KR101781638B1 - 종양 전이의 신생혈관과 관련된 피브리노겐의 ｅｄ-ａ 항원 - Google Patents

종양 전이의 신생혈관과 관련된 피브리노겐의 ｅｄ-ａ 항원 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐암 및 림프종의 검출 및 치료를 위해 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A (ED-A) 이소형에 결합하는 결합원에 관한 것이다.

Description

종양 전이의 신생혈관과 관련된 피브리노겐의 ＥＤ-Ａ 항원{THE ED-A ANTIGEN OF FIBRINOGEN IS ASSOCIATED WITH THE NEOVASCULATURE OF TUMOR METASTASES}
본 발명은 폐암의 검출 및 치료에 관한 것이다. 본 발명은 또한 림프종의 검출 및 치료에 관한 것이다. 본 발명은 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 특히 피브로넥틴의 도메인 ED-A에 결합하는 결합원의 용도에 관한 것이다.
혈관신생은 존재하는 혈관으로부터 새로운 혈관이 성장하는 것을 말하며, 성인에게서는 드물게 나타나지만, 고형 종양의 성장을 비롯하여 여러 질환의 특징적인 면이다. 혈관신생은 종양이 수 밀리미터를 넘는 직경으로 성장가능하게 하며, 종양은 다양한 성장 인자, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 분비를 통해 혈관신생을 유도할 수 있다. 혈관신생의 결과로 형성된 새로운 혈관들은 종양의 신생혈관으로 지칭되며, 다양한 신생혈관은 공격적인 종양의 특징적인 면이다.
피브로넥틴 (FN)은 당단백질이며, 다양한 정상 조직 및 체액에서 널리 발현된다. 이는 세포외 기질 (ECM) 성분이며, 세포 부착, 세포 이동, 지혈, 혈전증, 상처 치유, 조직 분화 및 암으로의 전환을 비롯한 많은 생물학적 과정에서 소정의 역할을 한다.
상이한 FN 이소형은 1차 전사체인 FN 전-mRNA의 세 영역 (ED-A, ED-B, IIICS)에서의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되며, 이 과정은 사이토킨 및 세포외 pH에 의해 조정된다 (발자(Balza)의 1988년 문헌; 카르네몰라(Carnemolla)의 1989년 문헌; 보르시(Borsi)의 1990년 문헌; 보르시의 1995년 문헌). 피브로넥틴은 선택적 스플라이싱을 겪을 수 있는 두 가지 제III형 구상 엑스트라-도메인인 ED-A 및 ED-B를 함유한다 (프렌치-콘스탄트(ffrench-Constant)의 1995년 문헌, 하이네스(Hynes)의 1990년 문헌, 카스파(Kaspar) 등의 2006년 문헌). 마우스 피브로넥틴 및 인간 피브로넥틴의 ED-A는 96.7％ 동일하다 (이들 둘의 90 아미노산 서열 중 3개의 아미노산만이 상이함, 도 2 참조).
피브로넥틴의 ED-A의 발현은 유방암 (야콥(Jacobs) 등의 2002년 문헌, 마츠모토(Matsumoto) 등의 1999년 문헌) 및 간암 (오야마(Oyama) 등의 1989년 문헌, 타비안(Tavian) 등의 1994년 문헌)에서는 mRNA 수준으로, 및 섬유육종, 횡문근육종 및 흑색종에서는 단리된 단백질 수준으로 (보르시 등의 1987년 문헌) 종양 세포 및 고형 종양에서 보고되어 있다.
면역조직화학적 수준에서 ED-A의 존재는 치성 종양 (헤이킨헤이모(Heikinheimo) 등의 1991년 문헌) 및 간세포 암종 (코우코울리스(Koukoulis) 등의 1995년 문헌)의 세포외 매트릭스 (ECM)에서 검출되었다. 이와 달리, ED-A는 악성 유방 신생물의 간질에서 (코우코울리스 등의 1993년 문헌) 및 잘 분화된 신장 세포 암종의 혈관 및 기저막에서 (로이(Lohi) 등의 1995년 문헌)에서 검출되었다. 그러나, 덜 분화된 신장 세포 암종 (로이 등의 1995년 문헌) 및 갑상선의 유두상 암종 (스카피노(Scarpino) 등의 1999년 문헌)에서는 ED-A가 혈관, 기저막 및 종양 간질에서 검출되었다. 교종 혈관계에서도 ED-A의 존재가 보고되었다 (보르시 등의 1998년 문헌). 따라서, 여러 유형의 종양에서 보고된 ED-A의 발현 패턴은 매우 다양하다.
본 발명자들은 본원에서 ED-A가 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암을 비롯한 폐 종양의 신생혈관에서 선택적으로 발현된다는 것을 밝힌다. 종양 혈관이 정맥내로 투여된 치료제에 용이하게 접근할 수 있기 때문에 (네리(Neri) 및 빅넬(Bicknell)의 2005년 문헌, 리박(Rybak) 등의 2006년 문헌, 토르페(Thorpe)의 2004년 문헌, 트라키셀(Trachsel) 및 네리의 2006년 문헌), A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합 분자, 예컨대 항체 분자는 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암을 비롯한 폐암 치료용 의약의 제조에 사용될 수 있는 신규 치료제를 나타낸다.
또한, 본 발명자들은 본원에서 ED-A가 림프종의 신생혈관에서 선택적으로 발현된다는 것을 밝힌다. 종양 혈관이 정맥내로 투여된 치료제에 용이하게 접근할 수 있기 때문에 (네리 및 빅넬의 2005년 문헌, 리박 등의 2006년 문헌, 토르페의 2004년 문헌, 트라키셀 및 네리의 2006년 문헌), A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합 분자, 예컨대 항체 분자는 림프종 치료용 의약의 제조에 사용될 수 있는 신규 치료제를 나타낸다.
종양 신생혈관의 요법 (종양 혈관 표적화)은 종양 치료를 위한 유망한 접근법이다. 종양 혈관 표적화는 종양 그 자체 내의 혈관을 파괴하고, 혈류를 감소시켜 종양으로부터 산소 및 영양소를 고갈시킴으로써, 종양 세포 사멸을 유발하는 것을 목표로 한다.
본원에서는 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암을 비롯한 폐 종양에서 새로 형성된 혈관을 선택적으로 인식하는 항-ED-A 항체를 제공한다.
추가로, 본원에서는 림프종에서 새로 형성된 혈관을 선택적으로 인식하는 항-ED-A 항체를 제공한다.
본 발명은 폐암 치료용 의약의 제조에서의 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A (ED-A) 이소형 (A-FN)에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 폐암 치료용 의약의 제조에서의 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자의 용도를 제공한다.
본 발명은 림프종 치료용 의약의 제조에서의 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A (ED-A) 이소형 (A-FN)에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 림프종 치료용 의약의 제조에서의 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자에 접합된 분자를 폐 종양의 신생혈관으로 전달하기 위한 상기 결합원의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자에 접합된 분자를 폐 종양의 신생혈관으로 전달하기 위한 상기 결합원의 용도를 제공한다. 상기 결합원은 이러한 분자의 전달을 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자에 접합된 분자를 림프종의 신생혈관으로 전달하기 위한 상기 결합원의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자에 접합된 분자를 림프종의 신생혈관으로 전달하기 위한 상기 결합원의 용도를 제공한다. 상기 결합원은 이러한 분자의 전달을 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있다.
본 발명은 폐암 진단용 진단 제품의 제조에서의 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 폐암 진단용 진단 제품의 제조에서의 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자의 용도를 제공한다.
본 발명은 림프종 진단용 진단 제품의 제조에서의 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 림프종 진단용 진단 제품의 제조에서의 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자의 용도를 제공한다.
본 발명은 추가로
(a) 인간 또는 동물에게 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자를 투여하는 단계, 및
(b) 인간 또는 동물 신체의 폐에서 상기 결합원의 존재 또는 부재를 결정하는 단계
를 포함하며, 폐로의 상기 결합원의 국소화는 폐암의 존재를 나타내는 것인, 인간 또는 동물에서 폐암을 검출 또는 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로
(a) 인간 또는 동물에게 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자를 투여하는 단계, 및
(b) 인간 또는 동물 신체의 림프계에서 상기 결합원의 존재 또는 부재를 결정하는 단계
를 포함하며, 인간 또는 동물의 림프계로의 상기 결합원의 국소화는 림프종의 존재를 나타내는 것인, 인간 또는 동물에서 림프종을 검출 또는 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자를 포함하는 의약을 치료 유효량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 폐암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자를 포함하는 의약을 치료 유효량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 폐암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자를 포함하는 의약을 치료 유효량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 림프종을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 결합원, 예를 들면 항체 분자를 포함하는 의약을 치료 유효량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 림프종을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하며 분자에 접합된 결합원, 예를 들면 항체 분자를 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물에서 폐 종양의 신생혈관에 상기 분자를 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 피브로넥틴의 ED-A에 결합하며 분자에 접합된 결합원, 예를 들면 항체 분자를 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물에서 폐 종양의 신생혈관에 상기 분자를 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명은 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하며 분자에 접합된 결합원, 예를 들면 항체 분자를 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물에서 림프종의 신생혈관에 상기 분자를 전달하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 피브로넥틴의 ED-A에 결합하며 분자에 접합된 결합원, 예를 들면 항체 분자를 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물에서 림프종의 신생혈관에 상기 분자를 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9, 또는 그의 변이체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는, 피브로넥틴의 ED-A 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 항체일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 또는 G9, 또는 그의 변이체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는, 피브로넥틴의 ED-A 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 항체이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 항체 F8 또는 그의 변이체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 피브로넥틴의 ED-A 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 항체이다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9의 H 및/또는 L CDR 세트, 또는 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9의 H 및/또는 L CDR 세트 내에 10개 이하, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 상기 개시한 H 및/또는 L CDR 세트를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 또는 G9의 H 및/또는 L CDR 세트 내에 10개 이하, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 상기 개시한 H 및/또는 L CDR 세트를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 항체 F8의 H 및/또는 L CDR 세트 내에 10개 이하, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환을 갖는 상기 개시한 H 및/또는 L CDR 세트를 포함한다.
치환은 잠재적으로 CDR 세트 내의 임의의 잔기에서 이루어질 수 있고, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 내에 있을 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 상기한 바와 같은 하나 이상의 CDR, 예를 들어 CDR3, 및 임의로 CDR1 및 CDR2 또한 포함하여 CDR 세트를 형성할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 또한 항체 분자, 예를 들어 인간 항체 분자를 포함할 수 있다. 결합원은 일반적으로 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 결합원의 VH 도메인 또한 본 발명에 사용하기 위해 제공된다. 각각의 VH 및 VL 도메인 내에는 상보성 결정 영역 ("CDR"), 및 프레임워크 영역 ("FR")이 존재한다. VH 도메인은 HCDR 세트를 포함하고, VL 도메인은 LCDR 세트를 포함한다. 항체 분자는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있다. 이와 달리 또는 이와 함께 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함할 수도 있다. 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9의 VH 및 VL 도메인 및 CDR을 본원에 기재한다. 본원에서 개시하는 모든 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR 세트, HCDR 세트, 및 LCDR 세트는 본 발명에 사용되는 결합원의 실시양태를 나타낸다. 본원에서 기재하는 바와 같은 "CDR 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDR 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 말하고, LCDR 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 말한다. 달리 언급이 없으면, "CDR 세트"에는 HCDR 및 LCDR이 포함된다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 HCDR1은 서열 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 또는 113이며, 임의로 HCDR2는 서열 4이고/이거나 HCDR3은 서열 5이다. 바람직하게는, HCDR1은 서열 23, 33, 43, 53, 73, 83 또는 103이다. 가장 바람직하게는, HCDR1은 서열 83이다.
이하에서 추가로 논의하는 바와 같이 VH 또는 VL 도메인은 단독으로도 항원과 결합하는데 사용될 수 있지만, 전형적으로 VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 이루어 항체 항원-결합 부위를 제공한다. 따라서, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VL 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 LCDR1은 서열 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 또는 116이고, 임의로 LCDR2는 서열 7이고/이거나 LCDR3은 서열 8이다. 바람직하게는, LCDR1은 서열 26, 36, 46, 56, 76, 86 또는 106이다. 가장 바람직하게는, LCDR1은 서열 86이다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 단리된 항체 분자이며, 여기서 VH 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 세트를 포함하고, VL 도메인은 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 및 프레임워크를 포함하며, 여기서
HCDR1은 서열 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 또는 113의 아미노산 서열을 갖고,
HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고,
HCDR3은 서열 5의 아미노산 서열을 갖고,
LCDR1은 서열 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 또는 116의 아미노산 서열을 갖고,
LCDR2는 서열 7의 아미노산 서열을 갖고,
LCDR3은 서열 8의 아미노산 서열을 갖는다.
항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR 세트는 프레임워크 (예를 들어, 인간 프레임워크)에 합체되어 본 발명에서 사용하기 위한 항체 분자를 제공할 수 있다. 프레임워크 영역은 인간 생식세포계열 유전자 분절 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 프레임워크는 생식세포계열일 수 있으며, 이로 인해 프레임워크 내의 하나 이상의 잔기는 가장 유사한 인간 생식세포계열 프레임워크 내의 동등한 위치의 잔기와 일치되도록 바뀐다. 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 인간 생식세포계열 프레임워크, 예를 들어 DP47 내에 HCDR 세트를 포함하는 VH 도메인을 갖는 단리된 항체 분자일 수 있다. 일반적으로, 결합원은 또한, 예를 들어 인간 생식세포계열 프레임워크 내에 LCDR 세트를 포함하는 VL 도메인을 갖는다. VL 도메인의 인간 생식세포계열 프레임워크는 DPK22일 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 VH 도메인은 서열 1, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 또는 111의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 VH 도메인은 서열 21, 31, 41, 51, 71, 81 또는 101의 아미노산 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 VH 도메인은 서열 81의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명에 사용하기 위한 VL 도메인은 서열 2, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 또는 112의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 VL 도메인은 서열 22, 32, 42, 52, 72, 82 또는 102의 아미노산 서열을 갖는다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 VL 도메인은 서열 82의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 펩티드 링커를 통해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv (scFv)일 수 있다. 당업자는 링커의 적절한 길이 및 서열을 선택할 수 있고, 예를 들어 적어도 5개 또는 10개의 아미노산 길이, 최대 약 15개, 20개 또는 25개의 아미노산 길이를 선택할 수 있다. 링커는 아미노산 서열 GSSGG (서열 28)을 가질 수 있다. scFv는 서열 9의 아미노산 서열로 이루어질 수 있거나, 상기 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 일반적으로 비-항체 단백질 골격에서 하나 이상의 CDR, 예를 들어 CDR 세트에 의해 제공되는 비-항체 분자 내의 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 비-항체 및 항체 분자를 포함하는 결합원을 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 기재한다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 살생 또는 세포독성 활성을 갖는 분자에 접합될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 방사성동위원소에 접합될 수 있다. 또다른 대안으로, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 검출가능한 표지로 표지될 수 있다.
