ES2549362T3 - Antígenos asociados a endometriosis - Google Patents

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Abstract

Una molécula de anticuerpo que se une a la isoforma ED-A de la fibronectina para su uso en un método de diagnóstico de la endometriosis, en donde el método de diagnóstico de la endometriosis comprende las etapas de: (a) administrar la molécula de anticuerpo al ser humano o animal, y (b) determinar la presencia o ausencia de la molécula de anticuerpo en los sitios de la endometriosis del cuerpo humano o animal; en donde la localización de la molécula de anticuerpo en los sitios de la endometriosis indica la presencia de endometriosis.

Description

Antígenos asociados a endometriosis
La presente invención se refiere a la detección y tratamiento de la endometriosis. La invención implica el uso de una molécula de anticuerpo que se une a la isoforma ED-A de la fibronectina, especialmente una molécula de anticuerpo que se une al dominio ED-A de la fibronectina, o una molécula de anticuerpo que se une a la tenascina-C, especialmente al dominio A1, A2, A3, A4 y / o B dominio D de tenascina C (la "forma larga" de la tenascina-C).
La mayoría de los productos farmacéuticos convencionales en uso actualmente para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis (tales como cáncer, artritis, etc.) no se acumulan selectivamente en el sitio de la enfermedad [Bosslet et al., 58, 1195-1201 Cancer Res. (1998)]. Por ejemplo, los fármacos administrados por vía intravenosa se distribuyen uniformemente dentro de los diferentes órganos y tejidos del cuerpo, en lugar de acumularse selectivamente en el sitio de la enfermedad.
Un enfoque para eludir las desventajas de las terapias farmacológicas convencionales implica la liberación preferente de un agente bioactivo en el sitio del tumor por medio de una molécula de unión específica de un marcador asociado a una patología [Neri & Bicknell (2005) Nature Rev. Cancer]. La focalización selectiva del fármaco hacia el tejido enfermo tiene como resultado, en última instancia, un aumento de la concentración local en su sitio de acción, evitando a los órganos normales los efectos tóxicos del agente bioactivo utilizado para conferir un beneficio farmacológico (por ejemplo, un fármaco citotóxico, una citocina, un radionúclido, un fotosensibilizador). En la mayoría de los casos, esto dará lugar a un índice terapéutico mejorado del producto farmacéutico liberado, es decir, una mayor eficacia con efectos secundarios minimizados. De hecho, el perfil de toxicidad favorable de las terapéuticas específicas del lugar puede abrir nuevas vías en la terapia de las enfermedades relacionadas con la angiogénesis, lo que permite la administración sistémica de agentes altamente potentes y prometedores, que actualmente se administran a dosis subóptimas o cuya aplicación clínica ha estado, hasta la fecha, dificultada por toxicidades inaceptables cuando se aplica en una forma no modificada.
Las estrategias de liberación farmacológica basada en ligandos fundamentalmente se basan en la identificación de marcadores de buena calidad de la patología, lo que permite una discriminación clara entre tejidos enfermos y órganos sanos. Los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos representan los agentes preferidos para aplicaciones de liberación farmacológica [Rybak et al. 2, 22-40 Chem. Med. Chem (2007); Shrama et al., 5, 147-159 Nat. Rev. Drug Discovery (2006)], a pesar de que los mutantes de la proteína globular [Binz y Plückthun, 23, 12571268 Nature Biotechnology (2005)], péptidos [Sergeeva et al., 58, 1622-1654, Adv. Drug. Deliv. Rev. (2006)] e incluso pequeños ligandos orgánicos [Low et al., 41, 120-129, Acc. Chem. Res. (2008)] se utilizan cada vez más. La mayoría de los esfuerzos en el campo de la focalización hacia la enfermedad se han realizado utilizando marcadores específicos expresados en la superficie de las células enfermas (por ejemplo, en la superficie de las células tumorales en el cáncer). Sin embargo, dirigir los antígenos a las mismas células enfermas es una tarea compleja para los agentes de transmisión sanguínea, frente a una serie de barreras físicas y cinéticas, que pueden impedir una liberación de fármacos eficiente. Estas barreras incluyen la presión intersticial en el sitio de la enfermedad, las distancias de difusión relativamente largos dentro del intersticio, la heterogeneidad de los antígenos en los sitios de la enfermedad, así como la denominada "barrera antígeno" [Dennis et al., 67, 254-261, Cancer Res. (2007)]. Todos estos factores perjudican significativamente la penetración en las zonas profundas del tejido.
Las proteínas que se expresan alrededor de los vasos sanguíneos patológicos en los sitios de la enfermedad, pero que están ausentes o presentes en niveles reducidos en el tejido normal, representan objetivos particularmente atractivo para el desarrollo de estrategias de liberación de fármacos selectivas y eficientes [Rybak et al. (2007) ChemMedChem; Trachsel et al., 9, R9, Arthritis Res. Ther. (2007)]. Las dianas vasculares son a menudo más fácilmente accesible desde el torrente sanguíneo a los agentes administrados por vía sistémica, superando el problema de acceso y permitiendo una liberación eficaz del compuesto en el lugar de la enfermedad. Además, el mismo agente vascular dirigido podría ser útil no sólo para la liberación de agentes terapéuticos, sino también para aplicaciones de imágenes moleculares.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "reconocimiento vascular" no se utiliza para indicar la inhibición de la molécula diana en una vía de señalización (por ejemplo, la inhibición de la señalización de VEGF por bevacizumab o por la inhibición de la quinasa BCR / ABL por imatinib). En su lugar, la molécula diana expresada en la vasculatura en los sitios de las enfermedades relacionadas con la angiogénesis se utiliza como un sitio de unión de fácil acceso para ligandos específicos, explotando la vasculatura como un armazón para lograr una localización específica del sitio de las moléculas efectoras en el tejido tumoral. Esta diferencia conceptual fundamental queda clara por el hecho de que, mientras que algunas moléculas marcadoras vasculares han demostrado ser muy adecuadas para aplicaciones de reconocimiento tumores dirigidos por ligandos, su papel fisiopatológico es todavía en gran parte desconocido (por ejemplo, el dominio adicional B de la fibronectina; véase más adelante).
Los presentes inventores han realizado previamente una amplia labor en la focalización basada en anticuerpos de marcadores de la angiogénesis tumoral, tal como el dominio adicional B de la fibronectina (ED-B) [Schliemann y Neri, 1776, 175-192, Biochim Biophys Acta (2008]. El ED-B es prácticamente indetectable en los tejidos adultos
normales, con excepción del endometrio en la fase proliferativa, pero se sobreexpresa en afecciones que afectan a la remodelación tisular, con un patrón de tinción perivascular prominente. Tres derivados de del anticuerpo anti-EDB humano L19 [Pini et al. (1998) J. Biol. Chem.] Se están investigando actualmente en ensayos clínicos en fase I y en fase II para el tratamiento del cáncer (el producto radiomarcado L19-131I y las inmunocitocinas L19-IL2 y L19-TNF). La capacidad de L19 para localizar selectivamente en los sitios angiogénicos en enfermedades no tumorales se ha estudiado en modelos animales de neovascularización ocular [Birchler et al. 17, 984-988, Nature Biotechnology (1999)], artritis reumatoide [Trachsel et al., 9, R9, Arthritis Res. Ther. (2007)], psoriasis [Trachsel et al., 127, 881-886,
J. Inv. Dermatol. (2007)] y aterosclerosis [Matter et al., 95, 1225-1233 Circulation Res. (2004)].
Más recientemente, los presentes inventores han estudiado otros dominios de corte y empalme alternativamente de componentes de la matriz extracelular, cuyos patrones de expresión no están tan bien caracterizados y que hasta el momento se han utilizado principalmente como dianas vasculares para aplicaciones dirigidas a tumores: el dominio ED-A de la fibronectina [Rybak et al., 67, 10948-10957 (2007) Cancer Res.] y el dominio A1 de la tenascina-C [Brack et al., 12, 3200-3208, (2006) Clin. Cancer Res.]. ED-A es reconocido específicamente por el anticuerpo monoclonal humano F8 [Villa et al., 122, 2405-2413 (2008) Int. J. Cancer], mientras que el anticuerpo monoclonal humano F16 se une el dominio A1 de LA tenascina-C [Brack et al. (2006) Clin. Cancer Res.].
El patrón de expresión de los dominios adicionales A1, A2, A3, A4, B y D de la tenascina-C son similares, siendo casi indetectables en los tejidos adultos normales, pero están fuertemente regulados por aumento en una multitud de diferentes tumores [Brack et al. (2006) Clin. Farrell, y col., Cancer Res. (2008) Lung Cancer, en prensa; Berndt et al., 132, 537-546, J Cancer Res Clin Oncol (2006); Balza et al., 261, 175-178, FEBS Lett. (1990)]. La expresión "isoforma grande de la tenascina A" se utiliza a menudo para indicar la forma de la tenascina C que contiene los dominios adicionales A1, A2, A3, A4, B y D [Borsi et al., 270, 6243-6245 (1995) J. Biol. Chem.; Borsi et al., 66, 632635 (1996) Int. J. Cancer; Carnemolla et al., 154, 1345-1352 (1999) Am. J. Pathol.]. Por el contrario, la expresión del dominio adicional C de la tenascina-C está más restringida, siendo indetectable en los tejidos adultos normales y se encuentra solamente en ciertos tipos de tumores, principalmente cáncer de pulmón y astrocitomas de alto grado [Carnemolla et al. (1999) Am. J. Pathol.].
Por lo tanto, la liberación dirigida basada en anticuerpos de agentes bioactivos a sitios de angiogénesis es una estrategia terapéutica atractiva para el tratamiento del cáncer, pero está en gran parte sin explorar para las enfermedades inflamatorias crónicas. Hemos demostrado previamente que el dominio ED-B de la fibronectina, un marcador de la angiogénesis, se expresa en lesiones psoriásicas en pacientes y en un modelo de ratón de psoriasis, así como en las patas artríticas en el modelo de ratón de artritis reumatoide inducida con colágeno. Utilizando técnicas tanto radiactivas como fluorescentes, se encontró que el anticuerpo monoclonal humano L19, específico de EDB, se localizaba selectivamente en sitios de inflamación in vivo, después de la administración intravenosa. Estos resultados sugieren un potencial terapéutico para la liberación selectiva basada en L19 de compuestos bioactivos en sitios de inflamación (Trachsel, 2007; PCT/EP2007/004044).
Anteriormente también se ha demostrado mediante hibridación in situ que el dominio ED-A de la fibronectina puede estar presente en muestras artríticas humanas (Berndt et al., 1998; Kriegsmann et al., 2004), y los inventores han demostrado previamente la expresión de ED-A en la artritis reumatoide [PCT/EP2008/009070].
En el presente documento los inventores demuestran los patrones de expresión de ED-A y de la tenascina-C grande en otras enfermedades no tumorales relacionadas con la angiogénesis, tales como esclerosis múltiple, artritis psoriásica, psoriasis, enfermedades inflamatorias del intestino y endometriosis, utilizando concentraciones idénticas de versiones biotiniladas de los anticuerpos F8 y F16 en formato SIP [Borsi et al., 102, 75-85 (2002) Int. J. Cancer; Villa et al., 122, 2405-2413 (2008) Int. J. Cancer; Brack et al., 12, 3200-3208, (2006) Clin. Cancer Res.]. Estas enfermedades están asociadas con la angiogénesis y son socialmente muy relevantes. La liberación de fármacos basada en ligandos puede abrir nuevas oportunidades de diagnóstico y terapéuticas para estas enfermedades.
La esclerosis múltiple es una enfermedad autoinmune en la que el sistema inmunológico ataca al sistema nervioso, lo que da lugar a la desmielinización de las neuronas (Compston y Coles, 359, 1221-1231, Lancet, 2002). Además de por la desmielinización, la esclerosis múltiple también se caracteriza por la inflamación. No existe una cura conocida para la esclerosis múltiple y muchos medicamentos existentes pueden tener efectos secundarios adversos
o ser mal tolerados.
La psoriasis es una enfermedad que afecta a la piel y las articulaciones, por lo general, formando placas psoriásicas escamosas y rojas en la piel. Estas placas psoriásicas son áreas de inflamación. Cuando la psoriasis causa inflamación de las articulaciones, se conoce como artritis psoriásica. Se requieren tratamientos más eficaces para la psoriasis y la artritis psoriásica y un enfoque sería la administración dirigida de citocinas antiinflamatorias, tales como IL-10 o TGF-β, fotosensibilizadores o fármacos citotóxicos con enlazadores escindibles. Este enfoque requiere la orientación eficaz de los fármacos a las zonas de inflamación y la identificación de objetivos específicos expresados en estas regiones.
Las formas principales de enfermedad inflamatoria del intestino son la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La enfermedad de Crohn puede afectar a cualquier parte del tracto gastrointestinal, mientras que la colitis ulcerosa se
limita al colon y el recto (Summers et al., 2003). Dependiendo de su gravedad, el tratamiento de la colitis ulcerosa puede requerir inmunosupresión para controlar sus síntomas y el tratamiento generalmente consiste en la administración de moléculas antiinflamatorias.
5 La endometriosis es una enfermedad frecuente en las mujeres y se caracteriza por un crecimiento más allá o fuera del útero de tejido parecido al endometrio, que normalmente recubre el útero (Rock y Markham, 340, 1264-1267 (1992) Lancet).
La endometriosis normalmente se ve durante los años reproductivos y se ha estimado que se produce en
10 aproximadamente del 5 % al 10 % de las mujeres. Su síntoma principal, aunque no universal, es el dolor pélvico en diversas manifestaciones. Además, la endometriosis es frecuente en mujeres con infertilidad (Buyalos y Agarwal, 12, 377-381, (2000) Curr Opin Obstet Gynecol).
Un síntoma importante de la endometriosis es el dolor pélvico recurrente intenso. La cantidad de dolor que siente
15 una mujer no está necesariamente relacionada con la extensión o el estadio (1 a 4) de la endometriosis. Algunas mujeres tendrán poco o ningún dolor a pesar de tener una endometriosis extensa que afecta a grandes áreas o de tener endometriosis con cicatrices. Por otro lado, las mujeres pueden tener dolor intenso a pesar de que tienen sólo unas pocas áreas pequeñas de endometriosis (Muse K, 31, 813-822 (1988) Clin Obstet Gynecol).
20 Las lesiones de endometriosis típicas muestran características histológicas similares al endometrio, es decir estroma y epitelio endometrial y glándulas que responden a estímulos hormonales. Las lesiones más antiguas pueden no mostrar glándulas, sino depósitos de hemosiderina residuales. Para el ojo, las lesiones aparecen de color azul o en negro quemado y de tamaño variable; algunas otras lesiones son de color rojo, blanco o no pigmentadas
25 Adicionalmente puede haber otras lesiones, especialmente endometriomas del ovario, formación de cicatrices, defectos o bolsillos peritoneales. Dado que el peritoneo de aspecto normal de las mujeres infértiles revela endometriosis en la biopsia en el 6-13 % de los casos, algunas lesiones pueden no ser visibles a simple vista.
Una historia clínica y una exploración física puede, en muchos pacientes, llevar al médico a sospechar 30 endometriosis.
El uso de las pruebas de imagen puede identificar áreas de endometriosis más grandes, como nódulos o quistes de endometriosis. Las dos pruebas de imagen más habituales son la ecografía y la resonancia magnética (RM). Sin embargo, resultados normales en estas pruebas no eliminan la posibilidad de endometriosis, dado que menudo las
35 áreas de endometriosis son demasiado pequeñas como para poder verse con estas pruebas.
