ES2640981T3

ES2640981T3 - Selección como diana de neovasculatura de médula ósea

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Publication number: ES2640981T3
Application number: ES10745136.1T
Authority: ES
Inventors: Manuela Kaspar; Christoph Schliemann; Dario Neri
Original assignee: Philogen SpA
Current assignee: Philogen SpA
Priority date: 2009-08-05
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2017-11-07
Anticipated expiration: 2030-08-02
Also published as: EP2461832A2; CA2769882C; EP2947096A1; US20120121506A1; WO2011015333A2; EP2461832B1; US9446124B2; WO2011015333A3; EP2947096B1; CA2769882A1; US20140199238A1; ES2712997T3; US8679488B2; HK1217497A1

Abstract

Anticuerpo que se une a la isoforma con dominio extra A (ED-A) de fibronectina, para su uso en un método de tratamiento o diagnóstico de leucemia mieloide aguda que comprende seleccionar como diana la neovasculatura de médula ósea en pacientes con leucemia mieloide aguda.

Description

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medio covalente o no covalente adecuado. En realizaciones preferidas, el conjugado anticuerpo-IL2 puede ser una proteína de fusión que comprende IL2 y el anticuerpo o un componente polipeptídico del mismo (por ejemplo, una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de cadena múltiple, tal como un Fab. Por tanto, por ejemplo, el resto de IL2 puede fusionarse a un dominio VH o dominio VL del anticuerpo. Normalmente, el anticuerpo, o componente del mismo, y el resto de IL2 se unen a través de un ligador peptídico, por ejemplo un péptido de aproximadamente 5-25 residuos, por ejemplo 10-20 residuos, de manera preferible aproximadamente 15 residuos. Se conocen bien en la técnica ejemplos adecuados de ligadores peptídicos. En algunas realizaciones, un ligador puede tener una secuencia de aminoácidos tal como se expone en SEQ ID NO: 28. Normalmente, el ligador tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una o más repeticiones en tándem de un motivo. Normalmente, el motivo es una secuencia de cinco residuos, y preferiblemente al menos 4 de los residuos son Gly o Ser. Cuando cuatro de los cinco residuos son Gly o Ser, el otro residuo puede ser Ala. Más preferiblemente cada uno de los cinco residuos es Gly o Ser. Motivos preferidos son GGGGS (SEQ ID NO: 33), SSSSG (SEQ ID NO: 34), GSGSA (SEQ ID NO: 35) y GGSGG (SEQ ID NO: 36). Preferiblemente, los motivos son adyacentes en la secuencia, sin nucleótidos intermedios entre las repeticiones. La secuencia del ligador puede comprender o consistir en entre una y cinco, preferiblemente tres o cuatro, repeticiones del motivo. Por ejemplo, un ligador con tres repeticiones en tándem puede tener una de las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NOs. 29 a 32.

Se sabe que los conjugados anticuerpo-fármaco son útiles para administrar selectivamente un agente citotóxico a una diana tal como un antígeno asociado con tumor (Carter et al., 2008). Tales conjugados permiten la administración de agentes citotóxicos directamente a los tejidos afectados, evitando de ese modo las desventajas asociadas con la quimioterapia convencional. Por ejemplo, se ha demostrado previamente que anticuerpos tales como F16 o F8 pueden acoplarse a fármacos citotóxicos y pueden localizar con eficacia y selectividad extraordinarias alrededor de vasos sanguíneos tumorales. Por tanto, en algunas realizaciones, puede conjugarse un anticuerpo para su uso en la invención con un agente citotóxico. Los agentes citotóxicos a modo de ejemplo incluyen agentes citotóxicos que son adecuados para tratar el cáncer. Por ejemplo, un agente citotóxico puede ser adecuado para tratar una enfermedad caracterizada por neovasculatura de médula ósea, tal como síndromes mielodisplásicos de leucemia o mieloma múltiple, por ejemplo LMA.

