрасного излучения (например, диффузная оптическая томография, эндоскопия), ультразвук (например, с нацеленными производными микропузырьков) и магнитно-резонансная томография (с нацеленными магнитными частицами).
В других способах реализации связывание антитела может происходить ίη νίΐτο, например, при твердофазном иммуноферментном анализе (ЕЬ18А), Вестерн-блоттинге, иммуноцитохимическом анализе, иммунопреципитации или аффинной хроматографии.
Способ обнаружения и/или визуализации клеток опухоли может, таким образом, включать приведение описанного в настоящей заявке антитела в контакт с образцом, полученным у пациента, и определение связывания указанного антитела с клетками опухоли в указанном образце.
Предпочтительные антитела для применения в таких ίη νίΐτο способах можно конъюгировать или связывать с молекулой-репортером. Молекула-репортер может представлять собой радионуклид, флюорохром, люминисцирующий или лазерный краситель со спектрально обособленными характеристиками испускания или поглощения. Подходящие флюорохромы включают флюоросцеин, родамин, фикоэритрин и техасский красный (Техак Кеб). Подходящие хромогенные красители включают диаминобензидин. Для визуализации ίη νίνο предпочтительны радионуклиды или флюорофоры.
Другие репортеры включают макромолекулярные коллоидные частицы или конкретный материал, такой как латексные гранулы с красителем, магнитным или парамагнитным, а также биологически или химически активные агенты, которые могут прямо или опосредованно порождать детектируемые сигналы, которые можно наблюдать визуально, детектировать при помощи электронных средств либо регистрировать другими способами. Эти молекулы могут представлять собой ферменты, которые катализируют реакции, в которых развивается или меняется окраска, или вызывают изменение электрических свойств, например. Они могут представлять собой возбудимые молекулы, благодаря чему переход между различными энергетическими состояниями порождает поглощение или излучение с определенным спектром. Они могут включать химические элементы, применяемые совместно с биосенсорами. Можно применять следующие системы детектирования: биотин/авидин или биотин/стрептавидин и щелочная фосфатаза.
Способ определения связывания не является признаком настоящего изобретения, и специалисты в данной области смогут выбрать подходящий способ, руководствуясь своими знаниями и предпочтениями.
Настоящее изобретение охватывает также специфично связывающий элемент, который конкурирует за связывание тенасцина-С с любым другим связывающим элементом, который связывает тенасцин-С, и содержит вариабельную область, включая гипервариабельный участок с последовательностью аминокислот, практически совпадающей с указанной в настоящей заявке (например, описанный в настоящей заявке специфично связывающий элемент). Конкуренцию между связывающими элементами можно легко исследовать ίη νίΐτο, например, посредством присоединения специфической молекулы-репортера к одному из связывающих элементов, которую можно детектировать в присутствии другого связывающего элемента (элементов) без меток, чтобы обеспечить идентификацию специфично связывающих элементов, которые связывают один и тот же эпитоп или перекрывающиеся эпитопы. Конкуренцию можно определять при помощи стандартных методик, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А).
При исследовании конкуренции можно применять фрагмент антигена, представляющий собой пептид, в частности пептид, содержащий представляющий интерес эпитоп. Можно применять пептид, имеющий последовательность эпитопа, а также одну или более аминокислот на любом из концов. Про такой пептид можно сказать, что он состоит практически из указанной последовательности. Специфичные связывающие элементы согласно настоящему изобретению могут быть такими, что их связывание с антигеном ингибирует пептид, который имеет данную последовательность или содержит ее. В исследовании этого факта можно применять белок с любой последовательностью плюс одна или более аминокислот. Подходящие пептиды можно получить из последовательностей доменов Ό, С и/или А1 тенасцина-С.
Специфичные связывающие элементы, которые связывают конкретный белок, можно выделить, например, из библиотеки фагового дисплея путем пэннинга (отбор посредством взаимодействия с (пропускания над) иммобилизованным лигандом) с пептидом (пептидами).
Настоящее изобретение также обеспечивает выделенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует специфично связывающий элемент согласно настоящему изобретению.
Нуклеиновая кислота включает ДНК и РНК. В предпочтительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, которая кодирует гипервариабельный участок вариабельной области легкой или тяжелой цепи, которые определены выше.
Настоящее изобретение также обеспечивает конструкты в форме плазмид, векторов, кассет транскрипции или экспрессии, которые содержат по меньшей мере один из описанных выше полинуклеотидов.
- 13 013537
Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантную клетку-хозяин, которая содержит один или более из указанных выше конструктов. Нуклеиновая кислота, кодирующая любой гипервариабельный участок, вариабельную область легкой цепи или тяжелой цепи или специфично связывающий элемент, сама по себе составляет один из аспектов настоящего изобретения, как и способ получения кодируемого продукта, который включает его экспрессию с кодирующей нуклеиновой кислоты. Экспрессию можно легко осуществить посредством культивирования рекомбинантных клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, в подходящих условиях. После получения вариабельной области тяжелой или легкой цепи, либо специфично связывающего элемента, путем экспрессии, их можно выделить и/или очистить, применяя любую подходящую методику, а затем применять соответствующим образом.
Специфичные связывающие элементы и/или вариабельные области тяжелой или легкой цепи, а также молекулы кодирующей нуклеиновой кислоты и векторы согласно настоящему изобретению можно обеспечивать в выделенном и/или очищенном виде, например, из (от) их естественного окружения, в практически чистой или гомогенной форме, либо, в случае нуклеиновой кислоты, свободными или практически свободными от нуклеиновых кислот или генов, отличающихся по происхождению от последовательности, кодирующей полипептид с необходимой функцией. Нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению может содержать ДНК или РНК и может быть полностью или частично синтетической. Ссылка на описанную в настоящей заявке последовательность нуклеотидов охватывает молекулу ДНК с указанной последовательностью, а также молекулу РНК с указанной последовательностью, в которой и (урацил) заменен на Т (тимин), если не указано другое.
Системы для клонирования и экспрессии полипептида в разнообразных клетках-хозяевах хорошо известны. Подходящие клетки-хозяева включают системы бактерий, клеток млекопитающих, дрожжей, а также бакуловирусы. Доступные в данной области для экспрессии гетерологичного полипептида линии клеток млекопитающих включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почек новорожденных хомячков (ВНК), клетки меланомы мыши N80 и многие другие. Традиционно предпочтительным хозяином является Е. сой.
Экспрессия антител и фрагментов антител в клетках прокариот, таких как Е. сой, хорошо разработана в данной области. Обзор можно найти, например, в Р1пск1йип, Α. Вю/Тесйпо1оду 9: 545-551 (1991). Специалистам в данной области также доступна экспрессия в эукариотических клетках, как дополнительная возможность для получения специфично связывающего элемента; обзор можно найти, например, в Век. М.Е. (1993) Сигг. Оршюп Вю!есй. 4: 573-576; Тп11 1.1. е! а1. (1995) Сигг. Оршюп Вю!есй 6: 553-560.