La única forma de confirmar y diagnosticar endometriosis es mediante laparoscopia, u otros tipos de cirugía. El diagnóstico se basa en el aspecto característico de la enfermedad y se corrobora mediante una biopsia, si es necesario. La laparoscopia también permite el tratamiento quirúrgico de la endometriosis (Brosens I., 15, 229-233
40 (1997) Semin Reprod Endocrinol).
Por esta razón, el descubrimiento de los marcadores vasculares de buena calidad de la endometriosis ofrece nuevas oportunidades para obtener imágenes de endometriosis (por ejemplo, mediante la liberación mediada por ligando de los radionúclidos y radioisótopos), y para la liberación farmacológica en el tejido endometrial de moléculas bioactivas
45 (tales como citocinas, hormonas, radionúclidos terapéuticos o fármacos con enlazadores escindibles).
En el presente documento los inventores muestran que un anticuerpo anti-tenascina-C, tal como el anticuerpo F16 descrito en el presente documento, es capaz de dar un patrón de tinción más fuerte en tejido endometrial humano que el anticuerpo anti-ED-B L19. Del mismo modo, un anticuerpo anti-ED-A, tal como el anticuerpo F8 divulgado en
50 el presente documento, también es capaz de dar un patrón de tinción más fuerte en tejido endometrial humano que el anticuerpo anti-ED-B L19, aunque la tinción que se ha visto con el anticuerpo F8 no tan intensa como la que se observa con el anticuerpo F16.
En el presente documento los inventores también muestran que un anticuerpo anti-tenascina-C, tal como el
55 anticuerpo F16 divulgado en el presente documento, es capaz de dar un patrón de tinción más fuerte en tejido de artritis psoriásica humano que el anticuerpo anti-ED-B L19 o el anticuerpo anti-ED-A F8.
Sin embargo, los inventores también han demostrado en el presente documento que la tinción de muestras de pacientes con colitis ulcerosa es prácticamente negativa para el anticuerpo anti-tenascina-C F16, el anticuerpo anti
60 ED-A F8 y el anticuerpo anti-ED-B L19, observándose sólo una positividad débil con F8 en algunas muestras.
El análisis de secciones de tejido de muestras patológicas de pacientes con esclerosis múltiple también reveló solamente positividad muy débil con el anticuerpo anti-tenascina C F16, el anticuerpo nti-ED-A F8 y el anticuerpo anti-ED-B L19.
En el caso de componentes de la matriz subendotelial modificada, el funcionamiento de liberación dirigida in vivo de los derivados de anticuerpos se correlaciona con abundante expresión de antígenos [Borsi et al., 102, 75-85 (2002) Int. J. Cancer; Demartis et al., 28, 534-539 (2001) Eur. J. Nucl. Med.; Tarli et al., 94, 192-198 (1999) Blood; Viti et al., 59, 347-352,(1999) Cancer Res.]. Basándose en los resultados descritos anteriormente, los inventores encontraron que la expresión de ED-A y de la isoforma “grande" de la tenascina C no se encuentra en todas las enfermedades relacionadas con la angiogénesis, y que la endometriosis parece ser particularmente adecuada para la liberación de fármacos utilizando moléculas de anticuerpo anti-ED -A, mientras que la endometriosis, la artritis psoriásica y la psoriasis parecen ser particularmente adecuadas para liberación farmacológica usando moléculas de anticuerpo anti-tenascina-C.
En consecuencia, el ED-A de la fibronectina está indicado como un marcador vascular de la endometriosis, mientras que la tenascina-C (en particular, la isoforma "grande" de la tenascina-C) está indicada como un marcador vascular de la endometriosis, artritis psoriásica y psoriasis.
Los miembros de unión específica, tales como las moléculas de anticuerpos que se unen al ED-A de la fibronectina, representan nuevos agentes que se pueden usar para el tratamiento de endometriosis, mientras que los miembros de unión específicos, tales como moléculas de anticuerpos que se unen la isoforma "grande" de la tenascina-C, representan nuevos agentes que se pueden usar para el tratamiento de endometriosis, artritis psoriásica o psoriasis.
En un primer aspecto, la invención proporciona una molécula de anticuerpo que se une a la isoforma del dominio extra-A (ED-A) de la fibronectina (A-FN) para su uso en un método de tratamiento de la endometriosis. La invención también proporciona el uso de una molécula de anticuerpo que se une la isoforma del Dominio Extra-A (ED-A) de la fibronectina para la fabricación de un medicamento para tratar la endometriosis. En el presente documento se divulga un método para tratar la endometriosis en un paciente, comprendiendo el método administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un medicamento que comprende un miembro de unión específica que se une a la isoforma ED-A isoforma de la fibronectina. Preferentemente, la molécula de anticuerpo se une a la isoforma ED-A isoforma de la fibronectina humana.
La molécula de anticuerpo, para su uso en este primer aspecto de la invención puede unirse al ED-A de la fibronectina.
La molécula de anticuerpo para su uso en este primer aspecto de la invención puede conjugarse con un marcador detectable, un radioisótopo, o una molécula bioactiva, tal como una citocina, una hormona, un radioisótopo terapéutico o un fármaco citotóxico. La molécula de anticuerpo puede conjugarse con la molécula bioactiva a través de un enlazador escindible.
En un segundo aspecto, la invención proporciona una molécula de anticuerpo que se une a la isoforma ED-A de la fibronectina para el uso en liberación en la neovasculatura del tejido endometrial de una molécula conjugada con el miembro de unión específica. La invención también proporciona el uso de una molécula de anticuerpo que se une a la isoforma ED-A de la fibronectina para la fabricación de un medicamento para la liberación en la neovasculatura del tejido endometrial de una molécula conjugada con el miembro de unión específica. En el presente documento se divulga un método para liberar una molécula en la neovasculatura del tejido endometrial en un ser humano o animal, en el que la molécula se conjuga con un miembro de unión específica que se une a la isoforma ED-A de la fibronectina para formar un conjugado y el método comprende la administración del conjugado al ser humano o animal. Preferentemente, la molécula de anticuerpo se une a la isoforma ED-A isoforma de la fibronectina humana.
La molécula de anticuerpo, para su uso en este segundo aspecto de la invención puede unirse al ED-A de la fibronectina.
La molécula de anticuerpo para su uso en este segundo aspecto de la invención puede conjugarse con un marcador detectable, un radioisótopo, o una molécula bioactiva, tal como una citocina, una hormona, un radioisótopo terapéutico o un fármaco citotóxico. La molécula de anticuerpo puede conjugarse con la molécula bioactiva a través de un enlazador escindible.
En un tercer aspecto, la invención proporciona una molécula de anticuerpo que se une a la isoforma ED-A de la fibronectina para su uso en un método de diagnóstico de la endometriosis. La invención también proporciona el uso de un miembro de unión específico que se une a la isoforma ED-A de la fibronectina para la fabricación de un producto de diagnóstico para el diagnóstico de endometriosis. En el presente documento se divulga un método para detectar o diagnosticar la endometriosis en un ser humano o animal, en el que el método comprende las etapas de:
(a)
administrar al ser humano o animal un miembro de unión específica que se une al dominio ED-A de la fibronectina, y
(b)
determinar la presencia o ausencia del miembro de unión específico en los sitios de la endometriosis del cuerpo humano o animal,
en el que la localización del miembro de unión específico al sitio de la endometriosis indica la presencia de endometriosis.
Preferentemente, la molécula de anticuerpo se une a la isoforma ED-A isoforma de la fibronectina humana.
5 La molécula de anticuerpo, para su uso en este tercer aspecto de la invención puede unirse al ED-A de la fibronectina.
La molécula de anticuerpo para su uso en este tercer aspecto de la invención puede conjugarse con un marcador 10 detectable, o un radioisótopo.
En el presente documento se divulga un miembro de unión específico que se une la isoforma ED-A de la fibronectina para su uso en un método de formación de imágenes del tejido endometrial. En el presente documento se divulga un miembro de unión específico que se une la isoforma ED-A de la fibronectina para la fabricación de un agente de
15 formación de imágenes para la obtención de imágenes del tejido endometrial. En el presente documento se divulga un método para detectar o formar imágenes del tejido endometrial en un ser humano o animal, en el que el método comprende las etapas de:
(a) administrar al ser humano o animal un miembro de unión específica que se une al dominio ED-A de la 20 fibronectina, y
(b) detectar la unión del miembro de unión específico a tejido endometrial en el cuerpo humano o animal.
Preferentemente, el miembro de unión específico se une a la isoforma ED-A isoforma de la fibronectina humana.
25 El miembro de unión específica, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, puede unirse a ED-A de la fibronectina.
El miembro de unión específica, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, puede conjugarse con un marcador detectable, o un radioisótopo.
30 Una molécula de anticuerpo para su uso en la invención puede ser un anticuerpo que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina y / o al ED-A de la fibronectina, en el que el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo, H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 o G9, o variantes de las mismas. F8, D5 y B7 se divulgan en Villa et al., 122, 2405-2413 (2008) Int. J. Cancer, mientras que H1, B2, C5, E5, C8, F1, E8 y G9 (y también F8, D5 y B7) se divulgan en el documento WO 2008/120101.
35 Preferentemente, una molécula de anticuerpo para su uso en la invención es un anticuerpo que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina y / o al ED-A de la fibronectina, que comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo B2, C5, D5, C8, F8, B7 o G9, o variantes de las mismas. Preferentemente, la molécula de anticuerpo se une a la isoforma ED-A isoforma de la fibronectina humana. Lo más preferentemente, una molécula de anticuerpo para su uso en la invención es un anticuerpo que se une a la isoforma del ED-A de la
40 fibronectina y / o al ED-A de la fibronectina, que comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo F8, o variantes de las mismas.
Preferentemente, una variante adecuada para su uso como se describe en el presente documento comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo que comprende un dominio VH y un dominio VL de uno cualquiera de los 45 anticuerpos F8, H1, B2, C5, D5, E5, C8, F1, B7, E8 y G9, en el que el residuo de valina (V) en la posición 5 del dominio VH está sustituido por leucina (L), y / o el residuo de lisina (K) en la posición 18 del dominio VL está sustituido por arginina (R)). Lo más preferentemente, una variante adecuada para su uso como se describe en el presente documento comprende un sitio de unión antígeno del anticuerpo que comprende el dominio VH V5L de F8 de la SEC ID Nº 16 y el dominio VL K18R de F8 de SEC ID Nº 78, en el que el residuo de valina (V) en la posición 5
50 del dominio VH está sustituido por leucina (L), y / o el residuo de lisina (K) en la posición 18 del dominio VL está sustituido por arginina (R).
Una molécula de anticuerpo para su uso en la invención puede comprender un conjunto de CDR de H y / o L de anticuerpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 o G9, o un conjunto de CDR de H y / o L de anticuerpo H1, B2, 55 C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 o G9 con diez o menos, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, o cinco, sustituciones de aminoácidos dentro del conjunto divulgado de CDR de H y/o L. Preferentemente, una molécula de anticuerpo para su uso en la invención comprende un conjunto de CDR de H y / o L de anticuerpo B2, C5, D5, C8, F8, B7 o G9 con diez o menos, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, o cinco, sustituciones de aminoácidos dentro del conjunto divulgado de CDR de H y / o L. Preferentemente, una molécula de anticuerpo para su uso en la invención 60 comprende un conjunto de CDR de H y / o L de anticuerpo F8, con diez o menos, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro,
o cinco, sustituciones de aminoácidos dentro del conjunto divulgado de CDR de H y / o L.
Las sustituciones pueden potencialmente realizarse en cualquier residuo dentro del conjunto de CDR y pueden estar dentro de CDR1, CDR2 y / o CDR3.
Por ejemplo, una molécula de anticuerpo para su uso en la invención puede comprender una o más CDR como se describe en el presente documento, por ejemplo, una CDR3, y opcionalmente también una CDR1 y CDR2 para formar un conjunto de CDR.
Un miembro de unión específico para su uso en la invención es una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo humano. La molécula de anticuerpo comprende normalmente un dominio de anticuerpo VH y / o VL. Los dominios VH de miembros de unión específica también se divulgan en el presente documento. Dentro de cada uno de los dominios VH y VL hay regiones determinantes de la complementariedad ("CDR,"), y regiones marco, ("FR"). Un dominio VH comprende un conjunto de HCDR, y un dominio VL comprende un conjunto de LCDR. Una molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VH de anticuerpo que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y un marco. Como alternativa o también comprende un dominio VL de anticuerpo que comprende un CDR1, CDR2 y CDR3 de VL y un marco. Los dominios VH y VL y las CDR de los anticuerpos H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8 (y su variante que comprende V5L VH y K18R VL), F1, B7, E8 y G9 se describen en el presente documento. Todas las secuencias de VH y VL, secuencias CDR, conjuntos de CDR y conjuntos de HCDR y conjuntos de LCDR divulgadas en el presente documento representan realizaciones de un miembro de unión específica para su uso en la invención. Como se describe en el presente documento, un "conjunto de CDR" comprende CDR1, CDR2 y CDR3. Por lo tanto, un conjunto de HCDR refiere a HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y un conjunto de LCDR refiere a LCDR1, LCDR2 y LCDR3. A menos que se indique lo contrario, un "conjunto de CDR" incluye HCDR y LCDR.
Una molécula de anticuerpo para su uso en la invención puede comprender un dominio VH de anticuerpo que comprende regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y un marco, en el que HCDR1 es la SEC ID Nº 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, o 50, y en el que opcionalmente HCDR2 es la SEC ID Nº 56; y/o HCDR3 es la SEC ID Nº 60. Preferentemente, el HCDR1 es la SEC ID Nº 42.
Normalmente, un dominio VH se empareja con un dominio VL para proporcionar un sitio de unión a antígeno del anticuerpo, aunque como se analiza más adelante, un dominio VH o VL por sí solo puede usarse para unirse al antígeno. Por tanto, una molécula de anticuerpo para su uso en la invención puede comprender además un dominio VL de anticuerpo que comprende regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y un marco, en el que LCDR1 es la SEC ID Nº 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, o 110, y en el que opcionalmente LCDR2 es la SEC ID Nº 114; y/o LCDR3 es la SEC ID Nº 118. Preferentemente, el LCDR1 es la SEC ID Nº 102.
Un miembro de unión específica para su uso en la invención puede ser una molécula de anticuerpo aislada para el ED-A de la fibronectina, que comprende un dominio VH y un dominio VL, en el que el dominio VH comprende un marco y un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y en el que el dominio VL comprende regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y un marco, y en el que HCDR1 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, o 50; HCDR2 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 56; HCDR3 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 60; LCDR1 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, o 110; LCDR2 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 114; y LCDR3 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 118. Preferentemente, el HCDR1 es la SEC ID Nº 42; y/o el LCDR1 es la SEC ID Nº 102.
UnA o más CDR o un conjunto de CDR de un anticuerpo pueden injertarse en un marco (por ejemplo, estructura humana) para proporcionar una molécula de anticuerpo para su uso en la invención. Las regiones marco pueden comprender secuencias de segmentos de genes de la línea germinal humana. Por lo tanto, el marco puede ser la línea germinal, en el que uno o más residuos dentro del marco se cambian para que coincidan con los residuos en la posición equivalente en el marco de la línea germinal humana más similar. Un miembro de unión específica para su uso en la invención puede ser una molécula de anticuerpo aislada que tiene un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR en un marco de línea germinal humana, por ejemplo, DP47. Normalmente, el miembro de unión específica también tiene un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR, por ejemplo, en un marco de línea germinal humana. El marco de la línea germinal humana del dominio VL puede ser DPK22.