Un agente citotóxico preferido incluye un agente citotóxico potente de estructura química relativamente sencilla para facilitar la fabricación. Se prefiere el uso de agentes citotóxicos potentes debido a la diferencia en el peso molecular entre anticuerpos y agentes citotóxicos (Carter et al., 2008). Un agente citotóxico potente puede ser un agente citotóxico que puede eliminar células tumorales a concentraciones sub-nanomolares. Los agentes citotóxicos adecuados que pueden conjugarse con un anticuerpo para su uso en la presente invención incluyen dolastatinas, vinblastinas, epotilonas, tubulisinas, y derivados y análogos de las mismas.

Las dolastatinas son una familia de péptidos antiproliferativos que inhiben el crecimiento y la reproducción de células diana e inducen apoptosis en una variedad de tipos de células malignas. Las dolastatinas a modo de ejemplo incluyen dolastatina-10 y dolastatina-15, y sus derivados, que se ha demostrado que tienen actividad antiproliferativa particularmente fuerte (de Arruda et al., 1995). Un derivado de dolastatina preferido es cemadotina que es un análogo de dolastatina-15. En realizaciones preferidas, el conjugado anticuerpo-dolastatina puede ser una proteína de fusión que comprende la dolastatina y el anticuerpo o un componente polipeptídico del mismo (por ejemplo, una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de cadena múltiple, tal como un Fab. Por tanto, por ejemplo, el resto de dolastatina puede fusionarse a un dominio VH o dominio VL del anticuerpo.

La vinblastina es un análogo químico de la vincristina que se usa en varios regímenes quimioterápicos incluyendo el tratamiento para el linfoma de Hodgkin. Se describen análogos potentes de vinblastina en Barnett et al. (1978) e incluyen monohidrazida de 4-desacetil-3-vinblastina.

Tanto la monohidrazida de 4-desacetil-3-vinblastina como la cemadotina actúan sobre los microtúbulos con un mecanismo de acción similar y pueden eliminar células endoteliales y células tumorales diana en el intervalo de concentración picomolar (de Arruda et al., 1995; Barnett et al., 1978; Reddy et al., 2007; Ray et al., 2007; y Leamon et al., 2007).

Las epotilonas son una clase de moléculas citotóxicas que han demostrado tener actividad antitumoral. Las epotilonas a modo de ejemplo incluyen ixabepilona, epotilona B y epotilona D.

Las tubulisinas son otra familia de agentes antiproliferativos que son candidatos principales para el desarrollo de agentes anticancerosos. Las tubulisinas a modo de ejemplo incluyen tubulisina A y tubulisina D. Se describen derivados de tubulisina a modo de ejemplo en Neri et al. (2006), Sani et al. (2007) y Patterson et al. (2007).

En algunas realizaciones, el anticuerpo para su uso en la invención puede conjugarse con un agente citotóxico que comprende un grupo maleimido terminal. Los grupos maleimido pueden usarse para la conjugación de fármacos específica de sitio con residuos de cisteína reactivos únicos presentes en los anticuerpos descritos en el presente documento (Borsi et al., 2002; Berndorff et al., 2006). Lo más preferiblemente, está presente un ligador escindible entre el agente citotóxico y el resto maleimido.

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distintas de anticuerpos, tal como se describe en más detalle a continuación.

Terminología

Anticuerpo

Esto describe una inmunoglobulina ya esté producida de manera natural o parcial o completamente sintética. El término también abarca cualquier polipéptido o proteína que comprende un sitio de unión anticuerpo-antígeno. Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de unión anticuerpo-antígeno incluyen, pero no se limitan a, moléculas tales como Fab, Fab’, Fab’-SH, scFv, Fv, dAb y Fd. Se han obtenido mediante ingeniería genética otras moléculas de anticuerpo diversas incluyendo uno o más sitios de unión anticuerpo-antígeno, incluyendo por ejemplo Fab2, Fab3, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos e inmunoproteínas pequeñas (SIP). Las moléculas de anticuerpo y los métodos para su construcción y uso se describen en Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 2005.

Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros y usar técnicas de tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que se unen al antígeno diana. Tales técnicas pueden implicar introducir ADN que codifica para la región variable de la inmunoglobulina, o las CDR, de un anticuerpo en las regiones constantes, o regiones constantes más regiones de entramado, de una inmunoglobulina diferente. Véase, por ejemplo, los documentos EP-A-184187, GB 2188638A o EPA-239400, y una gran cantidad de bibliografía posterior. Un hibridoma u otra célula que produce un anticuerpo puede someterse a mutación genética u otros cambios, que pueden alterar o no la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.

Puesto que los anticuerpos pueden modificarse en diversas formas, debe interpretarse que el término “molécula de anticuerpo” abarca cualquier sustancia o elemento de unión que tenga un sitio de unión anticuerpo-antígeno con la especificidad y/o unión requerida al antígeno. Por tanto, este término abarca fragmentos y derivados de anticuerpo, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un sitio de unión anticuerpo-antígeno, ya sea natural o parcial o completamente sintético. Por tanto se incluyen moléculas quiméricas que comprenden un sitio de unión anticuerpoantígeno, o equivalente, fusionado a otro polipéptido (por ejemplo derivado de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo). La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describe en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023 y en una gran cantidad de bibliografía posterior.

Preferiblemente, las moléculas de anticuerpo usadas en la invención son moléculas de anticuerpo humanas o humanizadas.

Se ha demostrado que fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de unir antígenos. Ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989); McCafferty et al (1990) Nature, 348, 552-554; Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490), que consiste en un dominio VH o uno VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos

(vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), donde un dominio VH y un dominio VL están unidos mediante un ligador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno (Bird et al, Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, 1988); (viii) dímeros Fv de cadena sencilla biespecíficos (documento PCT/US92/09965) y (ix) “diacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión génica (documento WO94/13804; Holliger, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 64446448, 1993). Las moléculas de Fv, scFv o diacuerpo pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter, Y. et al, Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Un Fv de cadena sencilla (scFv) puede estar comprendido dentro de una mini-inmunoglobulina o inmunoproteína pequeña (SIP), por ejemplo tal como se describe en (Li et al., 1997). Una SIP puede comprender una molécula de scFv fusionada al dominio CH4 de la isoforma secretora de IgE humana, IgE-S2 ((S2-CH4; Batista et al., 1996) formando una molécula de anticuerpo de mini-inmunoglobulina homodimérica. Además, también pueden obtenerse minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu, S. et al, Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996). Otros ejemplos de fragmentos de unión son Fab’, que difiere de los fragmentos Fab por la adición de algunos residuos en el extremo carboxilo terminal del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo, y Fab’-SH, que es un fragmento Fab’ en el que el(los) residuo(s) de cisteína del dominio constante porta(n) un grupo tiol libre.

Qui et al., Nat. Biotechnol. 25:921-929 (2007) describieron moléculas de anticuerpo que contenían sólo dos CDR unidas mediante una región de entramado. La CDR3 del dominio VH o VL se unió al bucle de CDR1 o CDR2 del otro dominio. La unión se realizó a través del extremo C-terminal de la CDR1 o CDR2 seleccionada al extremo N-terminal de la CDR3, a través de una región FR. Qui et al. seleccionaron la región FR que tenía la menor cantidad de parches hidrófobos. Se encontró que la mejor combinación para el anticuerpo sometido a prueba era CDR1 de VL unida mediante FR2 de VH a CDR3 de VH (CDR1 de VH-FR2 de VH-CDR3 de VL). A un peso molecular de aproximadamente 3 kDa, estas moléculas de anticuerpo ofrecen ventajas en lo que se refiere a penetración tisular mejorada en comparación con inmunoglobulinas completas (aproximadamente 150 kDa) o scFv (aproximadamente

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28 kDa).

Los fragmentos de anticuerpo de la invención pueden obtenerse partiendo de una molécula de anticuerpo parental mediante métodos tales como digestión por enzimas por ejemplo, pepsina o papaína y/o mediante escisión de los puentes disulfuro por reducción química. De otro modo, los fragmentos de anticuerpo comprendidos en la presente invención pueden obtenerse mediante técnicas de recombinación genética, conocidas asimismo por el experto en la técnica o también mediante síntesis de péptidos por medio de, por ejemplo, sintetizadores de péptidos automáticos, tales como los suministrados por la empresa Applied Biosystems, etc., o mediante síntesis y expresión de ácidos nucleicos. Los fragmentos de anticuerpo funcionales según la presente invención incluyen cualquier fragmento funcional cuya semivida se aumente mediante una modificación química, especialmente mediante pegilación, o mediante la incorporación en un liposoma.