Можно выбрать или создать подходящие векторы, содержащие соответствующие регуляторные последовательности, включая последовательности промоторов, последовательности терминаторов, последовательности полиаденилирования, последовательности энхансеров, гены-маркеры и другие подходящие последовательности. В случае необходимости векторы могут представлять собой плазмиды, вирусные векторы, например фаг или фагмиду. Более подробную информацию можно найти, например, в Мо1еси1аг С1ошпд: а Ьайога1огу Мапиа1 (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство), 2-е изд., 8атйгоок е! а1., 1989, Со1й 8ргшд Нагйог Ьайога1огу Рге55. Многие известные методики и протоколы манипуляций с нуклеиновой кислотой, например, в приготовлении конструктов нуклеиновой кислоты, мутагенезе, введении ДНК в клетки и экспрессии генов, а также в анализе белков подробно описаны в 2-м изд. Сиггеп! Рго!осо1§ ш Мо1еси1аг Вю1оду (Современные протоколы в молекулярной биологии), под ред. Ли5иЬе1 е! а1., 1ойп \УПеу & 8оп§, 1992. Описания Батйгоок е! а1. и Ли5иЬе1 е! а1. включены в настоящую заявку путем ссылки.
Соответственно, дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает клетку-хозяин, содержащую описанную в настоящей заявке нуклеиновую кислоту. Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает способ, включающий введение такой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин. Введение может задействовать любую доступную методику. Для эукариотических клеток подходящие методики могут включать кальций-фосфатную трансфекцию, ДЭАЭ-декстран, электропорацию, трансфекцию при помощи липосом и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса, например вируса осповакцины, или для клеток насекомых бакуловируса. Для клеток бактерий подходящие методики могут включать трансформацию с применением хлорида кальция, электропорацию и трансфекцию с применением бактериофага.
За введением может следовать стимулирование или допущение экспрессии с нуклеиновой кислотой, например, посредством культивирования клеток-хозяев в условиях, подходящих для экспрессии данного гена.
В одном способе реализации нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению встраивают в геном (например, в хромосому) клетки-хозяин. Встраивание можно стимулировать путем введения последовательностей, которые стимулируют рекомбинацию с геномом, в соответствии со стандартными методиками.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ, который включает применение описанного выше конструкта в системе экспрессии для экспрессии специфично связывающего элемента или полипептида, описанных выше.
Другие способы включают конъюгирование или связывание описанного в настоящей заявке специ- 14 013537 фично связывающего элемента с детектируемой меткой или противораковым агентом.
Подходящие метки и агенты описаны выше. Метки и агенты можно конъюгировать со специфично связывающим элементом, применяя стандартные химические средства.
Ниже некоторые аспекты и способы реализации настоящего изобретения будут проиллюстрированы посредством примеров со ссылками на следующие эксперименты.
В свете настоящего описания для специалиста в данной области будут очевидны разнообразные дальнейшие аспекты и способы реализации настоящего изобретения. Все документы, упомянутые в данном описании, полностью включены в него путем ссылки.
Настоящее изобретение охватывает все до единой комбинации и подкомбинации описанных выше признаков.
Ниже некоторые аспекты и способы реализации настоящего изобретения будут проиллюстрированы посредством примеров со ссылками на описанные фигуры и таблицу.
Фиг. 1 - схематическое изображение малой (А) и большой (В) изоформ тенасцина-С. Некоторые домены, подобные фибронектину III типа, подвергаются альтернативному сплайсингу, в результате которого они либо включаются (В), либо не включаются (А) в молекулу.
Фиг. 2 - биораспределение антитела 4Α1-Ρ16-8ΙΡ у мышей пибе с ксенотрансплантатом опухоли И87. (А) Цифры представляют средний процент от введенной путем инъекции дозы на грамм ткани в группе из трех мышей, через 3 (выше) и 6 (ниже) ч после инъекции. Усы обозначают стандартное отклонение.
Фиг. 3 - биораспределение антитела 4Α1-Ρ16-8ΙΡ в безтимусных мышах (пибе), несущих ксенотрансплантат опухоли И87. (А) Цифры представляют средний процент от введенной путем инъекции дозы на грамм ткани в группе из трех мышей, через 24 (выше) и 48 (ниже) ч после инъекции. Усы обозначают стандартное отклонение.
Фиг. 4 - альтернативное представление данных о биораспределении, показанных на фиг. 2 и 3.
Фиг. 5 - биораспределение 8ΙΡ(Ρ12). Мышам с подкожным ксенотрансплантатом опухоли - глиобластомы человека И87, вводили путем инъекции 3,5 мкг 8ΙΡ(Ρ12). Каждая временная точка представлена четырьмя животными.
Пример 1.
Ген, кодирующий домен А1 тенасцина-С человека клонировали посредством ПЦР в реальном времени с мРНК, выделенной из нормальных фибробластов кожи (ΝΗΌΡ), которые культивировали при рН 7,5 в отсутствие сыворотки с использованием олигонуклеотидов ТпС-ΑΙ ВатН1 Ьа (сддда!сс!ссас!даасаадсссс!дад) и ТпС-ΑΙ ВдШ для (ддада!с!йсссс!д1ддаддсс!садс) [16]. Затем этот ген клонировали в бактериальный вектор экспрессии рОЕ12 (Ц|адеп) и экспрессировали в Е.сой ТС-1. Очистку проводили посредством Ηίκ-метки на Νί-нитрилацетат-сефарозе (смола, нагруженная никелем ^адеп)).
Перед селекцией очищенный домен А1 биотинилировали, сульфо-NΗ8-88-биотином (Пегсе). Биопэннинг (Вюрапшпд) проводили, как описано в (νίίί Ρ., е! а1. Ме!йоб§ Епхуто1 2000; 326:480-505). Вкратце, биотинилированный белок (конечная концентрация 10-7 М) инкубировали с 600 мкл предварительного блокированного фага библиотеки ЕТН-2 в течение 30 мин. Затем связанные фаги фиксировали путем добавления 5,3х107 покрытых стрептавидином магнитных гранул (Эупа1). После тщательной промывки отобранный фаг элюировали путем восстановления дисульфидной связи в биотиновом линкере. Выделенный фаг амплифицировали в ТО-1 и концентрировали из надосадочной жидкости путем осаждения полиэтиленгликолем. После трех раундов пэннинга проводили скрининг 144 выделенных клонов путем твердофазного иммуноферментного анализа (ΕΜδΑ), выполняемого, как описано в νίίί Ρ., е! а1. Ме!йоб§ Еп/\то1 2000; 326:480-505.
