CN104768563B - 与炎性肠病有关的抗原 - Google Patents

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Abstract

结合纤维连接蛋白的ED‑A同种型的特异性结合成员，其可用于炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的治疗、诊断、检测和/或成像方法中，和/或用于将缀合至该特异性结合成员的分子递送至IBD组织。该特异性结合成员可(例如)缀合至免疫抑制性或抗炎性分子，例如白介素‑10。

Description

与炎性肠病有关的抗原
【技术领域】
本发明是关于炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的治疗和检测。本发明牵涉结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员的使用，特别是结合纤维连接蛋白的结构域ED-A的特异性结合成员。该特异性结合成员可(例如)缀合至免疫抑制性或抗炎性分子，例如白介素-10。
【先前技术】
炎性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)是一群影响结肠与小肠的炎性病况。IBD的主要类型为克罗恩氏病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)。IBD致病机理的特征为造成和维持肠内慢性发炎状态的不同血管发生性调节作用(Chidlow et al.,2006,Am J Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,29,G5-G18)。克罗恩氏病可影响胃肠道的任何部分，而溃疡性结肠炎则通常受限于结肠和直肠(SummersRW,Elliott DE,Qadir K,Urban JF,Thompson R,Weinstock JV(2003)Am.J.Gastroentol.,98:2034-2041)。依据其严重性，溃疡性结肠炎的治疗可能需要免疫抑制作用以控制其症状，且治疗经常牵涉施予抗炎性分子。
已知IBD的特征为促炎细胞因子的上调，例如：IFN-γ、IL-6和IL-12(如IL-12p70)。例如已知克罗恩氏病与过量的IL-12/IL-23和IFN-γ/IL-17产生有关(Strober etal.(2007),The Journal of Clinical Investigation,117(3),514-521)。亦已有克罗恩氏病活跃期间，IL-12p70与IL-23合成的报导(Fuss et al.2006,Inflamm.Bowel Dis.12:9-15)。
纤维连接蛋白(Fibronectin(FN))是一种醣蛋白，其在多种正常组织和体液中广泛表达。其是胞外基质(extracellular matrix(ECM))的组分，并参与许多生物过程，包括细胞附着、细胞迁移、止血、血栓形成、创伤愈合、组织分化和癌性转化。
不同的FN同种型是藉由原始转录体FN前mRNA(pre-mRNA)的三个区域(ED-A、ED-B、IIICS)的选择性剪接而产生，其是由细胞因子和胞外pH所调节的过程(Balza(1988)FEBSLett.,228,42-44；Carnemolla(1989)J.Cell Biol.,106,1139-1148；Borsi(1990)FEBSLett.261,175-178)。纤维连接蛋白含有两个III型球状外结构域(globular extra-domains)，其可进行选择性剪接：ED-A和ED-B(ffrench-Constant(1995)Exp.Cell Res.,22,261-271,Kaspar et al.(2006)Int.J.cancer,118,1331-1339)。小鼠纤维连接蛋白的ED-A和人纤维连接蛋白的ED-A的同一性为96.7％(这两个90氨基酸的序列之间仅有3个氨基酸不同)。
经报导乳癌(Jacobs et al.(2002)Human Pathol,33,29-38,Matsumoto et al.(1999)Jpn.J.Cancer Res.,90,320-325)和肝癌(Oyama et al.(1989)JBC,264,10331-10334,Tavian et al.(1994)Int.J.Cancer,56,820-825)的肿瘤细胞和实体肿瘤中在mRNA水平上有纤维连接蛋白ED-A的表达，而纤维肉瘤(fibrosarcoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)和黑色素瘤在分离蛋白质水平上有纤维连接蛋白ED-A的表达(Borsiet al.(1987)J.Cell Biol.,104,595-560)。除了癌症，已报导类风湿性关节炎有纤维连接蛋白的ED-A的表达(WO2009/056268)。WO2010/078950亦报导了纤维连接蛋白的ED-A在子宫内膜异位、牛皮癣和牛皮癣性关节炎中的表达，然而组织化学分析显示在多发性硬化症和溃疡性结肠炎中，ED-A的表达很弱至实际上无表达。Brenmoehl等人发表的免疫组织化学分析(Int.J.Colorectal Dis.(2007)22:611-623)显示相较于对照组黏膜，ED-A表达在CD患者的发炎肠黏膜的表达降低，而在溃疡性结肠炎则升高。Brenmoehl等人(2007)亦报导在CD患者的纤维性黏膜(fibrotic mucosa)中，ED-A和ED-B同种型的表达升高。因为已知所述纤维连接蛋白同种型与创伤愈合相关，故可预期纤维性黏膜中有ED-A和ED-B同种型表达。以CD患者的发炎肠粘膜中ED-A表达较衍生自对照组患者的黏膜低，Brenmoehl等人(2007)并未提出CD(活跃)期间ED-A发生表达。此文件中也没有公开结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的结合成员用于治疗或诊断IBD的用途。
白介素-10(IL-10)是一种抗炎性细胞因子，其功能为免疫系统的重要调控者。虽然已知IL-10在免疫系统中具有许多不同的作用，其两种主要活性包括抑制巨噬细胞的细胞因子产生，以及在T细胞活化期间抑制巨噬细胞的附属功能(Abbas A,Lichtman A,PoberJ.,1994,Cellular and Molecular Immunology.2nd Ed.Philadelphia:W.B.SaundersCompany)。这些作用的效果使得IL-10在免疫系统中主要扮演抗炎性作用。IL-10最初被称为细胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibiting factor(CSIF))，此蛋白质的发现基于的是其生物活性(Delves P,Roitt I(eds),1998,Encyclopedia of Immunology,2nd Ed.San Diego:Academic Press)。因为其众所周知的抗炎性特性，IL-10疗法被引入作为克罗恩氏病(CD)可能的新颖抗炎性治疗(Fedorak et al.,Gastroenterology(2000)119,1473-1482.；Schreiber et al.,Gastroenterology(2000)119,1461-1472；Colombelet al.,Gut(2001)49,42-46)。
Asadullah等人(Pharmacology Reviews,(2003),55,245-269)回顾了数种炎性疾病中白介素-10疗法的技术状况。在回顾慢性炎性肠病时，Asadullah等人报导进行了许多大型多中心临床试验(multicenter trial)，以患有轻微/中度CD或治疗抗性CD的患者测试多个IL-10剂量，以及藉由全身性施予进行治疗性回肠或回肠结肠切除术的患者，以预防内窥镜术后遗症(Fedorak et al.,Gastroenterology(2000)119,1473-1482.；Schreiber etal.,Gastroenterology(2000)119,1461-1472；Colombel et al.,Gut(2001)49,42-46.)。数据显示IL-10疗法是安全的且耐受性良好。然而，与安慰剂治疗相较，IL-10治疗并未造成显著较高的缓解率或临床改善。
整体而言，临床结果并不让人满意，而Herfarth和Scholmerich则有许多关于此治疗策略令人失望的讨论(Gut(2002)50,146-147)。
因此，仍有对于多种IBD状态的有效治疗的需求。
【发明内容】
本发明人意外发现，融合至IL-10的抗EDA抗体能够：(i)在IBD患病小鼠中体内选择性定位至发炎结肠的位点，和(ii)降低IBD患病小鼠中某些促炎细胞因子的血清水平，特别是干扰素-γ、IL-6和IL-12p70。
经由施予融合至IL-10的抗EDA抗体而下调促炎细胞因子特别令人意外，因为Tilg等人(Gut(2002),50,191-195)报导以重组的人IL-10治疗克罗恩氏病患者会引发干扰素-γ。Shibata等人(J.Immunol.,(1998)161,4283-4288)亦报导IL-10增强了NK细胞产生INF-γ，但抑制巨噬细胞产生诱导INF-γ的因子。
于是，在第一方面中，本发明提供一种特异性结合成员(例如：抗体分子)，其结合纤维连接蛋白(A-FN)的外结构域-A(Extra Domain-A(ED-A))同种型，用于治疗IBD的方法。本发明亦提供结合纤维连接蛋白的外结构域-A(ED-A)同种型的特异性结合成员(例如：抗体分子)，用于制造供治疗IBD的药物的用途。本发明亦提供一种治疗患者IBD的方法，该方法包含施予患者治疗有效量的药物，其包含结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员。优选地，该特异性结合成员结合人纤维连接蛋白的ED-A同种型。
用于本发明的第一方面的特异性结合成员(例如：抗体分子)，可结合纤维连接蛋白的ED-A。
用于本发明的第一方面的特异性结合成员(例如：抗体分子)，可缀合至具有免疫抑制性或抗炎性活性的分子、可检测标记、放射性同位素或生物活性分子，例如：细胞因子、激素、治疗性放射性同位素、细胞毒性药物。该特异性结合成员可由可切割的连接子缀合至该生物活性分子。
在一个优选实施例中，该特异性结合成员(例如：抗体分子)被缀合至具有免疫抑制性或抗炎性活性的分子，例如：IL-10。
IBD，如本文所称，可为活性IBD。具体而言，该IBD可为克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎(collagenous colitis)、淋巴细胞性结肠炎(lymphocytic colitis)、缺血性结肠炎(ischaemic colitis)、分流性结肠炎(diversion colitis)、贝赛特氏病(
Figure BDA0000688307660000051
disease)或未定型结肠炎(indeterminate colitis)。该IBD可为CD或UC。该IBD可为CD、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、分流性结肠炎、贝赛特氏病或未定型结肠炎。在一个实施方案中，该IBD不是UC。该IBD可为通常发炎作用不限于结肠和直肠的IBD，例如：CD。IBD可为不仅止影响结肠内膜的IBD。优选地该IBD是CD。本文所使用的术语CD、UC、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、分流性结肠炎、贝赛特氏病和未定型结肠炎，可分别代表活性CD、活性UC、活性胶原性结肠炎、活性淋巴细胞性结肠炎、活性缺血性结肠炎、活性分流性结肠炎、活性贝赛特氏病和活性未定型结肠炎。
