ES2864095T3 - Anticuerpo anti-tenascina no glicosilado - Google Patents

Abstract

Molécula de anticuerpo que se une a tenascina C humana, que comprende: (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, en la que dicha molécula de anticuerpo se une al dominio A1 de tenascina C con una mayor afinidad que un anticuerpo que comprende el dominio VH de SEQ ID NO: 1 y el dominio VL de SEQ ID NO: 7.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-tenascina no glicosilado

Campo

La presente invención se refiere a moléculas de anticuerpo que se unen a tenascina C humana y a usos de tales moléculas en el tratamiento de cáncer. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y cualquier objeto que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones es sólo para información.

Antecedentes

La glicosilación ligada a asparagina (N) es una importante modificación postraduccional que da como resultado la unión covalente de oligosacáridos sobre residuos de asparagina en una secuencia de proteína. La sustancia aceptora de la N-glicosilación es una asparagina dentro de la secuencia de consenso N-X-S/T, en la que X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Schwarz y Aebi, 2011 Curr Opin Struct Biol. 201121 (5): 576-82).

Sin embargo, la presencia de la secuencia de consenso no es suficiente para concluir que un residuo de asparagina está N-glicosilado porque el plegamiento de la proteína y la accesibilidad al disolvente de la secuencia de consenso también desempeña un papel importante en la regulación de la N-glicosilación (Pless et al (1977) PNAS USA 74134­ 138; Bause et al. Biochem J, 209 (1983), págs. 331-336; Lam et al (2013) Genomics, Proteomics Bioinformatics 112 96-104).

En la inmunoglobulina G (IgG), la Asp297 ubicada en la región Fc de la cadena pesada está glicosilada. El núcleo de azúcar anclado a este sitio de glicosilación desempeña un papel crítico en las funciones efectoras de IgG y, por tanto, ha sido y es ampliamente estudiado. La N-glicosilación también puede encontrarse en dominios variables de cadenas pesadas y ligeras de un pequeño número de IgG. Se sabe mucho menos sobre la función de los sitios de glicosilación dentro del dominio variable. No todos los sitios de glicosilación dentro de los dominios variables de anticuerpos están realmente glicosilados (Wright et al. EMBO J. Octubre de 1991; 10(10): 2717-2723). Además, diversos estudios diferentes han encontrado que eliminar la N-glicosilación de la región variable puede dar como resultado una disminución de la afinidad de unión a antígeno (Leibiger et al. Biochem J. 1999;338:529-38, Wright et al. EMBO J. Octubre de 1991; 10(10): 2717-2723; Jacquemin Haemophilia (2010) 16 (102) 16-19; Khurana et al. Biochem Biophys Res Commun (1997) 234 (2) 465-469; Coloma J Immunol (1999) 162(4) 2162-2170) o no tienen ningún efecto evidente (Sato et al., Hum Antibodies Hybridomas. 1996; 7(4): 175-83). También se ha notificado que la N-glicosilación de regiones variables de anticuerpos reduce la agregación (Wu et al (2010) PEDS 238643-651). El anticuerpo anti-tenascina C F16 (Brack et al. Clin Cancer Res. 15 de mayo de 2006; 12(10):3200-8) se une al extradominio A1 de tenascina C. Este dominio es prácticamente indetectable en tejidos adultos normales pero se expresa fuertemente en sitios de angiogénesis fisiológica y angiogénesis tumoral (Brack et al., 2006 anteriormente). El anticuerpo F16 tiene eficacia in vivo y se ha empleado con éxito para el desarrollo de anticuerpos armados, en particular inmunocitocinas. El anticuerpo F16 ha comenzado las pruebas clínicas en oncología (Pasche y Neri, 2012 Drug Discov Today 17(11-12):583-90). También se ha descrito el uso del anticuerpo F16, opcionalmente conjugado a una citocina tal como IL-2, para el tratamiento de cáncer (documento WO 2010/078916). No ha habido informes de N-glicosilación dentro de los dominios variables del anticuerpo F16.

Sumario

La presente invención se refiere al hallazgo inesperado de que el dominio variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo anti-tenascina F16 está N-glicosilado y, además, que la modificación del anticuerpo F16 para abolir esta N-glicosilación da como resultado propiedades drásticamente mejoradas, tales como afinidad de unión mejorada y biodistribución tumoral in vivo. La presente invención se define por el alcance de las reivindicaciones.

En el presente documento se da a conocer una molécula de anticuerpo que se une a tenascina C humana, que comprende:

(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene 5 o menos alteraciones de secuencia en relación con SEQ ID NO: 1; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene 5 o menos alteraciones de secuencia en relación con SEQ ID NO: 2, estando dichas alteraciones en posiciones distintas de 88 y 90.

Preferiblemente, el residuo en la posición 88 del dominio VL no es asparagina y puede ser, por ejemplo, glutamina o alanina. Lo más preferiblemente, el residuo en la posición 88 es glutamina. El residuo en la posición 90 del dominio VL es preferiblemente serina otreonina. Lo más preferiblemente, el residuo en la posición 90 es serina.

Una molécula de anticuerpo preferida que se une a tenascina C humana puede comprender:

(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

Otro aspecto de la invención proporciona una molécula de anticuerpo que se une a tenascina C humana, que comprende:

(a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos que tiene 5 o menos alteraciones de secuencia en relación con SEQ ID NO: 5; y

(b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene 5 o menos alteraciones de secuencia en relación con SEQ ID NO: 6, estando dichas alteraciones en posiciones distintas de 88 y 90.

Otro aspecto de la invención proporciona una molécula de anticuerpo que se une a tenascina C humana tal como se describió anteriormente conjugada con una citocina, preferiblemente IL-2.

Otro aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para una molécula de anticuerpo descrita anteriormente; el dominio VL de una molécula de anticuerpo descrita anteriormente o la cadena ligera de una molécula de anticuerpo descrita anteriormente.

Otros aspectos de la divulgación proporcionan una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento para su uso en un método de tratamiento o diagnóstico de un trastorno proliferativo, tal como cáncer, y el uso de una molécula de anticuerpo descrita en el presente documento en la fabricación de un medicamento para su uso en un método de tratamiento o diagnóstico de un trastorno proliferativo, tal como cáncer.

Breve descripción de figuras

Las figuras 1A, 1B y 1C muestran los resultados de los experimentos que caracterizan el anticuerpo IgG(F16)-3S-N88Q mutante. La figura 1A muestra los resultados de un análisis mediante SDS-PAGE del anticuerpo no reducido (carril 1) y reducido (carril 2). La figura 1B muestra los resultados de cromatografía de exclusión molecular (SEC) del anticuerpo mutante. La figura 1C es un espectro de EM deconvolucionado. El pico principal a 22704 Da corresponde a la cadena ligera (masa esperada de 22707 Da), mientras que los picos alrededor de 50500 Da corresponden a la cadena pesada glicosilada.

La figura 2 muestra los resultados de un análisis mediante SDS-PAGE del anticuerpo IgG(F16)-3S de tipo natural antes (carril 1) y después (carril 2) del tratamiento con PNGasa F en condiciones reductoras. Se indica la ubicación de las bandas correspondientes a la cadena ligera y pesada y PNGasa F. Puede observarse una diferencia en el peso de la cadena ligera glicosilada y desglicosilada en la muestra sin tratar en el carril 2.

La figura 3 muestra el perfil de FPLC de los conjugados IgG(F16)-3S-MMAE (figura 3A) e IgG(F16)-3S-N88Q-MMAE (figura 3B).

Las figuras 4A y 4B muestran los resultados de resonancia de plasmón superficial (BIAcore) para el anticuerpo IgG(F16)-3S-N88Q mutante (figura 4A) e IgG(F16)-3S de tipo natural (figura 4B), 50 nM respectivamente, se ajustaron las curvas para extrapolar los valores de Kd aparente.

La figura 5 muestra las curvas de BIAcore de los anticuerpos IgG(F16)-3S de tipo natural, SIP(F16) e IgG(F16)-3S-N88Q mutante 50 nM.

La figura 6 muestra los resultados de un análisis mediante ELISA llevado a cabo usando IgG(F16)-3S-N88Q, IgG(F16)-3S de tipo natural y SIP(F16). Los resultados muestran que existe una diferencia en la afinidad de unión entre las IgG mutantes y de tipo natural.

La figura 7 muestra los resultados de un estudio de biodistribución usando los anticuerpos SIP(F16), IgG(F16)-3S de tipo natural e IgG(F16)-3S-N88Q en ratones desnudos Balb/c que portan tumores A-431, U87 y MDA-MB-231. El eje y muestra el porcentaje de la dosis inyectada del anticuerpo por gramo de tejido (% de DI/g).

La figura 8 muestra los resultados de un estudio de terapia en ratones desnudos Balb/c que portan el modelo de glioblastoma U87. Se inyectaron a los ratones 7 mg/kg de o bien PBS, IgG(F16)N88Q-MMAE o bien SIP(F16)-MMAE tal como se indica y se midió el volumen tumoral. Los datos representan el volumen tumoral medio (± EEM), n = 3 ratones por grupo. 'CR' indica remisión completa.

La figura 9 muestra los resultados de un estudio de terapia en ratones desnudos Balb/c que portan el modelo de carcinoma epidérmico A431. Se inyectaron a los ratones 7 mg/kg de o bien PBS, IgG(F16)N88Q-MMAE o bien SIP(F16)-MMAE tal como se indica y se midió el volumen tumoral. Los datos representan el volumen tumoral medio (± EEM), n = 3 ratones por grupo. 'CR' indica remisión completa.