본 발명의 이와 같은 측면 및 기타 측면들을 이하에서 보다 상세하게 설명한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 scFv 항-ED-A 항체 D5를 이용하여 원발성 폐 종양 단면을 면역조직화학적으로 염색한 것을 도시한다. 컬럼 1은 폐암의 분류를 나타낸다: A: 소세포 폐암, B: 비-소세포 폐암, C: 편평상피 세포 암종, D: 선암, E: 기관지폐포 암종 및 F: 거대 세포 암종. 컬럼 2 및 3은 여러 아형의 폐 종양으로부터의 조직 단면에서 ED-A의 면역조직화학적 검출을 도시한다. 각 아형에 대해 컬럼 2 및 3에 도시한 조직 단면들은 동일한 종양 시편으로부터 얻었다. 면역조직화학적 염색 (더 어두운 선)은 A: 소세포 폐암 및 B: 비-소세포 폐암 (C: 편평상피 세포 암종, D: 선암, E: 기관지폐포 암종 및 F: 거대 세포 암종) 둘 다의 원발성 종양 단면에서 강한 혈관 패턴의 염색을 나타내었다.
도 2는 A: 인간 ED-A (위쪽 서열) 및 B: 마우스 ED-A (아래쪽 서열)를 서로 정렬시킨 것을 도시한다. 별표는 인간 ED-A 및 마우스 ED-A의 아미노산이 동일한 아미노산 위치를 나타낸다.
도 3A는 항-ED-A 항체 H1 중쇄 (VH)의 뉴클레오티드 서열 (서열 12)을 도시한다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR1의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR2의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 이탤릭체 부분 이다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR3의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 볼드체 부분 이다. 도 3B는 항-ED-A 항체 H1 링커 서열의 뉴클레오티드 서열 (서열 14)을 도시한다. 도 3C는 항-ED-A 항체 H1 경쇄 (VL)의 뉴클레오티드 서열 (서열 13)을 도시한다. 항-ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR1의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR2의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 이탤릭체 부분 이다. 항-ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR3의 뉴클레오티드 서열은 밑줄친 볼드체 부분 이다.
도 4A는 항-ED-A 항체 H1 중쇄 (VH)의 아미노산 서열 (서열 1)을 도시한다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 (서열 3)은 밑줄친 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 (서열 4)은 밑줄친 이탤릭체 부분 이다. 항-ED-A 항체 H1의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 (서열 5)은 밑줄친 볼드체 부분 이다. 도 4B는 항-ED-A 항체 H1 링커 서열의 아미노산 서열 (서열 11)을 도시한다. 도 4C는 항-ED-A 항체 H1 경쇄 (VL)의 아미노산 서열 (서열 2)을 도시한다. 항-ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 (서열 6)은 밑줄친 부분이다. 항-ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 (서열 7)은 밑줄친 이탤릭체 부분 이다. 항-ED-A 항체 H1의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열 (서열 8)은 밑줄친 볼드체 부분 이다.
피브로넥틴
피브로넥틴은 선택적 스플라이싱의 대상이 되는 항원이며, 본원의 다른 곳에서 기재하고 있는 바와 같이 피브로넥틴의 여러 다른 이소형이 공지되어 있다. 엑스트라 도메인-A (EDA 또는 ED-A)는 ED, 엑스트라 제III형 반복 A (EIIIA) 또는 EDI로도 알려져 있다. 인간 ED-A의 서열은 문헌 [Kornblihtt et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868] 및 [Paolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557]에 공개되어 있다. 또한, 인간 ED-A의 서열은 기탁 번호 P02751 하에 기탁된 아미노산 서열의 아미노산 1631-1720 (피브로넥틴 제III형 12; 엑스트라 도메인 2)로서 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스에서 입수가능하다. 마우스 ED-A의 서열은 기탁 번호 P11276 하에 기탁된 아미노산 서열의 아미노산 1721-1810 (피브로넥틴 제III형 13; 엑스트라 도메인 2)로서 스위스프롯 데이터베이스에서 입수가능하다.
피브로넥틴의 ED-A 이소형 (A-FN)은 엑스트라 도메인-A (ED-A)를 함유한다. 인간 A-FN의 서열은 상응하는 인간 피브로넥틴 전구체 서열로부터 추론가능하고, 이는 기탁 번호 P02751로 스위스프롯 데이터베이스에서 입수가능하다. 마우스 A-FN의 서열은 상응하는 마우스 피브로넥틴 전구체 서열로부터 추론가능하고, 이는 기탁 번호 P11276로 스위스프롯 데이터베이스에서 입수가능하다. A-FN은 인간의 피브로넥틴 ED-A 이소형일 수 있다. ED-A는 인간 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A일 수 있다.
ED-A는 선택적 스플라이싱에 의해 피브로넥틴 (FN)에 삽입된 90개의 아미노산 서열이며, FN의 도메인 11 및 12 사이에 위치한다 (문헌 [Borsi et al., 1987, J. Cell Biol., 104, 595-600]). ED-A는 주로 FN의 혈장 형태로는 존재하지 않지만, 배발생, 조직 재형성, 섬유화, 심장 이식 및 고형 종양 성장 동안 풍부해진다.
선택적 스플라이싱
선택적 스플라이싱이란 DNA의 1차 RNA 전사체에서 상이한 스플라이싱 패턴이 일어나 상이한 mRNA가 생성되는 것을 말한다. 인트론의 절단 이후 선택에 의해 어떤 엑손들이 함께 스플라이싱되어 mRNA를 형성할 것인지 결정될 수 있다. 선택적 스플라이싱은 상이한 엑손 및/또는 상이한 수의 엑손을 함유하는 상이한 이소형이 생성되도록 한다. 예를 들어, 하나의 이소형은 하나 이상의 엑손에 상응하는 부가적인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이것은 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다.
림프종
이는 림프구로 불리는 면역계의 세포와 연관된 암의 유형을 말하며, 이들 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 한다. 여러 상이한 아형의 림프종이 있으며, 이들은 두 개의 주요 카테고리로서 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종으로 분류될 수 있다. 호지킨 림프종은 특이적인 비정상 B 림프구 계통으로부터 발병한 것인데 반해, 비-호지킨 림프종은 비정상 B, T 또는 NK 세포로부터 유래될 수 있으며, 이들은 독특한 유전자 마커에 의해 구별된다. 버킷(Burkitt) 림프종은 B-세포 비-호지킨 림프종의 한 예이다. 본원에 언급된 림프종은 원발성 림프종일 수 있다. 본원에 언급된 림프종은 호지킨 림프종 또는 비-호지킨 림프종일 수 있다. 바람직하게는, 본원에 언급된 림프종은 원발성 호지킨 림프종 또는 원발성 비-호지킨 림프종이다.
폐암
이는 폐 조직의 악성 변형 및 팽창을 말한다. 폐암은 두 개의 주요 카테고리로서 소세포 폐암 (소세포 암종) 및 비-소세포 폐암으로 분류된다. 비-소세포 폐암의 아형은 편평상피 세포 암종, 선암 (선암종) 및 거대 세포 암종이다. 기관지폐포 암종은 선암의 아형이다. 본원에 언급된 폐암은 원발성 폐암일 수 있다. 폐 종양은 동물 (예를 들면, 인간)의 폐에서의 종양이며, 폐암의 결과이다. 본원에 언급된 폐 종양은 원발성 폐 종양일 수 있다.
원발성 종양
이는 종양이 최초로 발생한 부위 (원발성 부위)에서의 종양을 말한다. 원발성 종양은 때때로 그의 원래 부위 (원발성 부위)로부터 전파되어, 동물 신체의 다른 부위에서 속발성 종양 (전이)을 형성하며, 이러한 전파는 전이로 지칭된다.
결합원
이는 서로 결합하는 한 쌍의 분자 중의 한 일원을 말한다. 결합 쌍의 일원은 천연적으로 유래될 수 있거나, 또는 전체 또는 일부가 합성에 의해 생성될 수 있다. 분자의 쌍 중 한 일원은 그의 표면 상에 소정의 영역 또는 공동을 갖고, 그곳은 분자의 쌍 중 다른 일원의 특정한 공간적 및 극성 구성에 결합되며, 따라서 그에 상보적이다. 결합쌍 유형의 예로는 항원-항체, 바이오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이 있다. 본 발명은 항원-항체 유형의 반응에 관한 것이다.
결합원은 보통 항원-결합 부위를 갖는 분자를 포함한다. 예를 들어, 결합원은 항원-결합 부위를 포함하는 항체 분자 또는 비-항체 단백질일 수 있다.
항원 결합 부위는 피브로넥틴 또는 시토크롬 B 등과 같은 비-항체 단백질 골격 상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 배열에 의해 (한(Haan) 및 마고스(Maggos)의 2004년 문헌; 코이데(Koide)의 1998년 문헌; 니그렌(Nygren)의 1997년 문헌), 또는 목적하는 표적에 대해 결합 특이성을 부여하기 위한 단백질 골격 내 루프의 아미노산 잔기의 무작위화 또는 돌연변이화에 의해 제공될 수 있다. 단백질 내에 신규한 결합 부위를 조작하기 위한 골격은 니그렌 등의 1997년 문헌에서 상세하게 검토한 바 있다. 항체 모방체에 대한 단백질 골격은 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 WO/0034784에 개시되어 있고, 여기서 그 발명자들은 적어도 하나의 무작위화된 루프를 갖는 피브로넥틴 제III형 도메인을 포함하는 단백질 (항체 모방체)을 기재하고 있다. 하나 이상의 CDR, 예를 들어 HCDR 세트에 합체되기에 적합한 골격은 이뮤노글로불린 유전자 상과의 임의의 도메인 일원에 의해 제공될 수 있다. 그 골격은 인간 단백질이거나 비-인간 단백질일 수 있다. 비-항체 단백질 골격의 장점은, 적어도 일부 항체 분자에 비해 작으며 및/또는 제조가 용이한 골격 분자 내의 항원-결합 부위를 제공할 수 있다는 것이다. 크기가 작은 결합원은 세포로 진입하거나, 조직으로 깊이 침투하거나, 다른 구조체 내의 표적에 도달하거나, 또는 표적 항원의 단백질 공동 내에서 결합하는 능력과 같은 유용한 생리적 특성을 부여할 수 있다. 비-항체 단백질 골격 내의 항원 결합 부위의 용도는 웨스(Wess)의 2004년 문헌에서 검토되었다. 전형적인 것으로는 안정한 뼈대와 하나 이상의 가변 루프를 갖는 단백질이 있고, 루프 또는 루프들의 아미노산 서열은 특이적으로 또는 무작위로 돌연변이되어, 표적 항원에 결합하는 항원-결합 부위를 생성한다. 그러한 단백질로는 에스. 아우레우스(S. aureus) 유래의 단백질 A의 IgG-결합 도메인, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴 (예를 들어, 10 번째 피브로넥틴 제III형 도메인) 및 리포칼린이 있다. 다른 접근법으로는 합성 "마이크로바디(Microbodies)" (셀레코어 게엠베하(Selecore GmbH))가 있으며, 이는 분자내 디술파이드 결합을 갖는 작은 단백질인 시클로타이드를 기재로 한다.
항체 서열 및/또는 항원-결합 부위 뿐만 아니라, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은, 예를 들어 폴딩 도메인과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하는 다른 아미노산, 또는 항원에 결합하는 능력 이외에도 또다른 기능적 특성을 분자에 부여하기 위한 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 검출가능한 표지를 보유할 수 있거나, 또는 (예를 들어, 펩티드 결합 또는 링커를 통해) 독소 또는 표적화 모이어티 또는 효소에 접합될 수 있다. 예를 들어, 결합원은 항원 결합 부위 뿐만 아니라, (예를 들어, 효소 도메인 내에) 촉매 부위를 포함할 수 있고, 상기 항원 결합 부위는 항원에 결합하여 촉매 부위를 항원으로 표적화한다. 촉매 부위는, 예를 들어 절단에 의해 항원의 생물학적 기능을 억제할 수 있다.
주지되어 있는 바와 같이, CDR은 비-항체 골격에 의해 보유될 수 있지만, 본 발명의 CDR 또는 CDR 세트를 보유하는 구조체는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서열이거나, 또는 CDR 또는 CDR 세트가 재배열된 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 천연 발생 VH 및 VL 항체 가변 영역의 CDR 또는 CDR 세트에 상응하는 위치에 위치하는 그의 실질적인 부분일 것이다. 이뮤노글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 카벳(Kabat)의 1987년 문헌 및 그의 개정판을 참조하여 결정할 수 있고, 현재 인터넷으로 입수가능하다 (immuno.bme.nwu.edu 또는 임의의 검색 엔진에서 "Kabat"을 쳐서 찾을 것) .
