KR102011549B1 - 염증성 장 질환과 연관된 항원 - Google Patents

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Abstract

염증성 장 질환 (IBD)의 치료, 진단, 검출 및/또는 영상화 방법에서 사용하고/하거나, 특이적 결합 구성원에 접합된 분자를 IBD 조직에 전달하는데 사용하기 위한, 피브로넥틴의 ED-A 아이소형(isoform)에 결합하는 특이적 결합 구성원. 이러한 특이적 결합 구성원은, 예를 들어, 면역억제 또는 항염증 분자, 예컨대 인터루킨-10에 접합될 수 있다.

Description

염증성 장 질환과 연관된 항원{ANTIGENS ASSOCIATED WITH INFLAMMATORY BOWEL DISEASE}
본 발명은 염증성 장 질환 (IBD)의 치료 및 검출에 관한 것이다. 본 발명은 피브로넥틴의 ED-A 아이소형(isoform)에 결합하는 특이적 결합 구성원, 특히 피브로넥틴의 도메인 ED-A에 결합하는 특이적 결합 구성원의 사용을 수반한다. 이러한 특이적 결합 구성원은, 예를 들어, 면역억제 또는 항염증 분자, 예컨대 인터루킨-10에 접합될 수 있다.
염증성 장 질환 (IBD)은 결장 및 소장에 영향을 미치는 일군의 염증성 병태이다. IBD의 주요 유형은 크론병 (CD) 및 궤양성 결장염 (UC)이다. IBD 발병기전은 장에서의 만성 염증성 상태에 기여하고 이를 영속시키는 상이한 혈관형성 조절을 특징으로 한다 (Chidlow et al., 2006, Am J Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 29, G5 - G18). 크론병은 위장관의 임의의 부분에 영향을 미칠 수 있는 반면, 궤양성 결장염은 전형적으로 결장 및 직장에 한정된다 (Summers RW, Elliott DE, Qadir K, Urban JF, Thompson R, Weinstock JV (2003) Am. J. Gastroentol., 98:2034-2041). 이의 중증도에 따라, 궤양성 결장염의 치료는 이의 증상을 제어하기 위한 면역억제를 필요로 할 수 있고, 일반적으로 항염증 분자의 투여가 치료에 수반된다.
IBD는 염증유발성 사이토카인, 예컨대 IFN-γ, IL-6 및 IL-12 (예를 들어 IL-12p70)의 상향조절을 특징으로 하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 크론병은 과도한 IL-12/IL-23 및 IFN-γ/IL-17 생산과 연관되는 것으로 공지되어 있다 (Strober et al. (2007), The Journal of Clinical Investigation, 117(3), 514-521). 활성 크론병 동안의 IL-12p70 및 IL-23의 합성이 또한 보고되었다 (Fuss et al. 2006, Inflamm. Bowel Dis. 12 : 9-15).
피브로넥틴 (FN)은 당단백질이고, 다양한 정상 조직 및 체액에서 광범위하게 발현된다. 이는 세포외 매트릭스 (ECM)의 성분이고, 세포 부착, 세포 이동, 지혈, 혈전증, 상처 치유, 조직 분화 및 종양발생성 형질전환이 포함되는 다수의 생물학적 프로세스에서 역할을 한다.
다양한 FN 아이소형이 1차 전사체 FN 프리(pre)-mRNA의 3개의 영역 (ED-A, ED-B, IIICS)의 별법적인 스플라이싱에 의해 생성되고, 이러한 프로세스는 사이토카인 및 세포외 pH에 의해 조정된다 (Balza (1988) FEBS Lett., 228, 42-44; Carnemolla (1989) J. Cell Biol., 106, 1139-1148; Borsi (1990) FEBS Lett. 261, 175-178). 피브로넥틴은 별법적인 스플라이싱이 진행될 수 있는 2개의 III형 구체 엑스트라-도메인(Extra-Domain)을 함유한다: ED-A 및 ED-B (ffrench-Constant (1995) Exp. Cell Res., 22, 261-271, Kaspar et al. (2006) Int. J. cancer, 118, 1331-1339). 마우스 피브로넥틴 및 인간 피브로넥틴의 ED-A는 96.7％ 동일하다 (2개의 아미노산 서열 90개의 서열 사이에서 3개의 아미노산만이 상이하다).
피브로넥틴의 ED-A의 발현이 종양 세포 및 고형 종양에서, 유방암 (Jacobs et al. (2002) Human Pathol, 33, 29-38, Matsumoto et al. (1999) Jpn. J. Cancer Res., 90, 320-325) 및 간암 (Oyama et al. (1989) JBC, 264, 10331-10334, Tavian et al. (1994) Int. J. Cancer, 56, 820-825)에서는 mRNA 수준에서, 섬유육종, 횡문근육종 및 흑색종 (Borsi et al. (1987) J. Cell Biol., 104, 595-560)에서는 단리된 단백질의 수준에서 보고되었다. 암 이외에, 류머티스성 관절염에서 피브로넥틴의 ED-A의 발현이 보고되었다 (WO2009/056268). WO2010/078950 또한 자궁내막증, 건선 및 건선성 관절염에서의 피브로넥틴의 ED-A의 발현을 보고하였지만, 조직화학적 분석에서 다발성 경화증 및 궤양성 결장염에서의 ED-A의 매우 약한 발현 내지는 실질적으로 부재하는 발현이 밝혀졌다. 문헌 [Brenmoehl et al., Int. J. Colorectal Dis. (2007) 22:611-623]에서 보고된 면역조직화학적 분석은 ED-A 발현이 대조군 점막에 비교했을 때 CD 환자의 염증성 장 점막에서 감소되었고, 궤양성 결장염에서 증가되었음을 나타냈다. 문헌 [Brenmoehl et al. (2007)]에서 CD 환자의 섬유증 점막에서의 ED-A 및 ED-B 아이소형의 발현 증가가 또한 보고되었다. 이러한 피브로넥틴 아이소형들이 상처 치유에서 수반되는 것으로 공지되었기 때문에 섬유증 점막에서의 ED-A 및 ED-B 아이소형의 발현이 예상된다. 대조군 환자로부터 유래된 점막과 비교하여 CD 환자의 염증성 장 점막에서의 ED-A의 발현 감소를 고려하여, 문헌 [Brenmoehl et al. (2007)]에서는 (활성) CD 동안 ED-A가 발현된다는 것이 제안되지 않았다. IBD의 치료 또는 진단을 위한 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합하는 결합 구성원의 용도 또한 이러한 문헌에 개시되지 않았다.
인터루킨-10 (IL-10)은 면역계의 중요한 조절인자로서 기능하는 항염증 사이토카인이다. IL-10은 면역계에서 다수의 상이한 역할이 있는 것으로 공지되어 있지만, 이의 2가지 주요 활성은 대식세포에 의한 사이토카인 생산의 억제 및 T 세포 활성화 동안의 대식 세포의 보조 기능의 억제를 포함한다 (Abbas A, Lichtman A, Pober J., 1994, Cellular and Molecular Immunology. 2nd Ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company). 이러한 작용들의 효과는 IL-10이 주로 면역계에서의 항염증 역할을 하도록 한다. IL-10은 원래 사이토카인 합성 억제 인자 (CSIF)로서 공지되었고, 이러한 단백질의 발견은 이의 생물학적 활성을 기초로 하였다 (Delves P, Roitt I (eds), 1998, Encyclopedia of Immunology, 2nd Ed. San Diego: Academic Press). 이의 주지된 항염증 성질로 인해, IL-10 요법은 크론병 (CD)에서 잠재적인 새로운 항염증 요법으로서 도입되었다 (Fedorak et al., Gastroenterology (2000) 119, 1473-1482.; Schreiber et al., Gastroenterology (2000) 119, 1461-1472; Colombel et al., Gut (2001) 49, 42-46).
문헌 [Asadullah et al., Pharmacology Reviews, (2003), 55, 245-269]에서 다수의 염증성 질환에서의 최신식 인터루킨-10 요법이 검토되었다. 만성 염증성 장 질환을 검토할 때, 전신 투여에 의해 내시경성 수술후 발생을 방지하기 위해 치유성 회장 또는 회장결장 절제가 진행 중인 환자에서, 뿐만 아니라 경도/중등도 또는 요법 불응성 CD 환자에서 다중 IL-10 투여량을 테스트하는 여러 대형 다기관 실험이 수행되었음이 문헌 [Asadullah et al.]에서 보고되었다 (Fedorak et al., Gastroenterology (2000) 119, 1473-1482.; Schreiber et al., Gastroenterology (2000) 119, 1461-1472; Colombel et al., Gut (2001) 49, 42-46.). 데이터는 IL-10 요법이 안전하고 잘 허용된다는 것을 가리켰다. 그러나, IL-10 치료는 위약 치료와 비교하여 유의하게 더 높은 완화율 또는 임상 개선을 초래하지 않았다.
전반적으로, 이러한 임상 결과들은 불만족스러운 것으로 확인되었고, 이러한 치료 전략에 대한 실망에 대한 여러 설명이 문헌 [Herfarth and Scholmerich, Gut (2002) 50, 146-147]에서 논의되었다.
따라서, 다양한 IBD 상태의 효과적인 치료가 요구된다.
발명의 진술
본 발명자들은 IL-10에 융합된 항-EDA 항체가 (i) IBD 이환 마우스에서 생체 내에서 염증성 결장 부위에 선택적으로 국소화될 수 있고, (ii) IBD 이환 마우스 내의 특정 염증유발성 사이토카인, 특히 인터페론-감마, IL-6 및 IL-12p70의 혈청 수준을 감소시킬 수 있었다는 것을 뜻밖에 발견하였다.
재조합 인간 IL-10으로의 크론병 환자 치료가 인터페론-감마를 유도하는 것으로 문헌 [Tilg et al., Gut (2002), 50, 191-195]에서 보고되었기 때문에, IL-10에 융합된 항-EDA 항체의 투여를 통한 염증유발성 사이토카인의 하향조절이 특히 뜻밖이었다. IL-10이 INF-감마의 NK 세포 생산을 강화하지만, IFN-감마-유도 인자의 대식세포 생산을 억제한다는 것이 문헌 [Shibata et al., J. Immunol, (1998) 161, 4283-4288]에서 또한 보고되었다.
따라서, 첫 번째 측면에서, 본 발명은 IBD의 치료 방법에서 사용하기 위한, 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A (ED-A) 아이소형 (A-FN)에 결합하는 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자를 제공한다. 본 발명은 IBD 치료용 약제의 제작을 위한, 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A (ED-A) 아이소형에 결합하는 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자의 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합하는 특이적 결합 구성원을 포함하는 약제를 치료적 유효량으로 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 IBD를 치료하는 방법을 또한 제공한다. 바람직하게는, 특이적 결합 구성원은 인간 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합한다.
본 발명의 이러한 첫 번째 측면에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다.
본 발명의 이러한 첫 번째 측면에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자는 면역억제 또는 항염증 활성이 있는 분자, 검출가능한 표지, 방사성 동위원소, 또는 생체활성 분자, 예컨대 사이토카인, 호르몬, 치료용 방사성 동위원소, 세포독성 약물에 접합될 수 있다. 절단가능한 링커에 의해 특이적 결합 구성원이 생체활성 분자에 접합될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 면역억제 또는 항염증 활성이 있는 분자, 예컨대 IL-10에 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자가 접합된다.
본원에서 언급된 바와 같은 IBD는 활성 IBD일 수 있다. 특히, IBD는 크론병 (CD), 궤양성 결장염 (UC), 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병 또는 불확정 대장염일 수 있다. IBD는 CD 또는 UC일 수 있다. IBD는 CD, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병 또는 불확정 대장염일 수 있다. 한 실시양태에서, IBD는 UC가 아니다. IBD는 결장 및 직장에서의 염증에 전형적으로 한정되지 않는 IBD, 예컨대 CD일 수 있다. IBD는 결장의 내층(lining)에만 영향을 미치지 않는 IBD일 수 있다. 바람직하게는, IBD는 CD이다. 본원에서 사용된 바와 같은 CD, UC, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병 및 불확정 대장염이라는 용어들은 각각 활성 CD, 활성 UC, 활성 콜라겐성 결장염, 활성 림프구성 결장염, 활성 허혈성 결장염, 활성 전환 결장염, 활성 베체트병 및 활성 불확정 대장염을 지칭할 수 있다.
두 번째 측면에서, 본 발명은 특이적 결합 구성원에 접합된 분자를 IBD 조직에 전달하는데 사용하기 위한, 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합하는 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자를 제공한다. 본 발명은 특이적 결합 구성원에 접합된 분자를 IBD 조직에 전달하기 위한 약제의 제작을 위한, 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합하는 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자의 용도를 또한 제공한다. 본 발명은 접합체를 형성하도록 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합하는 특이적 결합 구성원에 접합된 분자를 인간 또는 동물 내의 IBD 조직에 전달하는 방법이고, 이러한 접합체를 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 또한 제공한다. 바람직하게는, 특이적 결합 구성원은 인간 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합한다.
본 발명의 이러한 두 번째 측면에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다.
본 발명의 이러한 두 번째 측면에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자는 검출가능한 표지, 방사성 동위원소, 또는 생체활성 분자, 예컨대 사이토카인, 호르몬, 치료용 방사성 동위원소, 세포독성 약물에 접합될 수 있다. 절단가능한 링커에 의해 특이적 결합 구성원이 생체활성 분자에 접합될 수 있다.
특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자는 바람직하게는 IL-10에 접합된다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 IBD의 진단 방법에서 사용하기 위한, 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합하는 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자를 제공한다. 본 발명은 IBD 진단용 진단 제품의 제작을 위한, 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합하는 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자의 용도를 또한 제공한다. 본 발명은
(a) 인간 또는 동물에게 피브로넥틴의 ED-A 도메인에 결합하는 특이적 결합 구성원을 투여하는 단계, 및
(b) 인간 또는 동물 신체의 IBD 부위 내의 특이적 결합 구성원의 존재 또는 부재를 결정하는 단계
를 포함하고, IBD 부위에 특이적 결합 구성원이 국소화되는 것이 IBD의 존재를 가리키는 것인, 인간 또는 동물에서 IBD를 검출 또는 진단하는 방법을 또한 제공한다.
바람직하게는, 특이적 결합 구성원은 인간 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합한다.
본 발명의 이러한 세 번째 측면에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다.