在第二方面中，本发明提供结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员(例如：抗体分子)，用于将缀合至该特异性结合成员的分子传递至IBD组织。本发明亦提供结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员(例如：抗体分子)，用于制造供将缀合至该特异性结合成员的分子递送至IBD组织的药物。本发明亦提供一种将分子传递至人或动物内IBD组织的方法，其中该分子被缀合至结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员以形成缀合物，该方法包含将该缀合物施予该人或动物。优选地，该特异性结合成员结合人纤维连接蛋白的ED-A同种型。
本发明的第二方面中使用的特异性结合成员(例如：抗体分子)可结合纤维连接蛋白的ED-A。
本发明的第二方面中使用的特异性结合成员(例如：抗体分子)可缀合至可检测性标记、放射性同位素或生物活性分子，例如：细胞因子、激素、治疗性放射性同位素或细胞毒性药物。该特异性结合成员可藉由可切割的连接子缀合至该生物活性分子。
该特异性结合成员(例如：抗体分子)优选地缀合至IL-10。
在第三方面中，本发明提供一种结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员(例如：抗体分子)以用于诊断IBD的方法。本发明亦提供结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员用于制造供诊断IBD的诊断产品的用途。本发明亦提供一种检测或诊断人或动物中IBD的方法，其中该方法包含下列步骤：
(a)向该人或动物施予结合纤维连接蛋白的ED-A结构域的特异性结合成员，和
(b)测定该特异性结合成员存在或不存在于该人体或动物体中的IBD位置，其中该特异性结合成员区域定位至IBD的位置代表IBD存在。
优选地，该特异性结合成员结合人纤维连接蛋白的ED-A同种型。
本发明的第三方面中使用的特异性结合成员(例如：抗体分子)可结合纤维连接蛋白的ED-A。
本发明的第三方面中使用的特异性结合成员(例如：抗体分子)可缀合至可检测标记或放射性同位素。
在第四方面中，本发明提供一种结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员以用于对IBD组织成像的方法。本发明亦提供结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员，用于制造供对IBD组织成像的成像剂的用途。本发明亦提供一种检测人或动物中IBD组织或对其成像的方法，其中该方法包含下列步骤：
(a)向该人或动物施予结合纤维连接蛋白的ED-A结构域的特异性结合成员，和
(b)检测该特异性结合成员与人体或动物体内的IBD组织的结合。
优选地，该特异性结合成员结合人纤维连接蛋白的ED-A同种型。
本发明的第四方面中使用的特异性结合成员(例如：抗体分子)可结合纤维连接蛋白的ED-A。
本发明的第四方面中使用的特异性结合成员(例如：抗体分子)可缀合至可检测标记或放射性同位素。
在第五方面中，本发明提供一种缀合物，其包含缀合至IL-10的结合纤维连接蛋白的ED-A同种型(例如：ED-A)的结合成员，其中该缀合物具有如SEQ ID NO:13所示的序列。此缀合物在本文中称为F8-IL10。因为此缀合物的VH和VL结构域是藉由5个氨基酸的连接子连接(参见图1B)，预期该缀合物在溶液中形成非共价性同型二聚体。
本发明使用的特异性结合成员可为结合纤维连接蛋白的ED-A同种型和/或纤维连接蛋白的ED-A的抗体分子，其中该抗体包含本文所述的F8抗体的一个或多个互补决定区(CDR)。所述序列提供于下文(参见SEQ ID NO:1-6)。F8抗体的CDR序列亦显示于图1。
本发明使用的特异性结合成员可包含一个或多个本文所述的CDR(例如：CDR3)，且任选地包含CDR1和CDR2，以形成一组CDR。
优选地，本发明使用的特异性结合成员包含一组本文所述的F8抗体的H和/或L抗体CDR，在所公开的H和/或L CDR组中带有十个或更少(例如：一个、二个、三个、四个或五个)氨基酸取代。
取代作用可能在该组CDR中的任何残基发生，且可在CDR1、CDR2和/或CDR3中。
本发明使用的特异性结合成员可包含抗体分子，例如：人抗体分子。该特异性结合成员通常包含抗体VH和/或VL结构域。特异性结合成员的VH结构域亦提供用于本发明中。各VH和VL结构域中包含互补决定区(CDR)和构架区域(FR)。VH结构域包含一组HCDRs，而VL结构域包含一组LCDR。抗体分子可包含抗体VH结构域，其包含VH CDR1、CDR2和CDR3与构架。其可替代性或同时包含抗体VL结构域，其包含VL CDR1、CDR2和CDR3与构架。所有本文所公开的VH和VL序列、CDR序列、CDR组和HCDR组与LCDR组，均代表本发明使用的特异性结合成员的实施方式。如本文所述，“一组CDR”包含CDR1、CDR2和CDR3。因此，一组HCDR代表HCDR1、HCDR2和HCDR3，而一组LCDR代表LCDR1、LCDR2和LCDR3。除非另有指明，“一组CDR”包括HCDR和LCDR。
本发明使用的特异性结合成员可包含抗体VH结构域，其包含互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3与构架，其中HCDR1是SEQ ID NO:1，且其中任选的HCDR2是SEQ ID NO:2和/或HCDR3是SEQ ID NO:3。
一般而言，VH结构域与VL结构域配对以提供抗体抗原结合位点，虽然如下文的进一步论述，VH或VL结构域单独可能用来结合抗原。因此，本发明使用的特异性结合成员可进一步包含抗体VL结构域，其包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3与构架，其中LCDR1是SEQID NO:4，且其中任选地LCDR2是SEQ ID NO:5和/或LCDR3是SEQ ID NO:6。
本发明使用的特异性结合成员优选地可包含纤维连接蛋白的ED-A的抗体分子，其中该抗体分子包含VH结构域和VL结构域，其中该VH结构域包含构架和一组互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，且其中该VL结构域包含互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3与构架，且其中：
HCDR1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列；
HCDR2具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列；
HCDR3具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列；
LCDR1具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
LCDR2具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列；和
LCDR3具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
一个或多个CDR或抗体的一组CDR可被接枝至构架(例如：人构架)中，以提供用于本发明的抗体分子。构架区域可包含人生殖细胞基因区段序列。因此，该构架可为种系化的，藉以改变构架内的一个或多个残基，以使之与最相似的人种系构架中相当位置的残基相符。本发明使用的特异性结合成员可为具有VH结构域的分离抗体分子，该VH结构域包含人种系构架中的一组HCDR(例如：DP47)。该特异性结合成员通常亦具有包含一组LCDR(例如在人种系构架中)的VL结构域。该VL结构域的人种系构架可为DPK22。
本发明使用的VH结构域可以优选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:7，其是F8抗体的VH结构域。本发明使用的VL结构域可优选地具有氨基酸序列SEQ ID NO:8，其是野生型F8抗体的VL结构域。
本发明使用的特异性结合成员可为或包含单链Fv(scFv)，其包含由肽连接子链接的VH结构域和VL结构域。熟练技术人员可选择连接子的适当长度与序列，例如：至少为5个或至少为10个氨基酸长，至多约15个、至多约20个或至多约25个氨基酸长。该连接子可具有氨基酸序列GGSGG(SEQ ID NO:9)。
该特异性结合成员可为双功能抗体(diabody)，其是由基因融合所建构的多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger et al.(1993a),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448)。
优选地，该特异性结合成员是scFv，其在溶液中形成(稳定的)非共价同型二聚体。例如：本文所述的F8抗体和F8-IL10缀合物均包含scFv，其预期在溶液中形成(稳定的)非共价同型二聚体。
单链Fv(scFv)可被包含在微型免疫球蛋白(mini-immunoglobulin)或小型免疫蛋白(small immunoprotein(SIP))中(例如Li et al.,(1997),Protein Engineering,10:731-736所述)。SIP可包含融合至人IgE分泌性同种型IgE-S2的CH4结构域的scFv分子(εS2-CH4；Batista et al.,(1996),J.Exp.Med.,184:2197-205)，形成同型二聚体性的微型免疫球蛋白抗体分子。
或者，本发明使用的特异性结合成员可包含非抗体分子中的抗原结合位点，一般由一个或多个CDR提供，例如：在非抗体蛋白质支架中的一组CDR。特异性结合成员(包括非抗体和抗体分子)在本文其他部分有更详细的描述。
本发明使用的特异性结合成员可为抗体分子，其包含如SEQ ID NO:7所示的F8抗体的VH结构域和/或如SEQ ID NO:8所示的F8抗体的VL结构域。本发明使用的特异性结合成员可为包含如SEQ ID NO:11所示的序列的抗体分子。本发明的缀合至IL-10的特异性结合成员可包含如SEQ ID NO:13所示的序列。
本发明使用的特异性结合成员亦可包含抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F1、B7、E8或G9或其变体的一个或多个(例如：全部六个)CDR，或者抗ED-A抗体H1、B2、C5、D5、E5、C8、F1、B7、E8或G9或其变体的VH和/或VL结构域。所述抗体的CDR序列与VH和VL结构域序列公开于WO2010/078950。
本发明使用的适当变体包含抗体抗原结合位点，其包含本文所述的F8抗体的VH结构域和VL结构域，其中如SEQ ID NO:7所示的VH结构域中位置5的亮氨酸(L)残基被缬氨酸(V)所取代，和/或如SEQ ID NO:8所示的VL结构域中位置18的精氨酸(R)残基被赖氨酸(K)所取代。
本发明的所述和其他方面在下文有更详细的描述。
【附图简单说明】
图1A显示抗ED-A F8抗体重链(VH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。抗ED-A F8抗体的重链CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)以下划线标出。抗ED-A F8抗体的重链CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)以斜体字加下划线显示。抗ED-A F8抗体的重链CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)以粗体字加下划线显示。图1B显示VH和VL结构域之间抗ED-A F8抗体连接子序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)。图1C显示抗ED-A F8抗体轻链(VL)的氨基酸序列(SEQID NO:8)。抗ED-A F8抗体的轻链CDR1的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)以下划线显示。抗ED-AF8抗体的轻链CDR2的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)以斜体字加下划线呈现。抗ED-A F8抗体的轻链CDR3的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)以粗体字加下划线显示。图1D显示当抗体缀合至IL-10时，F8抗体和IL-10之间连接子的氨基酸序列。图1E显示人IL-10的氨基酸序列。