Descripción detallada

La tenascina C (ID de gen: 3371; NP_002151.2 GI: 153946395) es una glicoproteína hexamérica grande de la matriz extracelular que modula la adhesión celular. Está implicada en procesos tales como la proliferación celular y la migración celular y está asociada con cambios en la arquitectura tisular que se producen durante la morfogénesis y la embriogénesis, así como bajo tumorigénesis o angiogénesis. Pueden generarse varias isoformas de tenascina C como resultado del corte y empalme alternativo que puede conducir a la inclusión de (múltiples) dominios en la parte central de esta proteína, que van desde el dominio AI al dominio D (Borsi L et al. Int J Cancer 1992; 52:688-692, Carnemolla B et al. Eur J Biochem 1992; 205:561-567).

El anticuerpo F16 se une al dominio A1 de tenascina C humana y se ha descrito ampliamente en la técnica (Schliemann et al. (2015) Cancer Immunol. Res., 3, 547-556; Catania et al. (2015) Cell Migr. Adhes., 9: 1-2, 14-21; Gutbrodt et al. (2013) Sci. Trans. Med., 5, 201ra118; Heuveling et al. (2013) J Nucl. Med., 54, 397-401; De Braud et al. (2011) J Clin. Oncol. 29, 2595; De Braud et al. (2010) J Clin. Oncol., 28, e13017; Pedretti et al. (2010) Br J Cancer, 103, 827-836; Marlind et al. (2008) Clin. Cancer Res 14, 6515-24; Brack et al. (2006) Clin. Cancer Res., 12, 3200-3208; documento WO2006050834). Frey et al. (2011) Exp. Dermatol, 20, 685-688; Schwager etal., Head Neck Oncol (2011) 3:25; Pedretti et al. (2010) Atherosclerosis (2010) 208, 382.389; Schliemann et al. (2009) Leuk Res., 33, 1718-1722.; Pedretti et al., (2009) 64, 28-33. El anticuerpo F16 puede comprender los dominios VH y VL de las SEQ ID NO: 1 y 7, respectivamente, por ejemplo, las cadenas pesada y ligera de las SEQ ID NO: 4 y 5, respectivamente.

Esta divulgación se refiere a una molécula de anticuerpo anti-tenascina F16 modificado que carece de sitios de N-glicosilación dentro del dominio VL. En particular, el anticuerpo F16 modificado carece del sitio de N-glicosilación en las posiciones 88-90 del dominio VL que está presente en el anticuerpo F16 original. El anticuerpo F16 modificado muestra propiedades mejoradas con respecto al anticuerpo F16 original, tales como afinidad de unión mejorada, agregación reducida y biodistribución tumoral in vivo mejorada.

Una molécula de anticuerpo F16 modificado, tal como se da a conocer en el presente documento, puede comprender:

(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene 5 o menos alteraciones de secuencia en relación con SEQ ID NO: 1; y

(b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene 5 o menos alteraciones de secuencia en relación con SEQ ID NO: 2, estando dichas alteraciones en posiciones distintas de 88 y 90.

La molécula de anticuerpo F16 modificado se une específicamente al dominio A1 de tenascina C humana, es decir, muestra la misma especificidad de unión que el anticuerpo F16 original. El dominio VL de la molécula de anticuerpo F16 modificado carece de la señal de N-glicosilación en los residuos 88-90 que está presente en la molécula de anticuerpo F16 original. Por ejemplo, los residuos en las posiciones 88 y 90 del dominio VL de la molécula de anticuerpo F16 modificado no son (i) Asn y Ser, (ii) Asn y Thr o (iii) Asn y Cys, respectivamente. Preferiblemente, el dominio VL de la molécula de anticuerpo F16 modificado comprende una alteración de secuencia en una o ambas posiciones 88 y 90, lo más preferiblemente en la posición 88 en relación con el anticuerpo F16 original (es decir, se elimina la señal de N-glicosilación mediante una única sustitución de amino en la posición 88).

Además de la eliminación de la señal de N-glicosilación de los residuos 88-90, el dominio VL de la molécula de anticuerpo F16 modificado puede comprender menos de otras 5 alteraciones de secuencia en relación con el dominio VL del anticuerpo F16 original. Preferiblemente, las cinco o menos alteraciones de secuencia están fuera de las CDR de VL del anticuerpo. Por ejemplo, el F16 modificado puede contener las mismas secuencias de CDR de VL que el anticuerpo F16 original. Preferiblemente, aparte de las alteraciones de secuencia en una o más de las posiciones 88 a 90, la molécula de anticuerpo F16 modificado (SEQ ID NO: 2) comprende el mismo dominio VL que la molécula de anticuerpo F16 original (SEQ ID NO: 7).

El dominio VH de la molécula de anticuerpo F16 modificado puede comprender menos de 5 alteraciones de secuencia en relación con el dominio VH del anticuerpo F16 original. Preferiblemente, las cinco o menos alteraciones de secuencia están fuera de las CDR de VH del anticuerpo. Por ejemplo, el F16 modificado puede contener las mismas secuencias de CDR de VH que el anticuerpo F16 original. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo F16 modificado comprende el mismo dominio VH que la molécula de anticuerpo F16 original (SEQ ID NO: 1).

Las alteraciones de secuencia pueden incluir sustituciones, deleciones o inserciones de un único aminoácido. Las sustituciones pueden ser sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 con 1, 2, 3 ó 4 sustituciones, deleciones o inserciones de un único aminoácido. La secuencia de aminoácidos del dominio VH de una molécula de anticuerpo F16 modificado puede tener una identidad de secuencia del 90% o más, del 95% o más o del 98% o más con s Eq ID NO: 1. La molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 con 1, 2, 3 ó 4 sustituciones, deleciones o inserciones de un único aminoácido en posiciones distintas de 88 a 90. La secuencia de aminoácidos del dominio VL de una molécula de anticuerpo F16 modificado puede tener una identidad de secuencia del 90% o más, del 95% o más o del 98% o más con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 7. Preferiblemente, las alteraciones de secuencia están fuera de las CDR de la molécula de anticuerpo.

Las técnicas para la introducción de sustituciones, deleciones o inserciones dentro de las secuencias de aminoácidos de los dominios VH o VL de anticuerpos están ampliamente disponibles en la técnica. Los anticuerpos pueden generarse con sustituciones, deleciones o inserciones de secuencia, que puede predecirse o no que tengan un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad, y pueden someterse a prueba para determinar su capacidad para unirse al dominio A1 de tenascina C humana y/o para determinar cualquier otra propiedad deseada.

En algunas divulgaciones, el dominio VH de la molécula de anticuerpo F16 modificado puede comprender Ala en lugar de Met en la posición 4 de VHCDR1 (posición 34 de SEQ ID NO: 1).

En algunas divulgaciones, los residuos de Cys en el anticuerpo F16 modificado pueden reemplazarse por residuos de Ser. Por ejemplo, el anticuerpo F16 modificado puede comprender Ser en lugar de Cys en una o más, por ejemplo, 1, 2 ó 3, posiciones en la cadena pesada o en las cadenas ligeras (Gebleux et al. Mol CancerTher. (2015) 14(11):2606-12). Las moléculas de anticuerpo F16 modificado preferidas pueden comprender un único residuo de Cys ubicado en el extremo N-terminal o C-terminal de la molécula de anticuerpo. Esto puede ser útil para la conjugación de moléculas bioactivas, tales como fármacos citotóxicos, con el anticuerpo F16 modificado.

En las divulgaciones preferidas de la solicitud, las secuencias de aminoácidos de los dominios VH y VL de la molécula de anticuerpo F16 modificado son idénticas al anticuerpo F16 original, excepto en una o ambas posiciones 88 y 90 en el dominio VL. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo F16 modificado puede comprender:

(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Preferiblemente, el residuo en la posición 88 del dominio VL no es asparagina. Por ejemplo, el residuo en la posición 88 del dominio VL puede ser glutamina o alanina. En algunas divulgaciones, el residuo en la posición 88 del dominio VL es glutamina o alanina, preferiblemente glutamina, y el residuo en la posición 90 del dominio VL es serina. Una molécula de anticuerpo preferida puede comprender:

(a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

En otro aspecto, una molécula de anticuerpo que se une a tenascina C humana puede comprender:

(a) una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos que tiene menos de 5 alteraciones de secuencia en relación con SEQ ID NO: 5; y

(b) una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene menos de 5 alteraciones de secuencia en relación con SEQ ID NO: 6, estando dichas alteraciones en posiciones distintas de una o más de 88 a 90.

En algunas divulgaciones de la solicitud, la molécula de anticuerpo puede comprender los dominios VH y VL de las SEQ ID NO: 1 y 3, respectivamente. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo preferida puede comprender:

(a) una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y

(b) una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

En algunas divulgaciones, una molécula de anticuerpo descrita anteriormente puede comprender uno o más residuos de Cys, preferiblemente residuos de Cys N-terminal o C-terminal. Los residuos de Cys pueden ser útiles para acoplar moléculas bioactivas, tales como compuestos citotóxicos, a la molécula de anticuerpo.

Las moléculas de anticuerpo F16 modificado, tal como se describen en el presente documento, son moléculas de anticuerpo monoclonal humano.

Las moléculas de anticuerpo F16 modificado incluyen inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas, y pueden producirse parcial o totalmente de manera sintética, por ejemplo, como molécula recombinante.

Una molécula de anticuerpo F16 modificado puede estar en cualquier formato y puede incluir cualquier polipéptido o proteína que comprenda un sitio de unión a antígeno de inmunoglobulina que comprenda dominios VH y VL emparejados, incluyendo Fab, Fab', Fab'-SH, Fab2, Fab3, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, scFv e inmunoproteínas pequeñas (SIP), así como anticuerpos completos de cualquier isotipo o subclase y fragmentos de anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo y los métodos para su construcción y uso se describen, por ejemplo, en Holliger y Hudson, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136 (2005).

