ES2928889T3

ES2928889T3 - Anticuerpos contra antígenos tumorales

Info

Publication number: ES2928889T3
Application number: ES18827069T
Authority: ES
Inventors: Laura Gualandi; Sarah Wulhfard; Francesca Pretto; Catherine Pemberton-Ross; Alessandra Villa; Luca Roberto De
Original assignee: Philogen SpA
Current assignee: Philogen SpA
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2022-11-23
Anticipated expiration: 2038-12-19
Also published as: EP3728324B1; CA3085960C; CA3085960A1; AU2018392741A1; US11629199B2; EP3728324A1; WO2019122025A1; AU2018392741B2; EP3502139A1; US20210054095A1

Abstract

La presente solicitud se refiere a miembros de unión específicos que se unen a la anhidrasa carbónica IX (CAIX). En particular, la presente solicitud se refiere al tratamiento, diagnóstico y detección de tumores, por ejemplo, tumores sólidos, utilizando miembros de unión específicos que se unen a CAIX. El miembro de unión específica puede conjugarse con una molécula biocida o citotóxica, o con un marcador detectable. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos contra antígenos tumorales

La presente invención se refiere a miembros de unión específicos que se unen a anhidrasa carbónica IX (CAIX). En particular, la presente invención se refiere al tratamiento, al diagnóstico y a la detección de tumores, por ejemplo tumores sólidos, usando miembros de unión específicos que se unen a CAIX. El miembro de unión específico puede conjugarse con una molécula biocida o citotóxica o con un marcador detectable.

Antecedentes de la invención

Las anhidrasas carbónicas son una gran familia de metaloenzimas de zinc cuya principal función enzimática es catalizar la hidratación reversible del dióxido de carbono (CO2) para dar bicarbonato (HCO3-) y protones (H+) (CO2 H2O ^ HCO3- H+). Las anhidrasas carbónicas son reguladores importantes en una variedad de procesos biológicos, incluyendo la respiración, la calcificación, la regulación ácido-base, la resorción ósea y los procesos biosintéticos. Hasta la fecha se han identificado dieciséis metaloenzimas distintas de esta familia. En el contexto de los tumores, se ha demostrado que dos isoformas, la anhidrasa carbónica IX (CAIX) y la anhidrasa carbónica XII (CAXII), están asociadas con la progresión del cáncer, la metástasis y la alteración de la respuesta terapéutica (McDonald et al., 2012, Oncotarget, 3(1): 84-97).

La CAIX es una proteína transmembranaria dimérica. La porción extracelular de CAIX está separada de una cola intracelular corta por un dominio transmembranario de un solo paso. La CAIX contiene un dominio similar al proteoglicano (PG) inmediatamente adyacente a su dominio catalítico (McDonald et al., 2012, Oncotarget, 3(1): 84 97). Se conoce la secuencia de CAIX humana (secuencia de ARNm: ID de GenBank BC014950, GI 15928967; secuencia de aminoácidos: ID de GenBank AAH14950, GI 15928968). También se ha identificado un homólogo de CAIX en ratones (secuencia de ARNm: ID de GenBank BC120544, GI 111307266; secuencia de aminoácidos: ID de GenBank AAI20545, GI 111307267).

La expresión de CAIX en células tumorales se induce fuertemente durante la hipoxia tumoral. La hipoxia tumoral se produce cuando un tumor supera su suministro de sangre durante el crecimiento del tumor, dejando porciones del tumor con regiones donde la concentración de oxígeno es significativamente menor que en los tejidos sanos. La hipoxia tumoral es un factor crucial en la fisiología del tumor, ya que afecta a la biología del tumor, incluyendo la inestabilidad genética, la angiogénesis, la invasividad, la supervivencia y el metabolismo. Los cambios metabólicos inducidos por la hipoxia pueden fomentar actividades asociadas con el comportamiento agresivo de las células tumorales, tales como la supervivencia, la invasión y la metástasis (McDonald et al., 2012, Oncotarget, 3(1): 84-97). El suministro reducido de oxígeno en la hipoxia tumoral limita la capacidad de las células tumorales para la fosforilación oxidativa como medio para generar energía, lo que da como resultado un cambio a la glicólisis. El cambio a la glicólisis, a su vez, da como resultado una mayor producción y exportación de metabolitos ácidos al espacio extracelular, lo que conduce a una reducción del pH extracelular. Esta acidificación extracelular conduce a la alteración del pH intracelular, proporcionando una ventaja selectiva a las células tumorales que pueden sobrevivir en estas condiciones. La CAIX desempeña un papel importante en el sistema regulador del pH de las células tumorales necesario para mantener un pH intracelular moderadamente alcalino aunque también para crear un entorno extracelular ácido (McDonald et al., 2012, Oncotarget, 3(1): 84-97).

La CAIX es una diana atractiva para los antineoplásicos, ya que se sobreexpresa en muchos tumores sólidos, pero muestra una expresión limitada en tejidos normales. Por consiguiente, se espera que la interferencia con CAIX tenga pocas consecuencias significativas, si es que las tiene. Además de la expresión selectiva de CAIX en tumores sólidos, se ha demostrado que existe una relación entre la expresión de CAIX y el mal pronóstico del paciente en muchos cánceres. Los cánceres que se ha demostrado que expresan CAIX incluyen cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de recto, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cavidad bucal y cáncer de riñón. Además, se ha demostrado que la expresión de CAIX se correlaciona con la enfermedad metastásica (McDonald et al., 2012, Oncotarget, 3(1): 84-97). Como resultado de la expresión selectiva de CAIX en tumores y su asociación con un mal pronóstico, la detección de CAIX puede usarse no sólo para el diagnóstico y la detección de tumores, sino también como marcador para el pronóstico del cáncer. La expresión de CAIX por células tumorales puede determinarse usando tinción inmunohistoquímica de cortes tisulares o mediante análisis de microalineamientos de tejidos, por ejemplo (McDonald et al., 2012, Oncotarget, 3(1): 84-97).

Se conocen en la técnica varios inhibidores de CAIX, incluyendo anticuerpos monoclonales e inhibidores de molécula pequeña, y varios de estos están investigándose para aplicaciones de terapia contra el cáncer. Los anticuerpos anti-CAIX conocidos incluyen M75, G250, cG250 (una versión quimérica de G250), A3 y CC7 (McDonald et al., 2012, Oncotarget, 3(1): 84-97; Ahlskog et al., British Journal of Cancer, 2009, 101:645-657). Los anticuerpos específicos para CAIX pueden interferir directamente con la actividad de CAIX, por ejemplo, seleccionando como diana el dominio catalítico de la enzima, o pueden usarse para administrar agentes terapéuticos a las células tumorales. El direccionamiento basado en anticuerpos de agentes terapéuticos a células tumorales es una estrategia prometedora para el tratamiento de cáncer, ya que permite la administración controlada de agentes terapéuticos directamente al sitio del tumor. La administración dirigida puede aumentar la eficacia, reducir la dosis de agente terapéutico necesaria para efectuar el tratamiento, reducir la exposición de los tejidos normales al agente terapéutico, así como el daño resultante del mismo. El documento De-Kuan Chang et al. (2015), MOLECULAR CANCER, vol. 14, n.° 119 describe anticuerpos anti-CAIX humanos que median en la inhibición de células inmunitarias del carcinoma de células renales in vitro y en un modelo de ratón humanizado in vivo.

Aunque se han identificado varios inhibidores de CAIX, incluyendo anticuerpos monoclonales específicos para CAIX, y varios están investigándose actualmente en ensayos clínicos, actualmente no hay terapias basadas en anticuerpos anti-CAIX disponibles para el tratamiento de pacientes con cáncer. Por tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de desarrollar terapias contra el cáncer adicionales, así como agentes de diagnóstico, que seleccionen como diana CAIX.

Exposición de la invención

La invención es tal como se define en las reivindicaciones.

Los presentes inventores han aislado un anticuerpo anti-CAIX, XE114, que tiene una alta afinidad por CAIX y se espera que funcione bien en el tratamiento, el diagnóstico, la detección y la obtención de imágenes de cánceres que expresan CAIX. El anticuerpo XE114 se une al dominio extracelular de CAIX. La secuencia del anticuerpo XE114 se muestra en la figura 1. Se ha demostrado que XE114 se une a un epítopo diferente en CAIX que el anticuerpo anti-CAIX A3 conocido.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo o un fragmento de la misma, que se une a anhidrasa carbónica IX (CAIX), en el que el miembro de unión específico comprende un dominio VH y un dominio VL, en el que el dominio VH tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 y el dominio VL tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 20 u 8.

La glicosilación ligada a asparagina (N) es una modificación postraduccional importante que da como resultado la unión covalente de oligosacáridos a residuos de asparagina en una secuencia de proteína. La sustancia aceptora de la N-glicosilación es una asparagina dentro de la secuencia de consenso N-X-S/T, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina (Schwarz y Aebi, 2011 Curr Opin Struct Biol. 2011 21(5):576-82). Como la LCDR3 del anticuerpo XE114 comienza con un motivo “NSS...”, la LCDR3 comprende un sitio de glicosilación. Para eliminar dicho sitio de glicosilación, el aminoácido en la posición 1 de la LCDR3 puede modificarse mediante sustitución por otro aminoácido. Por ejemplo, el aminoácido en la posición 1 de la LCDR3 puede sustituirse por glutamina (Q) o alanina (A). Alternativamente, para eliminar dicho sitio de glicosilación, el aminoácido en la posición 3 de la LCDR3 puede modificarse mediante sustitución por otro aminoácido. Por ejemplo, la serina (S) en la posición 3 de la LCDR3 puede sustituirse por una alanina (A). En una realización preferida, la asparagina (N) en la posición 1 de la LCDR3 se sustituye por glutamina (Q). Por tanto, en una realización preferida, la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 19, como en la secuencia de VL de SEQ ID NO: 20.

La similitud e identidad de aminoácidos se definen generalmente con referencia al algoritmo GAP (GCG Wisconsin Package™, Accelrys, San Diego CA). GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch para alinear dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos. Generalmente, se usan los parámetros por defecto, con una penalización por creación de huecos = 12 y una penalización por extensión de huecos = 4. Puede preferirse el uso de GAP, pero pueden usarse otros algoritmos, por ejemplo, BLAST o TBLASTN (que usan el método de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA (que usa el método de Pearson y Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448) o el algoritmo de Smith-Waterman (Smith y Waterman (1981) J. Mol Biol.

147: 195-197), generalmente empleando parámetros por defecto.

En la técnica se conocen métodos de mapeo de epítopos e incluyen resonancia de plasmón superficial, tal como Biacore, tal como se describe en otra parte en el presente documento, cocristalografía de rayos X que permite visualizar directamente la interacción entre el antígeno y el anticuerpo, barrido de unión a péptido, tal como PepScan, en el que se emplea una biblioteca de secuencias de oligopéptidos de segmentos solapantes y no solapantes de una proteína diana y se somete a prueba para determinar su capacidad para unirse al anticuerpo de interés, y mutagénesis dirigida al sitio en la que se introducen mutaciones sistemáticas de aminoácidos en una secuencia de proteína seguido de la medición de la unión al anticuerpo para identificar los aminoácidos que comprende el epítopo (tal como barrido de alanina). Estos y otros métodos son bien conocidos en la técnica (Ladner, Mapping the Epitopes of Antibodies, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, vol. 24, 1-30, 2007).

Por ejemplo, en un barrido de unión a péptido, tal como la clase proporcionada por los sistemas PepScan, se seleccionan de manera sistemática péptidos solapantes cortos derivados del antígeno para determinar la unión a un miembro de unión. Los péptidos pueden acoplarse covalentemente a una superficie de soporte para formar un alineamiento de péptidos. Los péptidos pueden estar en una conformación lineal o restringida. Una conformación restringida puede producirse usando péptidos que tienen un residuo de Cys terminal en cada extremo de la secuencia peptídica. Los residuos de Cys pueden acoplarse covalentemente, de manera directa o indirecta, a una superficie de soporte de tal manera que el péptido se mantiene en una conformación en bucle. Por tanto, los péptidos usados en el método pueden tener residuos de Cys añadidos en cada extremo de una secuencia peptídica correspondiente a un fragmento del antígeno. También pueden usarse péptidos con doble bucle, en los que un residuo de Cys está ubicado de manera adicional en o cerca de la parte central de la secuencia peptídica. Los residuos de Cys pueden acoplarse covalentemente, de manera directa o indirecta, a una superficie de soporte de tal manera que los péptidos forman una conformación en doble bucle, con un bucle en cada lado del residuo de Cys central. Los péptidos pueden generarse de manera sintética y, por tanto, los residuos de Cys pueden modificarse por ingeniería en las ubicaciones deseadas, a pesar de que no se produzcan de manera natural en la secuencia de la proteína CAIX. Opcionalmente, pueden seleccionarse péptidos tanto lineales como restringidos en un ensayo de unión a péptido. Un barrido de unión a péptido puede implicar identificar (por ejemplo, usando ELISA) un conjunto de péptidos a los que se une el miembro de unión, en el que los péptidos tienen secuencias de aminoácidos correspondientes a fragmentos de SEQ ID NO: 17 (por ejemplo, péptidos de aproximadamente 5, 10 o 15 residuos contiguos de SEQ ID NO: 17), y alinear los péptidos para determinar la huella de los residuos unidos por el miembro de unión, donde la huella comprende residuos comunes a los péptidos solapantes.

En la técnica se conocen métodos para determinar si un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a un antígeno diana, por ejemplo, debido a que los anticuerpos se unan a epítopos solapantes, e incluyen ensayos de bloqueo cruzado, tales como ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA) competitivos. Estos ensayos se conocen bien en la técnica (Ladner, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, vol. 24, 1 30, 2007).

Por ejemplo, para identificar un miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que inhibe la unión a CAIX de un miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, de la presente invención a través de un ELISA competitivo, el anticuerpo de la presente invención puede inmovilizarse en pocillos de una placa de múltiples pocillos. Luego puede añadirse el antígeno CAIX a los pocillos, seguido de lavado para retirar cualquier antígeno no unido. Luego puede añadirse a los pocillos un segundo anticuerpo anti-CAIX marcado con un marcador detectable, seguido de lavado para retirar cualquier anticuerpo no unido. Luego puede detectarse la unión del segundo anticuerpo anti-CAIX al antígeno CAIX a través de la detección del marcador detectable. Si la segunda molécula de anticuerpo anti-CAIX no puede unirse al antígeno CAIX, esto demuestra que la segunda molécula de anticuerpo anti-CAIX puede inhibir la unión de la molécula de anticuerpo de la invención a CAIX.