본 발명의 이러한 세 번째 측면에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자는 검출가능한 표지, 또는 방사성 동위원소에 접합될 수 있다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 IBD 조직의 영상화 방법에서 사용하기 위한, 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합하는 특이적 결합 구성원을 제공한다. 본 발명은 IBD 조직을 영상화하기 위한 영상화제의 제작을 위한, 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합하는 특이적 결합 구성원의 용도를 또한 제공한다. 본 발명은
(a) 인간 또는 동물에게 피브로넥틴의 ED-A 도메인에 결합하는 특이적 결합 구성원을 투여하는 단계, 및
(b) 인간 또는 동물 신체의 IBD 조직에 대한 특이적 결합 구성원의 결합을 검출하는 단계
를 포함하는, 인간 또는 동물에서 IBD 조직을 검출 또는 영상화하는 방법을 또한 제공한다.
바람직하게는, 특이적 결합 구성원은 인간 피브로넥틴의 ED-A 아이소형에 결합한다.
본 발명의 이러한 네 번째 측면에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다.
본 발명의 이러한 네 번째 측면에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자는 검출가능한 표지, 또는 방사성 동위원소에 접합될 수 있다.
다섯 번째 측면에서, 본 발명은 IL-10에 접합된 피브로넥틴의 ED-A 아이소형, 예를 들어 ED-A에 결합하는 결합 구성원을 포함하고, 서열 13에 제시된 서열을 갖는 접합체를 제공한다. 이러한 접합체는 본원에서 F8-IL10으로 지칭된다. 이러한 접합체의 VH 및 VL 도메인이 아미노산 5개의 링커 (도 1b 참조)에 의해 연결되기 때문에, 접합체는 용액에서 비-공유결합 동종이량체를 형성할 것으로 예상된다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 피브로넥틴의 ED-A 아이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 항체 분자일 수 있고, 이때 항체는 본원에 기술된 F8 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 이러한 서열들이 하기에서 제공된다 (서열 1-6 참조). F8 항체의 CDR 서열이 도 1에서 또한 제시된다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 하나 이상의 본원에 기술된 바와 같은 CDR, 예를 들어 CDR3을 포함할 수 있고, 임의적으로 또한 CDR1 및 CDR2를 포함하여 CDR 세트를 형성할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 H 및/또는 L CDR의 개시된 세트 내에 10개 이하, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환이 있는 본원에 기술된 F8 항체의 H 및/또는 L CDR의 세트를 포함한다.
치환은 잠재적으로 CDR 세트 내의 임의의 잔기에서 이루어질 수 있고, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 내일 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 항체 분자, 예를 들어 인간 항체 분자를 포함할 수 있다. 특이적 결합 구성원은 일반적으로 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원의 VH 도메인이 또한 제공된다. 각각의 VH 및 VL 도메인 내에는 상보성 결정 영역 ("CDR"), 및 프레임워크 영역 ("FR")이 있다. VH 도메인은 HCDR들의 세트를 포함하고, VL 도메인은 LCDR들의 세트를 포함한다. 항체 분자는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있다. 이는 VL CDR1, CDR2 및 CDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VL 도메인을 별법적으로 또는 또한 포함할 수 있다. 본원에 개시된 모든 VH 및 VL 서열, CDR 서열, CDR들의 세트 및 HCDR들의 세트 및 LCDR들의 세트는 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원의 실시양태를 나타낸다. 본원에서 기술된 바와 같이, "CDR들의 세트"는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 따라서, HCDR들의 세트는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭하고, LCDR들의 세트는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭한다. 달리 언급되지 않는 한, "CDR들의 세트"는 HCDR 및 LCDR을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함할 수 있고, 이때 HCDR1은 서열 1이고, 임의적으로 HCDR2는 서열 2이고/이거나 HCDR3은 서열 3이다.
하기에서 추가로 논의된 바와 같이, VH 또는 VL 도메인 단독이 항원에 결합하는데 사용될 수 있지만, 전형적으로, VH 도메인이 VL 도메인과 쌍을 이루어 항체의 항원-결합 부위를 제공한다. 따라서, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 및 프레임워크를 포함하는 항체 VL 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 이때 LCDR1은 서열 4이고, 임의적으로 LCDR2는 서열 5이고/이거나 LCDR3은 서열 6이다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 바람직하게는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 항체 분자를 포함하고, 이때 항체 분자는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하며, VH 도메인은 프레임워크, 및 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3의 세트를 포함하고, VL 도메인은 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3, 및 프레임워크를 포함하고,
HCDR1은 서열 1의 아미노산 서열을 갖고;
HCDR2는 서열 2의 아미노산 서열을 갖고;
HCDR3은 서열 3의 아미노산 서열을 갖고;
LCDR1은 서열 4의 아미노산 서열을 갖고;
LCDR2는 서열 5의 아미노산 서열을 갖고;
LCDR3은 서열 6의 아미노산 서열을 갖는다.
항체의 하나 이상의 CDR 또는 CDR들의 세트가 프레임워크 (예를 들어 인간 프레임워크) 내로 그래프트되어, 본 발명에서 사용하기 위한 항체 분자를 제공할 수 있다. 프레임워크 영역은 인간 생식계열 유전자 분절 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 프레임워크가 생식계열화될 수 있고, 이에 의해 가장 유사한 인간 생식계열 프레임워크 내의 등가의 위치에서의 잔기에 매칭되도록 프레임워크 내의 하나 이상의 잔기가 변화된다. 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 인간 생식계열 프레임워크, 예를 들어 DP47 내의 HCDR들의 세트를 포함하는 VH 도메인이 있는 단리된 항체 분자일 수 있다. 일반적으로, 특이적 결합 구성원에는 예를 들어 인간 생식계열 프레임워크 내의 LCDR들의 세트를 포함하는 VL 도메인도 있다. VL 도메인의 인간 생식계열 프레임워크는 DPK22일 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 VH 도메인은 바람직하게는 서열 7의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 이는 F8 항체의 VH 도메인이다. 본 발명에서 사용하기 위한 VL 도메인은 바람직하게는 서열 8의 아미노산 서열을 가질 수 있고, 이는 야생형 F8 항체의 VL 도메인이다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 펩티드 링커를 통해 연결된 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv (scFv)일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 링커의 적합한 길이 및 서열, 예를 들어, 아미노산 5개 이상 또는 10개 이상의 길이, 아미노산 약 15개 이하, 약 20개 이하 또는 약 25개 이하의 길이를 선택할 수 있다. 링커는 GGSGG (서열 9)의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
특이적 결합 구성원은 유전자 융합에 의해 구축된 다가 또는 다중특이적 단편인 디아바디(diabody)일 수 있다 (WO94/13804; Holliger et al. (1993a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448).
바람직하게는, 특이적 결합 구성원은 용액에서 (안정적인) 비-공유결합 이종이량체를 형성하는 scFv이다. 예를 들어, 본원에서 기술된 F8 항체 및 F8-IL10 접합체 양쪽 모두 용액에서 (안정적인) 비-공유결합 이종이량체를 형성할 것으로 예상되는 scFv를 포함한다.
예를 들어 문헌 [Li et al. (1997), Protein Engineering, 10: 731-736]에서 기술된 바와 같이, 미니-면역글로불린 또는 소형 면역단백질 (SIP) 내에 단일쇄 Fv (scFv)가 포함될 수 있다. SIP가 동종이량체성 미니-면역글로불린 항체 분자를 형성하는 인간 IgE 분비성 아이소형 IgE-S2의 CH4 도메인 (εS2-CH4; Batista et al, (1996), J. Exp. Med., 184: 2197-205)에 융합된 scFv 분자를 포함할 수 있다.
별법적으로, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 일반적으로 비-항체 단백질 스캐폴드 내의 하나 이상의 CDR, 예를 들어 CDR들의 세트에 의해 제공되는, 비-항체 분자 내의 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 비-항체 및 항체 분자가 포함되는 특이적 결합 구성원이 본원의 다른 곳에서 더욱 상세하게 기술된다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 서열 7에 제시된 F8 항체의 VH 도메인 및/또는 서열 8에 제시된 F8 항체의 VL 도메인을 포함하는 항체 분자일 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 서열 11에 제시된 서열을 포함하는 항체 분자일 수 있다. 본 발명의 IL-10에 접합된 특이적 결합 구성원은 서열 13에 제시된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 항 ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F1, B7, E8 또는 G9 또는 이의 변이체의 CDR 중 하나 이상, 예를 들어 6개 모두, 또는 항 ED-A 항체 H1, B2, C5, D5, E5, C8, F1, B7, E8 또는 G9 또는 이의 변이체의 VH 및/또는 VL 도메인을 또한 포함할 수 있다. 이러한 항체들의 CDR 서열 및 VH 및 VL 도메인 서열이 WO2010/078950에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 적절한 변이체는 서열 7로서 제시된 VH 도메인의 위치 5의 류신 (L) 잔기가 발린 (V)으로 치환되고/되거나 서열 8로서 제시된 VL 도메인의 위치 18의 아르기닌 (R) 잔기가 라이신 (K)으로 치환된, 본원에 기술된 F8 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체 항원 결합 부위를 포함한다.
본 발명의 이러한 측면들 및 기타 측면들이 하기에서 더욱 상세하게 기술된다.
도 1a는 항-ED-A F8 항체 중쇄 (VH)의 아미노산 서열 (서열 7)을 나타낸다. 항-ED-A F8 항체의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 (서열 1)에 밑줄이 그어져 있다. 항-ED-A F8 항체의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 (서열 2)이 밑줄친 이탤릭체 로 제시된다. 항-ED-A F8 항체의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 (서열 3)이 밑줄친 볼드체 로 제시된다. 도 1b는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 항-ED-A F8 항체 링커 서열의 아미노산 서열 (서열 9)을 나타낸다. 도 1c는 항-ED-A F8 항체 경쇄 (VL)의 아미노산 서열 (서열 8)을 나타낸다. 항-ED-A F8 항체의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 (서열 4)에 밑줄이 그어져 있다. 항-ED-A F8 항체의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 (서열 5)이 밑줄친 이탤릭체 로 제시된다. 항-ED-A F8 항체의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열 (서열 6)이 밑줄친 볼드체 로 제시된다. 도 1d는 항체가 IL-10에 접합되었을 때 F8 항체와 IL-10 사이의 링커의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 1e는 인간 IL-10의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 IBD 마우스 및 건강한 마우스로부터의 결장 자가조직방사선촬영술의 결과를 나타낸다. 결장을 수확하고, 24시간 동안 인-영상화 스크린 (몰레큘러 다이나믹스(Molecular Dynamics))에 노출시키고, 스톰(Storm) 860을 통해 영상화하였다. 레인-1: 0군 (건강한 마우스)으로부터의 주사 6시간 후에 수확된 결장; 레인-2: 2군 (IBD 마우스)으로부터의 주사 6시간 후에 수확된 결장; 레인-3: 0군 (건강한 마우스)으로부터의 주사 24시간 후에 수확된 결장; 레인-4: 2군 (IBD 마우스)으로부터의 주사 24시간 후에 수확된 결장.
도 3은 건강한 마우스 또는 이환 마우스에서의 125I-F8-IL10의 생체분포를 나타낸다. 차트는 주사 6시간 후 (A), 주사 24시간 후 (B), 및 주사 96시간 후 (C)의 건강한 마우스 및 이환 마우스에서의 125I-F8-IL10의 생체분포를 나타낸다. 96시간에, 건강한 마우스와 비교하여 이환 마우스의 결장 및 장간막 림프절 (L.N.)에서의 125I-F8-IL10의 우선적인 축적이 가시적이다. 이러한 실험에서 사용된 F8-IL10 접합체의 서열이 서열 13에서 제시된다.
도 4는 F8-IL10으로 처리된 마우스에서의 사이토카인 수준을 나타낸다. 상기 차트는 건강한 마우스 (물), 처리를 받지 않은 이환 마우스 (3％ DSS), 소형 면역 단백질(Small Immune Protein) 양식의 F8 항체를 받은 이환 마우스 (F8SIP), F8-IL10을 받은 이환 마우스 (F8-IL10)의 혈청에서의 사이토카인 수준을 나타낸다. 보고된 사이토카인 수준 (혈청 1 ㎖ 당 단백질 pg으로 표현됨)은 하기와 같다: 인터루킨 1β (IL1-b), 인터루킨 12 (IL-12p70), 인터페론 γ (IFNγ) 및 인터루킨 6 (IL6).
도 5는 F8-IL10으로 처리된 마우스에서의 사이토카인 수준을 나타낸다. 상기 차트는 건강한 마우스 (물), 처리를 받지 않은 이환 마우스 (3％ DSS), 소형 면역 단백질 양식의 F8 항체를 받은 이환 마우스 (F8SIP), F8-IL10을 받은 이환 마우스 (F8-IL10)의 혈청에서의 사이토카인 수준을 나타낸다. 보고된 사이토카인 수준 (혈청 1 ㎖ 당 단백질 pg으로 이의 수준이 표현됨)은 하기와 같다: 각질세포-유래 케모카인 (KC), 인터루킨 10 (IL10) 및 종양 괴사 인자 알파 (TNFa).
도 6은 SIP 양식의 F8 항체 및 폰 빌레브란트(Von Willebrand) 인자로 프로빙된 궤양성 결장염 및 크론병에 걸린 환자로부터의 결장 조직의 시험편의 조직화학적 분석을 나타낸다. F8 항체 및 폰 빌레브란트 인자로 관찰된 염색 패턴은 F8이 궤양성 결장염 및 크론병에 걸린 환자에서 새롭게 형성된 혈관을 염색하지만, 정상 혈관은 염색하지 않는다는 것을 나타낸다. (폰 빌레브란트 인자는 정상 혈관구조의 마커로서 일상적으로 사용된다.)
도 7은 궤양성 결장염 및 크론병에 걸린 환자의 결장 조직 (오른쪽) 및 병에 걸리지 않은 결장 (왼쪽)의 시험편의 조직화학적 분석을 나타낸다. F8 항체로 관찰된 염색 패턴은 F8이 이환 결장 내의 새롭게 형성 중인 혈관을 더욱 강하게 염색한다는 것을 나타낸다.
용어
피브로넥틴
본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 피브로넥틴은 별법적인 스플라이싱이 적용되는 항원이고, 피브로넥틴의 다수의 별법적인 아이소형이 공지되어 있다. 엑스트라-도메인-A (EDA 또는 ED-A)는 ED, 엑스트라 III형 반복물 A (EIIIA) 또는 EDI로 또한 공지되어 있다. 인간 ED-A의 서열이 문헌 [Kornblihtt et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868] 및 [Paolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557]에 의해 공개되었다. 인간 ED-A의 서열은 등록 번호 P02751 하에 기탁된 아미노산 서열의 아미노산 1631-1720 (피브로넥틴 III형 12; 엑스트라 도메인 2)으로서 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스에서 또한 입수가능하다. 마우스 ED-A의 서열은 등록 번호 P11276 하에 기탁된 아미노산 서열의 아미노산 1721-1810 (피브로넥틴 III형 13; 엑스트라 도메인 2)으로서 스위스프롯 데이터에서 입수가능하다.
