CN101090913A - 抗生腱蛋白c的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对胞外基质蛋白生腱蛋白C的特异性结合成员，尤其是针对生腱蛋白C的结构域A1、结构域C和结构域D的scFv抗体分子。抗生腱蛋白C特异性结合成员与标记、细胞毒性或细胞因子缀合。抗生腱蛋白C特异性结合成员在诊断和治疗，尤其是癌症中的应用。

Description

抗生腱蛋白C的抗体
技术领域
本发明涉及指向生腱蛋白C(tenascin-C)的特异性结合成员，特别是抗生腱蛋白C的人抗体。这些特异性结合成员具有治疗应用范围，例如在癌症的诊断和治疗中应用。
背景技术
生腱蛋白C为一种调节细胞黏附的细胞外基质的六聚化糖蛋白。它参与例如细胞增殖和细胞迁移这样的过程，并且与作为在形态发生和胚胎发生过程中以及肿瘤发生或血管发生中出现的组织结构改变相关。
生腱蛋白C的示意性结构域结构如图1所示。作为可变剪接的结果，可以产生几种生腱蛋白C的同种型，所述的可变剪接可以导致在这种从结构域A 1到结构域D的蛋白质的中心部分中包含(多个)结构域[Borsi L等Int J Cancer 1992；52：688-692，Carnemolla B等EurJ Biochem 1992；205：561-567]。预先推定可以通过可变剪接机制将结构域A1-D插入生腱蛋白C分子“块”或在其中无该分子，从而产生“生腱蛋白C大”(tenscin-C large)和“生腱蛋白C小”(tenscin-Csmall)的分子[Borsi L等J Biol Chem 1995；270：6243-6245]。已经报导在许多肿瘤中存在生腱蛋白C的大同种型的强的超表达[Borsi1992，文献同上]，并且已经在临床上广泛表征了分别对结构域A1和D具有特异性的两种单克隆抗体[Riva P等Int J Cancer 1992；51：7-13，Riva P等Cancer Res 1995；55：5952s-5956 s，Paganelli G等EurJ Nucl Med 1994；21：314-321，Reardon DA等J Clin Oncol 2002；20：1389-1397，Bigner DD等J Clin Oncol 1998；16：2202-2212。
然而，近来已经清楚的是通过更复杂调节的可变剪接机制可以导致生腱蛋白C的大同种型中的分子不均匀性增加。例如，据报导生腱蛋白C的额外结构域C展示出比生腱蛋白C的其它可变剪接结构域更受限的表达模式[Carnemolla B等Am J Pathol 1999；154：1345-1352]，其中使用免疫组织化学而显示的主要血管周围的染色。生腱蛋白C的C结构域在大部分正常成年人组织中检测不到，而在高级星形细胞瘤[Carnemolla B等Am J Pathol 1999；154：1345-1352]和其它肿瘤类型中超表达。对大生腱蛋白C同种型之间的不均匀性的进一步的支持来源于转录分析，它证实大生腱蛋白C转录物的特征在于异质性组成[Katenkamp K等J Pathol 2004；203：771-779]。翻译后修饰(例如糖基化)的存在或不存在均可以提供额外水平的复杂性，它们可以改变各蛋白质结构域表面上的某些表位，并且使得它们无法在体外或体内被特异性单克隆抗体进行特异性分子识别。
尽管使用现有的方法可以在体外对抗体特异性的、实际所关注的任何蛋白质进行快速分离，但是这类抗体识别表位在生物样本或疾病动物模型中并非显而易见。在体内不能结合的可能原因包括表位的翻译后修饰，从而掩蔽表位和抗体特异性或稳定性不足。由此难以评价在仅基于常规用于筛选单克隆抗体的典型固相测定法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)中的与重组抗原(或抗原片段)的反应性的单克隆抗体适合实际应用。
由此需要分别分析对生腱蛋白C的大同种型的各结构域的单克隆抗体，以便评价它们在诊断和治疗应用中的适合性。
发明内容
本发明者已经分离了对在生腱蛋白C中可变剪接区内的不同表位具有特异性的人单克隆抗体片段。这些抗体的特征在于其识别生物样本中生腱蛋白C大同种型的能力与在ELISA测定法中的高度特异性结合相当，而且该能力对极为相近似的抗原具有显著差异。
本发明的一个方面提供了结合人生腱蛋白C，特别是生腱蛋白C大同种型的特异性结合成员。
优选的特异性结合成员为肿瘤特异性的，并且与正常组织相比，优先结合肿瘤组织。特异性结合成员可以例如，与正常组织相比，优先结合肿瘤组织的基质和/或新血管和血管周围结构。
与生腱蛋白C小同种型相比，特异性结合成员可以优先结合生腱蛋白C大同种型。
在某些实施方案中，所述的特异性结合成员可以结合生腱蛋白C的A1结构域。合适的特异性结合成员可以包括：
抗体VH结构域，其选自SEQ ID NO.2的4A1-F16 VH结构域；SEQID NO.12的3A1-D5 VH结构域和包含具有选自SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO：13的氨基酸序列的一个或多个VH CDR的VH结构域；和/或
抗体VL结构域，其选自SEQ ID NO.4或SEQ ID NO：49)的VL结构域；和包含具有选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的氨基酸序列的一个或多个VL CDR的VL结构域。
4A1-F16在本文中也称作F16。
例如，合适的特异性结合成员可以包括SEQ ID NO.4或SEQ ID NO：49的4A1-F16/3A1-D5 VL结构域和/或SEQ ID NO.2的4A1-F16 VH结构域或SEQ ID NO：12的3A1-D5 VH结构域。
在其它实施方案中，所述的特异性结合成员可以结合生腱蛋白C的C结构域。合适的特异性结合成员可以包括：
抗体VH结构域，其选自E10 VH结构域(SEQ ID NO.15或SEQ IDNO：48)；A12 VH结构域(SEQ ID NO：25)；F4和G11 VH结构域(SEQID NO：29或SEQ ID NO：45)；和包含具有选自SEQ ID NO.18、SEQID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27的氨基酸序列的一个或多个VH CDR的VH结构域；和/或
抗体VL结构域，其选自SEQ ID NO.17或SEQ ID NO 81的VL结构域；具有SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：83的氨基酸序列的F4 VL结构域；具有SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：47的氨基酸序列的G11 VL结构域；和包含具有选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的氨基酸序列的一个或多个VLCDR的VL结构域。
因此，在一个实例中，所述的特异性结合成员可以包括：
抗体VH结构域，其选自E10 VH结构域(SEQ ID NO.15或SEQ IDNO：48)；A12 VH结构域(SEQ ID NO：25)；和包含具有选自SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27的氨基酸序列的一个或多个VH CDR的VH结构域；和/或
抗体VL结构域，其选自SEQ ID NO.17或SEQ ID NO：81的VL结构域和包含具有选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸序列的一个或多个VL CDR的VL结构域。
例如，合适的特异性结合成员可以包括SEQ ID NO.17或SEQ IDNO：81的E10/A12 VL结构域和/或SEQ ID NO.15或SEQ ID NO：48)的E10 VH结构域或SEQ ID NO.25的A12 VH结构域。
在另一个实例中，所述的特异性结合成员可以包括：
抗体VH结构域，其选自F4和G11 VH结构域(SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：45)和包含具有选自SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列的一个或多个VH CDR的VH结构域；和/或
抗体VL结构域，其选自F4 VL结构域(SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：83)；G11 VL结构域(SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：47)和包含具有选自SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的氨基酸序列的一个或多个VL CDR的VL结构域。
例如，合适的特异性结合成员可以包括SEQ ID NO：29或SEQ IDNO：45的F4/G11 VH结构域和/或SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：83的F4 VL结构域或SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：47的G11 VL结构域。
在另一个实例中，所述的特异性结合成员结合生腱蛋白C的结构域D。优选所述的特异性结合成员结合人结构域D。它可以与小鼠同种型发生交叉反应。我们分离了对结构域D具有特异性的抗体分子。将原始克隆命名为F4S。我们还研发了亲和成熟的F4S变体，将其命名为D11。我们进一步研发了亲和成熟的D11的变体，将其命名为P12。因此，合适的特异性结合成员可以包括：
抗体VH结构域，其选自SEQ ID NO.58的F4S VH结构域；SEQ IDNO.55的D11 VH结构域；SEQ ID NO：52的P12 VH结构域；和包含具有选自SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66的氨基酸序列的一个或多个VHCDR的VH结构域；和/或
抗体VL结构域，其选自SEQ ID NO.53的P12和D11 VL结构域；SEQ ID NO：60的F4S VL结构域；和包含具有选自SEQ ID NO.67、SEQ ID NO.68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO.71的氨基酸序列的一个或多个VL CDR的VL结构域。
一般而言，使VH结构域与VL结构域配对以便提供抗体抗原结合部位，不过如下所述，可以将VH结构域单独用于结合抗原。在一个优选的实施方案中，使本文所述的VH结构域(即SEQ ID NO 2，12，15，25，29，45，48，52，56或58)与相应的VL结构域(即SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：50(用于4A1-F16和3A1-D5)，SEQ ID NO：17或SEQ IDNO：81(用于A12和E 10)，用于F4和G11的SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：83，SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：47)，用于P12和D11的SEQ IDNO：54或用于F4S的SEQ ID NO：60配对，以便形成包含VH和VL结构域的抗体抗原结合部位(例如包含4A1-F16 VH和VL结构域，3A1-D5VH和VL结构域，E10 VH和VL结构域，A12 VH和VL结构域，F4 VH和VL结构域，G11 VH和VL结构域，P12 VH和VL结构域，D11 VH和VL结构域或F4S VH和VL结构域的部位)。在其它实施方案中，可以使VH结构域与VL结构域，而非相应的VL结构域，优选来自结合生腱蛋白C的相同结构域的特异性结合成员的VL结构域配对。本领域中充分确立了轻链的混杂性。
一个或多个CDR可以取自如本文披露的VH或VL结构域并且将它们整合到合适的构架中。这种情况在下文中进一步讨论。一般根据Kabat定义CDR。优选VH结构域和/或VL结构域包含CDR1、CDR2和CDR3。4A1-F16 VH CDR1如SEQ ID NO：5中所示。3A1-D5 VH CDR1如SEQ ID NO：13中所示。4A1-F16和3A1-D5 VH CDR 2和3分别如SEQ ID NO 6和7中所示。4A1-F16和3A1-D5 VL CDR1，2和3分别如SEQ ID NO 8，9和10中所示。E10 VH CDR 1和2如SEQ ID NO 18和19中所示。A12 VH CDR 1和2如SEQ ID NO 26和27中所示。E10和A12 VH CDR3如SEQ ID NO：23中所示。E 10和A12 VL CDR1，2和3分别如SEQ ID NO：21，22和23中所示。F4和G11 VH CDR1，2和3分别如SEQ ID NO：18，19和20中所示。F4 VL CDR1，2和3分别如SEQ ID NO：32，33和23中所示。G11 VL CDR1，2和3分别如SEQ ID NO：32，22和23中所示。P12 VH CDR分别如SEQ ID NO：61，63和66中所示。P12 VL CDR分别如SEQ ID NO：67，69和71中所示。D11 VH CDR分别如SEQ ID NO：62，64和66中所示。D11 VLCDR分别如SEQ ID NO：67，69和71中所示。F4S VH CDR分别为SEQID NO：62，65和66。F4S VL CDR分别为SEQ ID NO：68，70和71。
在某些实施方案中，特异性结合成员可以包括包含具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR3，具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的CDR2和包含具有SEQ ID NO.5，或更优选SEQ ID NO.13的氨基酸序列的CDR1中的一个或多个的抗体VH结构域。
在其它实施方案中，特异性结合成员可以包括具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR3，具有SEQ ID NO：27，更优选SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO：26，或更优选SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR 1中的一个或多个的抗体VH结构域。
特异性结合成员可以包括包含具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的CDR3，具有SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR1中的一个或多个的抗体VL结构域。
优选特异性结合成员为如在下文更具体地描述的scFv。VH和VL结构域可以通过肽接头连接，例如具有如SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列的接头。一般而言，这些接头具有包含一个或多个串连重复基序的氨基酸序列。该基序一般为5个残基的序列，并且优选残基中的至少4个为Gly或Ser。如果5个残基中的4个为Gly或Ser，那么其它残基可以为Ala。更优选5个残基各自为Gly或Ser。优选的基序为GGGGS，SSSSG，GSGSA和GGSGG(分别为SEQ ID NO：76，77，78和79)。优选这些基序在序列中相邻，其中在重复部分之间无间隔核苷酸。接头序列可以包含1-5个，优选3或4个重复基序或由它们组成。例如，带有三个处理重复的接头可以具有下列氨基酸序列之一：
GGGGSGGGGSGGGGS-SEQ ID NO：39
SSSSGSSSSGSSSSG-SEQ ID NO：41
GSGSAGSGSAGSGSA-SEQ ID NO：42
GGSGGGGSGGGGSGG-SEQ ID NO：43。
可以通过序列改变或突变和筛选的方法获得其序列如本文所示的并且可以用于与生腱蛋白C特异性结合的成员的VH和VL结构域和CDR的变体。本发明也提供这类方法。