Покрытые стрептавидином планшеты для ИФА (§1гер1а\Ме11 Нщй Вшб, Восйе) инкубировали с биотинилированным антигеном, добавляли надосадочную жидкость колоний индуцированной моноклональной Е.сой ТО-1, экспрессирующей фрагменты антитела 5сЕу. и детектировали связанное антитело моноклональным антителом М2 и конъюгатом антимышиного иммуноглобулина О с пероксидазой хрена (ЦО - ΗΚΡ). Клоны антитела с самыми высокими уровнями сигнала исследовали посредством анализа взаимодействия в реальном времени на приборе ВМсоге 3000. Три самых лучших клона очищали на колонке, загруженной сефарозой с белком А и исследовали способами иммуногистохимии на криосрезах различных опухолей.
Один из клонов, который продемонстрировал селективный характер окрашивания в иммуногистохимическом исследовании, 5сЕу (3Α1-Ό5), выбрали для созревания аффинности. Библиотеку созревания аффинности конструировали в фагмидном векторе, ρΌΝ322 (Тин Α. е! а1. I Вю1 Сйет 1998; 273:2176921776) путем введения случайных мутаций в позициях 31-33 в пределах гипервариабельного участка 1 вариабельной области тяжелой цепи (νΗ ί.ΌΒ1), используя олигонуклеотиды ПЦР ЬМВ3 1опд Ьа (саддааасадс!а!дасса!дайас, праймирующие в направлении, обратном транскрипции от 5'-конца гена антитела) и ΌΡ4 7ί.ΌΒΙιηι.ιΐ Гог (адсс!ддсддасссадс!сдстпптпптппдс!ааадд!даа!ссададдс!дс).
3'-Конец гена антитела амплифицировали, используя праймеры ^Ρ47С^Κ.1 Ьа (дадс!ддд!ссдссаддс!сс) и Гбзец 1опд Гог (дасдйад!ааа!даа!!йс!д1а!дадд). Два фрагмента объединяли путем
- 15 013537
ПЦР с использованием праймеров ЬМВ3 1опд Ьа и Гбзес.] 1опд Гог.
Проводили биопэннинг библиотеки созревания аффинности с биотинилированным антигеном. После двух раундов пэннинга (как описано выше, но используя 10-8М биотинилированного антигена), проводили скрининг всех 382 клонов антитела путем твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А). 69 клонов, которые в анализе ЕЫ8А были положительными, исследовали далее посредством твердофазного ИФА с М2 (М2-ЕЫ8А, 8сйеиегтапп 1. е! а1. 1 1ттипо1 Ме!йобз 2003; 276:129-134), чтобы определить значения коГГ отдельных клонов антител. Вкратце, надосадочную жидкость, содержащую антитела зсЕ:: наносили на поверхность, покрытую моноклональным антителом апй-Е1ад М2 (810МА). После добавления биотинилированного антигена и инкубирования до достижения равновесия добавляли избыток небиотинилированного антигена в качестве конкурента. После конкурирования в течение 0, 30, 60, 90 и 120 мин соответственно детектировали оставшуюся часть биотинилированного антигена, используя конъюгат стрептавидина и пероксидазы хрена.
Для ранжирования различных положительных по результатам ИФА клонов на основе профиля диссоциации применяли В1Асоге. Для очистки на колонке с покрытой антигеном сефарозой отобрали пять лучших клонов. Очищенные антитела подвергали гель-хроматографии, и полученные в результате фракции мономерныых фрагментов антител зсЕ:г применяли для определения констант аффинности и параметров кинетики на приборе В1Асоге 3000.
Антитело с лучшей константой диссоциации (Ко), 4А1-Г16, клонировали в формат бивалентного миниантитела, присоединяя способами генной инженерии последовательность зсΕν(4А1-Ε16) перед 5'концом гена, кодирующего домен СН4 иммуноглобулина Е человека, в результате чего получали маленький иммунный белок (8ΙΡ) (Вогз1 Ь. е! а1. 1п1. 1. Сапсег 2002, 102:75-85), названный 4А1-Г16-81Р. Домен СН4 стимулирует гомодимеризацию, увеличивая функциональную аффинность антитела благодаря более высокой авидности.
Проводили иммуногистохимический анализ с фрагментом антитела 5№ν(3Λ1-Ω5) против домена А1 тенасцина-С на тканях рака головы и шеи. Первичное антитело детектировали посредством пептидной £^0-:43-101, присоединенной к С-концу антитела зсЕ:: используя моноклональное анти-ЕЬА0 антитело М2 (810МА), после чего применяли систему АРААР (комплекс щелочная фосфатазаантищелочная фосфатаза, ОАК0). Обнаружили, что зсΕν(3А1-^5) и зсΕν(4А1-Ε16) сильно окрашивали строму опухоли и неоваскулярные структуры на криосрезах различных типов рака головы и шеи, в то время как с нормальной слизью рта, полученной от здорового донора, они не реагировали.
Способность 4А1-Г16-81Р нацеливаться на опухоль оценивали следующим образом.
Стимулировали образование опухолей у мышей Ва1Ь/С пи/пи путем подкожной инъекции 3х 106 клеток глиобластомы человека И87 (американская коллекция стандартных культур АТСС) на мышь. Через 20-25 дней после инъекции, когда размер опухоли достигал 300-1500 мм3, путем инъекции водили антитело с радиоактивной меткой.
Приготовление антитела включало последующую очистку аффинно-очищенного антитела 4А1-Г168ΙΡ путем гель-хроматографии на колонке с зирегбех 75. Собирали фракцию, представляющую гомодимерную форму (75 КДа), а затем метили ее йодом-125 (Атегзйат), используя йодоген (юбодеп, Р1егсе).
Мышам с опухолями вводили приблизительно 5 мкг антитела в хвостовую вену. Через 3, 6, 24 и 48 ч соответственно умерщвляли трех мышей, вырезали органы и определяли накопление Ι-125 в гаммасчетчике.
Пример 2.
Ген, кодирующий домен С тенасцина-С человека, клонировали в вектор рфЕ12 (Жаден) [Сагпето11а В. е! а1. Ат 1 Ра!йо1 1999; 154:1345-1352, Вака Е. е! а1. ГЕВ8 Ьей 1993; 332:39-43] и экспрессировали в Е.соН Т0-1. Очистку проводили посредством Нщ-метки на №-нитрилацетат-сефарозе (смола, нагруженная никелем Жаден)).
Перед селекцией очищенный домен С биотинилировали сульфо-№Н8-88-биотином (Р1егсе). Биопэннинг проводили, как описано в (Уй1 Г., е! а1. Ме!йобз Епхуто1 2000; 326:480-505), но применяя модифицированную процедуру пэннинга на покрытых стрептавидином и авидином планшетах. Вкратце, биотинилированный белок (конечная концентрация 10-7 М) инкубировали с 600 мкл предварительного блокированного фага библиотеки ЕТН-2 в течение 30 мин. Затем связанные фаги фиксировали на пластиковых микротитрационных планшетах, покрытых авидином (1 и 3 раунды пэннинга) или стрептавидина (2 раунд пэннинга). После тщательной промывки отобранный фаг элюировали путем восстановления дисульфидной связи в биотиновом линкере. Выделенный фаг амплифицировали в Т0-1 и концентрировали из надосадочной жидкости путем осаждения полиэтиленгликолем. После трех раундов пэннинга проводили скрининг нескольких дюжин выделенных клонов путем твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А), выполняемого, как описано в [Уй1 Г., е! а1. Ме1йобз Епхуто1 2000; 326:480-505].