Un dominio VH para su uso en la invención puede tener la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, o 24. Preferentemente, un dominio VH para su uso en la invención tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 14 o 16. Un dominio VL para su uso en la invención puede tener el aminoácido SEC ID Nº 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, o 86. Preferentemente, un dominio VL para su uso en la invención tiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 76 o 78.
Una molécula de anticuerpo para su uso en la invención puede ser o comprender un Fv de una sola cadena (scFv), que comprende un dominio VH y un dominio VL unidos a través de un enlazador peptídico. El experto puede seleccionar una longitud y secuencia de enlazador adecuados, por ejemplo, al menos 5 o al menos 10 aminoácidos de longitud, hasta aproximadamente 15, hasta aproximadamente 20 o hasta aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. El enlazador puede tener la secuencia de aminoácidos GSSGG (SEC ID Nº 122).
La molécula de anticuerpo puede ser un diacuerpo, que es un fragmento multivalente o multiespecífico construido mediante fusión génica (documento WO94/13804; Holliger 1993a).
Un Fv de cadena sencilla (scFv) puede estar comprendido dentro de una mini-inmunoglobulina o inmunoproteína pequeña (SIP), por ejemplo, como se describe en (Li et al., 1997). Una SIP puede comprender una molécula de scFv fusionada con el dominio CH4 de la isoforma IgE-S2 secretora de la IgE humana (εS2-CH4; Batista et al., 1996) formando una molécula de anticuerpo mini-inmunoglobulina homo dimérica.
Como alternativa, una molécula de anticuerpo para su uso en la invención puede comprender un sitio de unión al antígeno dentro de la molécula que no es anticuerpo, normalmente provista de una o más CDR por ejemplo, un conjunto de CDR en un armazón proteico no anticuerpo. Los miembros de unión específica, incluyendo las moléculas que no son anticuerpos y de anticuerpos, se describen con más detalle en otra parte en el presente documento.
Una o más CDR o un conjunto de CDR de un anticuerpo pueden injertarse en un marco (por ejemplo, estructura humana) para proporcionar una molécula de anticuerpo para su uso en la invención. Las regiones marco pueden comprender secuencias de segmentos de genes de la línea germinal humana. Por lo tanto, el marco puede ser la línea germinal, en el que uno o más residuos dentro del marco se cambian para que coincidan con los residuos en la posición equivalente en el marco de la línea germinal humana más similar. Un miembro de unión específica para su uso en la invención puede ser una molécula de anticuerpo aislada que tiene un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR en un marco de línea germinal humana, por ejemplo, DP47. Normalmente, el miembro de unión específica también tiene un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR, por ejemplo, en un marco de línea germinal humana. El marco de la línea germinal humana del dominio VL puede ser DPK22.
La molécula de anticuerpo puede ser un diacuerpo, que es un fragmento multivalente o multiespecífico construido mediante fusión génica (documento WO94/13804; Holliger 1993a).
Un Fv de cadena sencilla (scFv) puede estar comprendido dentro de una mini-inmunoglobulina o inmunoproteína pequeña (SIP), por ejemplo, como se describe en (Li et al., 1997). Una SIP puede comprender una molécula de scFv fusionada con el dominio CH4 de la isoforma IgE-S2 secretora de la IgE humana (εS2-CH4; Batista et al., 1996) formando una molécula de anticuerpo mini-inmunoglobulina homo dimérica.
Como alternativa, una molécula de anticuerpo para su uso en la invención puede comprender un sitio de unión al antígeno dentro de la molécula que no es anticuerpo, normalmente provista de una o más CDR por ejemplo, un conjunto de CDR en un armazón proteico no anticuerpo. Los miembros de unión específica, incluyendo las moléculas que no son anticuerpos y de anticuerpos, se describen con más detalle en otra parte en el presente documento.
Éstos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle más adelante.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra los resultados de la inmunohistoquímica en muestras de pacientes con endometriosis utilizando anticuerpos dirigidos a los marcadores de la angiogénesis. La tinción más oscura indica una fuerte expresión del antígeno, visualizado por las flechas negras. Las áreas de tinción negativa alrededor de las estructuras perivasculares se indican usando las flechas blancas. A, B y C muestran la tinción con F8-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une ED-A, divulgado en el presente documento. D, E y F muestran la tinción con L19-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une ED-B (por ejemplo, Pini et al., 1998). G, H e I muestran la tinción con F16-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une Al dominio A1 de LA tenascina-C (documento WO2006/050834). J, K y L son controles negativos en los que no se añadió anticuerpo primario. A, D, G, J, B, E, H y K muestran muestras observadas con un aumento de 10x y C, H, I y L muestran muestras observadas con un aumento 5x.
La Figura 2 muestra los resultados de la inmunohistoquímica en muestras de pacientes con colitis ulcerosa utilizando anticuerpos dirigidos a los marcadores de la angiogénesis. Las flechas blancas indican áreas de tinción negativa alrededor de las estructuras perivasculares. La Figura 2A muestra la tinción con F8-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une ED-A, divulgado en el presente documento. La Figura 2B muestra la tinción con L19-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une ED-B (por ejemplo. Pini et al., 1998). La Figura 2C muestra la tinción con F16-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une Al dominio A1 de LA tenascina-C (documento WO2006/050834). La Figura 2D es un control negativo en el que no se añadió anticuerpo primario.
La Figura 3 muestra los resultados de la inmunohistoquímica en muestras de pacientes con artritis psoriásica utilizando anticuerpos dirigidos a los marcadores de la angiogénesis. La tinción más oscura indica una fuerte expresión del antígeno, visualizado por las flechas negras. Las áreas de tinción negativa alrededor de las estructuras perivasculares se indican usando las flechas blancas. La Figura 3A muestra la tinción con F8-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une ED-A, divulgado en el presente documento. La Figura 3B muestra
la tinción con L19-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une ED-B (por ejemplo. Pini et al., 1998). La Figura 3C muestra la tinción con F16-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une al dominio A1 de la tenascina-C (documento WO2006/050834). La Figura 3D es un control negativo en el que no se añadió anticuerpo primario.
La Figura 4 muestra los resultados de la inmunohistoquímica en muestras de pacientes con esclerosis múltiple utilizando anticuerpos dirigidos a los marcadores de la angiogénesis. Las flechas blancas indican áreas de tinción negativa alrededor de las estructuras perivasculares. La Figura 4A muestra la tinción con F8-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une ED-A, divulgado en el presente documento. La Figura 4B muestra la tinción con L19-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une ED-B (por ejemplo. Pini et al., 1998). La Figura 4C muestra la tinción con F16-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une al dominio A1 de la tenascina-C (documento WO2006/050834). La Figura 4D es un control negativo en el que no se añadió anticuerpo primario.
La Figura 5 muestra los resultados de la inmunohistoquímica en muestras de pacientes con psoriasis utilizando anticuerpos dirigidos a los marcadores de la angiogénesis. La tinción más oscura indica una fuerte expresión del antígeno, visualizado por las flechas negras. Las áreas de tinción negativa alrededor de las estructuras perivasculares se indican usando las flechas blancas. La Figura 5A muestra la tinción con F8-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une ED-A, divulgado en el presente documento. La Figura 5B muestra la tinción con L19-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une ED-B (por ejemplo. Pini et al., 1998). La Figura 5C muestra la tinción con F16-SIP, que es una molécula de anticuerpo que se une Al dominio A1 de LA tenascina-C (documento WO2006/050834). La Figura 5D es un control negativo en el que no se añadió anticuerpo primario.
La Figura 6A muestra las secuencias de nucleótidos de la cadena pesada (VH) del anticuerpo F8 anti-ED-A (SEC ID Nº 13) y su variante, F8 V5L VH (SEC ID Nº 15). La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada CDR1 (SEC ID Nº 41) del anticuerpo F8 anti-ED-A está subrayada. La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada CDR2 (SEC ID Nº 55) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en cursiva y subrayada. La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada CDR3 (SEC ID Nº 59) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en negrita y subrayada.
La Figura 6B muestra las secuencias de nucleótidos de la secuencia enlazadora del anticuerpo F8 anti-ED-A (SEC ID Nº 121).
La Figura 6C muestra las secuencias de nucleótidos de la cadena ligera (VL) del anticuerpo F8 anti-ED-A (SEC ID Nº 75) y su variante, F8 K18R VL (SEC ID Nº 77). La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera CDR1 (SEC ID Nº 101) del anticuerpo F8 anti-ED-A está subrayado. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera CDR2 (SEC ID Nº 113) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en cursiva y subrayada. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera CDR3 (SEC ID Nº 117) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en negrita y subrayada.
La Figura 7A muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada (VH) del anticuerpo F8 anti-ED-A (SEC ID Nº 14) y su variante, F8 V5L VH (SEC ID Nº 16). La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDR1 (SEC ID Nº 42) del anticuerpo F8 anti-ED-A está subrayada. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDR2 (SEC ID Nº 56) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en cursiva y subrayada. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDR3 (SEC ID Nº 60) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en negrita y subrayada.
La Figura 7B muestra las secuencias de aminoácidos de la secuencia enlazadora del anticuerpo F8 anti-ED-A (SEC ID Nº 122).
La Figura 7C muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera (VL) del anticuerpo F8 anti-ED-A (SEC ID Nº 76) y su variante, F8 K18R VL (SEC ID Nº 78). La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDR1 (SEC ID Nº 102) del anticuerpo F8 anti-ED-A está subrayado. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDR2 (SEC ID Nº 114) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en cursiva y subrayada. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDR3 (SEC ID Nº 118) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en negrita y subrayada.
La Figura 8A muestra las secuencias de nucleótidos de la cadena pesada (VH) del anticuerpo anti-tenascina-C. F16 (SEC ID Nº 25) y su variante, 4A1-F16 (SEC ID Nº 27). Las secuencias de nucleótidos de la CDR1 de la cadena pesada de los anticuerpos anti-tenascina C F16 y F16-4A1 están subrayadas (SEC ID Nº 51 y 53, respectivamente). La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada CDR2 (SEC ID Nº 57) de los anticuerpos anti-tenascina C F16 y F16-4A1 se muestra en cursiva y subrayada. La secuencia de nucleótidos de la cadena pesada CDR3 (SEC ID Nº 61) de los anticuerpos anti-tenascina C F16 y F16-4A1 se muestra en negrita y subrayada.
La figura 8B muestra la secuencia de nucleótidos de la secuencia del enlazador (SEC ID Nº 121) de los anticuerpos anti-tenascina-C F16 y F16-4A1.
La figura 8C muestra la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera (VL) (SEC ID Nº 87) de los anticuerpos anti-tenascina-C F16 y F16-4A1. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera CDR1 (SEC ID Nº 111) de los anticuerpos anti-tenascina-C F16 y F16-4A1 está subrayada. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera CDR2 (SEC ID Nº 115) de los anticuerpos anti-tenascina C F16 y F16-4A1 se muestra en cursiva y subrayada. La secuencia de nucleótidos de la cadena ligera CDR3 (SEC ID Nº 119) de los anticuerpos anti-tenascina C F16 y F16-4A1 se muestra en negrita y subrayada.
La figura 9A muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (VH) del anticuerpo anti-tenascina C F16 (SEC ID Nº 26) y su variante, 4A1-F16 (SEC ID Nº 28). La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDR1 del anticuerpo anti-tenascina C F16 (SEC ID Nº 52) y 4A1-F16 (SEC ID Nº 54) está subrayada. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDR2 (SEC ID Nº 58) de los anticuerpos anti-tenascina C F16 y F16-4A1 se muestra en cursiva y subrayada. La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDR3 (SEC ID Nº 62) de los anticuerpos anti-tenascina C F16 y 4A1-F16 se muestra en negrita y subrayada.
La Figura 9B muestra las secuencias de aminoácidos de la secuencia enlazadora del anticuerpo anti-tenascina C F16 (SEC ID Nº 122).
La figura 9C muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera (VL) (SEC ID Nº 88) de los anticuerpos anti-tenascina-C F16 y 4A1-F16. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDR1 (SEC ID Nº 112) de los anticuerpos anti-tenascina-C F16 y 4A1-F16 está subrayada. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDR2 (SEC ID Nº 116) de los anticuerpos anti-tenascina C F16 y F16-4A1 se muestra en cursiva y subrayada. La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDR3 (SEC ID Nº 120) de los anticuerpos anti-tenascina C F16 y 4A1-F16 se muestra en negrita y subrayada.
La Figura 10 muestra los resultados de formación de imágenes en el infrarrojo cercano de las lesiones de endometriosis en ratones. Las áreas de endometriosis en los ratones se indican mediante círculos. Las Figuras 10A y B muestran los resultados de formación de imágenes en el infrarrojo cercano usando una molécula de anticuerpo SIP(F8)-ALEXA750, que se une a ED-A. SIP(F8)-ALEXA750 se inyectó en ratones con endometriosis y se realizaron imágenes 24 horas después de la inyección. Las flechas indican áreas de imágenes positivas. La Figura 10C muestra los resultados de formación de imágenes en el infrarrojo cercano usando una molécula de anticuerpo que reconoce el dominio A1 humano de la tenascina-C. Se inyectó SIP (F16) -ALEXA750 en ratones con endometriosis y la imagen se obtuvo 24 horas después de la inyección.
La Figura 11 muestra los resultados de tinción ex vivo de lesiones de endometriosis murinas. Las Figuras 11A, B y C muestran la detección inmunofluorescente de SIP (F8) -ALEXA750 usando un anticuerpo IgE de conejo antihumano seguido del anticuerpo IgG de cabra anti-conejo.
Las Figuras 11D, E y F muestran la detección de los vasos sanguíneos utilizando un anticuerpo anti-CD31 de rata seguido de IgG anti-rata de burro. Las Figuras 11 G, H e I representan controles negativos y muestran los resultados de probar las lesiones con IgG de anti-conejo de cabra solamente.
TERMINOLOGÍA
Fibronectina
La fibronectina es un antígeno sometido a corte y empalme alternativo y se conoce un número de isoformas alternativas de la fibronectina, como se describe en otra parte del presente documento. El dominio Extra-A (EDA o ED-A) también se conoce como ED, repetición A de tipo III extra (EIIIA) o EDI. La secuencia de ED-A humano ha sido publicada por Kornblihtt et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868 y Paolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557. La secuencia del ED-A humano también está disponible en la base de datos SwissProt, como los aminoácidos 1631 a 1720 (fibronectina tipo III-12; dominio adicional 2) de la secuencia de aminoácidos depositada bajo el número de acceso P02751. La secuencia del ED-A de ratón también está disponible en la base de datos SwissProt, como los aminoácidos 1721-1810 (fibronectina tipo III-13; dominio adicional 2) de la secuencia de aminoácidos depositada bajo el número de acceso P11276.
La isoforma de ED-A de la fibronectina (A-FN) contiene el dominio A extra (ED-A). La secuencia de la A-FN humana se puede deducir a partir de la correspondiente secuencia precursora de la fibronectina humana, que está disponible en la base de datos SwissProt número de acceso P02751. La secuencia de la A-FN de ratón se puede deducir a partir de la correspondiente secuencia precursora de la fibronectina de ratón, que está disponible en la base de datos SwissProt número de acceso P11276. La A-FN puede ser la isoforma de ED-A humana de la fibronectina. El ED-A puede ser el dominio extra-A de la fibronectina humana.
El ED-A es una secuencia de 90 aminoácidos que se inserta en la fibronectina (FN) mediante corte y empalme alternativo y está situado entre el dominio 11 y 12 de FN (Borsi et al., 1987, J. Cell Biol., 104, 595-600). El ED-A está principalmente ausente en la forma plasmática de FN, pero es abundante durante la embriogénesis, la remodelación de tejido, la fibrosis, el trasplante cardíaco y el crecimiento del tumor sólido.