可以如所述的按照本发明使用其序列特别如本文披露的任何VH和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体。具体的变体可以包括一个或多个氨基酸序列改变(氨基酸残基的添加、缺失、取代和/或插入)，可以少于20个改变，少于约15个，少于约10个改变或少于约5个，4个，3个，2个或1个改变。可以在一个或多个框架区和/或一个或多个CDR中进行改变。特别地，改变可以在VH CDR1，VH CDR2和/或VH CDR3，尤其是在VH CDR3中进行。
本发明的特异性结合成员可以是与任何能结合生腱蛋白C大同种型，特别是其A1或C结构域的特异性结合成员竞争结合抗原的一种特异性结合成员，并且包括特异性结合成员、本文披露的VH和/或VL结构域或本文披露的VH CDR或任何它们的变体。可以在体外很容易地对结合成员之间的竞争进行检测，例如，使用ELISA和/或通过用特异性报导分子标记可以一个特异性结合成员，其在有其它未标记的结合成员存在下检测，能够鉴定特异性结合相同或重叠表位的特异性结合成员。
因此，本发明的另一个方面提供了特异性结合成员，包括人抗体抗原结合部位，它与4A1-F16，3A1-D5，E10，A12，F4，G11，P12，D11和F4S中的一个或多个竞争结合生腱蛋白C。
本领域可以利用各种方法获得可以与4A1-F16，3A1-D5，E10，A12，F4 G11，P12，D11或F4S竞争的抗生腱蛋白C大同种型的抗体。与生腱蛋白C小同种型相比较，优选这类抗体优先结合生腱蛋白C大同种型。
本发明在另一个方面中提供了获得一个或多个能够结合抗原的特异性结合成员的方法，该方法包括使本发明的特异性结合成员文库和所述的抗原接触，并且筛选文库中能够结合所述抗原的一个或多个特异性结合成员。
文库可以是展示在噬菌体颗粒的表面的，各颗粒含有编码在其表面上展示的抗体VH可变结构域的核酸，并且另外任选地展示的VL结构域(如果存在的话)。
在选择能够结合抗原并且在噬菌体颗粒上展示的特异性结合成员后，可以从展示所述选择的特异性结合成员的噬菌体颗粒中提取核酸。这类核酸可以用于随后的特异性结合成员或抗体VH可变结构域(任选抗体VL可变结构域)的生产，所述的生产通过由具有取自展示所述选择的特异性结合成员的噬菌体颗粒的核酸序列的核酸表达而进行。
具有所述选择的特异性结合成员的抗体VH可变结构域氨基酸序列的抗体VH可变结构域可以以分离的形式提供，也可以是作为包含这类VH结构域的特异性结合成员的形式提供。
可以进一步测试结合生腱蛋白C的能力，还可以测试与4A1-F16，3A1-D5，E10，A12，F4，G11，P12，D11或F4S竞争结合生腱蛋白C的能力。
本发明的特异性结合成员可以以4A1-F16，3A1-D5，E10，A12，F4，G11，P12，D11或F4S或中的一个或多个的亲和力或以较大或较小亲和力结合生腱蛋白C。
可以在适当条件下比较不同特异性结合成员的结合亲和力。
除抗体序列外，本发明的特异性结合成员还可以包括其它氨基酸，例如形成肽或多肽，例如折叠的结构域的氨基酸，或除了结合抗原的能力之外，赋予该分子另一种功能性特征传的氨基酸。
本发明的特异性结合成员可以携带可检测标记，例如有利于肿瘤检测的试剂，例如放射性核素或荧光团，或可以与能够引起杀生物效果的试剂，例如放射性核素、光敏剂、药物、细胞因子、前凝血因子、毒素或酶缀合(例如通过肽基键或接头)，以用于治疗。
本发明在另一个方面中提供了包含编码本发明特异性结合成员的分离的核酸，本发明的VH或VL结构域的序列，制备本发明的特异性结合成员，VH结构域和/或VL结构域的方法，该方法包括在使所述特异性结合成员，VH结构域和/或VL结构域产生的条件下表达所述的核酸并且回收它。
本文所述的特异性结合成员可以用于人或动物体的治疗或诊断方法，例如治疗人类患者的疾病或病症，特别是增殖性病症，例如癌症的方法(可以包括预防性治疗)，该方法包括对所述的患者给予有效量的特异性结合成员。
本发明的另一个方面提供了一般为分离的编码本文披露的抗体VH可变结构域和/或VL可变结构域的核酸。
本发明的另一个方面提供了一般为分离的编码本文披露的VH CDR或VL CDR序列的核酸，所述的VH CDR或VL CDR序列尤其是选自SEQID NO 5，6，7，13，18，19，20，26和27的VH CDR或选自SEQ IDNO 8，9，10，21，22，23，32和33的VL CDR。
另一个方面提供了用本发明核酸转化的宿主细胞。
另一个方面提供了生产抗体VH可变结构域的方法，该方法包括由编码核酸产生表达。这类方法可以包括在生产所述抗体VH可变结构域的条件下培养宿主细胞。
还提供了用于生产包含VH和/或VL结构域的VL可变结构域和特异性结合成员的类似方法作为本发明的另一个方面。
生产方法可以包括分离和/或纯化产物的步骤。
生产方法可以包括将产物配制成包括至少一种额外成分，例如药学上可接受的赋形剂的组合物。
本发明的这些和其它方面在下文中进一步详细描述。
术语
特异性结合成员
该术语描述了彼此具有结合特异性的分子对中的成员。特异性结合对中的成员可以天然衍生或完全或部分合成产生。分子对中的一个成员在其表面上具有一定面积或腔，其特异性地结合于且由此与分子对中的另一个成员的特定空间和极性构成互补。因此，该对中的成员具有彼此特异性结合的特性。特异性结合对的类型的实例为抗原-抗体，生物素-抗生物素蛋白，激素-激素受体，受体-配体，酶-底物。本申请涉及抗原-抗体类反应。
抗体
该术语描述了无论是天然，还是部分或完全合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖了具有抗体结合结构域或基本上与之同源的结合结构域的任何多肽或蛋白质。抗体的实例为：免疫球蛋白同种型及其同种型亚类；包含抗原结合结构域的片段，例如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双抗体。也可以是用单克隆和其它抗体并使用重组DNA技术生产保留原始抗体特异性的其它的抗体或嵌合分子。这类技术可以包括导入编码免疫球蛋白可变区或不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加上框架区的抗体的互补决定区(CDR)的DNA。例如，参见，EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。可以使产生抗体的杂交瘤或其它细胞进行遗传突变或其它改变，它们可以改变产生的抗体的结合特异性，也可以不改变产生的抗体的结合特异性。
抗体可以用多种方式修饰，应将术语“抗体”解释为包括任何具有具备所需特异性的结合结构域的特异性结合成员或物质。因此，该术语包括抗体的抗体片段、衍生物、功能等效物和同源物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是完全或部分合成的。由此包括包含与另一种多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等效物的嵌合分子。抗体的克隆和表达描述在EP-A-0120694和EP-A-0125023中。
已经证实完整抗体的片段可以执行结合抗原的功能。结合片段的实例为：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward，E.S.等Nature 341，544-546(1989))；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，即一种包含两个Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过使得两种结构域结合成抗原结合部位的肽接头连接(Bird等，Science，242，423-426，1988；Huston等，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；和(ix)  “双抗体”，即通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448，1993)。Fv、scFv或双抗体分子可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫键来稳定(Y.Reiter等Nature Biotech 14 1239-1245 1996)。还制备了包含与CH3结构域连接的scFv的Minibodies(S.Hu等，Cancer Res.56 305 5-30611996)。
双抗体(diabody)为多肽类的多聚体，多肽各自包括包含免疫球蛋白轻链结合区的第一结构域和包含免疫球蛋白重链结合区的第二结构域，这两个结构域是连接的(例如通过肽接头)，但不能彼此结合成抗原结合部位：抗原结合部位通过多聚体中的一个多肽的第一结构域与多聚体内的另一个多肽的第二结构域结合而形成(WO94/13804)。
如果使用双特异性抗体，那么它们可以为可以按照各种方式制备，例如以化学方式或由杂种杂交瘤制备的常用的双特异性抗体(Holliger，P.和Winter G.Current Opinion Biotechnol.4，446-449(1993))或可以为上述双特异性抗体片段中的任何一种。可以仅使用可变结构域构建不含Fc区的双抗体和scFv，从而能够减少抗独特型反应的作用。
与双特异性完整抗体相反，双特异性双抗体也可能特别有用，因为它们易于构建并且在大肠杆菌中表达。易于使用来自文库的噬菌体展示(WO94/13804)选择具有适当的结合特异性的双抗体(和许多其它多肽类，例如抗体片段)。例如，如果抗体的一条臂保持指向抗原X的特异性恒定，那么可以制作另一条臂可变的文库，然后选择具有适当特异性的抗体。可以通过结进孔(knobs-into-holes)工程制备双特异性完整抗体(J.B.B.Ridgeway等，Protein Eng.9616-621，1996)。
抗原结合结构域
该术语描述了包含特异性结合抗原的部分或整体并且与之互补的区的抗体部分。如果抗原较大，那么抗体可能仅结合抗原的特定部分，该部分称作表位。抗原结合结构域可以由一个或多个抗体可变结构域提供(例如，所谓的由VH结构域组成的Fd抗体片段)。优选抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
特异性
该术语指特异性结合对中的一个成员不会对任何它的特异性结合伴侣之外的分子表现出显著的结合的状态。例如，对生腱蛋白C具有特异性的抗体表现出很弱的或者没有对胞外基质的其它成分，例如纤连蛋白的结合。类似地，对生腱蛋白C大同种型具有特异性的抗体表现出很弱的或未表现出对生腱蛋白C小同种型的结合。该术语还有另外的应用，其中，例如抗原结合结构域对很多个抗原所携带的特定表位具有特异性，在这种情况中，携带抗原结合结构域的特异性结合成员将能够结合携带所述表位的各种抗原。
包含
该术语一般以包括的含义使用，即允许一个或多个特征或成分存在。
分离的
该术语是指本发明的特异性结合成员或编码这类结合成员的核酸的状态将符合本发明。成员和核酸为游离的或基本上不含它们与之天然结合的物质，例如它们在其天然环境或通过在体外或体内实施重组DNA技术进行制备时的环境中(例如细胞培养物)被发现的与之结合的其它多肽类或核酸。可以使用用于分离的实际目的的稀释剂或佐剂配制成员和核酸，例如，一般会将所述的成员与明胶或其它载体混合，如果将它们用于包被用来免疫测定的微量滴定板，或在用于诊断或疗法时将它们与药学上可接受的载体或稀释混合的话。特异性结合成员可以是天然或通过异源真核细胞系统(例如CHO或NS0(ECACC85110503)细胞)糖基化的，或它们可以是非糖基化的(例如如果通过在原核细胞中表达产生)。
所谓“基本上如所示的”是指本发明的相关CDR或VH或VL结构域与如本文所示的指定区域的序列相同或非常类似。“非常类似”可视为可在CDR和/或VH或VL结构域中进行1-5个，优选1-4个，例如1-3或1或2或3或4个取代。
携带本发明CDR的结构一般是抗体的重链或轻链序列或其主要部分，其中CDR位于相当于天然存在的由重排免疫球蛋白基因编码的VH和VL抗体可变结构域的CDR的位置上。可以参照(Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of Immunological Interest.4th Edition.US Department of Health and Human Services.1987，及其补充的最新资料，目前可以在互联网上得到(http://immuno.bme.nwu.edu))测定免疫球蛋白可变结构域的结构和位置。
优选在人可变结构域或其主要部分中携带基本上如本文所示的CDR氨基酸序列作为CDR。
可以由任何种系或重排的人的可变结构域获得用于本发明的可变结构域，或其可以为基于已知的人可变结构域的共有序列的合成可变结构域。可以使用重组DNA技术将本发明的CDR序列(例如CDR1、CDR2或CDR3)导入缺乏CDR(例如相应的CDR1、CDR2或CDR3)的可变结构域的常在性组成中(repertoire)。
例如，Marks等(Bio/Technology，1992，10：779-783)描述了生产抗体可变结构域的常在性组成的方法，其中指向或邻近于可变结构域区的5′末端的共有引物用于连接人VH基因第三框架区的共有引物，以提供缺乏CDR3的VH可变结构域。Marks等进一步描述了如何将这种常在性组成与特定抗体的CDR3结合。使用类似技术，可以使用缺乏CDR的VH或VL结构域常在性组成改组的本发明的CDR衍生的序列，并且可以将完成改组的VH或VL结构域与同源的VL或VH结构域结合成本发明的特异性结合成员。然后可以在合适的宿主系统，例如WO92/01047的噬菌体展示系统中展示常在性组成，以选择合适的特异性结合成员。常在性组成可以由来自104个以上的各成员，例如106-108或1010个成员的任何个组成。
类似的改组或重组技术还由Stemmer(Nature，1994，370：389-391)披露，他描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术，并且观察到这种手段可以用于抗体的生成。
另一种备选是产生携带本发明CDR-衍生的序列的新VH或VL区，其是通过在完整可变结构域内对一个或多个选择的VH和/或VL基因使用随机诱变以产生突变而得到的。这类技术由Gram等(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 89：3576-3580)描述，他使用了易错PCR。
可以使用的另一种方法对VH或VL基因的CDR区进行定向诱变。这类技术由Barbas等(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：3809-3813)和Schier等(1996，J.Mol.Biol.263：551-567)披露。
所有上述技术照此在本领域中均为已知的并且其自身并不构成本发明的组成部分。本领域技术人员能够应用这类技术来使用本领域中的常规方法提供本发明的特异性结合成员。
本发明的另一个方面提供了用于获得对生腱蛋白C具有特异性的抗体抗原结合结构域的方法，该方法包括：通过在本文所示的VH结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸提供了作为VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域；任选将由此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域结合，并且测试VH结构域或VH/VL的组合或多种组合以鉴定对生腱蛋白C具有特异性的特异性结合成员或抗体抗原结合结构域。所述的VL结构域可以具有基本上如本文所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，可以向VH结构域的一个或多个CDR，例如CDR1、CDR2和/或CDR3中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸。
可以使用类似的方法，包括通过在本文所示的VL结构域的氨基酸序列中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸以提供作为VL结构域的氨基酸序列变体的VL结构域；将由此提供的VL结构域与一个或多个VH结构域结合，并且测试VH结构域或VH/VL的组合或多种组合以鉴定对生腱蛋白C具有特异性的特异性结合成员或抗体抗原结合结构域。所述的VH结构域可以具有基本上如本文所示的氨基酸序列，或可以为基本上如本文所示的如上所述获得的VH结构域的氨基酸序列变体。