피브로넥틴의 ED-A 아이소형 (A-FN)은 엑스트라 도메인-A (ED-A)를 함유한다. 인간 A-FN의 서열은 등록 번호 P02751 하에 스위스프롯 데이터베이스에서 입수가능한 상응하는 인간 피브로넥틴 전구체 서열로부터 추정될 수 있다. 마우스 A-FN의 서열은 등록 번호 P11276 하에 스위스프롯 데이터베이스에서 입수가능한 상응하는 마우스 피브로넥틴 전구체 서열로부터 추정될 수 있다. A-FN은 피브로넥틴의 인간 ED-A 아이소형일 수 있다. ED-A는 인간 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A일 수 있다.
ED-A는 별법적인 스플라이싱에 의해 피브로넥틴 (FN) 내로 삽입되고 FN의 도메인 11과 12 사이에 위치하는 아미노산 90개의 서열이다 (Borsi et al., 1987, J. Cell Biol., 104, 595-600). ED-A는 혈장 형태의 FN에는 주로 부재하지만, 배발생, 조직 리모델링, 섬유증, 심장 이식 및 고형 종양 성장 동안에는 풍부하다.
별법적인 스플라이싱
별법적인 스플라이싱은 DNA의 1차 RNA 전사체의 상이한 패턴들의 스플라이싱이 발생하여 상이한 mRNA들이 생산되는 것을 지칭한다. 인트론 절단 후, 선택에 의해 어떤 엑손들이 함께 스플라이싱되어 mRNA를 형성하는지가 결정될 수 있다. 별법적인 스플라이싱은 상이한 엑손 및/또는 상이한 개수의 엑손을 함유하는 상이한 아이소형들의 생산에 이른다. 예를 들어, 한 아이소형이 하나 이상의 엑손에 상응하는 부가적인 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 이는 하나 이상의 도메인을 포함할 수 있다.
특이적 결합 구성원
이는 서로 특이적으로 결합하는 한 쌍의 분자들 중 하나의 구성원을 기술한다. 특이적 결합쌍의 구성원들은 천연적으로 유래될 수 있거나, 또는 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 생산될 수 있다. 분자 쌍 중 하나의 구성원에는 분자 쌍의 다른 구성원에 결합하고 따라서 다른 구성원의 특정한 공간적 및 극성 구성에 상보적인 표면 상의 면적 또는 공동이 있다. 결합 쌍의 유형의 예는 항원-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 효소-기질이다. 본 발명은 항원-항체 유형 반응에 관한 것이다.
일반적으로 특이적 결합 구성원은 항원-결합 부위가 있는 분자를 포함한다. 예를 들어, 특이적 결합 구성원은 항원-결합 부위를 포함하는 항체 분자 또는 비-항체 단백질일 수 있다. 본원에서 언급된 바와 같은 특이적 결합 구성원은 바람직하게는 항체 분자이다.
비-항체 단백질 스캐폴드 예컨대 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B 등 상의 상보성 결정 영역 (CDR)의 배열에 의해 (Haan & Maggos, (2004), BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al, (1998), Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren et al, (1997), Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469), 또는 원하는 표적에 대한 결합 특이성을 부여하도록 단백질 스캐폴드 내의 루프의 아미노산 잔기를 무작위화 또는 돌연변이시킴으로써, 항원 결합 부위가 제공될 수 있다. 단백질 내의 신규 결합 부위를 조작하기 위한 스캐폴드가 문헌 [Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, 7: 463-469]에서 상세히 검토되었다. 하나 이상의 무작위화된 루프가 있는 피브로넥틴 III형 도메인을 포함하는 단백질 (항체 모방체)을 발명자들이 기술한 WO/0034784에 항체 모방체를 위한 단백질 스캐폴드가 개시되어 있다. 하나 이상의 CDR, 예를 들어, HCDR들의 세트가 그래프트될 적절한 스캐폴드가 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리의 임의의 도메인 구성원에 의해 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 비-인간 단백질일 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드의 장점은 적어도 일부 항체 분자보다 더 작고/작거나 조작하기가 더 용이한 스캐폴드 분자 내에 항원-결합 부위를 제공할 수 있다는 것이다. 결합 구성원의 작은 크기는 세포 내로 진입하거나, 조직 내로 깊이 침투하거나 또는 다른 구조물 내의 표적에 도달하는 능력 또는 표적 항원의 단백질 공동 내에서 결합하는 능력과 같은 유용한 생리학적 성질을 부여할 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드 내의 항원 결합 부위를 사용하는 것이 문헌 [Wess, 2004, BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7]에서 검토되었다. 안정적인 골격 및 하나 이상의 가변 루프가 있는 단백질이 전형적이고, 이때 표적 항원에 결합하는 항원-결합 부위가 생성되도록 루프 또는 루프들 내의 아미노산 서열이 특이적으로 또는 무작위로 돌연변이된다. 이같은 단백질은 에스. 아우레우스(S. aureus)로부터의 단백질 A의 IgG-결합 도메인, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴 (예를 들어 제10 피브로넥틴 III형 도메인) 및 리포칼린을 포함한다. 기타 접근법은 분자내 디술피드 결합이 있는 소형 단백질인 시클로티드를 기초로 하는 합성 "마이크로바디(Microbody)" (셀레코어 게엠베하(Selecore GmbH))를 포함한다.
항체 서열 및/또는 항원-결합 부위에 더하여, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 폴딩된 도메인과 같은 펩티드 또는 폴리펩티드를 형성하거나 또는 항원에 결합하는 능력에 더하여 또 다른 기능적 특성을 분자에 부여하는 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 결합 구성원은 검출가능한 표지를 보유할 수 있거나, 또는 독소, 면역억제 또는 항염증 효과를 발휘하는 분자 또는 표적화 모이어티 또는 효소에 (예를 들어 펩티드 결합 또는 링커를 통해) 접합될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 결합 구성원은 인터루킨 10에 접합된다.
예를 들어, 결합 구성원은 항원 결합 부위뿐만 아니라 촉매 부위를 (예를 들어, 효소 도메인 내에) 포함할 수 있고, 이때 항원 결합 부위는 항원에 결합하고, 따라서 촉매 부위를 항원에 표적화한다. 촉매 부위는, 예를 들어 절단에 의해, 항원의 생물학적 기능을 억제할 수 있다.
언급된 바와 같이, 비-항체 스캐폴드가 CDR을 보유할 수 있지만, CDR 또는 CDR들의 세트를 보유하기 위한 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 이의 실질적인 부분일 것이고, 여기에서 CDR 또는 CDR들의 세트는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 천연 발생 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDR들의 세트에 상응하는 위치에 위치한다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌 [Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4th Edition. US Department of Health and Human Services.], 및 이의 개정판을 참고로 결정될 수 있고, 이는 현재 인터넷 상에서 입수가능하다 (immuno.bme.nwu.edu에서 입수가능하거나, 또는 임의의 검색 엔진을 사용하여 "카밧(Kabat)"을 확인함).
CDR 영역 또는 CDR에 의해, 문헌 [Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, US Department of Health and Human Services] (문헌 [Kabat et al, (1991a), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington], 및 최신판)에 정의된 바와 같은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역을 가리키는 것이 의도된다. 전형적으로 항체는 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 함유한다. CDR 또는 CDR들이라는 용어는, 경우에 따라, 항체가 인식하는 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 친화력에 의해 결합을 담당하는 아미노산 잔기들 대부분을 함유하는 이러한 영역들 중 하나, 또는 이러한 영역들 중 몇개, 또는 심지어 이러한 영역들 전체를 가리키기 위하여 본원에서 사용된다.
6개의 짧은 CDR 서열 중에서, 중쇄의 세 번째 CDR (HCDR3)이 크기 가변성이 더 크다 (이를 발생시키는 유전자들의 배열 메커니즘에 본질적으로 기인하여 다양성이 더 크다). 이는 아미노산 2개만큼 짧을 수 있지만, 공지된 가장 긴 크기는 26개이다. 기능적으로, HCDR3은 항체 특이성의 결정에서 부분적으로 역할을 한다 (Segal et al, (1974), PNAS, 71:4298-4302; Amit et al, (1986), Science, 233:747-753; Chothia et al, (1987), J. Mol. Biol., 196:901-917; Chothia et al, (1989), Nature, 342:877-883; Caton et al, (1990), J. Immunol., 144:1965-1968; Sharon et al, (1990a), PNAS, 87:4814-4817; Sharon et al, (1990b), J. Immunol., 144:4863-4869; Kabat et al, (1991b), J. Immunol., 147:1709-1719).
항체 분자
이는 천연이든 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성으로 생산되었든 면역글로불린을 기술한다. 이러한 용어는 또한 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질에 관한 것이다. 본 발명이 천연 형태의 항체에 관한 것이 아니고, 즉 항체가 이의 천연 환경에 있는 것이 아니라, 천연 공급원으로부터 정제에 의해 단리 또는 수득되었을 수 있거나, 그렇지 않으면 유전자 재조합에 의해 또는 화학적 합성에 의해 수득되었을 수 있다는 것과 그렇다면 추후에 기술될 바와 같이 항체가 비천연 아미노산을 함유할 수 있다는 것을 본원에서 이해하여야 한다. 항체 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편은 항체 분자 예컨대 Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd; 및 디아바디를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
모노클로날 및 기타 항체를 취하고 재조합 DNA 공업 기술의 기술을 사용하여 표적 항원에 결합하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생산할 수 있다. 이같은 기술은 항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 CDR을 코딩하는 DNA를 상이한 면역글로불린의 불변 영역 또는 불변 영역 + 프레임워크 영역에 도입하는 것을 수반할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400, 및 다수의 후속 문헌을 참조한다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 기타 세포에 유전자 돌연변이 또는 기타 변화를 적용할 수 있고, 이는 생산된 항체의 결합 특이성을 변경시킬 수 있거나 또는 변경시키지 않을 수 있다.
항체가 다수의 방식으로 변형될 수 있기 때문에, "항체 분자"라는 용어는 원하는 특이성이 있는 항체 항원-결합 부위가 있고/있거나 항원에 결합하는 임의의 결합 구성원 또는 물질을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이러한 용어는, 천연이든 또는 전체적으로 또는 부분적으로 합성이든, 항체 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드가 포함되는 항체 단편 및 유도체를 포괄한다. 또 다른 폴리펩티드 (예를 들어, 또 다른 종으로부터 유래되거나 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속함)에 융합된, 항체 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 분자 또는 등가물이 따라서 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현이 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 및 다수의 후속 문헌에 기술되어 있다.
항체 조작 분야에서 이용가능한 추가적인 기술은 인간 항체 및 인간화 항체를 단리하는 것을 가능하게 하였다. 예를 들어, 문헌 [Kontermann & Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545]에 기술된 바와 같이 인간 하이브리도마를 제조할 수 있다. 결합 구성원을 생성시키기 위한 또 다른 확립된 기술인 파지 디스플레이가 WO92/01047 (하기에서 추가로 논의됨) 및 미국 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404 및 문헌 [Kontermann & Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545]과 같은 다수의 공개물에서 상세하게 기술되었다. 마우스 면역계의 다른 성분들은 그대로 두면서 마우스 항체 유전자가 불활성화되고 인간 항체 유전자로 기능적으로 교체되어 있는 트랜스제닉 마우스를 인간 항체를 단리하는데 사용할 수 있다 (Mendez et al, (1997), Nature Genet, 15(2): 146-156).
예를 들어 문헌 [Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296, 57-86] 또는 [Krebs et al. (2001) Journal of Immunological Methods, 254 67-84]에 기술된 바와 같이, 적절한 발현 벡터 내에 합성 및 조립된 올리고뉴클레오티드에 의해 생성된 유전자로부터의 발현에 의해 합성 항체 분자가 생성될 수 있다.
전체 항체의 단편이 항원에 결합하는 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546; McCafferty et al, (1990) Nature, 348, 552-554; Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490); (v) 단리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 이러한 2개의 도메인이 회합되어 항원 결합 부위를 형성하게 하는 펩티드 링커에 의해 연결된 단일쇄 Fv 분자 (scFv) (Bird et al. (1988) Science, 242, 423-426; Huston et al. (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883); (viii) 이중특이적 단일쇄 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축된 다가 또는 다중특이적 단편인 "디아바디" (WO94/13804; Holliger et al. (1993a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448)이다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디술피드 다리의 혼입에 의해 안정화될 수 있다 (Reiter et al. (1996), Nature Biotech, 14, 1239-1245). CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 미니바디(minibody)가 또한 제조될 수 있다 (Hu et al. (1996), Cancer Res., 56 (13): 3055-61). 결합 단편의 다른 예는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인이 포함되는 몇몇 잔기가 부가되어 Fab 단편과 상이한 Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 기를 보유하는 Fab' 단편인 Fab'-SH이다.
본원에 기술된 항체 분자들 중 임의의 것, 예를 들어 본원에 기술된 항체 중 임의의 것의 VH 및/또는 VL 도메인 또는 CDR을 포함하는 항체 분자로부터 출발하여 효소, 예컨대 펩신 또는 파파인에 의한 소화와 같은 방법 및/또는 화학적 환원에 의한 디술피드 다리의 절단에 의해 본 발명에서 사용하기 위한 항체 단편이 수득될 수 있다. 또 다른 예에서, 통상의 기술자에게 주지된 것과 같은 유전자 재조합의 기술에 의해, 그렇지 않으면 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 사 등이 공급하는 것과 같은 자동 펩티드 합성기에 의한 펩티드 합성에 의해, 또는 핵산 합성 및 발현에 의해 본 발명의 항체 단편이 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 항체 단편은 화학적 변형, 특히 PEG화에 의해 또는 리포솜 내의 혼입에 의해 반감기가 증가된 임의의 기능성 단편을 포함한다.
dAb (도메인 항체)는 항체, 즉 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역의 소형 단량체성 항원-결합 단편이다 (Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490). VH dAb는 낙타류 (예를 들어, 낙타, 라마)에서 천연적으로 발생하고, 낙타류를 표적 항원으로 면역화하고, 항원-특이적 B 세포를 단리하고, 개별적인 B 세포들로부터 dAb 유전자를 직접적으로 클로닝하는 것에 의해 생산될 수 있다. dAb는 세포 배양에서 또한 생산될 수 있다. 이들의 작은 크기, 양호한 용해도, 및 온도 안정성은 이들을 특히 생리학적으로 유용하게 하고 선별 및 친화력 성숙에 적절하게 한다. 본 발명의 결합 구성원은 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 VH 또는 VL 도메인 또는 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 CDR들의 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 기재된 바와 같은"이라는 구절은 본원에서 기술된 결합 구성원의 VH 또는 VL 도메인의 관련된 CDR의 특성(들)이 본원에 서열이 기재된 특정 영역과 동일하거나 또는 고도로 유사할 것임을 지칭한다. 본원에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 가변 도메인의 특정 영역(들)과 관련된 "고도로 유사한"이라는 구절은 1개 내지 약 5개, 예를 들어 1개 내지 4개 (1개 내지 3개, 또는 1개 또는 2개, 또는 3개 또는 4개가 포함됨)의 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인에서 이루어질 수 있다는 것으로 생각된다.