Corte y empalme alternativo
El corte y empalme alternativo se refiere a la aparición de diferentes patrones de corte y empalme de un transcrito de ARN primario de ADN para producir diferentes ARNm. Después de la escisión de los intrones, la selección puede determinar qué exones se empalman entre sí para formar el ARNm. El corte y empalme alternativo conduce a la producción de diferentes isoformas que contienen diferentes exones y / o diferentes números de exones. Por ejemplo, una isoforma puede comprender una secuencia de aminoácidos adicional correspondiente a uno o más exones, que puede comprender uno o más dominios.
Tenascina C
La tenascina-C es una glicoproteína grande hexamérica de la matriz extracelular que modula la adhesión celular. Está implicada en procesos tales como la proliferación celular y la migración celular y se asocia con cambios en la arquitectura del tejido como se producen durante la morfogénesis y la embriogénesis, así como bajo la tumorigénesis o la angiogénesis.
Se ha notificado un fuerte sobreexpresión de la isoforma grande de la tenascina C en una serie de tumores [Borsi 1992 citado anteriormente], y en la clínica se han caracterizado ampliamente los anticuerpos monoclonales específicos para los dominios A1 y D, respectivamente [Riva et al, Int J Cancer (1992) 51: 7-13; Riva et al., Cancer Res (1995), 55, 5952s-5956s; Paganelli et al., Eur [Riva et al., Int J Cancer (1992) 51:7-13; Riva et al., Cancer Res (1995), 55, 5952s-5956s; Paganelli et al., Eur J Nucl Med (1994) 21, 314-321. Reardon et al., J Clin Oncol (2002), 20, 1389-1397; Bigner et al., J Clin Oncol (1998) 16, 2202-2212.].
Los fragmentos de anticuerpos monoclonales humanos específicos de la tenascina C se describen en el documento WO2006/050834 y se ha demostrado que se unen preferentemente a tejido tumoral con respecto al tejido normal. Estos anticuerpos son útiles, por ejemplo, en la liberación de toxinas, tales como citocinas, específicamente a las células tumorales.
Miembro de unión específica
Esto describe un miembro de un par de moléculas que se unen específicamente entre sí. Los miembros de un par de unión específico pueden derivarse de forma natural o producirse total o parcialmente de forma sintética. Un miembro del par de moléculas tiene un área en su superficie, o una cavidad, que se une a, y por lo tanto es complementaria a, una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de moléculas. Ejemplos de tipos de pares de unión son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, receptor de hormona-hormona, receptor-ligando, enzima-sustrato. La presente invención se refiere a reacciones de tipo antígeno-anticuerpo.
Un miembro de unión específica comprende normalmente una molécula que tiene un sitio de unión al antígeno. Por ejemplo, un miembro de unión específica puede ser una molécula de anticuerpo o una proteína no anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno.
Un sitio de unión al antígeno puede proporcionarse por medio de la disposición de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en los armazones de proteínas no anticuerpos, tales como fibronectina o citocromo B etc. Haan & Maggos, 2004; Koide 1998; Nygren 1997), o mediante aleatorización o mutación de residuos de aminoácidos de un bucle dentro de un armazón proteico para conferir especificidad de unión para una diana deseada. Los andamios para la ingeniería de nuevos sitios de unión en las proteínas se han revisado con detalle en Nygren et al. (1997). Los armazones proteicos para miméticos de anticuerpos se divulgan en el documento WO/0034784, en el que los inventores describen proteínas (miméticos de anticuerpos) que incluyen un dominio de tipo III de la fibronectina que tiene al menos un bucle aleatorizado. Un armazón adecuado en el que injertar una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de HCDR, puede ser proporcionado por cualquier miembro de dominio de la superfamilia de genes de inmunoglobulinas. El armazón puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un armazón proteico que no es anticuerpo es que puede proporcionar un sitio de unión al antígeno en una molécula de armazón que es más pequeña y / o más fácil de fabricar que al menos algunas moléculas de anticuerpo. El pequeño tamaño de un miembro de unión puede conferir propiedades fisiológicas útiles, tales como una capacidad para entrar en las células, penetrar profundamente en los tejidos o alcanzar las dianas dentro de otras estructuras o para unirse dentro de las cavidades de la proteína del antígeno diana. El uso de sitios de unión a antígeno en armazones de proteínas que no son anticuerpos se revisa en Wess, 2004. Típicas son las proteínas que tienen un esqueleto estable y uno o más bucles variables, en los que la secuencia de aminoácidos del bucle o bucles está específicamente o aleatoriamente mutada para crear un sitio de unión al antígeno que se une al antígeno diana. Tales proteínas incluyen los dominios de unión a IgG de la proteína A de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por ejemplo, 10º dominio de tipo III de la fibronectina) y lipocalinas. Otros enfoques incluyen "Microcuerpos" sintéticos (Selecore GmbH), que se basan en ciclótidos -pequeñas proteínas que tienen enlaces disulfuro intramoleculares.
Además de las secuencias de anticuerpo y / o un sitio de unión al antígeno, un miembro de unión específica para su uso en la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, formando un péptido o polipéptido,
tal como un dominio plegado, o para impartir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad para unirse al antígeno. Los miembros de unión para su uso en la invención pueden llevar un marcador detectable, o puede conjugarse a una toxina o un resto o enzima dirigida (por ejemplo, mediante un enlace peptidilo o enlazador). Por ejemplo, un miembro de unión puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio de enzima), así como un sitio de unión al antígeno, en el que el sitio de unión al antígeno se une al antígeno y, por lo tanto, dirige el sitio catalítico al antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del antígeno, por ejemplo, por escisión.
Aunque, como se ha indicado, las CDR pueden estar en armazones que no son anticuerpos, la estructura para portar una CDR o un conjunto de CDR será generalmente una secuencia de anticuerpo de cadena pesada o ligera o una porción sustancial de la misma en la que la CDR o un conjunto de CDR se encuentra en una localización correspondiente a la CDR o al conjunto de CDR de los dominios variables del anticuerpo VH y VL de origen natural codificados por genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y las ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse por referencia a Kabat 1987, y sus actualizaciones, ahora disponible en Internet (en immuno.bme.nwu.edu o encontrarse en "Kabat" utilizando cualquier motor de búsqueda).
Por región CDR o CDR se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina como se define en Kabat et al. (1987), (Kabat 1991a, y ediciones posteriores). Un anticuerpo contiene normalmente 3 CDR de la cadena pesada y 3 CDR de la cadena ligera. El término CDR se utiliza en el presente documento con el fin de indicar, de acuerdo con el caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad, de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácidos responsables de la unión por afinidad del anticuerpo por el antígeno o el epítopo que reconoce.
Entre las seis secuencias de CDR cortas, la tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad debido esencialmente a los mecanismos de disposición de los genes que la producen). Puede ser tan corta como de 2 aminoácidos, aunque el tamaño más largo conocido es 26. Funcionalmente, la HCDR3 desempeña un papel en parte en la determinación de la especificidad del anticuerpo (Segal 1974; Amit 1986; Chothia 1987; Chothia 1989; Caton 1990; Sharon 1990a; Sharon 1990b; Kabat et al., 1991b).
Molécula de anticuerpo
Esto describe una inmunoglobulina producida de forma natural o sintética parcial o completamente. El término también se refiere a cualquier polipéptido o proteína que comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Se debe entender en el presente documento que la invención no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir, no están en su entorno natural sino que se han podido aislar u obtener mediante purificación a partir de fuentes naturales, o, de otro modo, obtener por recombinación genética, o mediante síntesis química, y que después pueden contener aminoácidos no naturales, como se describirá más adelante. Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de unión a antígeno del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, moléculas de anticuerpo tales como Fab, Fab ', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos.
Es posible utilizar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que se unen al antígeno diana. Dichas técnicas pueden implicar la introducción de ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina, o las CDR, de un anticuerpo a las regiones constantes, o regiones constantes más regiones marco, de una inmunoglobulina diferente. Véanse, por ejemplo, los documento EP-A-184187, GB 2188638Ao EP-A-239400, y una gran cantidad de literatura posterior. Un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo pueden estar sujetas a mutación genética o a otros cambios, que pueden o no alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.
Dado que los anticuerpos pueden modificarse de varias formas, la expresión "molécula de anticuerpo" debe interpretarse como que cubre cualquier miembro de unión o sustancia que tiene un sitio de unión antígeno anticuerpo con la especificidad y / o la unión a antígeno requeridas. Por lo tanto, este término cubre fragmentos de anticuerpo y derivados, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un sitio de unión a antígeno del anticuerpo, ya sea natural o total o parcialmente sintético. Por tanto, están incluidas las moléculas quiméricas que comprenden un sitio de unión a antígeno del anticuerpo, o equivalente, fusionado a otro polipéptido (por ejemplo, derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo). La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y en una gran cantidad de literatura posterior.
Otras técnicas disponibles en la materia de la ingeniería de anticuerpos han hecho posible aislar anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, los hibridomas humanos se pueden fabricar como describen Kontermann y Dubel (2001). La presentación en fagos, otra técnica establecida para la generación de miembros de unión, se ha descrito con detalle en muchas publicaciones tales como WO92/01047 (tratado más adelante) y las patentes de EE.UU. US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404 y Kontermann & Dubel (2001). Los ratones transgénicos en los que los genes de anticuerpos de ratón están inactivados y funcionalmente sustituidos por genes de anticuerpos humanos mientras que dejan intactos otros componentes del sistema inmunológico del
ratón, se pueden utilizar para aislar anticuerpos humanos (Mendez 1997).
Las moléculas de anticuerpos sintéticos pueden crearse mediante la expresión de genes generados por medio de oligonucleótidos sintetizados y ensamblados dentro de vectores de expresión adecuados, por ejemplo como se describe en Knappik et al. (2000) o Krebs et al. (2001).
Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de antígenos de unión. Los ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward 1989; McCafferty 1990; Holt 2003), que consiste en un dominio VH
o VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), en los que un dominio VH y un dominio VL están unidos por un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión de antígeno (Bird 1988; Huston 1988); (viii) dímeros Fv de cadena única biespecíficos (documento PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión de genes (documento WO94/13804; Holliger 1993a). Las moléculas Fv, scFv o de diacuerpo pueden estabilizarse por la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter 1996). También pueden fabricarse minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu 1996). Otros ejemplos de fragmentos de unión son Fab', que difiere de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo, y Fab'-SH, que es un fragmento Fab' en el que el o los residuos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre.
Los fragmentos de anticuerpos para su uso en la invención se pueden obtener a partir de cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento, por ejemplo, moléculas de anticuerpo que comprenden los dominios VH y / o VL o CDR de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, por métodos tales como digestión enzimática, tales como pepsina o papaína y / o mediante escisión de los puentes disulfuro por reducción química. En otra forma, los fragmentos de anticuerpo de la presente invención pueden obtenerse mediante técnicas de recombinación genética igualmente bien conocidas por el experto en la materia o bien mediante síntesis peptídica por medio de, por ejemplo, sintetizadores de péptidos automáticos tales como los suministrados por la empresa Applied Biosystems, etc., o mediante síntesis y expresión de de ácidos nucleicos.
Los fragmentos de anticuerpos funcionales de acuerdo con la presente invención incluyen cualquier fragmento funcional cuya semivida se incrementa por una modificación química, especialmente mediante PEGilación, o mediante incorporación en un liposoma.
Un dAb (anticuerpo de dominio) es un pequeño fragmento monomérico de unión al antígeno de un anticuerpo, a saber, la región variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo (Holt 2003). Los VH dAb se producen naturalmente en los camélidos (por ejemplo, camello, llama) y pueden producirse mediante la inmunización de un camélido con un antígeno diana, aislando las células B específicas de antígeno y la clonación directa de genes de dAb partir de células B individuales. Los dAb también se pueden producir en cultivo celular. Su pequeño tamaño, buena solubilidad y estabilidad a la temperatura hace que sean particularmente fisiológicamente útiles y adecuados para la selección y maduración de afinidad. Un miembro de unión de la presente invención puede ser un dAb que comprende un dominio VH o VL sustancialmente como se establece en el presente documento, o un dominio VH o VL que comprende un conjunto de CDR sustancialmente tal como se establece en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, la frase "sustancialmente tal como se establece" se refiere a la o las características de las CDR pertinentes del dominio VH o VL de los miembros de unión descritos en el presente documento serán idénticas o muy similares a las regiones especificadas de las cuales la secuencia se establece en el presente documento. Como se describe en el presente documento, la frase "muy similares" con respecto a la o las regiones especificadas de uno o más dominios variables, se contempla que se pueden hacer de 1 a aproximadamente 5, por ejemplo, de 1 a 4, incluyendo de 1 a 3, o 1 o 2, o 3 o 4, sustituciones de aminoácidos en la CDR y / o el dominio VHo VL.
Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales forman una segunda generación de anticuerpos monoclonales en la que dos regiones variables diferentes se combinan en la misma molécula (Holliger 1999). Su uso ha sido demostrado tanto en el campo del diagnóstico como en el campo de la terapia por su capacidad para reclutar nuevas funciones efectoras o para apuntar a varias moléculas en la superficie de las células tumorales. Cuando se van a usar anticuerpos biespecíficos, estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, que pueden fabricarse de muchas formas (Holliger 1993b), por ejemplo, prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mencionados anteriormente. Estos anticuerpos pueden obtenerse por métodos químicos (Glennie 1987; Repp 1. 995) o métodos somáticos (Staerz 1986; Suresh 1986), aunque también mediante técnicas de ingeniería genética que permiten forzar la heterodimerización y, de este modo, facilitar el proceso de purificación del anticuerpo buscado (Merchand 1998). Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen los de la tecnología BiTE ™ en la que los dominios de unión de dos anticuerpos con diferente especificidad se pueden utilizar y directamente unir a través de péptidos cortos flexibles. Esto combina dos anticuerpos en una única cadena de polipéptido corta. Los diacuerpos y los scFv pueden
construirse sin una región Fc, usando solo dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de la reacción anti-idiotipo.
Los anticuerpos biespecíficos se pueden construir como una IgG entera, un Fab'2 biespecífico, como Fab'PEG, como diacuerpos o bien como scFv biespecífico. Además, se pueden unir dos anticuerpos biespecíficos usando métodos de rutina conocidos en la técnica para formar anticuerpos tetravalentes.
Los diacuerpos biespecíficos, a diferencia de los anticuerpos biespecíficos enteros, también pueden ser particularmente útiles porque pueden construirse y expresarse fácilmente en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tales como fragmentos de anticuerpos) de especificidades de unión apropiadas pueden seleccionarse fácilmente usando la presentación en fagos (documento WO94/13804) a partir de bibliotecas. Si un brazo del diacuerpo debe mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra un antígeno diana, después se puede hacer una biblioteca en la que el otro brazo se varía y se selecciona un anticuerpo de especificidad apropiada. Los anticuerpos biespecíficos completos se pueden preparar por métodos de ingeniería alternativos como se describe en Ridgeway 1996.
En la técnica están disponibles varios métodos para la obtención de anticuerpos contra un antígeno diana. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, especialmente de origen humano, murino, quimérico o humanizado, que se pueden obtener de acuerdo con los métodos estándar bien conocidos por la persona experta en la técnica.
En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible hacer referencia a las técnicas que se describen en particular en el manual "Antibodies" (Harlow y Lane 1988) o a la técnica de preparación a partir de hibridomas descrita por Kohler y Milstein, 1975.
Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener, por ejemplo, a partir de una célula animal inmunizada contra A-FN o tenascina C, o uno de sus fragmentos que contienen el epítopo reconocido por dichos anticuerpos monoclonales, por ejemplo, un fragmento que comprende o que consiste en ED-A o el dominio A1, A2, A3, A4, B o D de la isoforma grande de la tenascina C, o un fragmento de péptido de la DE-A o el dominio A1, A2, A3, A4, B o dominio D de la isoforma grande de la tenascina C. A-FN o tenascina C, o uno de sus fragmentos, se pueden producir especialmente de acuerdo con los métodos de trabajo habituales, por recombinación genética empezando con una secuencia de ácido nucleico contenida en la secuencia de ADNc que codifica A-FN o tenascina C, o fragmento de la misma, mediante síntesis de péptidos a partir de una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia peptídica de la A-FN o tenascina C y / o fragmento de la misma.
Los anticuerpos monoclonales pueden, por ejemplo, purificarse en una columna de afinidad en la que A-FN o tenascina C, o uno de sus fragmentos que contienen el epítopo reconocido por dichos anticuerpos monoclonales, por ejemplo, un fragmento que comprende o que consiste en ED-A o tenascina C, o un fragmento de péptido de ED-A DE-A o tenascina C, se ha inmovilizado previamente. Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse por cromatografía en proteína A y / o G, seguida o no seguida de cromatografía de intercambio iónico dirigida a eliminar los contaminantes de proteínas residuales, así como el ADN y los LPS, en sí misma, seguida o no seguida de cromatografía de exclusión en gel de Sepharose para eliminar los agregados potenciales debido a la presencia de dímeros o de otros multímeros. El conjunto de estas técnicas se puede utilizar de forma simultánea o sucesivamente.
Sitio de unión al antígeno
Esto describe la parte de una molécula que se une a y es complementaria a todo o parte del antígeno diana. En una molécula de anticuerpo se conoce como el sitio de unión a antígeno del anticuerpo y comprende la parte del anticuerpo que se une a y es complementaria a todo o parte del antígeno diana. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse sólo a una parte particular del antígeno, cuya parte se denomina un epítopo. Un sitio de unión a antígeno del anticuerpo puede ser proporcionado por uno o más dominios variables del anticuerpo. Un sitio de de unión a antígeno del anticuerpo puede comprender una región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo.
Aislado
Esto se refiere al estado en el que miembros de unión específica para su uso en la invención o ácidos nucleicos que codifican dichos miembros de unión específica, en general, serán conforme a la presente invención. Por tanto, los miembros de unión específica, los dominios VH y/o VL de la presente invención se pueden proporcionar aislados y/o purificados, por ejemplo, de su entorno natural en una forma sustancialmente pura u homogénea o, en el caso de ácido nucleico, libres o sustancialmente libres de ácido nucleico o genes de origen distinto a la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida. Los miembros aislados y el ácido nucleico aislado estarán libres o sustancialmente libres de material con el que están asociados naturalmente, tales como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentran en su ambiente natural, o el entorno en el que se preparan (por ejemplo cultivo celular) cuando tal preparación es mediante tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los
miembros de unión específica y el ácido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes y todavía aislarse para fines prácticos, por ejemplo los miembros normalmente se mezclarán con gelatina u otros vehículos si se usan para recubrir placas de microtitulación para su uso en inmunoensayos, o se mezclarán con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se utilizan en el diagnóstico o terapia. Los miembros de unión específica pueden estar glicosilados, bien de forma natural o mediante sistemas de células eucariotas heterólogas (por ejemplo, células CHO o NS0 (ECACC 85110503), o pueden ser (por ejemplo si se producen mediante expresión en una célula procariota) no glicosilados.
Las preparaciones heterogéneas que comprenden moléculas de anticuerpo también se pueden utilizar en la invención. Por ejemplo, tales preparaciones pueden ser mezclas de anticuerpos con cadenas pesadas de longitud completa y cadenas pesadas que carecen de la lisina C-terminal, con varios grados de glicosilación y / o con aminoácidos derivatizados, tales como ciclación de un ácido glutámico N-terminal de formar un residuo de ácido piroglutámico.
Uno o más miembros de unión específica para un antígeno, por ejemplo, A-FN, la tenascina C, el ED-A de la fibronectina, o los dominios A1, A2, A3, A4, B o D de la isoforma grande de la tenascina C se pueden obtener poniendo en contacto una biblioteca de miembros de unión específica de acuerdo con la invención y el antígeno o un fragmento del mismo, por ejemplo, un fragmento que comprende o que consiste en ED-A o tenascina C, o un fragmento peptídico de ED-A o tenascina C y seleccionando uno o más miembros de unión específica de la biblioteca capaces de unirse al antígeno.
Una biblioteca de anticuerpos puede cribarse utilizando un cribado con filtros de colonias iterativo (ICFS). En el ICFS, las bacterias que contienen el ADN que codifica varias especificidades de unión se cultivan en un medio líquido y, una vez que se ha alcanzado la etapa de crecimiento exponencial, algunos miles de millones de ellas se distribuyen sobre un soporte de crecimiento que consiste en un filtro de membrana adecuadamente pre-tratado, que se incubar hasta la aparición de colonias de bacterias completamente confluentes. Un segundo sustrato trampa consiste en otro filtro de membrana, prehumidificado y cubierto con el antígeno deseado.
El filtro de membrana trampa se coloca después sobre una placa que contiene un medio de cultivo adecuado y se cubre con el filtro de crecimiento con la superficie cubierta con colonias bacterianas que apuntan hacia arriba. El sándwich obtenido de este modo se incuba a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas. Por tanto, es posible obtener la expresión de los genes que codifican los fragmentos de anticuerpo scFv que tiene una acción de diseminación, de modo que los fragmentos que se unen específicamente con el antígeno que está presente en la membrana trampa quedan atrapados. Después, la membrana trampa se trata para destacar los fragmentos de anticuerpos scFv unidos con técnicas colorimétricas utilizadas habitualmente para este propósito.
La posición de los puntos coloreados sobre el filtro trampa permite volver a las colonias bacterianas correspondientes que están presentes en la membrana de crecimiento y producen los fragmentos de anticuerpos atrapados. Estas colonias se recogen y se cultivan y las bacterias, unos pocos millones de ellas, se distribuyen sobre una nueva membrana de cultivo repitiendo los procedimientos descritos anteriormente. Después se llevan a cabo ciclos análogos hasta que las señales positivas en la membrana trampa corresponden a las colonias positivas individuales, cada una de los cuales representa una fuente potencial de fragmentos de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno utilizado en la selección. El ICFS se describe en, por ejemplo, el documento WO0246455. Una biblioteca también se puede mostrar en partículas o complejos moleculares, por ejemplo, paquetes genéticos replicables tales como partículas de bacteriófagos (por ejemplo, T7) u otros sistemas de expresión in vitro, conteniendo cada partícula o complejo molecular ácido nucleico que codifica el dominio variable VH del anticuerpo expresado sobre el mismo y opcionalmente también un dominio VL se muestra si está presente. La presentación en fagos se describe en el documento WO92/01047 y, por ejemplo, las patentes de EE. UU. US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 y US6521404.
Después de la selección de miembros de unión capaces de unirse al antígeno y expresarse en bacteriófagos u otras partículas o complejos moleculares de la biblioteca, el ácido nucleico se puede tomar de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que muestra dicho miembro de unión seleccionado. Tal ácido nucleico puede usarse en la posterior producción de un miembro de unión o un dominio variable VH o VL del anticuerpo mediante la expresión a partir del ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico tomada de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que muestra un dicho miembro de unión seleccionado.
Un dominio variable VH del anticuerpo con la secuencia de aminoácidos de un dominio variable VH del anticuerpo de un dicho miembro de unión seleccionado puede proporcionarse en forma aislada, como también puede un miembro de unión que comprende un dominio VH tal.
La capacidad de unir la A-FN o la tenascina C, o el ED-A de la fibronectina o el dominio A1, A2, A3, A4, B o el D de la isoforma grande de la tenascina C, o de otro antígeno diana o isoforma puede determinarse después, por ejemplo, la capacidad para competir con, por ejemplo, uno cualquiera de los anticuerpos anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8,
F8, F1, B7, E8 o G9 por la unión a A-FN o un fragmento de la A-FN, por ejemplo, el ED-A de la fibronectina, o un anticuerpo anti-tenascina C, tales como F16-F16 o 4A1, por la unión a la tenascina C o a un fragmento de tenascina C, por ejemplo, el dominio A1, A2, A3, A4, B o D de la isoforma grande de la tenascina C.
Un miembro de unión específica para su uso en la invención puede unirse a A-FN y / o al ED-A de la fibronectina específicamente. Un miembro de unión específica de la presente invención puede unirse a A-FN y / o al ED-A de la fibronectina, o la tenascina C, y / o el dominio A1 de la isoforma grande de la tenascina C, con la misma afinidad que un anticuerpo anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 o G9, por ejemplo, en el formato scFv, o como los anticuerpos anti-tenascina C F16 o 4A1-F16, respectivamente, o con una afinidad mejor. Un miembro de unión específica para su uso en la invención puede unirse a A-FN y / o al ED-A de la fibronectina con una KD de 3 x 10-8M
o una afinidad que es mejor. Preferentemente, un miembro de unión específica para su uso en la invención se une a A-FN y / o al ED-A de la fibronectina con una KD de 2 x 10-8M o una afinidad que es mejor. Más preferentemente, un miembro de unión específica para su uso en la invención se une a A-FN y / o al ED-A de la fibronectina con una KD de 1,7 x 10-8M o una afinidad que es mejor. Todavía más preferentemente, un miembro de unión específica para su uso en la invención se une a A-FN y / o al ED-A de la fibronectina con una KD de 1,4 x 10-8M o una afinidad que es mejor. Lo más preferentemente, un miembro de unión específica para su uso en la invención se une a A-FN y / o al ED-A de la fibronectina con una KD de 3 x 10-9 M o una afinidad que es mejor.
Un miembro de unión específica de la presente invención puede unirse al mismo epítopo en A-FN y / o el ED-A de la fibronectina como uno de los anticuerpos anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 o G9.
Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede no mostrar ninguna unión significativa a moléculas distintas de la A-FN y / o ED-A de la fibronectina.
En particular, el miembro de unión específica puede no unirse a otras isoformas de la fibronectina, por ejemplo la isoforma ED-B y / o la isoforma IIICS de la fibronectina.
Las variantes de las moléculas de anticuerpo divulgadas en el presente documento pueden producirse y usarse en la presente invención Las técnicas requeridas para hacer sustituciones dentro de secuencias de aminoácidos de las CDR, los dominios VH o VL de los anticuerpos y los miembros de unión generalmente están disponibles en la técnica. Las secuencias variantes se pueden hacer, con sustituciones que pueden o no predecirse que tienen un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad, analizarse la capacidad de unirse a A-FN y / o a ED-A de la fibronectina, y / o por cualquier otra propiedad deseada.
Variantes de la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL cuyas secuencias se dan a conocer específicamente en el presente documento pueden usarse de conformidad con la presente invención, como se ha tratado. Variantes particulares pueden incluir una o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos (adición, deleción, sustitución y / o inserción de un residuo de aminoácido), pueden ser de menos de aproximadamente 20 alteraciones, menos de aproximadamente 15 alteraciones, menos de aproximadamente 10 alteraciones o menos de aproximadamente 5 alteraciones, tal vez 5, 4, 3, 2 o 1. Las alteraciones se pueden hacer en una o más regiones estructurales y / o una o más CDR. Las alteraciones normalmente no dan lugar a pérdida de la función, por lo que un miembro de unión específica que comprende una secuencia de aminoácidos alterada de este modo puede retener la capacidad de unirse A-FN y / o al ED-A de la fibronectina. Por ejemplo, puede mantener la misma unión cuantitativa como miembro de unión específica en la que no se hace la alteración, por ejemplo, como se mide en un ensayo descrito en el presente documento. El miembro de unión específica que comprende una secuencia de aminoácidos alterada de este modo puede tener una mejor capacidad de unirse a A-FN y / o al ED-A de la fibronectina.
Se pueden generar nuevas regiones VH o VL que portan las secuencias derivadas de CDR para su uso en la invención usando mutagénesis aleatoria de uno o más genes de VH y / o VL seleccionados para generar mutaciones dentro de todo el dominio variable. En algunas realizaciones se realizan una o dos sustituciones de aminoácidos dentro de un dominio variable completo o conjunto de CDR. Otro método que puede usarse es dirigir la mutagénesis a regiones CDR de genes de VH o VL.
Como se ha indicado anteriormente, una secuencia de aminoácidos de CDR sustancialmente como se ha establecido en el presente documento se puede portar como una CDR en un dominio variable de anticuerpo humano
o una porción sustancial del mismo. Las secuencias HCDR3 sustancialmente como se establecen en el presente documento representan formas de realización de la presente invención y, por ejemplo, cada una de estas puede llevar como una HCDR3 en un dominio variable de la cadena pesada humana o una porción sustancial de la misma.
Los dominios variables empleados en la invención pueden obtenerse o derivarse de cualquier línea germinal o dominio variable humano reordenado, o pueden ser un dominio variable sintético basado en secuencias consenso o reales de los dominios variables humanos conocidos. Un dominio variable se puede derivar de un anticuerpo no humano. Una secuencia de CDR para su uso en la invención (por ejemplo, CDR3) puede introducirse en un repertorio de dominios variables que carecen de una CDR por ejemplo, CDR3), usando tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, Marks et al. (1992) describen métodos para producir repertorios de dominios variables
de anticuerpos en los que se usan cebadores consenso dirigidos a o adyacentes al extremo 5' de la zona de dominio variable conjuntamente con cebadores consenso para la tercera región marco de los genes VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una CDR3. Marks et al. describen además cómo este repertorio se puede combinar con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención pueden mezclarse con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una CDR3, y los dominios VH o VL completos barajados combinarse con un dominio VL o VH afín para proporcionar miembros de unión para su uso en la invención. El repertorio puede expresarse después en un sistema huésped adecuado tal como el sistema de expresión en fagos del documento WO92/01047o cualquiera de un gran cantidad de literatura posterior, incluyendo Kay, Winter & McCafferty (1996), por lo que se pueden seleccionar los miembros de unión adecuados. Un repertorio puede consistir en cualquier desde 104 miembros individuales hacia arriba, por ejemplo al menos 105, al menos 106, Al menos 107, al menos 108, al menos 109 o al menos 1010 miembros.
Del mismo modo, una o más, o las tres CDR pueden injertarse en un repertorio de dominios VH o VL que luego se someten a detección selectiva para buscar un miembro de unión o miembros de unión para A-FN y / o el ED-A de la fibronectina.
Se pueden usar una o más de las HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del anticuerpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9, o el conjunto de HCDR de anticuerpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9, y/o se pueden usar una o más de las LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de anticuerpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9, o el conjunto de LCDR de anticuerpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9.
Del mismo modo, se pueden usar otros dominios VH y VL, conjuntos de CDR y conjuntos de HCDR y / o conjuntos de LCDR divulgados en el presente documento.
El A-FN y / o el ED-A de la fibronectina se pueden usar en una detección selectiva de moléculas de anticuerpo para uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la endometriosis, psoriasis o artritis psoriásica. La detección selectiva puede una detección selectiva de un repertorio como se ha divulgado en el presente documento.