En otro aspecto, la invención se refiere a un miembro de unión específico de la invención para su uso en un método de tratamiento de cáncer. La divulgación también proporciona el uso de un miembro de unión específico de la invención para la preparación de un medicamento para tratar el cáncer. La divulgación también proporciona un método de tratamiento de cáncer en un paciente, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un medicamento que comprende un miembro de unión específico de la invención. Preferiblemente, el miembro de unión específico es una molécula de anticuerpo.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un miembro de unión específico de la invención para su uso en la administración a sitios de cáncer en un paciente de una molécula conjugada con el miembro de unión específico. La divulgación también proporciona a método de administración de una molécula a sitios de cáncer en un paciente, comprendiendo el método administrar un miembro de unión específico de la invención al paciente, en el que la molécula se conjuga con el miembro de unión. Preferiblemente, el miembro de unión específico es una molécula de anticuerpo.

En un aspecto aún adicional, la invención se refiere a un miembro de unión específico de la invención para su uso en un método de obtención de imágenes, detección o diagnóstico de cáncer. La divulgación también proporciona el uso de un miembro de unión específico de la invención para la preparación de un producto de diagnóstico para la obtención de imágenes, el diagnóstico o la detección cáncer. La divulgación proporciona además un método de obtención de imágenes, detección o diagnóstico de cáncer que expresa CAIX en un ser humano o animal que comprende las etapas de:

(i) administrar al ser humano o animal un miembro de unión específico de la invención;

(ii) determinar la presencia o ausencia del miembro de unión específico en el cuerpo del ser humano o animal; en el que la detección del miembro de unión específico en el cuerpo del ser humano o animal indica la presencia de un cáncer que expresa CAIX. El miembro de unión específico es preferiblemente una molécula de anticuerpo.

El cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en: cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de recto, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cavidad bucal y cáncer de riñón. Preferiblemente, el cáncer es cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de recto, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cavidad bucal y cáncer de riñón, en el que el cáncer expresa, por ejemplo sobreexpresa, o se ha determinado que expresa, CAIX.

El miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, de la invención puede conjugarse con un marcador detectable, un radioisótopo, por ejemplo, un radioisótopo terapéutico, un fármaco citotóxico, o con una molécula que tiene actividad biocida o citotóxica. El miembro de unión específico puede conjugarse con el radioisótopo, el fármaco citotóxico o la molécula que tiene actividad biocida o citotóxica a través de un ligador escindible. En el contexto del tratamiento de cáncer, el miembro de unión específico de la invención puede conjugarse con un radioisótopo, por ejemplo, un radioisótopo terapéutico, o una molécula que tiene actividad biocida o citotóxica, por ejemplo, un fármaco citotóxico. En el contexto de la obtención de imágenes, la detección o el diagnóstico de cáncer, el miembro de unión específico de la invención puede conjugarse con un marcador detectable. El marcador detectable puede ser un radioisótopo, por ejemplo, un radioisótopo no terapéutico.

En una realización preferida, el miembro de unión específico se conjuga con interleucina-2 (IL2) y un factor de necrosis tumoral, tal como factor de necrosis tumoral alfa (TNFa). El formato y la construcción de tales conjugados se describe en el documento WO2016/180715. En una realización más preferida, el TNF es un TNF mutante, tal como un TNFa mutante que tiene actividad reducida. Se ha demostrado que el uso de un mutante de factor de necrosis tumoral (TNF) de actividad reducida mejora la tolerabilidad de una inmunocitocina dual que comprende TNF e IL2, así como un miembro de unión específico, sin afectar a la eficacia. El formato y la construcción de tales conjugados se describe en el documento WO2018/087172. Los conjugados pueden usarse, por ejemplo, en el tratamiento de cáncer.

El miembro de unión específico conjugado con IL2 y TNF puede estar en forma de un scFv o un diacuerpo, pero lo más preferiblemente está en forma de un scFv.

La toxicidad de un conjugado que comprende un mutante de TNF puede reducirse en comparación con el correspondiente conjugado que comprende TNF de tipo natural. La toxicidad reducida puede incluir una tolerabilidad mejorada en un paciente, por ejemplo, una reducción en uno o más síntomas adversos asociados con la administración del/de los conjugado(s) al paciente. Los síntomas adversos reducidos por la toxicidad pueden incluir pérdida de peso, náuseas, vómitos, fiebre, escalofríos, sofocos, urticaria, exantema, toxicidad pulmonar, disnea, hipotensión, anafilaxis, enfermedad del suero, creatinina aumentada, cefalea.

Además, la toxicidad reducida del mutante de TNF en el conjugado aumenta el efecto sinérgico del resto de IL2, que puede administrarse a una dosis mayor debido a la menor actividad del mutante de TNF. Por tanto, las citocinas de potencia coincidente en el conjugado pueden ser útiles en aplicaciones terapéuticas.

Por tanto, un aspecto de la invención proporciona un conjugado tal como se describió anteriormente para su uso en un método de tratamiento de cáncer mediante el direccionamiento de IL2 y un mutante de TNF, preferiblemente un de mutante de TNFa, al tumor in vivo, así como un conjugado descrito en el presente documento para su uso en un método de administración de IL2 y un mutante de TNF, preferiblemente un mutante de TNFa, al tumor en un paciente.

Otro aspecto de la divulgación proporciona un método de tratamiento de cáncer mediante el direccionamiento de IL2 y un mutante de TNF, preferiblemente un mutante de TNFa, al tumor en un paciente, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado tal como se describió anteriormente al paciente, así como un método de administración de IL2 y un mutante de TNF, preferiblemente un mutante de TNFa, al tumor en un paciente que comprende administrar al paciente un conjugado tal como se describió anteriormente.

Además, otro aspecto de la divulgación proporciona el uso de un conjugado tal como se describió anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer. De manera similar, se contempla el uso de un conjugado tal como se describió anteriormente para la preparación de un medicamento para la administración de IL2 y un mutante de TNF, preferiblemente un mutante de TNFa, a la neovasculatura de un tumor. Las secuencias de las CDR del anticuerpo XE114 con el motivo de glicosilación en el dominio VL se muestran en la figura 1.

Un miembro de unión específico de la invención puede ser una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo humano. El miembro de unión específico comprende un dominio VH y/ VL de anticuerpo, tal como se expone en las reivindicaciones. Dentro de cada uno de los dominios VH y VL hay regiones determinantes de complementariedad (“CDR”) y regiones de entramado (“FR”). Un dominio VH comprende un conjunto de HCDR y un dominio VL comprende un conjunto de LCDR. Un dominio VH de anticuerpo comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 y una región de entramado de VH. Un dominio VL de anticuerpo comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 y una región de entramado de VL.

Un miembro de unión específico de la invención puede comprender una molécula de anticuerpo que se une a CAIX, en el que la molécula de anticuerpo comprende un dominio VH y un dominio VL, tal como se expone en las reivindicaciones, en el que el dominio VH comprende una región de entramado y un conjunto de regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y en el que el dominio VL comprende regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y una región de entramado, y en el que HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1;

HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2;

HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3;

LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4;

LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5; y

LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

Preferiblemente, el miembro de unión específico de la invención comprende una molécula de anticuerpo que se une a CAIX, en el que la molécula de anticuerpo comprende un dominio VH y un dominio VL, tal como se expone en las reivindicaciones, en el que el dominio VH comprende una región de entramado y un conjunto de regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y en el que el dominio VL comprende regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y una región de entramado, y en el que HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1;

HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2;

HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3;

LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4;

LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5; y

LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19.

Un miembro de unión específico de la invención es o comprende preferiblemente un Fv de cadena sencilla (scFv), que comprende un dominio VH y un dominio VL unidos a través de un ligador peptídico. Más preferiblemente, el miembro de unión específico de la invención es un scFv. El dominio VH y el dominio VL pueden tener la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, pero preferiblemente tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 20, respectivamente. El experto en la técnica puede seleccionar una longitud y una secuencia apropiadas del ligador, por ejemplo, al menos 10 aminoácidos de longitud, hasta aproximadamente 15, hasta aproximadamente 20 o hasta aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. El ligador puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. El miembro de unión específico de la presente invención en formato de scFv puede comprender o consistir en la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 10, pero preferiblemente comprende o consiste en la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 35.

Un Fv de cadena sencilla (scFv) puede estar comprendido dentro de una mini-inmunoglobulina o inmunoproteína pequeña (SIP), por ejemplo tal como se describe en (Li et al., (1997), Protein Engineering, 10: 731-736). Una SIP puede comprender una molécula de scFv fusionada al dominio CH4 de la isoforma secretora de IgE humana IgE-S2 (£s2-CH4; Batista et al., (1996), J. Exp. Med., 184: 2197-205) que forma una molécula de anticuerpo de miniinmunoglobulina homodimérica.

Un miembro de unión específico de la invención puede ser o comprender un diacuerpo (DB), que comprende un dominio VH y un dominio VL unidos a través de un ligador peptídico. Se describen diacuerpos en el documento WO94/13804 y en Holliger et al. (1993a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444-6448. El dominio VH y el dominio VL pueden tener la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, pero preferiblemente tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 20, respectivamente. El experto en la técnica puede seleccionar una longitud y una secuencia apropiadas del ligador. Por ejemplo, el ligador puede tener 10 aminoácidos de longitud o menos, 9 aminoácidos de longitud o menos, 8 aminoácidos de longitud o menos, 7 aminoácidos de longitud o menos, 6 aminoácidos de longitud o menos, o 5 aminoácidos de longitud o menos. El ligador puede tener al menos 5 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, el ligador puede tener la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 18.

Alternativamente, el miembro de unión específico de la invención puede ser una molécula de inmunoglobulina G (IgG), preferiblemente una molécula de IgG humana, tal como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, lo más preferiblemente IgG1 humana.

En este caso, el miembro de unión específico de la invención puede comprender una cadena pesada y una cadena ligera que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, respectivamente, pero preferiblemente comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 23, respectivamente.

La presente divulgación también proporciona un ácido nucleico que codifica para un miembro de unión específico, o conjugado, de la invención, así como un vector que comprende un ácido nucleico de este tipo.

También se proporciona una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico o el vector de la divulgación. Una célula huésped recombinante de este tipo puede usarse para producir un miembro de unión específico, o conjugado, de la invención. Por tanto, también se proporciona un método de producción de un miembro de unión específico de la invención, comprendiendo el método cultivar la célula huésped recombinante en condiciones para la producción del miembro de unión específico. El método puede comprender además una etapa de aislar y/o purificar el miembro de unión específico.

Se espera que los miembros de unión específicos de la presente invención hallen aplicación en aplicaciones terapéuticas, en particular aplicaciones terapéuticas en seres humanos, tales como el tratamiento de cáncer tal como se describió anteriormente. Por tanto, también se proporciona una composición farmacéutica que comprende un miembro de unión específico de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Por tanto, la presente invención proporciona:

1. Un miembro de unión específico que se une a anhidrasa carbónica IX (CAIX), en el que el miembro de unión específico comprende un dominio VH y un dominio VL, en el que el dominio VH tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en s Eq ID NO: 7 y el dominio VL tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 20 u 8.

2. El miembro de unión específico según el punto [1], en el que el miembro de unión específico se une al dominio extracelular de CAIX.

3. El miembro de unión específico según el punto [2], en el que el dominio extracelular de CAIX tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16.

4. El miembro de unión específico según uno cualquiera de los puntos [1] a [3], en el que el miembro de unión específico es una molécula de anticuerpo.

5. El miembro de unión específico según uno cualquiera de los puntos [1] a [4], en el que el miembro de unión es o comprende un Fv de cadena sencilla (scFv) o es una inmunoglobulina G (IgG).

6. El miembro de unión específico según el punto [5], en el que el miembro de unión es una inmunoproteína pequeña (SIP) o un diacuerpo.

7. El miembro de unión específico según uno cualquiera de los puntos [1] a [6], en el que el miembro de unión se conjuga con un marcador detectable.

8. El miembro de unión específico según uno cualquiera de los puntos [1] a [6], en el que el miembro de unión se conjuga con una molécula biocida, una molécula citotóxica o un radioisótopo.

9. El miembro de unión específico según uno cualquiera de los puntos [1] a [6], en el que el miembro de unión se conjuga con interleucina-2 (IL2) y un mutante de factor de necrosis tumoral (t Nf ), en el que el mutante de TNF tiene actividad reducida en relación con el TNF de tipo natural.

10. Un miembro de unión específico según uno cualquiera de los puntos [1] a [6], [8] o [9], para su uso en un método de tratamiento de cáncer.

11. Un miembro de unión específico según uno cualquiera de los puntos [1] a [7], para su uso en un método de obtención de imágenes, detección o diagnóstico de cáncer.

12. Un miembro de unión específico según uno cualquiera de los puntos [1] a [6], para su uso en la administración a sitios de cáncer en un paciente de una molécula conjugada con el miembro de unión específico.

[13] Un miembro de unión específico para su uso según uno cualquiera de los puntos [10] a [12], en el que el cáncer es un carcinoma de células renales.

[14] Un miembro de unión específico para su uso según uno cualquiera de los puntos [10] a [12], en el que el cáncer expresa, o se ha determinado que expresa, CAIX.

Estos y otros aspectos de la invención se describen con más detalle a continuación.

Breve descripción de las figuras

La figura 1A muestra la secuencia del dominio variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo anti-CAIX XE114 (SEQ ID NO: 7). La secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) del anticuerpo anti-CAIX XE114 está subrayada. La secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena pesada (SEQ ID NO: 2) del anticuerpo anti-CAIX XE114 se muestra en cursiva y subrayada. La secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada (SEQ ID NO: 3) del anticuerpo anti-CAIX XE114 se muestra en negrita y subrayada. La figura 1B muestra la secuencia de aminoácidos de la secuencia de ligador del anticuerpo anti-CAIX XE114 entre los dominios VH y VL (SEQ ID NO: 9). La figura 1C muestra las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo anti-CAIX XE114 con el motivo de glicosilación (SEQ ID NO: 8). La secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) del anticuerpo anti-CAIX XE114 está subrayada. La secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera (SEQ ID NO: 5) del anticuerpo anti-CAIX XE114 se muestra en cursiva y subrayada. La secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena ligera (SEQ ID NO: 6) del anticuerpo anti-CAIX XE114 se muestra en negrita y subrayada.