CDR 영역 또는 CDR에 의해, 카벳 등의 1987년 문헌 (카벳의 1991a년 문헌 및 이후 개정판)에서 정의된 바와 같은 이뮤노글로불린의 중쇄 및 경쇄의 초가변영역을 나타내는 것으로 의도된다. 항체는 전형적으로 3개의 중쇄 CDR과 3개의 경쇄 CDR을 함유한다. 본원에서 용어 CDR은 경우에 따라, 항체가 인식하는 항원 또는 에피토프에 대해 항체의 친화성에 의한 결합을 담당하는 대부분의 아미노산 잔기를 함유하는 영역 중 하나 또는 몇 개, 또는 심지어 전체 영역을 나타내기 위해 사용된다.
여섯 개의 짧은 CDR 서열 중에서, 중쇄의 세 번째 CDR (HCDR3)은 보다 큰 크기의 변이성 (본질적으로 유전자의 배열을 일으키는 메커니즘으로 인해 보다 큰 다양성)을 갖는다. 이는 2개의 아미노산 만큼 짧을 수도 있지만, 알려져 있는 가장 긴 크기는 26이다. 기능적으로, HCDR3은 항체의 특이성 결정에 있어서 부분적으로 소정의 역할을 한다 (세갈(Segal)의 1974년 문헌; 아미트(Amit)의 1986년 문헌; 코티아(Chothia)의 1987년 문헌; 코티아의 1989년 문헌; 캐톤(Caton)의 1990년 문헌; 샤론(Sharon)의 1990a년 문헌; 샤론의 1990b년 문헌; 카벳 등의 1991b년 문헌).
항체 분자
이는 천연적으로 생성되거나 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성에 의해 생성된 이뮤노글로불린을 말한다. 또한 이 용어는 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포괄한다. 본원에서 본 발명은 천연 형태의 항체에 관한 것이 아니며, 다시 말하면 항체는 천연 환경 내에 존재하는 것은 아니지만, 천연 공급원으로부터 정제에 의해 단리 또는 수득될 수 있거나, 유전자 재조합 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있는 것이며, 따라서 이하에서 설명하는 바와 같은 비천연 아미노산을 함유할 수 있는 것임이 이해되어야 한다. 항체 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편으로는 항체 분자, 예컨대 Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd, 및 디아바디가 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
모노클로날 및 기타 항체를 가지고 재조합 DNA 공학 기술을 이용하여 표적 항원에 결합하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생성할 수 있다. 그러한 기술은 항체의 이뮤노글로불린 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 상이한 이뮤노글로불린의 불변 영역 또는 불변 역역에 더하여 프레임워크 영역에 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400, 및 광범위한 후속 문헌을 참조한다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포는 유전자 돌연변이 또는 다른 변화의 대상이 될 수 있고, 생산되는 항체의 결합 특이성을 변화시키거나 그렇지 않을 수 있다.
항체는 수많은 방식으로 변형될 수 있기 때문에, 용어 "항체 분자"는 요구되는 특이성을 가진 항체 항원-결합 부위를 갖고/갖거나 항원에 결합하는 임의의 결합원 또는 물질을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 이 용어는 천연적이거나 전체적으로 또는 부분적으로 합성된 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 비롯한 항체 단편 및 유도체를 포괄한다. 따라서, 다른 폴리펩티드 (예를 들어, 다른 종 유래의 것 또는 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 것)에 융합된, 항체 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 분자 또는 그의 등가물도 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 및 광범위한 후속 문헌에 기재되어 있다.
항체 조작 분야에서 이용가능한 추가의 기술은 인간 항체 및 인간화 항체의 단리를 가능하게 하였다. 예를 들어, 인간 하이브리도마는 콘터만(Kontermann) 및 두벨(Dubel)의 2001년 문헌에 기재되어 있는 바와 같이 제조할 수 있다. 결합원을 생성하는 또다른 확립된 기술인 파지 디스플레이는 WO92/01047 (이하에서 추가로 논의함) 및 미국 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404, 및 콘터만 및 두벨의 2001년 문헌과 같은 많은 공개문헌들에 상세하게 기재되어 있다. 마우스 면역계의 다른 성분들은 손상시키지 않고, 마우스 항체 유전자가 불활성화되고 인간 항체 유전자로 기능적으로 대체된 트렌스제닉 마우스를 인간 항체를 단리하는데 사용할 수 있다 (멘데즈(Mendez)의 1997년 문헌).
합성 항체 분자는, 예를 들어 내픽(Knappik) 등의 2000년 문헌 또는 크렙스(Krebs) 등의 2001년 문헌에 기재되어 있는 바와 같이, 적합한 발현 벡터 내에서 합성되고 조립된 올리고뉴클레오티드에 의해 생성되는 유전자로부터의 발현에 의해 제조될 수 있다.
전체 항체의 단편은 항원에 결합하는 기능을 수행할 수 있음이 알려져 있다. 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (와드(Ward)의 1989년 문헌; 맥카퍼티(McCafferty)의 1990년 문헌; 홀트(Holt)의 2003년 문헌); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가의 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 두 개의 도메인을 회합시켜 항원 결합 부위를 형성하게 하는 펩티드 링커에 의해 연결된 단일쇄 Fv 분자 (scFv) (버드(Bird)의 1988년 문헌; 휴스톤(Huston)의 1988년 문헌); (viii) 이중특이적 단일쇄 Fv 이합체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제조된 다가 또는 다중특이적 단편인 "디아바디" (WO94/13804; 홀리거(Holliger)의 1993a년 문헌)가 있다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디술파이드 가교의 도입에 의해 안정화될 수 있다 (라이터(Reiter)의 1996년 문헌). CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디 또한 제조할 수 있다 (후(Hu)의 1996년 문헌). 결합 단편의 다른 예로는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 수 개의 잔기, 예컨대 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인이 부가됨으로 인해 Fab 단편과는 상이한 Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab' 단편인 Fab'-SH가 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항체 단편은 본원에서 기재하는 임의의 항체 분자, 예를 들어 본원에서 기재하는 임의의 항체의 VH 및/또는 VL 도메인 또는 CDR을 포함하는 항체 분자로부터 출발하여, 펩신 또는 파파인과 같은 효소에 의한 및/또는 화학적 환원에 의한 디술파이드 가교의 절단에 의한 소화와 같은 방법에 의해 수득할 수 있다. 다른 방식으로, 본 발명의 항체 단편은 당업자들에게 널리 알려져 있는 것과 같은 유전자 재조합 기술에 의해, 또는 예를 들어 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 사 등에 의해 공급되는 것과 같은 자동 펩티드 합성기에 의한 펩티드 합성에 의해, 또는 핵산 합성 및 발현에 의해 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 항체 단편은 화학적 변형, 특히 페길화에 의해, 또는 리포좀으로의 도입에 의해 그의 반감기가 증가된 임의의 기능성 단편을 포함한다.
dAb (도메인 항체)는 항체, 즉 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역의 작은 단량체 항원-결합 단편이다 (홀트의 2003년 문헌). VH dAb는 반추동물과 (camelid, 예를 들어, 낙타, 라마)에서 천연적으로 발생되며, 반추동물의 표적 항원으로의 면역화, 항원-특이적 B 세포의 단리 및 개별 B 세포로부터 dAb 유전자의 직접 클로닝에 의해 생성될 수 있다. dAb는 또한 세포 배양으로도 생성될 수 있다. 그들의 작은 크기, 양호한 가용성 및 온도 안정성은 그들을 특히 생리적으로 유용하게 하고 선택 및 친화성 성숙에 적합하게 한다. 본 발명의 결합원은 본원에서 실질적으로 설명한 바와 같은 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb일 수 있거나, 또는 본원에서 실질적으로 설명한 바와 같은 CDR 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb일 수 있다.
본원에서 사용되는 문구 "실질적으로 설명한 바와 같은"이란 본원에서 기재한 결합원의 VH 또는 VL 도메인의 관련 CDR의 특징(들)이 본원에서 설명한 바와 같은 구체화된 영역의 서열과 동일하거나 매우 유사할 것임을 말한다. 본원에서 하나 이상의 가변 도메인의 구체화된 영역(들)과 관련하여 기재하는 문구 "매우 유사한"이란 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인 내에 1 내지 약 5개, 예를 들어 1 내지 4개, 예컨대 1 내지 3개, 또는 1개 또는 2개, 또는 3개 또는 4개의 아미노산 치환이 있을 수 있음을 의도한다.
이중특이적 또는 이관능성 항체는 두 개의 상이한 가변 영역이 동일한 분자 내에서 합쳐진 제2 세대 모노클로날 항체를 형성한다 (홀리거(Holliger)의 1999년 문헌). 새로운 이펙터 기능이 보강되거나 종양 세포의 표면 상의 수 개의 분자를 표적화하는 그들의 능력으로 인해 진단 분야 및 치료 분야 모두에서 이들의 용도가 증명되었다. 이중특이적 항체를 사용하고자 할 경우, 이는 예를 들어 화학적으로 제조되거나 하이브리드 하이브리도마로부터 다양한 방식으로 제조될 수 있는 통상적인 이중특이적 항체일 수 있거나 (홀리거의 1993b년 문헌), 또는 상기에서 언급한 바와 같은 임의의 이중특이적 항체 단편일 수 있다. 이들 항체는 화학적 방법에 의해 (글레니(Glennie)의 1987년 문헌; 렙(Repp)의 1995년 문헌) 또는 체세포적 방법에 의해 (스태즈(Staerz)의 1986년 문헌; 수레쉬(Suresh)의 1986년 문헌), 마찬가지로 이종이합체화가 일어나게 하여 목적하는 항체의 정제 과정을 용이하게 하는 유전자 조작 기술에 의해 (머챈드(Merchand)의 1998년 문헌) 수득할 수 있다. 이중특이적 항체의 예로는, 서로 다른 특이성을 갖는 2개의 항체의 결합 도메인을 사용하고, 이들을 짧은 가요성 펩티드를 통해 직접 연결시킬 수 있는 바이트(BiTe™) 공학의 항체가 있다. 이것은 짧은 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 두 개의 항체를 합한 것이다. 디아바디 및 scFv는 오직 가변 영역만을 이용하여 Fc 영역없이 제조될 수 있고, 이는 항-개체특이적 반응 효과를 잠재적으로 감소시킨다.
이중특이적 항체는 전체 IgG로서, 이중특이적 Fab'2로서, Fab'PEG로서, 디아바디로서, 또는 이중특이적 scFv로서 제조될 수 있다. 추가로, 당업계 공지의 통상적인 방법을 이용하여 두 개의 이중특이적 항체를 연결하여 4가 항체를 형성할 수 있다.
이중특이적 전체 항체와 대조적으로 이중특이적 디아바디는 이. 콜라이(E. Coli)에서 용이하게 제조되고 발현될 수 있기 때문에 역시 특히 유용할 수 있다. 적절한 결합 특이성을 갖는 디아바디 (및 항체 단편과 같은 그 밖의 여러 폴리펩티드)는 라이브러리로부터의 파지 디스플레이 (WO94/13804)를 이용하여 용이하게 선택될 수 있다. 디아바디의 한쪽 팔이 예를 들어 표적 항원에 대해 특이성을 갖도록 불변으로 유지될 경우, 나머지 팔이 가변적이고 적절한 특이성을 갖는 항체가 선택된 라이브러리를 제조할 수 있다. 이중특이적 전체 항체는 릿지웨이(Ridgeway)의 1996년 문헌에 기재되어 있는 바와 같은 대안적인 조작 방법에 의해 제조할 수 있다.
표적 항원에 대한 항체를 얻기 위해 당업계의 다양한 방법들을 이용할 수 있다. 항체는 특히 인간, 뮤린, 키메라 또는 인간화 기원의 모노클로날 항체일 수 있고, 이는 당업자에게 널리 알려진 표준 방법에 따라 얻을 수 있다.
일반적으로, 특히 뮤린 기원의 모노클로날 항체 또는 그의 기능성 단편을 제조하기 위해, 특히 매뉴얼 "Antibodies" (할로우(Harlow) 및 레인(Lane)의 1988년 문헌)에 기재되어 있는 기술이나 콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 1975년 문헌에 기재된 하이브리도마로부터의 제조 기술을 참고하는 것이 가능하다.
모노클로날 항체는, 예를 들어 A-FN, 또는 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 그의 단편 중 하나, 예를 들어 ED-A를 포함하거나 그것으로 이루어진 단편, 또는 ED-A의 펩티드 단편에 대해 면역화된 동물 세포로부터 얻을 수 있다. A-FN 또는 그의 단편 중 하나는 특히 통상적인 제조 방법에 따라, A-FN 또는 그의 단편을 코딩하는 cDNA 서열에 함유되어 있는 핵산 서열로부터 출발하는 유전자 재조합에 의해, 또는 A-FN 및/또는 그의 단편의 펩티드 서열을 구성하는 아미노산 서열로부터 출발하는 펩티드 합성에 의해 생성할 수 있다.
모노클로날 항체는, 예를 들어 상기 모노클로날 항체에 의해 인식되는 에피토프를 함유하는 A-FN 또는 그의 단편 중 하나, 예를 들어 ED-A를 포함하거나 그것으로 이루어진 단편, 또는 ED-A의 펩티드 단편이 미리 고정되어 있는 친화성 컬럼 상에서 정제될 수 있다. 모노클로날 항체는 단백질 A 및/또는 G 상에서의 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있고, 그 자체 내에 존재하는 잔여 단백질 오염물 뿐만 아니라 DNA 및 LPS를 제거하기 위한 이온-교환 크로마토그래피가 후속되거나 후속되지 않고, 이합체 또는 기타 다합체의 존재로 인한 잠재적인 응집을 제거하기 위한 세파로스 겔 상에서의 배제 크로마토그래피가 후속되거나 후속되지 않는다. 이러한 기술은 전부 동시에 사용하거나 연속적으로 사용할 수 있다.