图2显示IBD小鼠和健康小鼠的结肠自显影结果。收集结肠并将其暴露于磷成像屏(Molecular Dynamics)24小时，并经由Storm 860成像。第1道：注射后6小时收集自第0组的结肠(健康小鼠)；第2道：注射后6小时收集自第2组的结肠(IBD小鼠)；
第3道：注射后24小时收集自第0组的结肠(健康小鼠)；第4道：注射后24小时收集自第2组的结肠(IBD小鼠)。
图3显示125I-F8-IL10在健康和患病小鼠中的生物分布。图表显示注射后6小时(A)、注射后24小时(B)和注射后96小时(C)125I-F8-IL10在健康和患病小鼠中的生物分布。于96小时，相较于健康小鼠，明显可见125I-F8-IL10倾向累积在患病小鼠的结肠和肠系膜淋巴结(L.N.)。所述实验中所用的F8-IL10缀合物的序列如SEQ ID NO:13所示。
图4显示经F8-IL10处理的小鼠的细胞因子水平。上述图表代表在健康小鼠(水)、未接受治疗的患病小鼠(3％DSS)、接受小型免疫蛋白(Small Immune Protein)形式F8抗体的患病小鼠(F8SIP)、接受F8-IL10的患病小鼠(F8-IL10)的血清中细胞因子的水平。报告的细胞因子水平(表示为每ml血清中的pg蛋白质)为：白介素1β(IL1-b)、白介素12(IL-12p70)、干扰素γ(IFNγ)和白介素6(IL6)。
图5显示经F8-IL10处理的小鼠中的细胞因子水平。上述图表代表在健康小鼠(水)、未接受治疗的患病小鼠(3％DSS)、接受小型免疫蛋白(Small Immune Protein)形式F8抗体的患病小鼠(F8SIP)、接受F8-IL10的患病小鼠(F8-IL10)的血清中细胞因子的水平。报告的细胞因子水平(表示为每ml血清中的pg蛋白质)为：角质细胞衍生的趋化因子(KC)、白介素10(IL10)和肿瘤坏死因子α(TNFa)。
图6显示组织化学分析来自罹患溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的患者的结肠组织样本，其中采用SIP形式的F8抗体和冯维勒布兰德因子进行探测。以F8抗体和温韦伯因子观察到的染色结果显示，F8在罹患溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的患者中对新形成血管染色，但不对正常血管染色。(温韦伯因子常规上作为正常血管的标记。)
图7显示罹患溃疡性结肠炎和克罗恩氏病患者的患部结肠组织样本(右)和非患部结肠样本(左)的组织化学分析。以F8抗体观察到的染色结果显示F8对患病结肠中新形成血管更为强烈地染色。
术语
纤维连接蛋白
纤维连接蛋白是一种进行选择性剪接的抗原，如本文在他处所述，目前已知数种选择性同种型。外结构域-A(Extra Domain-A(EDA或ED-A))也已知为ED、外部III型重复序列A(extra type III repeat A(EIIIA))或EDI。人ED-A的序列已经由Kornblihtt等人((1984),Nucleic Acids Res.12,5853-5868)和Paolella等人((1988),Nucleic AcidsRes.16,3545-3557)公开。人ED-A的序列亦可在SwissProt数据库，以登录号P02751保存的氨基酸序列的氨基酸1631-1720(III型纤维连接蛋白12；外结构域2)获得。小鼠ED-A的序列可在SwissProt数据库，以登录号P11276保存的氨基酸序列的氨基酸1721-1810(III型纤维连接蛋白13；外结构域2)获得。
纤维连接蛋白的ED-A同种型含有外结构域A(Extra Domain-A(ED-A))。人A-FN的序列可从相对应的人纤维连接蛋白前体序列推导得到，该前体序列可在SwissProt数据库以登录号P02751取得。小鼠A-FN的序列可从相对应的小鼠纤维连接蛋白前体序列推导得到，该前体序列可在SwissProt数据库以登录号P11276取得。A-FN可为纤维连接蛋白的人ED-A同种型。ED-A可为人纤维连接蛋白的外结构域A。
ED-A是90个氨基酸的序列，其是藉由选择性剪接插入纤维连接蛋白(FN)中，并位于FN的结构域11与12之间(Borsi et al.,1987,J.Cell Biol.,104,595-600)。ED-A大体上不存在于FN的血浆形式中，但在胚胎形成、组织重塑、纤维化、心脏移植和实体肿瘤形成期间却含量丰富。
选择性剪接
选择性剪接代表剪接DNA的原始RNA转录体时，发生不同剪接方式而产生不同mRNA。在切除内含子后，选择作用可决定哪些外显子被剪接在一起而形成mRNA。选择性剪接产生含有不同外显子和/或不同数量的外显子的不同同种型。例如，一种同种型可包含对应于一个或多个外显子的额外氨基酸序列，其可包含一个或多个结构域。
特异性结合成员
此术语描述特异性地彼此结合的一对分子中的一个成员。特异性结合分子对的成员可为自然衍生或全体或部分由人工合成。该分子对的一个成员在其表面上具有结合至并因而与该分子对的另一成员的特定空间与极性组织互补的区域或腔。结合分子对类型的实例是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本发明涉及抗原-抗体类型反应。
特异性结合成员一般包含具有抗原结合位点的分子。例如：特异性结合成员可为抗体分子或包含抗原结合位点的非抗体蛋白质。本文中所称的特异性结合成员优选是抗体分子。
抗原结合位点可藉由在非抗体蛋白质支架(例如纤维连接蛋白或细胞色素B等)上排布互补决定区(CDR)的方式提供(Haan&Maggos,(2004),BioCentury,12(5):A1-A6；Koideet al.,(1998),Journal of Molecular Biology,284:1141-1151；Nygren et al.,(1997),Current Opinion in Structural Biology,7:463-469)，或藉由将蛋白质支架中环的氨基酸残基随机化或突变的方式提供，以赋予对于目标靶的结合特异性。用于在蛋白质中加工新的结合位点的支架已由Nygren等人详尽回顾(1997)(Current Opinion inStructural Biology,7:463-469)。用作抗体模拟物的蛋白质支架公开于WO/0034784，在该文献中发明人描述了包括纤维连接蛋白III型结构域(具有至少一个随机化环)的蛋白质(抗体模拟物)。移植一个或多个CDR(例如：一组HCDR)的适当支架可由免疫球蛋白基因超家族(gene superfamily)的任何结构域成员提供。该支架可为人或非人蛋白质。非抗体蛋白质支架的优势为其可在相较于至少某些抗体分子而言较小和/或较容易操作的支架分子中提供抗原结合位点。小尺寸的结合成员可赋予有用的生理特性，例如：能够进入细胞、穿透至组织深处或到达其他结构内的目标、或结合至目标抗原的蛋白质腔中。抗原结合位点在非抗体蛋白质支架中的用途回顾于Wess,2004,In:BioCentury,The Bernstein Report onBioBusiness,12(42),A1-A7。典型有具有适当构架和一个或多个可变环的蛋白质，在其中该环的氨基酸序列被特异性或随机化突变，以创造结合目标抗原的抗原结合位点。该蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的蛋白质A的IgG结合结构域、转铁蛋白、四连蛋白(tetranectin)、纤维连接蛋白(例如：第10纤维连接蛋白III型结构域)和脂质运载蛋白(lipocalin)。其他方式包括基于大环寡肽(cyclotide)的合成“微小体(Microbody)”(Selecore GmbH)─具有分子内二硫键的小蛋白质。
除了抗体序列和/或抗原结合位点之外，本发明使用的特异性结合成员可包含其他氨基酸例如：形成肽或多肽，诸如折迭结构域，或除了结合抗原的能力外，给予该分子以另一功能特性的氨基酸。本发明使用的结合成员可带有可检测标记，或可缀合至毒素、具免疫抑制效果或抗发炎效果的分子或靶向部分或酶(例如：通过肽键或连接子)。优选地，本发明使用的结合成员缀合至白介素10。
例如：结合成员可包含催化位置(如于酶结构域中)以及抗原结合位点，其中该抗原结合位点结合抗原并因此使该催化位点靶向该抗原。该催化位点可抑制抗原的生物功能，例如：经由切割。
如所述的，虽然CDR可由非抗体支架携带，但用于携带CDR或CDR组的结构通常是抗体重链或轻链序列或其实质上的部分，其中该CDR或CDR组位于对应于由重排的免疫球蛋白基因编码的天然存在的VH和VL抗体可变结构域的CDR或CDR组的位置。免疫球蛋白可变结构域的结构与位置可参考Kabat等人的文献(1987)(Sequences of Proteins ofImmunological Interest.4th Edition.US Department of Health and HumanServices.)以及在互联网上可获得的其更新版本(于immuno.bme.nwu.edu，或使用关键词“Kabat”以任何搜索引擎检索)确定。
提到CDR区域或CDR时，其意指Kabat等人，(1987)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,4th Edition,US Department of Health and Human Services(Kabat et al.,(1991a),Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEdition,US Department of Health and Human Services,Public Service,NIH,Washington,以及之后的版本)中所定义的免疫球蛋白重链与轻链的高变区。抗体通常包含3个重链CDR和3个轻链CDR。根据情况，本文中所用的术语CDR意指这些区域之一或数个，或甚至这些区域的全部，其含有由该抗体对该抗原或其识别的表位的亲和力负责结合的主要的氨基酸残基。
在六个短CDR序列之中，该重链的第三个CDR(HCDR3)具有较大的尺寸可变性(更大的多样性，主要因为产生该HCDR3的该基因重排的机制导致的)。虽然已知最长的尺寸为26个氨基酸，但其可短如2个氨基酸。在功能上，HCDR3在决定该抗体的特异性方面起着部分作用(Segal et al.,(1974),PNAS,71:4298-4302；Amit et al.,(1986),Science,233:747-753；Chothia et al.,(1987),J.Mol.Biol.,196:901-917；Chothia et al.,(1989),Nature,342:877-883；Caton et al.,(1990),J.Immunol.,144:1965-1968；Sharon etal.,(1990a),PNAS,87:4814-4817；Sharon et al.,(1990b),J.Immunol.,144:4863-4869；Kabat et al.,(1991b),J.Immunol.,147:1709-1719)。
抗体分子
抗体分子描述天然或部分或全部人工合成的免疫球蛋白。该术语亦涉及任何包含抗体的抗原结合位点的多肽或蛋白质。在此须了解，本发明不涉及天然形式的抗体，也就是说它们并非存在于天然环境中，而是已从天然来源经纯化而分离或获得，或其他经由基因重组而获得，或经由化学合成，且其可包括如下文所述的非天然氨基酸。包含抗体的抗原结合位点的抗体片段包括(但不限于)诸如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb、Fd；和双功能抗体的抗体分子。