La figura 2 muestra los resultados de un análisis de Biacore para medir la afinidad del anticuerpo scFv anti-CAIX XE114 (con el motivo de glicosilación) por el dominio extracelular de CAIX. Basándose en los resultados del análisis mostrados en la figura 2, se calculó que la Kd del anticuerpo anti-CAIX XE114 para el dominio extracelular de CAIX cuando se mide a una concentración de 660 nM era de 15 nM.

La figura 3 muestra el mapeo de epítopos del anticuerpo scFv anti-CAIX XE114 (con el motivo de glicosilación) en comparación con el anticuerpo anti-CAIX A3 (Ahlskog et al., British Journal of Cancer, 2009, 101: 645-657). La figura 3 demuestra que el anticuerpo XE114 se une a un epítopo en CAIX distinto del epítopo unido por el anticuerpo anti-CAIX A3.

La figura 4 muestra los resultados de la tinción por inmunofluorescencia in vitro de cortes tumorales de carcinoma de células renales humanas (SKRC52) con anticuerpo XE114 marcado con biotina (con el motivo de glicosilación) en formato de diacuerpo, así como un anticuerpo específico para la lisozima de huevo de gallina como control negativo (ctr. neg.). También se muestran los resultados de la contratinción de los vasos sanguíneos del tumor con un anticuerpo de rata anti-CD31 murino y los núcleos celulares con DAPI. La figura 4 demuestra que el anticuerpo XE114 tiñó de manera específica e intensa el tejido del tumor SKRC52, mientras que no se observó tinción del tejido tumoral con el anticuerpo de control.

La figura 5 muestra los resultados de la tinción por inmunofluorescencia ex vivo de cortes del tumor SKRC52 con el anticuerpo XE114 (con el motivo de glicosilación) en formato de IgG, así como un anticuerpo específico para la lisozima de huevo de gallina como control negativo (ctr. neg.). También se muestran los resultados de la contratinción de los vasos sanguíneos del tumor con un anticuerpo de rata anti-CD31 murino y los núcleos celulares con DAPI. La figura 5 demuestra que el anticuerpo XE114 se acumuló específicamente en el sitio del tumor, mientras que tal acumulación no se observó con el anticuerpo de control.

La figura 6 muestra los resultados de la tinción por inmunofluorescencia de tejido estomacal humano. Cortes congelados de tejido estomacal humano sano con el anticuerpo XE114 (con el motivo de glicosilación) marcado con FITC en formato de hIgG1. También se muestran los resultados de núcleos celulares con DAPI. La figura 6 demuestra que el anticuerpo XE114 tiñó intensamente el tejido estomacal, lo que está en consonancia con el patrón de expresión de CAIX informado.

La figura 7 muestra los resultados de los análisis de FACS de células SKRC52, teñidas con el anticuerpo XE114 (con el motivo de glicosilación) en formato de diacuerpo o controles negativos. El anticuerpo XE114 mostró una unión clara y selectiva a las células SKRC52 en comparación con los controles negativos.

La figura 8 muestra el rendimiento de direccionamiento in vivo del anticuerpo XE114 (con el motivo de glicosilación) mediante análisis de biodistribución en ratones desnudos BALB/c que portan tumores de carcinoma de células renales humanas SKRC52 implantados subcutáneamente. La figura 8 demuestra que el anticuerpo XE114 se captó selectivamente en los tumores SKRC52 y mostró una razón óptima de tumor con respecto a órganos y de tumor con respecto a sangre.

La figura 9 muestra (A) el perfil de cromatografía de exclusión molecular y (B) el análisis del perfil de ESI-EM del anticuerpo XE114 en formato de scFv sin el motivo de glicosilación.

La figura 10 muestra (A) el perfil de cromatografía de exclusión molecular y (B) el análisis de SDS-Page del conjugado hIL2-XE114-hTNFmut (sin el motivo de glicosilación) en condiciones reductoras (R) y condiciones no reductoras (NR).

La figura 11 muestra los resultados de un análisis de Biacore para medir la afinidad del conjugado hIL2-XE114-hTNFmut (sin el motivo de glicosilación) por el dominio extracelular de CAIX.

La figura 12 muestra los resultados de hIL2-XE114-hTNFmut (sin el motivo de glicosilación) cuando se sometió a prueba en (A) un ensayo de bioactividad de IL2, basado en la proliferación de células CTLL-2, y (B) un ensayo de bioactividad de TNF, basado en la destrucción de células de fibroblastos L-M.

La figura 13 muestra la evaluación por citometría de flujo de la expresión de CAIX en células SKRC52, teñidas con los conjugados hIL2-XE114-hTNFmut (sin el motivo de glicosilación) e IL2-KSF-TNFmut (control negativo) y detectadas con un anticuerpo de rata anti-IL2 seguido de tinción con anticuerpo anti-IgG de rata marcado con AlexaFluor488. La figura 14 muestra el análisis por microscopía de fluorescencia de la expresión de CAIX en el corte del tumor SKRC52 teñido con los conjugados hIL2-XE114-hTNFmut (sin el motivo de glicosilación) e IL2-KSF-TNFmut (control negativo) y detectado con un anticuerpo de rata anti-IL2 seguido de tinción con anticuerpo anti-IgG de rata marcado con AlexaFluor488. La vasculatura se tiñó con un anticuerpo de cabra anti-CD31 y se reveló con un anticuerpo anti-IgG de cabra marcado con AlexaFluor594 (aumento de 20x).

La figura 15 muestra el análisis por inmunofluorescencia ex vivo de las propiedades de direccionamiento de los conjugados hIL2-XE114-hTNFmut (sin el motivo de glicosilación) e IL2-KSF-TNFmut (control negativo) 24 horas después de su inyección en ratones que portan lesiones de SKRC52. Los cortes criogénicos se tiñeron con anticuerpo anti-IL2 humana (Alexa Fluor 488) y anticuerpo anti-CD31 (Alexa Fluor 594) (aumento de 20x).

Descripción detallada

La invención es tal como se define en las reivindicaciones.

Anhidrasa carbónica IX

La CAIX es una proteína transmembranaria dimérica expresada por las células tumorales en respuesta a la hipoxia y está implicada en el mantenimiento del pH intracelular en presencia de un entorno extracelular ácido. La CAIX se expresa en muchos tumores sólidos y se asocia con un mal pronóstico, además de que se ha demostrado que se correlaciona con la metástasis. La CAIX comprende una porción extracelular que está separada de una cola intracelular corta por un dominio transmembranario de un solo paso.

El término “anhidrasa carbónica IX” o “CAIX” (CA-IX), tal como se usa en el presente documento, puede referirse a la anhidrasa carbónica IX humana y a homólogos de la misma en mamíferos no humanos, tales como el ratón. Preferiblemente, el término CAIX, tal como se usa en el presente documento, se refiere a CAIX humana y a fragmentos de la misma, tal como el dominio extracelular de CAIX. La CAIX humana puede tener la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 17. El dominio extracelular de CAIX humana puede tener la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 16.

Cáncer

Esto describe una transformación maligna del tejido normal que implica un crecimiento celular no regulado. El término “cáncer”, tal como se usa en el presente documento, puede referirse a cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer de recto, cáncer de ovario, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cavidad bucal o cáncer de riñón. El cáncer de riñón puede ser carcinoma de células renales (RCC). El cáncer de mama puede ser cáncer de mama de tipo basal o triple negativo que se ha demostrado que tiene una expresión particularmente alta de CAIX (McDonald et al., 2012, Oncotarget, 3(1): 84-97). Cáncer de mama triple negativo se refiere al cáncer de mama que no expresa los genes para el receptor de estrógeno, el receptor de progesterona o Her2/neu. El cáncer de pulmón puede ser un carcinoma de células escamosas, ya que se ha demostrado que existe un mayor porcentaje de tumores positivos para CAIX entre los del fenotipo de células escamosas (McDonald et al., 2012, Oncotarget, 3(1): 84-97). Lo más preferiblemente, el cáncer es carcinoma de células renales (RCC). El cáncer puede expresar, por ejemplo, puede haberse determinado que expresa, CAIX.

Un tumor, tal como se hace referencia en el presente documento, puede ser un tumor que es el resultado de uno de los cánceres a los que se ha hecho referencia anteriormente, más preferiblemente carcinoma de células renales (RCC). El tumor puede ser un tumor sólido. Un tumor sólido es un tumor que no contiene habitualmente quistes ni zonas líquidas. El término “tumor” puede referirse a un tumor primario y/o a una metástasis. En cuanto al cáncer, el tumor puede expresar, por ejemplo, puede haberse determinado que expresa, CAIX.

Miembro de unión específico

Esto describe a un miembro de un par de moléculas que se unen específicamente entre sí. Los miembros de un par de unión específico pueden derivarse de manera natural o producirse total o parcialmente de manera sintética. Un miembro del par de moléculas tiene un área en su superficie, o una cavidad, que se une a y, por tanto, es complementaria a, una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de moléculas. Ejemplos de tipos de pares de unión son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando, enzima-sustrato. La presente invención se refiere a reacciones de tipo antígeno-anticuerpo.

Un miembro de unión específico comprende normalmente una molécula que tiene un sitio de unión a antígeno. Por ejemplo, un miembro de unión específico puede ser una molécula de anticuerpo o una proteína distinta de anticuerpo que comprende un sitio de unión a antígeno. Un miembro de unión específico, tal como se menciona en el presente documento, es preferiblemente una molécula de anticuerpo.

Puede proporcionarse un sitio de unión a antígeno por medio de la disposición de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en armazones de proteína distinta de anticuerpo, tales como fibronectina o citocromo B, etc. (Haan y Maggos, (2004), BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al., (1998), Journal of Molecular Biology, 284: 1141 1151; Nygren et al., (1997), Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469), o mediante la aleatorización o mutación de residuos de aminoácido de un bucle dentro de un armazón de proteína para conferir especificidad de unión para una diana deseada. Los armazones para modificar por ingeniería novedosos sitios de unión en proteínas han sido revisados en detalle por Nygren et al. (1997) (Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469). Los armazones de proteína para miméticos de anticuerpos se dan a conocer en el documento WO00/034784, en el que los inventores describen proteínas (miméticos de anticuerpos) que incluyen un dominio de fibronectina tipo III que tiene al menos un bucle aleatorizado. Un armazón adecuado en el que injertar una o más CDR, por ejemplo, un conjunto de HCDR, puede ser proporcionado por cualquier miembro de dominio de la superfamilia de genes de inmunoglobulina. El armazón puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un armazón de proteína distinta de anticuerpo es que puede proporcionar un sitio de unión a antígeno en una molécula de armazón que es más pequeña y/o más fácil de fabricar que al menos algunas moléculas de anticuerpo. El pequeño tamaño de un miembro de unión puede conferir propiedades fisiológicas útiles tales como la capacidad de entrar en las células, penetrar profundamente en los tejidos o alcanzar dianas dentro de otras estructuras, o unirse dentro de las cavidades proteicas del antígeno diana. El uso de sitios de unión a antígeno en armazones de proteína distinta de anticuerpo se revisa en Wess, 2004, en: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7. Son típicas las proteínas que tienen una estructura principal estable y uno o más bucles variables, en las que la secuencia de aminoácidos del bucle o bucles se muta de manera específica o aleatoria para crear un sitio de unión a antígeno que se une al antígeno diana. Tales proteínas incluyen los dominios de unión a IgG de la proteína A de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por ejemplo, 10° dominio de fibronectina tipo III) y lipocalinas. Otros enfoques incluyen “Microbodies” sintéticos (Selecore GmbH), que se basan en ciclótidos, pequeñas proteínas que tienen enlaces disulfuro intramoleculares. Además de las secuencias de anticuerpo y/o un sitio de unión a antígeno, un miembro de unión específico para su uso en la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, formando un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado, o para conferir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad para unirse al antígeno. Los miembros de unión de la invención pueden portar un marcador detectable, o una molécula que ejerce actividad biocida o citotóxica (por ejemplo, a través de un enlace peptidilo o un ligador).

Por ejemplo, un miembro de unión puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio enzimático) así como un sitio de unión a antígeno, en el que el sitio de unión a antígeno se une al antígeno y, por tanto, dirige el sitio catalítico al antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del antígeno, por ejemplo, por escisión. Aunque, tal como se indicó, las CDR pueden ser portadas por armazones de proteína distinta de anticuerpo, la estructura para portar una CDR o un conjunto de CDR será generalmente una secuencia de cadena ligera o pesada de anticuerpo o una parte sustancial de la misma en la que se encuentra la CDR o el conjunto de CDR en una ubicación correspondiente a la CDR o al conjunto de CDR de los dominios variables VH y VL de anticuerpo que se producen de manera natural codificados por genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse por referencia a Kabat et al. (1987) (Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a edición. Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU.), y actualizaciones del mismo, ahora disponibles en Internet (en immuno.bme.nwu.edu o busque “Kabat” usando cualquier motor de búsqueda).

Por región CDR o CDR se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina tal como se definen, entre otros, por Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4.a edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU. (Kabat et al., (1991a), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., Public Service, NIH, Washington, y ediciones posteriores).

Un anticuerpo contiene normalmente 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El término CDR se usa en este caso para indicar, según el caso, una de estas regiones o varias, o incluso todas, de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácido responsables de la unión por afinidad del anticuerpo por el antígeno o el epítopo que reconoce.

Entre las seis secuencias de CDR cortas, la tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad debida esencialmente a los mecanismos de disposición de los genes que dan lugar a la misma). Puede tener tan sólo 2 aminoácidos, aunque el tamaño más largo conocido es de 26. Funcionalmente, la HCDR3 desempeña un papel en parte en la determinación de la especificidad del anticuerpo (Segal et al., (1974), PNAS, 71:4298-4302; Amit et al., (1986), Science, 233:747-753; Chothia et al., (1987), J. Mol. Biol., 196:901-917; Chothia et al., (1989), Nature, 342:877-883; Caton et al., (1990), J. Immunol., 144:1965-1968; Sharon et al., (1990a), PNAS, 87:4814-4817; Sharon et al., (1990b), J. Immunol., 144:4863-4869; Kabat et al., (1991b), J. Immunol., 147:1709-1719).