Una porción sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina puede comprender al menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones marco intermedias. La porción también puede incluir al menos aproximadamente 50 % de una o ambas de las regiones marco primera y cuarta, siendo el 50 % siendo el 50 % en C-terminal de la primera región marco y el 50 % en N-terminal de la cuarta región marco. Residuos adicionales en el extremo N-terminal o Cterminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquellos que normalmente no están asociados con las regiones del dominio variable de origen natural. Por ejemplo, la construcción de miembros de unión específica de la presente invención realizada mediante técnicas de ADN recombinante puede resultar en la introducción de residuos en los extremos N o C codificados por enlazadores introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación. Otras etapas de manipulación incluyen la introducción de enlazadores para unir dominios variables divulgados en otra parte del presente documento otras secuencias de proteínas que incluyen regiones constantes de anticuerpos, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o marcadores detectables / funcionales como se discute con más detalle en otra parte en el presente documento.
Aunque los miembros de unión específica pueden comprender un par de dominios VH y VL, los dominios de unión individuales basados en cualquiera de las secuencias de los dominios VH o VL también se pueden usar en la invención. Se sabe que los dominios de inmunoglobulina individuales, especialmente los dominios VH, son capaces de unirse antígenos diana de una manera específica. Por ejemplo, véase la discusión de dAb anterior.
En el caso de cualquiera de los dominios de unión individuales, estos dominios pueden usarse para la detección selectiva de dominios complementarios capaces de formar un miembro de unión de dos dominios capaz de unirse a A-FN y / o a ED-A de la fibronectina. Esto se puede lograr por métodos de detección selectiva de expresión en fagos utilizando el denominado enfoque combinatorio dual jerárquico como se describe en el documento WO92/01047, en la cual una colonia individual que contiene un clon de la cadena H o L se utilizó para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y el miembro de unión de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con técnicas de expresión en fagos tales como las descritas en esa referencia. Esta técnica también se divulga en Marks 1992.
Los miembros de unión específica para su uso en la presente invención pueden comprender además regiones constantes de anticuerpos o partes del mismo, por ejemplo, regiones constantes de anticuerpos humanos o partes de los mismos. Por ejemplo, un dominio VL puede estar unido en su extremo C-terminal a dominios constantes de la cadena ligera de anticuerpos, incluyendo las cadenas Ck o Cλ humanas, por ejemplo, Cλ. Del mismo modo, un miembro de unión específica basado en un dominio VH puede estar unido en su extremo C-terminal a la totalidad o parte (por ejemplo, un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM y cualquiera de las subclases de isotipo, particularmente de IgG1 e IgG4. Cualquier variante de región constante sintética o de otro tipo que tenga estas propiedades y estabilice regiones variables también es útil en realizaciones de la presente invención.
Los miembros de unión específica para su uso en la invención pueden marcarse con un marcador detectable o funcional. Un marcador puede ser cualquier molécula que produce o puede inducirse para que produzca una señal, incluyendo, pero no limitado a, fluorescentes, marcadores radiactivos, enzimas, agentes quimioluminiscentes o fotosensibilizadores. Por lo tanto, la unión se puede detectar y / o medido mediante la detección de fluorescencia o
5 luminiscencia, radioactividad, actividad enzimática o absorción de luz. Los marcadores detectables se pueden unir a anticuerpos para su uso en la invención utilizando la química convencional conocida en la materia.
Hay numerosos métodos por los cuales el marcador puede producir una señal detectable por medios externos, por ejemplo, por examen visual, radiación electromagnética, calor, y reactivos químicos. El marcador también se puede
10 unir a otro miembro de unión específico que se une al anticuerpo para su uso en la invención, o a un soporte.
Los miembros de unión específica marcados, por ejemplo, scFv marcado con un marcador detectable, se pueden usar para el diagnóstico in vivo, ex vivo o in vitro, y / o terapéuticamente.
15 Por ejemplo, los miembros de unión radiomarcados (por ejemplo, los miembros de unión conjugados a un radioisótopo) pueden usarse en radiodiagnóstico y radioterapia. Los radioisótopos que se pueden conjugar con un miembro de unión para su uso en la invención incluyen isótopos tales como 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111Posada, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 123YO, 124YO, 125YO, 131YO, 18F, 211A y 225Ac. Preferentemente, emisores de positrones, tales como 18F y 124I, o emisores gamma, tales
20 como emisores 99mTc, 111Y en 123T, se utilizan para aplicaciones de diagnóstico (por ejemplo, para el PET), mientras que los beta-emisores, tales como 131YO, 90Y y 177Lu, se utilizan preferentemente para aplicaciones terapéuticas. Los emisores alfa, tales como 211A y 225Ac también se puede utilizar para la terapia.
Por ejemplo, un miembro de unión específica para su uso en la invención marcado con un marcador detectable 25 puede usarse para detectar, diagnosticar o controlar la endometriosis en un ser humano o animal.
Un miembro de unión específica de la presente invención puede usarse para la fabricación de un producto de diagnóstico para su uso en el diagnóstico de endometriosis.
30 En el presente documento se divulga un método para detectar o diagnosticar endometriosis, psoriasis o artritis psoriásica en un humano o animal que comprende:
(a) administrar al ser humano o animal un miembro de unión específica de la presente invención, por ejemplo
marcado con un marcador detectable, que se une la isoforma de ED-A de la fibronectina y / o al ED-A de la 35 fibronectina, o tenascina C y / o al dominio A1, A2, A3, A4, B y / o D de la isoforma grande de la tenascina C, y
(b) determinar la presencia o ausencia del miembro de unión específico en los sitios de la endometriosis, psoriasis o artritis psoriásica del cuerpo humano o animal;
en el que la localización del miembro de unión especifica a los sitios de la endometriosis, psoriasis o artritis 40 psoriásica indica la presencia de endometriosis, psoriasis o artritis psoriásica.
Cuando el miembro de unión se marca con un marcador detectable, la presencia o ausencia del marcador detectable se puede determinar mediante la detección del marcador.
45 Un conjugado o fusión entre un miembro de unión para su uso en la invención y una molécula que ejerce un efecto biocida, citotóxico, inmunosupresor o antiinflamatorio en las células diana en las lesiones y un anticuerpo dirigido contra un componente de la matriz extracelular que está presente en tales lesiones pueden usarse en la presente invención. Por ejemplo, la molécula conjugada puede ser, entre otras, interleucina-10, TGF-β, IL-2, IL-12, IL-15, IL21, IL-24, IL-33, factor de necrosis tumoral (TNF), o interferón-α,-β o-γ, un fármaco antiinflamatorio o de otro tipo,
50 un fotosensibilizador o un radionúclido. Tales conjugados se pueden usar terapéuticamente, por ejemplo, para el tratamiento de endometriosis, psoriasis o artritis psoriásica como se hace referencia en el presente documento.
La producción y uso de fusiones o conjugados de miembros de unión específica con moléculas biocidas o citotóxicas se describen por ejemplo en el documento WO01/62298.
55 En el presente documento se divulga un método de tratamiento de la endometriosis, comprendiendo el método administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un medicamento que comprende un miembro de unión específica para su uso en la invención.
60 El miembro de unión para su uso en la invención específico puede ser un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto antiinflamatorio en las células diana mediante interacción celular, una molécula antiinflamatoria, una citocina, por ejemplo IL-10, TGF-β, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, IL-24, IL-33, factor de necrosis tumoral (TNF), interferónα,-β o-γ, o otro fármaco, y (ii) una molécula de anticuerpo para la isoforma ED-A de fibronectina y / o el ED-A de la fibronectina.
El miembro de unión específica para su uso en la invención específico puede ser un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto inmunosupresor o antiinflamatorio y (ii) una molécula de anticuerpo para la isoforma de ED-A de la fibronectina y / o el ED-A de la fibronectina.
El miembro de unión específica para su uso en la invención específico puede ser un conjugado de (i) la interleucina10 (IL10) o TGF beta y (ii) una molécula de anticuerpo para la isoforma de ED-A de la fibronectina y / o el ED-A de la fibronectina. Tal miembro de unión específica es útil en aspectos de la invención divulgados en el presente documento en relación al tratamiento de la endometriosis.
La invención proporciona el uso de un miembro de unión específica como se describe en el presente documento para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la endometriosis.
El miembro de unión específica para su uso en la invención puede ser un conjugado o fusionado a una molécula que ejerce un efecto biocida, citotóxico, inmunosupresor o antiinflamatorio tal como se describe en el presente documento. El miembro de unión específica para su uso en la invención específico puede ser un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre las células diana mediante interacción celular o tiene un efecto inmunosupresor o antiinflamatorio y (ii) una molécula de anticuerpo para la isoforma de ED-A de la fibronectina y / o el ED-A de la fibronectina.
En el presente documento también se describe un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre las células diana mediante interacción celular o tiene un efecto inmunosupresor o antiinflamatorio y
(ii) una molécula de anticuerpo para la isoforma de ED-A de la fibronectina y / o el ED-A de la fibronectina. Dicho conjugado comprende preferentemente una proteína de fusión que comprende la molécula biocida, citotóxica, inmunosupresora o antiinflamatoria y un dicho miembro de unión, o, cuando el miembro de unión es una proteína de fusión, de dos cadenas o de múltiples cadenas, una proteína de fusión que comprende la molécula biocida, citotóxica, inmunosupresora o antiinflamatoria y un componente de cadena polipeptídica de dicho miembro de unión. Preferentemente, el miembro de unión es un polipéptido de una sola cadena, por ejemplo, una molécula de anticuerpo de una sola cadena, tal como scFv.
Una proteína de fusión que comprende la molécula inmunosupresora o antiinflamatoria y un anticuerpo Fv de cadena sencilla de se pueden usar en la invención.
La molécula inmunosupresora o antiinflamatoria que ejerce su efecto sobre las células diana mediante interacción celular, puede interaccionar directamente con las células diana, puede interaccionar con un receptor unido a la membrana en la célula diana o perturbar el potencial electroquímico de la membrana celular. Preferentemente, la molécula es IL-10 o TGF-β.
Ejemplos de otras moléculas que pueden conjugarse con el miembro de unión específica incluyen IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, IL-24, IL-33, factor de necrosis tumoral (TNF), o interferón-α,-β o–γ.
Como se discute más adelante, el miembro de unión específica para su uso en la invención es una molécula de anticuerpo. Convenientemente, el miembro de unión específica puede ser un polipéptido de una sola cadena, tal como un anticuerpo de una sola cadena. Esto permite la producción conveniente de una proteína de fusión que comprende el anticuerpo de una sola cadena y, por ejemplo, la molécula inmunosupresora o antiinflamatoria (por ejemplo, interleucina-10 o TGF beta). Un sitio de unión a antígeno del anticuerpo puede proporcionarse por medio de la asociación de un dominio VH de anticuerpo y un dominio VL de anticuerpo en polipéptidos separados, por ejemplo, en un anticuerpo completo o en un fragmento de anticuerpo tal como Fab o diacuerpo. Cuando el miembro de unión específica es una molécula de cadena doble o de múltiples cadenas (por ejemplo, Fab o anticuerpo entero, respectivamente), una molécula inmunosupresora o antiinflamatoria, por ejemplo, se puede conjugar como un polipéptido de fusión con una o más cadenas polipeptídicas en el miembro de unión específica
El miembro de unión específica puede conjugarse con la molécula inmunosupresora o antiinflamatoria por medio de un enlace peptídico, es decir, dentro de un polipéptido de fusión que comprende dicha molécula y el miembro de unión específica o un componente de cadena polipeptídica de la misma (véase, por ejemplo, Trachsel et al.). Otros medios para la conjugación incluyen conjugación química, especialmente la reticulación usando un reactivo bifuncional (por ejemplo, empleando DOUBLE-REAGENTS™ Cross-linking Reagents Selection Guide, Pierce).
En el presente documento también se describe un ácido nucleico aislado que codifica un miembro de unión específica para su uso en la presente invención. El ácido nucleico puede incluir ADN y / o ARN. Un ácido nucleico puede codificar una CDR o un conjunto de CDR o un dominio VH o dominio VL o sitio de unión a antígeno del anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG, por ejemplo, IgGl, como se ha definido anteriormente. Las secuencias de nucleótidos pueden codificar los dominios VH y / o VL divulgados en el presente documento.
En el presente documento también se describen construcciones en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido como se ha descrito anteriormente.
También se describen una célula huésped recombinante que comprende una o más construcciones como anteriormente. Se describe un ácido nucleico que codifica cualquier CDR o conjunto de CDR o dominio VH o dominio VL o sitio de unión a antígeno del anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG1 o IgG4 como se ha proporcionado, como también un método de producción del producto codificado, cuyo procedimiento comprende la expresión a partir de ácido nucleico codificante. La expresión puede conseguirse convenientemente cultivando en condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico. Tras la producción mediante la expresión de un dominio VH o VL o el miembro de unión específica se puede aislar y/o purificar usando cualquier técnica adecuada, después se puede usar según sea adecuado.
Un ácido nucleico puede comprender ADN o ARN y puede ser total o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia de nucleótidos como se expone en el presente documento abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U se sustituye por T, a menos que el contexto requiera lo contrario.
También se describe un método de producción de un dominio variable VH de anticuerpo, incluyendo el procedimiento el método causar la expresión a partir de ácido nucleico codificante. Dicho método puede comprender el cultivo de células huésped en condiciones para la producción de dicho dominio variable VH de anticuerpo.
Un método de producción puede comprender una etapa de aislamiento y / o purificación del producto. Un método de producción puede comprender la formulación del producto en una composición que incluye al menos un componente adicional, tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Se conocen bien sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en varias células huésped diferentes. Entre células huésped adecuadas se incluyen bacterias, células de mamífero, células vegetales, hongos filamentosos, levaduras y sistemas de baculovirus, y plantas y animales transgénicos. La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en células procariotas está bien establecida en la técnica. Para una revisión, véase por ejemplo, Pluckthun 1991. Un huésped bacteriano común es E. coli.
La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la técnica como una opción para la producción de un miembro de unión específica, por ejemplo Chadd & Chamow (2001), Andersen & Krummen (2002), Larrick & Thomas (2001). Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células de melanoma de ratón NS0, células de mieloma de rata YB2 / 0, células de riñón de embriones humanos, células retina embrionaria humana y muchas otras.
Se pueden escoger o construir vectores adecuados que contengan las secuencias reguladoras adecuadas, incluidas secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras o genes marcadores y otras secuencias, según sea adecuado. Los vectores pueden ser plásmidos, por ejemplo fagemidos, o virales, por ejemplo, fagos, según sea adecuado. Para detalles adicionales, véase, por ejemplo, Sambrook & Russell (2001). Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen con detalle en Ausubel 1999.
Una célula huésped puede contener un ácido nucleico como se describe en el presente documento. Dicha célula huésped puede ser in vitro y pueden estar en cultivo. Dicha célula huésped puede ser in vivo. La presencia in vivo de la célula huésped puede permitir la expresión intracelular de un miembro de unión para su uso en la presente invención como "intracuerpos" o anticuerpos intracelulares. Los intracuerpos pueden usarse para la terapia génica.
También se describe un método que comprende introducir un ácido nucleico divulgado en el presente documento en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas de transfección adecuadas pueden incluir transfección con fosfato cálcico, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo vaccinia o, para células de insectos, baculovirus. La introducción de ácido nucleico en la célula huésped, en particular una célula eucariota, puede utilizar un virus o un sistema basado en plásmido. El sistema de plásmido puede mantenerse episomal o se puede incorporar en la célula huésped o en un cromosoma artificial. La incorporación puede ser mediante integración aleatoria o dirigida de una o más copias en los loci individuales o múltiples. Para las células bacterianas, técnicas adecuadas pueden incluir transformación de cloruro cálcico, electroporación y transfección usando bacteriófagos.