Un dAb (anticuerpo con un solo dominio) es un fragmento de unión a antígeno monomérico pequeño de un anticuerpo, concretamente la región variable de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo (Holt et al (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490). Los dAb de VH se producen de manera natural en camélidos (por ejemplo camello, Ilama) y pueden producirse inmunizando un camélido con un antígeno diana, aislando las células B específicas de antígeno y clonando directamente genes de dAb procedentes de células B individuales. Los dAb también pueden producirse en cultivo celular. Su pequeño tamaño, buena solubilidad y estabilidad frente a la temperatura los hacen particularmente útiles desde el punto de vista fisiológico y adecuados para la selección y maduración de la afinidad. Se han desarrollado dAb de VH de camélidos para uso terapéutico con el nombre “nanobodies™”. Una molécula de anticuerpo de la presente invención puede ser un dAb. La molécula de anticuerpo comprende un dominio VH o VL sustancialmente tal como se expone en el presente documento, o un dominio VH o VL que comprende un conjunto de CDR sustancialmente tal como se expone en el presente documento.

Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales forman una segunda generación de anticuerpos monoclonales en los que se combinan dos regiones variables diferentes en la misma molécula (Holliger y Bohlen, Cancer and metastasis rev. 18: 411-419, 1999). Se ha demostrado su uso tanto en el campo diagnóstico como en el campo terapéutico a partir de su capacidad para reclutar nuevas funciones efectoras o para seleccionar como diana varias moléculas sobre la superficie de células tumorales. Cuando van a usarse anticuerpos biespecíficos, estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, que pueden fabricarse en una diversidad de formas (Holliger, P. y Winter

G. Current Opinion Biotechnol 4, 446-449, 1993), por ejemplo pueden prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpo biespecífico mencionados anteriormente. Estos anticuerpos pueden obtenerse mediante métodos químicos (Glennie M J et al., 1987 J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp R. et al., 1995 J. Hemat. 377-382) o métodos somáticos (Staerz U. D. y Bevan M. J. 1986 PNAS 83; Suresh M. R. et al., 1986 Method Enzymol. 121: 210-228) pero también y preferiblemente mediante técnicas de ingeniería genética que permiten que se fuerce la heterodimerización y por tanto facilitan el procedimiento de purificación del anticuerpo buscado (Merchand et al., 1998 Nature Biotech. 16:677-681). Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen los de la tecnología BiTE™ en la que pueden usarse los dominios de unión de dos anticuerpos con especificidad diferente y unirse directamente a través de péptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos en una sola cadena polipéptidica corta. Pueden construirse diacuerpos y scFv sin una región Fc usando sólo dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de una reacción antiidiotípica.

Pueden construirse anticuerpos biespecíficos como IgG entera, como Fab’2 biespecífico, como Fab’PEG, como diacuerpos o también como scFv biespecífico. Además, pueden unirse dos anticuerpos biespecíficos usando métodos de rutina conocidos en la técnica para formar anticuerpos tetravalentes.

Los diacuerpos biespecíficos, al contrario que los anticuerpos completos biespecíficos, también pueden ser particularmente útiles porque pueden construirse y expresarse fácilmente en E. coli. Pueden seleccionarse fácilmente diacuerpos (y cualquier otro polipéptido, tal como fragmentos de anticuerpo) con especificidades de unión apropiadas usando presentación en fagos (documento WO94/13804) a partir de bibliotecas. Si va a mantenerse constante un brazo del diacuerpo, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antígeno de la neovasculatura tumoral, entonces puede obtenerse una biblioteca donde se varía el otro brazo y se selecciona un anticuerpo de especificidad apropiada. Los anticuerpos completos biespecíficos pueden obtenerse mediante métodos de ingeniería genética alternativos tal como se describe en Ridgeway et al., 1996 (Ridgeway, J. B. B. et al, Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

Se dispone en la técnica de diversos métodos para obtener anticuerpos contra un antígeno diana. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, especialmente de origen humano, murino, quimérico o humanizado, que pueden obtenerse según los métodos convencionales bien conocidos por el experto en la técnica.