Покрытые стрептавидином планшеты для твердофазного иммуноферментного анализа (8(гер1а\Уе11 Н1дй Втб, Воске) инкубировали с биотинилированным антителом, добавляли надосадочную жидкость колоний индуцированной моноклональной Е.соН Т0-1, экспрессирующей фрагменты антитела зсΕν и детектировали связанное антитело при помощи антитела против пептидной метки и затем конъюгатом
- 16 013537 иммуноглобулина С мыши с пероксидазой хрена (1дС - НКР). Клоны антитела с самыми высокими уровнями сигнала исследовали путем анализа взаимодействия в реальном времени на приборе ΒΙΑοογβ 3000.
Три самых лучших клона очищали на колонке, загруженной сефарозой с белком А, и исследовали способами иммуногистохимии на криосрезах различных опухолей.
Один из клонов, который продемонстрировал селективный характер окрашивания в иммуногистохимическом исследовании, ксРу (А12), отобрали для созревания аффинности. Библиотеку созревания аффинности конструировали в фагмидном векторе ρΗΕΝ1 [ΗοοдеηЬοοт Н.К. е! а1. Шс1е1с Ас1бк Кек 1991; 19:4133-4137], путем введения случайных мутаций в позициях 31-33 гипервариабельного участка 1 вариабельной области тяжелой цепи (УН СЭК1) и в позициях 52, 52а, 53 и 56 гипервариабельного участка 2 вариабельной области тяжелой цепи (УН СЭК2). используя олигонуклеотиды ПЦР ЬМВ3 1οη§ Ьа (саддааасадс!а!дасса1дайас, праймирующий в направлении, противоположном транскрипции, от 5'-конца гена антитела), ЭР4 7СЭК1 для (с1ддадсс1ддсддасссадс1са!тпптпптппдс1ааадд1даа1ссададдс1дс), ЭР47СЭК1 Ьа (1ддд1ссдссаддс1ссад), ЭР47СЭК2 для (дсссйсасддад1с1дсд!ад!а1д1тппассасстпптпптппаа!адс1дадасссас1сс), ЭР47СЭК2 Ьа (аса!ас!асдсадас1ссд1даадддс) и Гбкец 1οпд для (дасдйад1ааа1дааййс1д1а1дадд).
Проводили биопэннинг библиотеки созревания аффинности с биотинилированным антигеном. После двух раундов пэннинга (как описано выше), проводили скрининг всех 382 клонов антитела путем твердофазного иммуноферментного анализа (ЕБ18А). Клоны, которые в анализе ЕЫ8А были положительными, исследовали далее на приборе ΒΙΑοογβ, чтобы ранжировать положительные согласно ИФА клоны на основании профиля диссоциации. Из исследованных клонов наиболее обнадеживающие свойства продемонстрировал 5сРν(Ε10).
Проводили иммуногистохимический анализ с фрагментом антитела 5сΡν (А12) против домена С тенасцина-С на разнообразных тканях глиобластомы человека. Первичное антитело детектировали посредством пептидной тус-метки, которую присоединяли к С-концу антитела 5сΡν, используя моноклональное антитело против метки тус Е10, после чего применяли систему АРААР (комплекс щелочная фосфатаза-антищелочная фосфатаза, ΌΑΚ0). Обнаружили, что эти антитела специфическим образом реагируют с переваскулярными структурами, что демонстрирует иммуногистохимическое исследование на криосрезах глиобластомы.
Пример 3.
Используя протокол, аналогичный описанному в примере 2, выделили другие 5сΡν против домена С тенасцина-С, которые обозначили Р4 и С11 соответственно. Вариабельные области легкой цепи Р4 и С11 различаются двумя аминокислотами, а вариабельные области тяжелой цепи совпадают. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей соединяли пептидным линкером, имеющим последовательность аминокислот, показанную в 8Еф ГО N0: 37 или 8Еф ГО N0: 39, которую кодирует 8Еф ГО N0: 36 или 8Еф ГО N0: 38 соответственно.
Пример 4.
Ген, кодирующий домен Ό тенасцина-С человека (ТпС-Э), клонировали путем ПЦР в реальном времени с тотальной РНК, выделенной из линии меланомы человека 8КМе1-28 с использованием олигонуклеотидов для ПЦР ТпС-0 ΒатΗI Ьа (сддда1ссд!1асадаадссдаассддаа - 8Еф ГО N0: 72) и ТпС-Ό Β§ΙΙΙ для (сддда^ссдИасадаадссдаассддаа - 8Еф ГО N0: 73) [16].
Амплифицированный фрагмент субклонировали в бактериальный вектор экспрессии рфЕ12, который встраивал Н15-метку на С-конце белка. Ген, кодирующий изоформу ТпС-А1 мыши, выделяли путем ПЦР из клона метки экспрессируемой последовательности (Е8Т), полученного из ткани инфильтрующей карциномы протока, с использованием праймеров ттТпС-А1 ΕсοΒа (адаайсайааададдадааайаас!а!дададда!сс!ссасддаадаад!дссйс - 8Еф ГО N0: 74) и ттТпС-А1 Βд1Рο (1дада1сйд!ссс1д1ддадд!с1сддс - 8Еф ГО N0: 75), и клонировали в вектор рфЕ12 (ф1адеп).
Библиотеку ЕТН-2 [26] подвергали процедуре пэннинга с 100 нМ биотинилированного ТпС-0 человека, и связанный фаг фиксировали на покрытых стрептавидином магнитных гранулах. После трех раундов пэннинга надосадочные жидкости, полученные от 188 отдельных клонов, подвергали скринингу путем твердофазного иммуноферментного анализа (ЕБ18А) на биотинилированном ТпС-0 человека и на биотинилированном ТпС-0 мыши. Большинство клонов, которые распознавали изоформу ТпС-0 человека, реагировали также с изоформой ТпС-0 мыши.
Надосадочные жидкости положительных по результатам твердофазного ИФА клонов исследовали во втором твердофазном иммуноферментном анализе и подвергали скринингу на приборе ΒIАсο^е. Шесть лучших клонов тщательно исследовали и определили, что лучшим клоном является 5сРν(Р4). 5сРν(Р4) связывал ТпС-Э человека и ТпС-Э мыши с одинаковой аффинностью.
5сРν(Р4) в твердофазном иммуноферментном анализе распознавал исключительно белки, которые содержат домен Ό, и не реагировал с белками, которые близки к домену Ό по структуре. Однако в иммуногистохимическом анализе он лишь слабо реагировал со структурами опухолей, порождая сигналы, которые было трудно отличить от фона. Причиной этого предположительно является низкая аффинность 5сРν(Р4).