La introducción puede ir seguida de causar o permitir la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo, mediante el cultivo de células huésped en condiciones para la expresión del gen. La purificación del producto expresado puede lograrse por métodos conocidos para un experto en la técnica.
El ácido nucleico puede integrarse en el genoma (por ejemplo cromosoma) de la célula huésped. La integración puede estimularse mediante la inclusión de secuencias que estimulan la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas estándar.
También se describe un método que comprende el uso de una construcción como se ha indicado anteriormente en un sistema de expresión para expresar un miembro de unión específico o polipéptido como anteriormente.
Los miembros de unión específica para su uso en la presente invención están diseñados para usarse en métodos de diagnóstico o tratamiento en sujetos humanos o animales, por ejemplo, humano. Los miembros de unión específica para su uso en la invención se pueden usar en el diagnóstico o el tratamiento de la endometriosis.
De acuerdo con lo anterior, en el presente documento se divulgan métodos de tratamiento que comprenden la administración de un miembro de unión específica como se describe, composiciones farmacéuticas que comprenden dicho miembro de unión específica, y el uso de dicho miembro de unión específica en la fabricación de un medicamento para la administración, por ejemplo en un método de preparar un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el miembro de unión específica con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por la persona experta en la técnica como una función de la naturaleza y del modo de administración del o los compuestos activos elegidos.
Los miembros de unión específica para su uso en la presente invención generalmente se administrarán en forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además del miembro de unión específica. Por tanto, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento y para usar de acuerdo con la presente invención pueden comprender, además del ingrediente activo, un excipiente, vehículo, tampón, estabilizante u otro material farmacéuticamente aceptables bien conocidos para los expertos en la técnica. Dichos materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir en la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral, inhalada o mediante inyección, por ejemplo intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas para administración oral, tales como por ejemplo nanocuerpos etc. también se contemplan en la presente invención. Tales formulaciones orales pueden estar en forma de comprimidos, cápsulas, polvo, líquidas o semi-sólidas. Un comprimido puede comprender un vehículo sólido tal como gelatina o un adyuvante. En general, las composiciones farmacéuticas líquidas pueden comprenden un vehículo líquido, tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Se puede incluir solución fisiológica salina, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Para la inyección intravenosa, o la inyección en el punto de afección, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que carece de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica tienen la capacidad de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro sódico, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactato. Según se requiera se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos. Muchos métodos para la preparación de formulaciones farmacéuticas son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Robinson, 1978.
Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, simultáneamente o secuencialmente o como un preparado combinado con otro agente o agentes terapéuticos, dependiendo de la afección que se va a tratar.
Un miembro de unión específica para su uso en la presente invención puede usarse como parte de una terapia de combinación junto con un componente medicinal adicional. Los tratamientos de combinación pueden usarse para proporcionar efectos sinérgicos significativos, particularmente la combinación de un miembro de unión específica para su uso en la presente invención con uno o más de otros fármacos. Un miembro de unión específica para su uso en la presente invención puede administrarse simultáneamente o secuencialmente o como un preparado combinado con otro agente o agentes terapéuticos, para el tratamiento de una o más de las afecciones mencionadas en el presente documento.
Por ejemplo, un miembro de unión específica para su uso en la invención puede usarse en combinación con un agente terapéutico existente para el tratamiento de la endometriosis.
Un miembro de unión específico para su uso en la invención y uno o más de los componentes medicinales adicionales anteriores se pueden utilizar en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para la administración separada o combinada a un individuo y, de acuerdo con lo anterior, puede comprender el miembro de unión específica y el componente adicional como una preparación combinada o como preparaciones separadas. Las preparaciones separadas se pueden utilizar para facilitar la administración independiente y secuencial o simultánea, y permitir la administración de los componentes por diferentes vías por ejemplo, la administración oral y parenteral.
De acuerdo con la presente invención, las composiciones proporcionadas pueden administrarse a mamíferos. La administración puede ser en una "cantidad terapéuticamente eficaz", siendo esto suficiente para mostrar un beneficio a un paciente. Dicho beneficio puede ser, al menos, mejora de al menos un síntoma. Por tanto, "tratamiento de la endometriosis," se refiere a la mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada, y la velocidad y el
curso temporal de la administración, dependerá de la naturaleza y gravedad de lo que está siendo tratado, el mamífero particular que se esté tratando, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de liberación de la composición, el tipo de miembro de unión específica, el método de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros médicos, y pueden depender de la gravedad de los síntomas y / o progresión de una enfermedad que se está tratando. Las dosis apropiadas de anticuerpo son bien conocidas en la técnica (Ledermann 1991 y Bagshawe 1991. Se pueden usar las dosis específicas indicadas en el presente documento, o en Physician's Desk Reference (2003) según sea apropiado para el tipo de medicamento que se administra. Una cantidad terapéuticamente eficaz o dosis adecuada de un miembro de unión específica para su uso en la invención se pueden determinar comparando su actividad in vitro y la actividad in vivo en un modelo animal. Se conocen métodos para la extrapolación de las dosificaciones eficaces en ratones y otros animales de prueba a los seres humanos. La dosis precisa dependerá de una serie de factores, incluyendo si el anticuerpo es para el diagnóstico, la prevención o para el tratamiento, el tamaño y la ubicación de la zona a tratar, la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo completo, fragmento o diacuerpo), y la naturaleza de cualquier marcador detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis típica del anticuerpo estará en el intervalo de 100 µg hasta 1 g para aplicaciones sistémicas, y de 1 µg a 1 mg para aplicaciones tópicas. Se puede administrar una dosis de carga inicial más alta, seguida de uno o más dosis menores. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo entero, por ejemplo el isotipo IgG1 o IgG4. Esta es una dosis para un solo tratamiento de un paciente adulto, que puede ajustarse proporcionalmente para niños y lactantes, y también ajustarse para otros formatos de anticuerpo en proporción al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse a diario, dos veces a la semana, intervalos semanales o mensuales, a discreción del médico. Los tratamientos pueden ser cada dos a cuatro semanas para la administración subcutánea y cada cuatro a ocho semanas para la administración intravenosa. En algunas realizaciones de la presente invención, el tratamiento es periódico, y el período entre administraciones es de aproximadamente dos semanas o más, por ejemplo de aproximadamente tres semanas o más, aproximadamente cuatro semanas o más, o aproximadamente una vez al mes. En otras realizaciones de la invención, el tratamiento puede administrarse antes y / o después de la cirugía, y se puede administrar o aplicar directamente en el sitio anatómico del tratamiento quirúrgico.
Otros aspectos y realizaciones de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica dada la presente divulgación, incluyendo la siguiente ejemplificación experimental.
SECCIÓN EXPERIMENTAL
RESULTADOS
Análisis histoquímico de muestras de endometriosis humana
La expresión de los dominios ED-A y ED-B de la fibronectina y el dominio A1 de la isoforma grande de la tenascina se investigó mediante inmunohistoquímica en muestras de endometriosis humana utilizando los anticuerpos F8, L19y F16-SIP biotinilados, respectivamente. Los resultados del análisis histológico se muestran en la figura 1.
En la Figura 1, la tinción más oscura indica la expresión de los respectivos antígenos (indicado con flechas negras).
Tanto el ED-A de la fibronectina (reconocido por el anticuerpo F8-SIP biotinilado) como el dominio A1 de la tenascina C (reconocido por el anticuerpo F16-SIP biotinilado) se expresaron fuertemente alrededor de las estructuras perivasculares de biopsias de muestras de endometriosis humana (véanse Figuras 1A, B y C para la tinción con F8-SIP y las Figuras 1G, H & I para la tinción con F16-SIP). La intensa tinción de estructuras vasculares con F16-SIP FUE más fuerte que la observada con F8-SIP. No hay tinción visible para el control negativo, es decir, el mismo tipo de muestra de endometriosis incubada con el reactivo de estreptavidina, pero sin ningún anticuerpo primario (véanse las Figuras 1J, K y L).
El dominio ED-B de la fibronectina (reconocido por el anticuerpo L19-SIP biotinilado) solo fue débilmente positivo (véanse las figuras 1D, E y F).
Análisis histoquímico de muestras de colitis ulcerosa humana
La expresión de los dominios ED-A y ED-B de la fibronectina y el dominio A1 de la isoforma grande de la tenascina se investigó mediante inmunohistoquímica en muestras de colitis ulcerosa humana utilizando los anticuerpos F8, L19-y F16-SIP biotinilados, respectivamente. Los resultados del análisis histológico se muestran en la figura 2.
En la figura 2, las áreas de tinción negativa alrededor de las estructuras perivasculares se indican usando las flechas blancas.
El análisis inmunohistoquímico de muestras de colitis ulcerosa humana reveló tinción casi negativa para los tres anticuerpos, F8, L19 y F16 (véase la Figura 2A, B y C respectivamente). Solo se observó una positividad débil con F8-SIP en algunas muestras.
Análisis histoquímico de muestras de artritis psoriásica humana
La expresión de los dominios ED-A y ED-B de la fibronectina y el dominio A1 de la isoforma grande de la tenascina se investigó mediante inmunohistoquímica en muestras de artritis psoriásica humana utilizando los anticuerpos F8, L19-y F16-SIP biotinilados, respectivamente. Los resultados del análisis histológico se muestran en la figura 3.
En la Figura 3, la tinción más oscura indica la expresión de los respectivos antígenos (indicado con flechas negras).
El dominio A1 de la tenascina C (reconocido por el anticuerpo F16-SIP biotinilado) se expresó fuertemente alrededor de las estructuras perivasculares de las biopsias de muestras de artritis psoriásica humana, es decir, se observó una tinción más intensa (véase la Figura 3C). No hubo tinción visible para el control negativo ni para el dominio ED-B de la fibronectina (reconocido por el anticuerpo L19-SIP biotinilado) o el dominio ED-A de la fibronectina (reconocido por el anticuerpo F8-SIP biotinilado) (véanse las Figuras 3A, B y D, respectivamente).
Análisis histoquímico de las muestras de pacientes con esclerosis múltiple
La expresión de los dominios ED-A y ED-B de la fibronectina y el dominio A1 de la isoforma grande de la tenascina se investigó mediante inmunohistoquímica en muestras de pacientes con esclerosis múltiple utilizando los anticuerpos F8, L19-y F16-SIP biotinilados, respectivamente. Los resultados del análisis histológico se muestran en la figura 4.
En la figura 4, las áreas de tinción negativa alrededor de las estructuras perivasculares se indican usando las flechas blancas.
El análisis inmunohistoquímico de secciones de tejido de muestras patológicas de pacientes con esclerosis múltiple reveló solo positividad extremadamente débil en estructuras vasculares para L19, F8 y F16 (véanse las Figuras 4A, B y C).
Análisis histoquímico de las muestras de pacientes con psoriasis
La expresión de los dominios ED-A y ED-B de la fibronectina y el dominio A1 de la isoforma grande de la tenascina se investigó mediante inmunohistoquímica en muestras de pacientes con psoriasis utilizando los anticuerpos F8, L19-y F16-SIP biotinilados, respectivamente. Los resultados del análisis histológico se muestran en la figura 5.
En la Figura 5, la tinción más oscura indica la expresión de los respectivos antígenos (indicado con flechas negras).
El dominio A1 de la tenascina C (reconocido por el anticuerpo F16-SIP biotinilado) se expresó fuertemente alrededor de las estructuras perivasculares de las biopsias de muestras de psoriasis humana, es decir, se observó una tinción más intensa (véase la Figura 5C). No hubo tinción visible para el control negativo ni para el dominio ED-B de la fibronectina (reconocido por el anticuerpo L19-SIP biotinilado) o el dominio ED-A de la fibronectina (reconocido por el anticuerpo F8-SIP biotinilado) (véanse las Figuras 5D, B y A, respectivamente).
Basándose en los hallazgos descritos anteriormente, la expresión de ED-A y la isoforma grande de la tenascina C no se encuentra en todas las enfermedades relacionadas con la angiogénesis. La endometriosis es particularmente adecuada para la liberación del fármaco utilizando moléculas de anticuerpo anti-ED-A, mientras que la endometriosis, la psoriasis y la artritis psoriásica son particularmente adecuadas para la liberación de fármacos usando moléculas de anticuerpo anti-tenascina C.
Formación de imágenes en el infrarrojo cercano de las lesiones de endometriosis en ratones
Un modelo de ratón de la endometriosis se generó como se describe a continuación. La acumulación selectiva de F8-SIP en ratones con endometriosis se analizó mediante análisis de imágenes en el infrarrojo cercano, como se describe en Birchler et al. [Birchler et al., J Immunological Methods 1999, 231, 239-248]. F8-SIP y F16-SIP se marcaron utilizando Alexa750 (Molecular Probes), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, y se inyectaron en la vena de la cola de los ratones con endometriosis. Se sacrificó a los ratones y la imagen se formó en un formador de imágenes en el infrarrojo cercano 24 horas después de la inyección. F16-SIP se utilizó como control negativo, ya que reconoce el dominio A1 humano de tenascina C pero no el antígeno murino.
Como se muestra en las Figuras 10A y B, SIP(F8)-ALEXA750 se acumula en las lesiones de endometriosis (indicado por flechas), mientras que SIP (F16) -ALEXA750 no (Figura 10C), de modo que se confirma la especificidad in vivo de F8-SIP.
Detección ex vivo de SIP (F8) -ALEXA750
Tan pronto como se completó la formación de imágenes en el infrarrojo cercano, las lesiones de endometriosis se eliminaron de los animales sacrificados, se embebieron en el compuesto de crioinclusión (Microm, Walldorf,
Alemania) y se almacenaron a -80 °C. Después, se cortaron secciones (10 µm) y se fijaron en acetona. SIP (F8) -ALEXA750 se detectó utilizando un anticuerpo IgE anti-humano de conejo (Dako, Glostrup, Dinamarca), seguido de anti-IgG anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos). Para la detección de los vasos sanguíneos, se realizó tinción doble con anticuerpo anti-CD31 de rata, seguido de IgG anti-rata de burro Alexa Fluor 594. Como control negativo, la muestra se sondó con IgG de cabra anti-conejo Alexa Fluor 488 menos el anticuerpo IgE humano.
Los resultados muestran claramente la correspondencia entre los vasos sanguíneos (véanse las áreas más brillantes en las Figuras 11D, E y F) y tinción con SIP (F8) -ALEXA750 (véase las áreas más brillantes en las Figuras 11A, B y C). Estos resultados confirman que SIP (F8) -ALEXA750 se había acumulado alrededor de las estructuras vasculares durante los estudios de imagen.
Estos datos muestran el primer intento con éxito en la formación de imágenes in vivo de endometriosis sin la necesidad de laparoscopia, u otra forma de la cirugía.
MATERIALES Y MÉTODOS
Inmunohistoquímica con anticuerpos SIP biotinilados
Las secciones de tejido se fijaron en acetona fría (-20 °C) durante 10 minutos y los portaobjetos se secaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se aplicó silicio utilizando una pluma y los portaobjetos se sumergieron entonces en TBS (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4, 0,01 % de aprotinina) durante 5 minutos. Los portaobjetos se secaron con papel sin tocar las secciones. Las secciones se bloquearon con suero de ternera fetal al 20 % (FCS) en TBS durante 30 minutos. A continuación, la solución de bloqueo se retiró y los portaobjetos se sumergieron en TBS durante 5 minutos. El anticuerpo biotinilado primario en formato SIP se diluyó en TBS / BSA al 3 % hasta una concentración final de 1,6 µg / ml y se aplicó a las secciones durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron dos veces con TBS + MgCl2 2 mM (406 mg / l) (2x 5 minutos). La parte posterior de los portaobjetos se secó con papel y el complejo SAP a 1: 150 (Biopsa F014-62) en TBS + MgCl2 2 mM / 3 % de BSA durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron tres veces con TBS + MgCl2 2 mM (3 x 5 minutos). Se añadió el sustrato (compuesto por disolución de Tris 1 y 1 comprimido FastRed por 1 ml de agua MilliQ) y se incubó en las secciones durante 10 minutos. Las secciones se lavaron dos veces con agua desionizada (2x 2 minutos) y se transfirieron a solución de hematoxilina de Gill nº 2 durante 2 minutos. Los portaobjetos se transfirieron rápidamente a agua desionizada y se enjuagaron con agua durante 5 minutos. Los portaobjetos se dejaron secar y se montaron con glicerol y se visualizaron con un microscopio óptico (Zeiss Axiovert 5100 TV).