En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible hacer referencia a técnicas que se describen en particular en el manual “Antibodies” (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) o a la técnica de preparación de hibridomas descrita por Köhler y Milstein (Köhler y Milstein, Nature, 256:495-497, 1975).

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales, por ejemplo, a partir de una célula animal inmunizada contra el

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valencia de la molécula de anticuerpo. Alternativamente, múltiples sitios de unión a antígeno pueden unirse a antígenos diferentes (el antígeno diana y uno o más de otro antígeno), y esto puede usarse para añadir funciones efectoras, prolongar la semivida o mejorar la administración in vivo de la molécula de anticuerpo.

Específico

Esto puede usarse para hacer referencia a la situación en la que un miembro de un par de unión específico no mostrará ninguna unión significativa a moléculas distintas de su(s) pareja(s) de unión específica(s). Por ejemplo, un anticuerpo específico para la isoforma con EDA de fibronectina puede mostrar poca o ninguna unión a otras isoformas de fibronectina. Un anticuerpo específico para el dominio ED-A de fibronectina puede mostrar poca o ninguna unión a otros dominios de fibronectina.

El término también puede aplicarse cuando, por ejemplo, un dominio de unión a antígeno es específico para un epítopo particular que es portado por varios antígenos, en cuyo caso el elemento de unión específico que porta el dominio de unión a antígeno podrá unirse a los diversos antígenos que portan el epítopo.

Comprender

Esto se usa generalmente en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o más características o componentes.

Por “sustancialmente tal como se expone” quiere decirse que la CDR o el dominio VH o VL relevante de la invención será o bien idéntico o altamente similar a las regiones especificadas cuya secuencia se expone en el presente documento. Por “altamente similar” se contempla que pueden realizarse desde 1 hasta 5, preferiblemente desde 1 hasta 4 tal como de 1 a 3, o 1 ó 2, o 3 ó 4, sustituciones en la CDR y/o el dominio VH y/o VL.

La estructura para llevar a cabo una CDR de la invención será generalmente la de la secuencia de cadena pesada o ligera de un anticuerpo o parte sustancial de la misma en que se ubica la CDR en una ubicación correspondiente a la CDR de los dominios variables de anticuerpo VH y VL que se producen de manera natural codificados por los genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y las ubicaciones de las CDR y los dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse haciendo referencia a (Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4.ª Edición. Departamento de salud y servicios humanos de los EE.UU., 1987, y actualizaciones del mismo, disponible ahora en Internet (http://immuno.bme.nwu.edu)).

Fibronectina

La fibronectina (FN) es una glicoproteína y se expresa ampliamente en una variedad de tejidos y fluidos corporales normales. Es un componente de la matriz extracelular (MEC), y desempeña un papel en muchos procesos biológicos, incluyendo adhesión celular, migración celular, hemostasia, trombosis, cicatrización de heridas, diferenciación tisular y transformación oncogénica.

La fibronectina se somete a corte y empalme alternativo, y se conocen varias isoformas alternativas de fibronectina. El dominio extra-A (EDA o ED-A) también se conoce como ED, repetición A de tipo III extra (EIIIA) o EDI. La secuencia de EDA humana se ha publicado por Kornblihtt et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868 y Paolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557. La secuencia de ED-A humana (SEQ ID NO: 39) también está disponible en la base de datos SwissProt como los aminoácidos 1631-1720 (fibronectina tipo III 12; dominio extra 2) de la secuencia de aminoácidos depositada con el número de registro P02751. La secuencia de ED-A de ratón está disponible en la base de datos SwissProt como los aminoácidos 1721-1810 (fibronectina tipo III 13; dominio extra 2) de la secuencia de aminoácidos depositada con el número de registro P11276.