在某些实施方案中，可以向VL结构域的一个或多个CDR中添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸。
本发明的另一个方面提供了制备对生腱蛋白C具有特异性的特异性结合成员的方法，该方法包括：
(a)提供编码VH结构域的起始常在性组成的核酸，所述的VH结构域包括将被取代的CDR或缺乏CDR编码区；
(b)将所述的常在性组成与编码基本上如本文所所示的用于VHCDR的氨基酸序列的供体核酸结合，以便将所述的供体核酸插入常在性组成中的CDR区，从而提供编码VH结构域的常在性组成产物的核酸；
(c)表达所述常在性组成产物的核酸；
(d)选择特异于生腱蛋白C抗原的特异性结合成员；和
(e)回收所述的特异性结合成员或编码它的核酸。
CDR可以为VH CDR1、CDR2或CDR3。
此外，可以使用类似的方法，其中将本发明的VL CDR与编码VL结构域的核酸的常在性组成结合，所述的VL结构域包括将被取代的CDR或缺乏CDR编码区。
CDR可以为VL CDR1、CDR2或CDR3。
类似地，可以将一个或多个或所有三个CDR移植入VH或VL结构域的常在性组成中，所述的VH或VL结构域然后用于筛选特异性结合成员或对生腱蛋白C，特别是生腱蛋白C大同种型具有特异性的特异性结合成员。
免疫球蛋白可变结构域的主要部分包含至少三种CDR区域和间隔框架区。优选该部分还包括第一和第四框架区各自的至少约50％或它们两者，其中50％为50％的第一框架区的C-末端和50％的第四框架区的N-末端。可变结构域主要部分的N-末端或C-末端上的额外残基可以为并非通常与天然存在的可变结构域区结合的那些残基。例如，通过重组DNA技术来构建本发明特异性结合成员可以导致引入NB或编码接头的C-末端残基，以便于克隆或其它操作步骤。其它操作步骤包括引入接头以便如下文更详细描述的将本发明的可变结构域与另一种蛋白质序列，包括免疫球蛋白重链、其它可变结构域(例如在双抗体生产中)或蛋白质标记连接。
尽管在本发明的优选方面中，优选包含VH和VL结构域对的特异性结合成员，但是基于VH或VL结构域序列的单一结合结构域(singlebinding domain)形成本发明的另一个方面。已知单一免疫球蛋白结构域，尤其是VH结构域能够以特异性方式结合靶抗原。
就单链特异性结合结构域的情况而言，这些结构域可以用于筛选能够形成能与生腱蛋白C结合的双结构域(two-domain)特异性结合成员的互补结构域。
可以通过使用WO92/01047中披露的所谓的分级双重组合手段(hierarchical dual combinatorial approach)的噬菌体展示筛选方法实现这一目的，其中将含有单独的H或L链的各菌落用于感染编码另一条链(L或H)的克隆的完整文库，然后按照噬菌体展示技术，例如参考文献中所述的那些技术对所得到的双链特异性结合成员进行选择。这种技术也披露在Marks等上文的相同文献中。
本发明的特异性结合成员可以进一步包括抗体恒定区或其部分。例如，VL结构域可以在其C-末端上与包括人Cκ或Cλ链，优选Cλ链的抗体轻链恒定结构域结合。类似地，基于VH结构域的特异性结合成员可以在其C-末端与来源于任何抗体同种型，例如IgG、IgA、IgE和IgM和任何该同种型的亚类，特别是IgG1和IgG4的免疫球蛋白重链的全部或部分结合。
可以用可检测的或功能性的标记来标记本发明的特异性结合成员。
可检测标记可以包括放射性核素，例如碘-131、钇-90、铟-111和锝-99，可以使用抗体成像领域中已知的常规化学方法使其与本发明的抗体结合。用放射性同位素标记的特异性结合成员可以用于将放射物选择性地递送至具体的靶标，例如肿瘤。它可以用于如下所述使肿瘤成像或递送毒性剂量的射线。
其它可检测标记可以包括：酶标记，例如辣根过氧化物酶；化学部分，例如生物素可以通过结合特异性相关的可检测部分，例如抗生物素蛋白检测；荧光染料，例如荧光素、罗丹明、藻红蛋白；和德克萨斯红和近红外荧光团，包括花菁染料衍生物，例如Cy7(AmershamPharmacia)和Alexa750(Molecular probes)。
在其它实施方案中，可检测标记可以包括可通过超声检测的微气泡衍生物(Joseph S等Pharm Res.2004 Jun；21(6)：920-6)或磁性颗粒(Schellenberger EA等Bioconjug.Chem.2004 9月-10月；15(5)：1062-7)。
功能性标记可以包括能够引发杀生物事件或具有抗癌作用的制剂。合适的标记包括放射性核素、光敏剂、毒素多肽类、毒性小分子和其它药物、细胞因子(例如IL2、IL12、TNF)、趋化因子、前凝血因子(例如组织因子)、酶、脂质体和免疫应答因子(例如，参见D.Neri(2004)CHIMIA “Tumor Targeting”vol.58，723-726页)。
放射性核素包括碘-131、钇-90、铟-111和锝-99并且再前述中已经进行了具体的描述。
毒素多肽或肽具有细胞毒性或细胞凋亡活性并且可以来源于微生物、植物、动物或人体来源。在某些实施方案中，可以将毒素多肽直接插入特异性结合成员的恒定区。毒素多肽类的实例包括假单胞菌属外毒素、蓖麻毒素α-链和血管生成素。
毒性小分子包括具有细胞毒性活性的化学化合物，包括，例如，DNA-复合剂或细胞周期抑制剂。在某些实施方案中，可以通过裂解pH-或酶-敏感性接头(例如含有亚胺键的接头)在靶细胞附近释放毒性小分子。毒性小分子的实例包括美登素、calicheamicin、埃坡霉素和异烟肼及其衍生物。
免疫应答因子可以包括结合效应细胞的特异性结合成员。特异性结合成员的结合可以引起对靶细胞的细胞介导的免疫应答。
在优选的实施方案中，本发明的特异性结合成员与细胞因子缀合。可以生产包含特异性结合成员或其多肽成分(例如抗体的重链或轻链或多链抗体片段，例如Fab)和细胞因子的融合蛋白。因此，例如，本发明特异性结合成员的VH结构域或VL结构域可以与细胞因子融合。一般而言，特异性结合成员或其成分和细胞因子通过肽接头，例如约5-25个残基的肽，例如10-20个残基，优选约15个残基连接。本文中给出了合适的肽接头的实例。优选细胞因子为IL2，更优选为人IL2。细胞因子可以为融合的特异性结合成员或其多肽成分的上游(N-末端)或下游(C-末端)。优选的实施方案为包含本发明特异性结合成员(尤其是抗体分子，例如scFv分子)和IL2的融合蛋白。这类融合蛋白的氨基酸序列和包含编码它们的核苷酸序列的核酸构成了本发明的组成部分。
本发明的特异性结合成员可以用于诊断方法，例如肿瘤成像或用于治疗人或动物受试者，例如用于治疗癌症情况。
因此，本发明的额外方面提供了包括给予提供的特异性结合成员的治疗方法，包含这类特异性结合成员的药物组合物和这类特异性结合成员在制备给药用药剂，例如在制备包含用药学上可接受的赋形剂配制的特异性结合成员的药剂或药物组合物中的应用。
用于治疗方法的特异性结合成员优选与引起抗肿瘤作用的功能性标记缀合或与之连接。在优选的实施方案中，如上所述，特异性结合成员与细胞因子，例如IL2缀合或与之连接。
如本文所述的特异性结合成员可以用于提供治疗有益作用的临床适应征包括增殖性病症，例如恶变前和恶性赘生物和肿瘤(例如组织细胞瘤、神经胶质瘤、星细胞瘤、骨瘤)、癌(例如肺癌、小细胞肺癌、胃肠癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤)、白血病和血管生成疾病。
恶变前或恶变情况可以在任何细胞类型中发生，包括，但不限于肺、结肠、乳腺、卵巢、前列腺、肝、胰腺、脑和皮肤。
适合于如本文所述的治疗的增殖性病症的特征在于存在生腱蛋白C大同种型，特别是包含A1或C结构域的大同种型表达增加或升高的细胞或组织。
可以对个体给予本发明提供的组合物。优选以“治疗有效量”给药，它足以表现出对患者的有益作用。这类有益作用可以至少是改善至少一种症状。实际的给药量和给药时间过程取决于所治疗情况的性质和严重程度。治疗处方，例如有关剂量的决定等属于一般从业医师和其他医生的能力范围。合适的抗体剂量为本领域众所周知的；参见Ledermann J.A.等(1991)Int J.Cancer 47：659-664；Bagshawe K.D.等(1991)Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals4：915-922。
精确剂量取决于许多因素，包括抗体是用于诊断，还是用于治疗，所治疗的面积大小和位置，抗体的确切性质(例如完整抗体，片段或双抗体)和与抗体结合的任何可检测标记或其它分子的性质。用于全身施用的典型抗体剂量在0.5mg-100g，并且用于局部施用的典型抗体剂量为10μg-1mg。一般而言，抗体为完整抗体，优选IgG1或IgG4同种型。这是用于单一治疗成年患者的剂量，可以针对儿童和婴儿按比例调整，并且还可以为其它抗体形式按照与分子量的比例调整。可以根据临床医师的判断，以每天，每周两次，每周或每月间隔反复治疗。
通常以药物组合物的形式给予本发明的特异性结合成员，该药物组合物可以包含至少一种成分与特异性结合成员。
因此，本发明的药物组合物和本发明的应用除包括活性组分外，还可以包括药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域技术人员众所周知的物质。这类物质应是无毒性的并且不应干扰活性组分的功效。载体或其它物质的确切性质取决于给药途径，可以是口服或通过注射，例如静脉内。
口服给药用的药物组合物可以为片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包含固体载体，例如明胶或佐剂。液体药物组合物一般包含液体载体，例如水、凡士林、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液，或乙二醇类，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
为了静脉内注射或注射在患病部位，活性组分可以为无热原并且具有合适的pH、等渗性和稳定性的非肠道可接受的水溶液形式。相关领域技术人员能够很好地使用例如等渗媒介物，例如，例如氯化钠注射液、乳酸盐林格注射液制备合适的溶液。如果需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。
可以单独或与其它治疗方法同时或依次给予组合物，这取决于所治疗的疾病。其它治疗可以包括给予合适剂量的疼痛缓解药物，例如非类固醇抗炎药(例如阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬或酮洛芬)或阿片类物质，例如吗啡或止吐药。
本发明的另一个方面提供了检测和/或成像肿瘤细胞的方法，包括对个体给予如本文所述的抗体并且检测所述抗体与所述个体肿瘤细胞的结合。
用于这类方法的优选抗体可以与可检测标记，例如放射性核素或荧光团缀合或与之连接。
本发明的方法可以包括导致或允许如本文提供的特异性结合成员与生腱蛋白C结合。正如注意到的，这类结合例如可以在给予特异性结合成员或编码特异性结合成员的核酸后在体内进行。
可以测定特异性结合成员与生腱蛋白C结合的量。在某些实施方案中，可以测定特异性结合成员与获自个体的样品结合。在其它实施方案中，例如，可以在对个体体内的肿瘤成像或检测过程中测定体内特异性结合成员与抗原的结合。
可以定量与可能与诊断目的有关的抗原的量。
可以提供任何合适的方式测定抗体的结合。例如，可以使抗体与报导分子或可检测标记连接或与之缀合，然后对样品测定所述标记或报导分子的存在、量或定位。
可以测定体内抗体结合，例如在分子成像方法可以通过放射性检测(例如PET，SPECT)，近红外荧光成像(例如发散性光学断层摄影术，内窥镜检查)，超声(例如使用靶向的微气泡衍生物和MRI(使用靶向的磁性颗粒)进行测定。
在其它实施方案中抗体结合可以在体外进行，例如，可以在ELISA，蛋白质印迹，免疫细胞化学，免疫沉淀或亲和色谱法中进行。
检测和/或成像肿瘤细胞的方法由此可以包括使如本文所述的抗体接触获自个体的样品并且检测所述抗体与所述样品中肿瘤细胞的结合。
用于这类体外方法的优选抗体可以与报导分子缀合或与之连接。报导分子可以为具有光谱分离吸收或发射特征放射性核素、荧光染料、磷光体或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和德克萨斯红。合适的发色染料包括二氨基联苯。就体内成像而言，优选放射性核素或荧光团。
其它报导分子包括大分子胶体颗粒或颗粒物质，例如着色的磁性或顺磁性胶乳珠和可以直接或间接产生目视观察到的、电检测到的，否则就是可记录的可检测信号的和生物或化学制剂。这些分子可以为酶，例如，它们可以催化显色或改变颜色或导致电特性改变的反应。它们可以为分子可激发的，使得能量状态之间的电子跃迁产生光谱吸收或发射。它们可以包括用于与生物传感器结合的化学本体。可以使用生物素/抗生物素蛋白或生物素/链霉抗生物素和碱性磷酸酶检测系统。
测定结合的方式并非本发明的特征，并且本领域技术人员能够根据参考文献和一般知识选择合适的方式。
本发明进一步涉及与任何特异性结合成员竞争性结合生腱蛋白C的特异性结合成员，二者都结合生腱蛋白C，其包含包括具有基本上如本文所示的氨基酸的CDR的V结构域或者具有基本上如本文所示的氨基酸序列的V结构域(例如如本文所示的特异性结合成员)。结合成员之间的竞争可以很容易地在体外进行测定，例如，用特异性的报道分子标记一个结合成员，在其他未标记的结合成员的存在下对标记的分子进行检测，从而能够鉴定结合于相同表位或重叠表位的特异性结合成员。可以使用标准技术，例如ELISA测定竞争。
在测试竞争的过程中，可以使用抗原的肽片段，尤其是包括所关注的表位的肽。可以使用在任一末端上加上一个或多个氨基酸的具有表位序列的肽。这类肽可以说成是“主要由”指定的序列组成。本发明的特异性结合成员对抗原的结合可以被具有指定序列或包括指定序列的肽所抑制。在测试它的过程中，可以使用具有任一序列再加上一个或多个氨基酸的肽。合适的肽类可以获自生腱蛋白C的D、C和/或A1结构域的序列。
结合特异性肽的特异性结合成员可以通过例如，用肽(类)筛选噬菌体展示文库而被分离出来。
本发明进一步提供了编码本发明特异性结合成员的分离的核酸。核酸包括DNA和RNA。本发明在优选的方面中提供了编码如上述定义的本发明CDR或VH或VL结构域的核酸。
本发明还提供了包含至少一种上述多核苷酸的质粒、载体、转录或者表达盒的构建体。
本发明还提供了包含一个或多个上述构建体的重组宿主细胞。当实施生产编码的产物的方法时，编码任何的CDR、VH或VL结构域的核酸或作为所提供的特异性结合成员本身构成了本发明的一方面的内容，该方法包括从编码其核酸进行的表达。可以便利地在适当条件下培养含有所述核酸的重组宿主细胞进行表达。在提供表达生产后，可以使用任何合适的技术分离和/或纯化VH或VL结构域或特异性结合成员，然后根据需要使用。
例如，可以从天然环境中提供，分离和/或纯化基本上纯的或均质形式的本发明的特异性结合成员，VH和/或VL结构域和编码核酸的分子和载体，或在核酸的情况下，除了编码具有需要的功能的多肽的序列外，不含或基本上不含核酸或基因来源。本发明的核酸可以包含DNA或RNA，并且可以全部或部分是合成的。除非上下文中另作要求，否则涉及的本文所述的核苷酸序列包括具有特定序列的DNA分子，并且包括具有特定序列的RNA分子，其中U取代T。
用于克隆和表达各种不同宿主细胞的中的多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域中可利用表达异源多肽的哺乳动物细胞系，包括中国仓鼠卵巢细胞、Hala细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞等。通常优选的细菌宿主为大肠杆菌。
本领域中充分确立了抗体和抗体片段在原核细胞，例如大肠杆菌中的表达。就综述而言，例如，参见Plückthun，A.Bio/Technology9：545-551(1991)。本领域技术人员还可以选择利用在培养物中的真核细胞的表达生产特异性结合成员，就近期综述而言，例如，参见Ref，M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4：573-576；Trill J.J.等(1995)Curr.Opinion Biotech 6：553-560。