有可能获得单克隆抗体以及其他抗体，以及使用重组DNA技术产生其他结合标靶抗原的抗体或嵌合分子。此技术可涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加构架区。参见，例如：EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400，以及后来的大部分文献。可使产生抗体的杂交瘤或其他细胞进行基因突变或其他改变的处理，其可能会或可能不会改变所产生抗体的结合特异性。
因为抗体可经多种方式修饰，所以术语“抗体分子”应被解释为涵盖任何具有所需特异性和/或结合至抗原的抗体之抗原结合位点的结合成员或物质。因此，此术语涵盖抗体片段以及衍生物，包括不管是天然的或者是全部或部分人工合成的任何包含抗体之抗原结合位点的多肽。因此包括含有抗体之抗原结合位点(或相等物)与另一多肽(例如：由另一物种衍生而来，或属于另一抗体类型或亚型)融合成的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023，以及后来的大部分文献。
抗体工程技术领域中可得到的更进一步技术已使得有可能分离人以及人源化抗体。例如，人杂交瘤可以由Kontermann&Dubel所述的方式制得(Kontermann&Dubel(2001),S,Antibody Engineering,Springer-Verlag New York,LLC；ISBN:3540413545)。噬菌体展示，另一种已建立用于产生结合成员的技术，于许多公开文献中已有详细的说明，诸如：WO92/01047(进一步于下文讨论)和美国专利第US5969108号、第US5565332号、第US5733743号、第US5858657号、第US5871907号、第US5872215号、第US5885793号、第US5962255号、第US6140471号、第US6172197号、第US6225447号、第US6291650号、第US6492160号、第US6521404号和Kontermann&Dubel(2001)(S,Antibody Engineering,Springer-VerlagNew York,LLC；ISBN:3540413545)。将小鼠抗体基因去活化并以人抗体基因功能性取代，同时留下小鼠免疫系统的完整的其他组份的转基因小鼠可用来分离人抗体(Mendez et al.,(1997),Nature Genet,15(2):146-156)。
合成性抗体分子的制造可藉由从以寡核苷酸合成的手段产生的基因，然后装配在适合的表达载体内而表达出来，例如：于Knappik等人(2000)(J.Mol.Biol.296,57-86)或Krebs等人(2001)(Journal of Immunological Methods,25467-84)发表的文章所述。
已显示整个抗体的片段可进行结合抗原的功能。结合片段的实例为(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward et al.(1989)Nature 341,544-546；McCafferty et al.,(1990)Nature,348,552-554；Holt et al.(2003)Trends inBiotechnology 21,484-490)，其是由VH或VL结构域组成；(v)分离的CDR区域；(vi)F(ab')2片段，一种包含两个相连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域经由肽连接子连接，使得此两个结构域能缔合形成抗原结合位点(Bird et al.(1988)Science,242,423-426；Huston et al.(1988)PNAS USA,85,5879-5883)；(viii)双特异性的单链Fv二聚物(PCT/US92/09965)；和(ix)因基因融合构建成的“双功能性抗体(diabodies)”、多价或多特异性片段(WO94/13804；Holliger et al.(1993a),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448)。Fv、scFv或双功能性抗体分子可藉由掺入二硫基桥连接该VH与VL结构域予以稳定化(Reiter et al.(1996),Nature Biotech,14,1239-1245)。亦可制造包含连接至CH3结构域的scFv的微体(minibodies)(Hu et al.(1996),Cancer Res.,56(13):3055-61)。结合片段的其他实例为Fab’，其与Fab片段的差异为在重链CH1结构域的羧基末端处添加了一些残基，包括一个或多个来自该抗体绞链区的半胱氨酸，以及Fab’-SH，其是恒定区的半胱氨基酸残基带有游离巯基基团的Fab’片段。
本发明所用的抗体片段可从任何本文所述的抗体分子(例如：包含VH和/或VL结构域或任何本文所述的抗体的CDR的抗体分子)开始，利用诸如酶(例如：胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化的方法和/或利用化学还原打断二硫桥的方法而得到。于另一方法中，本发明的抗体片段可利用本领域熟练技术人员熟知的基因重组的技术制得，或利用其他肽合成方法，例如，使用诸如Applied Biosystems等公司所提供的自动肽合成器，或核酸合成以及表达制得。
本发明的功能性抗体片段包括任何半衰期经化学修饰(特别是聚乙二醇化)或经掺入脂质体中而延长的功能性片段。
dAb(结构域抗体)是一种抗体的小单体抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变区(Holt et al.(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490)。VH dAbs天然存在于骆驼科(例如：骆驼、骆马)中，可经由以标靶抗原免疫骆驼科动物、分离抗原特异性B细胞，和直接从个别B细胞中克隆dAb基因而产生。dAb亦可于细胞培养物中生产。它们的小尺寸、良好的溶解性以及温度稳定性使得它们特别有利于生理上的应用，适合用于选择以及亲和力成熟。本发明的结合成员可为包含实质上如本文所述的VH或VL结构域的dAb，或包含含有实质上如本文所述的CDR组的VH或VL结构域的dAb。
本文中所用的词组“实质上如…所述”代表本文中所述的结合成员的VH或VL结构域的相关CDR的特征会与本文中所示的序列的指定区域相同或高度相似。针对一个或多个可变结构域的指定区域使用的表达“高度相似”，意指可以在CDR和/或VH或VL结构域中进行1至约5个(例如：1至4个，包括1至3个，或1或2个，或3个或4个)氨基酸取代。
双特异性或双官能性抗体形成第二代单克隆抗体，在其中两个相异的可变区于相同分子中组合(Holliger and Bohlen 1999Cancer and metastasis rev.18:411-419)。由所述能够恢复新的效应子功能或将许多分子靶向至肿瘤细胞表面的能力，已证实它们在诊断领域以及治疗领域内的应用。使用双特异性抗体时，它们可为常见的双特异性抗体(其可以各种方法制成(Holliger et al.(1993b),Current Opinion Biotechnol 4,446-449)，例如：由化学方法制得或从杂合杂交瘤制得)，或可为如前文所述的双特异性抗体片段中的任一种。所述抗体可经由化学方法(Glennie et al.,(1987)J.Immunol.139,2367-2375；Repp et al.,(1995)J.Hemat.377-382)或体细胞方法(Staerz U.D.and Bevan M.J.(1986)PNAS 83；Suresh et al.(1986)Method.Enzymol.121:210-228)制得，同样可由基因工程技术制备，其使得异源二聚体化作用加速，并因而促进所搜寻的抗体的纯化过程(Merchand et al.,1998Nature Biotech.16:677-681)。双特异性抗体的实例包括那些具有BiTETM技术者，其中可使用具有不同特异性的二种抗体的结合结构域，并通过短的柔性肽直接连接。这样将二个抗体组合在短的单一多肽链上。双功能性抗体和scFv可在没有Fc区域的情况下仅使用可变区构建，有可能会降低抗独特型反应的效用。
双特异性抗体可构建为完整IgG、双特异性Fab'2、Fab'PEG、双功能性抗体或其他双特异性scFv。再者，二个双特异性抗体可使用技术领域熟知的例行方法连接在一起以形成四价抗体。
与双特异性完整抗体相反，双特异性双功能性抗体亦可特别有用，因为它们可轻易地建构成且可在E.coli中表达。使用噬菌体展示系统(WO94/13804)，可从文库中轻易地选择具有适当结合特异性的双功能性抗体(和许多其他多肽，诸如抗体片段)。假如该双功能性抗体的一个臂需要保持恒定(例如，具有针对标靶抗原的特异性)，则可建立一个文库，其中另一臂是可变的，并选择具有适当特异性的抗体。双特异性完整抗体可经由在Ridgeway等人发表的文献(1996)(Protein Eng.,9,616-621)中所述的替代性工程方法制得。
技术领域中有各种方法可用于获得抗标靶抗原的抗体。该抗体可为单克隆抗体，特别是人、鼠科动物、嵌合或人源化来源的单克隆抗体，其可依照熟谙此技术人士所熟知的标准方法制得。
一般而言，在制备单克隆抗体或其功能性片段(特别是鼠科动物来源)的方面，可能参照特别地在手册“Antibodies”(Harlow and Lane,Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor N.Y.,pp.726,1988)中描述的技术，或由Kohler和Milstein(1975,Nature,256:495-497)所述的从杂交瘤制备的技术。
单克隆抗体可从，例如，经A-FN或其含有可被该单克隆抗体识别的表位的片段(例如：包含或由ED-A组成的片段，或ED-A的肽片段)中之一免疫的动物细胞取得。该A-FN(或其片段之一)可特别地根据一般的操作方法，利用基因重组从编码A-FN(或其片段)的cDNA序列中所含的核酸序列开始，利用肽合成从A-FN和/或其片段的肽序列中所包含的氨基酸序列开始，来加以制造。
例如，单克隆抗体可在亲和柱(于其上A-FN或所述含有可被该单克隆抗体识别的表位的片段(例如：包含或由ED-A组成的片段，或ED-A的肽片段)之一已预先被固定在其上)上纯化。单克隆抗体可经由层析于蛋白质A和/或蛋白质G上纯化，接着使用或不使用离子交换层析，其目的为消除残留的蛋白质污染物以及其本身中的DNA与LPS，接着使用或不使用Sepharose凝胶上的排阻层析法，其目的为消除因二聚物或其他多聚物的存在而可能产生的凝聚。可同时使用或依续使用所述技术的全体。
抗原结合位点
此术语描述结合至并互补于标靶抗原的全部或部分的分子部分。在抗体分子中，其代表抗体的抗原结合位点，并包含结合至并互补于标靶抗原的全部或部分的抗体部分。当抗原较大时，抗体可能仅结合至该抗原的特定部分，此部分被称为表位。抗体之抗原结合位点可由一个或多个抗体可变结构域提供。抗体之抗原结合位点可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
分离
分离意指一种状态，其中本发明使用的特异性结合成员或编码此特异性结合成员的核酸，通常与本发明一致。因此，如本发明的特异性结合成员、VH和/或VL结构区，可(例如)从其天然环境中分离和/或纯化而得，呈实质上纯的或均质形式，或在核酸的情况下，呈无或实质上无除编码具有所需功能的多肽的序列外的其他来源的核酸或基因。分离的成员以及分离的核酸无或实质上无与其天然相关的材料，诸如其他于所述的天然环境中发现的多肽或核酸，或当于体外或体内实施重组DNA技术制备时，于其制备的环境(例如：细胞培养物)中可发现的多肽或核酸。特异性结合成员和核酸可以稀释剂或佐剂配制，且为实用目的仍是分离的，例如：该成员通常可与明胶或其他载体(若有使用)混合，以涂覆在供免疫分析使用的微滴定板，或当应用于诊断或治疗时，可与药学可接受的载体或稀释剂混合。特异性结合成员可为天然糖基化的，或经异源真核细胞(例如：CHO或NS0(ECACC 85110503))细胞体系糖基化的，或其可为(例如，假如是于原核细胞中表达而产生)非糖基化的。