Molécula de anticuerpo

Esto describe una inmunoglobulina ya sea natural o producida parcial o totalmente de manera sintética. El término también se refiere a cualquier polipéptido o proteína que comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Debe entenderse en este caso que la invención no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir que no se encuentran en su entorno natural sino que han podido ser aislados u obtenidos por purificación a partir de fuentes naturales, o bien obtenidos por recombinación genética, o por síntesis química, y que entonces pueden contener aminoácidos no naturales tal como se describirá más adelante. Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de unión a antígeno del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, moléculas de anticuerpo tales como Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos.

Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que se unan al antígeno diana. Tales técnicas pueden implicar la introducción de ADN que codifica para la región variable de la inmunoglobulina, o para las CDR, de un anticuerpo en las regiones constantes, o regiones constantes más regiones de entramado, de una inmunoglobulina diferente. Véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400, y una gran cantidad de bibliografía posterior. Un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo puede someterse a mutación genética u otros cambios, que pueden alterar o no la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.

Dado que los anticuerpos pueden modificarse de varias maneras, el término “molécula de anticuerpo” debe interpretarse como que cubre cualquier sustancia o miembro de unión que tiene un sitio de unión a antígeno del anticuerpo con la especificidad y/o la unión a antígeno requeridas. Por tanto, este término cubre fragmentos y derivados de anticuerpo, incluyendo cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo, ya sea natural o total o parcialmente sintético. Por tanto, se incluyen moléculas quiméricas que comprenden un sitio de unión a antígeno del anticuerpo, o equivalente, fusionado con otro polipéptido (por ejemplo, derivado de otra especie o perteneciente a otra clase o subclase de anticuerpo). La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023, y una gran cantidad de bibliografía posterior.

Las técnicas adicionales disponibles en la técnica de la ingeniería de anticuerpos han hecho posible aislar anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, los hibridomas humanos pueden prepararse tal como se describe por Kontermann y Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag Nueva York, LLC; ISBN: 3540413545. La presentación en fago, otra técnica establecida para generar miembros de unión, se ha descrito con detalle en muchas publicaciones tales como el documento WO92/01047 (comentado más adelante) y las patentes estadounidenses US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404 y Kontermann y Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag Nueva York, LLC; ISBN: 3540413545. Los ratones transgénicos, en los que los genes de anticuerpos de ratón se inactivan y se reemplazan funcionalmente por genes de anticuerpos humanos mientras se dejan intactos otros componentes del sistema inmunitario del ratón, pueden usarse para aislar anticuerpos humanos (Méndez et al., (1997), Nature Genet, 15(2): 146-156).

Las moléculas de anticuerpo sintéticas pueden crearse mediante la expresión de genes generados por medio de oligonucleótidos sintetizados y ensamblados dentro de vectores de expresión adecuados, por ejemplo, tal como se describe en Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296, 57-86 o Krebs et al. (2001) Journal of Immunological Methods, 25467-84.

Se ha demostrado que fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de antígenos de unión. Ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546; McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554; Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) que consiste en un dominio VH o VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos; (vii) moléculas de Fv de cadena sencilla (scFv), en las que un dominio VH y un dominio VL están unidos por un ligador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno (Bird et al. (1988) Science, 242, 423-426; Houston et al. (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883); (viii) dímeros de Fv de cadena sencilla biespecíficos (documento PCT/US92/09965); y (ix) “diacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión génica (documento WO94/13804; Holliger et al. (1993a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 906444 6448). Las moléculas de Fv, scFv o diacuerpo pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter et al. (1996), Nature Biotech, 14, 1239-1245). También pueden prepararse minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu et al. (1996), Cancer Res., 56(13):3055-61). Otros ejemplos de fragmentos de unión son Fab', que se diferencia de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo terminal del dominio CH1 de cadena pesada, que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo, y Fab'-SH, que es un fragmento Fab' en el que el/los residuo(s) de cisteína de los dominios constantes porta(n) un grupo tiol libre.

Los fragmentos de anticuerpo de la divulgación pueden obtenerse a partir de cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas en el presente documento, por ejemplo, moléculas de anticuerpo que comprenden dominios VH y/o VL o CDR de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento, mediante métodos tales como digestión con enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o mediante escisión de los puentes disulfuro por reducción química. De otro modo, los fragmentos de anticuerpo de la presente invención pueden obtenerse mediante técnicas de recombinación genética igualmente bien conocidas por el experto en la técnica, o bien mediante síntesis de péptidos por medio de, por ejemplo, sintetizadores automáticos de péptidos como los suministrados por la empresa Applied Biosystems, etc., o mediante síntesis y expresión de ácidos nucleicos.

Los fragmentos de anticuerpo funcionales según la presente invención incluyen cualquier fragmento funcional cuya semivida aumenta por una modificación química, especialmente por pegilación, o por incorporación en un liposoma. Un dAb (anticuerpo de dominio) es un pequeño fragmento monomérico de unión a antígeno de un anticuerpo, concretamente, la región variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo (Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490). Los dAb de VH se producen de manera natural en los camélidos (por ejemplo, camello, llama) y pueden producirse mediante la inmunización de un camélido con un antígeno diana, el aislamiento de células B específicas de antígeno y la clonación directa de genes de dAb a partir de células B individuales. Los dAb también pueden producirse en cultivo celular. Su pequeño tamaño, buena solubilidad y estabilidad frente a la temperatura los hace particularmente útiles fisiológicamente y adecuados para la selección y la maduración por afinidad.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “sustancialmente tal como se establece” se refiere a que la(s) característica(s) de las CDR relevantes del dominio VH o VL de los miembros de unión descritos en el presente documento será(n) idéntica(s) o muy similar(es) a las regiones especificadas cuya secuencia se establece en el presente documento. Tal como se describe en el presente documento, la expresión “muy similar” con respecto a la(s) región/regiones especificada(s) de uno o más dominios variables, se contempla que pueden realizarse desde 1 hasta aproximadamente 5, por ejemplo, desde 1 hasta 4, incluyendo de 1 a 3, o 1 o 2 o 3 o 4, sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en las CDR y/o el dominio VH o VL.

Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales forman una segunda generación de anticuerpos monoclonales en los que se combinan dos regiones variables diferentes en la misma molécula (Holliger y Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev. 18: 411-419). Su uso se ha demostrado tanto en el campo del diagnóstico como en el campo de la terapia a partir de su capacidad para reclutar nuevas funciones efectoras o para seleccionar como diana varias moléculas en la superficie de las células tumorales. Cuando van a usarse anticuerpos biespecíficos, estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, que pueden fabricarse de diversas formas (Holliger et al. (1993b), Current Opinion Biotechnol 4, 446-449), por ejemplo, prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpo biespecíficos mencionados anteriormente. Estos anticuerpos pueden obtenerse mediante métodos químicos (Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp et al., (1995) J. Hemat. 377-382) o métodos somáticos (Staerz U. D. y Bevan M. J. (1986) PNAS 83; Suresh et al. (1986) Method. Enzymol. 121: 210-228), pero también mediante técnicas de ingeniería genética que permiten forzar la heterodimerización y así facilitar el procedimiento de purificación del anticuerpo buscado (Merchand et al., 1998 Nature Biotech. 16:677-681). Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen los de la tecnología BiTE™ en la que pueden usarse dominios de unión de dos anticuerpos con especificidad diferente y unirse directamente a través de péptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos en una única cadena polipeptídica corta. Los diacuerpos y scFv pueden construirse sin una región Fc, usando sólo dominios variables, lo que reduce potencialmente los efectos de la reacción antiidiotípica.

Los anticuerpos biespecíficos pueden construirse como IgG completa, como Fab'2 biespecífico, como Fab'PEG, como diacuerpos o también como scFv biespecífico. Además, pueden unirse dos anticuerpos biespecíficos usando métodos de rutina conocidos en la técnica para formar anticuerpos tetravalentes.

Los diacuerpos biespecíficos, a diferencia de los anticuerpos completos biespecíficos, también pueden ser particularmente útiles porque pueden construirse y expresarse fácilmente en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos, tales como fragmentos de anticuerpo) de especificidades de unión apropiadas pueden seleccionarse fácilmente usando presentación en fago (documento WO94/13804) a partir de bibliotecas. Si un brazo del diacuerpo va a mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra un antígeno diana, entonces puede prepararse una biblioteca en la que se varíe el otro brazo y se seleccione un anticuerpo de especificidad apropiada. Los anticuerpos completos biespecíficos pueden prepararse mediante métodos de ingeniería alternativos tal como se describe en Ridgeway et al. (1996), Protein Eng., 9, 616-621.

Diversos métodos están disponibles en la técnica para obtener anticuerpos contra un antígeno diana. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, especialmente de origen humano, murino, quimérico o humanizado, que pueden obtenerse según los métodos convencionales bien conocidos por el experto en la técnica. En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible hacer referencia a técnicas que se describen en particular en el manual “Antibodies” (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., págs.

726, 1988) o a la técnica de preparación a partir de hibridomas descrita por Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse a partir de una célula animal inmunizada contra CAIX, o uno de sus fragmentos que contiene el epítopo reconocido por dichos anticuerpos monoclonales. Los fragmentos adecuados incluyen el dominio extracelular de CAIX, que puede comprender o consistir en los aminoácidos 120-397 de CAIX, o un fragmento peptídico de CAIX. La CAIX, o uno de sus fragmentos, puede producirse según los métodos de trabajo habituales, mediante recombinación genética comenzando con una secuencia de ácido nucleico contenida en la secuencia de ADNc que codifica para CAIX, o un fragmento de la misma, o mediante síntesis de péptidos comenzando a partir de una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia peptídica de CAIX y/o un fragmento de la misma.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden purificarse en una columna de afinidad en la que se ha inmovilizado previamente CAIX, el dominio extracelular de CAIX de la CAIX (que puede comprender o consistir en los aminoácidos 120-397 de CAIX), u otro fragmento de CAIX que contiene el epítopo reconocido por dichos anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse mediante cromatografía en proteína A y/o G, seguido o no seguido de cromatografía de intercambio iónico que tiene como objetivo eliminar los contaminantes proteicos residuales, así como el ADN y el LPS, por sí misma, seguido o no seguido de cromatografía de exclusión en gel de Sepharose para eliminar los posibles agregados debido a la presencia de dímeros o de otros multímeros. Todas estas técnicas pueden usarse de manera simultánea o sucesiva.

Sitio de unión a antígeno

Esto describe la parte de una molécula que se une a, y es complementaria, a la totalidad o una parte del antígeno diana. En una molécula de anticuerpo se denomina sitio de unión a antígeno del anticuerpo, y comprende la parte del anticuerpo que se une a, y es complementario a, la totalidad o una parte del antígeno diana. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo sólo puede unirse a una parte particular del antígeno, parte que se denomina epítopo. Puede proporcionarse un sitio de unión a antígeno del anticuerpo mediante uno o más dominios variables del anticuerpo. Un sitio de unión a antígeno del anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo.

Aislado

Esto se refiere al estado en el que los miembros de unión específicos, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, de la invención, o un ácido nucleico que codifica para tales miembros de unión específicos, estarán generalmente según la presente invención. Por tanto, los miembros de unión específicos, los dominios VH y/o VL de la presente invención pueden proporcionarse aislados y/o purificados, por ejemplo, a partir de su entorno natural, en una forma sustancialmente pura u homogénea, o, en el caso de un ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico o genes de origen distinto de la secuencia que codifica para un polipéptido con la función requerida. Los miembros aislados y el ácido nucleico aislado estarán libres o sustancialmente libres de material con el que se asocian de manera natural, tal como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se hallan en su entorno natural, o el entorno en el que se preparan (por ejemplo, cultivo celular) cuando tal preparación es mediante tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los miembros de unión específicos y el ácido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes y aun así aislarse para fines prácticos, por ejemplo, los miembros se mezclarán normalmente con gelatina u otros portadores si se usan para recubrir placas de microtitulación para su uso en inmunoensayos, o se mezclarán con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se usen en diagnóstico o terapia. Los miembros de unión específicos pueden glicosilarse, o bien de manera natural o bien mediante sistemas de células eucariotas heterólogas (por ejemplo, células CHO o NS0 (ECACC 85110503), o pueden estar sin glicosilar (por ejemplo, si se producen mediante expresión en una célula procariota).

También pueden usarse en la invención preparaciones heterogéneas que comprenden moléculas de anticuerpo. Por ejemplo, tales preparaciones pueden ser mezclas de anticuerpos con cadenas pesadas de longitud completa y cadenas pesadas que carecen de lisina C-terminal, con diversos grados de glicosilación y/o con aminoácidos derivatizados, tales como la ciclación de un ácido glutámico N-terminal para formar un residuo de ácido piroglutámico.

Pueden obtenerse uno o más miembros de unión específicos para CAIX poniendo en contacto una biblioteca de miembros de unión específicos según la invención y el antígeno o un fragmento del mismo, por ejemplo, el antígeno CAIX de longitud completa, un fragmento de CAIX que comprende o consiste en el dominio extracelular de CAIX (que puede comprender o consistir en los aminoácidos 120-397 de CAIX), u otro fragmento (por ejemplo, un fragmento peptídico) de CAIX, y seleccionar uno o más miembros de unión específicos de la biblioteca que puedan unirse al antígeno.

Una biblioteca de anticuerpos puede examinarse usando exploración iterativa de filtros de colonias (ICFS) según Giovannoni et al., Nucleic Acids Research (2001), 29:5 e27. En la ICFS, las bacterias que contienen el ADN que codifica para varias especificidades de unión se cultivan en un medio líquido y, una vez alcanzada la etapa de crecimiento exponencial, algunos miles de millones de ellas se distribuyen sobre un soporte de crecimiento que consiste en un filtro de membrana pretratado adecuadamente que se incuba hasta que aparecen colonias bacterianas completamente confluentes. Un segundo sustrato trampa consiste en otro filtro de membrana, prehumidificado y cubierto con el antígeno deseado.

Luego se coloca el filtro de membrana trampa sobre una placa que contiene un medio de cultivo adecuado y se cubre con el filtro de crecimiento con la superficie cubierta con colonias bacterianas hacia arriba. Se incuba el sándwich así obtenido a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 h. Así es posible obtener la expresión de los genes que codifican para fragmentos scFv de anticuerpo que tienen una acción de propagación, de modo que aquellos fragmentos que se unen específicamente con el antígeno que está presente en la membrana trampa quedan atrapados. Luego se trata la membrana trampa para señalar los fragmentos scFv de anticuerpo unidos con técnicas colorimétricas usadas habitualmente para este fin.