可以选择或构建合适的载体，它们含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和如果合适的其它序列。如果合适，载体可以为质粒，病毒，例如，噬菌体或噬菌粒。就进一步详细内容而言，例如，参见Molecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd edition，Sambrook等，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press。在操作核酸，例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA导入细胞和基因表达和蛋白质分析中的任何已知技术和方案具体地描述在Molecular Biology，Second Edition，Ausubel等eds.，John Wiley&Sons，1992中。将Sambrook等和Ausubel等披露的内容引入本文作为参考。
因此，本发明的另一个方面提供了含有如本文所披露的核酸的宿主细胞。另一个方面提供了包含将这类核酸导入宿主细胞的方法。导入可以使用任何可利用的技术。就真核细胞而言，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、使用逆转录病毒或其它病毒，例如牛痘，或对昆虫细胞而言使用杆状病毒的脂质体介导的转染和转导。就细菌细胞而言，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体转染。
导入后可以例如通过在用于基因表达的条件下培养宿主细胞，从而导致或允许由核酸表达。
在一个实施方案中，将本发明的核酸整合入宿主细胞基因组(例如染色体)。可以按照标准技术，通过包含促进与所述基因组重组的序列促进整合。
本发明还提供了一种方法，该方法包括在表达系统中使用如上所述的构建体以便表达上述特异性结合成员或多肽。
本发明的其它方法包括使如本文所述的特异性结合成员与可检测标记或抗癌剂缀合或与之连接。
合适的标记和药剂如上所述。可以使用标准化学方式使标记和药剂与特异性结合成员缀合。
附图说明
图1表示小(A)和大(B)生腱蛋白C同种型的图解表示。使几种III型纤连蛋白类结构域进行在分子中可以包括(B)或不包括(A)的可变剪接。
图2表示在具有U87肿瘤异种移植物的裸鼠中的4A1-F16-SIP抗体的生物分布。(A)数值代表注射后3(上部)和6(下部)小时时的每组3只小鼠的每克组织中注射剂量的百分比平均值。误差线代表标准偏差。
图3表示在具有U87肿瘤异种移植物的裸鼠中的4A1-F16-SIP抗体的生物分布。(A)数值代表注射后24(上部)和48(下部)小时时的每组3只小鼠的每克组织中注射剂量的百分比平均值。误差线代表标准偏差。
图4表示图2和3中所示的生物分布的变化。
图5表示SIP(P12)的生物分布。将3.5μg SIP(P12)注入具有皮下U87人成胶质细胞瘤的小鼠。每一时间点代表来自4只动物的结果。
具体实施方式
现在通过参照下列实验解释本发明的方面和实施方案。
根据本发明披露的内容，本发明的各种其他方面和实施方案对本领域技术人员而言显而易见。将本说明书中提及的所有对比文件完整地引入本文作为参考。
本发明包括上述特征各自和每种的组合和子组合。
现在通过各实施例并且参照上述图和下述表来解释本发明的某些方面和实施方案。
实施例1
通过RT-PCR，从mRNA克隆编码人生腱蛋白C的结构域A1的基因，具体为在没有血清存在下在pH 7.5下培养的正常人真皮的成纤维细胞(NHDF)[16]，通过PCR，使用寡聚TnC-A1 BamHI ba(cgggatcctccactgaacaagcccctgag)和TnC-A1 Bg1II for(ggagatctttcccctgtggaggcctcagc)从所述细胞分离得到所述的mRNA。然后将基因克隆入pQE12细菌表达载体(Qiagen)并且在大肠杆菌TG-1中表达。通过His-标记，使用加载了镍的Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)进行纯化。
使用磺基-NHS-SS-生物素(Pierce)使纯化的结构域A1在选择前进行生物素标记。如(Viti F，等Methods Enzymol 2000；326：480-505)所述进行生物筛选(biopanning)。简言之，将生物素化的蛋白(终浓度10-7M)与600μl预封闭的ETH-2文库噬菌体一起孵育30分钟。通过添加5.3×10-7链霉抗生物素包被的磁性珠(Dynal)俘获结合的噬菌体。在强洗涤后，通过还原生物素接头中的二硫键洗脱所选择的噬菌体。在TG-1中扩增分离的噬菌体并且通过聚乙二醇沉淀从上清液中浓缩。在三轮的孵育后，通过如Viti F，等Methods Enzymol 2000；326：480-505中所述进行ELISA，筛选出144个分离的抗体克隆。将链霉抗生物素包被的ELISA平板(StreptaWell High Bind，Roche)与生物素化的抗原一起孵育，加入诱导性表达scFv抗体的片段的大肠杆菌TG-1单克隆培养物上清液，然后使用M2单克隆抗体，随后使用抗小鼠免疫球蛋白G-HRP缀合物检测结合的抗体。通过实时相互作用分析，使用BIAcore 3000仪来分析具有最高信号的抗体克隆。在蛋白质A-琼脂糖柱上纯化三种最佳克隆，并且通过对各种肿瘤冷冻切片免疫组织化学分析进行测试。
在免疫组织化学中表现出选择性染色模式的克隆中选择出一个克隆scFv(3A1-D5)用于亲和成熟(affinity maturation)。通过PCR，使用寡核苷酸LMB3 long ba(caggaaacagctatgaccatgattac，抗体基因5′末端的引发上游)和DP47CDR1mut for(agcctggcggacccagctcgcmnnmnnmnngctaaaggtgaatccagaggctgc)在可变重链(VH CDR1)的互补性决定区1内31-33位上插入随机突变，在质粒载体pDN322(Pini A等J Biol Chem 1998；273：21769-21776)中构建亲和成熟文库。使用引物DP47CDR1 ba(gagctgggtccgccaggctcc)和fdseq longfor(gacgttagtaaatgaattttctgtatgagg)扩增抗体基因的3′末端。通过使用引物LMB3 long ba和fdseq long for装配两种片段。
使用生物素化的抗原对亲和成熟文库进行生物筛选。在两轮筛选(如上所述，但使用10-8M生物素化的抗原)后，通过ELISA筛选出总计382个抗体克隆。通过M2-ELISA(Scheuermann J等J Immunol Methods2003；276：129-134)进一步表征在ELISA中为阳性的69个克隆，以便评价各抗体克隆的koff值。简言之，将含有scFv抗体的上清液加入到包被了抗Flag M2单克隆抗体(SIGMA)的表面上。在添加生物素化的抗原并且孵育至平衡后，加入过量的未生物素化的抗原作为竞争剂。在0，30，60，90和120分钟的竞争时间后，使用链霉抗生物素-HRP缀合物检测剩余的生物素化的抗原级分。
将BIAcore用于对基于其解离特性的不同ELISA-阳性克隆进行分级。选择5种最佳克隆用于在抗原包被的琼脂糖柱上纯化。使纯化的抗体进行大小排阻色谱，并且将所得的单体scFv抗体片段级分通过使用BIAcore 3000测定亲和常熟和动力学参数。
通过对编码人免疫球蛋白E的CH4结构域的基因的5′-末端前的scFv(4A1-F16)序列进行基因融合，将具有最佳解离常数(KD)的抗体4A1-F16克隆成二价小抗体(bivalent minibody)形式，从而得到小免疫蛋白(SIP)(Borsi L等Int J Cancer 2002；102：75-85)，称作4A1-F16-SIP。CH4结构域促进同型二聚化，从而因较高的亲和力而增加对抗体的功能性亲和力。
使用生腱蛋白C抗体片段scFv的抗A1结构域(3A1-D5)对人头颈癌组织进行免疫组织化学试验。通过附加在scFv抗体C-末端上的肽FLAG-标记，使用单克隆抗FLAG抗体M2(SIGMA)，随后使用APAAP系统(DAKO)检测一抗。观察到scFv(3A1-D5)和scFv(4A1-F16)对不同头颈癌的冷冻切片上的肿瘤基质和新血管结构强烈染色，而它们不与健康供体的正常口腔粘膜反应。
如下评价4A1-F16-SIP的肿瘤靶向能力：
通过给每只小鼠皮下注射3×106个U87人成胶质细胞瘤细胞(ATCC)在Balb/C裸鼠中诱发肿瘤。在注射后20-25天，当肿瘤达到300-1500mm3大小时，注射放射性标记的抗体。
抗体的制备包括通过在superdex 75上的大小排阻色谱对亲和纯化的4A1-F16-SIP抗体进行进一步纯化。收集代表同型二聚化形式的级分(75kDa)且随后使用非水溶性碘化试剂(Pierce)以碘-125(Amersham)标记。
将约5μg抗体通过静脉内注入具有肿瘤的小鼠尾静脉。分别在3，6，24和48小时后，处死3只小鼠，切下器官并且用γ-计数器测定I-125的蓄积。
实施例2
将编码人生腱蛋白C的结构域C的基因克隆入载体pQE12(Qiagen)[Carnemolla B等Am J Pathol 1999；154：1345-1352，Balza E等FEBS Lett 1993；332：39-43]并且在大肠杆菌TG-1中表达。通过His-标记，使用加载镍的Ni-NTA(Qiagen)进行纯化。
使用磺基-NHS-SS-生物素(Pierce)在选择前对纯化的结构域C进行生物素标记。如[Viti F，等Methods Enzymol 2000；326：480-505]所述地进行生物筛选，不过是在链霉生物素和抗生物素蛋白包被的平板上使用交替筛选的操作步骤。简言之，将生物素化的蛋白(终浓度10-7M)与600μl预封闭的ETH-2文库噬菌体一起孵育30分钟。在包被了抗生物素蛋白(第1和第3个孵育周期)或链霉抗生物素(第2个孵育周期)的塑料微量滴定平板上俘获结合的噬菌体。在充分洗涤后，通过还原生物素接头中的二硫键洗脱选择的噬菌体。在TG-1中扩增分离的噬菌体并且通过聚乙二醇沉淀从上清液中浓缩。在三轮筛选后，通过如[Viti F，等Methods Enzymol 2000；326：480-505]中所述进行ELISA筛选，得到几打的抗体克隆。
将链霉抗生物素包被的ELISA平板(StreptaWell High Bind，Roche)与生物素化的抗原一起孵育，加入表达scFv抗体片段的经诱导的单克隆大肠杆菌TG-1的培养物上清液，并且使用M2单克隆抗体，随后使用抗肽标记抗体，随后使用抗小鼠免疫球蛋白G-HRP缀合物检测结合的抗体。通过实时相互作用分析，使用BIAcore 3000仪来分析具有最高信号的抗体克隆。在蛋白质A-琼脂糖柱上纯化三种最佳克隆，并且通过对各种肿瘤冷冻切片免疫组织化学分析进行测试。选择在免疫组织化学中表现出选择性染色模式的的克隆之一scFv(A12)用于亲和成熟。通过PCR，使用寡核苷酸LMB3 long ba(caggaaacagctatgaccatgattac，抗体基因的5′末端引发上游)，DP47CDR1 for(ctggagcctggcggacccagctcatmnnmnnmnngctaaaggtgaatccagaggctgc)，DP47CDR1 ba(tgggtccgccaggctccag)，DP47CDR2for(gcccttcacggagtctgcgtagtatgtmnnaccaccmnnmnnmnnaatagctgagacccactcc)，DP47CDR2 ba(acatactacgcagactccgtgaagggc)和fdseqlong for(gacgttagtaaatgaattttctgtatgagg)在VH CDR1内的31-33位和VH CDR2内的52，52a，53和56位上插入随机突变，在噬菌体载体pHEN1[Hoogenboom HR等Nucleic Acids Res 1991；19：4133-4137]中构建亲和成熟文库。
使用生物素化的抗原对亲和成熟文库进行生物筛选。在筛选两轮(如上所述)后，通过ELISA筛选出总计382个抗体克隆。用BIAcore进一步表征在ELISA中为阳性的克隆，以便基于其解离特性对不同ELISA-阳性克隆进行分级。在测试的克隆中，scFv(E10)表现出最有希望的性能。
使用生腱蛋白C抗体片段scFv(A12)的抗C结构域对人成胶质细胞瘤多形组织进行免疫组织化学试验。通过附加在scFv抗体C-末端上的肽myc-标记，使用单克隆抗myc标记抗体E10，随后使用APAAP系统(DAKO)检测一抗。观察到这些抗体与血管周围结构发生特异性反应，正如通过成胶质细胞瘤冷冻切片上的免疫组织化学所显示的。
实施例3
使用与实施例2中所述类似的方案，进一步分离针对生腱蛋白C的C结构域的scFv并且分别命名为F4和G11。F4和G11具有两种氨基酸不同的VL结构域并且具有相同的VH结构域。VH和VL结构域通过具有如SEQID NO：37或SEQ ID NO：39所示的分别由SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38编码的氨基酸序列的肽接头连接。
实施例4
通过RT-PCR，使用PCR oligos TnC-D BamHI ba(cgggatccgttacagaagccgaaccggaa-SEQ ID NO：72)和TnC-D Bg1II for(cgggatccgttacagaagccgaaccggaa-SEQ ID NO：73)[16]从分离自人黑素瘤细胞系SKMe1-28的总RNA中克隆编码生腱蛋白C的人结构域D(TnC-D)的基因。将扩增的片段亚克隆入在蛋白质的C-末端引入了His-标记的细菌表达载体pQE12。通过PCR，使用引物mmTnC-A1 Eco Ba(agaattcattaaagaggagaaattaactatgagaggatcctccacggaagaagtgccttc-SEQ ID NO：74)和mmTnC-A1 Bg1Fo(tgagatcttgtccctgtggaggtctcggc-SEQ ID NO：75)从来源于浸润性管癌组织的表达的序列标记(EST)分离编码小鼠TnC-A1同种型的基因并且克隆入载体pQE12(Qiagen)。
使用100nM生物素化的人TnC-D筛选ETH-2文库[26]，然后使用链霉抗生物素包被的磁性珠俘获结合的噬菌体。在筛选三轮后，对生物素化的人TnC-D和生物素化的小鼠-TnC-D进行ELISA来筛选获自188个克隆的上清液。能识别人同种型的大部分克隆也与小鼠TnC-D同种型反应。
在第二次ELISA中检测ELISA阳性克隆上清液，然后通过BIAcore筛选。充分表征6个最佳克隆并且将scFv(F4)鉴定为最佳克隆。scFv(F4)以相同的亲和力与人和小鼠TnC-D结合。
scFv(F4)仅识别在ELISA中包含结构域D的蛋白质并且不与在结构上与结构域D相关的蛋白质反应。然而，它在免疫组织化学中与肿瘤结构的反应只是极为微弱，从而产生难以与背景区分的信号。据推断这是因scFv(F4)亲和力低所致。
将ScFv(F4)用作通过CDR环诱变的亲和成熟的模板[26]。选择残基VLCDR1 30，31，32位和VHCDR2 50，52和53位(按照Kabat编号；[30]用于随机化。将文库克隆入在VLC-末端上附加myc标记的噬菌体载体pHEN[31]。
用生物素化的人TnC-D对亲和成熟文库噬菌体进行第一轮筛选，用生物素化小鼠TnC-D进行第二轮筛选。通过对生物素化的人TnC-D进行ELISA筛选出750个克隆，其中约5％为阳性。在通过BIAcore和ELISA对抗体进一步表征后，将scFv(D11)鉴定为最佳克隆。ScFv(D11)。通过BIAcore对单体级分进行亲和力测定显示scFv(D11)与亲代克隆scFv(F4)相比，亲和力提高了2-4倍。以稍高于人同种型的亲和力结合小鼠同种型。
scFv(D11)在对不同肿瘤组织进行的免疫组织化学试验中取得了良好结果。均用scFv(D11)染色人口腔鳞状细胞癌、人膀胱癌、生长在裸鼠中的A375人黑素瘤和生长在SvEv 129小鼠中的F9鼠F9畸胎癌。抗体与人肿瘤，如头颈癌或膀胱癌的基质以及对各种人和鼠肿瘤模型起强烈反应。