항원-결합 부위
이는 표적 항원의 전체 또는 일부에 결합하고 그에 상보적인 분자의 부분을 말한다. 항체 분자에서 이는 항체 항원-결합 부위라 불리고, 표적 항원의 전체 또는 일부에 결합하고 그에 상보적인 항체의 부분을 포함한다. 항원이 큰 경우에 항체는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있고, 그 부분을 에피토프라 부른다. 항체 항원-결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항체 항원-결합 부위는 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함할 수 있다.
단리된
이는 본 발명에 사용하기 위한 결합원 또는 그러한 결합원을 코딩하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 따른 것이 되는 상태를 말한다. 즉, 본 발명의 결합원, VH 및/또는 VL 도메인은, 예를 들어 그들의 천연 환경으로부터 단리 및/또는 정제되어 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로 제공될 수 있거나, 또는 핵산의 경우에는, 유리되거나 실질적으로 유리된 핵산, 또는 요구되는 기능을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 서열과는 다른 기원의 유전자로 제공될 수 있다. 단리된 일원 및 단리된 핵산에는, 그들과 천연적으로는 회합하는 물질, 예컨대 그들의 천연 환경 또는 그들이 제조되는 환경 (예를 들어, 세포 배양) (그러한 제조가 시험관내 또는 생체내에서 행해지는 재조합 DNA 기술에 의한 것일 경우)에서 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 없거나 실질적으로 없을 것이다. 일원 및 핵산은 희석제 또는 보조제와 함께 제형화될 수 있고, 역시 실질적인 목적을 위해 단리될 수 있으며, 예를 들어 면역검정법에 사용하기 위한 미세역가 플레이트를 코팅하는데 사용되는 경우 일반적으로 상기 일원은 젤라틴 또는 기타 담체와 함께 혼합될 것이고, 또는 진단 또는 치료에 사용되는 경우 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 혼합될 것이다. 결합원은 천연적으로 또는 이종 진핵 세포계에 의해 (예를 들어, CHO 또는 NS0 (ECACC 85110503) 세포) 글리코실화될 수 있거나, 또는 (예를 들어, 원핵 세포에서의 발현에 의해 생성되는 경우에는) 글리코실화되지 않을 수 있다.
또한, 항체 분자를 포함하는 불균일 제제도 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 그러한 제제는 전장 중쇄 및 C-말단 리신이 결여된 중쇄를 갖고, 글리코실화의 정도가 다양하고/하거나 유도체화된 아미노산, 예를 들어 N-말단 글루탐산이 고리화되어 형성된 피로글루탐산 잔기를 갖는 항체들의 혼합물일 수 있다.
항원, 예를 들어 A-FN 또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 하나 이상의 결합원은, 본 발명에 따른 결합원의 라이브러리를 항원 또는 그의 단편, 예를 들어 ED-A를 포함하거나 그것으로 이루어진 단편 또는 ED-A의 펩티드 단편과 접촉시키고, 항원에 결합할 수 있는 라이브러리의 하나 이상의 결합원을 선택함으로써 수득할 수 있다.
항체 라이브러리는 반복 콜로니 필터 스크리닝(Iterative Colony Filter Screening, ICFS)을 이용하여 스크리닝할 수 있다. ICFS에서는, 몇몇 결합 특이성을 코딩하는 DNA를 함유하는 박테리아를 액체 배지에서 성장시키고, 지수 성장 단계에 이르면, 수 십억 마리의 박테리아를 적합하게 전처리된 멤브레인 필터로 이루어진 성장 지지체 상에 분포시키고, 이를 완전히 전면배양된 박테리아 콜로니가 출현할 때까지 인큐베이션한다. 제2 트랩 기질은 예비 습윤화되고 목적하는 항원으로 덮힌 다른 멤브레인 필터로 이루어진다.
이어서, 트랩 멤브레인 필터를 적합한 배양 배지를 함유하는 플레이트 상에 놓고, 박테리아 콜로니가 위로 향하도록 덮힌 표면을 가진 성장 필터로 덮는다. 이렇게 하여 얻어진 샌드위치를 실온에서 약 16 시간 동안 인큐베이션한다. 이로써, 확산 작용을 가진 항체 단편 scFv를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있고, 트랩 멤브레인 상에 존재하는 항원과 특이적으로 결합하는 단편들이 트랩핑된다. 이어서, 결합된 항체 단편 scFv를 표출시키기 위한 목적으로 일반적으로 사용되는 비색정량 기술을 이용하여 트랩 멤브레인에 대해 결합된 항체 단편 scFv를 표출시키는 처리를 행한다.
트랩 필터 상의 발색 지점의 위치는 성장 멤브레인 상에 존재하며 트랩핑된 항체 단편을 생산하는 상응하는 박테리아 콜로니를 추적할 수 있게 한다. 그러한 콜로니들을 모아서 성장시키고, 그들 중 수 백만 마리의 박테리아를 새로운 배양 멤브레인 상에 분포시키고, 상기 과정을 반복한다. 이어서, 트랩 멤브레인 상의 양성 신호가 단일의 양성 콜로니와 상응하게 될 때까지 유사한 사이클을 수행하며, 상기 각 콜로니는 선택에 사용되는 항원에 대한 모노클로날 항체 단편의 잠재적인 공급원을 나타낸다. ICFS는, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 WO0246455에 기재되어 있다. 라이브러리는 또한 입자 또는 분자 복합체, 예를 들어 박테리오파지 (예를 들어, T7) 입자와 같은 복제가능한 유전자 패키지, 또는 기타 시험관내 디스플레이 시스템 상에서 디스플레이될 수 있고, 각 입자 또는 분자 복합체는 그 위에 디스플레이된 항체 VH 가변 도메인, 및 임의로 존재하는 경우 디스플레이된 VL 도메인을 코딩하는 핵산을 함유하는 것이다. 파지 디스플레이는 WO92/01047 및, 예를 들어 미국 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 및 US6521404에 기재되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
항원에 결합할 수 있고 박테리오파지 또는 기타 라이브러리 입자 또는 분자 복합체 상에서 디스플레이되는 결합원의 선택에 이어서, 상기 선택된 결합원을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 기타 입자 또는 분자 복합체로부터 핵산을 수득할 수 있다. 그러한 핵산은 상기 선택된 결합원을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 기타 입자 또는 분자 복합체로부터 수득한 핵산 서열을 이용하여 핵산으로부터의 발현에 의해, 결합원 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인을 후속적으로 생성하는데 사용될 수 있다.
상기 선택된 결합원의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인을 단리된 형태로 제공할 수 있고, 그러한 VH 도메인을 포함하는 결합원으로서도 제공할 수 있다.
A-FN 또는 피브로넥틴의 ED-A 또는 그 밖의 표적 항원 또는 이소형에 결합하는 능력, 예를 들어 A-FN 또는 A-FN의 단편, 예를 들어 피브로넥틴의 ED-A에의 결합에 대한 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9 중 어느 하나와 경쟁하는 능력을 추가로 시험할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 결합원은, 예를 들어 scFv 형식의 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9와 동일한 친화성으로 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 3 x 10-8 M의 KD 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 2 x 10-8 M의 KD 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 1.7 x 10-8 M의 KD 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합한다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 1.4 x 10-8 M의 KD 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 3 x 10-9 M의 KD 또는 더 나은 친화성으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합한다.
본 발명의 결합원은 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9로서 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A 상의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A 이외의 분자에 대해서는 어떠한 유의한 결합도 나타낼 수 없다. 특히, 결합원은 피브로넥틴의 다른 이소형, 예를 들어 피브로넥틴의 ED-B 이소형 및/또는 IIICS 이소형에 결합할 수 없다.
본원에서 개시하는 항체 분자의 변이체를 생성할 수 있으며, 이를 본 발명에서 사용할 수 있다. CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 결합원의 아미노산 서열을 치환시키는데 필요한 기술은 일반적으로 당업계에서 이용가능하다. 변이체 서열은 활성에 대해 최소한의 또는 유익한 효과를 갖는지 예상가능하거나 그렇지 않은 치환체에 의해 치환될 수 있으며, A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 능력 및/또는 그 밖에 임의의 목적하는 특성에 대해 시험될 수 있다.
본 발명에 따르면, 논의한 바와 같이 그 서열이 본원에 구체적으로 개시되어 있는 임의의 VH 및 VL 도메인의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체를 사용할 수 있다. 특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변경 (아미노산 잔기의 추가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있고, 그러한 변경은 약 20 미만, 약 15 미만, 약 10 미만 또는 약 5 미만, 아마도 5, 4, 3, 2 또는 1일 수 있다. 변경은 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다. 일반적으로 변경은 기능상의 손실을 야기하지 않고, 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합원은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 능력을 보유할 수 있다. 예를 들어, 이는 본원에서 기재하는 검정법으로 측정하였을때, 변경되지 않은 결합원과 동일한 결합력을 보유할 수 있다. 이와 같이 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합원은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대해 개선된 결합능을 가질 수 있다.
전체 가변 도메인 내에서 돌연변이를 일으키기 위해 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자에 무작위로 돌연변이를 유발시켜 본 발명에 사용하기 위한 CDR-유래 서열을 보유하는 신규한 VH 또는 VL 영역을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 전체 가변 도메인 또는 CDR 세트 내에서 1개 또는 2개의 아미노산을 치환시킨다. 사용가능한 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 직접 돌연변이를 유발시키는 것이다.
상기한 바와 같이, 본원에서 실질적으로 설명한 바와 같은 CDR 아미노산 서열은 인간 항체 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분 내의 CDR로서 보유될 수 있다. 본원에서 실질적으로 설명한 바와 같은 HCDR3 서열은 본 발명의 실시양태를 나타내고, 예를 들어 이들 각각은 인간 중쇄 가변 도메인 또는 그의 실질적인 부분 내의 HCDR3으로서 보유될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 가변 도메인은 임의의 생식세포계열 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 얻을 수 있거나 그로부터 유래될 수 있고, 또는 공지된 인간 가변 도메인의 컨센서스 서열 또는 실제 서열에 기초한 합성 가변 도메인일 수 있다. 가변 도메인은 비-인간 항체로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 CDR 서열 (예를 들어, CDR3)은 재조합 DNA 기술에 의해 CDR (예를 들어, CDR3)이 결여된 가변 도메인의 레퍼토리에 도입될 수 있다. 예를 들어, 마크스(Marks) 등의 1992년 문헌에는 가변 도메인 영역의 5' 말단 또는 그의 인접부를 향하는 컨센서스 프라이머를 인간 VH 유전자의 세 번째 프레임워크 영역에 대한 컨센서스 프라이머와 함께 사용하여 CDR3이 결여된 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공하는, 항체 가변 도메인 레퍼토리의 생성 방법이 기재되어 있다. 마크스 등은 또한 이러한 레퍼토리를 어떻게 특정 항체의 CDR3과 조합할 수 있는지에 대해서도 기재하였다. 유사한 기술을 이용하여 본 발명의 CDR3-유래 서열을 CDR3이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 섞을 수 있고, 섞인 완전한 VH 또는 VL 도메인은 그와 관련된 VL 또는 VH 도메인과 조합되어, 본 발명에 사용하기 위한 결합원을 제공한다. 이어서, 상기 레퍼토리를 WO92/01047 (본 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함됨) 또는 임의의 광범위한 후속 문헌, 예컨대 문헌 케이(Kay), 윈터(Winter) 및 맥카퍼티의 1996년 문헌에 기재된 파지 디스플레이 시스템과 같은 적합한 숙주 시스템에서 디스플레이되게 하여, 적합한 결합원을 선택할 수 있다. 상기 레퍼토리는 무엇이건 104 초과의 개별 일원, 예를 들어 105 이상, 106 이상, 107 이상, 108 이상, 109 이상 또는 1010 이상의 일원으로 이루어질 수 있다.
유사하게, 하나 이상의 또는 세 개 모두의 CDR을 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리에 합체시킬 수 있으며, 그 후 이들은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 결합원 또는 결합원(들)을 스크리닝한다.
항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9의 하나 이상의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 또는 HCDR 세트를 사용할 수 있고/있거나, 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9의 하나 이상의 X LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 또는 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 또는 G9의 LCDR 세트를 사용할 수 있다.
유사하게, 본원에서 개시하는 다른 VH 및 VL 도메인, CDR 세트 및 HCDR 세트 및/또는 LCDR 세트를 사용할 수도 있다.
A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A는 폐암 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 결합원, 예를 들어 항체 분자를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 스크리닝은 본원의 다른 곳에서 개시한 바와 같은 레퍼토리의 스크리닝일 수 있다.
A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A는 림프종 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 결합원, 예를 들어 항체 분자를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 스크리닝은 본원의 다른 곳에서 개시한 바와 같은 레퍼토리의 스크리닝일 수 있다.
이뮤노글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분은 적어도 세 개의 CDR 영역과 그들의 개재 프레임워크 영역를 포함할 수 있다. 상기 부분은 또한 첫 번째 및 네 번째 프레임워크 영역 중 어느 하나 또는 둘 모두를 적어도 약 50％ 포함할 수 있으며, 이 때 50％는 첫 번째 프레임워크 영역의 C-말단이 50％이고, 네 번째 프레임워크 영역의 N-말단이 50％이다. 가변 도메인의 실질적인 일부인 N-말단 또는 C-말단의 부가적인 잔기들은 일반적으로 천연 발생 가변 도메인 영역과 관련이 없는 것들일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의한 본 발명의 결합원의 제조는 클로닝 또는 다른 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입되는 링커에 의해 코딩된 N- 또는 C-말단 잔기의 도입을 야기할 수 있다. 그 밖의 조작 단계는 링커를 도입하여 본원의 다른 곳에 개시된 가변 도메인을 항체 불변 영역을 포함하는 추가의 단백질 서열, (예를 들어, 디아바디의 생성에 있어서의) 기타 가변 도메인, 또는 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 논의한 바와 같이 검출가능한/기능성 표지에 연결시키는 것을 포함한다.