包含抗体分子的异源制品亦可用于本发明。例如，此制品可为具有全长重链与缺少C端赖氨酸的重链，具有各种糖基化程度和/或衍生化氨基酸(诸如N端谷氨酸的环化，以形成焦谷氨酸残基)的抗体的混合物。
抗原(例如：A-FN、纤维连接蛋白的ED-A)的一个或多个特异性结合成员可藉由使本发明的特异性结合成员文库与抗原或其片段(例如：包含ED-A或由ED-A组成的片段，或ED-A的肽片段)接触，并选择该文库中能够与该抗原结合的一个或多个特异性结合成员来获得。
抗体文库可利用Iterative Colony Filter Screening(ICFS)筛选。ICFS中，含有编码多种结合特异性的DNA的细菌生长在液体培养基中，当已达指数生长阶段时，将数十亿细菌分散在由合适预处理的薄膜滤纸组成的生长支持物上，并培养直到完全汇聚的菌落出现为止。第二捕获基底(trap substrate)由另一薄膜滤纸(经预先湿润并以所需要的抗原覆盖)组成。
接着将该捕获薄膜滤纸置于含有适当培养基的板上，并以生长薄膜覆盖，其中被菌落覆盖的面朝上。将所得到的夹层结构物在室温培养约16小时。因此有可能得到扩散状的抗体片段scFv编码基因的表达，因而捕获与存在于该捕获膜上的抗原特异性结合的片段。接着将该捕获薄膜以常规用于此目的的比色技术处理以将结合的抗体片段指示出来。
该捕获滤纸上彩色斑点的位置使得能够回溯至存在于生长薄膜上并制造被捕捉的抗体片段的对应菌落，收集这样的菌落并使细菌生长─将数以百万计的该细菌重复前述步骤而分散在新的培养薄膜上。进行类似的循环直到捕获薄膜上的阳性信号对应于单一阳性菌落为止，各阳性菌落代表针对筛选中所用抗原的单克隆抗体片段的可能来源。ICFS描述于例如WO0246455。
文库亦可展示在颗粒或分子复合体(例如：可复制的基因封包，诸如噬菌体(例如：T7)颗粒或其他体外展示系统)上，各粒子或分子复合体含有展示于其上的抗体VH可变结构域的编码核酸，以及任选地所展示的VL结构域的编码核酸(如存在的话)。噬菌体展示法描述于WO92/01047和例如：美国专利第US5969108号、第US5565332号、第US5733743号、第US5858657号、第US5871907号、第US5872215号、第US5885793号、第US5962255号、第US6140471号、第US6172197号、第US6225447号、第US6291650号、第US6492160号和第US6521404号。
筛选能够结合抗原并展示在噬菌体或其他文库粒子或分子复合体上的结合成员之后，可从展示该被选定的结合成员的噬菌体或其他粒子或分子复合体取得核酸。该核酸可用于后续结合成员或抗体VH或VL可变结构域的制造，其是藉由从带有取自展示该被选定结合成员的噬菌体或其他粒子或分子复合体的核酸序列的核酸进行表达而得到的。
带有该被选定结合成员的抗体VH可变结构域的氨基酸序列的抗体VH可变结构域可以分离形式提供，包含这样的VH结构域的结合成员也可以分离形式提供。
可进一步检测结合A-FN或纤维连接蛋白的ED-A或其他标靶抗原或同种型的能力，例如：与抗ED-A抗体F8竞争与A-FN或A-FN的片段(例如：纤维连接蛋白的ED-A)相结合的能力。
本发明使用的特异性结合成员可特异性结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。本发明的特异性结合成员可以与抗ED-A抗体F8(例如：scFv形式)相同或更好的亲和力结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。本发明使用的特异性结合成员可以KD为3×10-8M或更好的亲和力结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。优选地，本发明使用的特异性结合成员以KD为2×10-8M或更好的亲和力结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。更优选地，本发明使用的特异性结合成员以KD为1.7×10-8M或更好的亲和力结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。进一步更优选地，本发明使用的特异性结合成员以KD为1.4×10-8M或更好的亲和力结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。最优选地，本发明使用的特异性结合成员以KD为3×10-9M或更好的亲和力结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A。
本发明的特异性结合成员可结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A上与抗ED-A抗体F8相同的抗原决定位。
本发明使用的特异性结合成员可能不会显著结合除了A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A以外的分子。特别是该特异性结合成员可能不会结合纤维连接蛋白的其他同种型，例如纤维连接蛋白的ED-B同种型和/或IIICS同种型。
本文所公开的抗体分子的变体可制造并使用于本发明。在CDR、抗体VH或VL结构域(特别是VH和VL结构域的构架区域)和结合成员的氨基酸序列中进行取代所需的技术是本技术领域中可获得的。可制造变体序列(带有可或不可预期对活性具有最小或有益影响的取代)并测试结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A的能力，和/或任何其他所希望的性质。
其序列在本文中特别公开的任何VH和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体可如所讨论的依据本发明而使用。具体变体可包括一个或多个氨基酸序列改变(alteration)(氨基酸残基的增加、删除、取代和/或插入)，可少于约20个改变、少于约15个改变、少于约10个改变或少于约5个改变，可能为5、4、3、2或1个。改变可制造于一个或多个构架区域和/或一个或多个CDR。该改变一般不会造成功能丧失，故包含如此改变的氨基酸序列的特异性结合成员可保留结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A的能力。例如，其可能保留与其内未制造改变的特异性结合成员相同的定量结合(例如：如本文所述的检验法所测得)。包含如此改变的氨基酸序列的特异性结合成员可具有更好的结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A的能力。例如，如本文所提到的，结合ED-A同种型或纤维连接蛋白的ED-A的特异性结合成员可包含如SEQ ID NO:7所示的VH结构域和如SEQ ID NO:8所示的VL结构域，在该VH和/或VL结构域的构架区域之中带有10个或更少(例如：5、4、3、2或1个)氨基酸取代。这样的特异性结合成员可以与包含如SEQ ID NO:7所示的VH结构域和如SEQ ID NO:8所示的VL结构域的特异性结合成员相同或实质上相同的亲和力结合ED-A同种型或纤维连结蛋白的ED-A，或者以比包含如SEQ ID NO:7所示的VH结构域和如SEQ ID NO:8所示的VL结构域的特异性结合成员更高的亲和力结合ED-A同种型或纤维连结蛋白的ED-A。
本发明使用的带有CDR衍生序列的新颖VH或VL区域可利用一个或多个被选定的VH和/或VL基因的随机诱变以在整个可变结构域中产生突变而制造。在一些实施例中，于整个可变结构域或CDR组中制造一或两个氨基酸取代。另一种可使用的方法为定点诱变VH或VL基因的CDR区域。
如前文所述，实质如本文所示的CDR氨基酸序列可作为CDR携带在人抗体可变结构域或其主要部分中。实质如本文所示的HCDR3序列代表本发明的实施例，例如其中的每一个可作为HCDR3携带在人重链可变结构域或其主要部分中。
本发明所用的可变结构域可获自或衍生自任何种系或重排的人可变结构域，或可为基于已知人可变结构域的共有或真实序列的合成可变结构域。可变结构域可衍生自非人抗体。本发明使用的CDR序列(例如：CDR3)可利用重组DNA技术导入缺少CDR(例如：CDR3)的可变结构域文库(repertoire)。例如：Marks等人(1992)描述了制造抗体可变结构域文库的方法，其中将针对或邻近可变结构域区域5'端的共有引物(consensus primer)与针对人VH基因的第三构架区域的共有引物一起使用，以提供缺少CDR3的VH可变结构域文库。Marks等人进一步描述了如何将此文库与特定抗体的CDR3结合。使用类似技术的情况下，本发明的CDR3衍生序列可与缺少CDR3的VH或VL结构域文库改组，而经改组的完整VH或VL结构域与同源VL或VH结构域组合以提供本发明使用的结合成员。接着可将该文库展示于适当宿主系统中(诸如WO92/01047或任何后续的大部分文献，包括Kay,Winter&McCafferty(1996)的噬菌体系统)，以便可筛选适当的结合成员。文库可由大于104以上的个体成员组成，例如：至少105、至少106、至少107、至少108、至少109或至少1010个成员。
类似地，一个或多个或全部三个CDR可被移植到VH或VL结构域文库中，然后用来筛选结合A-FN和/或纤维连结蛋白的ED-A的结合成员。
可使用抗体F8的HCDR1、HCDR2和HCDR3中的一个或多个或抗体F8的HCDR组，和/或可使用抗体F8的LCDR1、LCDR2和LCDR3中的一个或多个或抗体F8的LCDR组。
类似地，可使用本文所公开的其他VH和VL结构域、CDR组和HCDR组和/或LCDR组。
A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A可用于筛选用来制备供治疗IBD的药物的特异性结合成员(例如：抗体分子)。该筛选可为筛选本文其它处所公开的文库。
免疫球蛋白可变结构域的主要部分可包含至少该三个CDR区域，以及它们的间插构架区域。该部分亦可包括至少约50％的第一和第四构架区域之一或两者，该50％为第一构架区域的C端的50％和第四构架区域的N端的50％。位于该可变结构域主要部分的N端或C端的额外残基可为一般不与天然存在的可变结构域区域正常相关的那些残基。例如：由重组DNA技术所制造的本发明的特异性结合成员的构建可能造成导入由连接子编码的N或C端残基以促进克隆或其他操作步骤。其他操作步骤包括导入连接子以将本文其他处所公开的可变结构域连接至另外的蛋白质，包括：抗体恒定区域、其他可变结构域(例如在双功能抗体的生产中)或如本文他处详尽描述的可检测/功能性标记。
虽然特异性结合成员可包含一对VH和VL结构域，基于VH或VL结构域序列的单一结合结构域亦可用于本发明中。已知单一免疫球蛋白结构域(特别是VH结构域)能够以特定方式结合标靶抗原。例如：参见前文对于dAbs的讨论。
以单一结合结构域而言，所述结构域可用于筛选互补结构域，其能够形成可以结合A-FN和/或纤维连接蛋白的ED-A的二结构域结合成员。此可由利用如WO92/01047中所公开的所谓阶层式双重结合方法(hierarchical dual combinatorial approach)的噬菌体展示筛选法实现，其中含有H或L链克隆的个别菌落被用来感染编码另一链(L或H)的克隆的完整文库，并根据诸如所述描述于该参考文献中的噬菌体展示技术选择所生成的二链结合成员。此技术亦公开于Marks1992。
本发明使用的特异性结合成员可进一步包含抗体恒定区域或其部分，例如人抗体恒定区域或其部分。例如：VL结构域可在其C端连接至包括人Cκ或Cλ链的抗体轻链恒定结构域(例如：Cλ)。类似地，基于VH结构域的特异性结合成员可在其C端连接至衍生自任何抗体同工型(isotype)(例如：IgG、IgA、IgE和IgM)和任何同工型亚类(特别是IgG1和IgG4)的免疫球蛋白重链的全部或部分(例如：CH1结合域)。任何具有所述性质并稳定可变区的合成或其他的恒定区域变异体亦可用于本发明的实施方案中。
本发明使用的特异性结合成员可以用可检测或功能性标记进行标记。标记可为任何产生信号或可以被引发产生信号的分子，包括但不限于荧光剂、放射性标记、酶、化学发光剂或光敏剂。因此可藉由检测荧光或发光、放射活性、酶活性或光吸收度而检测和/或测量结合。可检测标记可利用本技术领域中已知的常规化学法连接到本发明使用的抗体。