接下来我们使CDR1和scFv(D11)的VH的CDR1内的残基随机化。我们选择了VHCDR1内的31，32，33位残基和VHCDR2内的52，52a，53和56位残基用于随机化(Kabat编号；[32])。使用10-8M人TnC-D作为抗原，通过噬菌体展示进行两轮的选择。为了增加选择的严格性，在添加第一轮中添加抗原前将10nM纯化的可溶性scFv(D11)与噬菌体混合，并且在第二轮的孵育中将1000倍过量的未生物素化的抗原加入到预先筛选的抗原-噬菌体混合物中。
在两轮筛选后的384个克隆中的25％对在ELISA中人生物素化的TnC-D而言为阳性的。在进一步表征后，其为scFv(P12)，将其鉴定为最佳克隆。它对人TnC-D的亲和力与scFv(D11)相比提高4.8倍。
将scFv(P12)克隆成SIP(小免疫蛋白)形式[25]。通过在具有U87人成胶质细胞瘤异种移植物的裸鼠中的生物分布实验评价SIP(P12)的体内靶向性能。经静脉内注射125I-标记的SIP抗体，并且在3，6，24和48小时后，处死动物，切下器官，称重并且对放射性进行计数。大部分器官在距注射后24小时内清除SIP(P12)，并且在24和48小时后观察到肿瘤部位的特异性蓄积，其中肿瘤与血液之比达15(图5和表1)。
表1.放射性标记的P12-SIP在具有U87肿瘤的裸鼠中的生物分布
    3小时     6小时     24小时     48小时
    肿瘤     5.60±0.84     5.17±1.06     2.27±0.53     1.49±0.45
    肠     4.93±0.99     5.02±1.37     2.57±0.74     1.19±0.38
    脾     14.96±4.49     9.58±1.23     1.10±0.26     0.44±0.21
    心脏     3.72±0.18     1.79±0.12     0.17±0.04     0.05±0.01
    肝     8.49±0.76     4.10±0.41     0.39±0.09     0.15±0.05
    肺     5.45±0.29     2.70±0.53     0.46±0.05     0.16±0.05
    肾     14.32±0.62     7.20±0.42     0.89±0.19     0.39±0.16
    血液     7.21±0.53     2.54±0.44     0.29±0.07     0.10±0.05
    肿瘤大小     99.5±62.0     53.5±18.2     102.3±89.6     48.8±35.2
将结果表示为每克组织中注射抗体所占的百分比(％ID/g)±SD
参考文献
1.Bosslet K等Cancer Res 1998；58：1195-1201
2.Jain RK.Adv Drug Deliv Rev 2001；46：149-168
3.Kohler G，Milstein C Nature 1975；256：495-497
4.Winter G等Annu Rev Immunol 1994；12：433-455
5.Halin C等Cancer Res 2003；63：3202-3210
6.Halin C等Nat Biotechnol 2002；20：264-269
7.Nilsson F等Cancer Res 2001；61：711-716
8.Borsi L等Blood 2003；102：4384-4392
9.Carnemolla B等Blood 2002；99：1659-1665
10.Zardi L等Embo J 1987；6：2337-2342
11.Castellani P等Am J Pathol 2002；161：1695-1700
12.Castellani P等Int J Cancer 1994；59：612-618
13.Carnemolla B等.Int J Cancer 1996；68：397-405
14.Borsi L等Int J Cancer 1992；52：688-692
15.Carnemol la B等Eur J Biochem 1992；205：561-567
16.Borsi L等J Biol Chem 1995；270：6243-6245
17.Riva P等Int J Cancer 1992；51：7-13
18.Riva P等Cance r Re s 1995；55：5952s-5956s
19.Paganelli G等Eur J Nucl Med 1994；21：314-321
20.Reardon DA等J Clin Oncol 2002；20：1389-1397
21.Bigner DD等J Clin Oncol 1998；16：2202-2212
22.Carnemolla B等Am J Pathol 1999；154：1345-1352
23.Katenkamp K等J Pathol 2004；203：771-779
24.Viti F，等Methods Enzymol 2000；326：480-505
25.Borsi L等Int J Cancer 2002；102：75-85
26.Pini A等J Biol Chem 1998；273：21769-21776
27.Scheuermann J等J Immunol Methods 200 3；276：129-134
28.Balza E等FEBS Lett 1993；332：39-43
29.Hoogenboom HR等Nucleic Acids Res 1991；19：4133-4137
30.Ignatovich，O.，等(1997).J Mol Biol 268(1)：69-77.31
31.Hoogenboom&Winter(1992).J Mol Biol 227(2)：381-8
32.Tomlinson，等(1992).J Mol Biol 227(3)：776-98
序列
SEQ ID NO：1.4A1-F16 VH结构域核苷酸序列
GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG
TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC CGG TAT
GGT GCG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC
TCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG
AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT
CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT
GCG AAA GCG CAT AAT GCT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC
ACC GTG TCG AGA
SEQ ID NO：2 4A1-F16 VH结构域氨基酸序列
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYGASWVRQA PGKGLEWVSA
ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKAH
NAFDYWGQGT LVTVSREVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYGASWVRQA
PGKGLEWVSA ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED
TAVYYCAKAH NAFDYWGQGT LVTVSR
SEQ ID NO：3 4A1-F16 & 3A1-D5 VL结构域核苷酸序列
TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG
ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA
AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT
GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC
AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA
GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT GTT TAT ACT ATG CCG CCC
GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO：4 4A1-F16 & 3A1-D5 VL结构域氨基酸序列
SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGK
NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSS VYTMPPVVFG
GGTKLTVLG
SEQ ID NO：5 4A1-F16 VH CDR1氨基酸序列
RYGAS
SEQ ID NO：6 4A1-F16 & 3A1-D5 VH CDR2氨基酸序列
AISGSGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO：7 4A1-F16 & 3A1-D5 VH CDR3氨基酸序列
AHNAFDY
SEQ ID NO：8 4A1-F16 & 3A1-D5 VL CDR1氨基酸序列
QGDSLRSYYAS
SEQ ID NO：9 4A1-F16 & 3A1-D5 VL CDR2氨基酸序列
GKNNRPS
SEQ ID NO：10 4A1-F16 & 3A1-D5 VL CDR3氨基酸序列
NSSVYTMPPVV
SEQ ID NO：11 3A1-D5 VH结构域核苷酸序列
GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG
TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC AGC TAT
GCC GCG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC
TCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG
AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT
CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT
GCG AAA GCG CAT AAT GCT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC
ACC GTG TCG AGA
SEQ ID NO：12 3A1-D5 VH结构域氨基酸序列
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAASWVRQA PGKGLEWVSA
ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKAH
NAFDYWGQGT LVTVSR
SEQ ID NO：13 3A1-D5 VH CDR1氨基酸序列
SYAAS
SEQ ID NO：14 E10 VH结构域核苷酸序列
GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG
TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC GGT AGT
CGT ATG GGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC
TCA GCT ATT AAT GAG GAG GGT GGT CAG ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG
AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT
CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT
GCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC
CTG GTC ACC GTG TCG AGA
SEQ ID NO：15 E10 VH结构域氨基酸序列
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GSRMGWVRQA PGKGLEWVSA
INEEGGQTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKHP
PHRPFDYWGQ GTLVTVSR
SEQ ID NO：16.E10 & A12 VL结构域核苷酸序列
TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG
ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA
AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT
GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC
AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA
GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCT
GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO：17 E10 & A12 VL结构域氨基酸序列
SSELTQDPAV SVALGQTVRI TCQGDSLRSY YASWYQQKPG QAPVLVIYGK
NNRPSGIPDRFSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSS HGPRRPVVFG
GGTKLTVLG
SEQ ID NO：18 E10，F4 & G11VH CDR1氨基酸序列
GSRMG
SEQ ID NO：19 E10，F4 & G11 VH CDR2氨基酸序列
AINEEGGQTYYADSVKG
SEQ ID NO：20 E10，A12，F4 & G11 VH CDR3氨基酸序列
HPPHRPFDY
SEQ ID NO：21 E10 & A12 VL CDR1氨基酸序列
QGDSLRSYYAS
SEQ ID NO：22 E10，A12 & G11 VL CDR2氨基酸序列
GKNNRPS
SEQ ID NO：23 E10 & A12 VL CDR3氨基酸序列
NSSHGPRRPVV
SEQ ID NO：24 A12 VH结构域核苷酸序列
GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG
TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC AGC TAT
GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC
TCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG
AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT
CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT
GCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC
CTG GTC ACC GTG TCG AGA
SEQ ID NO 25 A12 VH结构域氨基酸序列