결합원이 한 쌍의 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있지만, VH 또는 VL 도메인 서열을 기재로 하는 단일의 결합 도메인도 본 발명에 사용될 수 있다. 단일의 이뮤노글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특이적 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 dAb에 관한 내용을 참조한다.
단일의 결합 도메인 중 하나의 경우, 이들 도메인은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합가능한 2-도메인 결합원을 형성할 수 있는 상보적인 도메인을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이는 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 WO92/01047에 개시되어 있는 소위 계층적 이중 조합 접근법(hierarchical dual combinatorial approach)을 이용한 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있고, 여기서는 H 또는 L 쇄 클론을 함유하는 개별 콜로니를 사용하여 다른 쇄 (L 또는 H)를 코딩하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성된 2쇄 결합원은 상기 문헌에 기재되어 있는 바와 같이 파지 디스플레이 기술에 따라 선택된다. 이 기술은 또한 마크스의 1992년 문헌에도 개시되어 있다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 추가로 항체 불변 영역 또는 그의 일부, 예를 들어 인간 항체 불변 영역 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 그의 C-말단에서 인간 Cκ 또는 Cλ 쇄, 예를 들어 Cλ를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인 기재의 결합원은 그의 C-말단에서 임의의 항체 이소형, 예를 들어 IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 임의의 이소형 서브클래스, 특히 IgG1 및 IgG4 유래의 이뮤노글로불린 중쇄의 전부 또는 일부 (예를 들어, CH1 도메인)에 부착될 수 있다. 이와 같은 특성을 가지며 가변 영역을 안정화시키는 임의의 합성 또는 기타 불변 영역 변이체가 또한 본 발명의 실시양태에 유용하다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 검출가능한 또는 기능성 표지로 표지될 수 있다. 표지는 신호를 생성하거나 신호의 생성을 유도할 수 있는 임의의 분자일 수 있으며, 형광물질, 방사성표지, 효소, 화학발광물질 또는 광과민물질이 포함되나 이들로 한정되는 것은 아니다. 따라서, 결합은 형광 또는 발광, 방사성, 효소 활성 또는 광 흡수를 검출하는 것에 의해 검출 및/또는 측정될 수 있다. 검출가능한 표지는 당업계 공지의 통상적인 화학을 이용하여 본 발명에 사용하기 위한 항체에 부착시킬 수 있다.
예를 들어 육안 검사, 전자기 방사선, 열, 및 화학 시약에 의한 것과 같은 외적인 수단에 의해 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 표지에 의한 수 많은 방법들이 존재한다. 표지는 또한 본 발명에 사용하기 위한 항체에 결합하는 다른 결합원, 또는 지지체에 결합될 수 있다.
표지된 결합원, 예를 들어 검출가능한 표지에 의해 표지된 scFv는 생체내, 생체외, 또는 시험관내에서 진단용으로 및/또는 치료용으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 방사성표지된 결합원 (예를 들어, 방사성동위원소에 접합된 결합원)은 방사선진단법 및 방사선치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 결합원에 접합될 수 있는 방사성동위원소로는 94 mTc, 99 mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111In, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 123I , 124I, 125I 및 131I와 같은 동위원소가 있다.
예를 들어, 검출가능한 표지에 의해 표지된 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 인간 또는 동물에서 폐암을 검출, 진단 또는 모니터링하는데 사용될 수 있다.
대안적으로, 검출가능한 표지에 의해 표지된 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 인간 또는 동물에서 림프종을 검출, 진단 또는 모니터링하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 결합원은 폐암을 진단하는데 사용하기 위한 진단 제품의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 결합원은 림프종을 진단하는데 사용하기 위한 진단 제품의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명은
(a) 인간 또는 동물에게 피브로넥틴의 ED-A 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 본 발명의 결합원, 예를 들어 검출가능한 표지로 표지된 결합원을 투여하는 단계, 및
(b) 인간 또는 동물 신체의 폐에서 상기 결합원의 존재 또는 부재를 결정하는 단계
를 포함하며, 인간 또는 동물의 폐로의 상기 결합원의 국소화는 폐암의 존재를 나타내는 것인, 인간 또는 동물에서 폐암을 검출 또는 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은
(a) 인간 또는 동물에게 피브로넥틴의 ED-A 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 본 발명의 결합원, 예를 들어 검출가능한 표지로 표지된 결합원을 투여하는 단계, 및
(b) 인간 또는 동물 신체의 림프계에서 상기 결합원의 존재 또는 부재를 결정하는 단계
를 포함하며, 인간 또는 동물의 림프계로의 상기 결합원의 국소화는 림프종의 존재를 나타내는 것인, 인간 또는 동물에서 림프종을 검출 또는 진단하는 방법을 제공한다.
결합원이 검출가능한 표지로 표지된 경우, 검출가능한 표지의 존재 또는 부재는 표지를 검출하는 것에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원과 병변 내 표적 세포에 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하는 분자 및 그러한 병변 내에 존재하는 세포외 기질 성분에 대한 항체 사이의 접합체 또는 융합체를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 살생 또는 세포독성 분자는 인터루킨-2 (IL-2), 독소루비신, 인터루킨-12 (IL-12), 인터페론-γ (IFN-γ), 종양 괴사 인자 α (TNFα) 또는 조직 인자 (바람직하게는 말단절단형)일 수 있다. 그러한 접합체는 치료용으로, 예를 들어 본원에 언급된 림프종을 치료하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 그러한 접합체는 치료용으로, 예를 들어 본원에 언급된 폐암을 치료하는데 사용될 수 있다
결합원과 살생 또는 세포독성 분자의 융합체 또는 접합체의 제조 및 용도는, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 WO 01/62298에 기재되어 있다.
본 발명은 본 발명에 사용하기 위한 결합원을 포함하는 의약을 치료 유효량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 폐암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 사용하기 위한 결합원을 포함하는 의약을 치료 유효량으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 림프종의 치료 방법을 제공한다.
결합원은 (i) 세포 상호작용에 의해 표적 세포에 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하는 분자 및 (ii) 피브로넥틴의 ED-A 이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 결합원의 접합체일 수 있다.
본 발명은 폐암 치료용 의약의 제조에서의 본 발명에 사용하기 위한 결합원의 용도를 제공한다.
본 발명은 림프종 치료용 의약의 제조에서의 본 발명에 사용하기 위한 결합원의 용도를 제공한다.
결합원은 본원에 기재된 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하는 분자에 접합되거나 융합될 수 있다. 결합원은 (i) 세포 상호작용에 의해 표적 세포에 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하는 분자 및 (ii) 본 발명에 따른 인간 피브로넥틴에 대한 결합원의 접합체일 수 있다.
또한, (i) 세포 상호작용에 의해 표적 세포에 대한 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하는 분자 및 (ii) 본 발명의 용도에 따른 인간 피브로넥틴에 대한 결합원의 접합체가 본원에 기재된다. 이러한 접합체는 바람직하게는 살생 또는 세포독성 분자 및 상기 결합원을 포함하는 융합 단백질을 포함하거나, 또는 결합원이 2쇄 또는 다중쇄인 경우에는 살생 또는 세포독성 분자 및 상기 결합원의 폴리펩티드 쇄 성분을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 결합원은 단일쇄 폴리펩티드, 예를 들어 scFv와 같은 단일쇄 항체 분자이다. 살생 또는 세포독성 분자 및 단일쇄 Fv 항체 분자를 포함하는 융합 단백질이 본 발명에서 사용될 수 있다.
세포 상호작용에 의해 표적 세포에 그의 효과를 발휘하는 살생 또는 세포독성 분자는 표적 세포와 직접적으로 상호작용할 수 있거나, 표적 세포 상의 막-결합 수용체와 상호작용할 수 있거나, 세포막의 전기화학 전위를 교란시킬 수 있다. 막-결합 수용체와 상호작용하는 분자로는 케모카인, 사이토킨 및 호르몬이 포함된다. 세포막의 전기화학 전위를 교란시키는 화합물로는 헤모리신, 이오노포어, 이온 채널에 대해 작용하는 약물이 포함된다. 예시적인 바람직한 실시양태에서, 분자는 인터루킨-2, 조직 인자 (바람직하게는 말단절단형) 또는 독소루비신이다. 다른 실시양태는 인터루킨-12, 인터페론-감마, IP-10 및 종양 괴사 인자-α (TNF-α)를 이용할 수 있다.
하기에서 추가로 논의된 바와 같이, 특이적 결합원은 바람직하게는 항체이거나 또는 항체 항원-결합 부위를 포함한다. 편리하게는, 특정 결합원은 단일쇄 폴리펩티드, 예컨대 단일쇄 항체일 수 있다. 이는 단일쇄 항체 및 살생 또는 세포독성 분자 (예를 들어, 인터루킨-2 또는 조직 인자)를 포함하는 융합 단백질의 편리한 제조를 가능하게 한다. 항체 항원-결합 부위는 별도의 폴리펩티드에서, 예를 들어 완전한 항체, 또는 Fab나 디아바디와 같은 항체 단편에서 항체 VH 도메인과 항체 VL 도메인의 회합에 의해 제공될 수 있다. 특이적 결합원이 2쇄 또는 다중쇄 분자 (예를 들어, 각각 Fab 또는 전체 항체)인 경우, 살생 또는 세포독성 분자는 특이적 결합원 중 하나 이상의 폴리펩티드 쇄와 융합 폴리펩티드로서 접합될 수 있다.
결합원은 살생 또는 세포독성 분자와 펩티드 결합에 의해 접합될 수 있으며, 즉 상기 분자 및 특이적 결합원 또는 이의 폴리펩티드 쇄 성분을 포함하는 융합 폴리펩티드 내에 존재할 수 있다. IL-2를 포함하는 융합 폴리펩티드의 제조에 유용한 IL-2 서열 정보에 대해서는 문헌 [Taniguchi et al. (1983) Nature 302, 305-310]; [MaED-A et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Comm. 115: 1040-1047]; [Devos et al. (1983) Nucl. Acids Res. 11: 4307-4323]을 참조한다. 말단절단형 조직 인자에 대한 서열 정보는 문헌 [Scarpati et al. (1987) Biochemistry 26: 5234-5238] 및 [Ruf et al . (1991) J. Biol. Chem. 226: 15719-15725]에서 제공된다. 다른 접합 수단으로는 화학 접합, 특히 이관능성 시약을 사용한 (예를 들어, 더블-리에이전츠(DOUBLE-REAGENTS™) 가교결합 시약 선택 지침 (피어스(Pierce))을 사용한) 가교결합이 포함된다.
느린 방출이 바람직한 경우, 예를 들어 살생 또는 세포독성 분자가 독소루비신이거나 또는 세포막의 전기화학 전위를 교란시키는 다른 분자인 경우, 화학적 접합은 특이적 결합원 (항체 또는 항체 단편과 같은 폴리펩티드)의 1급 아미노기와 독소루비신과 같은 살생 또는 세포독성 분자의 산화된 당 모이어티 (다우노사민) 사이의 시프(Schiff) 염기 (이민) 형성에 의해 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명에 사용하기 위한 결합원을 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 기재된다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 핵산은 상기 정의된 바와 같은 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원-결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어 scFv 또는 IgG, 예를 들어 IgG1을 코딩할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 도메인을 코딩할 수 있다.
추가로, 상기 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 제조물이 본원에 기재된다.
또한, 상기와 같은 하나 이상의 제조물을 포함하는 재조합 숙주 세포가 기재된다. 제공된 바와 같은 임의의 CDR 또는 CDR 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원-결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어 scFv 또는 IgG1 또는 IgG4를 코딩하는 핵산으로부터 발현시키는 것을 포함하는, 코딩된 생성물의 제조 방법이 기재된다. 발현은 편리하게는 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 배양하여 달성할 수 있다. 발현에 의한 생성 후, VH 또는 VL 도메인, 또는 결합원을 임의의 적합한 기술을 사용하여 단리 및/또는 정제한 다음, 적절하게 사용할 수 있다.
핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며, 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 본원에서 설명한 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 문맥에서 달리 요구하지 않는 한, 구체화된 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하며, 구체화된 서열을 갖는 RNA 분자 (여기서는 U가 T 대신 사용됨)를 포함한다.
코딩 핵산으로부터 발현시키는 것을 포함하는, 항체 VH 가변 도메인의 제조 방법이 기재된다. 이러한 방법은 상기 항체 VH 가변 도메인의 제조를 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
제조 방법은 생성물의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 제조 방법은 생성물을 하나 이상의 부가적인 성분, 예컨대 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로 제형화하는 것을 포함할 수 있다.
각종 상이한 숙주 세포에서의 클로닝 및 폴리펩티드 발현을 위한 시스템이 널리 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포로는 박테리아, 포유동물 세포, 식물 세포, 섬유상 진균, 효모 및 바쿨로바이러스계 및 트랜스제닉 식물 및 동물이 포함된다. 원핵 세포에서 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에서 널리 확립되어 있다. 검토를 위해, 예를 들어 플루크툰(Plueckthun)의 1991년 문헌을 참조한다. 통상적인 박테리아 숙주는 이. 콜라이이다.
배양물 중 진핵 세포에서의 발현 또한 결합원의 제조를 위한 선택사항으로서 당업자에게 이용가능하다 (예를 들어, 채드(Chadd) 및 챠모우(Chamow)의 2001년 문헌, 앤더슨(Andersen) 및 크루멘(Krummen)의 2002년 문헌, 래릭(Larrick) 및 토마스(Thomas)의 2001년 문헌 참조). 이종 폴리펩티드의 발현을 위해 당업계에서 이용가능한 포유동물 세포주로는 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 그외 다수가 포함된다.
프로모터 서열, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적절한 다른 서열을 비롯한 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터를 선택 또는 제조할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 예를 들어 파지미드(phagemid)이거나 또는 적절한 경우 바이러스, 예를 들어 파지일 수 있다. 추가의 상세설명에 대해서는, 예를 들어 샘브룩(Sambrook) 및 러셀(Russell)의 2001년 문헌을 참조한다. 예를 들어 핵산 제조물의 제조에서 핵산 조작, 돌연변이유발, 서열분석, 세포 내로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 및 단백질 분석을 위한 다수의 공지 기술 및 프로토콜이 오수벨(Ausubel)의 1999년 문헌에 상세하게 기재되어 있다.