La posición de las manchas de color en el filtro trampa permite volver a las colonias bacterianas correspondientes que están presentes en la membrana de crecimiento y producir los fragmentos de anticuerpo atrapados. Tales colonias se juntan y se cultivan y las bacterias, unos pocos millones de ellas, se distribuyen sobre una nueva membrana de cultivo repitiendo los procedimientos descritos anteriormente. Luego se llevan a cabo ciclos análogos hasta que las señales positivas en la membrana trampa corresponden a colonias positivas únicas, cada una de las cuales representa una posible fuente de fragmentos de anticuerpo monoclonal dirigidos contra el antígeno usado en la selección. La ICFS se describe, por ejemplo, en el documento WO0246455.

También puede presentarse una biblioteca sobre partículas o complejos moleculares, por ejemplo, paquetes genéticos replicables, tales como partículas de bacteriófagos (por ejemplo, T7), u otros sistemas de presentación in vitro, conteniendo cada partícula o complejo molecular un ácido nucleico que codifica para el dominio variable VH del anticuerpo presentando en el mismo, y opcionalmente también un dominio VL presentado, si está presente. La presentación en fago se describe en el documento WO92/01047 y, por ejemplo, en las patentes estadounidenses US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 y US6521404.

Tras la selección de miembros de unión que pueden unirse al antígeno y presentados en bacteriófagos u otras partículas o complejos moleculares de la biblioteca, puede tomarse un ácido nucleico de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que presente dicho miembro de unión seleccionado. Tal ácido nucleico puede usarse en la producción posterior de un miembro de unión o un dominio variable VH o VL de anticuerpo mediante la expresión a partir de un ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico tomada de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que presenta dicho miembro de unión seleccionado.

Un dominio variable VH de anticuerpo con la secuencia de aminoácidos de un dominio variable VH de anticuerpo de dicho miembro de unión seleccionado puede proporcionarse en forma aislada, como un miembro de unión que puede comprender un dominio VH de este tipo.

La capacidad para unirse a CAIX puede someterse a prueba adicionalmente, por ejemplo, la capacidad para competir con el anticuerpo anti-CAIX XE114 para unirse a CAIX o a un fragmento de la misma, tal como un fragmento que comprende o consiste en el dominio extracelular de CAIX (que puede comprender o consistir en los aminoácidos 120-397 de CAIX), u otro fragmento (por ejemplo, un fragmento peptídico) de CAIX.

Un miembro de unión específico de la invención se une específicamente a CAIX, por ejemplo, el dominio extracelular de CAIX (que puede comprender los aminoácidos 120-397 de CAIX). Un miembro de unión específico de la presente invención puede unirse a CAIX, con la misma afinidad que el anticuerpo anti-CAIX XE114, por ejemplo, en formato de scFv, o con una afinidad que es mayor. Un miembro de unión específico de la invención se une a CAIX, con una K^dde 15 nM, 10 nM, 5 nM o 4 nM, o una afinidad que es mayor, preferiblemente con una K^dde 3 nM o una afinidad que es mayor. La afinidad de un miembro de unión específico por CAIX puede medirse usando resonancia de plasmón superficial (SPR), tal como Biacore, usando la configuración experimental descrita en los presentes ejemplos, en la que la concentración del miembro de unión específico puede ser, por ejemplo, de 660 nM.

Un miembro de unión específico de la presente invención puede tener la misma constante de velocidad de disociación (koff), cuando se une a CAIX, que el anticuerpo anti-CAIX XE114, por ejemplo, en formato de scFv, o una koff que es más lenta. Una koff más lenta se indica por un valor de koff menor, y significa que el miembro de unión específico se disocia más lentamente de su antígeno relacionado, en este caso CAIX. Un miembro de unión específico de la invención puede unirse a CAIX con una koff de 5 x 10'4 s_1 o una koff que es más lenta.

Los presentes inventores han demostrado que la constante de disociación (koff) del anticuerpo anti-CAIX sin el motivo de glicosilación en formato de scFv es de 3,05 x 10-4 s-1. Por tanto, en una realización preferida, la koff del anticuerpo anti-CAIX en formato de scFv puede ser de 4 x 10-4 s-1 o 3,5 x 10-4 s-1, o una koff que es más lenta. Por ejemplo, la koff del anticuerpo anti-CAIX en formato de scFv puede ser de aproximadamente 3 x 10-4 s-1.

Cazzamalli et al. (J. Am. Chem. Soc. (2018), 140 (5), 1617-1621) informan que la koff del anticuerpo anti-CAIX sin el motivo de glicosilación en formato de IgG1 es de 2,2 x 10'5s-1. Por tanto, en una realización preferida, la koff del anticuerpo anti-CAIX en formato de IgG1 puede ser de 4 x 10-5 s-1, 3 x 10-5 s-1 o 2,5 x 10-4 s-1, o una koff que es más lenta. Por ejemplo, la koff del anticuerpo anti-CAIX en formato de IgG1 puede ser de aproximadamente 2,2 x 10'5 s-1. Los bajos valores de koff de los miembros de unión específicos de la invención en formato de scFv e IgG1 son ventajosos, ya que significa que estos miembros de unión específicos se disocian más lentamente de CAIX, es decir, permanecen unidos a CAIX durante más tiempo que los miembros de unión específicos con valores de koff mayores. Se espera que la disociación lenta sea ventajosa en la detección de cánceres que expresan CAIX, tales como en métodos de diagnóstico o pronóstico de cáncer, así como en métodos que comprenden la administración de agentes terapéuticos a sitios de cáncer en un paciente, en los que se espera que los conjugados que comprenden un miembro de unión específico de la invención y una molécula citotóxica, por ejemplo, permanezcan unidos a la CAIX expresada en las células tumorales durante más tiempo y, por tanto, tengan una ventana de tiempo más prolongada para ejercer su efecto terapéutico.

La afinidad o koff de un miembro de unión específico por CAIX puede medirse con el miembro de unión específico en formato de scFv o con cualquier otro fragmento de anticuerpo monomérico, tal como Fab. Alternativamente, también puede medirse con el miembro de unión específico en formato de IgG o con cualquier otro formato de anticuerpo dimérico, tal como scFv-Fc. En la técnica se conocen métodos para medir la koff e incluyen SPR, tal como el análisis de Biacore.

Un miembro de unión específico de la invención puede no mostrar ninguna unión significativa a moléculas distintas de CAIX. En particular, el miembro de unión específico puede no mostrar ninguna unión significativa a moléculas distintas del dominio extracelular de CAIX. El miembro de unión específico puede no mostrar ninguna unión significativa a anhidrasas carbónicas distintas de CAIX. En particular, el miembro de unión específico puede no mostrar ninguna unión significativa a anhidrasa carbónica XII (CAXII), que también está regulada por incremento en condiciones hipóxicas.

Los miembros de unión específicos para uso en la presente invención pueden comprender además regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas, por ejemplo, regiones constantes de anticuerpos humanos o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL puede unirse en su extremo C-terminal a dominios constantes de cadena ligera de anticuerpo que incluyen cadenas CK o CX humanas, por ejemplo, CX.

De manera similar, un miembro de unión específico basado en un dominio VH puede unirse en su extremo C-terminal a la totalidad o parte (por ejemplo, un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM, y cualquiera de las subclases de isotipos, particularmente IgG1 e IgG4. Cualquier variante de región constante sintética u otra que tenga estas propiedades y estabilice regiones variables también es útil en realizaciones de la presente invención.

Los miembros de unión específicos de la invención pueden marcarse con un marcador detectable o funcional. Un marcador puede ser cualquier molécula que produzca o pueda ser inducida para producir una señal, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes que fluorescen, radiomarcadores, enzimas, agentes quimioluminiscentes o fotosensibilizadores. Por tanto, la unión puede detectarse y/o medirse detectando fluorescencia o luminiscencia, radiactividad, actividad enzimática o absorbancia de luz. Los marcadores detectables pueden unirse a los anticuerpos de la invención usando química convencional conocida en la técnica.

Existen numerosos métodos mediante los que el marcador puede producir una señal detectable por medios externos, por ejemplo, mediante examen visual, radiación electromagnética, calor y reactivos químicos. El marcador también puede unirse a otro miembro de unión específico que se une al anticuerpo para su uso en la invención, o a un soporte.

Los miembros de unión específicos marcados, por ejemplo, anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, scFv) marcados con un marcador detectable, pueden usarse de manera diagnóstica, in vivo, ex vivo o in vitro, y/o terapéuticamente.

Por ejemplo, pueden usarse miembros de unión radiomarcados (por ejemplo, miembros de unión conjugados con un radioisótopo) en radiodiagnóstico y radioterapia. Los radioisótopos que pueden conjugarse con un miembro de unión de la invención incluyen isótopos tales como 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111In, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 123I, 124I, 125I, 131I, 18F, 211At y 225Ac. Preferiblemente, se usan emisores de positrones, tales como 18F y 124I, o emisores gamma, tales como 99mTc, 111In y 123I, para aplicaciones de diagnóstico (por ejemplo, para PET), mientras que los emisores beta, tales como 131I, 90Y y 177Lu, se usan preferiblemente para aplicaciones terapéuticas. Los emisores alfa, tales como 211At y 225Ac, también pueden usarse para terapia. En un ejemplo, el miembro de unión específico puede conjugarse con 177Lu o 90Y.

Por ejemplo, un miembro de unión específico de la invención marcado con un marcador detectable puede usarse para obtener imágenes, detectar, diagnosticar o monitorizar el cáncer en un ser humano o animal. Un miembro de unión específico de la presente invención puede usarse para la fabricación de un producto de diagnóstico para su uso en la obtención de imágenes, la detección o el diagnóstico de cáncer.

Aspectos adicionales de la presente invención emplean un conjugado, por ejemplo, una fusión, entre un miembro de unión específico de la invención y una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre las células diana, por ejemplo, células cancerosas que expresan CAIX. Tales conjugados pueden usarse terapéuticamente para el tratamiento de cáncer tal como se menciona en el presente documento.

Tal como se comenta adicionalmente a continuación, el miembro de unión específico de la invención es preferiblemente una molécula de anticuerpo o comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Convenientemente, el miembro de unión específico puede ser un polipéptido de cadena sencilla, tal como un anticuerpo de cadena sencilla. Esto permite la producción conveniente de una proteína de fusión que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y, por ejemplo, una molécula biocida o citotóxica. Puede proporcionarse un sitio de unión a antígeno del anticuerpo mediante la asociación de un dominio VH de anticuerpo y un dominio VL de anticuerpo en polipéptidos independientes, por ejemplo, en un anticuerpo completo o en un fragmento de anticuerpo tal como Fab o un diacuerpo. Cuando el miembro de unión específico es una molécula de dos o más cadenas (por ejemplo, Fab o anticuerpo completo, respectivamente), una molécula biocida o citotóxica puede conjugarse como un polipéptido de fusión con una o más cadenas polipeptídicas en el miembro de unión específico.

El miembro de unión específico puede conjugarse con la molécula biocida o citotóxica mediante un enlace peptídico, es decir, dentro de un polipéptido de fusión que comprende dicha molécula y el miembro de unión específico o un componente de la cadena polipeptídica de la misma (véase, por ejemplo, Trachsel et al.). Otros medios para la conjugación incluyen conjugación química, especialmente reticulación usando un reactivo bifuncional (por ejemplo, empleando la guía de selección de reactivos de reticulación DOUBLE-REAGENTS™, Pierce).

El miembro de unión específico de la invención puede conjugarse con IL2 y TNF, tal como TNFa, preferiblemente un mutante de TNF. El miembro de unión específico es preferiblemente un scFv o un diacuerpo, lo más preferiblemente un scFv, tal como se describe en el presente documento.

La IL2 es preferiblemente IL2 humana.

La IL2 pueden comprender o consistir en la secuencia de IL2 mostrada en SEQ ID NO: 24. Normalmente, la IL2 tiene al menos el 70%, más preferiblemente uno de al menos el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de IL2 mostrada en SEQ ID NO: 24. La IL2 en los conjugados de la invención conserva la actividad biológica de IL2 humana, por ejemplo, la capacidad para inhibir la proliferación celular.

El TNF es preferiblemente TNF humano. Cuando el factor de necrosis tumoral es TNFa, el TNFa es preferiblemente TNFa humano.

El mutante de TNF es un mutante de TNF que conserva la función biológica de TNF humano, por ejemplo, la capacidad para inhibir la proliferación celular, pero tiene una actividad reducida.

El mutante de TNF puede comprender una o más mutaciones que reducen la actividad en relación con el TNF de tipo natural que carece de la una o más mutaciones, es decir, el mutante de TNF es menos potente que el TNF de tipo natural. Por ejemplo, el mutante de TNF puede comprender una mutación en la posición correspondiente a la posición 32 en la secuencia de TNF mostrada en SEQ ID NO: 24. En algunas realizaciones, la R en dicha posición puede sustituirse por un aminoácido diferente, preferiblemente un aminoácido distinto de G, por ejemplo, un aminoácido apolar, preferiblemente A, F o V, lo más preferiblemente A.

El TNFa humano consiste en un dominio citoplásmico de 35 aminoácidos, un domino transmembranario de 20 aminoácidos y un dominio extracelular de 177 aminoácidos. El dominio extracelular de 177 aminoácidos se escinde para producir una forma soluble de 157 aminoácidos, que es biológicamente activa, y que forma un trímero unido de manera no covalente en disolución. En el contexto de los conjugados de la presente invención, el TNFa humano es un mutante de TNFa que es preferiblemente la forma soluble del dominio extracelular del TNFa humano, o el dominio extracelular del TNFa humano. Normalmente, el TNFa mutante tiene al menos el 70%, más preferiblemente uno de al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24 con una o más mutaciones que reducen la actividad, por ejemplo, una mutación en la posición correspondiente a la posición 32 en la secuencia de TNF mostrada en SEQ ID NO: 24.

Preferiblemente, el miembro de unión específico se conecta con la IL2 y el mutante de TNF, preferiblemente el mutante de TNFa, a través de ligadores, por ejemplo, ligadores peptídicos. Alternativamente, el miembro de unión específico y la IL2 y/o un mutante del factor de necrosis tumoral pueden conectarse directamente, por ejemplo, a través de un enlace químico. Cuando el miembro de unión específico se une a IL2 y a un mutante de factor de necrosis tumoral por medio de uno o más ligadores peptídicos, el conjugado puede ser una proteína de fusión. Por “proteína de fusión” se entiende un polipéptido que es un producto de traducción que resulta de la fusión de dos o más genes o secuencias codificantes de ácido nucleico en un marco de lectura abierto (ORF).