이중특이적 또는 2관능성 항체는 2개의 상이한 가변 영역이 동일한 분자 내에서 조합된 제2 세대 모노클로날 항체를 형성한다 (Holliger and Bohlen 1999 Cancer 및 metastasis rev. 18: 411-419). 새로운 이펙터 기능을 동원하거나 또는 종양 세포의 표면 상의 여러 분자를 표적화하는 이들의 능력으로부터 진단 분야 및 치료법 분야 양쪽 모두에서 이들의 용도가 실연되었다. 이중특이적 항체가 사용되는 경우, 이는 다양한 방식으로 제작될 수 있는 (Holliger et al. (1993b), Current Opinion Biotechnol 4, 446-449), 예를 들어 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 통상적인 이중특이적 항체일 수 있거나, 또는 상기 언급된 이중특이적 항체 단편들 중 임의의 것일 수 있다. 이러한 항체들을 화학적 방법 (Glennie et al. (1987), J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp et al. (1995), J. Hemat. 377-382) 또는 체세포 방법 (Staerz U. D. and Bevan M. J. (1986), PNAS 83; Suresh et al. (1986), Method. Enzymol. 121: 210-228)에 의해 수득할 수 있고, 이종이량체화가 강요되도록 하여 추구하는 항체의 정제 공정을 용이하게 하는 유전자 조작 기술 (Merchand et al., 1998 Nature Biotech. 16:677-681)에 의해서도 수득할 수 있다. 이중특이적 항체의 예는 특이성이 상이한 2개의 항체의 결합 도메인이 사용될 수 있고 짧은 가요성 펩티드를 통해 직접적으로 연결될 수 있는 BiTE™ 기술의 것들을 포함한다. 이는 2개의 항체를 짧은 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 조합시킨다.
Fc 영역 없이 가변 도메인만을 사용하여 디아바디 및 scFv가 구축될 수 있고, 이는 잠재적으로 항-이디오타입 반응의 효과를 감소시킨다.
전체 IgG로서, 이중특이적 Fab'2로서, Fab'PEG로서, 디아바디로서 또는 이중특이적 scFv로서 이중특이적 항체가 구축될 수 있다. 또한, 4가 항체가 형성되도록 관련 기술분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 2개의 이중특이적 항체를 연결시킬 수 있다.
이중특이적 전체 항체와 대조적으로, 이.콜라이(E.coli)에서 쉽게 구축 및 발현될 수 있기 때문에 이중특이적 디아바디가 또한 특히 유용할 수 있다. 적합한 결합 특이성의 디아바디 (및 다수의 기타 폴리펩티드 예컨대 항체 단편)를 라이브러리로부터 파지 디스플레이 (WO94/13804)를 사용하여 쉽게 선별할 수 있다. 디아바디의 한쪽 팔이 예를 들어 표적 항원에 대해 지시된 특이성이 있도록 불변으로 유지되어야 한다면, 다른쪽 팔이 변화되는 라이브러리를 제조할 수 있고, 적합한 특이성의 항체를 선별할 수 있다. 문헌 [Ridgeway et al. (1996), Protein Eng., 9, 616-621]에 기술된 바와 같은 별법적인 조작 방법에 의해 이중특이적 전체 항체를 제조할 수 있다.
표적 항원에 대한 항체를 수득하기 위해 다양한 방법이 관련 기술분야에서 이용가능하다. 항체는 모노클로날 항체, 특히 인간, 뮤린, 키메라 또는 인간화 기원의 모노클로날 항체일 수 있고, 이는 통상의 기술자에게 주지된 표준 방법에 따라 수득될 수 있다.
일반적으로, 모노클로날 항체 또는 이의 기능성 단편, 특히 뮤린 기원의 것의 제조를 위해, 매뉴얼 "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988)에 특히 기술되어 있는 기술 또는 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497]에 기술된 하이브리도마로부터의 제조 기술을 참고할 수 있다.
모노클로날 항체를, 예를 들어, A-FN 또는 상기 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프를 함유하는 이의 단편들 중 하나, 예를 들어 ED-A를 포함하거나 ED-A로 이루어진 단편 또는 ED-A의 펩티드 단편에 대해 면역화된 동물 세포로부터 수득할 수 있다. 특히, A-FN, 또는 이의 단편 중 하나를 일반적인 작업 방법에 따라, A-FN 또는 이의 단편을 코딩하는 cDNA 서열 내에 함유된 핵산 서열로 출발하여 유전자 재조합에 의해, A-FN 및/또는 이의 단편의 펩티드 서열 내에 포함된 아미노산들의 서열로부터 출발하여 펩티드 합성에 의해 생산할 수 있다.
모노클로날 항체를, 예를 들어, A-FN 또는 상기 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프를 함유하는 이의 단편들 중 하나, 예를 들어 ED-A를 포함하거나 ED-A로 이루어진 단편 또는 ED-A의 펩티드 단편이 미리 고정된 친화력 칼럼 상에서 정제할 수 있다. 단백질 A 및/또는 G 상에서의 크로마토그래피로 모노클로날 항체를 정제할 수 있고, 그 자체 내에 존재하는 잔여 단백질 오염물질, 뿐만 아니라 DNA 및 LPS를 제거하기 위한 목적의 이온-교환 크로마토그래피가 이어지거나 또는 이어지지 않고, 이량체 또는 기타 다량체의 존재로 인한 잠재적인 응집물을 제거하기 위한 세파로스 겔 상에서의 배제 크로마토그래피가 이어지거나 또는 이어지지 않는다. 이러한 기술들 전체가 동시에 또는 연속적으로 사용될 수 있다.
항원-결합 부위
이는 전체 표적 항원 또는 표적 항원의 일부에 결합하고 이에 대해 상보적인 분자의 일부분을 기술한다. 항체 분자에서, 이는 항체 항원-결합 부위로 지칭되고, 전체 표적 항원 또는 표적 항원의 일부에 결합하고 이에 대해 상보적인 항체의 일부분을 포함한다. 항원이 큰 경우에, 항체는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있고, 이러한 부분을 에피토프로 칭한다. 항체 항원-결합 부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항체 항원-결합 부위는 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함할 수 있다.
단리됨
이는 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원 또는 이같은 특이적 결합 구성원을 코딩하는 핵산이 일반적으로 본 발명에 따른 것인 상태를 지칭한다. 따라서, 본 발명의 특이적 결합 구성원, VH 및/또는 VL 도메인은 예를 들어 이의 천연 환경으로부터 단리 및/또는 정제되어, 실질적으로 순수하거나 균질한 형태로, 또는 핵산의 경우에는 원하는 기능의 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 것에서 기원하는 핵산 또는 유전자가 없거나 실질적으로 없이 제공될 수 있다. 단리된 구성원 및 단리된 핵산은 이들과 천연적으로 회합되는 물질 예컨대 이들의 천연 환경 또는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 실행되는 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는 경우 이들이 제조되는 환경 (예를 들어 세포 배양)에서 함께 발견되는 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 없거나 또는 실질적으로 없을 것이다. 특이적 결합 구성원 및 핵산은 희석제 또는 아주반트와 함께 제형화될 수 있고, 여전히 실용적인 목적을 위해 단리될 수 있다 - 예를 들어, 면역검정법에서 사용하기 위한 미량역가 플레이트를 코팅하는데 사용되는 경우 구성원이 일반적으로 젤라틴 또는 기타 담체와 혼합되거나, 또는 진단 또는 치료법에서 사용되는 경우 구성원이 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다. 특이적 결합 구성원은 천연적으로 또는 이종 진핵생물 세포 (예를 들어 CHO 또는 NS0 (ECACC 85110503) 세포)에 의해 글리코실화될 수 있거나, 또는 (예를 들어, 원핵생물 세포에서의 발현에 의해 생산된다면) 글리코실화되지 않을 수 있다.
항체 분자를 포함하는 비균질 제제가 본 발명에서 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 이같은 제제는 글리코실화 정도가 다양하고/하거나 유도체화 아미노산, 예컨대 N-말단 글루탐산이 고리화되어 형성된 피로글루탐산 잔기가 있는, 전장 중쇄 및 C-말단 라이신이 없는 중쇄가 있는 항체들의 혼합물일 수 있다.
본 발명에 따른 특이적 결합 구성원들의 라이브러리와 항원 또는 이의 단편, 예를 들어 ED-A를 포함하거나 ED-A로 이루어진 단편, 또는 ED-A의 펩티드 단편을 접촉시키고, 항원에 결합할 수 있는 라이브러리의 하나 이상의 특이적 결합 구성원을 선택함으로써, 항원, 예를 들어 A-FN, 피브로넥틴의 ED-A에 대한 하나 이상의 특이적 결합 구성원을 수득할 수 있다.
항체 라이브러리를 반복 콜로니 필터 스크리닝 (ICFS: Iterative Colony Filter Screening)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. ICFS에서, 몇몇 결합 특이성을 코딩하는 DNA를 함유하는 박테리아를 액체 배지에서 성장시키고, 지수 성장 단계에 도달하면, 적절하게 예비 처리된 막 필터로 이루어진 성장 지지체 상에 수십억 개를 분포시키고, 이를 완전히 전면성장된 박테리아 콜로니가 나타날 때까지 인큐베이션한다. 제2 포획 기판은 미리 습윤화되고 원하는 항원으로 덮힌 또 다른 막 필터로 이루어진다.
그 후, 포획 막 필터를 적절한 배양 배지를 함유하는 플레이트 상에 놓고, 성장 필터로 덮고, 이때 박테리아 콜로니를 위로 향하게 하여 표면을 덮는다. 이렇게 수득된 샌드위치를 실온에서 약 16시간 동안 인큐베이션한다. 따라서, 확산 작용이 있는 항체 단편 scFv를 코딩하는 유전자의 발현을 수득할 수 있어, 포획 막 상에 존재하는 항원과 특이적으로 결합하는 단편들이 포획된다. 그 후, 결합된 항체 단편 scFv를 지시하도록 이러한 목적에 통상적으로 사용되는 비색법 기술로 포획 막을 처리한다.
포획 필터 상의 유색 지점의 위치는 성장 막 상에 존재하고 포획된 항체 단편을 생산하는 상응하는 박테리아 콜로니를 추적할 수 있게 한다. 이같은 콜로니들을 수집하여 성장시키고, 그 중 수백만 개의 박테리아를 새로운 배양 막 상에 분포시켜 상기 기술된 절차를 반복한다. 그 후, 포획 막 상의 양성 신호가 단일 양성 콜로니에 상응할 때까지 유사한 사이클을 수행하고, 이러한 콜로니 각각은 선별에서 사용된 항원에 대해 지시된 모노클로날 항체 단편의 잠재적인 공급원을 나타낸다. 예를 들어 WO0246455에 ICFS가 기술되어 있다.
입자 또는 분자 복합체, 예를 들어, 복제가능한 유전자 패키지 예컨대 박테리오파지 (예를 들어 T7) 입자, 또는 기타 시험관내 디스플레이 시스템 상에 라이브러리가 또한 디스플레이될 수 있고, 각각의 입자 또는 분자 복합체는 입자 또는 분자 복합체 상에 디스플레이된 항체 VH 가변 도메인을 코딩하고, 임의적으로는 디스플레이된 VL 도메인 (존재하는 경우)을 또한 코딩하는 핵산을 함유한다. WO92/01047 및 예를 들어 미국 특허 US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 및 US6521404에 파지 디스플레이가 기술되어 있다.
항원에 결합할 수 있고 박테리오파지 또는 기타 라이브러리 입자 또는 분자 복합체 상에 디스플레이된 결합 구성원을 선별한 후, 상기 선별된 결합 구성원을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 기타 입자 또는 분자 복합체로부터 핵산을 취할 수 있다. 이같은 핵산을 상기 선별된 결합 구성원을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 기타 입자 또는 분자 복합체로부터 취해진 핵산의 서열을 갖는 핵산으로부터의 발현에 의한 결합 구성원 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인 후속 생산에서 사용할 수 있다.
상기 선별된 결합 구성원의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인이 단리된 형태로 제공될 수 있고, 이같은 VH 도메인을 포함하는 결합 구성원도 제공될 수 있다.
A-FN, 또는 피브로넥틴의 ED-A, 또는 기타 표적 항원 또는 아이소형에 결합하는 능력, 예를 들어, A-FN 또는 A-FN의 단편, 예를 들어 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 것에 대해 항-ED-A 항체 F8과 경쟁하는 능력을 추가로 테스트할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 특이적 결합 구성원은 항-ED-A 항체 F8 (예를 들어 scFv 양식)과 동일한 친화력 또는 이보다 더 양호한 친화력으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 3×10-8 M의 KD 또는 이보다 더 양호한 친화력으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 2×10-8 M의 KD 또는 이보다 더 양호한 친화력으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 1.7×10-8 M의 KD 또는 이보다 더 양호한 친화력으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합한다. 더욱 더 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 1.4×10-8 M의 KD 또는 이보다 더 양호한 친화력으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 3×10-9 M의 KD 또는 이보다 더 양호한 친화력으로 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합한다.
본 발명의 특이적 결합 구성원은 항-ED-A 항체 F8와 동일한 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A 상의 에피토프에 결합할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A 이외의 분자에 대해 어떠한 유의한 결합도 나타내지 않을 수 있다. 특히, 특이적 결합 구성원은 피브로넥틴의 다른 아이소형, 예를 들어, 피브로넥틴의 ED-B 아이소형 및/또는 IIICS 아이소형과 결합하지 않을 수 있다.