숙주 세포는 본원에 기재된 핵산을 함유할 수 있다. 이러한 숙주 세포는 시험관내 또는 배양물내 존재할 수 있다. 이러한 숙주 세포는 생체내 존재할 수 있다. 숙주 세포의 생체내 존재는 "인트라바디" 또는 세포내 항체로서 본 발명에 사용하기 위한 결합원의 세포내 발현을 허용할 수 있다. 인트라바디는 유전자 요법에 사용될 수 있다.
본원에 개시된 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법 또한 기재된다. 도입은 임의의 이용가능한 기술을 사용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기술로는 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 리포좀-매개 트랜스펙션 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어 우두를 사용한 형질도입이 포함될 수 있거나, 또는 곤충 세포의 경우 바쿨로바이러스가 포함될 수 있다. 숙주 세포, 특히 진핵 세포에의 핵산 도입은 바이러스 또는 플라스미드에 기초한 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피좀으로 유지될 수 있거나, 숙주 세포 또는 인공 염색체에 혼입될 수 있다. 혼입은 단일 또는 다수 위치에서 하나 이상의 복제물의 무작위 또는 표적화 일체화에 의할 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기술로는 염화칼슘 형질전환, 전기천공법 및 박테리오파지를 사용한 트랜스펙션이 포함될 수 있다.
도입에 이어서, 예를 들어 숙주 세포를 유전자 발현을 위한 조건 하에 배양하여 핵산으로부터의 발현을 야기 또는 허용할 수 있다. 발현된 생성물의 정제는 당업자에게 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
핵산은 숙주 세포의 게놈 (예를 들어, 염색체) 내로 일체화될 수 있다. 일체화는 표준 기술에 따라 재조합을 촉진시키는 서열을 게놈에 포함시켜 촉진시킬 수 있다.
또한, 상기와 같은 결합원 또는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 상기 언급한 바와 같은 제조물을 사용하는 것을 포함하는 방법이 기재된다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 인간 또는 동물 대상체, 예를 들어 인간에서의 진단 또는 치료 방법에 사용되도록 고안된다. 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 림프종의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 폐암의 진단 또는 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 제공된 바와 같은 결합원의 투여를 포함하는 치료 방법, 상기 결합원을 포함하는 제약 조성물, 및 투여용 의약의 제조에서의, 예를 들어 결합원을 제약상 허용되는 부형제와 함께 제형화하는 것을 포함하는 의약 또는 제약 조성물의 제조 방법에서의 상기 결합원의 용도를 제공한다. 제약상 허용되는 비히클은 널리 공지되어 있으며, 선택된 활성 화합물(들)의 속성 및 투여 방식의 함수에 따라 당업자에 의해 변형될 것이다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 보통 결합원 외에도 하나 이상의 성분을 포함할 수 있는 제약 조성물의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 그리고 본 발명에 따른 용도를 위한 제약 조성물은 활성 성분 외에도, 당업자에게 널리 공지된 제약상 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 속성은 경구, 흡입 또는 주사, 예를 들어 정맥내 주사일 수 있는 투여 경로에 따라 좌우될 것이다.
경구 투여용 제약 조성물, 예를 들어 나노바디 등이 또한 본 발명에서 예견된다. 이러한 경구 제제는 정제, 캡슐, 분말, 액체 또는 반고체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예컨대 젤라틴 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액체 제약 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대 물, 석유, 동물성유 또는 식물성유, 광유 또는 합성유를 포함한다. 생리 식염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액, 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내 주사 또는 고통 부위에의 주사의 경우, 활성 성분은 발열원-무함유이며 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. 당업자는 예를 들어 등장성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락테이트 링거 주사를 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요한 경우 사용될 수 있다. 제약 제제의 제조를 위한 다수의 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 로빈슨(Robinson)의 1978년 문헌을 참조한다.
조성물은 치료될 상태에 따라 단독으로 또는 다른 치료제와 조합하여, 동시에 또는 순차적으로, 또는 또다른 치료제(들)과의 조합 제제로서 투여될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원은 부가적인 의학 성분과 함께 조합 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 조합 치료, 특히 본 발명에 사용하기 위한 결합원과 하나 이상의 다른 약물의 조합을 이용하여 유의한 상승 효과를 제공할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 본원에 열거된 하나 이상의 상태의 치료를 위해 동시에 또는 순차적으로 또는 또다른 치료제(들)과의 조합 제제로서 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 림프종의 치료를 위한 기존 치료제와 조합되어 사용될 수 있다.
비-호지킨 림프종의 치료를 위한 기존 치료제로는 (CHOP 화학요법 섭생)과 조합된 리툭시맙; 및 사이톡산, 히드록시루비신 (아드리아마이신), 온코빈 (빈크리스틴), 및 프레드니손이 있다.
호지킨 림프종의 치료를 위한 기존 치료제로는 (ABVD 화학요법 섭생)과 조합된 아드리아마이신, 블레오마이신, 빈크리스틴, 및 다카르바진이 있다.
대안적으로, 본 발명에 사용하기 위한 결합원은 폐암의 치료를 위한 기존 치료제와 조합되어 사용될 수 있다.
비-소세포 폐암의 치료를 위한 기존 치료제로는 겜시타빈, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드 또는 비노렐빈과 조합된 시스플라틴 또는 카르보플라틴이 있다. 소세포 폐암의 치료를 위한 기존 치료제로는 단독으로, 또는 카르보플라틴, 겜시타빈, 파클리탁셀, 비노렐빈, 토포테칸 또는 이리노테칸과 조합된, 시스플라틴 또는 에토포시드가 있다.
본 발명에 사용하기 위한 결합원 및 하나 이상의 상기 추가의 의학 성분이 의약의 제조에 사용될 수 있다. 의약은 개체에 대한 별도 또는 조합 투여용일 수 있으며, 따라서 조합 제제 또는 별도 제제로서 결합원 및 추가의 성분을 포함할 수 있다. 별도의 제제가 사용되어 별도 투여 및 순차 또는 동시 투여를 용이하게 할 수 있으며, 상이한 경로에 의한 성분의 투여, 예를 들어 경구 및 비경구 투여가 가능하다.
본 발명에 따라, 제공된 조성물은 포유동물에게 투여될 수 있다. 투여는 "치료 유효량"으로 할 수 있으며, 이는 환자에게 이익을 나타내기에 충분한 양이다. 이러한 이익은 적어도 하나 이상의 증상의 개선일 수 있다. 투여된 실제 양, 및 투여 속도 및 시간-경과는 치료될 증상의 속성 및 중증도, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 조성물의 전달 부위, 결합원의 유형, 투여 방법, 투여 스케쥴 및 의료 전문가에게 알려진 다른 인자에 따라 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 투여량에 대한 결정 등은 일반 전문가 및 다른 의사의 책임 범위 내에 있으며, 증상의 중증도 및/또는 치료될 질환의 진행에 따라 좌우될 수 있다. 항체의 적절한 투여는 당업계에 널리 공지되어 있다 (레더만(Ledermann)의 1991년 문헌 및 백쉐이웨(Bagshawe)의 1991년 문헌 참조). 투여될 의약의 유형에 대해 적절한 경우, 본원 또는 문헌 [Physician's Desk Reference (2003)]에서 지시하는 특정 투여량이 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 결합원의 치료 유효량 또는 적합한 투여량은 동물 모델에서 시험관내 활성과 생체내 활성을 비교하여 결정할 수 있다. 마우스 또는 다른 시험 동물에서의 유효 투여량을 인간에 외삽하는 방법이 공지되어 있다. 정확한 투여량은 항체가 진단용인지, 예방용인지 또는 치료용인지 여부, 치료될 영역의 크기 및 위치, 항체의 정확한 속성 (예를 들어, 전체 항체, 단편 또는 디아바디), 및 임의의 검출가능한 표지 또는 항체에 부착된 다른 분자의 속성을 비롯한 다수의 인자에 따라 좌우될 것이다. 전형적인 항체 투여량은 전신 적용의 경우 100 ㎍ 내지 1 g, 국소 적용의 경우 1 ㎍ 내지 1 mg의 범위일 것이다. 초기의 보다 많은 로딩 투여량에 이어서 하나 이상 적은 투여량을 투여할 수 있다. 항체는 전체 항체, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4 이소형일 수 있다. 이는 성인 환자의 단일 치료를 위한 투여량으로, 소아 및 유아에 대해 비례적으로 조정될 수 있으며, 또한 다른 항체 형식에 대해 분자량에 비례하여 조정될 수 있다. 치료는 의사의 판단하에 매일, 주 2회, 주 또는 월 간격으로 반복될 수 있다. 치료는 피하 투여의 경우 2주 내지 4주 마다, 정맥내 투여의 경우 4주 내지 8주 마다 수행될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 치료는 주기적이며, 투여 사이의 기간은 약 2주 이상, 예를 들어 약 3주 이상, 약 4주 이상, 또는 한달에 약 한번이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 치료는 수술 전 및/또는 후에 제공될 수 있으며, 수술 처치의 해부학상 부위에 직접 투여 또는 적용될 수 있다.
하기 실험 예시를 비롯한 본 개시에 의해 본 발명의 추가의 측면 및 실시양태는 당업자에게 분명할 것이다.
실험
물질 및 방법
항체
항-ED-B 항체 단편 scFv (L19)의 단리는 이전에 기재되었다 (피니(Pini) 등의 1998년 문헌 참조). 모 항-ED-A 항체를 공개된 절차를 사용하여 ETH-2 라이브러리로부터 단리하였다 (문헌 [Giovannoni, Nucleic. Acid Research, 2001, 29(5):E27] 참조). 고친화성 항-ED-A 항체를 생성하는 모 항-ED-A 항체의 친화성 성숙은 하기 단락에서 설명한다.
모 항- ED -A 항체의 친화성 성숙
모 항-ED-A 항체 (ETH-2 유래의 항체)를 친화성 성숙 라이브러리의 제조를 위한 주형으로서 사용하였다. 라이브러리의 VH CDR1 (DP47 생식세포계열) 및 VL CDR1 (DPK22 생식세포계열)에서의 서열 가변성은, VH CDR1의 위치 31, 32 및 33 및 VL CDR1의 위치 31, 31a 및 32에서 무작위 돌연변이를 생성하는 방법에서 VH에 대해서는 부분적 축퇴 프라이머 5'-CTGGAGCCTGGCGGACCCAGCTCATMNNMNNMNNGCTAAAGGTGAATCCAGA-3' (서열 17) 및 VL에 대해서는 5'-CCAGGTTTCTGCTGGTACCAGGCTAAMNNMNNMNNGCTAACACTCTGACTGGCCCTGC-3' (서열 18) (모든 올리고뉴클레오티드는 오페론 바이오테크놀로지스(Operon Biotechnologies; 독일 쾰른 소재)로부터 구입함)을 사용하여 PCR에 의해 도입하였다. VHVL 조합은, 주형으로서 겔-정제된 VH 및 VL 분절을 사용하며 프라이머 LMB3long (5'-CAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3') (서열 19) 및 fdseqlong (5'-GACGTTAGTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3') (서열 20)을 사용하여 PCR 조립에 의해 scFv 형식으로 조립하였다. 조립된 VH-VL 단편을 NcoI/NotI로 이중 소화시키고, NcoI/NotI-소화된 pHEN1 파지미드 벡터 내로 클로닝하였다 (후겐붐(Hoogenboom) 등의 1991년 문헌 참조). 생성된 라이게이션 생성물을 비티(Viti) 등의 2000년 문헌에 따라 전기감응(electrocompetent) 이. 콜라이 TG-1 세포 내로 전기천공하여, 1.5×107 개별 항체 클론을 함유하는 라이브러리를 생성하고, 이를 향상된 친화성으로 ED-A에 결합하는 항체에 대해 스크리닝하였다.
항- ED -A 항체의 선별
상기 기재된 항체 라이브러리를 BIAcore 분석을 사용하여 모 항-ED-A 항체보다 더 큰 친화성으로 ED-A에 결합하는 항체에 대해 스크리닝하였다. BIAcore 분석에 사용된 항원 (11A12)은 인간 피브로넥틴의 ED-A 도메인을 함유하였으며, 하기 아미노산 서열 (서열 120)을 가졌다:
Figure 112010011980330-pct00001
항원 (11A12)의 뉴클레오티드 서열 (서열 121)은 하기와 같다:
Figure 112010011980330-pct00002
항원의 뉴클레오티드 서열을 각각 5' 및 3'에서 BamHI 및 BglII 제한 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물 및 벡터 pQE12 (QIAGEN)를 BamHI 및 BglII 제한 엔도뉴클레아제로 소화시킨 후, 삽입물 대 벡터를 3:1의 비로 함유하는 반응에서 라이게이션하였다. 생성된 벡터를 서열분석하여 서열이 정확한지 검사하였다.