8сРν(Р4) применяли в качестве матрицы для созревания аффинности путем мутагенеза гипервариа- 17 013537 бельных участков [26]. Для рандомизации выбрали остатки в положениях 30, 31, 32 гипервариабельного участка 1 вариабельной области легкой цепи и в положениях 50, 52 и 53 гипервариабельного участка 2 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация согласно КаЬа1; [30]). Библиотеку клонировали в фагмидный вектор ρΗΞΝ, который присоединяет метку тус к С-концу вариабельной области легкой цепи [31].
Первый раунд пэннинга с фагом библиотеки созревания аффинности проводили с биотинилированным ТпС-ϋ человека, второй раунд - с биотинилированным ТпС-ϋ мыши. 750 клонов подвергли скринингу в твердофазном иммуноферментном анализе на биотинилированном ТпС-ϋ человека, из них приблизительно 5% были положительными. После дальнейшего исследования антител на приборе В1Асоге и способом твердофазного иммуноферментного анализа 8сГу(р11) идентифицировали как лучший клон. Измерения аффинности с мономерными фракциями на приборе В1Асоге показали, что аффинность зсБуЩИ) в два-четыре раза выше, чем аффинность родительского клона зсЕу(Е4). 8σΕν(Ό11) связывал изоформу тенасцина мыши с несколько более высокой аффинностью, чем изоформу тенасцина человека.
δσΕν(Ό11) дал хорошие результаты в иммуногистохимическом анализе на различных опухолевых тканях. δσΕν(Ό11) окрашивал плоскоклеточную карциному рта человека, карциному мочевого пузыря человека и меланому А375 человека, выращенные в мышах пибе, а также тератокарциному Е9 мыши, выращенную в мышах 8νЕν 129. Это антитело хорошо реагировало со стромой опухолей человека, таких как рак головы и шеи и карцинома мочевого пузыря, а также с различными моделями опухолей мышей и человека.
Затем мы рандомизировали остатки в СЭК1 и СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи δσΕν(Ό11). Для рандомизации мы выбрали остатки 31, 32, 33 в СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи и 52, 52а, 53 и 56 в СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи (нумерация по КаЬа1; [32]). Провели два раунда селекции способом фагового дисплея, используя 10-8 М ТпС-ϋ человека в качестве антигена. Чтобы повысить точность отбора, перед добавлением антигена в первом раунде смешивали 10 нМ очищенного растворимого зсЕу(П11) с фагом, а во втором раунде пэннинга к предварительно инкубированной смеси антиген-фаг добавляли 1000-кратный избыток небиотинилированного антигена.
Скрининг способом твердофазного иммуноферментного анализа после двух раундов показал, что 25% из 384 клонов положительны по отношению к биотинилированному ТпС-ϋ человека. После дальнейшего исследования зсЕу(Р12) идентифицировали как лучший клон. Его аффинность к ТпС-ϋ человека увеличилась с коэффициентом 4,8 по сравнению с зсЕу(П11).
8сΕν(Р12) клонировали в формате 81Р (маленький иммунобелок) [25]. Способность нацеливания 81Р (Р12) 1п νινΌ оценивали в экспериментах по биораспределению с мышами пибе, несущими ксеноктрансплантат глиобластомы человека И87. Антитела 81Р, меченые 125Ι, вводили путем внутривенной инъекции и через 3, 6, 24 и 48 ч животных забивали, вырезали органы, взвешивали их и измеряли радиоактивность. Из большинства органов 81Р(Р12) выводился в пределах 24 ч после инъекции, а через 24 и 48 ч наблюдали специфическое накопление в опухолях с отношением опухоль/кровь, достигающим 15 (фиг. 5 и таблица).
Биораспределение меченого радиацией Р12-81Р в мышах пибе с опухолью
Зч. 6 ч. 24 ч. 48 ч.
опухоль 5.6010.84 5.17 ±1.06 2.27 ±0.53 1.49 ±0.45
кишечник 4.9370.99 5.02 ±1.37 2.57 ±0.74 1,19 ±0.38
селезенка 14.96 ±4.49 9.58 ±1.23 1.10 ±0.26 0.44 ±0.21
сердце 3.72 ±0.18 1.79 ±0.12 0.17 ±0.04 0.05 ± 0.01
печень 8.49 ±0.76 4.10 ±0.41 0.39 ±0.09 0.15 ±0.05
легкое 5.45±0.29 2.70 ±0.53 0.46 ±0.05 0.16 ±0.05
почка 14.32 ±0.62 7.20 ±0.42 0 89±0.19 0.39 ±0.16
кровь 7.21 ±0.53 2.54±0.44 0.29 ±0.07 0.10 ±0.05
размер 99.5 ±62. 53.5 ±18.2 102.3 ±89.6 48.8 ±35.2
опухоли (мг)
Результаты выражены в процентах от дозы введенного путем инъекции антитела на грамм опухоли (% введенная доза/г) ± стандартное отклонение.
Ссылки
1. Возз1е! К. е! а1. Сапсег Кез 1998; 58:1195-1201
2. .кип К.К. Αбν Эгид 1Α1ιν Неу 2001; 46:149-168
3. КоЫег 6., М11з1еш С. №1иге 1975; 256:495-497
4. \У1п1ег 6. е! а1. Аппи Кеи 1ттипо1 1994; 12:433-455
5. На1т С. е! а1. Сапсег Кез 2003; 63:3202-3210
6. На1т С. е! а1. N1 Вю1есйпо1 2002; 20:264-269
7. №1ззоп Е. е! а1. Сапсег Кез 2001; 61:711-716
8. Вогз1 Б. е! а1. В1ооб 2003; 102:4384-4392
- 18 013537
9. Сагпето11а В. е! а1. В1ооб 2002; 99:1659-1665
10. ΖηιτΙι Ь. е! а1. ЕтЬо I 1987; 6:2337-2342
11. Саз!е11ат Р. е! а1. Ат I Ра!ко1 2002; 161:1695-1700
12. Са§!е11ап1 Р. е! а1. Ιη!. I. Сапсег 1994; 59:612-618
13. Сатето11а В. е! а1. Ιη!. I. Сапсег 1996; 68:397-405
14. Вог§1 Ь. е! а1. Ιη!. I. Сапсег 1992; 52:688-692
15. Сатето11а В. е! а1. Еиг I Вюскет 1992; 205:561-567
16. Вог81 Е. е! а1. I Вю1 Скет 1995; 270:6243-6245
17. К1уа Р. е! а1. Ιη! I Сапсег 1992; 51:7-13
18. К1уа Р. е! а1. Саисет Кез 1995; 55:5952з-5956з
19. Рада^Их О. е! а1. Еиг I Чис1 Меб 1994;21:314-321
20. Кеа^боη Ώ.Α. е! а1. I Ο1ΐη Опсо1 2002; 20:1389-1397
21. В1Ц11ег Ό.Ό. е! а1. I С1т Опсо1 1998; 16:2202-2212
22. Сатето11а В. е! а1. Ат I Ра!ко1 1999;154:1345-1352
23. Ка1е11катр К. е! а1. I Ра!ко1 2004; 203:771-779
24. νΐ!ΐ Р., е! а1. Ме!кобз Е11/уто1 2000; 326:480-505
25. Вогз1 Е. е! а1. Ιη! I Са11сег 2002; 102:75-85
26. Рш1 А. е! а1. I Вю1 Скет 1998;273:21769-21776
27. 8скеиегтаип I. е! а1. I Iттиηо1 Ме!кобз 2003; 276:129-134
28. Вака Е. е! а1. РЕЕВ ЕеП 1993; 332:39-43
29. Нооде11Ьоот Н.К. е! а1. Хискче Ас1бз Кез 1991; 19:4133-4137
30. Т^а^укЬ, О., е! а1. (1997). I Мо1 Вю1 268(1): 69-77.31.