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWVSA
ISGSGGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKHP
PHRPFDYWGQ GTLVTVSR
SEQ ID NO：26 A12 VH CDR1基酸序列
SYAMS
SEQ ID NO：27 A12 VH CDR2氨基酸序列
AISGSGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO：28 F4 & G11 VH结构域核酸序列
GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG
TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC GGT AGT
CGT ATG GGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC
TCA GCT ATT AAT GAG GAG GGT GGT CAG ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG
AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT
CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT
GCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC
CTG GTC ACC GTC TCG AGA
SEQ ID NO：29 F4 & G11 VH 结构域氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSRMGWVRQAPGKGLEWVSAINEEGGQTY
YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPPHRPFDYWGQGTLVTVSR
SEQ ID NO：30 F4 VL结构域核酸序列
TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG
ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT GCA
AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT
GGT AAA TCT AGT CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC
AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA
GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCT
GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO：31 F4 VL结构域氨基酸序列
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKSSRPSGIPD
RFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO：32 F4 & G11 VL CDR1氨基酸序列
QGDSLRLYYAS
SEQ ID NO：33 F4 VL CDR2氨基酸序列
GKSSRPS
SEQ ID NO：34 G11 VL结构域核酸序列
TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG
ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT GCA
AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT
GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC
AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA
GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCT
GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO：35 G11 VL结构域氨基酸序列
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPD
RFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO：36肽接头核酸序列
GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA
SEQ ID NO：37肽接头氨基酸序列
GGGGSGGGGSGGGG
SEQ ID NO：38肽接头核酸序列
GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGT TCT GGC GGT GGC GGA TCG
SEQ ID NO：39肽接头氨基酸序列
GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：40肽接头核酸序列
TCT TCC TCA TCG GGT AGT AGC TCT TCC GGC TCA TCG TCC AGC GGC
SEQ ID NO：41肽接头氨基酸序列
SSSSGSSSSGSSSSG
SEQ ID NO：42肽接头氨基酸序列
GSGSAGSGSAGSGSA
SEQ ID NO：43肽接头氨基酸序列
GGSGGGGSGGGGSGG
SEQ ID NO：44新F4 & G11VH结构域核酸序列
GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG
TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC GGT AGT
CGT ATG GGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC
TCA GCT ATT AAT GAG GAG GGT GGT CAG ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG
AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT
CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAA GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT
GCG AAA CAT CCG CCG CAT CGG CCG TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC
CTG GTC ACC GTC TCG AGT
SEQ ID NO：45新F4 & G11 VH结构域氨基酸序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSRMGWVRQAPGKGLEWVSAINEEGGQTY
YAD SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPPHRPFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：46新G11 VL结构域核酸序列
TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA
GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT GCA AGC
TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT
AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC
TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT
GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCT GTG
GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO：47新G11 VL结构域氨基酸序列
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO：48新E10 VH结构域氨基酸序列
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GSRMGWVRQA PGKGLEWVSA
INEEGGQTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKHP
PHRPFDYWGQ GTLVTVSS
SEQ ID NO：49新4A1-F16 & 3A1-D5 VL结构域核苷酸序列
TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA
GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC
TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT
AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC
TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT
GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT GTT TAT ACT ATG CCG CCC GTG
GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO：50新4A1-F16 & 3A1-D5 VL结构域氨基酸序列
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO：51 P12 VH结构域核酸序列
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT
CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGCCAGTATTCTATGAGCTGGGTCCGCCAGG
CTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTACGGGGACTGGTGGTGAGACATAC
TACGCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT
GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAG
GGCGGCGGATTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCGAGA
SEQ ID NO：52 P12 VH结构域氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGQYSMSWVRQAPGKGLEWVSAITGTGGETY
YADSVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRRIFDYWGQGTLVTVSR
SEQ ID NO：53 P12和D11 VL结构域核酸序列
TCGAGTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGAT
CACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGACGGCAGCCTGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAG
GACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATTATAAAAAGCTGCGGCCCTCAGGGATCCCAGAC
CGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGC
GGAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCTTTTCGCCCAAGCCGAAGCCTGTGGTAT
TCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGC
SEQ ID NO：54 P12和D11 VL结构域氨基酸序列
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRRQPASWYQQKPGQAPVLVIYYKKLRPSGIPD
RFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSFSPKPKPVVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO：55 D11 VH结构域核酸序列
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACT
CTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGG
CTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATAC
TACGCAGACTCCGTGGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCT
GTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAAAG
GGCGGCGGATTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCGAGA
SEQ ID NO：56 D11 VH结构域氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY
YADSVEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRRIFDYWGQGTLVTVSR
SEQ ID NO：57 F4S VH结构域核酸序列
GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG
TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT AGC AGC TAT
GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC
TCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG
AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT
CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA TAT TAC TGT
GCG AAA GGG CGG CGG ATT TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC
ACC GTG TCG AGA
SEQ ID NO：58 F4S VH结构域氨基酸序列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTY
YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRRIFDYWGQGTLVTVSR
SEQ ID NO：59 F4S VL结构域核酸序列
TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG
ACA GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA
AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT
GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC
AGC TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA
GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TTT TCG CCC AAG CCG AAG CCT
GTG GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO：60 F4S VL结构域氨基酸序列
SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPD
RFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSFSPKPKPVVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO：61 P12 VH CDR1氨基酸序列
QYSMS
SEQ ID NO：62 D11和F4S VH CDR1氨基酸序列
SYAMS
SEQ ID NO：63 P12 VH CDR2氨基酸序列
AITGTGGETYYADSVEG
SEQ ID NO：64 D11 VH CDR2氨基酸序列
AISGSGGSTYYADSVEG
SEQ ID NO：65 F4S VH CDR2氨基酸序列
AISGSGGSTYYADSVKG
SEQ ID NO：66 P12，D11和F4S VH CDR3氨基酸序列
GRRIFDY
SEQ ID NO：67 P12和D11 VL CDR1氨基酸序列
QGDSLRRQPAS
SEQ ID NO：68 F4S VL CDR1氨基酸序列
QGDSLRSYYAS
SEQ ID NO：69 P12和D11 VL CDR2氨基酸序列
YKKLRPS
SEQ ID NO：70 F4S VL CDR2氨基酸序列
GKNNRPS
SEQ ID NO：71 P12，D11和F4S VL CDR3氨基酸序列
NSFSPKPKPVV
SEQ ID NO：72 PCR寡核苷酸引物TnC-D BamHI ba
cgggatccgttacagaagccgaaccggaa
SEQ ID NO：73 PCR寡核苷酸引物TnC-D Bg1II for
cgggatccgttacagaagccgaaccggaa
SEQ ID NO：74 PCR寡核苷酸引物mmTnC-A1 EcoBa
agaattcattaaagaggagaaattaactatgagaggatcctccacggaagaagtgccttc
SEQ ID NO：75 PCR寡核苷酸引物mmTnC-A1 Bg1Fo
tgagatcttgtccctgtggaggtctcggc
SEQ ID NO：76肽接头基序
GGGGS
SEQ ID NO：77肽接头基序
SSSSG
SEQ ID NO：78肽接头基序
GSGSA
SEQ ID NO：79肽接头基序
GGSGG
SEQ ID NO：80.新E10 & A12 VL结构域核苷酸序列
TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA
GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC
TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT
AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC
TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT
GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCT GTG
GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO：81新E10 & A12 VL结构域氨基酸序列
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLG
SEQ ID NO：82新F4 VL结构域核酸序列
TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT GTG GCC TTG GGA CAG ACA
GTC AGG ATC ACA TGC CAA GGA GAC AGC CTC AGA CTT TAT TAT GCA AGC
TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC TAT GGT
AAA TCT AGT CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC
TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT
GAG GCT GAC TAT TAC TGT AAC TCC TCT CAT GGG CCC CGT AGG CCT GTG
GTA TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGC
SEQ ID NO：83新F4 VL结构域氨基酸序列
SELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRLYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKSSRPSGIPDR
FSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSHGPRRPVVFGGGTKLTVLG

Claims (69)

1.结合人生腱蛋白C的特异性结合成员，且其包括：
抗体VH结构域，其选自：SEQ ID NO.2的4A1-F16 VH结构域；SEQ ID NO：12的3A1-D5 VH结构域；和包含具有选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO：13的氨基酸序列的一个或多个VH CDR的VH结构域；和/或
抗体VL结构域，其选自SEQ ID NO.4的VL结构域和包含具有选自SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的氨基酸序列的一个或多个VL CDR的VL结构域。
2.权利要求1的特异性结合成员，包括包含具有SEQ ID NO.7的氨基酸序列的CDR3的抗体VH结构域。
3.权利要求2的特异性结合成员，其中抗体VH结构域包括具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列的VH CDR2。
4.权利要求2或权利要求3的特异性结合成员，包括包含具有SEQID NO.5的氨基酸序列的VH CDR1的抗体VH结构域。
5.权利要求2或权利要求3的特异性结合成员，包括包含具有SEQID NO.13的氨基酸序列的VH CDR1的抗体VH结构域。
6.权利要求1-5中任一项的特异性结合成员，包括抗体VL结构域。
7.权利要求1-6中任一项的特异性结合成员，该特异性结合成员与包含4A1-F16 VH结构域(SEQ ID NO.2)和4A1-F16 VL结构域(SEQ IDNO.4或SEQ ID NO：50)的抗体的生腱蛋白C-结合结构域竞争结合生腱蛋白C。
8.权利要求1-6中任一项的特异性结合成员，包括4A1-F16 VH结构域(SEQ ID NO.2)。
9.权利要求8的特异性结合成员，包括4A1-F16 VL结构域(SEQ IDNO.4或SEQ ID NO：50)。
10.权利要求1-3中任一项的特异性结合成员，其以等于或优于由4A1-F16 VH结构域(SEQ ID NO.2)和4A1-F16 VL结构域(SEQ I NO.4或SEQ ID NO：50)形成的生腱蛋白C抗原结合部位亲和力的亲和力结合生腱蛋白C，所述特异性结合成员的亲和力和抗原结合部位的亲和力是在相同条件下测定的。
11.结合人生腱蛋白C的特异性结合成员，其包括：
抗体VH结构域，其选自E10 VH结构域(SEQ ID NO.15或SEQ ID NO：48)；A12 VH结构域(SEQ ID NO：25)；F4和G11 VH结构域(SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：45)；和包含具有选自SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27的氨基酸序列的一个或多个VH CDR的VH结构域；和/或
抗体VL结构域，其选自SEQ ID NO.17或SEQ ID NO：81的VL结构域；具有SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：83的氨基酸序列的F4 VL结构域；具有SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：47的氨基酸序列的G11 VL结构域；和包含具有选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33的氨基酸序列的一个或多个VL CDR的VL结构域。
12.权利要求11的特异性结合成员，包括包含具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR3的抗体VH结构域。
13.权利要求12的特异性结合成员，其中抗体VH结构域包括具有SEQ ID NO.19的氨基酸序列的VH CDR2。
14.权利要求12或权利要求13的特异性结合成员，包括包含具有SEQ ID NO.18的氨基酸序列的VH CDR1的抗体VH结构域。
15.权利要求14的特异性结合成员，其中VH结构域为具有如SEQID NO：29或SEQ ID NO：45中所示的氨基酸序列的F4&G11 VH结构域。
16.权利要求12的特异性结合成员，包括包含具有SEQ ID NO.27的氨基酸序列的VH CDR2的抗体VH结构域。
17.权利要求12或权利要求16的特异性结合成员，包括包含具有SEQ ID NO.26的氨基酸序列的VH CDR1的抗体VH结构域。
18.权利要求11-17中任一项的特异性结合成员，包括抗体VL结构域。
19.权利要求18的特异性结合成员，其中VL结构域包括具有如SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列的VL CDR1。
20.权利要求18或权利要求19的特异性结合成员，其中VL结构域包括具有如SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列的VL CDR2。
21.权利要求18、19或20的特异性结合成员，其中VL结构域包括具有如SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列的VL CDR3。
22.权利要求21的特异性结合成员，其中VL结构域为具有如SEQID NO：31或SEQ ID NO：83中所示的氨基酸序列的F4 VL结构域。
23.权利要求21的特异性结合成员，其中VL结构域为具有如SEQID NO：35或SEQ ID NO 47中所示的氨基酸序列的G11 VL结构域。
24.权利要求11-23中任一项的特异性结合成员，该特异性结合成员与包含E10 VH结构域(SEQ ID NO.15或SEQ ID NO：48)和E10 VL结构域(SEQ ID NO.17或SEQ ID NO：81)的抗体的生腱蛋白C-结合结构域竞争结合生腱蛋白C。
25.权利要求11-24中任一项的特异性结合成员，其以等于或优于由E10 VH结构域(SEQ ID NO.15或SEQ ID NO：48)和E10 VL结构域(SEQ ID NO.17或SEQ ID NO：81)形成的生腱蛋白C抗原结合部位亲和力的亲和力结合生腱蛋白C，所述特异性结合成员的亲和力和抗原结合部位的亲和力是在相同条件下测定的。
26.权利要求11-25中任一项的特异性结合成员，包括E10 VH结构域(SEQ ID NO.15或SEQ ID NO：48)。
27.权利要求2 5的特异性结合成员，包括E10 VL结构域(SEQ ID NO.17或SEQ ID NO：81)。
28.结合人生腱蛋白C的特异性结合成员，包括：
抗体VH结构域，其选自SEQ ID NO.58的F4S VH结构域；SEQ IDNO.55的D11 VH结构域；SEQ ID NO：52的P12 VH结构域和包含具有选自SEQ ID NO.61、SEQ ID NO.62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66的氨基酸序列的一个或多个VH CDR的VH结构域；和/或
抗体VL结构域，其选自SEQ ID NO.54的P12和D11 VL结构域；SEQ ID NO：60的F4S VL结构域；和包含选自具有SEQ ID NO.67、SEQID NO.68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70和SEQ ID NO.71的氨基酸序列的一个或多个VL CDR的VL结构域。
29.权利要求28的特异性结合成员，包括包含如SEQ ID NO：66中所示的P12、D11和F4S的CDR3序列的抗体VH结构域。
30.权利要求29的特异性结合成员，包括包含如SEQ ID NO：61，63和66中所示的P12的CDR序列的抗体VH结构域。
31.权利要求29的特异性结合成员，包括包含如SEQ ID NO：62，64和66中所示的D11的CDR序列的抗体VH结构域。
32.权利要求29的特异性结合成员，包括包含如SEQ ID NO：62，65和66中所示的F4S的CDR序列的抗体VH结构域。
33.权利要求28-32中任一项的特异性结合成员，包括抗体VL结构域。
34.权利要求33的特异性结合成员，其中VL结构域包括如SEQ IDNO：71中所示的P12、D11和F4S的CDR3序列。
35.权利要求34的特异性结合成员，其中VL结构域包括如SEQ IDNO：67，69和71中所示的P12的CDR序列。
36.权利要求34的特异性结合成员，其中VL结构域包括如SEQ IDNO：67，69和71中所示的D11的CDR序列。
37.权利要求34的特异性结合成员，其中VL结构域包括如SEQ IDNO：68，70和71中所示的F4S的CDR序列。
38.权利要求1-37中任一项的特异性结合成员，其包括scFv抗体分子。
39.权利要求1-37中任一项的特异性结合成员，其包括抗体恒定区。
40.权利要求39的特异性结合成员，其包括完整抗体。
41.权利要求1-40中任一项的特异性结合成员，其与可检测标记或细胞因子缀合。
42.权利要求42的特异性结合成员，其中该特异性结合成员的VH结构域或VL结构域与细胞因子通过肽接头缀合成融合蛋白。
43.权利要求42或权利要求43的特异性结合成员，其中所述的细胞因子为IL2。
44.权利要求1-41中任一项的特异性结合成员，其与细胞毒性剂缀合。
45.分离的核酸，包括编码权利要求1-43中任一项的特异性结合成员或特异性结合成员的抗体VH或VL结构域的核苷酸序列。
46.用权利要求45的核酸转化的宿主细胞。
47.生产特异性结合成员或抗体VH或VL结构域的方法，该方法包括在生产所述的特异性结合成员或抗体VH或VL结构域的条件下培养权利要求46的宿主细胞。
48.权利要求47的方法，进一步包括分离和/或纯化所述的特异性结合成员或抗体VH或VL可变结构域。