En algunas divulgaciones, la molécula de anticuerpo F16 modificado es un scFv, un diacuerpo o una inmunoproteína pequeña (SIP).

Una inmunoproteína pequeña (SIP) puede comprender una molécula scFv que comprende los dominios VH y VL de una molécula de anticuerpo F16 modificado descrita en el presente documento fusionada con el dominio CH4 de la inmunoglobulina E humana.

En otras divulgaciones, la molécula de anticuerpo F16 modificado puede ser un anticuerpo completo. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo F16 modificado puede ser una IgG, IgA, IgE o IgM o cualquiera de las subclases de isotipo, particularmente IgG1 e IgG4.

Una molécula de anticuerpo F16 modificado puede unirse a tenascina C humana con una Kd de 1 |iM o menos, 100 nM o menos, 50 nM o menos, 25 nM o menos, 10 nM o menos o 1 nM o menos, preferiblemente 10 nM o menos.

Las técnicas adecuadas para la medición de la afinidad se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Brack et al. (2006)) e incluyen resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el sistema BIAcore3000 en condiciones convencionales. La resonancia de plasmón superficial implica hacer pasar un analito en fase fluida sobre un ligando unido a un soporte y determinar la unión entre el analito y el ligando. La resonancia de plasmón superficial puede realizarse, por ejemplo, haciendo pasar una molécula de anticuerpo en fase fluida sobre el dominio A1 de tenascina C inmovilizado sobre un soporte sólido. Puede calcularse una constante de afinidad Kd a partir de la razón de constantes de velocidad kd1/ka1, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial. Preferiblemente, una molécula de anticuerpo F16 modificado se une a tenascina C humana con una mayor afinidad que la molécula de anticuerpo F16 original, por ejemplo, cuando se mide usando resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando un instrumento BIAcore3000. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo F16 modificado puede unirse a tenascina C humana con una afinidad 2 veces o más, 4 veces o más, 6 veces o más u 8 veces o más mayor que la molécula de anticuerpo F16 original.

La molécula de anticuerpo F16 original puede comprender el dominio VH de F16 de SEQ ID NO: 1 y el dominio VL de F16 de SEQ ID NO: 7.

Otros aspectos de la invención proporcionan una molécula de ácido nucleico aislado que codifica para una molécula de anticuerpo F16 modificado, tal como se describió anteriormente, o una cadena ligera o un dominio VL de la misma, y un vector que comprende un ácido nucleico de este tipo.

Las moléculas de ácido nucleico pueden comprender ADN y/o ARN y pueden ser parcial o totalmente sintéticas. La referencia a una secuencia de nucleótidos, tal como se establece en el presente documento, engloba una molécula de ADN con la secuencia especificada y engloba una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U se sustituye por T, a menos que el contexto requiera lo contrario.

Pueden elegirse o construirse vectores adecuados que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, según sea apropiado. Preferiblemente, el vector contiene secuencias reguladoras apropiadas para impulsar la expresión del ácido nucleico en células de mamífero. Un vector también puede comprender secuencias, tales como orígenes de replicación, regiones promotoras y marcadores seleccionables, que permiten su selección, expresión y replicación en huéspedes bacterianos tales como E. coli. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, por ejemplo, fago o fagémido, según sea apropiado. Para obtener detalles adicionales véase, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3a edición, Russell et al., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de constructos de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, se describen en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons, 1992.

Puede introducirse un ácido nucleico o vector, tal como se describe en el presente documento, en una célula huésped. Las técnicas para la introducción de un ácido nucleico en células están bien establecidas en la técnica y puede emplearse cualquier técnica adecuada, según las circunstancias particulares. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otro virus, por ejemplo, adenovirus, AAV, lentivirus o vaccinia. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos. Pueden usarse genes marcadores tales como genes de sensibilidad o resistencia a antibióticos para identificar clones que contienen el ácido nucleico de interés, tal como se conoce bien en la técnica.

El ácido nucleico introducido puede estar en un vector extracromosómico dentro de la célula o el ácido nucleico puede integrarse en el genoma de la célula huésped. La integración puede fomentarse mediante la inclusión de secuencias dentro del ácido nucleico o vector que fomentan la recombinación con el genoma, según técnicas convencionales.

La introducción del ácido nucleico puede ir seguida por la expresión del ácido nucleico en las células para producir la molécula de anticuerpo F16 modificado codificada. Las células huésped (que pueden incluir células realmente transformadas, aunque es más probable que las células sean descendientes de las células transformadas) pueden cultivarse in vitro en condiciones para la expresión del ácido nucleico, de modo que se produzca la molécula de anticuerpo F16 modificado codificada. Cuando se usa un promotor inducible, la expresión puede requerir la activación del promotor inducible.

La divulgación también proporciona una célula recombinante que comprende un ácido nucleico o vector que expresa una molécula de anticuerpo F16 modificado tal como se describió anteriormente.

Un aspecto de la invención proporciona un método para producir una molécula de anticuerpo F16 modificado que comprende expresar un ácido nucleico que codifica para una molécula de anticuerpo F16 modificado en una célula huésped y, opcionalmente, aislar y/o purificar la molécula de anticuerpo F16 modificado así producida.

Se conoce en la técnica una variedad de células huésped adecuadas para la producción de moléculas de anticuerpo F16 modificado recombinantes. Las células huésped adecuadas pueden incluir células eucariotas, incluyendo células de mamífero tales como CHO y líneas celulares derivadas de CHO (células Lec), células HeLa, COS, HEK293 y HEK-EBNA, células de anfibio tales como ovocitos de Xenopus, células de insecto tales como Trichoplusia ni, Sf9 y Sf21, y células de levadura tales como Pichia pastoris.

Las técnicas adecuadas para la producción recombinante de moléculas de anticuerpo se conocen bien en la técnica (véanse, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor; Chadd et al. (2001), Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194); Andersen et al. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117; Larrick y Thomas (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418). Preferiblemente, una molécula de anticuerpo F16 modificado producida por expresión en células de mamífero. Tras la expresión, la molécula de anticuerpo F16 modificado puede aislarse y/o purificarse. Las técnicas adecuadas para el aislamiento y/o la purificación de polipéptidos recombinantes se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo, HPLC, FPLC o cromatografía de afinidad.

Cuando sea apropiado, las moléculas de anticuerpo pueden purificarse en una columna de afinidad que comprende antígeno inmovilizado. Alternativamente, las moléculas de anticuerpo pueden purificarse en una columna de afinidad que comprende proteína A y/o G inmovilizada, seguida opcionalmente por cromatografía de intercambio iónico con el objetivo de eliminar los contaminantes proteicos residuales, así como el ADN y el LPS y/o cromatografía de exclusión en gel Sepharose para eliminar agregados, tales como dímeros u otros multímeros.

Después de la producción, una molécula de anticuerpo F16 modificado puede investigarse adicionalmente, por ejemplo, para determinar sus propiedades farmacológicas u otras propiedades y/o actividad. Las técnicas adecuadas de análisis de proteínas se conocen bien en la técnica.

Las moléculas de anticuerpo F16 modificado pueden modificarse adicionalmente mediante modificación química, por ejemplo, mediante pegilación, o mediante incorporación en un liposoma, para mejorar sus propiedades farmacéuticas, por ejemplo, aumentando la semivida in vivo. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo F16 modificado puede unirse a uno o más restos de polietilenglicol (PEG) u otros restos (Cantin et al. 2002, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27; 659-665). Una molécula de anticuerpo F16 modificado puede estar mono-pegilada o polipegilada (por ejemplo, con 2-6 restos de PEG). Los métodos de pegilación adecuados se conocen bien en la técnica.

En algunas realizaciones, una molécula de anticuerpo F16 modificado puede conjugarse con una molécula bioactiva. Las moléculas bioactivas adecuadas incluyen citocinas. El dominio VH o el dominio VL de la molécula de anticuerpo F16 modificado puede fusionarse con la citocina para formar un inmunoconjugado o una inmunocitocina. El resto de citocina puede fusionarse en el sentido de 5' (N-terminal) o en el sentido de 3' (C-terminal) de la molécula de anticuerpo. Normalmente, la molécula de anticuerpo, o un componente de la misma, y la citocina se unen mediante un ligador peptídico, por ejemplo, un péptido de aproximadamente 5-25 residuos, por ejemplo, 10-20 residuos, preferiblemente de aproximadamente 15 residuos. Las citocinas adecuadas incluyen IL-2, IL-4, IL-12, IL-15 y TNFa. Preferiblemente, las citocinas son citocinas humanas.

En algunas realizaciones preferidas, la molécula de anticuerpo F16 modificado puede conjugarse con IL2 para formar un inmunoconjugado de anticuerpo-citocina. La interleucina-2 (IL2) es una citocina secretada que participa en la inmunorregulación y la proliferación de linfocitos T y B. Se ha demostrado que la IL2 tiene un efecto citotóxico sobre las células tumorales, y la IL2 humana recombinante (aldesleucina: Proleukin™) tiene la aprobación de la FDA para el tratamiento de carcinoma renal metastásico y melanoma metastásico. La secuencia de IL2 humana está disponible públicamente con la referencia de la base de datos de secuencias NP_000577.2 GI: 28178861 y se muestra en la SEQ ID NO: 12.

Las moléculas bioactivas adecuadas incluyen agentes citotóxicos tales como monometil auristatina E (MMAE), dolastatinas, vinblastinas, fotosensibilizadores, polipéptidos de toxina tales como exotoxina de Pseudomonas, cadena a de ricina y angiogenina, moléculas pequeñas tóxicas tales como maitansina, caliqueamicina, epotilona, tubulisina, duocarmicinas, antraciclinas, pirrolobenzodiazepinas, indolinobenzodiazepinas y amatoxinas, y otros fármacos, quimiocinas, factores procoagulantes (por ejemplo, factor tisular) y enzimas.