본원에 개시된 항체 분자의 변이체가 본 발명에서 생산 및 사용될 수 있다. CDR, 항체 VH 또는 VL 도메인, 특히 VH 및 VL 도메인의 프레임워크, 및 결합 구성원의 아미노산 서열에서 치환을 일으키는데 필요한 기술이 관련 기술분야에서 이용가능하다. 활성에 대한 최소의 효과 또는 이로운 효과가 있는 것으로 예상될 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 치환으로 변이체 서열을 제조할 수 있고, A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 능력, 및/또는 임의의 다른 원하는 성질에 대해 이를 테스트할 수 있다.
본원에 서열이 구체적으로 개시된 VH 및 VL 도메인 중 임의의 것의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체가 논의된 바와 같이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 특정 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변경 (아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있고, 이는 약 20개 미만의 변경, 약 15개 미만의 변경, 약 10개 미만의 변경, 또는 약 5개 미만의 변경일 수 있고, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개일 수 있다. 변경은 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 하나 이상의 CDR에서 이루어질 수 있다. 일반적으로 변경은 기능 상실을 초래하지 않아, 이렇게 변경된 아미노산 서열을 포함하는 특이적 결합 구성원은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 능력을 유지할 수 있다. 예를 들어, 이는, 예를 들어 본원에 기술된 검정법으로 측정했을 때, 변경이 이루어지지 않은 특이적 결합 구성원과 동일한 정량적인 결합을 유지할 수 있다. 이렇게 변경된 아미노산 서열을 포함하는 특이적 결합 구성원은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합하는 능력이 개선될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 지칭되는 바와 같은, 피브로넥틴의 ED-A 아이소형 또는 ED-A에 결합하는 특이적 결합 구성원은 VH 및/또는 VL 도메인의 프레임워크 영역 내에 10개 이하, 예를 들어, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 치환이 있는 서열 7에 제시된 VH 도메인 및 서열 8에 제시된 VL 도메인을 포함할 수 있다. 이같은 특이적 결합 구성원은 서열 7에 제시된 VH 도메인 및 서열 8에 제시된 VL 도메인을 포함하는 특이적 결합 구성원과 동일하거나 실질적으로 동일한 친화력으로 피브로넥틴의 ED-A 아이소형 또는 ED-A에 결합할 수 있거나, 또는 서열 7에 제시된 VH 도메인 및 서열 8에 제시된 VL 도메인을 포함하는 특이적 결합 구성원보다 더 높은 친화력으로 피브로넥틴의 ED-A 아이소형 또는 ED-A에 결합할 수 있다.
전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 생성시키는 하나 이상의 선별된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이유발을 사용하여 본 발명에서 사용하기 위한 CDR-유래 서열을 보유하는 신규 VH 또는 VL 영역이 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 또는 2개의 아미노산 치환이 전체 가변 도메인 또는 CDR들의 세트에서 이루어진다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 영역에 대한 직접적인 돌연변이유발이다.
상기 언급된 바와 같이, 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 CDR 아미노산 서열이 인간 항체 가변 도메인 또는 이의 실질적인 부분 내에 CDR로서 보유될 수 있다. 실질적으로 본원에 기재된 바와 같은 HCDR3 서열들이 본 발명의 실시양태를 나타내고, 예를 들어, 이들 각각이 인간 중쇄 가변 도메인 또는 이의 실질적인 부분 내에 HCDR3으로서 보유될 수 있다.
본 발명에서 사용된 가변 도메인은 임의의 생식계열 인간 가변 도메인 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 수득 또는 유래될 수 있거나, 또는 공지된 인간 가변 도메인의 컨센서스 서열 또는 실제 서열을 기초로 하는 합성 가변 도메인일 수 있다. 비-인간 항체로부터 가변 도메인이 유래될 수 있다. 재조합 DNA 기술을 사용하여, 본 발명에서 사용하기 위한 CDR 서열 (예를 들어 CDR3)이 CDR (예를 들어 CDR3)이 없는 가변 도메인의 레퍼토리 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al. (1992)]에 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 생산하는 방법이 기술되어 있고, 이러한 방법에서 가변 도메인 영역의 5' 끝부분에 지시되거나 이에 인접한 컨센서스 프라이머가 인간 VH 유전자의 세 번째 프레임워크 영역에 대한 컨센서스 프라이머와 함께 사용되어 CDR3이 없는 VH 가변 도메인의 레퍼토리가 제공된다. 문헌 [Marks et al.]에는 어떻게 이러한 레퍼토리를 특정 항체의 CDR3와 조합할 수 있는지가 추가로 기술되어 있다. 유사한 기술을 사용하여, 본 발명의 CDR3-유래 서열을 CDR3이 없는 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리에 셔플링할 수 있고, 셔플링된 완전한 VH 또는 VL 도메인이 동족 VL 또는 VH 도메인과 조합되어 본 발명에서 사용하기 위한 결합 구성원을 제공할 수 있다. 그 후, 레퍼토리가 적절한 숙주 시스템 예컨대 WO92/01047 또는 문헌 [Kay, Winter & McCafferty (1996)]이 포함되는 다수의 후속 문헌 중 임의의 것의 파지 디스플레이 시스템에서 디스플레이될 수 있어, 적절한 결합 구성원이 선별될 수 있다. 레퍼토리는 104개를 초과하는 개별적인 구성원, 예를 들어, 105개 이상, 106개 이상, 107개 이상, 108개 이상, 109개 이상 또는 1010개 이상의 구성원으로 이루어질 수 있다.
유사하게, 하나 이상의 CDR 또는 3개의 CDR 모두가 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 내로 그래프트될 수 있고, 그 후 이를 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 결합 구성원 또는 결합 구성원들에 대해 스크리닝한다.
항체 F8의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 중 하나 이상, 또는 항체 F8의 HCDR들의 세트를 사용할 수 있고/있거나, 항체 F8의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 중 하나 이상, 또는 항체 F8의 LCDR들의 세트를 사용할 수 있다.
유사하게, 본원에 개시된 기타 VH 및 VL 도메인, CDR들의 세트 및 HCDR들의 세트 및/또는 LCDR들의 세트를 사용할 수 있다.
A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A가 IBD 치료용 약제의 제조에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원, 예를 들어 항체 분자에 대한 스크린에서 사용될 수 있다. 이러한 스크린은 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같은 레퍼토리의 스크린일 수 있다.
면역글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분이 3개 이상의 CDR 영역을 이들의 개재 프레임워크 영역과 함께 포함할 수 있다. 이러한 부분은 제1 및 제4 프레임워크 영역 중 하나 또는 양쪽 모두의 약 50％ 이상을 또한 포함할 수 있고, 이때 50％는 제1 프레임워크 영역의 C-말단 50％ 및 제4 프레임워크 영역의 N-말단 50％이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N-말단 또는 C-말단 끝부분의 추가적인 잔기는 일반적으로는 천연 발생 가변 도메인 영역과 회합되지 않는 것들일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 이루어진 본 발명의 특이적 결합 구성원의 구축으로 클로닝 또는 기타 조작 단계를 용이하게 하도록 도입된 링커에 의해 코딩되는 N- 또는 C-말단 잔기의 도입이 초래될 수 있다. 기타 조작 단계는 본원의 다른 곳에서 개시된 가변 도메인을 항체 불변 영역이 포함되는 추가적인 단백질 서열, 다른 가변 도메인 (예를 들어, 디아바디를 생산하는 경우), 또는 본원의 다른 곳에서 더욱 상세하게 논의된 바와 같은 검출가능한/기능성 표지에 연결시키는 링커의 도입을 포함한다.
특이적 결합 구성원이 한 쌍의 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있지만, VH 또는 VL 도메인 서열 중 어느 하나를 기초로 하는 단일 결합 도메인도 본 발명에서 사용될 수 있다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인이 특이적 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 dAb에 관한 논의를 참조한다.
단일 결합 도메인 중 어느 하나의 경우, 이러한 도메인들은 A-FN 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 결합할 수 있는 2-도메인 결합 구성원을 형성할 수 있는 상보적인 도메인들을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이는 WO92/01047에 개시된 바와 같은 소위 계층적 이중 조합형 접근법을 사용하여 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해 달성될 수 있고, 이때 H 또는 L 사슬 클론을 함유하는 개별적인 콜로니를 사용하여 다른 사슬 (L 또는 H)을 코딩하는 클론들의 완전 라이브러리를 감염시키고, 생성된 2-사슬 결합 구성원을 파지 디스플레이 기술 예컨대 이러한 참조문헌에 기술된 것에 따라 선별한다. 이러한 기술이 문헌 [Marks 1992]에 또한 개시되어 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 항체 불변 영역 또는 이의 일부분, 예를 들어 인간 항체 불변 영역 또는 이의 일부분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인이 이의 C-말단 끝부분에서 인간 Cκ 또는 Cλ 사슬, 예를 들어 Cλ가 포함되는 항체 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인을 기초로 하는 특이적 결합 구성원이 이의 C-말단 끝부분에서 임의의 항체 아이소타입(isotype), 예를 들어 IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 임의의 아이소타입 서브클래스, 특히 IgG1 및 IgG4로부터 유래된 면역글로불린 중쇄 전체 또는 이의 일부분 (예를 들어 CH1 도메인)에 부착될 수 있다. 이러한 성질들이 있고 가변 영역을 안정화시키는 임의의 합성 또는 기타 불변 영역 변이체가 본 발명의 실시양태에서 또한 유용하다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원이 검출가능한 표지 또는 기능성 표지로 표지될 수 있다. 표지는 형광 물질, 방사성 표지, 효소, 화학발광 물질 또는 광민감제를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 신호를 생산하거나 또는 신호를 생산하도록 유도될 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 따라서, 형광 또는 발광, 방사능, 효소 활성 또는 흡광을 검출함으로써 결합을 검출 및/또는 측정할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 통상적인 화학을 사용하여 본 발명에서 사용하기 위한 항체에 검출가능한 표지가 부착될 수 있다.
표지가 외부 수단에 의해, 예를 들어, 육안 검사, 전자기 방사선, 열, 및 화학 시약에 의해서 검출가능한 신호를 생산할 수 있는 다수의 방법이 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 항체에 결합하는 또 다른 특이적 결합 구성원에 또는 지지체에 표지가 결합될 수도 있다.
표지된 특이적 결합 구성원, 예를 들어 검출가능한 표지로 표지된 scFv는 생체 내에서, 생체 외에서 또는 시험관 내에서 진단용으로, 및/또는 치료용으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 방사성 표지된 결합 구성원 (예를 들어 방사성 동위원소에 접합된 결합 구성원)이 방사선 진단법 및 방사선 요법에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 결합 구성원에 접합될 수 있는 방사성 동위원소는 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, 111In, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 123I, 124I, 125I, 131I, 18F, 211At 및 225Ac와 같은 동위원소를 포함한다. 바람직하게는, 양전자 방출제, 예컨대 18F 및 124I, 또는 감마 방출제, 예컨대 99mTc, 111In 및 123I가 진단 용도 (예를 들어 PET)에 사용되는 한편, 베타-방출제, 예컨대 131I, 90Y 및 177Lu가 치료 용도에 바람직하게 사용된다. 알파-방출제, 예컨대 211At 및 225Ac도 치료법에 사용될 수 있다.
예를 들어, 검출가능한 표지로 표지된 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원이 인간 또는 동물에서 IBD를 검출, 진단 또는 모니터링하는데 사용될 수 있다.
IBD 진단에서 사용하기 위한 진단 제품의 제작에서 본 발명의 특이적 결합 구성원이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 결합 구성원과 병변 내의 표적 세포 상에서 살생, 세포독성, 면역억제 또는 항염증 효과를 발휘하는 분자 및 이같은 병변 내에 존재하는 세포외 매트릭스 성분에 대해 지시된 항체 사이의 접합체 또는 융합체가 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 접합된 분자는 인터루킨-10일 수 있다. 이같은 접합체는 치료적으로, 예를 들어, 본원에서 언급된 바와 같이 IBD의 치료를 위해 사용될 수 있다.
특이적 결합 구성원과 살생 또는 세포독성 분자의 융합체 또는 접합체의 생산 및 용도가 예를 들어 WO01/62298에 기술되어 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 (i) 세포 상호작용에 의해 표적 세포 상에 항염증 효과를 발휘하는 분자, 항염증 분자, 사이토카인 예를 들어 IL-10 및 (ii) 피브로넥틴의 ED-A 아이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 특이적 결합 구성원의 접합체일 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 (i) 면역억제 또는 항염증 효과를 발휘하는 분자 및 (ii) 피브로넥틴의 ED-A 아이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 특이적 결합 구성원의 접합체일 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 바람직하게는 (i) 인터루킨-10 (IL10) 및 (ii) 피브로넥틴의 ED-A 아이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 특이적 결합 구성원의 접합체일 수 있다. 이같은 특이적 결합 구성원은 IBD의 치료에 관하여 본원에서 개시된 본 발명의 측면들에서 유용하다.
(i) 세포 상호작용에 의해 표적 세포 상에 살생 또는 세포독성 효과를 발휘하거나 또는 면역억제 또는 항염증 효과를 발휘하는 분자 및 (ii) 피브로넥틴의 ED-A 아이소형 및/또는 피브로넥틴의 ED-A에 대한 결합 구성원의 접합체가 본원에서 또한 기술된다. 바람직하게는 이같은 접합체는 살생, 세포독성, 면역억제 또는 항염증 분자 및 상기 결합 구성원을 포함하는 융합 단백질을 포함하거나, 또는 결합 구성원이 2쇄 또는 다중쇄인 경우에는, 살생, 세포독성, 면역억제 또는 항염증 분자 및 상기 결합 구성원 폴리펩티드 사슬 성분을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 바람직하게는 결합 구성원은 단일쇄 폴리펩티드, 예를 들어 단일쇄 항체 분자, 예컨대 scFv이다.
본원에서 언급된 바와 같은 접합체는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 따라서, 면역억제 또는 항염증 분자 및 단일쇄 Fv 항체 분자를 포함하는 융합 단백질이 본 발명에서 사용될 수 있다.
세포 상호작용에 의해 표적 세포 상에 자신의 효과를 발휘하는 면역억제 또는 항염증 분자는 표적 세포와 직접적으로 상호작용할 수 있거나, 표적 세포 상의 막-결합 수용체와 상호작용할 수 있거나, 또는 세포막의 전기화학 전위를 교란시킬 수 있다. 바람직하게는, 이러한 분자는 IL-10이다.
바람직하게는, 특이적 결합 구성원에 접합된 분자는 IL-10이다.
