ES2534726T3 - Antígeno ED-A del fibrinógeno que está asociado con linfomas - Google Patents

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Abstract

Anticuerpo que se une a la isoforma extradominio A (ED-A) de fibronectina para su uso en un método de tratamiento de linfoma, en el que el anticuerpo se conjuga con una molécula que tiene actividad biocida o citotóxica, o con un radioisótopo.

Description

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DESCRIPCIÓN
Antígeno ED-A del fibrinógeno que está asociado con linfomas
5 La presente invención se refiere a la detección y al tratamiento de linfomas. La invención implica el uso de un anticuerpo que se une a la isoforma ED-A de fibronectina, especialmente un anticuerpo que se une al dominio ED-A de fibronectina.
La angiogénesis describe el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos sanguíneos existentes y es un acontecimiento poco común en el adulto pero es un aspecto característico de muchas enfermedades, incluyendo el crecimiento de tumores sólidos. Se requiere angiogénesis para que los tumores crezcan más allá de algunos milímetros de diámetro y los tumores pueden inducir la angiogénesis a través de la secreción de diversos factores de crecimiento, por ejemplo, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Los nuevos vasos sanguíneos formados como resultado de la angiogénesis se denominan la neovasculatura del tumor, y una neovasculatura
15 vigorosa es un aspecto característico de un tumor agresivo.
La fibronectina (FN) es una glicoproteína que se expresa ampliamente en una variedad de tejidos normales y fluidos corporales. Es un componente de la matriz extracelular (ECM), y desempeña un papel en muchos procesos biológicos, incluyendo adhesión celular, migración celular, hemostasia, trombosis, cicatrización de heridas, diferenciación tisular y transformación oncogénica.
Se generan diferentes isoformas de FN por corte y empalme alternativo de tres regiones (ED-A, ED-B, IIICS) del pre-ARNm de FN de transcrito primario, un proceso que está modulado por citocinas y el pH extracelular (Balza 1988; Carnemolla 1989; Borsi 1990; Borsi 1995). La fibronectina contiene dos extradominios globulares de tipo III que
25 pueden experimentar corte y empalme alternativo: ED-A y ED-B (ffrench-Constant 1995, Hynes 1990, Kaspar et al. 2006). Los ED-A de fibronectina de ratón y fibronectina humana son idénticos en un 96,7% (solo difieren en 3 aminoácidos entre las dos secuencias de 90 aminoácidos, véase la figura 2).
Se ha notificado expresión del ED-A de fibronectina en células tumorales y en tumores sólidos a nivel del ARNm en cáncer de mama (Jacobs et al. 2002, Matsumoto et al. 1999) y cáncer de hígado (Oyama et al. 1989, Tavian et al. 1994) y a nivel de proteína aislada en fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y melanoma (Borsi et al. 1987).
A nivel inmunohistoquímico, se ha detectado la presencia de ED-A en la matriz extracelular (ECM) de tumores odontogénicos (Heikinheimo et al. 1991) y carcinoma hepatocelular (Koukoulis et al. 1995). En cambio, se ha
35 detectado ED-A en el estroma de neoplasias malignas de mama (Koukoulis et al. 1993), y en los vasos sanguíneos y membranas basales de carcinoma de células renales bien diferenciado (Lohi et al. 1995). Sin embargo, en carcinoma de células renales menos diferenciado (Lohi et al. 1995) y carcinoma papilar del tiroides (Scarpino et al. 1999) se ha detectado ED-A en vasos sanguíneos, membranas basales y estroma tumoral. También se ha notificado la presencia de ED-A en la vasculatura de gliomas (Borsi et al. 1998). Por tanto, el patrón de expresión de ED-A notificado para diferentes tipos de tumores es muy variable.
Se muestra en el presente documento que ED-A se expresa selectivamente en la neovasculatura de linfomas. Puesto que los vasos sanguíneos tumorales son fácilmente accesibles para agentes terapéuticos administrados por vía intravenosa (Neri y Bicknell 2005, Rybak et al. 2006, Thorpe 2004, Trachsel y Neri 2006), moléculas de unión
45 tales como moléculas de anticuerpo que se unen a la A-FN y/o el ED-A de fibronectina representan agentes novedosos que pueden usarse para la preparación de un medicamento para el tratamiento de linfomas.
Se ha sugerido previamente un método basado en anticuerpos para el diagnóstico y tratamiento de linfoma (documento EP0603735).
La terapia de la neovasculatura tumoral (que selecciona como diana la vasculatura tumoral) es un enfoque prometedor para el tratamiento de tumores. La selección como diana de la vasculatura tumoral tiene como objetivo alterar la vasculatura dentro del propio tumor, reduciendo el flujo sanguíneo para privar al tumor de oxígeno y nutrientes, provocando la muerte de las células tumorales.
55 En el presente documento se dan a conocer anticuerpos anti-ED-A que reconocen selectivamente los vasos sanguíneos de nueva formación de linfomas.
La presente invención es tal como se expone en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona un anticuerpo que se une a la isoforma extradominio-A (ED-A) de fibronectina para su uso en un método de tratamiento de linfoma, en el que el anticuerpo se conjuga con una molécula que tiene actividad biocida o citotóxica, o con un radioisótopo.