Los marcadores detectables adecuados incluyen radioisótopos tales como yodo-125, yodo-131, itrio-90, indio-111 y tecnecio-99; fluorocromos tales como fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, rojo Texas y derivados de colorantes de cianina, por ejemplo, Cy7 y Alexa750; colorantes cromogénicos tales como diaminobencidina; perlas de látex; marcadores de enzimas tales como peroxidasa de rábano picante; colorantes de fósforo o láser con características de absorción o emisión aisladas espectralmente; y restos químicos tales como biotina, que pueden detectarse mediante la unión a un resto detectable afín específico, por ejemplo, avidina marcada.

Las moléculas bioactivas pueden incluir radioisótopos terapéuticos. Los radioisótopos terapéuticos adecuados incluyen 1311,90Y, 1241,211At, 77B ry 76Br.

La molécula de anticuerpo F16 modificado puede conjugarse con la molécula bioactiva mediante cualquier enlace covalente o no covalente adecuado. Preferiblemente, la molécula de anticuerpo F16 modificado se conjuga con la molécula bioactiva mediante un ligador covalente, tal como un disulfuro o péptido. Por ejemplo, una molécula bioactiva puede conjugarse mediante un enlace disulfuro con un residuo de Cys en la molécula de anticuerpo F16 modificado.

En algunas divulgaciones, la molécula bioactiva puede conjugarse con la molécula de anticuerpo mediante un ligador escindible. El ligador puede permitir la liberación de la molécula bioactiva a partir de la molécula de anticuerpo en un sitio de terapia. Los ligadores pueden incluir enlaces amida (por ejemplo, ligadores peptídicos), enlaces disulfuro o hidrazonas. Los ligadores peptídicos, por ejemplo, pueden escindirse mediante proteasas específicas de sitio, los enlaces disulfuro pueden escindirse mediante el entorno reductor del citosol y las hidrazonas pueden escindirse mediante hidrólisis mediada por ácido.

Las moléculas de anticuerpo F16 modificado, incluyendo moléculas de anticuerpo conjugadas, normalmente se administrarán en forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además de la molécula de anticuerpo. Por tanto, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden comprender, además del principio activo, un excipiente, portador, tampón, estabilizante u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica. Un método puede comprender formular una molécula de anticuerpo F16 modificado con un excipiente farmacéuticamente aceptable. El término “farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del juicio médico razonable, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, según una relación beneficio/riesgo razonable. Cada portador, excipiente, etc. también debe ser “aceptable” en el sentido de ser compatible con los demás componentes de la formulación. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser por bolo, infusión, inyección, intravenosa o subcutánea, o cualquier otra vía adecuada, tal como se comenta a continuación.

Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un portador líquido tal como agua, vaselina, aceites de origen animal o vegetal, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra disolución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para administración parenteral, por ejemplo, subcutánea o intravenosa, por ejemplo, mediante inyección, la composición farmacéutica que comprende la molécula de anticuerpo F16 modificado puede estar en forma de una disolución acuosa parenteralmente aceptable que no contiene pirógenos y tiene un pH, una isotonicidad y una estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica pueden preparar disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos, tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de lactato de Ringer. Pueden emplearse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos según se requiera, incluyendo tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3'-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparaginas, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Pueden encontrarse portadores, excipientes, etc. adecuados en los textos farmacéuticos convencionales, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990.

En algunas divulgaciones, la molécula de anticuerpo F16 modificado puede proporcionarse en forma liofilizada para su reconstitución antes de la administración. Por ejemplo, las moléculas de anticuerpo liofilizadas pueden reconstituirse en agua estéril y mezclarse con solución salina antes de la administración a un individuo.

Las moléculas de anticuerpo F16 modificado, tal como se describen en el presente documento, pueden usarse en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal, incluyendo el tratamiento terapéutico y profiláctico o preventivo (por ejemplo, tratamiento antes de la aparición de un estado en un individuo para reducir el riesgo de que se produzca el estado en el individuo; retrasar su aparición; o reducir su gravedad después de la aparición).

Un método para tratar a un individuo puede comprender administrar una molécula de anticuerpo F16 modificado descrita en el presente documento o una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo F16 modificado a un individuo que lo necesita.

Un individuo adecuado para el tratamiento, tal como se describió anteriormente, puede ser un mamífero, tal como un roedor (por ejemplo, una cobaya, un hámster, una rata, un ratón), murino (por ejemplo, un ratón), cánido (por ejemplo, un perro), félido (por ejemplo, un gato), équido (por ejemplo, un caballo), un primate, un simio (por ejemplo, un mono o un homínido), un mono (por ejemplo, un tití, un babuino), un homínido (por ejemplo, un gorila, un chimpancé, un orangután, un gibón) o un ser humano.

En algunas divulgaciones preferidas, el individuo es un ser humano. En otras divulgaciones preferidas, pueden emplearse mamíferos no humanos, especialmente mamíferos que se usan convencionalmente como modelos para demostrar la eficacia terapéutica en seres humanos (por ejemplo, animales murinos, primates, porcinos, cánidos o conejos).

La administración puede ser en una “cantidad terapéuticamente eficaz”, que es suficiente para mostrar un beneficio a un paciente. Tal beneficio puede ser al menos la mejora de al menos un síntoma. Por tanto, “tratamiento” de una enfermedad específica se refiere a la mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada y la velocidad y el transcurso de la administración dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se esté tratando, el paciente en particular que se esté tratando, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración de la composición, el tipo de molécula de anticuerpo, el método de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los médicos.

La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosis, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros médicos, y puede depender de la gravedad de los síntomas y/o la progresión de la enfermedad que se está tratando. Las dosis apropiadas de anticuerpo se conocen bien en la técnica (Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; y Bagshawe et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). Pueden usarse dosificaciones específicas indicadas en el presente documento, o en el Physician's Desk Reference (2003), según sea apropiado, para el tipo de medicamento que se está administrando. Puede determinarse una cantidad terapéuticamente eficaz o una dosis adecuada de una molécula de anticuerpo para su uso en la divulgación comparando su actividad in vitro y actividad in vivo en un modelo animal. Se conocen métodos para la extrapolación de dosificaciones eficaces en ratones y otros animales de experimentación a seres humanos. La dosis precisa dependerá de varios factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico, prevención o tratamiento, el tamaño y la ubicación del área que va a tratarse, la naturaleza precisa de la molécula de anticuerpo.

Una dosis de anticuerpo típica estará en el intervalo de 100 a 1 g para aplicaciones sistémicas. Puede administrarse una dosis de carga inicial más alta seguida por una o más dosis más bajas. Esta es una dosis para un único tratamiento de un paciente adulto, que puede ajustarse proporcionalmente para niños y lactantes, y también ajustarse según el formato del anticuerpo en proporción al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse a intervalos diarios, dos veces a la semana, semanales o mensuales, a discreción del médico. Los tratamientos pueden ser cada dos a cuatro semanas para la administración subcutánea y cada cuatro a ocho semanas para la administración intravenosa. En algunas divulgaciones, el tratamiento es periódico y el periodo entre administraciones es de aproximadamente dos semanas o más, por ejemplo, de aproximadamente tres semanas o más, de aproximadamente cuatro semanas o más o de aproximadamente una vez al mes. La pauta de tratamiento para un individuo puede depender de las propiedades farmacodinámicas y farmacocinéticas de la molécula de anticuerpo, la vía de administración y la naturaleza del estado que se está tratando.

El tratamiento puede ser periódico y el periodo entre administraciones puede ser de aproximadamente una semana o más, por ejemplo, de aproximadamente dos semanas o más, de aproximadamente tres semanas o más, de aproximadamente cuatro semanas o más, de aproximadamente una vez al mes o más, de aproximadamente cinco semanas o más o de aproximadamente seis semanas o más. Por ejemplo, el tratamiento puede ser cada dos a cuatro semanas o cada cuatro a ocho semanas. El tratamiento puede administrarse antes y/o después de la cirugía y/o puede administrarse o aplicarse directamente en el sitio anatómico del traumatismo, tratamiento quirúrgico o procedimiento invasivo. Las formulaciones y vías de administración adecuadas se describen anteriormente.

Un individuo adecuado para el tratamiento con una molécula de anticuerpo F16 modificado puede tener un trastorno proliferativo.

Los trastornos proliferativos están provocados o caracterizados por crecimiento y proliferación celular aumentados y pueden incluir una neoplasia o un tumor premaligno o maligno (por ejemplo, histiocitoma, glioma, astrocitoma, osteoma), cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer gastrointestinal, cáncer de intestino, cáncer de colon, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, cáncer de próstata, cáncer de testículo, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, carcinoma de células de Merkel, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro tal como glioma, sarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Kaposi, melanoma), una enfermedad caracterizada por neovasculatura o una enfermedad angiogénica. También pueden tratarse tumores no cancerosos de cualquiera de estos tejidos. Los cánceres pueden ser familiares o esporádicos.

El tratamiento de un tumor o cáncer en un individuo puede comprender la erradicación del tumor. Sin embargo, para muchas formas de tumores, especialmente cánceres malignos y formas agresivas tales como glioblastoma, es posible que la curación completa no sea posible. El tratamiento puede comprender retardar el crecimiento tumoral y/o reducir el volumen tumoral. El tratamiento puede comprender alargar la supervivencia global o la supervivencia libre de progresión del individuo. El tratamiento puede comprender mejorar la calidad de vida del individuo, por ejemplo, reduciendo uno o más síntomas provocados por el tumor. El tratamiento puede comprender inhibir el recrecimiento del tumor después de la regresión del tumor. El tratamiento según la presente divulgación puede usarse para lograr cualquiera o todos estos efectos terapéuticos.