하기에 추가로 논의된 바와 같이, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 바람직하게는 항체 분자이거나 또는 항체 항원-결합 부위를 포함한다. 편리하게는, 특이적 결합 구성원은 단일쇄 폴리펩티드, 예컨대 단일쇄 항체일 수 있다. 이는 단일쇄 항체 및 예를 들어 면역억제 또는 항염증 분자 (예를 들어 인터루킨-10 또는 TGF 베타)를 포함하는 융합 단백질의 편리한 생산을 가능하게 한다. 예를 들어 완전 항체 또는 항체 단편 예컨대 Fab 또는 디아바디에서 별도의 폴리펩티드들 내의 항체 VH 도메인 및 항체 VL 도메인이 회합되는 것에 의해 항체 항원-결합 부위가 제공될 수 있다. 특이적 결합 구성원이 2쇄 또는 다중쇄 분자 (예를 들어 각각 Fab 또는 전체 항체)인 경우, 면역억제 또는 항염증 분자는, 예를 들어, 특이적 결합 구성원 내의 하나 이상의 폴리펩티드 사슬과의 융합 폴리펩티드로서 접합될 수 있다.
특이적 결합 구성원이 펩티드 결합에 의해 면역억제 또는 항염증 분자와 접합될 수 있고, 즉 상기 분자 및 특이적 결합 구성원 또는 이의 폴리펩티드 사슬 성분을 포함하는 융합 폴리펩티드 내에서 접합될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Trachsel et al.] 참조). 기타 접합 수단은 화학적 접합, 특히 2관능성 시약을 사용하는 가교 (예를 들어, 피어스(Pierce)의 더블-리에이전츠™ 가교 시약 선별 가이드(DOUBLE-REAGENTS™ Cross-linking Reagents Selection Guide)를 사용함)를 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원을 코딩하는 단리된 핵산이 또한 제공된다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 핵산은 상기 정의된 바와 같은 CDR 또는 CDR들의 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원-결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어 scFv 또는 IgG, 예를 들어 IgG1을 코딩할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 VH 및/또는 VL 도메인을 코딩할 수 있다.
하나 이상의 상기 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 구축물이 본원에서 추가로 기술된다.
하나 이상의 상기와 같은 구축물을 포함하는 재조합 숙주 세포가 또한 제공된다. 제공된 바와 같은 임의의 CDR 또는 CDR들의 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원-결합 부위 또는 항체 분자, 예를 들어 scFv 또는 IgG1 또는 IgG4를 코딩하는 핵산이 기술되고, 코딩 핵산으로부터의 발현을 포함하는, 코딩되 생성물의 생산 방법도 기술된다. 적합한 조건 하에 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 편리하게 발현이 달성될 수 있다. 발현에 의한 생산 후에, VH 또는 VL 도메인, 또는 특이적 결합 구성원을 임의의 적절한 기술을 사용하여 단리 및/또는 정제한 후에, 적합하게 사용할 수 있다.
핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고, 전체적으로 또는 부분적으로 합성일 수 있다. 문맥적으로 달리 요구되지 않는 한, 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 특정 서열의 DNA 분자를 포함하고, U가 T를 대체하는 특정 서열의 RNA 분자를 포함한다.
코딩 핵산으로부터 발현을 야기하는 것을 포함하는, 항체 VH 가변 도메인의 생산 방법이 또한 기술된다. 이같은 방법은 숙주 세포를 상기 항체 VH 가변 도메인의 생산을 위한 조건 하에 배양하는 것을 포함할 수 있다.
생산 방법은 생성물의 단리 및/또는 정제 단계를 포함할 수 있다. 생산 방법은 생성물을 하나 이상의 추가적인 성분, 예컨대 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물로 제형화하는 것을 포함할 수 있다.
다양한 상이한 숙주 세포에서의 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템이 주지되어 있다. 적절한 숙주 세포는 박테리아, 포유동물 세포, 식물 세포, 필라멘트형 진균, 효모 및 배큘로바이러스 시스템 및 트랜스제닉 식물 및 동물을 포함한다. 원핵생물 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현이 관련 기술분야에 잘 확립되어 있다. 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthun (1991), Bio/Technology 9: 545-551]을 참조한다. 통상적인 박테리아 숙주는 이.콜라이이다.
배양 중인 진핵생물 세포에서의 발현을 특이적 결합 구성원의 생산을 위한 선택권으로서 통상의 기술자가 또한 이용가능하다. 예를 들어 문헌 [Chadd et al. (2001), Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194]; [Andersen et al. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117]; [Larrick & Thomas (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418] 참조. 이종 폴리펩티드의 발현을 위한 관련 기술분야에서 이용가능한 포유동물 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 래트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 그외 다수를 포함한다.
프로모터 서열, 종결인자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적합한 기타 서열이 포함되는 적합한 조절 서열을 함유하는 적절한 벡터가 선택 또는 구축될 수 있다. 적합하다면, 벡터는 플라스미드, 예를 들어, 파지미드, 또는 바이러스, 예를 들어, 파지일 수 있다. 추가적인 상세사항에 대해서, 예를 들어, 문헌 [Sambrook & Russell (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press]를 참조한다. 예를 들어, 핵산 구축물의 제조, 돌연변이유발, 서열분석, 세포 내로의 DNA 도입 및 유전자 발현, 및 단백질 분석에서, 핵산을 조작하기 위한 다수의 공지된 기술 및 프로토콜이 문헌 [Ausubel et al. (1999) 4th eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons]에 상세하게 기술되어 있다.
숙주 세포는 본원에 기술된 바와 같은 핵산을 함유할 수 있다. 이같은 숙주 세포는 시험관 내에 있을 수 있거나 또는 배양물 내에 있을 수 있다. 이같은 숙주 세포는 생체 내에 있을 수 있다. 숙주 세포가 생체 내에 존재하는 것은 본 발명에서 사용하기 위한 결합 구성원이 "인트라바디(intrabody)" 또는 세포내 항체로서 세포 내에서 발현되게 할 수 있다. 인트라바디는 유전자 요법에서 사용될 수 있다.
본원에 개시된 핵산을 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하는 방법이 또한 기술된다. 이러한 도입은 임의의 이용가능한 기술을 이용할 수 있다. 진핵생물 세포의 경우, 적절한 기술은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포솜-매개 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 기타 바이러스, 예를 들어, 우두, 또는 곤충 세포의 경우의 배큘로바이러스를 사용하는 형질도입을 포함할 수 있다. 숙주 세포, 특히 진핵생물 세포에 핵산을 도입하는 것은 바이러스 또는 플라스미드를 기초로 하는 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피솜으로 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포 내로 또는 인공 염색체 내로 혼입될 수 있다. 단일 또는 다중 유전자좌에서의 하나 이상의 사본의 무작위 또는 표적화 삽입에 의해 혼입될 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적절한 기술은 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용하는 형질감염을 포함할 수 있다.
도입에 이어서, 핵산으로부터의 발현을 야기하거나 허용할 수 있고, 예를 들어, 숙주 세포를 유전자 발현을 위한 조건 하에 배양할 수 있다. 발현된 생성물의 정제가 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다.
숙주 세포의 게놈 (예를 들어 염색체) 내로 핵산이 통합될 수 있다. 표준 방법에 따라, 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함하는 것에 의해 통합이 촉진될 수 있다.
상기와 같은 특이적 결합 구성원 또는 폴리펩티드를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 상기 언급된 바와 같은 구축물을 사용하는 것을 포함하는 방법이 또한 기술된다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 인간 또는 동물 대상체, 예를 들어 인간에서의 진단 또는 치료 방법에서 사용되도록 디자인된다. 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 IBD의 진단 또는 치료에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 기술된 바와 같은 특이적 결합 구성원의 투여를 포함하는 치료 방법, 이같은 특이적 결합 구성원을 포함하는 제약 조성물, 및 투여용 약제의 제작, 예를 들어 특이적 결합 구성원을 제약상 허용되는 부형제와 함께 제형화하는 것을 포함하는 약제 또는 제약 조성물의 제조 방법에서의 이같은 특이적 결합 구성원의 용도를 제공한다. 제약상 허용되는 비히클이 주지되어 있고, 선택된 활성 화합물(들)의 성질 및 투여 방식에 따라 통상의 기술자에 의해 개조될 것이다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 일반적으로 제약 조성물의 형태로 투여될 것이고, 이는 특이적 결합 구성원에 더하여 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기술되고 본 발명에 따라 사용하기 위한 제약 조성물은, 활성 성분에 더하여, 제약상 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 통상의 기술자에게 주지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 이같은 물질은 비-독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 성질은 투여 경로에 좌우될 것이고, 이는 경구, 흡입 또는 주사, 예를 들어, 정맥내 주사일 수 있다.
경구투여용 제약 조성물, 예를 들어 나노바디(nanobody) 등이 본 발명에서 또한 구상된다. 이같은 경구 제형은 정제, 캡슐, 분말, 액체 또는 반고체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체 예컨대 젤라틴 또는 아주반트를 포함할 수 있다. 액체 제약 조성물은 일반적으로 액체 담체 예컨대 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리식염수 용액, 덱스트로스 또는 기타 당류 용액 또는 글리콜 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내 주사 또는 고통 부위에서의 주사의 경우, 활성 성분은 발열원이 없고 pH, 등장성 및 안정성이 적절한 비경구용으로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. 예를 들어 등장성 비히클 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락테이트화 링커 주사를 사용하여 통상의 기술자는 적절한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요하다면 방부제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 사용될 수 있다. 제약 제형의 제조를 위한 다수의 방법이 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
치료될 병태에 따라, 조성물은 단독으로 또는 다른 치료와 함께 동반적으로 또는 순차적으로 또는 또 다른 치료제 또는 치료제들과의 조합 제제로서 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원은 추가적인 의학 성분과 함께 조합 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 유의한 상승작용성 효과를 제공하기 위해 조합 치료, 특히 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원과 하나 이상의 다른 약물의 조합물이 사용될 수 있다. 본원에 열거된 병태들 중 하나 이상의 치료를 위해, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원이 또 다른 치료제 또는 치료제들과 동반적으로 또는 순차적으로 또는 또 다른 치료제 또는 치료제들과의 조합 제제로서 투여될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원이 IBD 치료를 위한 기존의 치료제와 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원 및 상기의 추가적인 의학 성분들 중 하나 이상이 약제의 제작에서 사용될 수 있다. 이러한 약제는 개체에게 별도로 또는 조합하여 투여하기 위한 것일 수 있고, 따라서 특이적 결합 구성원 및 추가적인 성분을 조합 제제로서 또는 별도의 제제들로서 포함할 수 있다. 별도의 제제들은 분리된 순차적 또는 동시 투여를 용이하게 하는데 사용될 수 있고, 상이한 경로 예를 들어 경구 및 비경구 투여에 의한 성분들의 투여를 허용한다.
본 발명에 따라, 제공된 조성물이 포유동물에게 투여될 수 있다. 투여는 환자에게 이익을 나타내는데 충분한 "치료적 유효량"일 수 있다. 이같은 이익은 하나 이상의 증상을 적어도 호전시키는 것일 수 있다. 따라서, "IBD 치료"는 하나 이상의 증상의 호전을 지칭한다. 실제 투여되는 양, 투여 속도 및 투여 과정은 치료되는 대상의 성질 및 중증도, 치료되는 특정 포유동물, 개별적인 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 조성물의 전달 부위, 특이적 결합 구성원의 유형, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료인에게 공지된 기타 요인에 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투여량 등의 결정은 일반 개업의 및 기타 의사의 책임이고, 증상의 중증도 및/또는 치료되는 질환의 진행에 좌우될 수 있다. 항체의 적합한 용량은 관련 기술분야에 주지되어 있다 (문헌 [Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664]; 및 [Bagshawe et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922]). 본원에서 또는 문헌 [Physician's Desk Reference (2003)]에서 투여되는 약제의 유형에 적합한 것으로 지시된 특정 투여량을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 특이적 결합 구성원의 치료적 유효량 또는 적절한 용량은 이의 시험관내 활성 및 생체내 활성을 동물 모델에서 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 기타 테스트 동물에서의 효과적인 투여량을 인간에게 외삽하는 방법이 공지되어 있다. 정확한 용량은 항체가 진단용인지, 예방용인지 또는 치료용인지 여부, 치료될 면적의 크기 및 위치, 항체의 정확한 성질 (예를 들어 전체 항체, 단편 또는 디아바디), 및 항체에 부착된 임의의 검출가능한 표지 또는 기타 분자의 성질이 포함되는 다수의 요인에 좌우될 것이다. 전형적인 항체 용량은 전신 투여의 경우 100 ㎍ 내지 1 g, 국소 투여의 경우 1 ㎍ 내지 1 ㎎의 범위일 것이다. 초기의 더 높은 로딩 용량에 이어지는 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 항체는 전체 항체, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4 아이소타입일 수 있다. 이는 성인 환자의 1회 치료를 위한 용량이며, 이러한 용량은 아동 및 유아에 대해 비례적으로 조정될 수 있고, 다른 항체 양식에 대해서도 분자량에 비례하여 조정될 수 있다. 치료는 의사의 재량으로 매일, 일주일에 2번, 매주 또는 매달 간격으로 반복될 수 있다. 치료는 피하 투여의 경우는 2주 내지 4주마다일 수 있고, 정맥내 투여의 경우는 4주 내지 8주마다일 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 치료는 주기적이고, 투여들 사이의 기간은 약 2주 이상, 예를 들어, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 또는 한달에 약 1회이다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 치료가 수술 전 및/또는 수술 후에 제공될 수 있고, 해부학적인 수술 치료 부위에 직접적으로 투여 또는 적용될 수 있다.
염증성 장 질환 ( IBD )
염증성 장 질환은 결장 및 소장에 영향을 미치는 일군의 염증성 병태이다. IBD의 주요 유형은 크론병 (CD) 및 궤양성 결장염 (UC)인 한편, IBD의 기타 유형은 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병 및 불확정 대장염을 포함한다. CD는 위장관의 임의의 부분에 영향을 미칠 수 있는 반면, UC는 전형적으로 결장 및 직장에 한정된다.