65 La presente invención proporciona un anticuerpo que se une a la isoforma ED-A de fibronectina para su uso en un método in vivo de detección o diagnóstico de linfoma en un ser humano o animal, en el que el anticuerpo se marca
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otros aminoácidos, por ejemplo que forman un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado, o para conferir a la molécula otra característica funcional además de la capacidad de unirse al antígeno. Los miembros de unión pueden portar un marcador detectable, o pueden conjugarse con una toxina o un resto de direccionamiento o una enzima (por ejemplo, mediante un ligador o enlace de peptidilo). Por ejemplo, un miembro de unión puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio enzimático) así como un sitio de unión a antígeno, en el que el sitio de unión a antígeno se une al antígeno y dirige así el sitio catalítico al antígeno. El sitio catalítico puede inhibir la función biológica del antígeno, por ejemplo mediante escisión.
Aunque, tal como se indica, las CDR pueden portarse por armazones distintos de anticuerpos, la estructura para portar una CDR o un conjunto de CDR en general será una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o una parte sustancial de la misma, en la que la CDR o conjunto de CDR se ubica en una ubicación correspondiente a la CDR o conjunto de CDR de dominios variables de anticuerpo VH y VL que se producen de manera natural codificados por genes de inmunoglobulina reorganizados. Las estructuras y ubicaciones de dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse mediante referencia a Kabat 1987, y sus actualizaciones, ahora disponibles en Internet (en immuno.bme.nwu.edu o encontrar “Kabat” usando cualquier motor de búsqueda).
Por región CDR o CDR pretende indicarse las regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina tal como se definen por Kabat et al. (1987), (Kabat 1991a, y ediciones posteriores). Un anticuerpo contiene normalmente 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El término la CDR o las CDR se usa en el presente documento para indicar, según el caso, una de estas regiones o varias, o incluso todas estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácido responsables de la unión por afinidad del anticuerpo al antígeno o el epítopo que reconoce.
Entre las 6 secuencias de CDR cortas, la tercera CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad debido esencialmente a los mecanismos de reorganización de los genes que dan lugar a la misma). Puede ser tan corta como 2 aminoácidos, aunque el mayor tamaño conocido es de 26. Funcionalmente, la HCDR3 desempeña un papel en parte en la determinación de la especificidad del anticuerpo (Segal 1974; Amit 1986; Chothia 1987; Chothia 1989; Caton 1990; Sharon 1990a; Sharon 1990b; Kabat et al., 1991b).
Molécula de anticuerpo
Esto describe una inmunoglobulina ya sea natural o se produzca parcial o totalmente de manera sintética. El término también cubre cualquier polipéptido o proteína que comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Debe entenderse en este caso que la invención no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir no están en su entorno natural sino que pueden haberse aislado u obtenido por purificación a partir de fuentes naturales, u obtenido por recombinación genética, o por síntesis química, y que entonces pueden contener aminoácidos no naturales tal como se describirá más adelante. Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de unión a antígeno del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, moléculas de anticuerpo tales como Fab, Fab’, Fab’-SH, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos.
Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que se unen al antígeno diana. Tales técnicas pueden implicar introducir ADN que codifica para la región variable de inmunoglobulina, o las CDR, de un anticuerpo, en las regiones constantes, o las regiones constantes más las regiones de entramado, de una inmunoglobulina diferente. Véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-184187, GB 2188638A o EPA-239400, y un extenso conjunto de bibliografía posterior. Un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo puede someterse a mutación genética u otros cambios, que pueden alterar o no la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.
Puesto que los anticuerpos pueden modificarse de varios modos, el término “molécula de anticuerpo” debe interpretarse que cubre cualquier miembro de unión o sustancia que tiene un sitio de unión a antígeno del anticuerpo con la especificidad requerida y/o que se une al antígeno. Por tanto, este término cubre fragmentos y derivados de anticuerpo, incluyendo cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión a antígeno del anticuerpo, ya sea natural o total o parcialmente sintético. Por tanto, se incluyen moléculas quiméricas que comprenden un sitio de unión a antígeno del anticuerpo, o equivalente, fusionado con otro polipéptido (por ejemplo, derivado de otra especie
o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo). La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describe en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023, y un extenso conjunto de bibliografía posterior.
Técnicas adicionales disponibles en la técnica de diseño de anticuerpos han hecho posible aislar anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, pueden prepararse hibridomas humanos tal como se describe por Kontermann y Dubel (2001). La presentación en fago, otra técnica establecida para generar anticuerpos, se ha descrito con detalle en muchas publicaciones tales como el documento WO92/01047 (comentado adicionalmente a continuación) y las patentes estadounidenses US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404 y Kontermann y Dubel (2001). Pueden usarse ratones transgénicos en los que se inactivan los genes de anticuerpos del ratón y se sustituyen funcionalmente por genes de anticuerpos humanos, mientras que se dejan intactos otros componentes del sistema inmunitario del ratón, para aislar anticuerpos humanos (Mendez 1997).
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de 1, 7 x 10-8 M o una afinidad que es mejor. Aún más preferiblemente, un anticuerpo para su uso en la invención se une a la A-FN y/o el ED-A de fibronectina con una KD de 1, 4 x 10-8 M o una afinidad que es mejor. Lo más preferiblemente, un anticuerpo para su uso en la invención se une a la A-FN y/o el ED-A de fibronectina con una KD de 3 x 10-9 M o una afinidad que es mejor.