Los trastornos proliferativos también pueden incluir enfermedades caracterizadas por neovasculatura de la médula ósea, tales como leucemia (por ejemplo, LMC, LMA, LCP, LLC o LLA, preferiblemente LMA), síndromes mielodisplásicos o mieloma múltiple.

Un estado premaligno o maligno puede producirse en cualquier tipo de célula, incluyendo, pero sin limitarse a, pulmón, colon, mama, ovario, próstata, hígado, páncreas, cerebro y piel.

En algunas divulgaciones, un trastorno proliferativo adecuado para el tratamiento, tal como se describe en el presente documento, puede caracterizarse por la presencia de células o tejido que expresan una isoforma grande de tenascina C que comprende el dominio A1, o en el que la expresión de dicha isoforma aumenta por encima de los niveles normales, es decir, expresión aberrante de la isoforma grande de tenascina C.

En el presente documento se da a conocer una molécula de anticuerpo F16 modificado, tal como se describe en el presente documento, para su uso en un método de tratamiento de un trastorno proliferativo; el uso de una molécula de anticuerpo F16 modificado, tal como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno proliferativo; y un método de tratamiento de un trastorno proliferativo que comprende administrar una molécula de anticuerpo F16 modificado, tal como se describe en el presente documento, a un individuo que lo necesita.

En el presente documento se da a conocer una molécula de anticuerpo F16 modificado, tal como se describe en el presente documento, para su uso en un método para inhibir la angiogénesis; el uso de una molécula de anticuerpo F16 modificado, tal como se describe en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para la inhibición de la angiogénesis; y un método para inhibir la angiogénesis que comprende administrar una molécula de anticuerpo F16 modificado, tal como se describe en el presente documento, a un individuo que lo necesita.

La molécula de anticuerpo F16 modificado puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, de forma simultánea o secuencial o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, para el tratamiento de una enfermedad, incluyendo un trastorno proliferativo, tal como cáncer. Por ejemplo, puede usarse una molécula de anticuerpo F16 modificado en combinación con un agente terapéutico existente para el tratamiento de un trastorno proliferativo, tal como cáncer. La administración combinada puede incluir la administración conjunta, ya sea en una única formulación farmacéutica o usando formulaciones independientes, o la administración consecutiva en cualquier orden pero generalmente dentro de un periodo de tiempo tal que todos los agentes activos puedan ejercer sus actividades biológicas simultáneamente.

Los agentes terapéuticos pueden incluir compuestos antineoplásicos tales como: agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides y terpenoides vegetales, inhibidores de la topoisomerasa, antibióticos antitumorales, anticuerpos monoclonales y corticosteroides. Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen ciclofosfamida, cisplatino, clorambucilo, carboplatino y oxaliplatino. Los ejemplos de antimetabolitos incluyen metotrexato, análogos de purina tales como cladribina, fludarabina, tioguanina y pentostatina, y análogos de pirimidina tales como citarabina, 5-fluorouracilo y floxuridina. Los ejemplos de alcaloides y terpenoides vegetales incluyen alcaloides de la vinca tales como vincristina, vinblastina, vinorelbina y vindesina; agentes quimioterápicos derivados de podofilotoxina tales como fosfato de etopósido y tenipósido taxanos; y taxanos, que incluyen paclitaxel y docetaxel. Los ejemplos de inhibidores de la topoisomerasa incluyen inhibidores de la topoisomerasa de tipo I tales como camptotecinas e inhibidores de la topoisomerasa de tipo II tales como amsacrina, etopósido, fosfato de etopósido y tenipósido. Los ejemplos de antibióticos antitumorales incluyen antraciclinas tales como doxorrubicina y epirrubicina, actinomicinas y bleomicina. Los ejemplos de anticuerpos monoclonales incluyen rituximab y los ejemplos de corticosteroides incluyen prednisona y prednisolona.

Los compuestos antineoplásicos preferidos incluyen: antraciclinas, citarabina, vincristina, L-asparaginasa, ciclofosfamida, fibromun, dacarbazina, metotrexato y 6-mercaptopurina, clorambucilo, ciclofosfamida, corticosteroides tales como prednisona y prednisolona, cladribina, pentostatina, rituximab, clorambucilo, taxanos tales como paclitaxel, imidazotetrazinems tales como temozolomida, doxorrubicina y bloqueantes de puntos de control inmunitarios tales como ipilimumab, pembrolizumab y nivolumab.

Puede administrarse una molécula de anticuerpo F16 modificado a un individuo que lo necesita en combinación con quimioterapia o inmunoterapia basada en IgG. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD33 se están investigando actualmente para el tratamiento de la LMA en ensayos clínicos en fase IIb. Los anticuerpos anti-CD33 adecuados se describen, por ejemplo, en Feldman et al. (2003) Leukemia. Febrero de 2003; 17(2):314-8, Feldman et al. (2005) J Clin Oncol. 20 de junio de 2005; 23(18):4110-6. y Kobayashi et al. (2009) Int J Hematol. 89(4):460-9. Además, los anticuerpos anti-CD123 basados en IgG también se están investigando en el tratamiento de la LMA (Jin et al., 2009 Cell Stem Cell. 2;5(1):31-42). Por tanto, en un ejemplo, la inmunoterapia basada en IgG puede implicar el tratamiento con un anticuerpo anti-CD33 o anti-CD123. Los anticuerpos anti-CD33 adecuados incluyen lintuzumab. Las moléculas de anticuerpo F16 modificado, tal como se describen en el presente documento, también pueden usarse en un método de diagnóstico del cuerpo humano o animal. Por ejemplo, una molécula de anticuerpo F16 modificado puede usarse en pacientes que padecen un trastorno proliferativo, tal como una enfermedad caracterizada por neovasculatura, para la detección o el diagnóstico de dicha enfermedad.

Un método puede comprender provocar o permitir la unión de una molécula de anticuerpo F16 modificado al dominio A1 detenascina C. Tal como se indicó, tal unión puede tener lugar in vivo, por ejemplo, después de la administración de una molécula de anticuerpo F16 modificado, o in vitro.

Puede determinarse la cantidad de unión de la molécula de anticuerpo F16 modificado a tenascina C humana que comprende el dominio A1. En algunas divulgaciones, puede determinarse la unión de la molécula de anticuerpo F16 modificado a una muestra obtenida de un individuo. En otras divulgaciones, puede determinarse la unión del miembro de unión a un antígeno in vivo, por ejemplo, en la obtención de imágenes o la detección de tumores en el cuerpo de un individuo. Puede determinarse la presencia, ubicación y/o cantidad de unión. La cuantificación puede estar relacionada con la cantidad de antígeno, que puede ser de interés diagnóstico.

La unión de moléculas de anticuerpo puede determinarse mediante cualquier medio apropiado. El modo de determinar la unión no es una característica de la presente divulgación y los expertos en la técnica pueden elegir un modo adecuado según sus preferencias y conocimientos generales.

Las moléculas de anticuerpo preferidas para su uso en tales métodos pueden conjugarse o unirse a una molécula indicadora o un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados se describen anteriormente.

La unión puede determinarse mediante la presencia, cantidad o ubicación del marcador o informador.

Puede determinarse la unión de una molécula de anticuerpo F16 modificado in vivo, por ejemplo, en un método de obtención de imágenes moleculares, mediante detección radiactiva (por ejemplo, PET, SPECT), obtención de imágenes por fluorescencia en el infrarrojo cercano (por ejemplo, tomografía óptica difusa, endoscopia), ecografía (por ejemplo, con derivados de microburbujas dirigidas) y resonancia magnética (con partículas magnéticas dirigidas).

Un método para detectar o diagnosticar un trastorno proliferativo, tal como una enfermedad caracterizada por neovasculatura, en un individuo puede comprender:

administrar una molécula de anticuerpo F16 modificado al individuo; y

detectar la unión del anticuerpo a la neovasculatura en el individuo,

en el que la unión del anticuerpo a la neovasculatura del individuo indica que el individuo tiene dicha enfermedad. Las moléculas de anticuerpo F16 modificado pueden ser útiles para detectar o diagnosticar una enfermedad caracterizada por neovasculatura de la médula ósea, tal como leucemia, síndromes mielodisplásicos o mieloma múltiple, en un individuo. Por ejemplo, un método puede comprender:

administrar una molécula de anticuerpo F16 modificado al individuo; y

determinar la presencia o ausencia de la molécula de anticuerpo en la médula ósea del individuo.

Las moléculas de anticuerpo F16 modificado pueden ser útiles para detectar u obtener imágenes de células tumorales o placas ateroscleróticas. Un método in vivo de detección y/u obtención de imágenes de células tumorales o placas ateroscleróticas puede comprender:

administrar una molécula de anticuerpo F16 modificado a un individuo y

detectar la unión de dicho anticuerpo a células tumorales o placas ateroscleróticas en dicho individuo.

En otras divulgaciones, la unión del anticuerpo puede tener lugar in vitro, por ejemplo, en ELISA, inmunotransferencia de tipo Western, inmunocitoquímica, inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad.

Un método in vitro para detectar o diagnosticar un trastorno proliferativo, tal como una enfermedad caracterizada por neovasculatura o un trastorno aterosclerótico, en un individuo puede comprender:

aplicar una molécula de anticuerpo F16 modificado a una muestra obtenida de un individuo; y

detectar la unión del anticuerpo a la muestra,

en el que la unión del anticuerpo a la muestra indica que el individuo tiene dicha enfermedad.

Un método in vitro para detectar y/u obtener imágenes de células tumorales puede comprender, por tanto, poner en contacto un anticuerpo, tal como se describe en el presente documento, con una muestra obtenida de un individuo y detectar la unión de dicho anticuerpo a células tumorales en dicha muestra.