La isoforma con ED-A de fibronectina (A-FN) contiene el dominio extra-A (ED-A). La secuencia de la AFN humana puede deducirse a partir de la secuencia del precursor de fibronectina humana correspondiente que está disponible en la base de datos SwissProt con el número de registro P02751. La secuencia de la A-FN de ratón puede deducirse a partir de la secuencia del precursor de fibronectina de ratón correspondiente que está disponible en la base de datos SwissProt con el número de registro P11276. La A-FN puede ser la isoforma con ED-A humana de fibronectina. El ED-A puede ser el dominio extra-A de la fibronectina humana.

El ED-A es una secuencia de 90 aminoácidos que se inserta en la fibronectina (FN) mediante corte y empalme alternativo y se ubica entre los dominios 11 y 12 de FN (Borsi et al., 1987, J. Cell Biol., 104, 595-600). El ED-A está ausente principalmente en la forma plasmática de FN pero es abundante durante la embriogénesis, remodelación tisular, fibrosis, trasplante cardiaco y crecimiento de tumores sólidos.

“Y/o”, cuando se usa en el presente documento, ha de considerarse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo “A y/o B” ha de considerarse como la divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si se expone cada uno individualmente en el presente documento.

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3% + MgCl2 2 mM. Se usó el sustrato Fast Red (Sigma) para la detección de la actividad fosfatasa. Se contratiñeron los cortes con hematoxilina de Gill n.º 2 (Sigma) y se montaron con medio de montaje Glycergel (Dako, Glostrup, Dinamarca).

Estudios de inmunofluorescencia multicolor

Se usaron anticuerpos biotinilados en un formato de inmunoproteína pequeña (SIP) en condiciones idénticas (2 g/ml). Se prepararon alícuotas a partir de un solo lote de anticuerpos, se congelaron y se usaron sólo una vez para garantizar la reproducibilidad de las tinciones inmunohistoquímicas.

Se fijaron cortes de 10 m de grosor en acetona helada y se bloquearon con suero bovino fetal al 20% en PBS. Se añadieron F8-SIP (V5L/K18R) y 4A1-F16-SIP biotinilados sobre los cortes en una concentración final de 2 g/ml en disolución al 3% de albúmina sérica bovina (BSA)/PBS y se incubaron durante una hora. Se usó anticuerpo de ratón anti-vWF (factor de von Willebrandt factor) humano para perfilar las células endoteliales. Tras lavar en PBS, se detectaron anticuerpos primarios unidos con estreptavidina-Alexa Fluor 488 y se usaron anticuerpos anti-IgG de ratón-Alexa Fluor 594 (Invitrogen) como anticuerpos secundarios. Se contratiñeron los núcleos con DAPI y se capturaron las imágenes en un microscopio Axioskop 2 Mot plus equipado con una cámara AxioCam MRc (Zeiss).

Modelo de ratón de leucemia humana

El modelo de ratón para leucemia humana usado en este caso se describió previamente en Potter et al. (1984). Específicamente, se sometieron a xenoinjerto ratones atímicos con células de la línea celular de leucemia HL-60 y, tras el desarrollo de tumores HL-60 (sarcomas granulocíticos), se obtuvieron muestras tanto de dichos tumores como de la médula ósea de los ratones. Entonces se realizaron estudios de inmunohistoquímica tal como se describe en “inmunohistoquímica” anteriormente.

Resultados

El análisis de inmunohistoquímica mostró que el anticuerpo 4A1-F16-SIP podía teñir la inmensa mayoría de los vasos sanguíneos en la médula ósea de pacientes con LMA. El anticuerpo F8-SIP (V5L/K18R) también tiñó una gran proporción de estos vasos sanguíneos pero menos de los observados con el anticuerpo 4A1-F16-SIP. Estos resultados se muestran en las figuras 1A y B.

Se obtuvieron resultados similares cuando se sometieron biopsias de médula ósea de dos pacientes con LMA extramedular a análisis de inmunohistoquímica. El anticuerpo 4A1-F16-SIP tiñó fuertemente los vasos sanguíneos presentes en las biopsias de médula ósea en ambos casos. El nivel de tinción observado con el anticuerpo F8-SIP (V5L/K18R) fue similar al observado usando el anticuerpo 4A1-F16-SIP en una biopsia (figura 2B) pero más débil en el otro (figura 2A).