Un anticuerpo para su uso en la presente invención puede unirse al mismo epítopo en A-FN y/o el ED-A de fibronectina que el anticuerpo anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 o G9.
Un anticuerpo para su uso en la invención puede no mostrar ninguna unión significativa a moléculas distintas de la A-FN y/o el ED-A de fibronectina. En particular, el anticuerpo puede no unirse a otras isoformas de fibronectina, por ejemplo la isoforma ED-B y/o la isoforma IIICS de fibronectina.
Las variantes de moléculas de anticuerpo dadas a conocer en el presente documento pueden producirse y usarse en la presente invención. Las técnicas requeridas para hacer sustituciones dentro de las secuencias de aminoácidos de CDR, dominios VH y VL de anticuerpo y anticuerpos, en general están disponibles en la técnica. Pueden hacerse secuencias variantes con sustituciones que puede predecirse o no que tienen un efecto mínimo o beneficioso sobre la actividad, y puede someterse a prueba la capacidad para unirse A-FN y/o el ED-A de fibronectina y/o cualquier otra propiedad deseada.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL cuyas secuencias se dan a conocer específicamente en el presente documento pueden emplearse según la presente invención, tal como se ha comentado. Las variantes particulares pueden incluir una o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos (adición, deleción, sustitución y/o inserción de un residuo de aminoácido), pueden ser de menos de aproximadamente 20 alteraciones, menos de aproximadamente 15 alteraciones, menos de aproximadamente 10 alteraciones o menos de aproximadamente 5 alteraciones, pueden ser 5, 4, 3, 2 ó 1. Las alteraciones pueden hacerse en una o más regiones de entramado y/o una o más CDR. Las alteraciones normalmente no dan como resultado la pérdida de función, de modo que un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos así alterada puede conservar la capacidad para unirse a A-FN y/o el ED-A de fibronectina. Por ejemplo, puede conservar la misma unión cuantitativa que un anticuerpo en el que no se ha hecho la alteración, medido por ejemplo en un ensayo descrito en el presente documento. El anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos así alterada pude tener una capacidad mejorada para unirse a A-FN y/o el ED-A de fibronectina.
Pueden generarse regiones VH o VL novedosas que portan secuencias derivadas de CDR usando mutagénesis al azar de uno o más genes de VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones dentro del dominio variable entero. Por ejemplo, se hacen una o dos sustituciones de aminoácidos dentro de un dominio variable entero o conjunto de CDR. Otro procedimiento que puede usarse es dirigir la mutagénesis a regiones CDR de genes de VH o VL.
Tal como se indicó anteriormente, una secuencia de aminoácidos de CDR sustancialmente tal como se expone en el presente documento puede portarse como una CDR en un dominio variable de anticuerpo humano o una parte sustancial del mismo. Las secuencias de HCDR3 sustancialmente tal como se expone en el presente documento representan realizaciones de la presente invención y por ejemplo cada una de éstas puede portarse como una HCDR3 en un dominio variable de cadena pesada humano o una parte sustancial del mismo.
Pueden obtenerse o derivarse dominios variables de cualquier línea germinal o dominio variable humano reorganizado, o puede ser un dominio variable sintético basado en secuencias consenso o reales de dominios variables humanos conocidos. Un dominio variable puede derivarse de un anticuerpo no humano. Puede introducirse una secuencia de CDR (por ejemplo CDR3) en un repertorio de dominios variables que carecen de una CDR (por ejemplo CDR3), usando tecnología de ADN recombinante. Por ejemplo, Marks et al. (1992) describen métodos de producción de repertorios de dominios variables de anticuerpos en los que se usan cebadores consenso dirigidos a
o adyacentes al extremo 5’ de la zona del dominio variable conjuntamente con cebadores consenso para la tercera región de entramado de genes de VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de una CDR3. Marks et al. describen además cómo este repertorio puede combinarse con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención pueden intercambiarse con repertorios de dominios de VH y VL que carecen de una CDR3, y los dominios VH o VL completos intercambiados pueden combinarse con un dominio VL o VH relacionado para proporcionar anticuerpos para su uso en la invención. El repertorio puede presentarse entonces en un sistema huésped adecuado tal como el sistema de presentación en fago del documento WO92/01047, o cualquiera de un extenso conjunto de bibliografía posterior, incluyendo Kay, Winter y McCafferty (1996), de modo que pueden seleccionarse anticuerpos adecuados. Un repertorio puede consistir en cualquiera a partir de 104 miembros individuales hacia arriba, por ejemplo al menos 105, al menos 106, al menos 107, al menos 108, al menos 109 o al menos 1010 miembros.
De manera similar, una o más, o las tres CDR pueden injertarse en un repertorio de dominios VH y VL que entonces se examina para detectar un anticuerpo o anticuerpos para la A-FN y/o el ED-A de fibronectina.
Puede emplearse una o más de las HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del anticuerpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7,
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E8 o G9, o el conjunto de HCDR, y/o puede emplearse una o más de las LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del anticuerpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 o G9 o el conjunto de LCDR del anticuerpo H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 o G9.
De manera similar, pueden emplearse otros dominios VH y VL, conjuntos de CDR y conjuntos de HCDR y/o conjuntos de LCDR dados a conocer en el presente documento.