La neovasculatura puede incluir neovasculatura de la médula ósea. Una enfermedad caracterizada por neovasculatura de la médula ósea puede incluir leucemia, síndromes mielodisplásicos o mieloma múltiple. Un método puede comprender:

aplicar una molécula de anticuerpo F16 modificado a una muestra de médula ósea obtenida del individuo; y detectar la unión de la molécula de anticuerpo F16 modificado a la muestra,

en el que la unión de una molécula de anticuerpo F16 modificado a la neovasculatura de la médula ósea en la muestra indica que el individuo tiene dicha enfermedad.

Otras divulgaciones proporcionan las divulgaciones descritas anteriormente con el término “que comprende” reemplazado por el término “que consiste en” y los aspectos y las realizaciones descritos anteriormente con el término “que comprende” reemplazado por el término “que consiste esencialmente en”.

Otros aspectos y realizaciones de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica dada la presente divulgación que incluye la siguiente ejemplificación experimental.

A menos que se indique lo contrario, los residuos de anticuerpo se enumeran en el presente documento según el esquema de numeración de Kabat (Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesmann, K.S y Foeller, C. (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, publicación de los NIH n.° 91-3242. Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU.

Cuando se usa “y/o” en el presente documento, debe tomarse como divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, “A y/o B” debe tomarse como divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno se expusiera individualmente en el presente documento.

Debe entenderse que la solicitud da a conocer todas las combinaciones de cualquiera de las divulgaciones anteriores descritas anteriormente entre sí, a menos que el contexto dicte lo contrario. De manera similar, la solicitud da a conocer todas las combinaciones de las características preferidas y/u opcionales, ya sea individualmente o junto con cualquiera de los otros aspectos, a menos que el contexto dicte lo contrario.

A continuación, se ilustrarán determinadas divulgaciones a modo de ejemplo y con referencia a las figuras descritas anteriormente.

Ejemplos

Materiales y métodos

Clonación, producción y purificación de IgG(F16)-3S-N88Q

Se diseñaron cebadores para mutar el residuo de asparagina 88 en la cadena ligera de IgG(F16)-3S para dar glutamina. Se prepararon dos reacciones de PCR de 40 |il, usando 20 |il de ReadyMix REDTaq 2X (R2648, de Sigma-Aldrich), plantilla de ADN de 650 ng (plásmido pMM137 que contiene la secuencia de IgG(F16)-3S), 2 |il de cebador directo 10 nM, 2 |il de cebador inverso 10 nM y se añadió agua mQ hasta alcanzar un volumen final de 40 |il. Como cebadores, se usaron F16SpelLedSeqFo (SEQ ID NO: 8) y F16LCN88QRev (SEQ ID NO: 9) en la reacción A, mientras que F16LCN88QFo (SEQ ID N^o : 10) y F16EcoRIRev (SEQ ID NO: 11) en la reacción B. Se llevó a cabo amplificación por PCR usando el siguiente programa: 4 min a 94°C, 27 ciclos: 20 s a 94°C, 45 s a 60°C, 2 min a 72°C, extensión final de 10 min a 72°C. Las muestras amplificadas se cargaron en un gel de agarosa/tampón TBE al 1% (p/v) que contenía una disolución de bromuro de etidio (10714181, de Fisher Scientific) diluida 1/10000. Los fragmentos de ADN se separaron bajo una corriente constante de 100 V y 70 mA durante 35 min. Los fragmentos del tamaño deseado (355 pb para la reacción A y 414 pb para la reacción B) se escindieron y purificaron usando limpieza con gel NucleoSpin (740609.250, de Macherey-Nagel) siguiendo las instrucciones del proveedor. Se preparó una segunda reacción de PCR, usando 20 |il de ReadyMix REDTaq 2X, aproximadamente 80 ng de fragmentos de la reacción A y B, 2 |il de cebador F16SpelLedSeqFo, 2 |il de cebador F16EcoRIRev y agua mQ hasta alcanzar un volumen final de 40 |il. Se usó el mismo programa de PCR descrito anteriormente, y el fragmento deseado, que contenía la secuencia mutada de la cadena ligera completa (LC mutada; 730 pb), se purificó en gel tal como se explicó anteriormente.

Se digirió el fragmento de ADN purificado en tampón CutSmart 1X (suministrado con enzimas de restricción, diluido en volumen de reacción y agua mQ) durante 2 h a 37°C, usando 20 unidades de cada enzima de restricción (exceso de enzima 10X). Al mismo tiempo, se digirieron aproximadamente 13 |ig de plásmido pMM137 usando un exceso de enzima 5X en las mismas condiciones de reacción. Se usaron Spel-HF (R3133S, de NEB) y EcoRI-HF (R3101S, de NEB) para digerir tanto el fragmento como el plásmido. La reacción de digestión se detuvo con colorante de carga de gel púrpura 1X (suministrado con enzimas de restricción), los fragmentos de ADN digeridos se separaron en gel de agarosa/tampón TBE al 1% (p/v) y se purificaron tal como se describió anteriormente.

Se preparó una reacción de ligación de 20 |il, usando 530 ng de fragmento de inserto (LC mutada), 1 |ig de plásmido digerido (razón molar de vector:inserto 1:5), 2 |il de tampón de ligasa T4 10X (suministrado con enzima), 2 |il de enzima ADN ligasa T4 (M0202S, de NEB) y agua mQ hasta alcanzar el volumen final. Se incubó la muestra durante 15 min a temperatura ambiente (TA) y se detuvo la reacción mediante una incubación de 10 min a 65°C. Se mezclaron suavemente 10 |il de ambas reacciones de ligación, así como 10 |il de una dilución 10X y 10 |il de una dilución 50X de la reacción de ligación con 50 |il de células de E. coli TG1 electrocompetentes en una cubeta Gene Pulser de 0,2 cm (1652086, de Bio-Rad) sobre hielo. Se transformaron las células por electroporación usando un manipulador de electrocélulas BTX ECM600 (aparato Harvard). Se aplicó un voltaje de 1,2 kV a través de la cubeta. Se añadieron 70 |il de medio 2xYT (3012-041, de MPbio) recién preparado a cada muestra de transformación y cada muestra se sembró en una placa de 2xYT-agar que contenía ampicilina 1 |ig/ml. Se incubaron las placas a 37°C durante la noche. Se recogieron 14 colonias con un palillo de la placa de dilución 50X y se inocularon en 4 ml de medio de 2xYT-ampicilina en un agitador a 37°C durante 5-7 h. Se prepararon reservas de glicerol de los 14 cultivos mezclando 400 |il de cultivo con 400 |il de glicerol al 40% (v/v)/agua y luego se almacenaron a -20°C. Antes de la inoculación en el medio, cada palillo se sumergió en una muestra de PCR que contenía 10 |il de ReadyMix REDTaq 2X, 1 |il de cebador F16SpelLedSeqFo, 1 |il de cebador F16EcoRIRev y 8 |il de agua mQ y se llevó a cabo la amplificación por PCR de la secuencia codificante de LC usando el siguiente programa: 4 min a 94°C, 25 ciclos: 20 s a 94°C, 45 s a 60°C, 80 s a 72°C, extensión final de 10 min a 72°C. Los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa tal como ya se describió y los fragmentos codificantes de LC resultantes se purificaron usando limpieza con gel NucleoSpin. Seis de estos fragmentos purificados (derivados de 6 clones diferentes) se enviaron para secuenciación y se confirmó que tres de ellos contenían la secuencia de LC mutada deseada. Se inocularon 400 |il de E. coli TG1 electrocompetentes almacenadas en glicerol transformadas con plásmido que contenía IgG(F16)-3S mutado en N88Q en 4 ml de medio 2xYT (que contenía ampicilina 1 |ig/ml). Después de una incubación de 7 h en un agitador a 37°C x 150 rpm, los cultivos se transfirieron en 400 ml de medio recién preparado de ampicilina 1 |ig/ml/2xYT y la incubación continuó durante la noche en las mismas condiciones.

Los plásmidos se purificaron usando el kit NucleoBond® Xtra Maxi Plus (740416.50, de Macherey-Nagel) siguiendo el protocolo proporcionado para el plásmido de baja copia y se midió la concentración de los plásmidos recuperados a 260 nm usando un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific).

Se realizaron transfecciones mediadas por PEI de diferentes tamaños, dependiendo de la cantidad de anticuerpo necesaria, siguiendo el mismo protocolo.

Se contaron las células CHO-S (R800-07, de Invitrogen) en medio PowerCHO-2CD⁺ (BE12-771Q, de Lonza) y se centrifugó un volumen de cultivo que contenía el número deseado de células a temperatura ambiente usando una centrífuga Megafuge 1.0R (5' x 1000 rcf). Se resuspendieron las células en medio ProCHO-4⁺ (BE12-029Q, de Lonza) hasta una concentración final de 2x10⁶ células/ml.

Las cantidades deseadas de plásmido (1,25 |ig/millón de células) y polietilenimina (PEI, 23966, de Polysciences Inc.) (5 |ig/millón de células, a partir de una disolución madre de 1 mg/ml) se diluyeron por separado en NaCl 150mM/H²O (el volumen de las disoluciones de ADN-NaCl o PEI-NaCl es igual a 1/20 del volumen de medio ProCHO-4⁺), se mezcló cuidadosamente la disolución de ADN-NaCl con la disolución de PEI-NaCl y se dejó reposar la mezcla durante 10' para permitir la formación de complejos de ADN-PEI. La mezcla se añadió cuidadosamente a las células, que se incubaron en un agitador a 37°C x 160 rpm durante 4 h. Se añadió PowerCHO-2CD⁺ al cultivo para diluir las células 1:2 y se agitó el cultivo a 31°C x 140 rpm durante 5-7 días.