标记可以通过许多方法产生可藉由外部手段检测的信号，例如：藉由目测检查、电磁辐射、热和化学试剂。该标记亦可结合至另一个结合本发明使用的抗体的特异性结合成员，或结合至支持物。
经标记的特异性结合成员(例如：以可检测标记标记的scFv)可于体内(in vivo)、离体(ex vivo)或体外(in vitro)诊断上和/或治疗上使用。
例如：经放射标记的结合成员(例如：缀合至放射性同位素的结合成员)可使用于放射性诊断和放射性治疗中。可缀合至本发明使用的结合成员的放射性同位素包括诸如94mTc、99mTc、186Re、188Re、203Pb、67Ga、68Ga、47Sc、111In、97Ru、62Cu、64Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、123I、124I、125I、131I、18F、211At和225Ac的同位素。优选地使用诸如18F和124I的正子发射体或诸如99mTc、111In和123I的γ发射体进行诊断应用(例如：用于PET)，而诸如131I、90Y和177Lu的β发射体则优选地用于治疗应用。诸如211At和225Ac的α发射体亦可用于治疗。
例如：经可检测标记标记的本发明使用的特异性结合成员可用于检测、诊断或监测人或动物的IBD。
本发明的特异性结合成员可用于制造供诊断IBD的诊断产品。
本发明使用的结合成员和对于病灶中靶细胞发挥杀生物效果、细胞毒性免疫抑制效果或抗炎性效果的分子和针对存在于该病灶的胞外基质组分的抗体之间的缀合物或融合物可使用于本发明中。例如：该缀合分子可为白介素-10。该缀合物可用于治疗上，例如：用于治疗本文所提及的IBD。
特异性结合成员与杀生物性或细胞毒性分子的融合物或缀合物的制造和用途描述于例如WO01/62298之中。
本发明使用的特异性结合成员可为下列的缀合物：(i)藉由细胞相互作用对靶细胞发挥抗炎性效果的分子，抗炎性分子，细胞因子(例如：IL-10)以及(ii)纤维连接蛋白的ED-A同种型和/或纤维连接蛋白的ED-A的特异性结合成员。
本发明使用的特异性结合成员可为下列的缀合物：(i)发挥免疫抑制性或抗炎性效果的分子和(ii)纤维连接蛋白的ED-A同种型和/或纤维连接蛋白的ED-A的特异性结合成员。
本发明使用的特异性结合成员优选是下列的缀合物：(i)白介素-10(IL10)和(ii)纤维连接蛋白的ED-A同种型和/或纤维连接蛋白的ED-A的特异性结合成员。这样的特异性结合成员可用于本文所公开的关于治疗IBD的本发明各方面中。
本文还提及下列的缀合物：(i)藉由细胞相互作用对靶细胞发挥杀生物性或细胞毒性效果的分子，或发挥免疫抑制性或抗炎性效果的分子和(ii)纤维连接蛋白的ED-A同种型和/或纤维连接蛋白的ED-A的结合成员。该缀合物优选地包含融合蛋白质，该融合蛋白质包含杀生物性、细胞毒性、免疫抑制性或抗炎性分子以及该结合成员，或者，当该结合成员为双链或多链时，该融合蛋白质包含该杀生物性、细胞毒性、免疫抑制性或抗炎性分子以及该结合成员的多肽链组分。优选地该结合成员是单链多肽，例如：诸如scFv的单链抗体分子。
本文所称的缀合物可以融合蛋白质形式表达。因此，包含免疫抑制性或抗炎性分子以及单链Fv抗体分子的融合蛋白可用于本发明中。
该藉由细胞相互作用对靶细胞发挥其效果的免疫抑制性或抗炎性分子，可直接与该靶细胞交互作用、可与靶细胞上的膜结合型受体相互作用或扰乱细胞膜的电化学电位。优选地该分子是IL-10。
优选地缀合至特异性结合成员的所述分子是IL-10。
如下文所详述，本发明中使用的特异性结合成员优选地是抗体分子或包含抗体的抗原结合位点。该特异性结合成员较适合为单链多肽，诸如单链抗体。如此得以方便制造包含单链抗体和(例如)免疫抑制性或抗炎性分子(例如：白介素-10或TGFβ)的融合蛋白。抗体的抗原结合位点可藉由将分开的多肽中(例如：在完整的抗体中或在诸如Fab或双功能抗体的抗体片段中)的抗体VH结构域与抗体VL结构域相缔合而提供。特异性结合成员是双链或多链分子(分别例如Fab或完整抗体)时，免疫抑制性或抗炎性分子(例如)可缀合为特异性结合成员中有一个或多个多肽链的融合多肽。
特异性结合成员可藉由肽键的手段与免疫抑制性或抗炎性分子缀合，意即：在包含该分子和该特异性结合成员或其多肽链组分的融合多肽中(参见例如Trachsel等人的文献)。其他用于缀合的手段包括化学缀合，特别是利用双功能试剂进行交联(例如：利用DOUBLE-REAGENTSTM Cross-linking Reagents Selection Guide,Pierce)。
还提供了编码本发明使用的特异性结合成员的分离核酸。核酸可包括DNA和/或RNA。核酸可编码CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体的抗原结合位点或抗体分子，例如：如前文定义的scFv或IgG(例如：IgG1)。核苷酸序列可编码本文所公开的VH和/或VL结构域。
本文进一步详述了质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包含至少一种前文所述的多核苷酸。
还提供了包含一或多种如前述的构建体的重组宿主细胞。描述了编码任何CDR或CDR组或VH结构域或VL结构域或抗体之抗原结合位点或抗体分子(例如所提供的scFv或IgG1或IgG4)，如制造所编码的产物的方法中，该方法包含从编码核酸进行表达。表达可藉由在适当的条件下培养含有该核酸的重组宿主细胞而达成。在藉由表达而制造之后，VH或VL结构域或特异性结合成员可利用合适的技术进行分离和/或纯化，接着在适当时使用。
核酸可包含DNA或RNA，并可为完整或部分人工合成的。提及如本文所示的核苷酸序列时，包括带有具体指明的序列的DNA分子，并包括带有具体指明的序列的RNA分子(其中U取代T，除非上下文另有要求)。
还描述了一种制造抗体VH可变结构域的方法，该方法包括从编码核酸进行表达。该方法可包含将宿主细胞培养在用于制造该抗体VH可变结构域的条件下。
制造方法可包含分离和/或纯化产物的步骤。制造方法可包含将产物配制成包括至少一种额外组分(诸如医药上可接受的赋形剂)的组合物。
用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。适当的宿主细胞包括细菌、哺乳类细胞、植物细胞、丝状真菌、酵母和杆状病毒系统以及转基因植物和动物。在原核细胞中表达抗体和抗体片段的技术在技术领域中已确立。回顾文献参见例如Plückthun(1991),Bio/Technology 9:545-551。常见的细菌宿主为E.coli。
在培养的真核细胞中表达亦为本技术领域中熟练技术人员可用作制造特异性结合成员的选择，例如Chadd等人的文献(2001)(Current Opinion in Biotechnology 12:188-194)；Andersen等人的文献(2002)(Current Opinion in Biotechnology 13:117)；Larrick&Thomas(2001)(Current Opinion in Biotechnology 12:411-418)。本技术领域中可用来表达异源多肽的哺乳类细胞系包括中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary(CHO))细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞(baby hamster kidney cell)、NS0小鼠黑色素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾细胞、人胚视网膜细胞和多种其他细胞。
可选择或构建含有适当调节序列的合适载体，该适当调节序列包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和适用的其他序列。载体可为质粒(例如：噬菌粒)或适用的病毒(例如：噬菌体)。更进一步的细节参见，例如：Sambrook&Russell(2001)(Molecular Cloning:a Laboratory Manual:3rd edition,Cold Spring HarborLaboratory Press)。许多用于操纵核酸(例如：核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA导入细胞和基因表达)与分析蛋白质的已知技术和实验流程细节详述于Ausubel等人的文献(1999)(4th eds.,Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methodsfrom Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons)。
宿主细胞可含有如本文所述的核酸。该宿主细胞可是体外的，并且可以处于培养物中。该宿主细胞可以是体内的。宿主细胞的体内存在使得本发明使用的结合成员能够细胞内表达为“内体(intrabody)”或细胞内抗体(intracellular antibody)。内体可用于基因治疗。
本文亦描述一种包含将本文所公开的核酸导入宿主细胞的方法。该导入作用可利用任何可供利用的技术。以真核细胞来说，合适的技术可包括磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法、脂质体介导的转染法和利用反转录病毒或其他病毒(例如：牛痘病毒，或以昆虫细胞而言则包括杆状病毒)的转导法。将核酸导入宿主细胞(特别是真核细胞)可使用病毒或基于质粒的系统。该质粒系统可保持为游离于体外形式的或可合并入宿主细胞或并入人工染色体。合并作用可为一个或多个基因拷贝在单一或多个基因座的随机或靶向整合。以细菌细胞而言，合适的技术可包括氯化钙转化法、电穿孔法和利用噬菌体的转染法。
在导入作用之后可接着引发或允许该核酸表达，例如：藉由将宿主细胞培养在表达该基因的条件下。所表达产物的纯化可藉由本技术领域中熟练技术者已知的方法实现。
核酸可嵌入宿主细胞的基因组(例如：染色体)。可藉由根据标准技术纳入促进与基因组重组的序列而促进整合。
本文亦描述一种在表达系统中利用前文说明的构建体表达如前述的特异性结合成员或多肽的方法。
本发明使用的特异性结合成员被设计用于诊断或治疗人或动物个体(例如：人)的方法。本发明使用的特异性结合成员可用于诊断或治疗IBD。
因此，本发明提供了包含施予如所述的特异性结合成员或包含该特异性结合成员的药物组合物的治疗方法，和该特异性结合成员用于制造供施予的药物的用途，例如：制造药物或药物组合物的方法，其包含将特异性结合成员与医药上可接受的赋形剂一起配制。医药上可接受的载体是众所周知的，并且可由本技术领域中的熟练技术人员根据所选活性化合物的性质和施予模式进行调整。
本发明使用的特异性结合成员通常会以药物组合物的形式施予，其中除该特异性结合成员以外还可包含至少一种组分。因此，本文所述并根据本发明所用的药物组合物中，除活性成分外，还可包含医药上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域熟练技术人员熟知的其它物质。该物质应为无毒的且不应干扰活性成分的功效。载体或其他物质的确切性质将视施予的途径而定，该途径可为口服、吸入或注射(例如：静脉注射)。
用于口服施予的药物组合物(诸如例如纳米小体(nanobody)等)亦涵盖在本发明中。这样的口服配方可为片剂、胶囊、粉剂、液体或半固体形式。片剂可包含诸如明胶的固体载剂或佐剂。液体药物组合物一般包含诸如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油的液体载体。生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇的二元醇类可被包括在内。
以静脉注射或注射于患部而言，活性成分的形式可以是胃肠外可接受的水溶液，其不含热源(pyrogen-free)并具有适当的pH值、等张性和稳定性。本技术领域中的那些相关技术可用来制备合适的溶液，使用例如：诸如Sodium Chloride Injection、Ringer'sInjection、Lactated Ringer's Injection的等张媒液。如有需要，可使用防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。医药配方的许多制备方法为本技术领域中熟练技术人员所已知。参见例如Robinson ed.,Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