La A-FN y/o el ED-A de fibronectina pueden usarse también en un examen para detectar moléculas de anticuerpo, para su uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un linfoma. El examen puede ser un examen de un repertorio tal como se da a conocer en otra parte en el presente documento.
Una parte sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina puede comprender al menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones de entramado intermedias. La parte también puede incluir al menos aproximadamente el 50% de cualquiera o ambas de las regiones de entramado primera y cuarta, siendo el 50% el 50% C-terminal de la primera región de entramado y el 50% N-terminal de la cuarta región de entramado. Residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquellos que normalmente no están asociados con regiones de dominio variable que se producen de manera natural. Por ejemplo, la construcción de anticuerpos producidos por técnicas de ADN recombinante pueden dar como resultado la introducción de residuos N-o C-terminales codificados por ligadores introducidos para facilitar la clonación u otras etapas de manipulación. Otras etapas de manipulación incluyen la introducción de ligadores para unir dominios variables dados a conocer en otra parte en el presente documento a secuencias de proteína adicionales incluyendo regiones constantes de anticuerpo, otros dominios variables (por ejemplo en la producción de diacuerpos) o marcadores detectables/funcionales tal como se comenta con más detalle en otra parte en el presente documento.
Aunque los anticuerpos pueden comprender una pareja de dominios VH y VL, también pueden usarse dominios de unión individuales basados en secuencias de dominios VH o VL en la invención. Se sabe que los dominios de inmunoglobulina individuales, especialmente los dominios VH, pueden unirse a antígenos diana de una manera específica. Por ejemplo, véase la discusión de los dAb anterior.
En el caso de cualquiera de los dominios de unión individuales, estos dominios pueden usarse para examinar dominios complementarios que pueden formar un anticuerpo de dos dominios que puede unirse a A-FN y/o el ED-A de fibronectina. Esto puede conseguirse por métodos de examen de presentación en fago usando el denominado enfoque combinatorio doble jerárquico, tal como se da a conocer en el documento WO92/01047, en el que una colonia individual que contiene un clon de cadena o bien H o bien L se usa para infectar una biblioteca completa de clones que codifican para la otra cadena (L o H) y el anticuerpo de dos cadenas resultante se selecciona según las técnicas de presentación en fago, tales como las descritas en esa referencia. Esta técnica también se da a conocer en Marks, 1992.
Los anticuerpos para su uso en la presente invención pueden comprender además regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas, por ejemplo regiones constantes de anticuerpo humano o partes de las mismas. Por ejemplo, puede unirse un dominio VL en su extremo C-terminal a dominios constantes de cadena ligera de anticuerpo incluyendo las cadenas C o C humanas, por ejemplo, C. De manera similar, un anticuerpo basado en un dominio VH puede unirse en su extremo C-terminal a toda o parte (por ejemplo, un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM, y cualquiera de las subclases de isotipos, en particular IgG1 e IgG4. Cualquier variante de región constante sintética u otra que tenga estas propiedades y estabilice las regiones variables también es útil en realizaciones de la presente invención.
Los anticuerpos para su uso en la invención pueden marcarse con un marcador detectable o funcional. Un marcador puede ser cualquier molécula que produce o que puede inducir la producción de una señal, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes que fluorescen, radiomarcadores, enzimas, agentes quimioluminiscentes o fotosensibilizadores. Por tanto, la unión puede detectarse y/o medirse detectando la fluorescencia o luminiscencia, radiactividad, actividad enzimática o absorbancia de luz. Los marcadores detectables pueden unirse a anticuerpos para su uso en la invención usando química convencional conocida en la técnica.
Hay numerosos métodos mediante los cuales el marcador puede producir una señal detectable por medios externos, por ejemplo, mediante examen visual, radiación electromagnética, calor y reactivos químicos. El marcador también puede unirse a otro miembro de unión que se une al anticuerpo para su uso en la invención, o a un soporte.
Los anticuerpos marcados, por ejemplo scFv marcado con un marcador detectable, pueden usarse con fines de diagnóstico in vivo, ex vivo o in vitro, y/o terapéuticos.
Por ejemplo, los anticuerpos radiomarcados (por ejemplo, anticuerpos conjugados con un radioisótopo) pueden usarse en radiodiagnóstico y radioterapia. Los radioisótopos que pueden conjugarse con un anticuerpo para su uso en la invención incluyen isótopos tales como 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111In, 97Ru, 62Cu,64Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 123I, 124I, 125I y 131I.
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Por ejemplo, un anticuerpo para su uso en la invención marcado con un marcador detectable puede usarse para detectar, diagnosticar o monitorizar un linfoma en un ser humano o animal.
Un anticuerpo tal como se da a conocer en el presente documento puede usarse para la fabricación de un producto de diagnóstico para su uso en el diagnóstico de un linfoma.
La invención también proporciona un anticuerpo para su uso en un método in vivo de diagnóstico de linfoma en un ser humano o animal, en el que el procedimiento comprende las etapas de:
(a)
administrar al ser humano o animal un anticuerpo, por ejemplo marcado con un marcador detectable, que se une a la isoforma ED-A de fibronectina y/o al ED-A de fibronectina, y
(b)
determinar la presencia o ausencia del anticuerpo en el sistema linfático del cuerpo humano o animal;
en el que la localización del anticuerpo en el sistema linfático en el ser humano o animal indica la presencia de un linfoma.