Las diferencias en el nivel de tinción observado con los anticuerpos F8-SIP (V5L/K18R) y 4A1-F16-SIP puede deberse a diferencias en el nivel de expresión del dominio A1 de tenascina-C en relación con la isoforma con ED-A de fibronectina en los vasos sanguíneos de médula ósea de pacientes con LMA.

Estudios de inmunofluorescencia multicolor de zonas de médula ósea de pacientes con LMA con altas densidades de blastocitos mostraron adicionalmente una co-ubicación excelente del anticuerpo 4A1-F16-SIP con anticuerpos específicos para el factor de von Willebrand (vWF).

Los anticuerpos 4A1-F16 SIP y F8-SIP (V5L/K18R) también tiñeron cortes de tumores HL-60 obtenidos de un modelo de ratón de leucemia humana. Específicamente, ambos anticuerpos tiñeron fuertemente los vasos presentes en los cortes de tumor HL-60 (sarcoma granulocítico), mientras que no fue visible ninguna tinción en los cortes de médula ósea sana obtenidos de los mismos ratones (figura 3).

Estos resultados muestran por primera vez que existen antígenos que se expresan de manera diferencial en la neovasculatura de médula ósea, en particular, la neovasculatura de médula ósea de pacientes con leucemia, en comparación con tejidos normales. Los resultados también muestran que los mismos antígenos también se expresan de manera diferencial en la neovasculatura de tumores formados por células leucémicas, tales como sarcomas granulocíticos, en comparación con tejidos normales. Por tanto, estos antígenos representan dianas atractivas para el desarrollo de estrategias de administración farmacológica selectivas y eficaces en el tratamiento de enfermedades caracterizadas por neovasculatura de médula ósea, tales como leucemia. En particular, como los agentes administrados por vía sistémica tienen a menudo un acceso más fácil a las dianas presentes en la vasculatura desde el torrente circulatorio, se supera el problema del acceso y se permite una administración eficaz del compuesto al sitio de enfermedad.

Por ejemplo, los antígenos expresados en neovasculatura de médula ósea, tal como la neovasculatura de médula ósea de pacientes con leucemia, pueden seleccionarse como diana usando anticuerpos que pueden unirse a dichos antígenos. Conjugando agentes bioactivos con dichos anticuerpos, los agentes bioactivos pueden administrarse

directamente a la neovasculatura de médula ósea. La selección como diana selectiva del agente bioactivo al sitio de enfermedad dará como resultado en última instancia un aumento de la concentración local en su sitio de acción, reduciendo o eliminando así la exposición de tejidos normales a cualquier efecto tóxico del agente bioactivo usado. Una administración dirigida puede mejorar el índice terapéutico del agente bioactivo administrado proporcionando

5 una mayor eficacia con efectos secundarios minimizados. Además, el perfil de toxicidad favorable de agentes terapéuticos específicos de sitio puede abrir nuevas vías en la terapia de enfermedades caracterizadas por neovasculatura de médula ósea, tales como leucemia, permitiendo la administración sistémica de agentes altamente potentes y prometedores, que actualmente o bien se administran a dosis subóptimas o cuya aplicación clínica se ha impedido hasta la fecha por toxicidades inaceptables cuando se aplican en forma no modificada.

10 Secuencias – Anticuerpo 4A1-F16

SEQ ID NO: 1. secuencia de nucleótidos del dominio VH de 4A1-F16

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SEQ ID NO: 2 secuencia de aminoácidos del dominio VH de 4A1-F16

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SEQ ID NO: 3 secuencia de nucleótidos del dominio VL de 4A1-F16

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25 SEQ ID NO: 4 secuencia de aminoácidos del dominio VL de 4A1-F16

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SEQ ID NO: 5 secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH de 4A1-F16

30

RYGMS

SEQ ID NO: 6 secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH de 4A1-F16

35 AISGSGGSTYYADSVKG

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Claims

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