Se centrifugó el cultivo 5-7 días usando una centrífuga Sorvall® RC 5C Plus (rotor SLA-3000, 4°C, 6500 rpm, 25'), se recogió el sobrenadante y se cargó en la bomba conectada a la columna PD-10 y la columna de proteína A. Se ajustó la velocidad de flujo de la bomba a 2 ml/min, se dejó fluir el sobrenadante y se detuvo el flujo tan pronto como el nivel descendente de sobrenadante alcanzó la resina de proteína A. Se descartó la columna PD-10 y se cargaron > 200 ml de tampón de lavado A (NaCl 100 mM, EDTA 0,5 mM, Tween-20 al 0,1% (v/v) en PBS) en primer lugar y tampón de lavado B (NaCl 500 mM, EDTA 0,5 mM en PBS) a continuación directamente en la columna de proteína A una velocidad de flujo mayor (hasta 7 ml/min), teniendo cuidado de no dejar que la resina de proteína A se seque. Las proteínas de IgG se eluyeron con 10-15 ml de glicina 0,1 M/H²O (pH 3) en fracciones de 1 ml. La DO²⁸⁰ de cada fracción se midió con un espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific) para seleccionar las fracciones que contenían proteínas. Las fracciones positivas se combinaron y cargaron en una membrana de diálisis Spectra/Por® 4, MWCO de 12-14 kDa (132700, de Spectrum Laboratories) previamente humedecida en agua desionizada y sellada con clips de plástico. La diálisis se llevó a cabo durante la noche en 3,5 l de PBS. Después de la diálisis, se midió de nuevo la DO²⁸⁰, se concentraron las proteínas hasta una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml usando Vivaspin® Turbo 15 (VS15T01, de Sartorious), se esterilizaron por filtración usando un filtro de 0,22 um (99722, de TPP), se dividieron en alícuotas, se ultracongelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C.

La cantidad deseada de IgG se redujo con 30 equivalentes molares de TCEP (AB121644, de abcr), a partir de una disolución madre de TCEP 0,1 M/PBS, o bien durante la noche a 4°C o bien 1 hora a 37°C. La disolución se cargó en Ákta FPLC (GE Healthcare) y la proteína reducida se purificó mediante cromatografía de exclusión molecular en una columna de desalación HiPrep 26/10 (17-5087-01, de GE Healthcare). Se usó DTPA 1 mM (D6518, de Sigma-Aldrich)/PBS como fase móvil a una velocidad de flujo de 1,5-2 ml/min. Se combinó la proteína recuperada y se concentró usando Vivaspin® Turbo 15 (VS15T01, de Sartorious) para permanecer en el límite de capacidad del bucle de FPLC. Se disolvieron 10 equivalentes molares de vedotina (MC-vc_PAB-MMAE, de Concortis Biosystems) en DMSO (41640, de Sigma-Aldrich) y se añadieron a la proteína reducida; el contenido final de DMSO fue del 5% (v/v). Se dejaron reaccionar IgG y vedotina con agitación durante 15' a TA, luego se inactivó la reacción con L-Cys (30090, de Fluka) a una concentración final de 1 mM durante 10' a TA. El producto final se purificó mediante FPLC tal como se describió anteriormente, se midió la DO²⁸⁰ y se concentró el producto usando Vivaspin® Turbo 15 (VS15T01, de Sartorious) hasta aproximadamente 1 mg/ml. Se ultracongelaron las alícuotas esterilizadas en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C para su uso posterior.

SDS-PAGE

Se diluyeron las muestras de proteína hasta 0,2-0,3 mg/ml en PBS y se mezclaron con tampón de carga 5X reductor o no reductor. Las muestras se desnaturalizaron 5' a 95°C y se cargaron en gel de Bis-Tris al 4-12% NuPAGE (NP0335, de Novex de Life Technologies). Se usó MES NuPAGE 1X (NP0002, de Novex de Life Technologies) como tampón de transferencia y se realizó la electroforesis a 180 V, 110 mA durante 1 h. El gel se aclaró con agua desionizada y se tiñó con azul de Coomassie durante 15-20' en un agitador orbital. Se descartó la disolución de tinción y el gel se enjuagó 3 veces con agua desionizada y se sumergió en una disolución decolorante (ácido acético al 10%/metanol al 30%/agua mQ) durante 3-12 h en un agitador orbital. La disolución decolorante se descartó y se recirculó, el gel se lavó con agua desionizada y se tomó una fotografía del gel.

Las formulaciones para el tampón de carga 5X y la tinción con azul de Coomassie son las siguientes:

Para el tampón de carga 5X reductor, se añade 2-mercaptoetanol al 5-10% (v/v)

Protocolo de PNGasa F

Se mezclaron 12 |il de una muestra de IgG(F16)-3S 1,6 mg/ml (aproximadamente 19 |ig de glicoproteína) con 2 |il de tampón desnaturalizante de glicoproteínas 10X (reactivo suministrado con enzima PNGasa F) y 6 |il de agua mQ. La mezcla se incubó 8' a 95°C para desnaturalizar la glicoproteína, se enfrió brevemente en hielo y se centrifugó durante 10'. Se añadieron 4 |il de Glycobuffer 2 10X, 4 |il de NP-40 al 10% (reactivos suministrados con enzima PNGasa F), 12 |il de agua mQ y finalmente 2 |il de enzima PNGasa F (P0704, de NEB) a la muestra, que se mezcló suavemente y se incubó 1 h a 37°C. Después de la incubación, la mitad de la muestra (20 |iL) se mezcló con tampón de carga 5X reductor, mientras que la otra mitad con tampón de carga 5X no reductor, y las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE. Se usó Mo PS NuPAGE 1X (NP0001, de Novex de Life Technologies) como tampón de transferencia en lugar de MES 1X.

Cromatografía de exclusión molecular (SEC)

Se cargaron 100 |il de muestra diluida (concentración final de 0,3-0,5 mg/ml) en un FPLC (Ákta, GE Healthcare) y se separaron las proteínas mediante una columna Superdex200 10/300GL (GE Healthcare) previamente equilibrada con 1 CV de PBS, usando PBS como fase móvil a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min (límite de presión de columna establecido en 1,5 MPa). Las proteínas se detectaron mediante un detector de UV a una longitud de onda de 280 nm.

Cromatografía de líquidos - espectrometría de masas (CL-EM)

Las muestras se diluyeron hasta aproximadamente 0,1 mg/ml y la CL-EM se realizó en un instrumento Waters Xevo G2-XS Qtof (ESl-ToF-EM) acoplado a un sistema Waters Acquity UPLC H-Class usando una columna 2,1 x 50 mm Acquity BEH300 C4 de 1,7 |im (186004495, de Waters). Se usaron ácido fórmico al 0,1% en agua (disolvente A) y ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo (disolvente B) como fase móvil a una velocidad de flujo de 0,4 ml/min. El gradiente se programó de la siguiente manera: después de 1,5 min isocrático con el 95% de disolvente A, cambio gradual del 95% de disolvente A al 95% de disolvente B en 4,5 min (aumento del 10% cada 0,5 min), de nuevo al 95% de disolvente A en 0,5 min, linealmente al 95% de disolvente B y de nuevo al 95% de disolvente A en 2,25 min (última etapa repetida dos veces).

Resonancia de plasmón superficial (SPR)

Se cebó un nuevo chip sensor CM5 (BR100012, de GE Healthcare) durante aproximadamente 1 h con tampón HBS-EP (BR100188, de GE Healthcare) a una velocidad de flujo de 2 |il/min. La matriz de dextrano carboximetilado del chip se activó con 40 |il de una mezcla 1:1 de EDC-HCl 400 mM y NHS 100 mM y se recubrió con 30 |il de hTnC A1 50 |ig/ml (recibido de Philochem) en o bien tampón acetato 4,5 (BR100350, de GE Healthcare) o bien tampón acetato 5 (BR100351, de GE Healthcare). Los ácidos carboxílicos activados residuales de la matriz se inactivaron con 30 |il de etanolamina 1 M y las proteínas no unidas se eliminaron por lavado con 10 |il de HCl 10 mM. Se cebó el chip recubierto con NaN3 al 0,01% (p/v) en PBS a una velocidad de flujo de 5 |il/min. Se inyectaron muestras de 30 |il a una velocidad de flujo de 10 |il/min, seguido por 300 s de flujo de tampón (fase de disociación). El chip se lavó antes y después de cada inyección de muestra con 5-10 |il de HCl 10 mM.

Ensayo ELISA

Se recubrieron pocilios 24x Maxisorp Nunc-Immuno (468667, de Thermo Scientific) con 100 |il de dominio A1 de tenascina C humana sometido a corte y empalme alternativo 1x10'7 M (hTnC A1, recibido de Philochem) en PBS durante la noche a 4°C. Se lavaron los pocillos 3 veces con PBS y se bloquearon durante 1 h a TA con 200 |il de leche en polvo al 2% (p/v) (de coop) en PBS. Se descartó la disolución de bloqueo y se lavaron los pocillos 3 veces con PBS. Cada pocillo se llenó con 88 |il de muestras de proteína a diferentes concentraciones, se diluyeron en leche en polvo al 2%/PBS y se incubó la placa 1 h a TA. Se usaron PBS, SIP(KSF) e IgG(F8) como controles negativos. Se descartaron las disoluciones de proteína en los pocillos y se lavaron los pocillos 3 veces con PBS y luego se incubaron 1 h a TA con 100 |il de una dilución 1/1000 de proteína A-HRP (NA9120V, de GE Healthcare) en leche en polvo al 4% (p/v)/PBS. Después de descartar el contenido de los pocillos y lavar 3 veces con PBS-Tween (PBS Tween 20 al 0,05% (v/v)) y 3 veces con PBS, se añadieron 100 |il de sustrato BM Blue POD (11484281001, de Roche) a cada pocillo. La reacción se detuvo después de 5' añadiendo 50 |il de H2SO41 M a cada pocillo y se midió la absorbancia a 450 nm.