Cuando el anticuerpo está marcado con un marcador detectable, la presencia o ausencia del marcador detectable puede determinarse detectando el marcador.
En la presente invención puede emplearse un conjugado o fusión entre un anticuerpo para su uso en la invención y una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre células diana en las lesiones y un anticuerpo dirigido contra un componente de la matriz extracelular que está presente en tales lesiones. Por ejemplo, la molécula biocida
o citotóxica puede ser interleucina-2 (IL-2), doxorubicina, interleucina-12 (IL-12), interferón- (IFN-y), factor de necrosis tumoral  (TNF) o factor tisular (preferiblemente truncado). Tales conjugados pueden usarse de manera terapéutica, por ejemplo para el tratamiento de linfoma tal como se menciona en el presente documento.
La producción y el uso de fusiones o conjugados de anticuerpos con moléculas biocidas o citotóxica se describe por ejemplo en el documento WO 01/62298.
También se da a conocer en el presente documento un método de tratamiento de linfoma, comprendiendo el procedimiento administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un medicamento que comprende un anticuerpo para su uso en la invención.
El anticuerpo puede ser un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre células diana mediante interacción celular y (ii) un anticuerpo para la isoforma ED-A de fibronectina y/o el ED-A de fibronectina.
La invención también proporciona el uso de un anticuerpo para su uso en la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un linfoma.
El anticuerpo puede estar conjugado o fusionado con una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico tal como se describe en el presente documento. El anticuerpo puede ser un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre células diana mediante interacción celular y (ii) un anticuerpo para fibronectina humana tal como se describe en el presente documento.
También se describe en el presente documento un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre células diana mediante interacción celular y (ii) un anticuerpo para fibronectina humana según el uso en la presente invención. Un conjugado de este tipo comprende preferiblemente una proteína de fusión que comprende la molécula biocida o citotóxica y dicho anticuerpo o, cuando el miembro de anticuerpo es una cadena doble o cadena múltiple, una proteína de fusión que comprende la molécula biocida o citotóxica y un componente de la cadena polipeptídica de dicho anticuerpo. Preferiblemente, el anticuerpo es un polipéptido de cadena sencilla, por ejemplo una molécula de anticuerpo de cadena sencilla, tal como scFv. También puede usarse en la invención una proteína de fusión que comprende la molécula biocida o citotóxica y una molécula de anticuerpo Fv de cadena sencilla.
La molécula biocida o citotóxica que ejerce su efecto sobre células diana mediante interacción celular, puede interaccionar directamente con las células diana, puede interaccionar con un receptor unido a la membrana en la célula diana o alterar el potencial electroquímico de la membrana celular. Las moléculas que interaccionan con un receptor unido a la membrana incluyen quimiocinas, citocinas y hormonas. Los compuestos que alteran el potencial electroquímico de la membrana celular incluyen hemolisina, ionóforos, fármacos que actúan sobre canales iónicos. En realizaciones preferidas a modo de ejemplo, la molécula es la interleucina-2, factor tisular (preferiblemente truncado) o doxorubicina. Otras realizaciones pueden usar interleucina-12, interferón gamma, IP-10 y factor de necrosis tumoral  (TNF-).
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heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células renales de cría de hámster, células de melanoma de ratón NS0, células de mieloma de rata YB2/0, células renales embrionarias humanas, células de retina embrionaria humana y muchas otras.
Pueden elegirse o construirse vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, por ejemplo fagémidos, o virales por ejemplo, fago, según sea adecuado. Para más detalles véase, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001). Se describen en detalle muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructos de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas, en Ausubel 1999.
Una célula huésped puede contener un ácido nucleico tal como se describe en el presente documento. Una célula huésped de este tipo puede estar in vitro y puede estar en cultivo. Una célula huésped de este tipo puede estar in vivo. La presencia in vivo de la célula huésped puede permitir la expresión intracelular de un anticuerpo para su uso en la presente invención como “intracuerpos” o anticuerpos intracelulares. Pueden usarse intracuerpos para terapia génica.
También se da a conocer un método que comprende introducir un ácido nucleico dado a conocer en el presente documento en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción usando retrovirus u otro virus, por ejemplo, virus vaccinia, o para células de insecto, baculovirus. Para la introducción del ácido nucleico en la célula huésped, en particular en una célula eucariota, puede usarse un sistema viral o basado en plásmido. El sistema de plásmido puede mantenerse de manera episomal o puede incorporarse en la célula huésped o en un cromosoma artificial. La incorporación puede ser o bien por integración aleatoria o bien dirigida de una o más copias en un único locus o múltiples locus. Para células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos.
A la introducción le puede seguir provocar o permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo cultivando las células huésped en condiciones para la expresión del gen. La purificación del producto expresado puede lograrse por procedimientos conocidos por el experto en la técnica.
El ácido nucleico puede integrarse en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración puede promoverse mediante la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, según técnicas convencionales.
También se describe un método que comprende usar un constructo tal como se estableció anteriormente en un sistema de expresión con el fin de expresar un anticuerpo o polipéptido tal como también se ha descrito anteriormente.