본원에서 언급된 바와 같은 IBD는 CD, UC, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병 또는 불확정 대장염일 수 있다. 특히, 본원에서 사용된 바와 같은 CD, UC, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병 및 불확정 대장염이라는 용어들은 각각 활성 CD, 활성 UC, 활성 콜라겐성 결장염, 활성 림프구성 결장염, 활성 허혈성 결장염, 활성 전환 결장염, 활성 베체트병 및 활성 불확정 대장염을 지칭할 수 있다. 한 실시양태에서, IBD는 CD 또는 UC일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, IBD는 CD, 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트병 또는 불확정 대장염일 수 있다. 추가적인 실시양태에서, IBD는 UC가 아니다. IBD는 결장 및 직장에서의 염증에 전형적으로 한정되지 않는 IBD, 예컨대 CD일 수 있다. IBD는 결장의 내층에만 영향을 미치지 않는 IBD일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, IBD는 CD이다. 가장 바람직하게는, IBD는 활성 CD이다.
하기의 실험적 예시를 포함하는 본 개시내용을 고려하여 본 발명의 추가적인 측면 및 실시양태가 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
이러한 명세서에서 언급된 모든 문헌은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용된 경우의 "및/또는"은 2개의 특정 특색 또는 성분 각각을 함께 또는 따로따로 구체적으로 개시하는 것으로서 이해되어야 한다. 예를 들어 "A 및/또는 B"는 (i) A, (ii) B 및 (iii) A 및 B 각각을 이들 각각이 본원에서 개별적으로 기재된 것처럼 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다.
문맥적으로 달리 지시되지 않는 한, 상기 기술된 특색들의 설명 및 정의는 본 발명의 임의의 특정 측면 또는 실시양태에 한정되지 않고, 기술된 모든 측면 및 실시양태에 동등하게 적용된다.
이제 본 발명의 특정 측면 및 실시양태가 예로써, 그리고 상기 기술된 도면을 참조로 설명될 것이다.
실험
물질 및 방법
마우스 IBD 모델
DSS 투여를 수반하는 IBD용 마우스 모델이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 적절한 마우스 모델이, 예를 들어, 문헌 [Okayasu et al. (1990), Gastroenterology, 98, 694-702]에 또한 기술되어 있다.
본원에 기술된 실험을 위해, 3％ 덱스트란 소듐 술페이트 (DSS) (MP 바이오메디컬즈(MP BioMedicals))를 7일 동안 식수에 포함시킨 후 3-5일 동안 일반 식수를 제공함으로써 C57BL/6 마우스 (잭슨 래버러토리즈(Jackson Laboratories), 메인주 바 하버)에서 결장염을 유도하였다. 대조군 마우스에게는 연구 과정 전반에 걸쳐 표준 물을 제공하였다. 마우스를 제3일-제5일의 잠혈검사에 의해, 뿐만 아니라 일일 체중 변화에 의해 증명되는 바와 같은 질환 유도/진행에 대해 모니터링하였다. 물에 DSS를 포함시키는 것을 중단하고 나서 3-5일 후의 다양한 시점에 마우스를 안락사시켜, F8-IL-10의 표적화, 국소화 및 약리학적 효과를 평가하였다.
125 I-F8/IL10 방사성 요오드화, 정제, 특성화 및 투약 용액 제조
숙신이미딜-요오도벤조에이트 (SIB)를 사용하여 125I-F8/IL10을 제조하였다 (Zalutsky & Narula (1988) Cancer Research, 48,1446-1450; Zalutsky & Narula (1987) Appl. Radiat. Isot. 38, 1051-1055; Cheng, et al. (2002) J. Med. Chem. 45, 3048-3056). 간략하게, 분취량의 요오드-125 (20 ㎕ ~2.0 mCi) (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 매사추세츠주 월섬)를 1.5％ 아세트산 (v:v)을 함유하는 50 ㎕의 메탄올 (양쪽 모두 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스) 내의 산화제로서의 10 ㎍ NCS (시그마-알드리치)와 함께 2.5 ㎍ N-숙신이미딜-3-(트리-n-부틸스타닐) 벤조에이트 (C23H35NO4Sn; MW = 508.23, 텍사스주 칼리지 스테이션의 텍사스 바이오케미컬즈, 인크.(Texas Biochemicals, Inc.)에 의해 합성됨)와 반응시켰다. 주위 온도에서의 15분 인큐베이션 후, 10 ㎍ 황산수소나트륨 (환원제) (시그마-알드리치)을 첨가하고 주위 온도에서 추가로 5분 동안 인큐베이션함으로써, 반응 용액 내의 잔여 산화제를 켄칭시켰다. 주위 온도에서 20분 동안 pH 8.0에서 인큐베이션함으로써, 125I-표지 SIB를 F8-IL10 항체 (~ 0.2 ㎎, 중간체 대 항체에 대해 약 2.5:1의 출발 몰비)에 접합시켰다. 방사성 표지된 생성물 (125I-F8/IL10)을 예비-밸런싱(pre-balancing)된 PD-10 칼럼 (GE 헬스케어(GE Healthcare), 영국 버킹엄셔 리틀 챌폰트) (칼럼 상의 잠재적인 비-특이적 단백질 결합 부위가 소 혈청 알부민을 사용하여 포화된 후, 칼럼을 적어도 3 칼럼 부피의 PBS로 헹굼)을 사용하여 정제하고, PBS 내에 용출시켰다. 약 30％의 방사화학 수율이 수득되었다.
125I-F8/IL10의 방사화학 순도 (RCP) 및 생체활성을 각각 크기 배제 크로마토그램 (SEC), 및 EDA-친화력 칼럼으로 특성화하였다. SEC 분석을 위해, 약 1 μCi의 125I-F8/IL10 생성물 용액을 크기 배제 칼럼 (G3000SWxl, 토소 바이오사이언시즈(TOSOH Biosciences), 일본 도쿄)이 장착된 HPLC (인-라인(in-line) 방사성 검출기가 장착된 애질런트(Agilent) 1100) 내로 주입하고, 25 mM 포스페이트 완충제, 0.15 M NaCl, pH 6.8의 이동 용매로 1 ㎖/분의 유속으로 용출시켰다. 125I-F8/IL10의 신원을 방사선계측 크로마토그램에서의 이의 체류 시간을 UV (280 nm) 크로마토그램에서의 기준물질 F8/IL10의 것에 비교함으로써 확인하였다. 99％를 초과하는 RCP가 125I-F8/IL10에 대해 수득되었고, 이때 방사성 비활성은 약 4.5 mCi/mg였다.
125I-F8-IL10의 생체활성을 EDA 친화력 칼럼 검정법으로 결정하였다. 간략하게, 분취량 (약 1 μCi)의 125I-F8/IL10을 예비-밸런싱된 EDA 친화력 칼럼 (250 ㎕의 EDA 수지를 함유하고, 예비-밸런싱은 비-특이적 결합 부위를 PBS 내의 2 ㎎/㎖의 BSA 2 ㎖로 차단한 후, 칼럼을 8 ㎖ PBS로 세정함으로서 수행되었다) 상에 로딩하였다. 친화력 칼럼을 6 ㎖의 BSA (PBS 내의 2 ㎎/㎖)로 세정하고, 용출액을 분획별로 수집하였다. 수집된 용출액 및 친화력 칼럼 상의 잔류물의 방사능을 감마 계수기에서 측정하였다. 로딩된 총 방사능 중 EDA-수지 칼럼에 잔류한 방사능의 백분율을 계산하였다. 64％의 친화력 칼럼 상에 잔류한 방사능의 백분율이 125I-F8/IL10에 대해 수득되었다.
125I-F8/IL10을 미표지 F8/IL10 (F8/IL10 모액), 및 필요한 최종 농도까지의 제형 완충제와 혼합함으로써 PK 및 조직 분포 연구에 사용된 투약 용액을 제조하였다. 투약일에 테스트 물품 용액을 제조하였고, 동물에게 투여하기 전에 주위 온도가 되게 하였다.
IBD 마우스 모델에서의 125 I-F8/IL10 생체분포 및 결장으로의 국소화
미처리 또는 DSS-처리 마우스 양쪽 모두를 투약하기 약 2-4일 전 (DSS 시작 후 제5일-제7일)에 요오드화칼슘 (KI) 물 (20 mM)로 처리하여, 생체 내에서 생성된 임의의 잠재적인 미결합 유리 I-125의 갑상선 흡수를 차단하였다. DSS 처리 시작 후 제9일에, 단일 용량의 125I-F8/IL10을 정맥내 (IV) 투여하였다. 군 당 용량 및 방사능이 하기에 요약된다:
i) 0군 - 마우스 당 대략적인 용량: 5 ㎎/㎏
0군 - 마우스 당 대략적인 방사능: 7.5 μCi (비활성 75 uCi/㎎).
ii) 1군 - 마우스 당 대략적인 용량: 5 ㎎/㎏
1군 - 마우스 당 대략적인 방사능: 10 μCi (비활성 100 uCi/㎎).
iii) 2군 - 마우스 당 대략적인 용량: 0.15 ㎎/㎏
2군 - 마우스 당 대략적인 방사능: 12 μCi (비활성 4490 uCi/㎎).
하위군의 마우스들에서 5분, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간, 48시간 및 96시간에 혈액을 채취한 후, 다양한 조직을 수집하였다. 혈청 분리기 수집관 내로의 심장 천자 또는 안와 후방 채혈에 의해 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 샘플을 10,000 g에서 5분 동안 원심분리함으로써 혈청 샘플을 수확하였다. 조직 수집을 위해, 혈액 샘플 채취 및 전신 관류 직후에 동물을 희생시키고 관심 조직을 수집하였다. 약 20 ㎖의 헤파린-PBS (25 유닛/㎖)를 약 10분 동안 투여함으로써 전신 혈액 관류를 수행하였다. 관심 조직은 뇌, 장간막 림프절, 피부, 지방, 넓적다리 골격근, 폐, 심장, 지라, 간, 위, 소장, 대장 및 신장을 포함하였고, 이를 수집하고 칭량하였다. GI 내의 내용물을 제거하였다. 감마 계수기에 의해 조직 샘플의 방사능 (cpm 단위의 총량)을 직접적으로 측정하였다.
이환 마우스 및 건강한 마우스의 결장 자가조직방사선촬영술
0군 및 2군 마우스로부터의 결장에서 결장 자가조직방사선촬영술을 수행하였다. 결장을 수확하고, 이의 내용물을 제거하고, 조직을 인-영상화 스크린 (몰레큘러 다이나믹스)에 24시간 동안 노출시키고, 스톰 860을 통해 영상화하였다. 결과가 도 2에서 제시된다. 레인-1: 0군 (건강한 마우스)으로부터의 주사 6시간 후에 수확된 결장; 레인-2: 2군 (DSS 처리 마우스)으로부터의 주사 6시간 후에 수확된 결장; 레인-3: 군0 (건강한 마우스)으로부터의 주사 24시간 후에 수확된 결장; 레인-4: 2군 (DSS 처리 마우스)으로부터의 주사 24시간 후에 수확된 결장. 125I-F8/IL10의 고르지 않은 국소화가 DSS 처리 마우스의 결장을 따라 관찰되었고, 정상 마우스에서는 관찰되지 않았으며, 이는 이러한 모델에서의 불규칙한 결장 염증 및 연관된 표적 EDA의 발현 프로파일과 일관된다.
혈청 및 조직에서의 방사성 등가 농도의 결정 및 약동학 계산
측정된 TCA (트리클로로아세트산) 침전성 (단백질 회합) 방사능을 기초로 125I-F8/IL10의 혈청 등가 농도 (ng eq./g)을 추정하였다. TCA 침전을 위해, 분취량 (50 ㎕)의 혈청 샘플을 50 ㎕의 마우스 혈청과 혼합한 후, 100 ㎕의 20％ TCA 용액을 첨가하였다. 샘플 혼합물을 10,000 g에서 5분 동안 회전시켜 단백질을 침전시켰다. 상청액 내의 TCA-가용성 방사능 및 총 방사능을 결정하였다. 소정의 샘플 내의 TCA-침전성 방사능 (cpm), 투약 용액의 비활성 (단백질 1 ㎎ 당 TCA-침전성 cpm), 뿐만 아니라 샘플 측정일 (tS) 및 투약 용액 측정일 (tD)을 사용하여, 소정의 샘플 내의 테스트 물품의 등가 농도 (ng eq./mL)를 하기의 식을 사용하여 계산하였다: [TCA-침전성 cpm/EXP(-0.693/60.2×(tS-td))]/[비활성 (cpm/㎎ 단위)×샘플 부피 (㎖ 단위)].
하기 식을 사용하여, 125I의 물리적 붕괴 반감기에 대한 보정 후에, 샘플 내의 측정된 총 방사능 및 투약 용액의 비활성을 기초로 조직 내의 125I-F8/IL10의 등가 농도 (ng eq./g)의 정량을 계산하였다: [샘플 cpm/EXP(-0.693/60.2×(tS-tD))]/[비활성 (cpm/㎎ 단위)×샘플 중량 (㎎ 단위)]. 조직 샘플에 대해 균질화 또는 TCA-침전을 수행하지 않았다. 방사성 등가 농도 (혈청의 경우 ng eq./㎖, 조직의 경우 ne eq./g)에 더하여, 그램 당 주사된 용량의 백분율 (％ID/g) 및/또는 주사된 용량의 백분율 (％ID)을 혈청 및 관심 조직에 대해 또한 계산하였다.
정상 마우스 (0군) 및 DSS 처리 마우스 (1군)에서의 125I-F8/IL10의 생체 분포를 주사 6시간 후 (도 3A), 24시간 후 (도 3B) 및 96시간 후 (도 3C)에 결정하였다.
측정된 시점의 평균 혈청 또는 조직 농도로 PK 파라미터를 계산하였다. 약동학 소프트웨어 패키지 WinNonlin (5.1 버전, 파사이트(Pharsight))의 비-구획 분석 모듈을 사용하였다. 농도 대 시간 곡선의 곡선하 면적 (AUC)을 선형 사다리꼴 방법을 사용하여 계산하였다.