항원을 하기와 같이 제조하였다:
10 ml 2TY, Amp, 1％ 글루코스 중 TG1 전기감응 사전배양물을 11A12의 DNA 미니프렙 1 ㎕의 존재 하에 전기천공하였다. 이어서, 사전배양물을 1:100으로 희석하고 (2TY, Amp, 0.1％ 글루코스 800 ml 중 8 ml), 0.4 내지 0.6의 OD600으로 성장시킨 다음, 밤새 IPTG로 유도하였다. 다음날, 세포를 회전 침강시키고, 상청액을 여과하였다 (밀리포어(Millipore) 0.22 μm). 배양 브로쓰의 원심분리 및 정화 후, FPLC 상에서 힛트랩(Hitrap) 컬럼을 사용하여 11A12를 정제하였다. Ni/컬럼을 하기와 같이 재생하였다: 컬럼을 5 컬럼 부피 (CV) H2O로 헹군 후, 3CV 0.5 M EDTA/0.2 M Tris (pH 8)를 적용하여 컬럼으로부터 오래된 니켈을 세척 제거하였다. 이어서, 5CV H2O로 컬럼을 헹구었다. 이어서, 컬럼을 2CV 100 mM NiSO4로 재로딩한 후, 수 CV H2O로 컬럼을 헹구었다. 이어서, 컬럼을 5CV 용해 완충액 (20 mM 이미다졸/250 mM NaCl/PBS (pH 7.4))으로 평형화하였다. 세포 용해물을 여과하고 (밀리포어 0.45 μm), 컬럼 상에 (수동으로) 로딩하였다. 이어서, 컬럼을 다시 FPLC 상에 놓고, UV 신호가 안정할 (일정할) 때까지 용해 완충액 (약 3CV)이 흐르도록 하였다. 이어서, 용출 프로그램을 시작하였다: 5CV로 용출 완충액 (400 mM 이미다졸/250 mM NaCl/PBS (pH 7.4)) 0％ 내지 100％의 구배. 용출된 항원을 함유하는 분획을 모으고, 밤새 PBS에서 투석하였다.
항- ED -A 항체의 발현 및 정제
항-ED-A 항체를 하기와 같이 발현시키고 정제하였다: 10 ml 2TY, Amp, 1％ 글루코스 중 TG1 전기감응 사전배양물을 항-ED-A 항체 중 하나의 DNA 미니프렙 1 ㎕의 존재 하에 전기천공하였다. 이어서, 사전배양물을 1:100으로 희석하고 (2TY, Amp, 0.1％ 글루코스 800 ml 중 8 ml), 0.4 내지 0.6의 OD600으로 성장시킨 다음, 밤새 IPTG로 유도하였다. 다음날, 세포를 회전 침강시키고, 상청액을 여과하였다 (밀리포어 0.22 μm). scFv를 단백질 A-세파로스 컬럼 상에서 정제하고, 트리에틸아민을 사용하여 컬럼으로부터 scFv를 용출시켰다. 용출된 scFv를 함유하는 분획을 4℃에서 밤새 PBS에서 투석하였다. 이어서, scFv 분획을 0.5 ml/분으로 흐르는 PBS를 함유하는 슈퍼덱스(Superdex) 75 컬럼 상에 놓고, 0.25 ml 분획을 수집하였다. 단량체 분획을 BIAcore 분석에 사용하였다.
BIAcore 분석 1
BIAcore 칩을 HBS-EP 완충액 BIACORE, 0.01 M Hepes (pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ 계면활성제 P20 (분석에 사용된 동일한 완충액)을 이용하여 5 ㎕/분의 유속으로 밤새 플러슁하였다. 항원 (11A12)을 아세테이트 완충액 (pH 4.0) 중 50 μg/ml의 농도로 희석하고, 칩 상의 COOH 기를 N-히드록시 숙신이미드 (NHS)와 에틸-N-(디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 (EDC)의 혼합물 50 ㎕를 주입하여 활성화하였다. 11A12 항원 40 ㎕를 칩 상에 주입하고, 잔류 유리 COOH 기를 에탄올아민 30 ㎕로 차단하였다. 0.22 μm 여과 후, 각각의 개별 박테리아 상청액 20 ㎕를 칩 상에 주입하고, 항원과의 상호작용을 실시간 모니터링하였다.
BIAcore 분석 2
모 항-ED-A 항체의 kon, koff 및 KD, 및 항-ED-A 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 및 G9를 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance)을 사용하여 평가하였다. 칩을 분석 동안 사용된 동일한 완충액을 이용하여 5 ㎕/분의 완충액 유속으로 밤새 평형화하였다. 이 유속으로 전체 코팅 절차를 수행하였다. 항원 11A12를 아세테이트 완충액 (pH 4.00) (BIACORE에서 제공)에 의해 1:25로 희석하여 20 μg/ml의 최종 농도가 되게 하였다. 이어서, NHS 및 EDC를 혼합하고, 50 ㎕를 주입하여 CM5 칩 상의 COOH 기를 활성화하였다. 이어서, 항원 40 ㎕를 주입하였다 (이를 약 40초 지속하였다). 이어서, 에탄올아민 30 ㎕를 주입하여 최후 유리 COOH의 반응성을 차단하였다.
각각의 샘플을 유속 20 ㎕/분에서 분석하였다. 20 ㎕의 비희석 단량체 단백질 (겔 여과로부터 유래됨)을 주입하였다. 해리 시간을 약 200초 동안 진행하도록 두었다. 이어서, 10 mM HCl 10 ㎕를 주입하여 칩을 재생하였다. 단량체 단백질의 주입을 상이한 희석, 즉 1:2 희석 (PBS 중)으로 반복한 다음, HCl로 재생하였다. 이어서, 1:4 희석으로 단백질의 세번째 주입 후, 다시 HCl로 재생하였다. 각각의 항-ED-A 항체에 대한 kon, koff 및 KD 값을 비아이벨류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
림프종 단면의 면역조직화학
라모스(Ramos) 림프종의 단면을 저온의 아세톤 (-20℃) 중에서 10분 동안 고정시키고, 슬라이드를 실온에서 (RT) 30분 동안 방치하여 건조시켰다. 이어서, 슬라이드를 TBS 중에 5 내지 10분 동안 담구고, 단면을 건드리지 않게 하여 슬라이드의 후면을 종이로 건조시켰다. 그 후, TBS (50 mM TRIS, 100 mM NaCl, pH 7.4로 조정, 0.01％ 아프로티닌) 중 100 ㎕ 초과의 20％ 태아 소 혈청 (FCS)을 이용하여 30분 동안 상기 단면을 차단시켰다. 차단 용액을 부어 버리고, 슬라이드를 TBS에 5분 동안 담구었다. 이어서, myc-태그를 보유한 1차 항체 scFv F8 (대략 20 ng/㎕) 100 ㎕를 TBS/3％ BSA로 희석한 바이오티닐화 항-myc 항체 9E10 (OD 0.25, 1:20 희석) 10 ㎕와 함께 상기 슬라이드에 첨가하였다. 음성 대조군으로서, 라모스 림프종 단면을 동일한 방식으로 면역조직화학적으로 염색하였으나, 1차 항체, 즉 myc-태그를 보유한 scFv 항 ED-A 항체 F8은 생략하였다. 슬라이드를 습식 챔버에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 TBS로 세척한 후, TBS/3％ BSA로 1:150 희석된 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제를 첨가하고, 습식 챔버에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 슬라이드를 5분 동안 TBS로 2회 세척하고, 슬라이드의 후면을 종이로 건조시켰다. 패스트 레드(Fast Red) 기질 500 ㎕ (패스트 레드 분말 5 mg를 패스트 레드 용액 5 ml [49 ml 트리스-HCl, 0.1M, pH 8.2; 1.0 ml N,N-디메틸포름아미드; 10 mg 나프톨 AS-MX 포스페이트 및 50 ㎕ 레바미솔(Levamisole) 용액 (1 ml 0.1 M 트리스-HCl pH 8.2, 레바미솔 분말 240.8 mg)]에 첨가하고, 0.45 μ의 공극을 갖는 여과기를 이용하여 여과함)를 각 슬라이드에 첨가하고, 슬라이드를 습식 챔버에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 이용하여 각 단면 상에 탈이온수를 직접 가함으로써 슬라이드를 탈이온수로 2회 세척한 다음, 물 중에 방치하였다. 이어서, 슬라이드를 길리스 헤마톡실린(Gillis Hematoxilin) 용액에 50분 동안 옮긴 후, 신속히 물로 옮기고, 물로 6회 세척하였다. 마지막으로, 슬라이드를 글리세르겔(Glycergel, 다코사이토메이션(DakoCytomation), 덴마크 글로스트럽) 봉입 매질을 이용하여 봉입하고, 악시오버트(Axiovert) S100 TV 현미경 (칼 자이스(Carl Zeiss), 스위스 펠트바하)에서 악시오비젼(Axiovision) 소프트웨어 (칼 자이스)를 이용하여 분석하였다.
폐암 단면의 면역조직화학 염색
소세포 폐암 (소세포 암종) 및 몇몇 비-소세포 폐암 (편평상피 세포 암종, 선암종, 기관지폐포 암종 및 거대 세포 암종)의 단면을 상기 기재한 바와 같이 myc-태그를 보유한 scFv 항-ED-A 항체를 이용하여 면역조직화학적으로 염색하였다 (예를 들면, 브랙(Brack) 등의 2006년 문헌 참조). 간략히, 상기 단면을 scFv 항-EDA 항체 D5 (최종 농도, 2 내지 15 ㎍/mL) 및 2차 항체 (모노클로날 항-myc 항체 9E10)과 함께 동시에 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 토끼 항-마우스 이뮤노글로불린 항체 (다코사이토메이션, 덴마크 글로스트럽)에 이어, 마우스 모노클로날 알칼리 포스파타제-항알칼리 포스파타제 복합체 (다코사이토메이션)를 이용하여 검출하였다. 패스트 레드 (시그마(Sigma))를 포스파타제 기질로서 사용하였고, 단면을 헤마톡실린 (시그마)을 이용하여 반대 염색하였다. 마지막으로, 슬라이드를 글리세르겔 (다코사이토메이션, 덴마크 글로스트럽)을 이용하여 봉입하고, 악시오버트 S100 TV 현미경 (칼 자이스, 스위스 펠트바하)에서 악시오비젼 소프트웨어 (칼 자이스)를 이용하여 분석하였다.
결과
항- ED -A 항체의 선별
BIAcore 분석 1
BIAcore 분석은 하기와 같이 항원에 대한 항체의 친화성을 추론하기 위해 분석된 각각의 항-ED-A 항체에 대한 그래프를 생성하였다: 각 그래프의 x 축은 시간에 해당하고, y 축은 공명 단위 (BIAcore 칩 상에 코팅된 항원에 대해 시험된 항체의 결합 친화성을 나타내는 척도)에 해당한다. 각 그래프는, 완충액의 변화에 상응하므로 결과의 해석에는 무관한 3 피크 및 1 하락(dip)을 나타내었다.
각 그래프의 상승부는 회합 단계를 나타낸다. 그래프의 이 부분에서 곡선이 가파를수록, 항체와 항원의 회합은 보다 빠르다. 각 그래프의 하강부는 항원으로부터 항체의 해리 단계를 나타낸다. 그래프의 이 부분에서 곡선이 편평할수록, 항원으로부터 항체의 해리는 보다 느리다.
항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9 모두는 이들이 유래된 모 항-ED-A 항체보다 더 편평한 해리 곡선을 나타내었으며, 이는 이들이 모 항-ED-A 항체보다 더 큰 친화성으로 ED-A 및 그에 따라 또한 A-FN에 결합함을 나타낸다. 항체 E5, F1, F8 및 H1에 대한 그래프는 시험된 모든 항-ED-A 항체 중 가장 편평한 해리 곡선을 나타내었다. 항체 H1, C5, D5, E5, C8, F8 및 F1의 회합 곡선은 모 항-ED-A 항체에 대해 관찰된 경우보다 더 편평하였으며, 항체 B2, B7, E8 및 G9에 대해 관찰된 회합 곡선은 모 항-ED-A 항체에 대해 관찰된 회합 곡선만큼 가파랐다. 그러나, IPTG-유도 이. 콜라이 TG-1 세포의 박테리아 상청액을 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9의 BIAcore 분석에 사용하였기 때문에, 시험된 항체 샘플의 농도는 알려지지 않았으나, 아마도 비교를 위해 사용된 모 항-ED-A 항체 샘플의 농도보다 낮았을 것이다. 결과적으로, 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9의 회합 곡선은 BIAcore 분석에 사용된 샘플에서 항체의 낮은 농도로 인해 인공적으로 낮을 수 있다. 그러나, 농도는 BIAcore 분석에서 표적 항원으로부터 항체의 해리에 유의한 영향을 미치지 않기 때문에, 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9에 대해 관찰된 편평한 해리 곡선은 이들 항체가 모 항-ED-A 항체와 적어도 동일한 친화성 및 아마도 보다 높은 친화성으로 ED-A에 결합한다는 것을 나타낸다.
BIAcore 분석 2
각각의 항-ED-A 항체에 대한 kon, koff 및 KD 값을 비아이벨류에이션 소프트웨어를 사용하여 평가하였다. 항원 11A12에 대한 모 항-ED-A 항체 및 항-ED-A 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 및 G9의 kon, koff 및 KD 값을 하기 표 2에서 상세히 설명한다. 항-ED-A 항체 B2, C5, D5, C8, F8, B7 및 G9 모두는 이들이 유래된 모 항-ED-A 항체보다 항원 11A12에 대해 더 우수한 KD 값을 가지며, 이는 모 항-ED-A 항체보다 더 큰 친화성으로 ED-A 및 그에 따라 또한 A-FN에 결합함을 나타낸다.
림프종 단면의 면역조직화학
원발성 인간 라모스 림프종 (비-호지킨 B-세포 림프종 [버킷 림프종])의 단면을 항-ED-A scFv F8 항체를 이용하여 면역조직화학적으로 염색한 결과, 신생혈관의 강력하고 특이적인 염색이 나타났다. 그와 반대로, 항-ED-A scFv F8 항체를 생략한 것을 제외하고는 동일한 조건하에 원발성 라모스 림프종을 염색한 음성 대조군에서는 신생혈관을 포함하는 원발성 라모스 림프종의 염색이 관찰되지 않았다. 이는, 본 발명의 항-EDA scFv 항체가 림프종의 신생혈관을 특이적으로 표적화한다는 것을 입증한다. 따라서, ED-A는 림프종에서 표적화 전략을 토대로 결합원 (예를 들면 항체)에 대한 일반적인 표적으로서 작용할 수 있다.