49.权利要求48的方法，包括使所述的特异性结合成员或抗体VH或VL可变结构域与可检测标记或细胞毒性剂缀合。
50.权利要求49的方法，其中所述的标记为放射性核素或荧光团。
51.权利要求47-50中任一项的方法，进一步包括将所述的特异性结合成员或抗体VH或VL可变结构域配制成包括至少一种额外成分的组合物。
52.获得结合生腱蛋白C的特异性结合成员的方法，该方法包括：
通过在亲代VH结构域的氨基酸序列上添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸来提供各自为所述亲代VH结构域的氨基酸序列变体的一个或多个VH结构域，所述的亲代VH结构域选自4A1-F16 VH结构域；3A1-D5 VH结构域；E10 VH结构域；A12 VH结构域；F4&G11 VH结构域；P12 VH结构域；D11 VH结构域和F4S VH结构域；任选地，将由此提供的一个或多个VH结构域氨基酸序列变体与一个或多个VL结构域结合，以便提供一个或多个VH/VL的组合；和/或
通过在亲代VL结构域的氨基酸序列上添加、缺失、取代或插入一个或多个氨基酸来提供作为亲代VL结构域的氨基酸序列变体的VL结构域，所述的亲代VL结构域选自4A1-F16/3A1-D5 VL结构域；E10/A12 VL结构域；F4 VL结构域；G11 VL结构域；P12/D11 VL结构域和F4S VL结构域；将由此提供的一个或多个VL结构域氨基酸序列变体与一个或多个VH结构域结合，以便提供一个或多个VH/VL结构域的组合；并且
测试VH结构域氨基酸序列变体或VH/VL组合以鉴定结合生腱蛋白C的特异性结合成员。
53.获得结合生腱蛋白C的特异性结合成员的方法，该方法包括：
提供编码一个或多个包含待被取代的CDR或缺乏CDR编码区的VH结构域的起始核酸，并且将所述的起始核酸与编码VH CDR氨基酸序列的供体核酸结合，所述的VH CDR氨基酸序列选自SEQ ID NO：5；SEQ IDNO：6；SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：18；SEQ ID N0：19；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：61；SEQ IDNO：62；SEQ ID NO：63；SEQ ID NO：64；SEQ ID NO：65；和SEQ IDNO：66，由此将所述的供体核酸插入起始核酸中的CDR区，以便提供编码VH结构域的产物核酸；
表达所述产物核酸的核酸，所述的产物核酸编码VH结构域并且任选将由此产生的VH结构域与一个或多个VL结构域结合而提供VH/VL组合；和/或表达所述产物核酸的核酸，所述的产物核酸编码VL结构域和将由此产生的VL结构域与一个或多个VH结构域结合而提供VH/VL组合；
选择结合生腱蛋白C的包含VH结构域或VH/VL组合的特异性结合成员；和
回收结合生腱蛋白C的特异性结合成员和/或编码结合生腱蛋白C的特异性结合成员的核酸。
54.权利要求52或权利要求53的方法，其中结合生腱蛋白C的特异性结合成员为包含VH结构域和VL结构域的抗体片段。
55.权利要求54的方法，其中所述的抗体片段为scFv抗体分子。
56.权利要求54的方法，其中所述的抗体片段为Fab抗体分子。
57.权利要求54的方法，进一步包括提供完整抗体中抗体片段的VH结构域和/或VL结构域。
58.权利要求52-57中任一项的方法，进一步包括使所述的特异性结合成员与可检测标记缀合。
59.权利要求52-57中任一项的方法，进一步包括使所述的特异性结合成员与抗癌剂缀合。
60.权利要求52-59中任一项的方法，进一步包括将结合生腱蛋白C的特异性结合成员或结合生腱蛋白C的特异性结合成员的抗体VH或VL可变结构域的特异性结合成员配制成包括至少一种额外成分的组合物。
61.权利要求47-60中任一项的方法，进一步包括使特异性结合成员结合生腱蛋白C或生腱蛋白C的片段。
62.包括使权利要求1-44中任一项的特异性结合成员与生腱蛋白C或生腱蛋白C的片段结合的方法。
63.权利要求61或权利要求62的方法，其中所述的结合在体外进行。
64.权利要求61-63中任一项的方法，包括测定特异性结合成员的结合量。
65.权利要求1-44中任一项的特异性结合成员在治疗或诊断方法中的应用。
66.权利要求1-44中任一项的特异性结合成员在制备用于治疗方法或增殖性病症的体内诊断的药物中的应用。
67.治疗个体增殖性病症的方法，包括：对该个体给予权利要求1-44中任一项的特异性结合成员。
68.检测和/或成像个体肿瘤细胞的方法，包括：
对该个体给予权利要求1-44中任一项的特异性结合成员；并且检测所述抗体与所述个体的肿瘤细胞的结合。
69.权利要求68的方法，其中所述的特异性结合成员与可检测标记缀合。
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060257317A1 (en) * 2005-05-04 2006-11-16 Duke University Combination therapy in the treatment of cancer
WO2007056441A2 (en) * 2005-11-07 2007-05-18 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
JP5221641B2 (ja) 2007-04-02 2013-06-26 フィロゲン エスピーエー 腫瘍転移の血管新生と関連するフィブロネクチンのｅｄ−ａ抗原
MX2009013752A (es) * 2007-06-28 2010-02-01 Philogen Spa Inmunocitocinas para el tratamiento del cancer en combinacion con agentes quimioterapeuticos.
US10202442B2 (en) 2007-07-25 2019-02-12 Philogen S.P.A. Antigen associated with lung cancers and lymphomas
WO2009056268A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Philogen S.P.A. An antigen associated with rheumatoid arthritis
WO2009089998A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-23 Philochem Ag Binding members for tenascin-c domain a2
US8580267B2 (en) 2008-12-19 2013-11-12 Philogen S.P.A. Immunocytokines for tumour therapy with chemotherapeutic agents
CA2748401C (en) 2009-01-07 2017-09-12 Philogen S.P.A. Antigens associated with endometriosis
EP2448599A1 (en) 2009-06-30 2012-05-09 Philogen S.p.A. Immunocytokines in combination with anti-erbb antibodies for the treatment of cancer
EP2461832B1 (en) 2009-08-05 2017-06-28 Philogen S.p.A. Targeting of bone marrow neovasculature
WO2011107586A1 (en) * 2010-03-05 2011-09-09 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research, Smoc1, tenascin-c and brain cancers
RU2584597C2 (ru) 2010-08-13 2016-05-20 Рош Гликарт Аг Антитела против а2 тенасцина с и способы их применения
WO2013010749A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Philogen S.P.A Sequential anti - ctla4 and targeted il-2 therapy
EP2736535B1 (en) 2011-07-27 2018-10-17 Philogen S.p.A. Il-12 immunoconjugate
JP6241912B2 (ja) * 2012-04-27 2017-12-06 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 核医学診断装置の制御方法、核医学診断装置、および診断剤キット
DK2903629T3 (da) 2012-10-03 2019-08-05 Philogen Spa Antistofkonjugat til anvendelse ved behandling af inflammatorisk tarmsygdom
CN104837502B (zh) 2012-10-12 2018-08-10 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
JP6444902B2 (ja) 2013-03-13 2018-12-26 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ピロロベンゾジアゼピン及びその結合体
WO2015114166A2 (en) * 2014-02-03 2015-08-06 Philochem Ag Targeted drug conjugates
US10188746B2 (en) 2014-09-10 2019-01-29 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EP3387016A1 (en) 2015-12-11 2018-10-17 Philogen S.p.A. Antibodies for treatment and diagnosis of inflammatory bowel disease
ES2864095T3 (es) 2016-04-15 2021-10-13 Philogen Spa Anticuerpo anti-tenascina no glicosilado
CN109071652B (zh) 2016-05-11 2022-09-23 豪夫迈·罗氏有限公司 包含tnf家族配体三聚体和生腱蛋白结合模块的抗原结合分子
WO2017194441A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified anti-tenascin antibodies and methods of use
EP3525829A1 (en) 2016-10-11 2019-08-21 Medimmune Limited Antibody-drug conjugates with immune-mediated therapy agents
AU2017358578B2 (en) 2016-11-09 2022-12-08 Philogen S.P.A IL2 and TNF mutant immunoconjugates
GB201621806D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Philogen Spa Immunocytokines with progressive activation mechanism
EP3601346A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 H. Hoffnabb-La Roche Ag Bispecific antigen binding molecule for a costimulatory tnf receptor
WO2018224550A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Philogen S.P.A Vascular endothelial growth factor/anti-fibronectin antibody fusion proteins
CN113286616A (zh) 2018-05-23 2021-08-20 Adc治疗有限公司 分子佐剂
TW202016144A (zh) * 2018-06-21 2020-05-01 日商第一三共股份有限公司 包括cd3抗原結合片段之組成物及其用途
EP3660039A1 (en) 2018-11-30 2020-06-03 Philogen S.p.A. Il2 immunoconjugates
WO2020070150A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Philogen S.P.A Il2 immunoconjugates
US20220119450A1 (en) 2019-02-04 2022-04-21 University Of Tartu Bi-specific extracellular matrix binding peptides and methods of use thereof
WO2020249757A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Philogen S.P.A Immunoconjugates comprising a single chain diabody and interleukin-15 or interleukin-15 and a sushi domain of interleukin-15 receptor alpha
WO2022073038A1 (en) 2020-10-02 2022-04-07 Abbvie Inc. Interleukin-22 (il-22) fusion proteins and uses thereof
WO2022079211A1 (en) 2020-10-16 2022-04-21 Adc Therapeutics Sa Glycoconjugates
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE199392T1 (de) 1992-12-04 2001-03-15 Medical Res Council Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung
IT1307864B1 (it) * 1999-04-20 2001-11-19 Istituto Naz Per La Ricerca Su Metodo diagnostico per il riconoscimento di neoplasie umane attraversola determinazione dell'isoforma ctn-c della tn-c, frammenti di
WO2001062800A1 (en) * 2000-02-24 2001-08-30 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
US9209965B2 (en) 2014-01-14 2015-12-08 Microsemi Semiconductor Ulc Network interface with clock recovery module on line card

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Publication number Publication date
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