Modelo de ratón de la endometriosis
Ratones C57BL / 6 de 6-8 semanas de edad s fueron sometidos a ovariectomía 7 días antes de la inducción de la endometriosis. Los ratones se anestesiaron con isoflurano en combinación con carprofeno (Rimadyl). Después de la ovariectomía, se trató a los ratones con estrógenos (3x / semana 4 µg de estradiol / ratón en un volumen de aceite de cacahuete de 100 µl por vía subcutánea inyectada, comenzando el día del trasplante). La ovariectomía más suplemento con estrógeno se realizó con el fin de anular las diferencias relacionadas con la etapa del ciclo estral. El día 0, los ratones se dividieron en 2 grupos: ratones donantes (33 %) y ratones receptores (66 %). Se sacrificó a los ratones donantes y se extrajeron ambos cuernos uterinos y posteriormente se colocaron en una placa Petri estéril que contiene solución salina estéril. El endometrio se separó del músculo uterino y se picó utilizando un bisturí. Los fragmentos endometriales se suspendieron en solución salina y se inyectaron en la cavidad peritoneal de los ratones receptores. 4 semanas después del trasplante, se utilizaron ratones para formación de imágenes en el infrarrojo cercano.
Secuencias divulgadas en la solicitud
SEC ID Nº 1 (dominio VH de H1)
SEC ID Nº 2 (dominio VH de H1)
SEC ID Nº 3 (dominio VH de B2)
15 SEC ID Nº 4 (dominio VH de B2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAAKMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSS
20 SEC ID Nº 5 (dominio VH de C5)
SEC ID Nº 6 (dominio VH de C5)
SEC ID Nº 7 (dominio VH de D5)
SEC ID Nº 8 (dominio VH de D5)
SEC ID Nº 9 (dominio VH de E5)
SEC ID Nº 14 (dominio VH de F8)
SEC ID Nº 15 (dominio VH V5L de F8)
SEC ID Nº 16 (dominio VH V5L de F8)
SEC ID Nº: 17 (dominio VH de F1)
SEC ID Nº: 22 (dominio VH de E8)
SEC ID Nº 23 (dominio VH de G9)
SEC ID Nº 24 (dominio VH de G9)
SEC ID Nº 25 (dominio VH de F16)
SEC ID Nº 26 (dominio VH de F16)
SEC ID Nº 27 (dominio VH de 4A1-F16)
SEC ID Nº 28 (dominio VH de 4A1-F16)
SEC ID Nº 29 (CDR1 VH de H1) CCGCGGAGG
20
SEC ID Nº 30 (CDR1 VH de H1) PRR
25
SEC ID Nº 31 (VH CDR1 de B2) GCGGCTAAG SEC ID Nº 32 (VH CDR1 de B2) AAK
30
SEC ID Nº 33 (VH CDR1 de CS) CCGATTACT
SEC ID Nº 34 (VH CDR1 de C5) PIT
35
SEC ID Nº 35 (VH CDR1 de D5) GTGATGAAG
40
SEC ID Nº 36 (VH CDR1 de D5) VMK SEC ID Nº 37 (VH CDR1 de E5) ACTGGTTCT
45
SEC ID Nº 38 (VH CDR1 de E5) TGS
SEC ID Nº 39 (VH CDR1 de C8) CTTCAGACT
50
SEC ID Nº 40 (VH CDR1 de C8) LQT
SEC ID Nº 41 (VH de F8 y VH V5L CDR1 deF8) CTGTTTACG
SEC ID Nº 42 (VH de F8 y VH V5L CDR1 deF8) 5 LFT
SEC ID Nº 43 (VH CDR1 de F1) TAGGCGCGT
10 SEC ID Nº 44 (VH CDR1 de F1) QAR
SEC ID Nº 45 (VH CDR1 de B7) CATTTTGAT
15 SEC ID Nº 46 (VH CDR1 de B7) HFD
SEC ID Nº 47 (CDR1 VH de E8) 20 GATATGCAT
SEC ID Nº 48 (CDR1 VH de E8) DMH
25 SEC ID Nº 49 (VH CDR1 de G9) CATATGCAG
SEC ID Nº 50 (VH CDR1 de G9) HMQ
30 SEC ID Nº 51 (VH CDR1 de F16) CGGTATGGTATGAGC
SEC ID Nº 52 (VH CDR1 de F16) 35 RYGMS
SEC ID Nº 53 (VH CDR1 de 4A1-F16) CGGTATGGTGCGAGC
40 SEC ID Nº 54 (VH CDR1 de 4A1-F16) RYGAS
SEC ID Nº 55 (VH CDR2 de H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F8 V5L, F1, B7, E8 y G9) AGTGGTAGTGGTGGTAGC
45 SEC ID Nº 56 (VH CDR2 de H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F8 V5L, F1, B7, E8 y G9) SGSGGS
SEC ID Nº 57 (VH CDR2 de F16 y 4A1-F16) 50 GCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGC
SEC ID Nº 58 (VH CDR2 de F16 y 4A1-F16) AISGSGGSTYYADSVKG
55 SEC ID Nº 59 (VH CDR3 de H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F8 V5L, F1, B7, E8 y G9) AGTACTCATTTGTATCTT
SEC ID Nº 60 (VH CDR3 de H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F8 V5L, F1, B7, E8 y G9) STHLYL
60 SEC ID Nº 61 (VH CDR3 de F16 y 4A1-F16) GCGCATAATGCTTTTGACTAC
SEC ID Nº 62 (VH CDR3 de F16 y 4A1-F16) 65 AHNAFDY
SEC ID Nº 63 (dominio VL de H1)
SEC ID Nº 64 (dominio VL de H1)
SEC ID Nº 65 (dominio VL de B2)
SEC ID Nº 66 (dominio VL de B2)
SEC ID Nº 67 (dominio VL de C5)
SEC ID Nº 70 (dominio VL de D5)
SEC ID Nº 71 (dominio VL de E5)
SEC ID Nº 72 (dominio VL de E5)
SEC ID Nº 73 (dominio VL de C8)
SEC ID Nº 74 (dominio VL de C8)
SEC ID Nº 75 (dominio VL de F8)
SEC ID Nº 76 (dominio VL de F8)
SEC ID Nº 77 (dominio VL K18R de F8)
SEC ID Nº 78 (dominio VL K18R de F8)
SEC ID Nº 79 (dominio VL de F1)
SEC ID Nº 80 (dominio VL de F1)
SEC ID Nº 81 (dominio VL de B7)
SEC ID Nº 82 (dominio VL de B7)
SEC ID Nº 83 (dominio VL de E8)
SEC ID Nº 86 (dominio VL de G9)
SEC ID Nº 87 (dominio VH de F16 y 4A1-F16)
SEC ID Nº 88 (dominio VH de F16 y 4A1-F16)
SEC ID Nº 89 (VL CDR1 de H1) 10 TCTGCGTGG
SEC ID Nº 90 (VL CDR1 de H1) SAW
15 SEC ID Nº 91 (VL CDR1 de B2) GTGGCTTTT
SEC ID Nº 92 (VL CDR1 de B2) VAF
20 SEC ID Nº 93 (VL CDR1 de C5) TTGCATTTT
SEC ID Nº 94 (VL CDR1 de C5) 25 LHF
SEC ID Nº 95 (VL CDR1 de D5) AATGCTTTT
30 SEC ID Nº 96 (VL CDR1 de D5) NAF
SEC ID Nº 97 (VL CDR1 de E5) CTTGCGCAT
35 SEC ID Nº 98 (VL CDR1 de E5) LAH
SEC ID Nº 99 (VL CDR1 de C8) 40 CTTCCTTTT
SEC ID Nº 100 (VL CDR1 de C8) LPF
45 SEC ID Nº 101 (VL de F8 y VL K18R CDR1 de F8) ATGCCGTTT
SEC ID Nº 102 (VL de F8 y VL K18R CDR1 de F8) MPF
50 SEC ID Nº 103 (VL CDR1 de F1) GCGCCTTTT
SEC ID Nº 104 (VL CDR1 de F1) 55 APF
SEC ID Nº 105 (VL CDR1 de B7) CTGGCTTTT
SEC ID Nº 106 (VL CDR1 de B7) LAF
SEC ID Nº 107 (VL CDR1 de E8) 5 TCGTCTTTT
SEC ID Nº 108 (VL CDR1 de E8) SSF
10 SEC ID Nº 109 (VL CDR1 de G9) ACTGCTTTT
SEC ID Nº 110 (VL CDR1 de G9) TAF
15 SEC ID Nº 111 (VL CDR1 de F16 y 4A1-F16) CAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGC
SEC ID Nº 112 (VL CDR1 de F16 y 4A1-F16) 20 QGDSLRSYYAS
SEC ID Nº 113 (VH CDR2 de H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F8 K18R, F1, B7, E8 y G9) GGTGCATCCAGCAGGGCCACT
25 SEC ID Nº 114 (VH CDR2 de H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F8 K18R, F1, B7, E8 y G9) GASSRAT
SEC ID Nº 115 (VL CDR2 de F16 y 4A1-F16) GGTAAAAACAACCGGCCCTCA
30 SEC ID Nº 116 (VL CDR2 de F16 y 4A1-F16) GKNNRPS
SEC ID Nº 117 (VH CDR3 de H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F8 K18R, F1, B7, E8 y G9) 35 ATGCGTGGTCGGCCGCCG
SEC ID Nº 118 (VH CDR3 de H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F8 K18R, F1, B7, E8 y G9) MRGRPP
40 SEC ID Nº 119 (VL CDR3 de F16 y 4A1-F16) AACTCCTCTGTTTATACTATGCCGCCCGTGGTA
SEC ID Nº 120 (VL CDR3 de F16 y 4A1-F16) NSSVYTMPPVV
45 SEC ID Nº 121 (enlazador de F8, F16 y 4A1-F16) GGCGGTAGCGGAGGG
SEC ID Nº 122 (enlazador de F8, F16 y 4A1-F16) 50 GGSGG
SEC ID Nº 123 (dominio VH V5L de H1)
SEC ID Nº 124 (dominio VH V5L de B2)
SEC ID Nº 125 (dominio VH V5L de C5)
SEC ID Nº 126 (dominio VH V5L de D5)
SEC ID Nº 127 (dominio VH V5L de E5)
SEC ID Nº 128 (dominio VH V5L de C8)
SEC ID Nº 129 (dominio VH V5L de F1)
SEC ID Nº 130 (dominio VH V5L de B7)
SEC ID Nº 131 (dominio VH V5L de E8)
SEC ID Nº 132 (dominio VH V5L de G9)
SEC ID Nº 133 (dominio VL K18R de H1)
SEC ID Nº 77 (dominio VL K18R de B2)
SEC ID Nº 135 (dominio VL K18R de C5)
SEC ID Nº 136 (dominio VL K18R de D5)
SEC ID Nº 137 (dominio VL K18R de E5)
SEC ID Nº 138 (dominio VL K18R de C8)
SEC ID Nº 139 (dominio VL K18R de F1)
SEC ID Nº 140 (dominio VL K18R de B7)
SEC ID Nº 141 (dominio VL K18R de E8)
SEC ID Nº 142 (dominio VL K18R de G9)
REFERENCIAS
Todas las referencias citadas en cualquier lugar en esta memoria descriptiva, incluyendo las citadas en cualquier lugar anteriormente.
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Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una molécula de anticuerpo que se une a la isoforma ED-A de la fibronectina para su uso en un método de diagnóstico de la endometriosis, en donde el método de diagnóstico de la endometriosis comprende las etapas de:
    (a)
    administrar la molécula de anticuerpo al ser humano o animal, y
    (b)
    determinar la presencia o ausencia de la molécula de anticuerpo en los sitios de la endometriosis del cuerpo humano o animal; en donde la localización de la molécula de anticuerpo en los sitios de la endometriosis indica la presencia de endometriosis.
  2. 2. Una molécula de anticuerpo que se une a la isoforma ED-A de la fibronectina para su uso en un método de formación de imágenes del tejido endometrial, en donde el método comprende las etapas de:
    (a)
    administrar la molécula de anticuerpo al ser humano o animal, y
    (b)
    detectar la unión de la molécula de anticuerpo a tejido endometrial en el cuerpo humano o animal.
  3. 3.
    Una molécula de anticuerpo que se une la isoforma del dominio extra-A (ED-A) de la fibronectina para su uso en un método de tratamiento de la endometriosis.
  4. 4.
    Una molécula de anticuerpo que se une a la isoforma de ED-A de la fibronectina para su uso en un método de proporcionar a la neovasculatura de tejido endometrial una molécula conjugada con la molécula de anticuerpo, en donde el método comprende administrar el conjugado al ser humano o animal.
  5. 5.
    La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en donde la molécula de anticuerpo está conjugada a una molécula bioactiva, tal como una citocina, una hormona, un radioisótopo terapéutico o un fármaco citotóxico, y en donde la molécula bioactiva está opcionalmente conjugada con la molécula de anticuerpo mediante un enlazador escindible.
  6. 6.
    La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde molécula de anticuerpo se une a la ED-A de la fibronectina.
  7. 7.
    La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 6, en donde la molécula de anticuerpo está conjugada con un marcador detectable.
  8. 8.
    La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o 6, en donde la molécula de anticuerpo está conjugada con un radioisótopo.
  9. 9.
    La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula de anticuerpo comprende un dominio VH que comprende un marco y un conjunto de regiones de determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en donde HCDR1 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 42, HCDR2 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 56, HCDR3 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 60;
    o en donde el dominio VH comprende un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad que tienen diez o menos sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3.
  10. 10.
    La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el marco del dominio VH es un marco de la línea germinal humana, y en donde el dominio VH tiene opcionalmente una secuencia de aminoácidos SEC ID Nº 14 o 16.
  11. 11.
    La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10, en donde la molécula de anticuerpo comprende además un dominio VL que comprende un conjunto de regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y un marco.
  12. 12.
    La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde LCDR1 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 102, LCDR2 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 114, y LCDR3 tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 118;
    o en donde el dominio VL comprende un conjunto de regiones determinantes de la complementariedad que tienen diez o menos sustituciones de aminoácidos dentro de las regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3.
  13. 13. La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 11 o 12, en donde el marco del dominio VL es un marco de la línea germinal humana, y en donde el dominio VL tiene opcionalmente una secuencia
    de aminoácidos SEC ID Nº 76 o 78.
  14. 14.
    La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde la molécula de anticuerpo comprende un Fv de cadena sencilla, y en donde la molécula de anticuerpo es opcionalmente una inmunoproteína (SIP) pequeña.
  15. 15.
    La molécula de anticuerpo para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde la molécula de anticuerpo es un diacuerpo.
    Figura 1
    Figura 2
    Figura 3
    Figura 4
    Figura 5
    Figura 10 Figura 11
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