El enlace químico puede ser, por ejemplo, un enlace covalente o iónico. Los ejemplos de enlaces covalentes incluyen enlaces peptídicos (enlaces amida) y enlaces disulfuro. La molécula de anticuerpo y la IL2 y/o el mutante de TNF, preferiblemente el mutante de TNFa, pueden unirse covalentemente, por ejemplo, mediante enlaces peptídicos (enlaces amida). Por tanto, el miembro de unión específico, en particular una porción de scFv de una molécula de anticuerpo, y la IL2 y/o el mutante de TNF, preferiblemente el mutante de TNFa, pueden producirse como una proteína de fusión.

Cuando el miembro de unión específico es una molécula de dos cadenas o de múltiples cadenas (por ejemplo, un diacuerpo), la IL2 y/o el mutante de TNF pueden conjugarse como una proteína de fusión con una o más cadenas polipeptídicas en el miembro de unión específico.

El ligador peptídico que conecta la molécula de anticuerpo y la IL2 y/o el mutante de TNF puede ser un ligador peptídico flexible. En la técnica se conocen ejemplos adecuados de secuencias de ligadores peptídicos. El ligador puede tener 10-20 aminoácidos, preferiblemente 10-15 aminoácidos de longitud. Lo más preferiblemente, el ligador tiene 11-15 aminoácidos de longitud. El ligador puede tener la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 24.

Cuando la molécula de anticuerpo es, o comprende, un scFv, la IL2 puede unirse al extremo N-terminal del dominio VH del scFv a través de un ligador peptídico y el mutante de TNF puede unirse al extremo C-terminal del dominio VL del scFv a través de un ligador peptídico. Alternativamente, cuando la molécula de anticuerpo es, o comprende, un scFv, el mutante de TNF puede unirse al extremo N-terminal del dominio VH del scFv a través de un ligador peptídico y la IL2 puede unirse al extremo C-terminal del dominio VL del scFv a través de un ligador peptídico. Como una alternativa adicional, la IL2 y el mutante de TNF, preferiblemente el mutante de TNFa, por tanto, pueden unirse al extremo C-terminal del dominio VL del anticuerpo, por ejemplo en un formato de scFv, a través de un ligador peptídico. Como una alternativa aún adicional, la IL2 y el mutante de TNF, preferiblemente el mutante de TNFa, pueden unirse al extremo N-terminal del dominio VH del anticuerpo, por ejemplo en un formato de scFv, a través de un ligador peptídico. En los dos últimos conjugados, la IL2 y el TNF pueden estar en cualquier orden y/o pueden unirse opcionalmente entre sí a través de un ligador peptídico. En el presente documento se describen ligadores peptídicos adecuados.

Los conjugados de la invención pueden comprender o consistir en la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 24 o pueden ser una variante de la misma. Una variante puede tener al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24.

Sin querer limitarse a ninguna explicación teórica, un conjugado descrito en el presente documento que comprende un mutante de TNF puede formar un homotrímero en disolución. Un conjugado trimérico de este tipo comprendería tres moléculas de IL2 activa por una molécula de TNF activo con actividad reducida (en estructura trimérica). Esto puede ser ventajoso ya que las inmunocitocinas basadas en IL2 se usan normalmente en la práctica clínica en dosis más altas en comparación con las inmunocitocinas basadas en TNFa. Por ejemplo, se halló que la dosis recomendada de L19-IL2 era de 4 mg en pacientes con cáncer [Johannsen et al. (2010) Eur. J. Cancer], mientras que la dosis recomendada de L19-TNFa está en el intervalo de dosis de 1-1,5 mg [Spitaleri et al. (2012) J. Clin. Oncol. Cancer Res.]. Además, pueden usarse dosis mayores de los conjugados descritos en el presente documento, ya que el mutante de TNF tiene una actividad reducida, en comparación con un conjugado que comprende un TNF de tipo natural e IL2. Por tanto, los conjugados descritos en el presente documento pueden tener propiedades ventajosas con respecto a los regímenes de administración.

También se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para un miembro de unión específico, o conjugado, de la presente invención. El ácido nucleico puede incluir ADN y/o ARN. Un ácido nucleico puede codificar para una CDR o un conjunto de CDR o un dominio V^ho un dominio VL o un sitio de unión a antígeno del anticuerpo o una molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG, por ejemplo, IgG1, tal como se definió anteriormente. Las secuencias de nucleótidos pueden codificar para los dominios VH y/o VL dados a conocer en el presente documento.

En el presente documento se describen además constructos en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido tal como se describió anteriormente.

También se proporciona una célula huésped recombinante que comprende uno o más constructos como los anteriores. Se describe un ácido nucleico que codifica para cualquier CDR o conjunto de CDR o dominio VH o dominio VL o sitio de unión a antígeno del anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG1 o IgG4 tal como se proporcionan, como un método de producción del producto codificado, método que comprende la expresión a partir del ácido nucleico codificante. La expresión puede lograrse convenientemente cultivando en condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contienen el ácido nucleico. Tras la producción mediante expresión, un dominio VH o VL, o un miembro de unión específico, puede aislarse y/o purificarse usando cualquier técnica adecuada, y luego usarse según sea apropiado.

Un ácido nucleico puede comprender ADN o ARN y puede ser total o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia de nucleótidos tal como se expone en el presente documento abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la que U se sustituye por T, a menos que el contexto requiera lo contrario.

También se describe un método de producción de un dominio variable VH de anticuerpo, incluyendo el método provocar la expresión a partir del ácido nucleico codificante. Un método de este tipo puede comprender cultivar células huésped en condiciones para la producción de dicho dominio variable VH de anticuerpo.

Un método de producción puede comprender una etapa de aislamiento y/o purificación del producto. Un método de producción puede comprender formular el producto en una composición que incluya al menos un componente adicional, tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los sistemas para la clonación y la expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, células vegetales, hongos filamentosos, sistemas de levaduras y baculovirus y plantas y animales transgénicos. La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en células procariotas está bien establecida en la técnica. Para una revisión, véase, por ejemplo, Plückthun (1991), Bio/Technology 9: 545-551. Un huésped bacteriano habitual es E. coli.

La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la técnica como una opción para la producción de un miembro de unión específico, por ejemplo, Chadd et al. (2001), Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194); Andersen et al. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117; Larrick y Thomas (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células de melanoma de ratón NS0, células de mieloma de rata YB2/0, células de riñón embrionario humano, células de retina embrionaria humana, y muchas otras.

Pueden elegirse o construirse vectores adecuados que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, por ejemplo, de fagémido, o virales, por ejemplo, de fago, según sea apropiado. Para más detalles véase, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de un ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y el análisis de proteínas, se describen en detalle en Ausubel et al. (1999) 4a ed., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons.

Una célula huésped puede contener un ácido nucleico tal como se describe en el presente documento. Una célula huésped de este tipo puede estar in vitro y puede estar en cultivo. Una célula huésped de este tipo puede estar in vivo. La presencia in vivo de la célula huésped puede permitir la expresión intracelular de un miembro de unión para su uso en la presente invención como “intracuerpos” o anticuerpos intracelulares. Los intracuerpos pueden usarse para la terapia génica.

También se describe un método que comprende la introducción de un ácido nucleico dado a conocer en el presente documento en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otro virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insectos, baculovirus. La introducción de ácido nucleico en la célula huésped, en particular una célula eucariota, puede usar un sistema basado en virus o plásmidos. El sistema de plásmidos puede mantenerse de manera episomal o puede incorporarse a la célula huésped o a un cromosoma artificial. La incorporación puede ser por integración aleatoria o dirigida de una o más copias en loci únicos o múltiples. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos.

La introducción puede ir seguida de provocar o permitir la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células huésped en condiciones para la expresión del gen. La purificación del producto expresado puede lograrse mediante métodos conocidos por un experto en la técnica. El ácido nucleico puede integrarse en el genoma (por ejemplo, el cromosoma) de la célula huésped. La integración puede fomentarse mediante la inclusión de secuencias que fomentan la recombinación con el genoma, según técnicas convencionales.

También se describe un método que comprende el uso de un constructo tal como se indicó anteriormente en un sistema de expresión para expresar un polipéptido o miembro de unión específico tal como se indicó anteriormente. Los miembros de unión específicos de la presente invención están diseñados para usarse en métodos de diagnóstico o tratamiento en sujetos humanos o animales, por ejemplo, un ser humano. Los miembros de unión específicos de la invención pueden usarse en el diagnóstico o tratamiento de cáncer.

Por consiguiente, la divulgación proporciona métodos de tratamiento que comprenden la administración de un miembro de unión específico tal como se describe, composiciones farmacéuticas que comprenden un miembro de unión específico de este tipo y el uso de un miembro de unión específico de este tipo en la fabricación de un medicamento para su administración, por ejemplo, en un método de preparación de un medicamento o una composición farmacéutica que comprende formular el miembro de unión específico con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por el experto en la materia en función de la naturaleza y del modo de administración del/de los compuesto(s) activo(s) elegido(s).

Los miembros de unión específicos de la presente invención se administrarán habitualmente en forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además del miembro de unión específico. Por tanto, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, y para su uso según la presente invención, pueden comprender, además del principio activo, un excipiente, portador, tampón, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral, inhalada o por inyección, por ejemplo, intravenosa.

También se contemplan en la presente invención composiciones farmacéuticas para administración oral tal como, por ejemplo, nanocuerpos, etc. Tales formulaciones orales pueden estar en forma de comprimido, cápsula, polvo, líquida o semisólida. Un comprimido puede comprender un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas comprenden generalmente un portador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra disolución de sacáridos, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de la afección, el principio activo estará en forma de una disolución acuosa parenteralmente aceptable que esté libre de pirógenos y tenga un pH, una isotonicidad y una estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica pueden preparar disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de lactato de Ringer. Pueden emplearse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. Los expertos en la técnica conocen muchos métodos para la preparación de formulaciones farmacéuticas. Véase, por ejemplo. Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Puede administrarse una composición sola o en combinación con otros tratamientos, de manera simultánea o secuencial, o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, dependiendo del estado que va a tratarse.

Un miembro de unión específico de la presente invención puede usarse como parte de una terapia de combinación junto con un componente medicinal adicional. Los tratamientos combinados pueden usarse para proporcionar efectos sinérgicos significativos, particularmente la combinación de un miembro de unión específico para su uso en la presente invención con uno o más de otros fármacos. Un miembro de unión específico para su uso en la presente invención puede administrarse de manera simultánea o secuencial, o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, para el tratamiento de uno o más de los estados enumerados en el presente documento.

Por ejemplo, un miembro de unión específico de la invención puede usarse en combinación con un agente terapéutico existente para el tratamiento de cáncer, en particular cánceres que expresan CAIX.

Un miembro de unión específico de la invención y uno o más de los componentes medicinales adicionales anteriores pueden usarse en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para la administración independiente o combinada a un individuo y, por consiguiente, puede comprender el miembro de unión específico y el componente adicional como una preparación combinada o como preparaciones independientes. Pueden usarse preparaciones independientes para facilitar la administración independiente y secuencial o simultánea, y permitir la administración de los componentes por diferentes vías, por ejemplo, administración oral y parenteral.

Según la presente invención, las composiciones proporcionadas pueden administrarse a mamíferos. La administración puede ser en una “cantidad terapéuticamente eficaz”, siendo esta suficiente para mostrar un beneficio a un paciente. Tal beneficio puede ser al menos la mejora de al menos un síntoma. Por tanto, “tratamiento de cáncer” se refiere a la mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada, y la velocidad y la evolución temporal de la administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que está tratándose, el mamífero particular que está tratándose, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración de la composición, el tipo de miembro de unión específico, el método de administración, la programación de la administración y otros factores conocidos por los médicos. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos de cabecera y otros médicos, y puede depender de la gravedad de los síntomas y/o el avance de una enfermedad que está tratándose. Las dosis apropiadas de anticuerpo se conocen bien en la técnica (Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; y Bagshawe et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). Pueden usarse las dosificaciones específicas indicadas en el presente documento, o en Physician's Desk Reference (2003) según sea apropiado para el tipo de medicamento que está administrándose. La cantidad terapéuticamente eficaz o dosis adecuada de un miembro de unión específico de la invención puede determinarse comparando su actividad in vitro y su actividad in vivo en un modelo animal. Se conocen métodos para la extrapolación de dosificaciones eficaces en ratones y otros animales de experimentación a los seres humanos. La dosis precisa dependerá de varios factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico, prevención o tratamiento, el tamaño y la ubicación del área que va a tratarse, la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo completo, fragmento o diacuerpo), y la naturaleza de cualquier marcador detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis de anticuerpo típica estará en el intervalo de 100 |ig a 1 g para aplicaciones sistémicas, y de 1 |ig a 1 mg para aplicaciones tópicas. Puede administrarse una mayor dosis de carga inicial, seguida de una o más dosis más bajas. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo completo, por ejemplo, el isotipo IgG1 o IgG4. Esta es una dosis para un único tratamiento de un paciente adulto, que puede ajustarse de manera proporcional para niños y lactantes, y también ajustarse para otros formatos de anticuerpo en proporción al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse en intervalos de una vez al día, dos veces a la semana, una vez a la semana o una vez al mes, a la discreción del médico. Los tratamientos pueden ser de cada dos a cuatro semanas para la administración subcutánea y de cada cuatro a ocho semanas para la administración intravenosa. En algunas realizaciones de la presente invención, el tratamiento es periódico, y el periodo entre administraciones es de aproximadamente dos semanas o más, por ejemplo, aproximadamente tres semanas o más, aproximadamente cuatro semanas o más, o aproximadamente una vez al mes. En otras realizaciones de la invención, el tratamiento puede proporcionarse antes y/o después de una cirugía, y puede administrarse o aplicarse directamente en el sitio anatómica del tratamiento quirúrgico.

Aspectos y realizaciones adicionales de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica dada la presente divulgación que incluye la siguiente ejemplificación experimental.

“y/o”, cuando se usa en el presente documento, debe tomarse como una divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, “A y/o B” debe tomarse como una divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno se estableciera individualmente en el presente documento.