视所治疗的病况而定，组合物可单独进行，或与其他治疗一起同时或依序使用或作为与其他治疗剂的组合制剂而施予。
本发明使用的特异性结合成员可与额外药品组分结合用作组合疗法的部分。组合治疗可用来提供显著的协同效应，特别是将本发明使用的特异性结合成员与一或多种其他药品组合。本发明使用的特异性结合成员可同时或依序或作为与其他治疗剂的组合制剂而施予，用来治疗一或多种本文所列的病况。
例如：本发明使用的特异性结合成员可与已有的治疗剂组合使用来治疗IBD。
本发明使用的特异性结合成员和一种或多种前述的额外药品组分可用于制造药物。该药物可分别或组合施予个体，据此可为包含特异性结合成员和额外组分的组合制剂或分开制剂形式。分开制剂有助于分开和依序施予或同时施予，并容许组分的施予经由不同途径(例如：口服和胃肠外施予)进行。
依据本发明，所提供的组合物可施予哺乳类。可以“治疗有效剂量”施予，此剂量足以对患者展现益处。该益处可为至少改善至少一种症状。因此，“IBD的治疗”代表改善至少一种症状。施予的真实剂量和施予的频率与时程，将依治疗的性质和严重性、所治疗的特定哺乳类动物、个别患者的临床病况、病症的起因、递送组合物的位置、特异性结合成员的类型、施予的方法、施予的方案和医务人员已知的其它因素而定。治疗处方(例如：剂量等的决定)是在一般从业者和其他医生的职责范围内，且可视症状的严重性和/或所欲治疗的疾病的进程而定。抗体的合适剂量为本技术领域所熟知(Ledermann et al.(1991)Int.J.Cancer 47:659-664；and Bagshawe et al.(1991)Antibody,Immunoconjugatesand Radiopharmaceuticals 4:915-922)。当适用于所施予的药物类型时，可使用本文或在Physician's Desk Reference(2003)中所指出的具体剂量。本发明使用的特异性结合成员的治疗有效剂量或合适剂量可藉由比较其体外活性和在动物模式的体内活性而确定。已知小鼠和其他试验动物至人的有效剂量的推断方法。精确剂量将视数个因素而定，包括：抗体是用于诊断、预防还是治疗，所欲治疗的范围大小和位置，确切的抗体性质(例如：完整抗体、片段或双功能抗体)，以及附着至抗体的任何可检测标记或其他分子的性质。一般的抗体剂量对于全身性应用会在100μg至1g范围内，局部应用则在1μg至1mg范围内。初始可施予较高的载入剂量，接着施予一个或多个较低剂量。抗体可为完整抗体，例如：IgG1或IgG4同工型。这是用于成年患者的单一治疗的剂量，其可依比例调整而用于孩童和婴幼儿，亦可依其他抗体形式的分子量比例调整。治疗可依医师判断以每日一次、每周两次、每周或每月的间隔重复。治疗于皮下施予的情况可为每二至四周一次，而于静脉施予则为每四到八周一次。在本发明的一些实施例中，治疗可为周期性的，且两次施予之间的间隔是约二周或更久，例如：约三周或更久、约四周或更久或约一个月一次。在本发明的其他实施例中，可在手术前和/或手术后给予治疗，并可直接施予或施用至手术治疗的解剖位置。
炎性肠病(IBD)
炎性肠病是一群影响结肠和小肠的炎性病况。IBD的主要类型为克罗恩氏病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，而其他类型的IBD包括胶原性结肠炎(collagenous colitis)、淋巴细胞性结肠炎(lymphocytic colitis)、缺血性结肠炎(ischaemic colitis)、分流性结肠炎(diversion colitis)、贝赛特氏病(
Figure BDA0000688307660000341
disease)和未定型结肠炎(indeterminate colitis)。CD可影响胃肠道的任何部分，然而UC通常仅局限在结肠和直肠。
本文中所称的IBD可为CD、UC、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、分流性结肠炎、贝赛特氏病或未定型结肠炎。特别是本文中所使用的术语CD、UC、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、分流性结肠炎、贝赛特氏病和未定型结肠炎，可分别指称活跃性CD、活跃性UC、活跃性胶原性结肠炎、活跃性淋巴细胞性结肠炎、活跃性缺血性结肠炎、活跃性分流性结肠炎、活跃性贝赛特氏病和活跃性未定型结肠炎。在一实施例中，该IBD可为CD或UC。在另一实施例中，该IBD可为CD、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、分流性结肠炎、贝赛特氏病或未定型结肠炎。在进一步实施例中，该IBD不为UC。该IBD可为一种通常不局限于结肠和直肠发炎的IBD，诸如CD。该IBD可为一种不仅止影响结肠内膜的IBD。在一个优选实施例中，该IBD是CD。最优选地，该IBD是活跃性CD。
根据包括下列实验范例的本公开文件，本领域熟练技术人员将能明白了解本发明的更多方面和实施例。
所有在此说明书中提及的文件均以引用方式将所述的全文并入本文中。
本文中所使用的“和/或”被视为所指定的两个特征或组份中的每一个，其中具有或不具有另一个。例如“A和/或B”被视为明确的揭示(i)A、(ii)B和(iii)A与B，就如同其中每一个在此被单独地表述一样。
除非另有说明，否则前文所载的特征的描述和定义并不局限于任何本发明的特定方面或实施例，并同等的适用于所有所述的方面和实施例。
本发明的某些方面和实施例现在将以实例方式说明并参照前文所述的附图。
实验
材料和方法
小鼠IBD模型
与施予DSS相关的IBD小鼠模型为技术领域中所已知。适当小鼠模型的描述亦见于例如：Okayasu等人的文章(1990)(Gastroenterology,98,694-702)。
本文所述的实验是藉由在饮用水中加入3％葡聚糖硫酸钠(DSS)(MPBioMedicals)7天，接着给予正常饮用水3至5天，而在C57BL/6小鼠(JacksonLaboratories,Bar Harbor,ME)中引发结肠炎。在本研究的全程中均对对照组小鼠给予标准水。利用第3至5天的潜血检测以及每日的体重变化作为监测小鼠疾病引发/进展的证明。于停止在水中添加DSS后3至5天的不同时间处死小鼠，以评估F8-IL-10的靶向、区域定位和药理学效果。
125I-F8/IL10放射性碘标定、纯化、鉴定和给药溶液制备
125I-F8/IL10是利用琥珀酰亚胺基-碘苯甲酸酯(SIB)(Zalutsky&Narula(1988)Cancer Research,48,1446-1450；Zalutsky&Narula(1987)Appl.Radiat.Isot.38,1051-1055；Cheng,et al.(2002)J.Med.Chem.45,3048-3056)制备。简言之，将一等分的碘-125(20μL～2.0mCi)(Perkin Elmer,Waltham,MA)与2.5μg N-琥珀酰亚胺基-3-(三-正丁基锡烷基)苯甲酸酯(C23H35NO4Sn；MW＝508.23,由Texas Biochemicals,Inc.College Station,TX合成)和10μg NCS(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)作为氧化剂在50μL的含有1.5％醋酸(v:v)的甲醇(均购自Sigma-Aldrich)中反应。在室温培养15分钟后，添加10μg亚硫酸钠(还原剂)(Sigma-Aldrich)并在室温额外培养5分钟，以将反应溶液中剩余的氧化剂淬灭。于室温在pH 8.0培养20分钟，以将经125I标记的SIB缀合至F8-IL10抗体(约0.2mg，起始摩尔比是中间物比抗体约为2.5:1)。将经过放射标记的产物(125I-F8/IL10)利用经预平衡的PD-10管柱(GE Healthcare,Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)(利用牛血清白蛋白使柱上可能的非特异性蛋白结合位点饱和，接着以至少三倍柱体积的PBS冲洗柱)纯化，洗脱于PBS中。所得的放射化学产率约为30％。
分别以尺寸排阻层析法(size exclusion chromatogram(SEC))和EDA-亲和柱鉴定125I-F8/IL10的放射化学纯度(radiochemical purity(RCP))和生物活性。在SEC分析方面，将约1μCi的125I-F8/IL10产物溶液注射至配备有粒径排阻柱(G3000SWxl,TOSOHBiosciences,Tokyo,Japan)的HPLC(Agilent 1100，配备有在线放射活性检测器)中，并以25mM磷酸盐缓冲液、0.15M NaCl、pH 6.8的流动溶剂以每分钟1mL的流速洗脱。比较125I-F8/IL10在放射测量层析中的滞留时间与参考F8/IL10在UV(280nm)层析中的滞留时间以确认其身份。125I-F8/IL10的RCP大于99％，放射性比活性(radioactive specific activity)约为4.5mCi/mg。
通过EDA亲和柱检测法测定125I-F8-IL10的生物活性。简言之，将一等分(约1μCi)125I-F8/IL10上样至经预平衡的EDA亲和柱(含有250μL EDA树脂，藉由以2mL BSA(2mg/mL于PBS中)封闭非特异性结合位点、接着以8mL PBS洗涤柱而实施预平衡)。以6mL的BSA(2mg/mL于PBS中)洗涤该亲和柱并以级分形式收集洗出液。在γ计数器中测量所收集的洗出液的放射活性和该亲和柱上所残留的放射活性。计算残留在EDA-树脂柱的放射活性对总上样放射活性的百分比。以125I-F8/IL10而言，残留在亲和柱上的放射活性百分比为64％。
将125I-F8/IL10与未经标记的F8/IL10(F8/IL10储存溶液)以及制剂缓冲液混合至所需的最终浓度，制备用于PK和组织分布研究的给药溶液。受试品(test article)溶液是在给药当日制备，并在施予动物之前使其达到室温。
125I-F8/IL10在IBD小鼠模型中的生物分布和区域定位至结肠
在施药(开始DSS处理后的第5至7天)之前约2至4天，将未经或经DSS处理的小鼠均以碘化钾(KI)水(20mM)处理，以阻断甲状腺对在体内产生的任何潜在未结合的游离I-125。在开始DSS处理后的第9天，经由静脉(IV)注射施予单剂125I-F8/IL10。每组的剂量和放射活性说明如下：
i)第0组-每只小鼠的大致剂量：5mg/kg
第0组-每只小鼠的大致放射活性：7.5μCi(比活性75uCi/mg)。
ii)第1组-每只小鼠的大致剂量：5mg/kg
第1组-每只小鼠的大致放射活性：10μCi(比活性100uCi/mg)。
iii)第2组-每只小鼠的大致剂量：0.15mg/kg，
第2组-每只小鼠的大致放射活性：12μCi(比活性4490uCi/mg)。
分别在第5分钟、第1、3、6、24、48和96小时将小鼠亚组进行采血和收集不同组织。血液样本是藉由心脏穿刺或眼后采血收集至血清分离收集管。藉由将血液样本在10,000g离心5分钟收集血清样本。组织收集方面，则是处死动物，并在采集血液样本和全身性灌流之后立刻收集感兴趣的组织。全身性血液灌流是藉由在约10分钟期间施予约20mL的肝素-PBS(每mL 25单位)而实施。收集并称重感兴趣的组织，包括：脑、肠系膜淋巴结、皮肤、脂肪、大腿骨骼肌、肺、心、脾、肝、胃、小肠、大肠和肾。将GI中的内容物移除。直接以γ计数器测量组织样本中的放射活性(以cpm表达的总计数)。
患病和健康小鼠的结肠放射自显影