IBD의 마우스 모델에서의 F8-IL10의 치료적 처리의 혈청 사이토카인 수준에 대한 효과
IL-10은 염증유발성 사이토카인을 감소시키는 것으로 공지되어 있기 때문에, 본 발명자들은 IBD의 마우스 모델에서의 F8-IL10 투여가 이러한 모델에서의 혈청 사이토카인 응답에 영향을 미칠 것인지 여부를 테스트하였다. 200 ㎍/마우스의 F8-IL10, 또는 대조군인 소형 면역 단백질 (F8-SIP)을 DSS 처리 시작 후 제3일, 제6일 및 제9일에 마우스에 정맥내 투여하였다 (n=마우스 10 마리/군). 이러한 용량 체계는 콜라겐 유도 관절염 모델에서의 효과적인 체계와 동일하였다 (Schwager K, et al. Arthritis Research and Therapy, (2009) 11: R142). 대조군은 비-이환 마우스 (일반적인 물) 및 미처리 이환 마우스를 포함하였다 (n=마우스 10 마리/군). DSS 시작 후 제 10일에, 국소화 연구를 위해 상기 기술된 바와 같이 혈액을 수집하고 혈청을 수득하였다. MSD 기술 플랫폼 및 마우스 7plex MSD 키트를 사용하여 제조사의 설명서 (메조스케일 디스커버리(Mesoscale Discovery), 메릴랜드주 게이더스버그)에 따라 IL-1b, IL-12p40, IFNg, IL-6, KC, IL-10 및 TNFa의 수준에 대해 혈청을 평가하였다. 도 4 및 5에서 혈청 1 ㎖ 당 단백질 pg으로서 사이토카인 수준이 표현된다.
EDA 발현에 대한 인간 조직 염색
궤양성 결장염에 걸린 60세 여성 환자 및 크론병에 걸린 42세 남성 환자의 결장 조직의 동결된 OCT-매립 시험편의 면역조직화학 분석. 양쪽 시험편에 SIP 양식의 F8 항체 및 폰 빌레브란트 인자를 프로빙하였다.
또한, 동일한 크론병 또는 궤양성 결장염 환자로부터의 쌍을 이룬 병에 걸린 동결 생검 시험편 및 병에 걸리지 않은 동결 생검 시험편 (n=3명의 크론병 환자 및 n=5명의 UC 환자)을 어낼리티컬 바이올로지컬 서비시즈(Analytical Biological Services) (델라웨어주 윌밍턴)로부터 수득하였다. 동결 샘플을 드라이 아이스 상에 배향시켜 해동을 방지하고, O.C.T. 화합물 (티슈-텍(Tissue-Tek) #4583)이 충전된 크라이오몰드(Cryomold), 스탠다드 (티슈-텍 4557) 내에 매립하고, 드라이 아이스에 의해 냉각된 이소펜탄에서 급속 동결시켰다. 조직 블록을 라이카(Leica) CM1850 냉동미세절단기 상에서 4 마이크로미터로 절단하고, 유리 슬라이드 상에 놓고, 면역조직화학 (IHC)을 수행할 때까지 -80℃에서 보관하였다. IHC을 시작할 때, 조직을 저온 (-20 F) 메탄올 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) A412P-4)에 침지시켜 보관으로 형성될 수 있는 모든 수분을 제거하고, 20분 동안 실온에서 공기 건조시켰다. 그 후, 조직을 저온 (-20 F) 아세톤 (ACROS CAS # 67-64-1)에 10분 동안 침지시키고, 10분 동안 실온에서 공기 건조시켰다.
조직 슬라이드를 적합한 벤타나(Ventana) 바 코드로 표지하고, 피브로넥틴 F8 SIP 또는 KSF SIP (대조군 항체) IHC를 위해 벤타나 디스커버리 XT(Ventana Discovery XT) 내에 놓았다. 20분 동안의 벤타나 S 블록(Ventana S Block) (벤타나 760-4212) 내의 5％ 정상 마우스 혈청 (잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research) 015-000-120), 및 8분 동안의 벤타나 비오틴 블록킹(Ventana Biotin Blocking) 키트 (벤타나 760-050) 양쪽 모두로 내인성 비오틴을 차단하였다. 피브로넥틴 F8SIP 또는 KSF를 다코(Dako) 항체 희석제 (S0908) (다코 노스 아메리카(Dako North America), 캘리포니아주 카핀테리아)로 1:200 농도 (100 ul/슬라이드)로 희석하고, 40분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 헤마톡실린 및 청색화 시약으로 대비염색한 후 (각각 4분), 러닝을 완료하였다. 슬라이드를 제거하고, 후속 탈수 및 커버슬리핑(coverslipping)을 위해 벤타나 심포니(Ventana Symphony) 내에 놓았다. 대표적인 IHC 영상이 도 7에서 제시된다. 궤양성 결장염 환자 UH0501-34 (위쪽) 및 크론병 환자 UH0405-09 (아래쪽)로부터의 병에 걸리지 않은 조직 샘플 (왼쪽) 및 병에 걸린 조직 샘플 (오른쪽)로부터의 IHC.
결과
결장 자가조직방사선촬영술
도 2는 방사선 표지 F8-IL10을 투여하고 나서 6시간 후 (레인 1 및 2) 또는 24시간 후 (레인 3 및 4)의 비-이환 마우스 (물) (레인 1 및 3) 또는 이환 마우스 (DSS-처리) (레인 2 및 4)의 결장의 자가조직방사선촬영술을 나타낸다. 이는 정상 결장보다는 염증 결장에서 F8-IL10이 축적된다는 것을 실연한다. F8-IL10의 이환 결장 국소화의 고르지 않은 출현은 이러한 모델에서 결장 길이를 따라 관찰된 다양한 수준의 염증 및 EDA 발현과 일관되고, 염증으로의 F8-IL10의 국소화를 추가로 지지한다.
이환 마우스 및 건강한 마우스에서의 125 I-F8-IL10의 생체 분포
도 3은 정상 마우스 (물)와 비교하여 이환 마우스 (DSS)에서의 결장 및 장간막 림프절 (L.N.)에서의 6시간, 24시간 및 96시간 시점의 125I-F8-IL10의 축적을 나타낸다. 도 2와 유사하게, 이러한 데이터는 DSS-처리 마우스에서 F8-IL10이 결장 및 연관된 림프절에 표적화되는 것을 실연한다. 또한 이러한 연구들로부터, 혈청 반감기가 약 3.5시간인 것으로 결정된 반면, 결장에서의 F8-IL10의 반감기는 약 35시간이었다; 약 10배의 증가는 강화된 조직 지속성을 시사한다. 이는 F8-IL10이 결장성 염증 동안 결장 및 장간막 림프절을 표적화할 뿐만 아니라, 일단 도달하면, 혈행에서보다 더 긴 기간 동안 지속된다는 것을 가리킨다. 총괄적으로, 이러한 데이터는 결장에서의 염증 병태 하에, 예컨대 인간에서의 크론병 및 궤양성 결장염에서, F8-IL10이 이러한 부위들을 우선적으로 표적화하고 이러한 부위들에서 지속될 것임을 시사한다.
이환 마우스 및 건강한 마우스로부터의 혈청 내의 사이토카인 수준
도 4는 대조군에 비교하여, 치료 양식의 F8-IL10의 투여가 염증성 사이토카인 IL-1β, IL12p40, IFNγ 및 IL-6의 혈청 수준의 유의한 감소를 초래한다는 것을 나타낸다.
도 5는 대조군과 비교하여, 치료 양식의 F8-IL10의 투여가 TNF-알파 및 각질세포-유래 케모카인 (KC)의 증가를 초래하지 않고, IL-10의 수준 증가를 초래한다는 것을 나타낸다. DSS 모델에서의 도 4의 이러한 사이토카인들의 수준 증가는 결장에서의 질환 유도와 연관된다. 도 4의 이러한 염증성 사이토카인들의 감소 및 IL-10의 증가는 IL-10의 공지된 생물학적 효과와 일관된다 (Abbas A, Lichtman A, Pober J., 1994, Cellular and Molecular Immunology. 2nd Ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company; Delves P, Roitt I (eds), 1998, Encyclopedia of Immunology, 2nd Ed. San Diego: Academic Press). 따라서, 염증과 연관된 사이토카인 및 IBD 환경에서의 병리학을 감소시킴으로서 F8-IL10은 이러한 IBD 모델에서 약리학적 활성을 나타낸다. 이러한 염증유발성 사이토카인들이 IBD 환자에서 상향조절되는 것으로 공지되어 있기 때문에, F8-IL10 투여를 통한 이러한 사이토카인들의 하향조절은 F8-IL10이 생체 내에서 IBD를 치료하는데 이로울 것임을 시사한다. 특히, 인터페론 γ 및 IL-12p70이 CD 환자에서 상향조절되는 것으로 공지되어 있고, 본원에 개시된 데이터는 F8-IL10 투여가 따라서 생체 내에서 CD를 치료하는데 특히 유용할 것임을 시사한다.
면역조직화학
도 6은 F8 SIP 항체가 궤양성 결장염에 걸린 환자에서 새롭게 형성된 혈관을 염색하지만 정상 혈관은 염색하지 않는다는 것을 나타낸다. (폰 빌레브란트 인자는 정상 혈관구조의 마커로서 일상적으로 사용된다.)
도 7은 EDA에 대한 면역조직화학으로 염색된 쌍을 이룬 크론병 또는 UC 생검 샘플의 대표 영상을 나타낸다. 화살표는 각각의 영상 내의 혈관을 가리킨다. 동일한 환자로부터의 병에 걸리지 않은 샘플에 비교하여 병에 걸린 혈관에서의 혈관 주변의 염색 강도가 증가된다. 이는 증가된 EDA 발현이 이러한 인간 질환 환경에서의 결장의 염증 면적으로의 증가된 표적화를 초래할 수 있었다는 것을 시사한다. 요약하면, 뮤린 IBD 모델에서 F8-IL10으로 관찰된 결장 표적화 분포 및 혈청 사이토카인 감소, 뿐만 아니라 인간의 병에 걸린 크론병 및 궤양성 결장염 결장 조직 내의 혈관 주변에서의 EDA 발현 증가는 F8-IL10 투여가 IBD를 표적화할 수 있고 IBD 환자에 양성적으로 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사하는 증거를 총괄적으로 제공한다.
출원에 개시된 서열
Figure 112015040004873-pct00001
Figure 112015040004873-pct00002
SEQUENCE LISTING <110> Neri, Giovanni Schwager, Kathrin Ruzek, Melanie O'Hara, Denise Chen, Jianqing <120> Antigens Associated with Inflammatory Bowel Disease <130> 5026-P05632WO01 <140> PCT/US12/58574 <141> 2012-10-03 <150> PCT/US2012/058574 <151> 2012-10-03 <160> 13 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8 antibody VH domain CDR1 <400> 1 Leu Phe Thr 1 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8 antibody VH domain CDR2 <400> 2 Ser Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8 antibody VH domain CDR3 <400> 3 Ser Thr His Leu Tyr Leu 1 5 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8 antibody VL domain CDR1 <400> 4 Met Pro Phe 1 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8 antibody VL domain CDR2 <400> 5 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8 antibody VL 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Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 12 <211> 231 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr 115 120 125 Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr 145 150 155 160 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser 165 170 175 Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln 210 215 220 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 <210> 13 <211> 406 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F8-IL10 <400> 13 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe 20 25 30 Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr 115 120 125 Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr 145 150 155 160 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser 165 170 175 Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln 210 215 220 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser 225 230 235 240 Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn 245 250 255 Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu 260 265 270 Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln 275 280 285 Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly 290 295 300 Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu 305 310 315 320 Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His 325 330 335 Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg 340 345 350 Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu 355 360 365 Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys 370 375 380 Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met 385 390 395 400 Thr Met Lys Ile Arg Asn 405

Claims (30)

  1. 항체 접합체를 포함하는, 염증성 장 질환 (IBD)을 치료하기 위한 제약 조성물이며,
    항체 접합체는 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A (ED-A)에 결합하고 인터루킨-10 (IL-10)에 접합된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하며,
    상기 항체는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고,
    VH 도메인은 서열 7에서 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하고,
    VL 도메인은 서열 8에서 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    제약 조성물.
  2. 항체 접합체를 포함하는, 환자에서의 염증성 장 질환 (IBD)의 부위로 인터루킨-10 (IL-10)을 전달하기 위한 제약 조성물이며,
    항체 접합체는 피브로넥틴의 엑스트라 도메인-A (ED-A)에 결합하고 인터루킨-10 (IL-10)에 접합된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하며,
    상기 항체는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고,
    VH 도메인은 서열 7에서 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하고,
    VL 도메인은 서열 8에서 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    제약 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    VH 도메인이 인간 DP47 유전자로부터의 프레임워크를 포함하고/거나,
    VL 도메인이 인간 DPK22 유전자로부터의 프레임워크를 포함하는 것인
    제약 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    VH 도메인이 인간 DP47 유전자로부터의 프레임워크를 포함하고/거나,
    VL 도메인이 인간 DPK22 유전자로부터의 프레임워크를 포함하는 것인
    제약 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    VH 도메인이 서열 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    VL 도메인이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    제약 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    VH 도메인이 서열 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    VL 도메인이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    제약 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    VH 도메인이 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고,
    VL 도메인이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    제약 조성물.
  8. 제2항에 있어서,
    VH 도메인이 서열 7의 아미노산 서열을 포함하고,
    VL 도메인이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    제약 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인터루킨-10 (IL-10)이 인간 인터루킨-10 (IL-10)인 제약 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 링커를 통해 상기 인터루킨-10 (IL-10)에 접합된 것인 제약 조성물.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 접합체가 단일 쇄 Fv (scFv)를 포함하며, 여기서 scFv에서의 VH 도메인 및 VL 도메인이 펩티드 링커를 통해 서로 접합된 것인 제약 조성물.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 접합체가 디아바디를 포함하며, 여기서 디아바디가 펩티드 링커를 통해 서로 접합된 2개의 도메인 VH 및 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 제약 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 펩티드 링커가 적어도 5개의 아미노산으로 이루어진 것인 제약 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 펩티드 링커가 아미노산 잔기 GGSGG (서열 9)로 이루어진 것인 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    (i) VH 도메인이 서열 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    VL 도메인이 서열 8의 아미노산 서열을 포함하며,
    (ii) 인터루킨-10 (IL-10)은 인간 인터루킨-10 (IL-10)이며,
    (iii) 펩티드 링커가 아미노산 잔기 GGSGG (서열 9)로 이루어지고,
    (iv) 항체의 VL 도메인이 아미노산 잔기 (SSSSG)3 (서열 10)을 포함하는 펩티드 링커를 통해 인간 IL-10에 접합된 것인
    제약 조성물.
  16. 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 항체 접합체를 포함하는, 염증성 장 질환 (IBD)을 치료하기 위한 제약 조성물.
  17. 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 항체 접합체를 포함하는, 환자에서의 염증성 장 질환 (IBD)의 부위로 인터루킨-10 (IL-10)을 전달하기 위한 제약 조성물.
  18. 제1항 내지 제8항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IBD가 궤양성 결장염 (UC), 콜라겐성 결장염, 림프구성 결장염, 허혈성 결장염, 전환 결장염, 베체트 질환, 불확정 결장염, 및 크론병 (CD) 중 임의의 것으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
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