Determinados aspectos y realizaciones de la invención se ilustrarán ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras descritas anteriormente.

Parte experimental

Ejemplo 1: Aislamiento del Fv de cadena sencilla XE114 contra CAIX

Materiales y métodos

Aislamiento del Fv de cadena sencilla XE114 contra CAIX

Se incubaron 120 pmol de CAIX marcada con His biotinilada (aminoácidos 120-397 de la proteína de longitud completa; SEQ ID NO: 15) con 60 |il de Dynabeads recubiertas con estreptavidina durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. Se lavó el antígeno CAIX no unido de las perlas 3x con PBS pH 7,4. Se incubó el complejo antígeno-perla con 1012 unidades de transformantes (u.t.) de anticuerpos de fago en 1 ml de leche al 2% en PBS durante 1 h con rotación a temperatura ambiente. Se lavaron los fagos no unidos de las perlas usando 6x 1 ml de PBST seguido de 6x 1 ml de PBS. Se eluyeron los fagos unidos de las perlas mediante la adición de 800 |il de TAE 100 mM e incubación durante 5 min. Se neutralizaron los fagos eluidos inmediatamente mediante la adición de 200 |il de Tris 1 M pH 7,4. Una vez eluidos y neutralizados, se usaron los fagos para infectar células de E. coli TG1 en crecimiento exponencial.

Se realizaron dos rondas de cribado contra CAIX marcada con His (SEQ ID NO: 15) y se sometió a prueba los rendimientos de selección para determinar la unión a CAIX marcada con His (SEQ ID NO: 15) en un ELISA.

Selección por BIAcore de clones positivos

Se seleccionaron mediante BIAcore los clones que dieron una señal positiva en un ELISA para confirmar qué scFv podían unirse a CAIX. Se realizó la selección del sobrenadante en un instrumento Biacore 3000. Se inmovilizaron 2100 unidades de respuesta (UR) de CAIX recombinante marcada con His (SEQ ID NO: 15) en un chip CM5. Se permitió que 15 |il de cada sobrenadante fluyeran sobre el chip recubierto a una velocidad de flujo de 10 |il/min. Se identificaron y secuenciaron los clones positivos.

Secuenciación de los scFv específicos para CAIX

Los clones positivos identificados mediante la selección por BIAcore, incluyendo el anticuerpo scFv anti-CAIX XE114, se secuenciaron usando métodos convencionales para identificar scFv únicos.

Mediciones de afinidad mediante BIAcore

Se realizaron mediciones de afinidad en un instrumento Biacore 3000. Se inmovilizaron 2100 UR de CAIX recombinante marcada con His (SEQ ID NO: 15) en un chip CM5. Los picos que representan las fracciones monoméricas del scFv se recogieron mediante cromatografía de exclusión molecular en una columna Superdex 75 HR 10/30. Se inyectó la fracción monomérica a una velocidad de flujo de 10 |il min-1 sobre el chip recubierto con antígeno a cuatro concentraciones diferentes, 660 nM, 160 nM y 80 nM. Se evaluaron todos los datos cinéticos usando el software BIAevaluation 4.1. Los resultados de la medición de afinidad del anticuerpo XE114 a una concentración de 660 nM se muestran en la figura 2.

Mapeo de epítopos mediante BIAcore

Se mapeó el epítopo en CAIX unido por el anticuerpo scFv XE114 a través de comparación con un segundo anticuerpo scFv que se une a CAIX, ^a3 (Ahlskog et al., British Journal of Cancer, 2009, 101: 645-657) usando un instrumento Biacore 3000. Se inmovilizaron 2100 UR de CAIX recombinante marcada con His (SEQ ID NO: 15) en un chip CM5. Se inyectaron 30 |il del anticuerpo scFv A3 a una concentración de 0,1 mg/ml sobre el chip recubierto con antígeno a una velocidad de flujo de 10 |il min-1.

Para determinar si el anticuerpo scFv XE114 se une a un epítopo en CAIX distinto del epítopo de scFv A3, se realizó una segunda inyección de 30 |il con una mezcla 1:1 de scFv A3 y scFv XE114. La concentración de proteína total fue de 0,1 mg/ml (0,05 mg/ml de A3 0,05 mg/ml de XE114) y se inyectó la muestra sobre el chip recubierto con antígeno a una velocidad de flujo de 10 |il min-1. Se realizaron dos reacciones de control en las que la segunda inyección consistió en 30 |il de scFv A3 o 30 |il de una mezcla 1:1 de scFv A3 y un anticuerpo scFv irrelevante que no se une a CAIX. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 3.

Tinción por inmunofluorescencia in vitro de tumores SKRC52

Se tiñeron cortes congelados de tumor de carcinoma de células renales humanas (SKRC52) de la siguiente manera. Se añadió anticuerpo XE114 marcado con biotina en formato de diacuerpo (Db) a una concentración final de 5 |ig/ml a cortes de tumor SKRC52 fijados en acetona. Se determinó la unión del anticuerpo XE114 marcado con biotina a los cortes de tumor usando estreptavidina conjugada con AlexaFluor488 (dilución final 1:500). Como control negativo se usó un anticuerpo irrelevante específico para la lisozima de huevo de gallina.

Se realizó la contratinción de los vasos sanguíneos tumorales usando un anticuerpo de rata anti-CD31 murino (dilución final 1:200), seguida de la detección con anticuerpo de burro anti-IgG de rata conjugado con AlexaFluor594 (dilución final 1:500). Se realizó la tinción de los núcleos de células tumorales con DAPI. Se montaron los cortes de tumor con medio de montaje fluorescente y se analizaron usando un microscopio Axioskop2 con un objetivo de 10x. Los resultados de los análisis de inmunofluorescencia in vitro de los cortes de tumor SKRC52 se muestran en la figura 4.

Tinción por inmunofluorescencia ex vivo de tumores SKRC52

A ratones desnudos BALB/c que portaban tumores de carcinoma de células renales humanas SKRC52 implantados subcutáneamente se les inyectaron 100 |ig de anticuerpo XE114 en formato de IgG o un anticuerpo específico para lisozima de huevo de gallina como control negativo. 60 horas después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se recogieron y congelaron los tumores.

Se detectó el anticuerpo XE114 usando un anticuerpo de conejo anti-huIgG (dilución final 1:500). Se reveló la unión del anticuerpo a los cortes de los tumores recogidos con un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con AlexaFluor488 (dilución final 1:500).

Se realizó la contratinción de los vasos sanguíneos con un anticuerpo de rata anti-CD31 murino (dilución final 1:200), seguida de la detección con anticuerpo de burro anti-IgG de rata conjugado con AlexaFluor594 (dilución final 1:500). Se realizó la tinción de los núcleos celulares con DAPI. Se montaron los cortes de tumor con medio de montaje fluorescente y se analizaron usando un microscopio Axioskop2 con un objetivo de 10x. Los resultados de los análisis de inmunofluorescencia ex vivo de los cortes de tumor SKRC52 se muestran en la figura 5.

Tinción por inmunofluorescencia de tejido estomacal humano

Se tiñeron cortes congelados de tejido estomacal humano sano de la siguiente manera. En resumen, se añadió el anticuerpo XE114 marcado con FIT^cen formato de IgG1 humana (hIgG1) a una concentración final de 2 ug/ml a cortes fijados en acetona. Se realizó la detección del anticuerpo primario con un anticuerpo de conejo anti-FITC (dilución final 1:1000) y se reveló la unión del anticuerpo primario a los cortes de tejido con un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado con AlexaFluor488 (dilución final 1:500).

Se realizó la contratinción de los núcleos celulares con DAPI. Se montaron los cortes de tejido con medio de montaje fluorescente y se analizaron con un microscopio Axioskop2 con un objetivo de 10x. Los resultados de los análisis de inmunofluorescencia de los cortes de tejido estomacal humano se muestran en la figura 6.

Análisis de FACS de células SKRC52

Se recogieron células SKRC52 y se concentraron en disolución de bloqueo (PBS, FBS descomplementado al 1%) hasta 5 millones de células/ml: se usaron 500 |il de esta disolución celular para cada tinción individual. Se incubaron las células con 250 |il de XE114 biotinilado en formato de diacuerpo (Db) diluido hasta 10 |ig/ml en disolución de bloqueo o con un anticuerpo de control específico para lisozima de huevo de gallina. Después del lavado, se incubaron las células en la oscuridad con 250 |il de estreptavidina conjugada con AlexaFluor488 diluida 1:500 en disolución de bloqueo. Después de los lavados, se transfirieron las células a tubos de FACS y se analizaron con un citómetro de flujo BD FACSCanto. Los resultados de los análisis de FACS de las células SKRC52 se muestran en la figura 7.

Biodistribución

Se produjo el XE114 en formato de diacuerpo en células CHO-S mediante expresión génica transitoria y se purificó por medio de una resina de cromatografía de afinidad de proteína A - Sepharose. Se evaluó la pureza de la proteína mediante cromatografía de exclusión molecular (Superdex200, tampón de transferencia: PBS, pH 7,40).

Se evaluó el rendimiento de direccionamiento in vivo del XE114 en formato de diacuerpo mediante análisis de biodistribución. Después de la radioyodación con 125I, se inyectaron un total de 10 |ig de anticuerpo radiomarcado en la vena de la cola de ratones desnudos BALB/c que portaban tumores de carcinoma de células renales humanas SKRC52 implantados subcutáneamente. Los ratones se sacrificaron 24 h después de la inyección. Se pesaron los órganos y se contó la radiactividad con un contador gamma Packard Cobra. Se registró el contenido radiactivo de órganos representativos y se expresó como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido (% de DI/g). Los resultados de los análisis se muestran en la figura 8.

Resultados

Aislamiento del Fv de cadena sencilla XE114 contra CAIX

Después de dos rondas de cribado, se examinaron 480 sobrenadantes bacterianos que contenían scFv expresado para determinar su capacidad para unirse a CAIX en un ELISA. 86 de los sobrenadantes bacterianos seleccionados dieron una señal positiva en ELISA y se recogieron y sometieron a análisis de BIAcore.

Selección por BIAcore de clones positivos

Se analizaron 60 de los sobrenadantes seleccionados que dieron las señales positivas más altas en el ELISA para determinar la unión a CAIX mediante BIAcore. Se secuenciaron los Fv de cadena sencilla de 16 de los sobrenadantes que mostraron unión a CAIX mediante BIAcore. Se identificaron once secuencias únicas y se expresaron y purificaron estos 11 scFv. A partir de estas moléculas se identificó al scFv XE114 como el anticuerpo con la afinidad más alta por CAIX.

Secuenciación de los scFv específicos para CAIX

La secuencia de nucleótidos del anticuerpo scFv anti-CAIX XE114 se muestra en SEQ ID NO: 14. La secuencia de aminoácidos de este anticuerpo se muestra en SEQ ID NO: 10, así como en la figura 1.

Mediciones de afinidad mediante BIAcore

La Kd del anticuerpo anti-CAIX XE114 para CAIX cuando se mide a una concentración de 660 nM fue de 15 nM (figura 2).

Mapeo de epítopos mediante BIAcore

Los resultados del mapeo de epítopos (figura 3) muestran que el anticuerpo XE114 se une a un epítopo en CAIX distinto del epítopo unido mediante el anticuerpo anti-CAIX ^a3 conocido.

Tinción por inmunofluorescencia in vitro de tumores SKRC52

Los resultados de los experimentos de inmunofluorescencia (figura 4) muestran que el anticuerpo XE114 tiñó de manera específica e intensa el tejido del tumor de carcinoma de células renales (SKRC52), mientras que no se observó tinción del tejido del tumor con el anticuerpo de control.

Tinción por inmunofluorescencia ex vivo de tumores SKRC52

El anticuerpo XE114 mostró acumulación específica en el sitio del tumor, mientras que tal acumulación no se observó con el anticuerpo de control.

Tinción por inmunofluorescencia de tejido estomacal humano

Se observó una intensa tinción del tejido estomacal con el anticuerpo XE114, lo que está en consonancia con el patrón de expresión informado para el antígeno relacionado del anticuerpo, CAIX.

Análisis de FACS de células SKRC52

El anticuerpo XE114 mostró una unión clara y selectiva a las células SKRC52 en comparación con los controles negativos para los que no se observó unión.

Biodistribución

El anticuerpo XE114 mostró una captación selectiva en los tumores SKRC52 con una razón óptima de tumor con respecto a órganos y de tumor con respecto a sangre.

Ejemplo 2: Producción y caracterización del XE114 sin motivo de glicosilación en formato de Fv de cadena sencilla y de IgG

Material y métodos

Clonación, purificación y caracterización in vitro del anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de scFv Se diseñaron cebadores para mutar la asparagina en la posición 88 del dominio VL del scFv XE114 a glutamina. Se amplificó por PCR el gen que codifica para el anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación usando los cebadores “Leader Seq DP47 Fo>“ (^sE^qID NO: 26) y “Not STOP D^pL16 Ba<“ (SEQ ID NO: 27). Se amplificó adicionalmente el fragmento de PCR resultante usando los cebadores y “NheI leader>“ (SEQ ID NO: 28) y “Not STOP DPL16 Ba<“ (SEQ ID NO: 29). A continuación, se digirió este fragmento de PCR con NheI y NotI y se clonó en el vector pCDNA 3.1.

Procedimiento de producción

Se expresó el anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de scFv usando expresión génica transitoria en células CHO-S. Para 1 ml de producción, se centrifugaron 4 * 106 células CHO-S en suspensión y se resuspendieron en 1 ml de ProCHO4. Luego se añadieron a las células 0,625 |ig de ADN plasmídicos seguido de 2,5 |ig de polietilenimina (PEI; disolución 1 mg/ml en agua a pH 7,0) por millón de células y se mezclaron suavemente. Se incubaron los cultivos transfectados en una incubadora con agitación a 31°C durante 6 días. Se purificó la proteína del medio de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad de proteína A y luego se dializó frente a PBS.

Caracterización de proteínas

Se analizó adicionalmente el anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de scFv mediante cromatografía de exclusión molecular en una columna Superdex 75 con un aumento 10/300 GL en un dispositivo ÁKTA FPLC.

Para el análisis de ESI-EM, se diluyó el anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de scFv hasta aproximadamente 0,1 mg/ml y se realizó CL-EM en un instrumento Xevo G2XS Qtof de Waters (ESI-ToF-EM) acoplado a un sistema de clase H Acquity UPLC de Waters usando una columna 2,1 * 50 mm Acquity BEH300 C4 de 1,7 |im.