在来自第0组和第2组小鼠的结肠进行结肠放射自显影(radio-autography)。收集结肠、清除所述的内容物并将组织暴露于放射性磷成像屏(phosphor-imaging screen)(Molecular Dynamics)24小时，并经由Storm 860成像。结果显示于图2。第1道：注射6小时之后，收集自第0组(健康小鼠)的结肠；第2道：注射6小时之后，收集自第2组(经DSS处理的小鼠)的结肠；第3道：注射24小时之后，收集自第0组(健康小鼠)的结肠；第4道：注射24小时之后，收集自第2组(经DSS处理的小鼠)的结肠。在经DSS处理的小鼠中沿着结肠可观察到块状的125I-F8/IL10定位，在正常小鼠中则未能观察到，此结果与本模型中不规则的结肠发炎和相关的靶EDA表达模式相符。
测定血清和组织中放射活性当量浓度与药物动力学计算
125I-F8/IL10的血清当量浓度(ng eq./g)以所测得的TCA(三氯乙酸)可沉淀性(与蛋白质相关)放射活性为基础进行估算。为了进行TCA沉淀作用，将等分量(50μL)的血清样本与50μL小鼠血清混合，接着添加100μL的20％TCA溶液。将样本混合物在10,000g旋转5分钟以沉淀蛋白质。测定上清液中的总体放射活性和TCA可溶性放射活性。利用给定样本中的TCA可沉淀性放射活性(cpm)、给药溶液的比活性(每mg蛋白质的TCA可沉淀性cpm)，以及采样(tS)与给药溶液(tD)测量的日期，以下列方程式计算给定样本中受试品的当量浓度(ngeq./mL)：[TCA可沉淀性cpm/EXP(-0.693/60.2*(tS-td))]/[比活性(以cpm/mg表示)*样本体积(以mL表示)]。
125I-F8/IL10在组织中的当量浓度(ng eq./g)定量是以在样本中测得的总体放射活性和校正125I的物理性衰退半衰期后给药溶液的比活度为基础，利用下列方程式计算：[样本cpm/EXP(-0.693/60.2*(tS-tD))]/[比活性(以cpm/mg表示)*样本重量(以mg表示)]。组织样本没有进行匀浆化作用或TCA沉淀作用。除了放射活性当量浓度(血清为ng eq./mL，组织为ne eq./g)之外，还计算血清和感兴趣组织每克的注射剂量百分比(％ID/g)和/或注射剂量百分比(％ID)。
在注射后6小时(图3A)、24小时(图3B)和96小时(图3C)，测定正常小鼠(第0组)和经DSS处理小鼠(第1组)中125I-F8/IL10的生物分布。
利用受测时间点的平均血清或组织浓度计算PK参数。使用药物动力学软件包WinNonlin(第5.1版，Pharsight)的非区室数据分析模块。利用线性梯形法(lineartrapezoidal method)计算浓度对时间曲线下的面积(AUC)。
IBD小鼠模型中F8-IL10治疗性处理对血清细胞因子量的效用
既已知IL-10会降低促炎细胞因子，我们测试在IBD小鼠模型中施予F8-IL10是否会影响此模型中的血清细胞因子反应。在开始DSS处理后第3、6和9天，静脉注射施予每只小鼠200μg的F8-IL10或对照组小型免疫蛋白(small Immune Protein(F8-SIP))(n＝10只小鼠/组)。此给药方案与胶原蛋白引发的关节炎模型中的有效方案相同(Schwager K,etal.Arthritis Research and Therapy,(2009)11:R142)。对照组包括未患病组(一般水)和未经治疗的患病组(n＝10只小鼠/组)。在开始DSS处理之后的第10天，收集血液并以如前文针对定位研究所述的方式取得血清。利用MSD技术平台和小鼠7plex MSD试剂盒，根据制造商的说明书评估血清中IL-1b、IL-12p40、IFNg、IL-6、KC、IL-10和TNFa的量(MesoscaleDiscovery,Gaithersburg,MD)。图4和5中细胞因子水平表示为每ml血清中有多少pg蛋白质。
EDA表达的人组织染色
以免疫组织化学分析OCT包埋的冷冻结肠组织样本，样本是来自患有溃疡性结肠炎的60岁女性患者和患有克罗恩氏病(Crohn’s disease)的42岁男性患者。两个样本均以SIP形式的F8抗体和冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor)进行探测。
此外，来自患有克罗恩氏病或溃疡性肠炎的相同患者(n＝3克罗恩氏病患者和n＝5UC患者)的患部和非患部冷冻活检样本是自Analytical Biological Services(Wilmington,DE)取得的。将冷冻样本置于干冰上以避免融化，将其包埋于充满O.C.T.化合物(Tissue-Tek#4583)的Cryomolds标准模具(Tissue-Tek 4557)中并在经过干冰冷却的异戊烷中快速冷冻。将组织块以Leica CM1850冷冻切片机切片为4微米，将切片放置于玻片上并储存于-80℃直到进行免疫组织化学染色(IHC)为止。开始IHC时，将组织浸入冷的(-20F)甲醇(Fisher Scientific A412P-4)中以除去储存中可能形成的任何水分，并在室温风干20分钟。接着将组织浸入冷的(-20F)丙酮(ACROS CAS#67-64-1)10分钟，并在室温风干10分钟。
以适当的Ventana条形码标记组织玻片，并将其置入Ventana Discovery XT进行Fibronectin F8SIP或KSF SIP(对照组抗体)IHC。将内源性生物素以Ventana S Block(Ventana 760-4212)中的5％正常小鼠血清(Jackson Immuno Research 015-000-120)封闭20分钟，并以Ventana Biotin Blocking kit(Ventana 760-050)封闭8分钟。将纤维连接蛋白F8SIP或KSF以1:200浓度(每片玻片100ul)稀释在Dako抗体稀释液(S0908)(DakoNorth America,Carpinteria,CA)中，并孵育40分钟。在完成该轮程序前，将玻片以苏木色素(hematoxylin)和蓝色试剂进行负染色(各4分钟)。将玻片取出并置入VentanaSymphony，以进行接下来的脱水和封片。IHC的代表性图像显示于图7。来自溃疡性肠炎患者UH0501-34(上)和克罗恩氏病患者UH0405-09(下)的非患部(左)和患部(右)组织样本的IHC。
结果
结肠放射自显影
图2显示非患病小鼠(水)(第1和3泳道)或患病小鼠(经DSS处理)(第2和4泳道)的结肠在施予经放射标记的F8-IL10后第6小时(第1和2泳道)或第24小时(第3和4泳道)的放射自显影。此结果显示F8-IL10在发炎结肠中的累积确实比正常结肠多。F8-IL10在患病结肠部位的斑块状外观，与此模型中沿结肠长度所观察到的发炎和EDA表达水平的多变性相符合，进一步支持F8-IL10会区域定位于发炎处的理论。
125I-F8-IL10在患病小鼠和健康小鼠中的生物分布
图3显示患病(DSS)小鼠与正常(水)小鼠比较，125I-F8-IL10在第6、24和96小时时间点在结肠和肠系膜淋巴结(L.N.)中的积累。相似于图2，所述数据显示在经DSS处理的小鼠中，F8-IL10会靶向至结肠和相关联的淋巴结。从所述研究亦可看出，血清半衰期测定为约3.5小时，而结肠中F8-IL10的半衰期则为约35小时；提高10倍代表了组织持久性增强。此结果表明，在结肠发炎期间，F8-IL10不仅靶向至结肠和肠系膜淋巴结，而且一旦抵达后，其相较于在循环中亦滞留更久。总结来说，所述数据代表在结肠发炎的情况下(例如人的克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)，F8-IL10倾向于靶向至并滞留于所述位置。
来自患病小鼠和健康小鼠的血清中的细胞因子量
图4显示相较于对照组，以治疗形式施予F8-IL10使得炎性细胞因子、IL-1β、IL12p40、IFNγ和IL-6的血清水平显著降低。
图5显示相较于对照组，以治疗形式施予F8-IL10不会造成TNF-α和角质细胞衍生趋化因子(KC)升高，而会造成IL-10水平升高。DSS模型中图4的细胞因子水平的升高与在结肠中该病的诱导有关。图4所述炎性细胞因子的下降与IL-10的升高均与IL-10的已知生物作用一致(Abbas A,Lichtman A,Pober J.,1994,Cellular and MolecularImmunology.2nd Ed.Philadelphia:W.B.Saunders Company；Delves P,Roitt I(eds),1998,Encyclopedia of Immunology,2nd Ed.San Diego:Academic Press)。因此，F8-IL10藉由降低IBD中与发炎作用和病理相关的细胞因子，证实了在此IBD模型中的药理学活性。因为已知所述促炎细胞因子在IBD患者体内会被上调，因此经由施予F8-IL10而将所述细胞因子下调揭示了F8-IL10对于在体内治疗IBD可能是有益的。尤其是已知CD患者内干扰素γ和IL-12p70会被上调，本文所公开的数据表明施予F8-IL10很可能在体内治疗CD中特别有用。
免疫组织化学染色
图6显示F8SIP抗体会将溃疡性结肠炎患者的新生血管染色，但不会将正常血管染色。(冯维勒布兰德因子常规被用作为正常血管的标记。)
图7显示克罗恩氏病或UC配对活检组织样本，经由EDA免疫组织化学染色的代表性图像。箭头指出每张图像中的血管。患部血管周围的染色强度较来自相同患者的非患部样本高。此结果表明在所述人类疾病情形下EDA表达提高可造成更多地靶向至结肠中发炎区域。总结来说，在鼠类IBD模型中以F8-IL10观察到的结肠靶向分布与血清细胞因子降低，以及在人克罗恩氏病和溃疡性结肠炎结肠组织中血管周围的EDA表达增加，共同表明施予F8-IL10可靶向并积极影响患有IBD的患者。
本申请所公开的序列
SEQ ID NO：1(F8抗体VH结构域CDR1)
LFT
SEQ ID NO：2(F8抗体VH结构域CDR2)
SGSGGS
SEQ ID NO：3(F8抗体VH结构域CDR3)
STHLYL
SEQ ID NO：4(F8抗体VL结构域CDR1)
MPF
SEQ ID NO：5(F8抗体VL结构域CDR2)
GASSRAT
SEQ ID NO：6(F8抗体VL结构域CDR3)
MRGRPP
SEQ ID NO：7(F8抗体VH结构域)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：8(F8抗体VL结构域)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：9(F8抗体VH结构域和VL结构域之间的连接子)
GGSGG
SEQ ID NO：10(F8抗体的VL结构域和IL-10之间的连接子)
SSSSGSSSSGSSSSG
SEQ ID NO：1 1(人IL-10)
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
SEQ ID NO：12(F8抗体)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：13(F8-IL10)
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN
Figure IDA0000688307720000011
Figure IDA0000688307720000031
Figure IDA0000688307720000041
Figure IDA0000688307720000051

Claims (4)

1.抗体缀合物在制备用于治疗炎性肠病(IBD)的药物中的用途，其中所述抗体缀合物由氨基酸序列SEQ ID NO:13组成。
2.抗体缀合物在制备用于将人IL-10递送到患者内炎性肠病(IBD)的位点处而治疗炎性肠病的药物中的用途，其中所述抗体缀合物由氨基酸序列SEQ ID NO:13组成。
3.权利要求1或2所述的用途，其中所述IBD选自下述任一种：溃疡性结肠炎(UC)、未定型结肠炎(indeterminate colitis)和克罗恩氏病(Crohn’s disease(CD))。
4.权利要求1或2所述的用途，其中所述IBD选自下述任一种：胶原性结肠炎(collagenous colitis)、淋巴球性结肠炎(lymphocytic colitis)、缺血性结肠炎(ischaemic colitis)和分流性结肠炎(diversion colitis)。
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