Los anticuerpos para su uso en la presente invención se diseñan para usarse en métodos de diagnóstico o tratamiento en sujetos humanos o animales, por ejemplo en el ser humano. Los anticuerpos para su uso en la invención pueden usarse en el diagnóstico o tratamiento de linfoma.
Por consiguiente, la invención proporciona el uso de un anticuerpo de este tipo en la fabricación de un medicamento para la administración, por ejemplo, en un método de preparación de un medicamento o una composición farmacéutica que comprende formular el miembro de anticuerpo con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Se conocen bien vehículos farmacéuticamente aceptables y el experto en la técnica los adaptará en función de la naturaleza y el modo de administración del/de los compuesto(s) activo(s) elegido(s).
Los anticuerpos para su uso en la presente invención se administrarán normalmente en forma de una composición farmacéutica, que puede comprender al menos un componente además del anticuerpo. Por tanto, las composiciones farmacéuticas según la presente invención, y para su uso según la presente invención, pueden comprender, además del principio activo, un excipiente, portador, tampón, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por el experto en la técnica. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deben interferir con la eficacia del principio activo. La naturaleza exacta del portador u otro material dependerá de la vía de administración, que puede ser oral, inhalada o mediante inyección, por ejemplo, intravenosa.
Las composiciones farmacéuticas para administración oral, tales como por ejemplo nanocuerpos, etc. también se prevén en la presente invención. Tales formulaciones orales pueden estar en forma de comprimido, cápsula, polvo, líquido o semisólido. Un comprimido puede comprender un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas en general comprenden un portador líquido tal como agua, vaselina, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse disolución salina fisiológica, dextrosa u otra disolución de sacárido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
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Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de la afección, el principio activo estará en forma de una disolución acuosa aceptable por vía parenteral que está libre de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica podrán preparar disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer con lactato. Pueden emplearse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. Los expertos en la técnica conocen muchos métodos para la preparación de formulaciones farmacéuticas. Véase, por ejemplo, Robinson, 1978.
Puede administrarse una composición sola o en combinación con otros tratamientos, de manera simultánea o secuencial, o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, dependiendo de la afección que va a tratarse.
Puede usarse un anticuerpo para su uso en la presente invención como parte de una terapia de combinación conjuntamente con un componente medicinal adicional. Los tratamientos de combinación pueden usarse para proporcionar efectos sinérgicos significativos, en particular la combinación de un anticuerpo para su uso en la presente invención con uno o más fármacos distintos. Un anticuerpo para su uso en la presente invención puede administrarse de manera simultánea o secuencial o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, para el tratamiento de uno o más de los estados enumerados en el presente documento.
Por ejemplo, un anticuerpo para su uso en la invención puede usarse en combinación con un agente terapéutico existente para el tratamiento de linfoma.
Los agentes terapéuticos existentes para el tratamiento de linfomas no Hodgkin incluyen: rituximab; y Cytoxan, hidroxirubicina (adriamicina), Onvobin (vincristina) y prednisona en combinación (régimen de quimioterapia CHOP).
Los agentes terapéuticos existentes para el tratamiento de linfomas de Hodgkin incluyen: adriamicina, bleomicina, vinblastina y dacarbazina en combinación (régimen de quimioterapia ABVD).
Puede usarse un anticuerpo para su uso en la invención y uno o más de los componentes medicinales adicionales anteriores en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para la administración separada o combinada a un individuo, y por consiguiente puede comprender el anticuerpo y el componente adicional como una preparación combinada o como preparaciones separadas. Pueden usarse preparaciones separadas para facilitar la administración separada y secuencial o simultánea, y permiten la administración de los componentes por vías diferentes, por ejemplo, administración oral y parenteral.
Según la presente invención, las composiciones proporcionadas pueden administrarse a mamíferos. La administración puede ser en una “cantidad terapéuticamente eficaz”, siendo esta suficiente para mostrar beneficio a un paciente. Dicho beneficio puede ser al menos la mejora de al menos un síntoma. La cantidad real administrada, y la velocidad y el transcurso de tiempo de la administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que está tratándose, el mamífero particular que está tratándose, el estado clínico del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración de la composición, el tipo de anticuerpo, el método de administración, el calendario de administración y otros factores conocidos por los profesionales médicos. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificación, etc., está dentro de la responsabilidad de los profesionales sanitarios y otros doctores en medicina, y puede depender de la gravedad de los síntomas y/o el avance de la enfermedad que está tratándose. Las dosis adecuadas del anticuerpo se conocen bien en la técnica (Ledermann 1991 y Bagshawe 1991). Pueden usarse las dosificaciones específicas indicadas en el presente documento o en Physician’s Desk Reference (2003) según sean apropiadas para el tipo de medicamento que está administrándose. Una cantidad terapéuticamente eficaz o dosis adecuada de un anticuerpo para su uso en la invención puede determinarse comparando su actividad in vitro y actividad in vivo en un modelo animal. Se conocen métodos de extrapolación de dosificaciones eficaces en ratones y otros animales de prueba a seres humanos. La dosis exacta dependerá de varios de factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico, prevención o para tratamiento, el tamaño y la ubicación de la zona que va a tratarse, la naturaleza exacta del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo entero, fragmento o diacuerpo), y la naturaleza de cualquier marcador detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis de anticuerpo típica estará en el intervalo de 100 g a 1 g para aplicaciones sistémicas, y de 1 g a 1 mg para aplicaciones tópicas. Puede administrarse una dosis de carga inicial superior, seguida de una o más dosis inferiores. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo entero, por ejemplo, el isotipo IgG1 o IgG4. Esta es una dosis para un único tratamiento de un paciente adulto, que puede ajustarse de manera proporcional para niños y lactantes, y también puede ajustarse para otros formatos de anticuerpo en proporción al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse diariamente, dos veces a la semana, a intervalos semanales o mensuales, a discreción del médico. Los tratamientos pueden ser cada dos a cuatro semanas para la administración subcutánea y cada cuatro a ocho semanas para la administración intravenosa. En algunas realizaciones de la presente invención, el tratamiento es periódico, y el periodo entre administraciones es de aproximadamente dos semanas o más, por ejemplo, aproximadamente tres semanas o más, aproximadamente cuatro semanas o más, o aproximadamente una vez al mes. En otras realizaciones de la invención, el tratamiento puede administrarse antes y/o después de una cirugía, y puede administrarse o aplicarse directamente en el sitio anatómico de tratamiento quirúrgico.