31. Нооде11Ьоот & \\'нНег (1992). I Мо1 Вю1 227(2): 381-8
32. Тош11пзоп, е! а1. (1992). I Мо1 Вю1 227(3): 776-98.

Claims (35)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антитело, специфично связывающее домен А1 тенасцина-С человека, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, включающую один или более гипервариабельных участков СОК 1, СОК 2, СОК 3 вариабельной области тяжелой цепи, где
    СОК 1 соответствует 8Е0 ΙΌ N0: 5 или 8Е0 ΙΌ N0: 13;
    СОК 2 соответствует 8Е0 ΙΌ N0: 6;
    СОК 3 соответствует 8Е0 ΙΌ N0: 7; и вариабельную область легкой цепи антитела, включающую один или более гипервариабельных участков СОК 1, СОК 2, СОК 3 вариабельной области легкой цепи, где
    СОК 1 соответствует 8Е0 ΙΌ N0: 8;
    СОК 2 соответствует 8Е0 ΙΌ N0: 9;
    СОК 3 соответствует 8Е0 ΙΌ N0: 10.
  2. 2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи антитела включает СОК 1, СОК 2 и СОК 3 вариабельной области тяжелой цепи, где
    СОК 1 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 5 или 8Е0 ΙΌ N0: 13;
    СОК 2 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 6;
    СОК 3 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7.
  3. 3. Антитело по любому из пп.1-2, отличающееся тем, что вариабельная область легкой цепи антитела включает СОК 1, СОК 2 и СОК 3 вариабельной области легкой цепи, где
    СОК 1 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8;
    СОК 2 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 9;
    СОК 3 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 10.
  4. 4. Антитело по п.3, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи антитела включает СОК 1, СОК 2 и СОК 3 вариабельной области тяжелой цепи, где
    СОК 1 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 5 или 8Е0 ΙΌ N0: 13;
    СОК 2 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 6;
    СОК 3 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 7; и вариабельная область легкой цепи антитела включает СОК 1, СОК 2 и СОК 3 вариабельной области легкой цепи, где
    СОК 1 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 8;
    СОК 2 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 9;
    СОК 3 имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 10.
  5. 5. Антитело по любому из пп.1-4, в котором СЭЕ1 тяжелой цепи имеет последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 5.
  6. 6. Антитело по любому из пп.1-5, которое включает вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 2, или вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность аминокислот, отличающуюся от 8Е0 ΙΌ N0: 2 менее чем на 5 изменений аминокислот.
  7. 7. Антитело по любому из пп.1-5, которое включает вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 12, или вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность аминокислот, отличающуюся от 8Е0 ΙΌ N0: 12 менее чем на 5 изменений аминокислот.
  8. 8. Антитело по любому из пп.1-6, которое включает вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 50, или вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность аминокислот, отличающуюся от 8Е0 ΙΌ N0: 50 менее чем на 5 изменений аминокислот.
  9. 9. Антитело по любому из пп.1-6, которое включает вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 4, или вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность аминокислот, отличающуюся от 8Е0 ΙΌ N0: 4 менее чем на 5 изменений аминокислот.
  10. 10. Антитело по п.8, которое включает вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 50.
  11. 11. Антитело по любому из пп.6 или 10, которое включает вариабельную область тяжелой цепи антитела, которая имеет последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 2; и вариабельную область легкой цепи антитела, которая имеет последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 50.
  12. 12. Антитело, которое специфично связывает домен А1 тенасцина-С человека, включающее вариабельную область тяжелой цепи антигена, имеющую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 2 или последовательность аминокислот, отличающуюся от 8Е0 ΙΌ N0: 2 менее чем на 5 изменений аминокислот; и вариабельную область легкой цепи антигена, имеющую последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ
    - 62 013537
    N0: 50 или последовательность аминокислот, отличающуюся от 8ЕР ΙΌ N0: 50 менее чем на 5 изменений аминокислот, причем указанное антитело связывает домен А1 тенасцина-С человека с аффинностью, равной или большей аффинности антитела, включающего вариабельную область тяжелой цепи 8Ер ΙΌ N0: 12 и вариабельную область легкой цепи 8Ер ΙΌ N0: 50.
  13. 13. Антитело по любому из пп.1-12, которое включает молекулу одноцепочечного антитела зсЕу.
  14. 14. Антитело по любому из пп.1-12, которое включает константную область антитела.
  15. 15. Антитело по п.11, которое представляет собой целое антитело.
  16. 16. Антитело по любому из пп.1-15, конъюгированное с детектируемой меткой или цитокином.
  17. 17. Антитело по п.16, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи или вариабельная область легкой цепи конъюгирована с цитокином посредством пептидного линкера в виде слитого белка.
  18. 18. Антитело по п.16 или 17, отличающееся тем, что цитокин представляет собой интерлейкин 2 (Ш2).
  19. 19. Антитело по любому из пп.1-18, конъюгированное с цитотоксическим агентом.
  20. 20. Изолированная нуклеиновая кислота, которая включает последовательность нуклеотидов, кодирующую антитело по любому из пп.1-15, либо вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи, входящих в состав указанного антитела.
  21. 21. Клетка-хозяин, трансформированная нуклеиновой кислотой по п.20.
  22. 22. Способ получения антитела по любому из пп.1-15 либо вариабельной области тяжелой цепи указанного антитела или вариабельной области легкой цепи указанного антитела, который включает культивирование клетки-хозяина по п.21 в условиях, обеспечивающих получение указанного антитела, или вариабельной области тяжелой цепи указанного антитела, или вариабельной области легкой цепи указанного антитела.
  23. 23. Способ по п.22, дополнительно включающий выделение и/или очистку антитела, или вариабельной области тяжелой цепи антитела, или вариабельной области легкой цепи антитела.
  24. 24. Способ по п.23, дополнительно включающий конъюгирование антитела, или вариабельной области тяжелой цепи антитела, или вариабельной области легкой цепи антитела с детектируемой меткой или цитотоксическим агентом.