Clonación, purificación y caracterización in vitro del anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de IgG Clonación

Se clonó el gen del anticuerpo IgG1(XE114) en el vector pMM137 usando los métodos descritos en Zuberbuhler et al., Protein Eng. Des. Sel. (2009) 22, 169. Para anular la glicosilación, se mutó la asparagina en la posición 88 del dominio VL del XE114 en formato de IgG1 a glutamina, siguiendo la estrategia descrita en Gébleux et al. In t. J. Cancer (2017) 140, 1670.

Cultivo celular

Se cultivaron en suspensión las células CHO-S transfectadas con el vector pMM137 que codifican para el anticuerpo IgG1(XE114) sin el motivo de glicosilación en medio PowerCHO-2CD, complementado con Ultraglutamine-1, suplemento de HT y antibiótico-antimicótico.

Producción y purificación de proteínas

Se expresó el anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de IgG en células CHO-S mediante expresión génica transitoria. En resumen, en primer lugar se contaron las células CHO en suspensión y se resuspendieron en medio ProCHO recién preparado hasta una concentración de células final de 4 * 106 células/ml. Se añadieron cuidadosamente a las células 0,9 |ig/millón de células de ADN y 2,5 |ig/millón de células de PEI. Se incubaron las células en un agitador a 31°C * 150 rpm durante 6 días. Después de la incubación, se centrifugó la suspensión a 4°C * 6500 rpm durante 25 minutos (rotor SLA-3000) usando una centrífuga Sorvall RC 5C Plus. Se recogió el sobrenadante y se filtró usando una columna PD-10 y se cargó en una columna de proteína A. Después de eso se lavó la columna con 200 ml de tampón A (NaCl 100 mM, EDTA 0,5 mM, Tween 20 al 0,1% en PBS) y luego con 200 ml de tampón B (NaCl 500 mM, EDTA 0,5 mM en PBS). Se eluyó el producto de anticuerpo usando 10-15 ml de glicina 0,1 M a pH = 3 y se recogieron fracciones de 1 ml. Se midió la DO a una absorbancia de 280 nm (DO280) y se combinaron las fracciones que contenían proteína (DO280 > 0,1 mg/ml) y se cargaron en una membrana de diálisis SpectraPor de PM 12-14000 y se dializaron en PBS durante la noche a 4°C. Después de la diálisis, se caracterizó el anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de IgG mediante SDS-PAGE, cromatografía de exclusión molecular y espectrometría de masas.

Mediciones de afinidad

Se realizaron mediciones de afinidad mediante resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIAcore X100 usando un chip CM5 recubierto con CAIX. Se inyectó el anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de scFv como diluciones en serie, en un intervalo de concentración de desde 1 mM hasta 15,7 nM. Se realizó la regeneración del chip mediante HCl 10 mM.

Resultados

Clonación, purificación y caracterización in vitro del anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de scFv Se expresó el anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de scFv en células CHO y se purificó hasta la homogeneidad aprovechando las propiedades de unión del dominio VH del anticuerpo XE114 a la resina de proteína A tal como se describió anteriormente. El anticuerpo producido fue de excelente calidad tal como demuestra el único pico observado por filtración en gel que corresponde a la fracción monomérica (figura 9A). El análisis de EM confirmó que el anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de scFv tenía el peso molecular esperado en condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR) (figura 9B).

Mediciones de afinidad

El análisis de BIAcore confirmó que el anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en formato de scFv podía unirse a CAIX. Los resultados se resumen en la tabla 1.

Tabla 1

Ejemplo 3: Producción y caracterización del conjugado hIL2-XE114-hTNFmut

Material y métodos

Se fusionó simultáneamente el anticuerpo XE114 en formato de scFv sin motivo de glicosilación tanto con interleucina-2 humana (hIL2) como con factor de necrosis tumoral alfa humano (hTNFa). El conjugado hIL2-XE114-hTNFmut es un producto inmunoestimulador completamente humano que reconoce la anhidrasa carbónica IX (CAIX). La IL2 es una citocina que estimula las células efectoras inmunitarias, mientras que el TNF es una citocina proinflamatoria potente. Teniendo en cuenta que el TNF es diez veces más potente que la IL2, para igualar la actividad biológica de las dos citocinas se introdujo una única mutación puntual en el resto de TNF.

Clonación del conjugado h-IL2-XE114-hTNFmut

Se diseñaron cebadores para mutar la asparagina en la posición 88 del dominio VL del anticuerpo XE114 en formato de scFv a glutamina para eliminar el motivo de glicosilación. Además, se diseñaron cebadores para mutar la arginina en la posición 32 del dominio de TNF a alanina. Se amplificó mediante PCR el gen que codifica para el anticuerpo XE114 en formato de scFv sin motivo de glicosilación usando los cebadores “Link-F8VH>“ (SEQ ID NO: 30) y “VL-link(15aa)-lamda ba” (SEQ ID NO: 31). Se amplificó por PCR el gen que codifica para la IL2 humana usando los cebadores “NheI leader>“ (SEQ ID nO: 28) y “hIL2-Li12aa<“ (SEQ ID NO: 32). Se amplificó por PCR el gen que codifica para el TNF humano mutante usando los cebadores “link-hsTNF>“ (SeQ ID NO: 33) y “NotISTOP-hsTNF<“ (SEQ ID NO: 34). Luego se ensamblaron estos tres fragmentos mediante PCR, se digirieron con NheI y NotI y se clonaron en el vector pCDNA 3.1. El conjugado hIL2-XE114-hTNFmut tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 24.

Clonación del conjugado IL2-KSF-TNFmut

Se preparó un conjugado IL2-KSF-TNFmut para actuar como control negativo para el conjugado hIL2-XE114-hTNFmut.

Se diseñaron cebadores para mutar la arginina en la posición 32 del dominio de TNF a alanina. Se amplificó por PCR el gene que codifica para el anticuerpo KSF en formato de scFv usando los cebadores “Link-F8VH>“ (SEQ ID NO: 30) y “VL-link(15aa)-lamda ba” (SEQ ID NO: 31). Se amplificó por PCR el gene que codifica para IL2 humana usando los cebadores “NheI leader >“ (SEQ ID NO: 28) y “hIL2-Li12aa<“ (SEQ ID NO: 32). Se amplificó por PCR el gene que codifica para el TNF humano mutante descrito anteriormente usando los cebadores “link-hsTNF>“ (SEQ ID NO: 33) y “NotISTOP-hsTNF<“ (SEQ ID NO: 34). Luego se ensamblaron los tres fragmentos mediante P_cR, se digirieron con NheI y NotI y se clonaron en el vector pCDNA 3.1.

Producción de conjugados hIL2-XE114-hTNFmut e IL2-KSF-TNFmut

Se expresaron los conjugados hIL2-XE114-hTNFmut e IL2-KSF-TNFmut usando expresión génica transitoria en células CHO-S. Para 1 ml de producción, se centrifugaron 4 * 106 células CHO-S en suspensión y se resuspendieron en 1 ml de ProCHO4. Luego se añadieron a las células 0,625 |ig de ADN plasmídicos seguido de 2,5 |ig de polietilenimina (PEI; disolución 1 mg/ml en agua a pH 7,0) por millón de células y se mezclaron suavemente. Se incubaron los cultivos transfectados en una incubadora con agitación a 31°C durante 6 días. Se purificaron los conjugados del medio de cultivo celular mediante cromatografía de afinidad de proteína A y luego se dializaron frente a PBS. El resultado de la producción de hIL2-XE114-hTNFmut se resume en la tabla 2.

Tabla 2

Caracterización de proteínas

Se realizó SDS-PAGE con geles al 10% en condiciones reductoras y no reductoras. Luego se analizó adicionalmente el conjugado hIL2-XE114-hTNFmut mediante cromatografía de exclusión molecular en una columna Superdex 200 con aumento de 10/300 GL en un dispositivo ÁKTA FPLC.

Mediciones de afinidad

Se realizaron las mediciones de afinidad mediante resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIAcore X100 usando un chip SA recubierto con CAIX. Se inyectaron las muestras como diluciones en serie, en un intervalo de concentración de desde 1 mM hasta 62,5 nM. Se realizó la regeneración del chip mediante HCl 10 mM.

Actividades biológicas

Se determinó la actividad biológica del TNF mediante incubación con fibroblastos LM de ratón, en presencia de 2 |ig/ml de actinomicina D. En placas de 96 pocillos, se incubaron las células en medio complementado con actinomicina D y concentraciones variables de TNF humano recombinante o hIL2- XE114-hTNFmut. Después de 24 horas a 37°C, se determinó la viabilidad celular con disolución Cell Titer Aqueous One. Se expresaron los resultados como el porcentaje de viabilidad celular en comparación con las células tratadas sólo con actinomicina D. Se determinó la actividad biológica de IL2 por su capacidad para estimular la proliferación de células CTLL-2. Se sembraron las células en placas de 96 pocillos en el medio de cultivo complementado con concentraciones variables de las proteínas de fusión. Después de la incubación a 37°C durante 48 horas, se determinó la proliferación celular con disolución Cell Titer Aqueous One.

Citometría de flujo

Se confirmó la expresión del antígeno en células SKRC52 mediante citometría de flujo. Se centrifugaron las células y se lavaron en tampón de FACS frío (BSA al 0,5%, EDTA 2 mM en PBS) y se tiñeron con conjugado hIL2-XE114-hTNFmut (concentración final 10 |ig/ml) y se detectaron con anticuerpo de rata anti-IL2 seguido de tinción con anticuerpo anti-IgG de rata marcado con AlexaFluor488. Se usó IL2-KSF-TNFmut (específico para un antígeno irrelevante) como control negativo.

Estudios de inmunofluorescencia

Se confirmó la expresión de CAIX en cortes de criostato de 8 |im fijados en acetona helada de SKRC52 teñidas con conjugado hIL2-XE114-hTNFmut (concentración final 5 |ig/ml) y se detectó con anticuerpo de rata anti-IL2 y anticuerpo anti-IgG de rata marcado con AlexaFluor488. Para la tinción vascular se usaron los anticuerpos de cabra anti-CD3l y anti-IgG de cabra marcado con AlexaFluor594. Se usó IL2-KSF-TNFmut (específico para un antígeno irrelevante) como control negativo. Se montaron portaobjetos con medio de montaje fluorescente y se analizaron con el microscopio Axioskop2 mot plus.

Para el análisis de inmunofluorescencia ex vivo, a los ratones se les inyectaron 60 ug de conjugado hIL2-XE114-hTNFmut o IL2-KSF-TNFmut y se sacrificaron 24 horas después de la inyección. Se extirparon los órganos y se incrustaron en medio de crioincrustación y se tiñó el corte de criostato (10 |im) usando los siguientes anticuerpos: anticuerpo de rata anti-IL2 y anticuerpo anti-IgG de rata marcado con AlexaFluor488. Para la tinción vascular se usaron los anticuerpos de cabra anti-CD31 y anti-IgG de cabra marcado con AlexaFluor594. Se montaron portaobjetos con medio de montaje fluorescente y se analizaron con el microscopio Axioskop2 mot plus.

Resultados

Caracterización de proteínas

Se expresó el conjugado hIL2-XE114-hTNFmut en células CHO-S y se purificó hasta la homogeneidad aprovechando las propiedades de unión del dominio VH del anticuerpo XE114 a la resina de proteína A tal como se describió anteriormente. El conjugado se produjo con una calidad excelente, tal como demuestra un único pico en la filtración en gel (figura 10 (A)) y una única banda en SDS-Page (figura 10 (B)).

Mediciones de afinidad

El análisis de BIAcore confirmó la capacidad del anticuerpo XE114 sin motivo de glicosilación en el conjugado hIL2-XE114-hTNFmut para reconocer CAIX (figura 11).

Actividades biológicas

El análisis de la actividad in vitro del conjugado hIL2-XE114-hTNFmut indicó que el conjugado hIL2-XE114-hTNFmut y el IL2-KSF-TNFmut, una proteína de fusión basada en IL2 de referencia, mostraron una actividad de IL2 comparable basándose en un ensayo de proliferación de líneas celulares (figura 12 (A)), mientras que la actividad de TNF disminuyó en el TNF mutante presente en el conjugado hIL2-XE114-hTNFmut (figura 12 (B)).

Citometría de flujo

Se evaluó la unión del conjugado hIL2-XE114-hTNFmut a su antígeno relacionado (CAIX) y se confirmó mediante citometría de flujo en células SKRC52 (CAIX+) (figura 13).

Estudios de inmunofluorescencia

Un análisis de microscopía de fluorescencia de cortes de tumor con xenoinjerto SKRC52 confirmó la expresión de CAIX in vivo, mediante tinción con el conjugado hIL2-XE114-hTNFmut (figura 14).

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un miembro de unión específico que se une a anhidrasa carbónica IX (CAIX), en el que el miembro de unión específico comprende un dominio VH y un dominio VL, en el que el dominio VH tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 y el dominio VL tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 20 u 8.
2. El miembro de unión específico según la reivindicación 1, en el que el miembro de unión específico se une al dominio extracelular de CAIX.
3. El miembro de unión específico según la reivindicación 2, en el que el dominio extracelular de CAIX tiene la secuencia de SEQ ID NO: 16.
4. El miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el miembro de unión específico es una molécula de anticuerpo.
5. El miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el miembro de unión es o comprende un Fv de cadena sencilla (scFv), o es una inmunoglobulina G (IgG).
6. El miembro de unión específico según la reivindicación 5, en el que el miembro de unión es una inmunoproteína pequeña (SIP), o un diacuerpo.
7. El miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el miembro de unión se conjuga con un marcador detectable.
8. El miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el miembro de unión se conjuga con una molécula biocida, una molécula citotóxica, o un radioisótopo.
9. El miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el miembro de unión se conjuga con interleucina-2 (IL2) y un mutante de factor de necrosis tumoral (TNF), en el que el mutante de TNF tiene actividad reducida en relación con el TNF de tipo natural.
10. Un miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 o 9, para su uso en un método de tratamiento de cáncer.
11. Un miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en un método de obtención de imágenes, detección o diagnóstico de cáncer.
12. Un miembro de unión específico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en la administración a sitios de cáncer en un paciente de una molécula conjugada con el miembro de unión específico.