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Se amplificó por PCR la secuencia de nucleótidos del antígeno usando cebadores que contenían los sitios de restricción BamHI y BglII en 5’ y 3’ respectivamente. Se digirieron el producto de PCR resultante y el vector pQE12 (QIAGEN) con las endonucleasas de restricción BamHI y BglII y posteriormente se ligaron en una reacción que contenía una razón de inserto con respecto a vector de 3:1. Se secuenció el vector resultante para comprobar que la secuencia era correcta.
Se preparó el antígeno tal como sigue:
Se sometió a electroporación un precultivo electrocompetente de TG1 en 10 ml de 2TY, Amp, glucosa al 1%, en presencia de 1 l de una miniprep. de ADN de 11A12. Entonces se diluyó el precultivo 1:100 (8 ml en 800 ml de 2TY, Amp, glucosa al 0, 1%) y se hizo crecer hasta una DO600 de 0, 4-0, 6 y entonces se indujo con IPTG durante la noche. Al día siguiente, se centrifugaron las células y se filtró el sobrenadante (Millipore 0,22 m). Después de la centrifugación y clarificación del caldo de cultivo, se purificó 11A12 usando una columna Hitrap sobre FPLC. Se regeneró la columna de Ni/ tal como sigue: se enjuagó la columna con 5 volúmenes de columna (VC) de H2O seguido de la aplicación de 3 VC de EDTA 0, 5 M/Tris 0, 2 M pH 8 para lavar el níquel antiguo de la columna. A esto le siguió el enjuagado de la columna con 5 VC de H2O. Entonces volvió a cargarse la columna con 2 VC de NiSO4 100 mM seguido del enjuagado de la columna con varios VC de H2O. Entonces se equilibró la columna con 5 VC de tampón de lisis (imidazol 20 mM/NaCl 250 mM/PBS pH 7, 4). Se filtró el lisado celular (Millipore 0, 45 m) y se cargó sobre la columna (manualmente). Entonces se puso de nuevo la columna sobre FPLC y se dejó que el tampón de lisis fluyera hasta que la señal UV era estable (constante), aproximadamente 3 VC. Entonces se inició el programa de elución: gradiente del 0% al 100% de tampón de elución (imidazol 400 mM/NaCl 250 mM/PBS pH 7, 4) en 5 VC. Se agruparon las fracciones que contenían el antígeno eluido y se dializaron en PBS durante la noche.
Expresión y purificación de los anticuerpos anti-ED-A
Se expresaron y purificaron los anticuerpos anti-ED-A tal como sigue: Se sometió a electroporación un precultivo electrocompetente de TG1 en 10 ml de 2TY, Amp, glucosa al 1%, en presencia de 1 l de una miniprep. de ADN de uno de los anticuerpos anti-ED-A. Entonces se diluyó el precultivo 1:100 (8 ml en 800 ml de 2TY, Amp, glucosa al 0,1%) y se cultivó hasta una DO600 de 0,4-0,6 y entonces se indujo con IPTG durante la noche. Al día siguiente, se centrifugaron las células y se filtró el sobrenadante (Millipore 0,22 m). Se purificó el scFv en una columna de proteína A-Sepharose y se usó trietilamina para eluir los scFv de la columna. Se dializaron las fracciones que contenían los scFv eluidos en PBS durante la noche a 4ºC. Entonces se pusieron las fracciones de scFv en una columna Superdex 75 con PBS fluyendo a 0,5 ml/min y se recogieron fracciones de 0,25 ml. Se usaron las fracciones monoméricas para el análisis de BIAcore.
Análisis de BIAcore 1
Se lavó el chip de BIAcore durante la noche a una velocidad de flujo de 5 l/min con tampón de HBS-EP de BIACORE, Hepes 0,01 M pH 7, 4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005% (el mismo tampón usado para el ensayo). Se diluyó el antígeno (11A12) hasta una concentración de 50 g/ml en tampón acetato (pH 4,0) y se activaron los grupos COOH en el chip mediante inyección de 50 l de una mezcla de N-hidroxisuccinimida (NHS) y etil-N-(dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC). Se inyectaron 40 l del antígeno 11A12 sobre el chip y se bloquearon los grupos COOH libres residuales con 30 l de etanolamina. Después de una filtración a través de 0,22 m, se inyectaron 20 l de cada sobrenadante bacteriano individual sobre el chip y se monitorizó la interacción con el antígeno en tiempo real.