  25. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что метка представляет собой флюорофор.
  26. 26. Композиция, содержащая антитело, полученное способом по любому из пп.22-25, и по меньшей мере один дополнительный компонент, такой как фармацевтически приемлемый наполнитель.
  27. 27. Способ получения комплекса, включающего антитело, полученное способом по любому из пп.22-26 и тенасцин-С или его фрагмент, который включает связывание указанного антитела с тенасцином-С или фрагментом тенасцина-С.
  28. 28. Способ получения комплекса, включающего антитело по любому из пп.1-19 и тенасцин-С или его фрагмент, включающий связывание указанного антитела с тенасцином-С или фрагментом тенасцинаС.
  29. 29. Способ по п.27 или 28, отличающийся тем, что указанное связывание происходит ΐπ νΐΐΓΟ.
  30. 30. Способ по любому из пп.27-29, включающий определение степени связывания антитела.
  31. 31. Применение антитела по любому из пп.1-19 для лечения или диагностики пролиферативного заболевания, связанного с активностью тенасцина-С.
  32. 32. Применение антитела по любому из пп.1-16 в изготовлении лекарственного средства для диагностики или лечения пролиферативного заболевания, связанного с активностью тенасцина-С.
  33. 33. Способ лечения пролиферативного заболевания, связанного с активностью тенасцина-С, у индивидуума, включающий введение индивидууму антитела по любому из пп.1-19.
  34. 34. Способ детектирования и/или визуализации клеток опухоли в организме индивидуума, включающий введение индивидууму антитела по любому из пп.1-19 и детектирование связывания указанного антитела с клетками опухоли в организме указанного индивидуума.
  35. 35. Способ по п.34, отличающийся тем, что антитело конъюгируют с детектируемой меткой.
EA200700991A 2004-11-09 2005-10-31 Антитела к тенасцину-с человека и их применение EA013537B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62617304P 2004-11-09 2004-11-09
US67737605P 2005-05-03 2005-05-03
PCT/EP2005/011624 WO2006050834A2 (en) 2004-11-09 2005-10-31 Antibodies against tenascin-c

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200700991A1 EA200700991A1 (ru) 2007-12-28
EA013537B1 true EA013537B1 (ru) 2010-06-30

Family

ID=36336853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200700991A EA013537B1 (ru) 2004-11-09 2005-10-31 Антитела к тенасцину-с человека и их применение

Country Status (20)

Country Link
US (1) US7968685B2 (ru)
EP (2) EP1817345B9 (ru)
JP (2) JP2008518609A (ru)
KR (1) KR20070085892A (ru)
CN (1) CN101090913B (ru)
AT (1) ATE432293T1 (ru)
AU (1) AU2005304031B2 (ru)
BR (1) BRPI0517967B8 (ru)
CA (1) CA2586661A1 (ru)
CY (1) CY1110481T1 (ru)
DE (1) DE602005014665D1 (ru)
DK (1) DK1817345T3 (ru)
EA (1) EA013537B1 (ru)
ES (1) ES2327349T3 (ru)
HK (1) HK1115756A1 (ru)
MX (1) MX2007005582A (ru)
PL (1) PL1817345T3 (ru)
PT (1) PT1817345E (ru)
SI (1) SI1817345T1 (ru)
WO (1) WO2006050834A2 (ru)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060257317A1 (en) * 2005-05-04 2006-11-16 Duke University Combination therapy in the treatment of cancer
EP1957531B1 (en) * 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
BRPI0809989B8 (pt) 2007-04-02 2021-05-25 Philogen Spa usos de um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga a isoforma extradomínio-a (ed-a) de fibronectina e/ou ao ed-a de fibronectina
WO2009001219A2 (en) * 2007-06-28 2008-12-31 Philogen S.P.A Immunocytokines for cancer treatment in combination with chemotherapeutic agents
US10202442B2 (en) 2007-07-25 2019-02-12 Philogen S.P.A. Antigen associated with lung cancers and lymphomas
KR102002739B1 (ko) 2007-10-30 2019-07-23 필로겐 에스.피.에이. 류마티스 관절염과 연관된 항원
WO2009089998A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 Philochem Ag Binding members for tenascin-c domain a2
EP2373343B1 (en) 2008-12-19 2015-02-11 Philogen S.p.A. Immunocytokines for tumour therapy with chemotherapeutic agents
EP2379116B1 (en) 2009-01-07 2015-08-26 Philogen S.p.A. Antigens associated with endometriosis
WO2011001276A1 (en) 2009-06-30 2011-01-06 Philogen S.P.A. Immunocytokines in combination with anti-erbb antibodies for the treatment of cancer
ES2640981T3 (es) 2009-08-05 2017-11-07 Philogen S.P.A. Selección como diana de neovasculatura de médula ósea
WO2011107586A1 (en) * 2010-03-05 2011-09-09 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research, Smoc1, tenascin-c and brain cancers
CN103168049B (zh) 2010-08-13 2015-10-07 罗切格利卡特公司 抗生腱蛋白-c a2抗体及使用方法
US9549981B2 (en) 2011-07-19 2017-01-24 Philogen S.P.A. Sequential antibody therapy
EP3437662B1 (en) 2011-07-27 2021-02-17 Philogen S.p.A. Il-12 immunoconjugate
JP6241912B2 (ja) * 2012-04-27 2017-12-06 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 核医学診断装置の制御方法、核医学診断装置、および診断剤キット
HUE044927T2 (hu) 2012-10-03 2019-11-28 Philogen Spa Ellenanyag-konjugátum, gyulladásos bélbetegség kezelésében történõ alkalmazásra
KR101819404B1 (ko) 2012-10-12 2018-02-28 메디뮨 리미티드 피롤로벤조디아제핀 및 그의 컨주게이트
JP6444902B2 (ja) 2013-03-13 2018-12-26 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びその結合体
EP3102242A2 (en) * 2014-02-03 2016-12-14 Philochem AG Targeted drug conjugates
CN106687141A (zh) 2014-09-10 2017-05-17 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其缀合物
WO2017097990A1 (en) * 2015-12-11 2017-06-15 Philogen S.P.A. Antibodies for treatment and diagnosis of inflammatory bowel disease
US10906963B2 (en) 2016-04-15 2021-02-02 Philogen S.P.A Non-glycosylated anti-tenascin antibody
CN109071640B (zh) * 2016-05-11 2022-10-18 豪夫迈·罗氏有限公司 经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法
EP3455254B1 (en) 2016-05-11 2021-07-07 F. Hoffmann-La Roche AG Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer and a tenascin binding moiety
US20200023072A1 (en) 2016-10-11 2020-01-23 Medimmune Limited Antibody-drug conjugates with immune-mediated therapy agents
CA3043146C (en) 2016-11-09 2021-11-23 Philogen S.P.A. Il2 and tnf mutant immunoconjugates