Cultivo de células tumorales

Células de tres tumores de origen humano diferentes; se cultivaron células de glioblastoma U-87 (HTB-14, de ATCC), células de carcinoma epidermoide A-431 (CRL-1555, de ATCC) y células de adenocarcinoma MdA-MB-231 (HTB-26, de ATCC) en frascos de cultivo a partir de alícuotas almacenadas en criotubos. Las células U-87 se cultivaron en MEM (41090-028, de Life Technologies), mientras que A-431 y MDA-MB-231 se cultivaron en DMEM (41966-029, de Life Technologies). Todos los medios se complementaron con FBS al 10% (v/v) (16000-044, de gibco® de Life Technologies) y 1xAnti-Anti (15240-062, de gibco® de Life Technologies). Las células se pasaron de T75 a T150 y T300 al alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia; una vez en T300, las células se dividieron en múltiples T300 hasta alcanzar el número deseado de células necesarias para la implantación en ratones. El procedimiento de pasaje/división incluyó descartar el medio viejo, lavar 1x con PBS estéril, separar las células mediante incubación en tripsina al 0,05%-EDTA (25300-062, de gibco® de Life Technologies) y añadir medio recién preparado precalentado. Se usó tripsina al 0,25%-EDTA (15050-065, de gibco® de Life Technologies) para separar las células A-431.

Implantación de tumores

Las células tumorales se separaron del matraz T300 mediante tripsinización, se diluyeron en medio recién preparado y se contaron. Se centrifugó un volumen que contenía el número deseado de células 5' x 1000 rcf usando Megafuge 1.0R (Heraeus Instruments). El sedimento se resuspendió en 50 ml de HBSS (14175-053, de gibco® de Life Technologies), se centrifugó de nuevo y finalmente se resuspendió en aproximadamente 500 |il de HBSS; suficiente para inyectar a cinco ratones 100 |il. Cada ratón asignado a MDA-MB-231 recibió 15x106 células, cada U-876,0x106 y cada A-431 2,7x106 como una inyección subcutánea (s.c.) en el flanco derecho.

El tamaño tumoral se midió usando un compás calibrador digital y el volumen se calculó usando la siguiente fórmula: Tamaño tumoral [mm3] = longitud [mm] x ancho2 [mm]/2

siendo la longitud el valor más alto y el ancho el valor más bajo.

Los ratones se sacrificaron cuando el tamaño tumoral alcanzó 2000 mm3 o la pérdida de peso superó el 15% del peso corporal inicial (antes de la implantación). Los experimentos se realizaron bajo una licencia de proyecto emitida por Veterinaramt des Kantons Zürich, Suiza (Bew. n.° 42/2012 y n.° 027/15).

Experimento de terapia

Los tumores implantados se dejaron crecer hasta un volumen promedio de unos 100 mm3 antes de comenzar con el régimen de terapia. Tres ratones por modelo de tumor recibieron 7 mg/kg de IgG(F16)-3S-N88Q-vedotina, tres recibieron 7 mg/kg de SIP(F16)-vedotina y tres recibieron PBS, cada 3 días, 4 veces en total. Se inyectaron por vía intravenosa disoluciones esterilizadas por filtración en la vena lateral de la cola, usando una jeringa de insulina Omnican® 50 (9151125, de B. Braun).

Estudio de biodistribución

El experimento de biodistribución se inició cuando los tumores alcanzaron un volumen promedio de 200-400 mm3. Al menos 2 días antes de comenzar el experimento, se administró a los ratones disolución de Lugol al 5% (3 gotas por cada botella de agua llena). Antes de comenzar con el marcaje, se administró a los ratones una dosis oral de perclorato de sodio (1 gota de una disolución de perclorato de sodio 1 g/ml en agua).

Marcaje de IgG(F16)-3S, N88Q-IgG(F16)-3S y SIP(F16)

Se humedecieron tres tubos de yodación prerrecubiertos Pierce (28601, de Life Technologies) con 1 ml de PBS esterilizado por filtración durante 5 min. Se retiró el PBS y se añadieron 100 |il de PBS nuevo directamente al fondo de cada tubo. Se añadieron 1,5 |il de I125 (NEZ033A001MC, de Perkin Elmer) a cada tubo, que se incubó 5 min a TA, con agitación regular (cada 30 s). El yoduro activado resultante se retiró del tubo de Pierce y se añadió a 400 |il de proteína diluida en PBS (se prepararon tres muestras de proteína; IgG(F16)-3S de tipo natural [1,125 mg/ml], IgG(F16)-3S mutante [0,87 mg/ml] y SIP(F16) [0,88 mg/ml]). Las muestras se incubaron durante 5 min a TA, agitando suavemente cada 30 s. Se cargaron 496,5 |il de cada muestra en una columna PD-10 (17-0851-01, de GE Healthcare) previamente bloqueada con 1 ml de BSA 1 mg/ml/PBS y previamente equilibrada con 25 ml de PBS. Las muestras se dejaron penetrar en la resina de la columna y se añadieron 2 ml de PBS a cada columna PD-10 para alcanzar el volumen de entrada recomendado de 2,5 ml. Las proteínas marcadas se eluyeron con 3 ml de PBS. Se recogieron fracciones de 5 y 11 gotas en 5 tubos Eppendorf (5 gotas para la primera fracción, 11 gotas para las siguientes). Se descartó la primera fracción, mientras que se usaron 5 |il de cada fracción restante para la prueba de incorporación.

Prueba de incorporación

Se midió la actividad en diez muestras, con el fin de determinar la cantidad promedio de yodo radiactivo incorporado en las proteínas. Se prepararon diez viales de contador (55.476, de Sarstedt) tal como se describe en la tabla 1.

Tabla 1: Preparación de viales de contador para la prueba de incorporación.

Los viales se analizaron en el contador Cobra Auto-Gamma (Packard) y los valores resultantes se usaron para calcular la eficiencia de incorporación, usando la siguiente fórmula:

Tasa de incorporación (cpm/|ig) = suma de las actividades en los viales 3,5,7,9 [cpm] x 100/proteína de entrada [|ig] x 0,8

suponiendo que el 80% de la proteína se recuperó después de la purificación en la columna PD-10.

Nueve ratones que portaban el mismo xenoinjerto tumoral se dividieron equitativamente en 3 grupos; un grupo se asignó a SIP(F16), el segundo a IgG(F16)-3S de tipo natural y el tercero a IgG(F16)N88Q-3S. A cada ratón del grupo se le inyectó la proteína marcada correspondiente. Para las inyecciones sólo se usó la muestra que contenía la fracción principal de proteína marcada (aproximadamente 150 |il/ratón). La dosis inyectada se calculó con la siguiente fórmula:

DI [cpm] = (actividad en el 1% de la fracción principal [cpm]/1% del volumen de la fracción principal [|il]) x volumen inyectado [|il]

Después de 24 h, se sacrificaron los ratones y se resecaron el tumor y los órganos (hígado, pulmones, intestino, estómago, riñones, corazón, sangre, bazo, cola) y se recogieron en viales de contador previamente pesados. Se determinó el peso del tumor y los órganos y se midió su actividad en el contador Cobra Auto-Gamma. La acumulación de la proteína investigada en los diferentes órganos y el tumor se calculó con la siguiente fórmula:

% de DI/g = (actividad en el órgano [cpm]/DI [cpm] x peso del órgano [g]) x 100

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   i. Molécula de anticuerpo que se une a tenascina C humana, que comprende:

   (a) un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y

   (b) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3,

   en la que dicha molécula de anticuerpo se une al dominio A1 de tenascina C con una mayor afinidad que un anticuerpo que comprende el dominio VH de SEQ ID NO: 1 y el dominio VL de SEQ ID NO: 7.
2. 2. Molécula de anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende:

   (a) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos que tiene menos de 5 alteraciones de secuencia en relación con SEQ ID NO: 5; y

   (b) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene menos de 5 alteraciones de secuencia en relación con SEQ ID NO: 6.
3. 3. Molécula de anticuerpo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que muestra:

   (i) agregación reducida

   (ii) eficacia aumentada y/o

   (iii) biodistribución tumoral aumentada

   en relación con la correspondiente molécula de anticuerpo que comprende el dominio VH de SEQ ID NO: 1 y el dominio VL de SEQ ID NO: 7.
4. 4. Molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un anticuerpo completo, opcionalmente una IgG.
5. 5. Molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la molécula de anticuerpo se conjuga con una molécula bioactiva, opcionalmente en la que la molécula bioactiva es un agente citotóxico.
6. 6. Molécula de anticuerpo según la reivindicación 5, en la que la molécula bioactiva es una citocina, opcionalmente en la que la citocina es IL-2.
7. 7. Molécula de ácido nucleico aislado que codifica para una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. 8. Vector que comprende una molécula de ácido nucleico aislado según la reivindicación 7.
9. 9. Célula recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico aislado según la reivindicación 7.
10. 10. Método para producir una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el método cultivar una célula recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico aislado que codifica para una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en condiciones para la expresión de la molécula de anticuerpo, comprendiendo además opcionalmente aislar y/o purificar la molécula de anticuerpo tras la expresión.
11. 11. Composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. 12. Método para producir una composición farmacéutica, que comprende mezclar una molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 con un excipiente farmacéuticamente aceptable
13. 13. Molécula de anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en el tratamiento de cáncer.
14. 14. Molécula de anticuerpo para su uso según la reivindicación 13, en la que el cáncer es leucemia o glioma.
15. 15. Molécula de anticuerpo para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, en la que la molécula de anticuerpo se administra en combinación con un segundo agente terapéutico.