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en la figura 3. La secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-ED-A H1 se muestra en la figura 4.
Las secuencias de nucleótidos preferidas que codifican para VH y/o VL de los anticuerpos anti-ED-A B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 y G9 son idénticas a las secuencias de nucleótidos que codifican para VH y/o VL del anticuerpo anti-ED-A H1, excepto porque las secuencias de nucleótidos que codifican para las CDR1 de H1 de la cadena ligera (VL) y pesada (VH) se sustituyen por las secuencias de nucleótidos que codifican para las CDR1 de la cadena ligera (VL) y pesada (VH) enumeradas en la tabla 1 para el anticuerpo respectivo.
Las secuencias de nucleótidos preferidas que codifican para VH y/o VL del diacuerpo scFv anti-ED-A F8 son idénticas a las secuencias de nucleótidos que codifican para VH y/o VL del anticuerpo anti-ED-A H1, excepto porque las secuencias de nucleótidos que codifican para las CDR1 de H1 de la cadena ligera (VL) y pesada (VH) se sustituyen por las secuencias de nucleótidos que codifican para las CDR1 de la cadena ligera (VL) y pesada (VH) enumeradas en la tabla 1 para el anticuerpo anti-ED-A F8. La secuencia de nucleótidos preferida que codifica para el ligador que une VH y VL del diacuerpo scFv anti-ED-A F8 es gggtccagtggcggt (SEQ ID NO: 29).
Los anticuerpos anti-ED-A B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 y G9 tienen secuencias de aminoácidos idénticas al anticuerpo anti-ED-A H1, excepto porque las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de H1 de la cadena ligera (VL) y pesada (VH) se sustituyen por las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de la cadena ligera (VL) y pesada (VH) enumeradas en la tabla 1 para el anticuerpo respectivo. La secuencia de aminoácidos del diacuerpo scFv antiED-A F8 es idéntica a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-ED-A H1, excepto porque las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de H1 de la cadena ligera (VL) y pesada (VH) se sustituyen por las secuencias de aminoácido de las CDR1 de la cadena ligera (VL) y pesada (VH) enumeradas en la tabla 1 para el anticuerpo antiED-A F8, y la secuencia de aminoácidos del ligador en H1 se sustituye por la secuencia de aminoácidos del ligador GSSGG (SEQ ID NO: 28).
La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A B2 (SEQ ID NO: 21) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VH de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 23.
La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A C5 (SEQ ID NO: 41) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VH de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 43.
La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A D5 (SEQ ID NO: 51) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VH de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 53.
La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A E5 (SEQ ID NO: 61) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VH de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 63.
La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A C8 (SEQ ID NO: 71) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VH de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 73.
La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A F8 (SEQ ID NO: 81) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VH de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 83. El dominio VH del diacuerpo anti-ED-A F8 tiene la misma secuencia de aminoácidos que el dominio VH del anticuerpo anti-ED-A F8 (es decir, SEQ ID NO: 81).
La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A F1 (SEQ ID NO: 91) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VH de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 93.
La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A B7 (SEQ ID NO: 101) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VH de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 103.
La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A E8 (SEQ ID NO: 111) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VH de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 113.
La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A G9 (SEQ ID NO: 31) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VH de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 33.
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La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A B2 (SEQ ID NO: 22) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VL de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 26.
La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A C5 (SEQ ID NO: 42) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VL de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 46.
La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A D5 (SEQ ID NO: 52) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VL de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 56.
La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A E5 (SEQ ID NO: 62) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VL de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 66.
La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A C8 (SEQ ID NO: 72) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 VL de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 76.
La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A F8 (SEQ ID NO: 82) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VL de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 86. El dominio VL del diacuerpo anti-ED-A F8 tiene la misma secuencia de aminoácidos que el dominio VL del anticuerpo anti-ED-A F8 (es decir, SEQ ID NO: 82).
La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A F1 (SEQ ID NO: 92) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VL de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 96.
La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A B7 (SEQ ID NO: 102) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VL de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 106.
La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A E8 (SEQ ID NO: 112) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VL de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 116.
La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A G9 (SEQ ID NO: 32) es idéntica a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-ED-A H1 excepto porque la CDR1 de VL de H1 se sustituye por SEQ ID NO: 36.
Opcionalmente, el aminoácido en la posición 5 del dominio VH de los anticuerpos anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9 y el diacuerpo scFv F8 puede ser un residuo de leucina (L) en lugar de un residuo de valina (V) tal como se muestra en la figura 4A. Además o alternativamente, el aminoácido en la posición 18 del dominio VL de los anticuerpos anti-ED-A H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9 y el diacuerpo scFv F8 puede ser un residuo de arginina (R) en lugar de un residuo de lisina (K) tal como se muestra en la figura 4C.
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30 Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las CDR1 de la cadena pesada (VH) y la cadena ligera (VL) de los anticuerpos anti-ED-A madurados por afinidad
Anticuerpo
CDR1 (VH) CDR1 CVL)
H1
B2
C5
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D5
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C8
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35 Tabla 2 Datos de evaluación de BIAcore
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