폐암 단면의 면역조직화학
일반적으로 특정 부류의 암 내에서 "범종양(pantumoral) 항체"를 찾기는 힘들며, 예를 들어 헤르셉틴은 유방암의 20％만을 염색한다. 도 1은 항-ED-A 항체 D5가 폐암의 신생혈관으로 특이적으로 국소화되는 것을 도시한다. 구체적으로, 항-ED-A 항체 D5는 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암 둘 다의 신생혈관으로 특이적으로 국소화된다. 비-소세포 폐암은 전체 폐암의 대략 75％ 내지 85％인 반면에, 소세포 폐암은 대략 15％ 내지 25％이다. 또한, 도 1은 항-ED-A 항체가 시험한 모든 비-소세포 폐암 아형, 즉 편평상피 세포 암종, 선암종, 기관지폐포 암종 및 거대 세포 암종으로 국소화됨을 입증한다. 따라서, 도 1에 도시된 결과는 놀랍게도 항-ED-A 항체, D5가 시험한 폐암의 모든 조직 유형을 염색시킴을 입증한다. 따라서, ED-A는 폐암에서 표적화 전략을 토대로 결합원 (예를 들면 항체)에 대한 일반적인 표적으로서 작용할 수 있다.
서열분석
항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9는 모두 scFv 항체이며, 전형적인 방법을 사용하여 서열분석하였다. 항-ED-A 항체 H1의 뉴클레오티드 서열은 도 3에 도시되어 있다. 항-ED-A 항체 H1의 아미노산 서열은 도 4에 도시되어 있다.
항-ED-A 항체 B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9의 VH 및/또는 VL을 코딩하는 바람직한 뉴클레오티드 서열은 항-ED-A 항체 H1의 VH 및/또는 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 동일하되, 단 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 H1 CDR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 각 항체에 대해 하기 표 1에 열거된 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) CDR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 치환된 것이다.
항-ED-A scFv F8 디아바디의 VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 바람직한 뉴클레오티드 서열은 항-ED-A 항체 H1의 VH 및/또는 VL을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 동일하되, 단 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 H1 CDR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 항-ED-A 항체 F8에 대해 하기 표 1에 열거된 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) CDR1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 치환된 것이다. 항-ED-A scFv F8 디아바디의 VH와 VL을 연결하는 링커를 코딩하는 바람직한 뉴클레오티드 서열은 gggtccagtggcggt (서열 29)이다.
항-ED-A 항체 B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 및 G9는 항-ED-A 항체 H1과 동일한 아미노산 서열을 갖되, 단 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 H1 CDR1의 아미노산 서열이 각 항체에 대해 하기 표 1에 열거된 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) CDR1의 아미노산 서열로 치환된다. 항-ED-A scFv F8 디아바디의 아미노산 서열은 항-ED-A 항체 H1의 아미노산 서열과 동일하되, 단 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 H1 CDR1의 아미노산 서열이 항-ED-A 항체 F8에 대해 하기 표 1에 열거된 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) CDR1의 아미노산 서열로 치환되고, H1에서 링커의 아미노산 서열이 링커 아미노산 서열 GSSGG (서열 28)로 치환된다.
항-ED-A 항체 B2 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 21)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 23이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 C5 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 41)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 43이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 D5 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 51)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 53이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 E5 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 61)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 63이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 C8 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 71)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 73이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 F8 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 81)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 83이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다. 항-ED-A F8 디아바디의 VH 도메인은 항-ED-A 항체 F8의 VH 도메인과 동일한 아미노산 서열 (즉 서열 81)을 갖는다.
항-ED-A 항체 F1 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 91)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 93이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 B7 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 101)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 103이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 E8 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 111)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 113이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 G9 VH 도메인의 아미노산 서열 (서열 31)은 항-ED-A 항체 H1의 VH 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 33이 H1의 VH CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 B2 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 22)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 26이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 C5 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 42)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 46이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 D5 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 52)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 56이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 E5 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 62)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 66이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 C8 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 72)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 76이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 F8 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 82)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 86이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다다. 항-ED-A F8 디아바디의 VL 도메인은 항-ED-A 항체 F8의 VL 도메인과 동일한 아미노산 서열 (즉 서열 82)을 갖는다.
항-ED-A 항체 F1 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 92)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 96이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 B7 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 102)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 106이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 E8 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 112)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 116이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
항-ED-A 항체 G9 VL 도메인의 아미노산 서열 (서열 32)은 항-ED-A 항체 H1의 VL 도메인의 아미노산 서열과 동일하되, 단 서열 36이 H1의 VL CDR1 대신 사용된다.
임의로, 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9, 및 scFv F8 디아바디의 VH 도메인의 위치 5 아미노산은 도 4A에 도시된 바와 같이 발린 잔기 (V)가 아니라 류신 잔기 (L)일 수 있다. 게다가 또는 다르게는, 항-ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8, G9, 및 scFv F8 디아바디의 VL 도메인의 위치 18 아미노산은 도 4C에 도시된 바와 같이 리신 잔기 (K)가 아니라 아르기닌 잔기 (R)일 수 있다.
참고문헌
상기 인용된 참고문헌을 비롯한, 본 명세서에서 인용된 모든 참고문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
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Figure 112010011980330-pct00004
Figure 112010011980330-pct00005
<표 1>
항-ED-A 친화성 성숙 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) CDR1의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
Figure 112010011980330-pct00006
<표 2>
BIAcore 평가 데이타
Figure 112010011980330-pct00007
SEQUENCE LISTING <110> Philogen S.p.A. Neri, Dario Rybak, Jascha-Nikolai Villa, Alessandra Trachsel, Eveline <120> An Antigen Associated With Lung Cancers And Lymphomas <130> SMWFP6557979 <150> US 60/951,765 <151> 2007-07-25 <160> 193 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody H1 heavy chain (VH) <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Arg 20 25 30 Arg Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody H1 light chain (VL) <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala 20 25 30 Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the heavy chain CDR1 of anti-ED-A antibody H1 <400> 3 Pro Arg Arg 1 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the heavy chain CDR2 of anti-ED-A antibody H1 <400> 4 Ser Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the heavy chain CDR3 of anti-ED-A antibody H1 <400> 5 Ser Thr His Leu Tyr Leu 1 5 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the light chain CDR1 of anti-ED-A antibody H1 <400> 6 Ser Ala Trp 1 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the light chain CDR2 of anti-ED-A antibody H1 <400> 7 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the light chain CDR3 of anti-ED-A antibody H1 <400> 8 Met Arg Gly Arg Pro Pro 1 5 <210> 9 <400> 9 000 <210> 10 <400> 10 000 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody H1 linker sequence <400> 11 Gly Gly Gly 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gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagatgcgtg gtcggccgcc gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaagcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat 360 ctgaatgggg ccgcatagac tgtgaaa 387 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Nucleotide sequence of the anti-ED-A antibody H1 linker sequence <400> 14 ggcggtggag gttctggcgg cggtggcagt ggcggtggag gttccggggg tggaggatct 60 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Phe Leu Thr Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Ala Pro 1 5 10 15 Arg <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Partially degenerate primer <220> <221> misc_feature <222> 27, 28, 30, 31, 33, 34 <223> n is a or g or c or t <400> 17 ctggagcctg gcggacccag ctcatmnnmn nmnngctaaa ggtgaatcca ga 52 <210> 18 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Partially degenerate primer <220> <221> misc_feature <222> 28, 29, 31, 32, 34, 35 <223> n is a or g or c or t <400> 18 ccaggtttct gctggtacca ggctaamnnm nnmnngctaa cactctgact ggccctgc 58 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer LMB3long <400> 19 caggaaacag ctatgaccat gattac 26 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Primer fdseqlong <400> 20 gacgttagta aatgaatttt ctgtatgagg 30 <210> 21 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody B2 VH domain <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Ala 20 25 30 Lys Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody B2 VL domain <400> 22 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Val Ala 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 23 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the heavy chain CDR1 of anti-ED-A antibody B2 <400> 23 Ala Ala Lys 1 <210> 24 <400> 24 000 <210> 25 <400> 25 000 <210> 26 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the light chain CDR1 of anti-ED-A antibody B2 <400> 26 Val Ala Phe 1 <210> 27 <400> 27 000 <210> 28 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Linker sequence of F8 diabody <400> 28 Gly Ser Ser Gly Gly 1 5 <210> 29 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Linker sequence of F8 diabody <400> 29 gggtccagtg gcggt 15 <210> 30 <400> 30 000 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody G9 VH domain <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Met 20 25 30 Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Amino acid sequence of the anti-ED-A antibody G9 VL domain <400> 32 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ala 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala 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Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 184 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody B2 <400> 184 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Val Ala 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 185 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody C5 <400> 185 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Leu His 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 186 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody D5 <400> 186 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ala 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 187 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody E5 <400> 187 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Leu Ala 20 25 30 His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 188 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody C8 <400> 188 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Leu Pro 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 189 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody F8 <400> 189 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Pro 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 190 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody F1 <400> 190 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Pro 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 191 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody B7 <400> 191 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 192 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody E8 <400> 192 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 <210> 193 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: VL domain of anti-ED-A antibody G9 <400> 193 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ala 20 25 30 Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ala Ala Glu 100 105 110 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 115 120 125 6 1 1 1

Claims (55)

  1. 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A (ED-A) 이소형에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 폐암 치료용 의약이며,
    상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고,
    상기 VH 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 세트를 포함하고, HCDR1은 서열 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 또는 113의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3은 서열 5의 아미노산 서열을 갖고;
    상기 VL 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하고, LCDR1은 서열 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 또는 116의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2는 서열 7의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3은 서열 8의 아미노산 서열을 갖고,
    상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 살생 또는 세포독성 활성을 갖는 분자 또는 방사성동위원소에 접합된 것인 의약.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 것인 의약.
  3. 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 접합된 분자를 폐 종양으로 전달하기 위한 의약이며,
    상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고,
    상기 VH 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 세트를 포함하고, HCDR1은 서열 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 또는 113의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3은 서열 5의 아미노산 서열을 갖고;
    상기 VL 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하고, LCDR1은 서열 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 또는 116의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2는 서열 7의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3은 서열 8의 아미노산 서열을 갖고,
    상기 분자는 살생 또는 세포독성 활성을 갖거나 방사성동위원소인 의약.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 것인 의약.
  5. 삭제
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 도메인 프레임워크가 인간 생식세포계열 프레임워크인 의약.
  7. 제6항에 있어서, 상기 VH 도메인의 인간 생식세포계열 프레임워크가 DP47인 의약.
  8. 제7항에 있어서, 상기 VH 도메인이 서열 1, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 또는 111의 아미노산 서열을 갖는 것인 의약.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VL 도메인 프레임워크가 인간 생식세포계열 프레임워크인 의약.
  10. 제9항에 있어서, 상기 VL 도메인의 인간 생식세포계열 프레임워크가 DPK22인 의약.
  11. 제10항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 2, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 또는 112의 아미노산 서열을 갖는 것인 의약.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, VH 도메인의 위치 5 아미노산이 발린 잔기 (V) 대신 류신 잔기 (L)인 것을 제외하고는 서열 81로 나타낸 바와 같은 VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 위치 18 아미노산이 리신 잔기 (K) 대신 아르기닌 잔기 (R)인 것을 제외하고는 서열 82로 나타낸 바와 같은 VL 도메인을 포함하는 것인 의약.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 단일쇄 Fv인 의약.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 디아바디인 의약.
  15. 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고,
    상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고,
    상기 VH 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 세트를 포함하고, HCDR1은 서열 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 또는 113의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3은 서열 5의 아미노산 서열을 갖고;
    상기 VL 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하고, LCDR1은 서열 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 또는 116의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2는 서열 7의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3은 서열 8의 아미노산 서열을 갖는, 폐암 진단용 진단 제품.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 것인 진단 제품.
  17. 피브로넥틴의 ED-A 이소형에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고,
    상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고,
    상기 VH 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 세트를 포함하고, HCDR1은 서열 3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 또는 113의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열 4의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3은 서열 5의 아미노산 서열을 갖고;
    상기 VL 도메인은 프레임워크 및 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 세트를 포함하고, LCDR1은 서열 6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 또는 116의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2는 서열 7의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3은 서열 8의 아미노산 서열을 갖고,
    여기서 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 또는 동물에게 투여된 후 상기 인간 또는 동물의 폐로의 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 국소화가 폐암의 존재를 나타내는 것인, 인간 또는 동물에서 폐암을 검출 또는 진단하기 위한 진단 제품.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 것인 진단 제품.
  19. 제17항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 검출가능한 표지에 접합된 것인 진단 제품.
  20. 제17항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 방사성동위원소에 접합된 것인 진단 제품.
  21. 삭제
  22. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VH 도메인 프레임워크가 인간 생식세포계열 프레임워크인 진단 제품.
  23. 제22항에 있어서, 상기 VH 도메인의 인간 생식세포계열 프레임워크가 DP47인 진단 제품.
  24. 제23항에 있어서, 상기 VH 도메인이 서열 1, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 또는 111의 아미노산 서열을 갖는 것인 진단 제품.
  25. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VL 도메인 프레임워크가 인간 생식세포계열 프레임워크인 진단 제품.
  26. 제25항에 있어서, 상기 VL 도메인의 인간 생식세포계열 프레임워크가 DPK22인 진단 제품.
  27. 제26항에 있어서, 상기 VL 도메인이 서열 2, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 또는 112의 아미노산 서열을 갖는 것인 진단 제품.
  28. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이, VH 도메인의 위치 5 아미노산이 발린 잔기 (V) 대신 류신 잔기 (L)인 것을 제외하고는 서열 81로 나타낸 바와 같은 VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 위치 18 아미노산이 리신 잔기 (K) 대신 아르기닌 잔기 (R)인 것을 제외하고는 서열 82로 나타낸 바와 같은 VL 도메인을 포함하는 것인 진단 제품.
  29. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 단일쇄 Fv인 진단 제품.
  30. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 디아바디인 진단 제품.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
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