GB201621806D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Philogen Spa Immunocytokines with progressive activation mechanism
EP3601346A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
AU2018281871B2 (en) 2017-06-07 2022-07-28 Philogen S.P.A. Vascular endothelial growth factor/anti-fibronectin antibody fusion proteins
EP3796942A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 ADC Therapeutics SA Molecular adjuvant
TW202016144A (zh) * 2018-06-21 2020-05-01 日商第一三共股份有限公司 包括cd3抗原結合片段之組成物及其用途
EP3660039A1 (en) 2018-11-30 2020-06-03 Philogen S.p.A. Il2 immunoconjugates
WO2020070150A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Philogen S.P.A Il2 immunoconjugates
US20220119450A1 (en) 2019-02-04 2022-04-21 University Of Tartu Bi-specific extracellular matrix binding peptides and methods of use thereof
WO2020249757A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Philogen S.P.A Immunoconjugates comprising a single chain diabody and interleukin-15 or interleukin-15 and a sushi domain of interleukin-15 receptor alpha
WO2022073038A1 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Abbvie Inc. Interleukin-22 (il-22) fusion proteins and uses thereof
US20230372528A1 (en) 2020-10-16 2023-11-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycoconjugates
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000063699A1 (en) * 1999-04-20 2000-10-26 Philogen S.R.L. A tenascin-c isoform as a marker for neoplasias
WO2001062800A1 (en) * 2000-02-24 2001-08-30 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1994013804A1 (en) 1992-12-04 1994-06-23 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US9209965B2 (en) 2014-01-14 2015-12-08 Microsemi Semiconductor Ulc Network interface with clock recovery module on line card

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000063699A1 (en) * 1999-04-20 2000-10-26 Philogen S.R.L. A tenascin-c isoform as a marker for neoplasias
WO2001062800A1 (en) * 2000-02-24 2001-08-30 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARNEMOLLA B. ET AL.: "IDENTIFICATION OF A GLIOBLASTOMA-ASSOCIATED TENASCIN-C ISOFORM BY AHIGH AFFINITY RECOMBINANT ANTIBODY" AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY, PHILADELPHIA, PA, US, May 1999 (1999-05), pages 1345-1352, XP000937680 ISSN: 0002-9440 cited in the application figure 2 *
DAVIS C.G. ET AL.: "TRANSGENIC MICE AS A SOURCE OF FULLY HUMAN ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF CANCER" CANCER AND METASTASIS REVIEWS, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, DORDRECHT, NL, vol. 18, 1999, pages 421-425, XP000944725 ISSN: 0167-7659 the whole document *
DESIDERIO A. ET AL.: "A semi-synthetic repertoire of intrinsically stable antibody fragments derived from a single-framework scaffold" JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, LONDON, GB, vol. 310, no. 3, 13 July 2001 (2001-07-13), pages 603-615, XP004464207 ISSN: 0022-2836 the whole document *
HOOGENBOOM H.R.: "OVERVIEW OF ANTIBODY PHAGE-DISPLAY TECHNOLOGY AND ITS APPLICATIONS". METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, HUMANA PRESS INC., CLIFTON, NJ, US, vol. 178, 2002, pages 1-37, XP009065679 the whole document *
MERLO A. ET AL.: "BIODISTRIBUTION OF 111IN-LABELLED SCN-BZ-DTPA-BC-2 MAB FOLLOWING LOCO-REGIONAL INJECTION INTO GLIOBLASTOMAS" INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, NEW YORK, NY, US, vol. 71, 1997, pages 810-816, XP002927963 ISSN: 0020-7136, page 811 & LATIJNHOUWERS MIEKE A.H.E. ET AL.: "Expression of tenascin-C splice variants by human skin cells" ARCHIVES OF DERMATOLOGICAL RESEARCH, vol. 292, no. 9, September 2000 (2000-09), pages 446-454, XP002387814 ISSN: 0340-3696 figure 1 *
PINI A. ET AL.: "Design and use of a phage display library. Human antibodies with subnanomolar affinity against a marker of angiogenesis eluted from a two-dimensional gel" JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM,, US, vol. 273, no. 34, 21 August 1998 (1998-08-21), pages 21769-21776, XP002124781 ISSN: 0021-9258 the whole document *
SILACCI MICHELA ET AL.: "Design, construction, and characterization of a large synthetic human antibody phage display library" PROTEOMICS, vol. 5, no. 9, June 2005 (2005-06), pages 2340-2350, XP002387815 ISSN: 1615-9853 figure 5 *

Also Published As

Publication number Publication date
HK1115756A1 (zh) 2008-12-05
US7968685B2 (en) 2011-06-28
ES2327349T3 (es) 2009-10-28
WO2006050834A3 (en) 2007-02-08
DE602005014665D1 (de) 2009-07-09
JP5127085B2 (ja) 2013-01-23
CN101090913A (zh) 2007-12-19
SI1817345T1 (sl) 2009-10-31
PT1817345E (pt) 2009-08-21
EP1817345B1 (en) 2009-05-27
BRPI0517967A (pt) 2008-10-28
ATE432293T1 (de) 2009-06-15
AU2005304031A1 (en) 2006-05-18
CA2586661A1 (en) 2006-05-18
MX2007005582A (es) 2007-09-11
WO2006050834A2 (en) 2006-05-18
BRPI0517967B8 (pt) 2021-05-25
KR20070085892A (ko) 2007-08-27
EP1817345A2 (en) 2007-08-15
JP2008518609A (ja) 2008-06-05
CY1110481T1 (el) 2015-04-29
US20080056997A1 (en) 2008-03-06
JP2012176957A (ja) 2012-09-13
EP1817345B9 (en) 2009-11-18
EP2157102A1 (en) 2010-02-24
CN101090913B (zh) 2015-11-25
DK1817345T3 (da) 2009-09-28
PL1817345T3 (pl) 2009-10-30
EA200700991A1 (ru) 2007-12-28
AU2005304031B2 (en) 2009-04-23
BRPI0517967B1 (pt) 2020-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA013537B1 (ru) Антитела к тенасцину-с человека и их применение
CN100447159C (zh) 结合纤连蛋白ed-b结构域的抗体及其构建和应用
US12083193B2 (en) Anti-Her2 nanobody and coding sequence and use thereof
HU225675B1 (en) Antibodies to the ed-b domain of fibronectin, conjugates containing them and use thereof for diagnosis and therapy of tumors and diseases associated with angiogenesis
CN110300766A (zh) 新型重组双功能融合蛋白及其制备方法和用途
US11197934B2 (en) Dual variable domain immunoconjugates and uses thereof
JP7329288B2 (ja) 腫瘍細胞を死滅させるための医薬
KR100494530B1 (ko) 피브로넥틴ed-b도메인에대한항체,그제조방법및용도
Li et al. Anti-MET immunoPET for non-small cell lung cancer using novel fully

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU