MX2015003908A

MX2015003908A - Antigenos asociados con enfermedades inflamatoria del intestino.

Info

Publication number: MX2015003908A
Application number: MX2015003908A
Authority: MX
Inventors: Denise O'hara; Giovanni Neri; Kathrin Schwager; Melanie Ruzek; Jianqing Chen
Original assignee: Philogen Spa
Priority date: 2012-10-03
Filing date: 2012-10-03
Publication date: 2015-08-05
Also published as: IL237856B; CA2886152A1; IN2015DN03229A; KR20150061648A; NZ631476A; CA2886152C; HK1212220A1; AU2012391490B2; IL237856A0; US20180044408A1; US20150361161A1; CO7380754A2; JP6158933B2; ES2743423T3; PT2903629T; PL2903629T3; RU2612878C2; EP2903629B1; EP2903629A4; SG11201502404WA

Abstract

Se describen miembros de unión específicos que se unen a la isoforma del ED-A de la fibronectina, para usarse en métodos de tratamiento, diagnóstico, detección y/o formación de imágenes de enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), y/o para usarse en el suministro hacia el tejido con IBD, de una molécula conjugada con el miembro de unión específico; el miembro de unión específico puede ser conjugado, por ejemplo, con una molécula inmunosupresora o antiinflamatoria, tal como interleucina-10.

Description

ANTÍGENOS ASOCIADOS CON ENFERMEDAD INFLAMATORIA DEL INTESTINO La presente invención se refiere al tratamiento y detección de enfermedad inflamatoria del intestino (IBD). La invención implica el uso de un miembro de unión específico que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina, especialmente un miembro de unión específico que se une al dominio ED-A de la fibronectina. El miembro de unión específico puede ser, por ejemplo, conjugado con una molécula ¡nmunosupresora o antiinflamatoria, tal como la ¡nterleucina-10.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), es un grupo de condiciones inflamatorias que afectan al colon y el intestino delgado. Los tipos principales de la IBD son la enfermedad de Crohn (CD) y la colitis ulcerosa (UC). La patogénesis de la IBD se caracteriza por una diferente regulación angiogénica que contribuye a, y que perpetúa, un estado inflamatorio crónico en el intestino (Chidlow et ai, 2006, Am J Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 29, G5 - G18). La enfermedad de Crohn puede afectar a cualquier parte del tracto gastrointestinal, mientras que la colitis ulcerosa se restringe típicamente al colon y el recto (Summers RW, Elliott DE, Qadir K, Urban JF, Thompson R, Weinstock JV (2003) Am. J. Gastroenterol., 98: 2034-2041). Dependiendo de su severidad, el tratamiento de la colitis ulcerosa puede requerir inmunosupresión para controlar sus síntomas, y el tratamiento implica usualmente la administración de moléculas antiinflamatorias.

Se sabe que la IBD se caracteriza por la sobrerregulación de citocinas proinflamatorias, tales como el IFN-g, la IL-6 y la IL-12 (por ejemplo, IL-12p70). Por ejemplo, se sabe que la enfermedad de Crohn está asociada con el exceso de la producción de IL-12/IL-23 e IFN-y/IL-17 (Strober et al. (2007), The Journal of Clinical Investigaron, 117(3), 514-521). Se ha reportado también la síntesis de IL-12p70 e IL-23 durante la enfermedad de Crohn activa (Fuss etal. 2006, Inflamm. Bowel Dis. 12: 9-15).

La fibronectina (FN) es una glucoproteína, y es expresada ampliamente en una variedad de tejidos y fluidos corporales normales. Es un componente de la matriz extracelular (ECM), y desempeña una función en muchos procesos biológicos, que incluyen adhesión celular, migración celular, hemostasis, trombosis, curación de heridas, diferenciación de tejidos y transformación oncogénica.

Diferentes isoformas de FN se generan mediante el empalme alternativo de tres regiones (ED-A, ED-B, IIICS) del transcrito primario pre-ARNm de FN, un proceso que es modulado por citocinas y el pH extracelular (Balza (1988) FEBS Lett., 228, 42-44; Carnemolla (1989) J. Cell Biol., 106, 1139-1148; Borsi (1990) FEBS Lett. 261, 175-178). La fibronectina contiene dos extradominios globulares tipo III, los cuales pueden sufrir empalme alternativo: ED-A y ED-B (ffrench-Constant (1995) Exp. Cell Res., 22, 261-271, Kaspar et ai (2006) Int. J. Cáncer, 118, 1331-1339). Las moléculas del ED-A de la fibronectina de ratón y la fibronectina humana son 96.7% idénticas (sólo 3 aminoácidos difieren entre las dos secuencias de 90 aminoácidos).

La expresión del ED-A de la fibronectina se ha reportado en células tumorales y en tumores sólidos a nivel del ARNm en cáncer de mama (Jacobs et ai (2002) Human Pathol, 33, 29-38, Matsumoto et al. (1999) Jpn. J. Cáncer Res., 90, 320-325) y cáncer de hígado (Oyama et a i (1989) JBC, 264, 10331-10334, Tavian et a i (1994) Int. J, Cáncer, 56, 820-825) y al nivel de la proteína aislada en fibrosarcoma, rabdomiosarcoma y melanoma (Borsi et a I. (1987) J. Cell Biol., 104, 595-560). A diferencia del cáncer, la expresión del ED-A de la fibronectina se ha reportado en artritis reumatoide (W02009/056268). El documento W02010/078950 reporta también la expresión del ED-A de la fibronectina en endometriosis, psoriasis y artritis psoriática; sin embargo, el análisis histoquímico reveló una expresión muy débil a virtualmente ausente del ED-A en esclerosis múltiple y en colitis ulcerosa. Los análisis inmunohistoquímicos reportados por Brenmoehl et a i (Int. J. Colorectal Dis. (2007) 22: 611-623), muestran que la expresión del ED-A es disminuida en la mucosa intestinal inflamada de los pacientes con CD cuando se compara con la mucosa control, e incrementada en la colitis ulcerosa. Brenmoehl et ai (2007) reportan también la expresión incrementada de las isoformas del ED-A y ED-B en la mucosa fibrótica de los pacientes con CD. La expresión de las isoformas del ED-A y ED-B en la mucosa fibrótica es esperada, puesto que se sabe que estas isoformas de la fibronectina están implicadas en la curación de heridas. No hay sugerencia alguna en Brenmoehl et ai (2007) de que el ED-A sea expresado durante la CD (activa), dada la expresión disminuida del ED-A en la mucosa intestinal inflamada de los pacientes con CD en comparación con la mucosa derivada de los pacientes control. El uso de miembros de unión que se unen a la isoforma del ED-A de la fibronectina para el tratamiento o el diagnóstico de la IBD no se describe tampoco en este documento.

La interleuclna-10 (IL-10) es una citocina antiinflamatoria que funciona como un regulador importante en el sistema inmune. Aunque se sabe que la IL-10 tiene muchas funciones diferentes en el sistema inmune, sus dos actividades principales incluyen la inhibición de la producción de citocinas por los macrófagos y la inhibición de las funciones accesorias de los macrófagos durante la activación de las células T (Abbas A, Lichtman A, Pober J., 1994, Cellular and Molecular Immunology. 2a. ed. Filadelfia: W. B. Saunders Company). Los efectos de estas acciones hacen que la IL-10 desempeñe principalmente una función antiinflamatoria en el sistema inmune. La IL-10 era conocida originalmente como el factor inhibidor de la síntesis de citocinas (CSIF), y el descubrimiento de esta proteína se basó en su actividad biológica (Delves P, Roitt I (eds), 1998, Encyclopedia of Immunology, 2a. ed. San Diego: Academic Press). Debido a sus propiedades antiinflamatorias bien conocidas, la terapia con IL-10 se introdujo como una nueva terapia antiinflamatoria potencial en enfermedad de Crohn (CD) (Fedorak et al., Gastroenterology (2000) 119, 1473-1482; Schreiber et al., Gastroenterology (2000) 119, 1461-1472; Colombel et al., Gut (2001) 49, 42-46).

Asadullah et al. (Pharmacology Reviews, (2003), 55, 245-269) revisan el estado de la téenica de la terapia con interleucina-10 en muchas enfermedades inflamatorias. Cuando se revisa la enfermedad inflamatoria crónica del intestino, Asadullah etal. reportan que se llevaron a cabo varias grandes pruebas de centros múltiples, poniendo a prueba múltiples dosificaciones de IL-10 en pacientes con CD leve/moderada o refractaria a la terapia, así como en pacientes que sufren resección ileal o ileocolónica curativa para prevenir la ocurrencia post-operatoria endoscópica mediante administración sistémica (Fedorak et al., Gastroenterology (2000) 119, 1473-1482; Schreiber et al., Gastroenterology (2000) 119, 1461-1472; Colombel et al., Gut (2001) 49, 42-46). Los datos indican que la terapia con IL-10 es segura y bien tolerada. Sin embargo, el tratamiento con IL-10 no dio como resultado índices de remisión significativamente mayores o mejora clínica en comparación con el tratamiento con placebo.

En general, se encontró que los resultados clínicos son insatisfactorios, y varias explicaciones para el desengaño con esta estrategia terapéutica fueron discutidas por Herfarth y Scholmerich (Gut (2002) 50, 146-147).

Por lo tanto, existe la necesidad de tratamientos efectivos de varios estados de IBD.

Afirmaciones de la invención Los presentes inventores han encontrado en forma sorprendente que, un anticuerpo anti-ED-A fusionado con IL-10, fue capaz de (i) localizarse selectivamente en sitios del colon inflamado in vivo en ratones enfermos por la IBD, y (ii) disminuir los niveles en suero de ciertas citocinas proinflamatorias en los ratones enfermos por la IBD, en particular interferón-gamma, IL-6 e IL-12p70.

La subregulación de citocinas proinflamatorias a través de la administración de un anticuerpo anti-ED-A fusionado con IL-10 fue particularmente sorprendente, puesto que Tilg et al. (Gut (2002), 50, 191-195) reportan que el tratamiento de los pacientes con enfermedad de Crohn con IL-10 humana recombinante induce interferón-gamma. Shibata et ai (J. Immunol., (1998) 161, 4283-4288) reportan también que la IL-10 mejora la producción de INF-gamma por las células NK, pero inhibe la producción de factores que inducen IFN-gamma por los macrófagos.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención provee un miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se une a la isoforma del dominio extra A (ED-A) de la fibronectina (A-FN), para su uso en un método de tratamiento de la IBD. La invención provee también el uso de un miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se une a la isoforma del dominio extra A (ED-A) de la fibronectina, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la IBD. La invención provee también un método de tratamiento de la IBD en un paciente, el método comprendiendo administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un medicamento que comprende un miembro de unión específico que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina. De preferencia, el miembro de unión específico se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina humana.

El miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, para su uso en este primer aspecto de la invención, puede unirse al ED-A de la fibronectina.

El miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, para su uso en este primer aspecto de la invención, puede ser conjugado con una molécula que tiene actividad inmunosupresora o antiinflamatoria, un marcador detectable, un radioisótopo, o una molécula bioactiva, tal como una atocina, una hormona, un radioisótopo terapéutico o un fármaco citotóxico. El miembro de unión específico puede ser conjugado con la molécula bioactiva por un enlazador escindible.

En una modalidad preferida, el miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, es conjugado con una molécula que tiene actividad inmunosupresora o antiinflamatoria, tal como IL-10.

La IBD, como es referida en la presente, puede ser IBD activa. En particular, la IBD puede ser enfermedad de Crohn (CD), colitis ulcerosa (UC), colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis diverticular, enfermedad de Behget o colitis indeterminada. La IBD puede ser CD o UC. La IBD puede ser CD, colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis diverticular, enfermedad de Behget o colitis indeterminada. En una modalidad, la IBD no es UC. La IBD puede ser una IBD que no se restringe típicamente a inflamación en el colon y el recto, tal como CD. La IBD puede ser una IBD que no afecta sólo al revestimiento del colon. De preferencia, la IBD es CD. Los términos CD, UC, colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis diverticular, enfermedad de Behget y colitis indeterminada, como se usan en la presente, pueden referirse a CD activa, UC activa, colitis colagenosa activa, colitis linfocítica activa, colitis isquémica activa, colitis diverticular activa, enfermedad de Behget activa y colitis indeterminada activa, respectivamente.

En un segundo aspecto, la invención provee un miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina para su uso en el suministro hacia el tejido con IBD, de una molécula conjugada con el miembro de unión específico. La invención provee también el uso de un miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina en la fabricación de un medicamento para el suministro hacia el tejido con IBD, de una molécula conjugada con el miembro de unión específico. La invención provee también un método de suministro de una molécula hacia tejido con IBD en un humano o animal, en donde la molécula es conjugada con un miembro de unión específico que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina para formar un conjugado, y el método comprende administrar el conjugado al humano o animal. De preferencia, el miembro de unión específico se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina humana.

El miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, para su uso en este segundo aspecto de la invención, puede unirse al ED-A de la fibronectina.

El miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, para su uso en este segundo aspecto de la invención, puede ser conjugado con un marcador detectable, un radioisótopo o una molécula bioactiva, tal como una citocina, una hormona, un radioisótopo terapéutico o un fármaco citotóxico. El miembro de unión específico puede ser conjugado con la molécula bioactiva por un enlazador escindible.

El miembro de unión específico, por ejemplo, molécula de anticuerpo, es de preferencia conjugado con IL-10.

En un tercer aspecto, la invención provee un miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina para su uso en un método de diagnóstico de IBD. La invención provee también el uso de un miembro de unión específico que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina, en la fabricación de un producto de diagnóstico para el diagnóstico de IBD. La invención provee también un método de detección o de diagnóstico de IBD en un humano o animal, en donde el método comprende los pasos de: (a) administrar al humano o animal un miembro de unión específico que se une al dominio ED-A de la fibronectina, y (b) determinar la presencia o ausencia del miembro de unión específico en sitios con IBD del cuerpo del humano o animal, en donde la localización del miembro de unión específico hacia el sitio con IBD indica la presencia de IBD.

De preferencia, el miembro de unión específico se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina humana.

El miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, para su uso en este tercer aspecto de la invención, puede unirse al ED-A de la fibronectina.

El miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, para su uso en este tercer aspecto de la invención, puede ser conjugado con un marcador detectable, o un radioisótopo.

En un cuarto aspecto, la invención provee un miembro de unión específico que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina, para su uso en un método de formación de imágenes del tejido con IBD. La invención provee también el uso de un miembro de unión específico que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina, en la fabricación de un agente de formación de imágenes para representar con una imagen el tejido con IBD. La invención provee también un método de detección o de formación de imágenes de tejido con IBD en un humano o animal, en donde el método comprende los pasos de: (a) administrar al humano o animal un miembro de unión específico que se une al dominio ED-A de la fibronectina, y (b) detectar la unión del miembro de unión específico al tejido con IBD en el cuerpo del humano o animal.

El miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, para su uso en este cuarto aspecto de la invención, puede unirse al ED-A de la fibronectina.

El miembro de unión específico, por ejemplo, una molécula de anticuerpo, para su uso en este cuarto aspecto de la invención, puede ser conjugado con un marcador detectable, o un radioisótopo.

En un quinto aspecto, la invención provee un conjugado que comprende un miembro de unión que se une a la isoforma del ED-A, por ejemplo, el ED-A, de la fibronectina conjugado con IL-10, en donde el conjugado tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 13. Este conjugado es referido como F8-IL10 en la presente. Puesto que los dominios VH y VL de este conjugado son enlazados por medio de un enlazador de 5 aminoácidos (véase la figura IB), se espera que el conjugado forme homodímeros no covalentes en solución.

Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede ser una molécula de anticuerpo que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina y/o el ED-A de la fibronectina, en donde el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) del anticuerpo F8 descrito en la presente. Estas secuencias se proveen a continuación (véase SEQ ID NOs: 1-6). Las secuencias de la CDR del anticuerpo F8 se muestran también en las figuras 1A a 1E.

Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede comprender una o más CDRs como se describe en la presente, por ejemplo, una CDR3, y opcionalmente también una CDR1 y CDR2 para formar una serie de CDRs.

De preferencia, un miembro de unión específico para su uso en la invención comprende una serie de CDRs H y/o L del anticuerpo F8 descrito en la presente con diez o menos, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o cinco, sustituciones de aminoácido dentro de la serie descrita de CDRs H y/o L.

Las sustituciones pueden hacerse potencialmente en cualquier residuo dentro de la serie de CDRs, y pueden estar dentro de CDR1, CDR2 y/o CDR3.

Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede comprender una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo humano. El miembro de unión específico comprende normalmente un dominio VH y/o VL del anticuerpo. Los dominios VH de los miembros de unión específicos se proveen también para su uso en la invención. Dentro de cada uno de los dominios VH y VL están regiones determinantes de complementariedad, ("CDRs"), y regiones de estructura, ("FRs"). Un dominio VH comprende una serie de HCDRs, y un dominio VL comprende una serie de LCDRs. Una molécula de anticuerpo puede comprender un dominio VH del anticuerpo que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y una región de estructura. Puede comprender en forma alternativa o también un dominio VL del anticuerpo que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de VL y una región de estructura. Todas las secuencias del VH y VL, secuencias de la CDR, series de CDRs y series de HCDRs y series de LCDRs descritas en la presente, representan modalidades de un miembro de unión específico para su uso en la invención. Como se describe en la presente, una "serie de CDRs" comprende CDR1, CDR2 y CDR3. De esta manera, una serie de HCDRs se refiere a HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y una serie de LCDRs se refiere a LCDR1, LCDR2 y LCDR3. A menos que se indique de otra manera, una "serie de CDRs" incluye HCDRs y LCDRs.

Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede comprender un dominio VH del anticuerpo que comprende regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3 y una región de estructura, en donde la HCDR1 es SEQ ID NO: 1, y en donde opcionalmente la HCDR2 es SEQ ID NO: 2, y/o la HCDR3 es SEQ ID NO: 3.

Típicamente, un dominio VH es apareado con un dominio VL para proveer un sitio de unión al antígeno del anticuerpo, aunque como se discute más adelante, un dominio VH o VL solo puede usarse para unirse al antígeno. De esta manera, un miembro de unión específico para su uso en la invención puede comprender además un dominio VL del anticuerpo que comprende las regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y una región de estructura, en donde la LCDR1 es SEQ ID NO: 4, y en donde opcionalmente la LCDR2 es SEQ ID NO: 5 y/o la LCDR3 es SEQ ID NO: 6.

Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede comprender de preferencia una molécula de anticuerpo para el ED-A de la fibronectina, en donde la molécula de anticuerpo comprende un dominio VH y un dominio VL, en donde el dominio VH comprende una región de estructura y una serie de regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y en donde el dominio VL comprende las regiones determinantes de complementa riedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y una región de estructura, y en donde: la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1; la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3; la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5; y la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

Una o más CDRs o una serie de CDRs de un anticuerpo pueden ser injertadas en una región de estructura (por ejemplo, una región de estructura humana) para proveer una molécula de anticuerpo para su uso en la invención. Las regiones de estructura pueden comprender secuencias de segmentos de genes de la línea germinal humana. De esta manera, la región de estructura puede ser de la línea germinal, por lo cual uno o más residuos dentro de la región de estructura son cambiados para aparearse con los residuos en la posición equivalente en la región de estructura de la línea germinal humana más similar. Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede ser una molécula de anticuerpo aislada que tiene un dominio VH que comprende una serie de HCDRs en una región de estructura de la línea germinal humana, por ejemplo, DP47. Normalmente, el miembro de unión específico tiene también un dominio VL que comprende una serie de LCDRs, por ejemplo, en una región de estructura de la línea germinal humana. La región de estructura de la línea germinal humana del dominio VL puede ser DPK22.

Un dominio VH para su uso en la invención puede tener de preferencia la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, la cual es el dominio VH del anticuerpo F8. Un dominio VL para su uso en la invención puede tener de preferencia la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8, la cual es el dominio VL del anticuerpo F8 de tipo silvestre.

Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede ser o comprende un Fv de cadena sencilla (scFv), que comprende un dominio VH y un dominio VL unidos por medio de un enlazador de péptidos. El experto en la téenica puede seleccionar una longitud y secuencia apropiada del enlazador, por ejemplo, por lo menos 5 o por lo menos 10 aminoácidos de longitud, hasta aproximadamente 15, hasta aproximadamente 20 o hasta aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. El enlazador puede tener la secuencia de aminoácidos GGSGG (SEQ ID NO: 9).

El miembro de unión específico puede ser un cuerpo bivalente, el cual es un fragmento multivalente o multiespecífico construido mediante la fusión de genes (véase el documento WO94/13804; Holliger eta!. (1993a), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 6444-6448).

De preferencia, el miembro de unión específico es un scFv que forma homodímeros no covalentes (estables) en solución. Por ejemplo, el anticuerpo F8 y el conjugado F8-IL10 descritos en la presente comprenden un scFv el cual se espera forme homodímeros no covalentes (estables) en solución.

Un Fv de cadena sencilla (scFv) puede estar comprendido dentro de una mini-¡nmunoglobulina o ¡nmunoproteína pequeña (SIP), por ejemplo, como se describe en Li et al. (1997), Protein Engineering, 10: 731-736. Una SIP puede comprender una molécula de scFv fusionada con el dominio CH4 de la isoforma secretoria de IgE humana IgE-S2 (.£s2-CH4; Batista et al., (1996), J. Exp. Med., 184: 2197-205), formando una molécula de anticuerpo de mini-inmunoglobulina homodimérica.

En forma alternativa, un miembro de unión específico para su uso en la invención puede comprender un sitio de unión al antígeno dentro de una molécula no de anticuerpo, normalmente provisto por una o más CDRs, por ejemplo, una serie de CDRs en un andamio de proteína no de anticuerpo. Miembros de unión específicos, incluyendo moléculas de anticuerpo y no de anticuerpo, se describen en más detalle en otra parte en la presente.

El miembro de unión específico para su uso en la presente invención puede ser una molécula de anticuerpo que comprende el dominio VH del anticuerpo F8 mostrado en SEQ ID NO: 7, y/o el dominio VL del anticuerpo F8 mostrado en SEQ ID NO: 8. El miembro de unión específico para su uso en la presente invención puede ser una molécula de anticuerpo que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 11. El miembro de unión específico conjugado con IL-10 de la presente invención puede comprender la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 13.

Un miembro de unión específico para su uso en la presente invención puede comprender también una o más, por ejemplo las seis, de las CDRs de los anticuerpos anti ED-A Hl, B2, C5, D5, E5, C8, Fl, B7, E8 o G9, o variantes de las mismas, o los dominios VH y/o VL de los anticuerpos anti ED-A Hl, B2, C5, D5, E5, C8, Fl, B7, E8 o G9, o variantes de las mismas. Las secuencias de las CDRs y las secuencias de los dominios VH y VL de estos anticuerpos, se describen en el documento W02010/078950.

Una variante adecuada para su uso en la presente invención comprende un sitio de unión al antígeno del anticuerpo que comprende un dominio VH y un dominio VL del anticuerpo F8 descrito en la presente, en donde el residuo de leucina (L) en la posición 5 del dominio VH mostrado como SEQ ID NO: 7 es sustituido con valina (V), y/o el residuo de arginina (R) en la posición 18 del dominio VL mostrado como SEQ ID NO: 8 es sustituido con Usina (K).

Estos y otros aspectos de la invención se describen en más detalle a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1A muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada (VH) del anticuerpo F8 anti-ED-A (SEQ ID NO: 7). La secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena pesada (SEQ ID NO: 1) del anticuerpo F8 anti-ED-A está subrayada. La secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena pesada (SEQ ID NO: 2) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en cursivas v subrayada. La secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada (SEQ ID NO: 3) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en negritas v subrayada. La figura IB muestra la secuencia de aminoácidos de la secuencia del enlazador del anticuerpo F8 anti-ED-A entre los dominios VH y VL (SEQ ID NO: 9). La figura 1C muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera (VL) del anticuerpo F8 anti-ED-A (SEQ ID NO: 8). La secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera (SEQ ID NO: 4) del anticuerpo F8 anti-ED-A está subrayada. La secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera (SEQ ID NO: 5) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en cursivas v subrayada. La secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena ligera (SEQ ID NO: 6) del anticuerpo F8 anti-ED-A se muestra en negritas v subrayada. La figura ID muestra la secuencia de aminoácidos del enlazador entre el anticuerpo F8 y la IL-10 cuando el anticuerpo es conjugado con IL-10. La figura 1E muestra la secuencia de aminoácidos de la IL-10 humana.

La figura 2 muestra los resultados de una autorradiografía del colon de ratones sanos y con IBD. Los cólones fueron cosechados y expuestos a una pantalla de formación de imágenes luminiscentes (Molecular Dynamics) por 24 horas, y representados por medio de Storm 860. Campo 1: colon cosechado a 6 horas post-lnyección del grupo 0 (ratón sano); campo 2: colon cosechado a 6 horas post-inyección del grupo 2 (ratón con IBD); campo 3: colon cosechado a 24 horas post-inyección del grupo 0 (ratón sano); campo 4: colon cosechado a 24 horas post inyección del grupo 2 (ratón con IBD).

Las figuras 3A a 3C muestran la biodistribución de 125I-F8-IL10 en ratones sanos o con enfermedad. Los diagramas muestran la biodistribución de 125I-F8-IL10 en ratones sanos y enfermos 6 horas post-inyección (Figura 3A), 24 horas post-inyección (Figura 3B) y 96 horas postinyección (Figura 3C). A 96 horas, una acumulación preferencial de 125I-F8-IL10 en el colon y en los nodulos linfáticos (L.N.) mesentéricos de ratones enfermos es visible, en comparación con los ratones sanos. La secuencia del conjugado F8-IL10 usado en estos experimentos se muestra en SEQ ID NO: 13.

La figura 4 muestra los niveles de citocinas en ratones tratados con F8-IL10. El diagrama de arriba representa los niveles de citocinas en el suero de ratones sanos (agua), ratones enfermos que no recibieron tratamiento (DSS a 3%), ratones enfermos que recibieron el anticuerpo F8 en el formato de pequeña proteína inmune (F8SIP), ratones enfermos que recibieron F8-IL10 (F8- IL10). Los niveles de citocinas (expresados como mg de proteína por mi de suero) reportados son: Interleucina 1b (ILl-b), interleucina 12 (IL-12p70), ¡nterferón g (IFNy) e ¡nterleuclna 6 (IL6).

La figura 5 muestra los niveles de citocinas en ratones tratados con F8-IL10. El diagrama de arriba representa los niveles de citocinas en el suero de ratones sanos (agua), ratones enfermos que no recibieron tratamiento (DSS a 3%), ratones enfermos que recibieron el anticuerpo F8 en el formato de pequeña proteína inmune (F8SIP), ratones enfermos que recibieron F8-IL10 (F8-IL10). Los niveles de citocinas (cuyos niveles se expresaron como pg de proteína por mi de suero) reportados son: Quimiocina derivada de queratinocitos (KC), interleucina 10 (IL10) y factor de necrosis tumoral alfa (FNTa).

La figura 6 muestra el análisis histoquímico de especímenes de tejido del colon de pacientes afectados por colitis ulcerosa, y por enfermedad de Crohn sondeada con el anticuerpo F8 en el formato de SIP y el factor de Von Willebrand. El patrón de tinción observado con el anticuerpo F8 y el factor de Von Willebrand muestra que el anticuerpo F8 tiñe los vasos sanguíneos recién formados pero no los vasos sanguíneos normales en los pacientes afectados por la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn (el factor de Von Willebrand se usa habitualmente como un marcador de la vasculatura normal).

La figura 7 muestra el análisis histoquímico de especímenes de tejido del colon de pacientes afectados por colitis ulcerosa y por enfermedad de Crohn (derecha) y de cólones no afectados (izquierda). El patrón de tinción observado con el anticuerpo F8 muestra que el anticuerpo F8 tiñe más intensamente los nuevos vasos sanguíneos que se forman en los cólones enfermos.

Terminología Fibronectina La fibronectina es un antígeno sujeto a empalme alternativo, y se conocen muchas isoformas alternativas de fibronectina, como se describe en otra parte en la presente. El dominio extra-A (EDA o ED-A) se conoce también como ED, repetición A extra tipo III (EIIIA) o EDI. La secuencia del ED-A humano ha sido publicada por Kornblihtt et a! (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868 y Paolella et a /. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557. La secuencia del ED-A de humano está también disponible en la base de datos SwissProt como aminoácidos 1631-1720 (fibronectina tipo-III 12; dominio extra 2) de la secuencia de aminoácido depositada bajo el número de acceso P02751. La secuencia del ED-A de ratón está disponible en la base de datos SwissProt como aminoácidos 1721-1810 (fibronectina tipo-III 13; dominio extra 2) de la secuencia de aminoácidos depositada bajo el número de acceso P11276.

La ¡soforma del ED-A de la fibronectina (A-FN) contiene al dominio extra-A (ED-A). La secuencia de la A-FN de humano puede deducirse de la secuencia del precursor de fibronectina humana correspondiente que está disponible en la base de datos SwissProt bajo el número de acceso P02751. La secuencia de la A-FN de ratón puede deducirse de la secuencia del precursor de fibronectina de ratón correspondiente que está disponible en la base de datos SwissProt bajo el número de acceso P11276. La A-FN puede ser la isoforma del ED-A de humano de la fibronectina. El ED-A puede ser el dominio extra-A de la fibronectina humana.

El ED-A es una secuencia de 90 aminoácidos que es insertada en la fibronectina (FN) mediante empalme alternativo, y se localiza entre los dominios 11 y 12 de la FN (Borsi et al., 1987, J. Cell Biol., 104, 595-600). El ED-A está principalmente ausente en la forma de FN del plasma, pero es abundante durante la embriogénesis, la reconstrucción de tejidos, la fibrosis, el trasplante cardiaco y el crecimiento de tumores sólidos.

Empalme alternativo El empalme alternativo se refiere a la ocurrencia de diferentes patrones de empalme de un transcrito de ARN primario de ADN que produce diferentes moléculas de ARNm. Después de la excisión de los intrones, la selección puede determinar qué exones son empalmados juntos para formar el ARNm. El empalme alternativo lleva a la producción de diferentes isoformas que contienen diferentes exones y/o diferentes números de exones. Por ejemplo, una isoforma puede comprender una secuencia de aminoácidos adicional que corresponde a uno o más exones, que puede comprender uno o más dominios.

Miembro de unión específico Este describe un miembro de un par de moléculas que se unen específicamente a alguna otra. Los miembros de un par de unión específico pueden derivarse naturalmente, o pueden producirse totalmente o parcialmente por medio de síntesis. Un miembro del par de moléculas tiene un área sobre su superficie, o una cavidad, que se une a y es por lo tanto complementaria, a una organización espacial y polar particular del otro miembro del par de moléculas. Ejemplos de tipos de pares de unión son antígeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando o enzima-substrato. La presente invención está relacionada con las reacciones tipo antígeno-anticuerpo.

Un miembro de unión específico comprende normalmente una molécula que tiene un sitio de unión al antígeno. Por ejemplo, un miembro de unión específico puede ser una molécula de anticuerpo o una proteína no de anticuerpo que comprende un sitio de unión al antígeno. Un miembro de unión específico, como es referido en la presente, es de preferencia una molécula de anticuerpo.

Un sitio de unión al antígeno puede ser provisto por medio de la disposición de regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en andamios de proteína no de anticuerpo tales como fibronectina o citocromo B, etc. (Haan y Maggos, (2004), BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al., (1998), Journal of Molecular Biology, 284: 1141-1151; Nygren et al., (1997), Current Opinión in Structural Biology, 7: 463-469), o mediante la aleatorización o mutación de residuos de aminoácido de un bucle dentro de un andamio de proteína que confiere especificidad de unión por un objetivo deseado. Andamios para el diseño de sitios de unión novedosos en proteínas han sido revisados en detalle por Nygren et al. (1997) (Current Opinión in Structural Biology, 7: 463-469). Los andamios de proteína para miméticos de anticuerpos se describen en el documento WO/0034784, en el cual los inventores describen proteínas (miméticos de anticuerpos) que incluyen un dominio de fibronectina tipo III que tiene por lo menos un bucle aleatorizado. Un andamio adecuado en el cual se injertan una o más CDRs, por ejemplo, una serie de HCDRs, puede ser provisto por cualquier miembro de dominio de la superfamilia de genes de inmunoglobulina. El andamio puede ser una proteína humana o no humana. Una ventaja de un andamio de proteína no de anticuerpo es que puede proveer un sitio de unión al antígeno en una molécula del andamio que es más pequeña y/o es más fácil de sintetizar que por lo menos algunas moléculas de anticuerpo. El tamaño pequeño de un miembro de unión puede conferir propiedades fisiológicas útiles tales como una capacidad para entrar a las células, penetrar profundamente en los tejidos o alcanzar objetivos dentro de otras estructuras, o de unirse dentro de las cavidades de las proteínas del antígeno objetivo. El uso de sitios de unión al antígeno en andamios de proteína no de anticuerpo es revisado en Wess, 2004, en: BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, 12(42), A1-A7. Típicas son proteínas que tienen una estructura de base estable y uno o más bucles variables, en los cuales la secuencia de aminoácidos del bucle o bucles es específicamente o aleatoriamente mutada para crear un sitio de unión al antígeno que se une al antígeno objetivo. Dichas proteínas incluyen los dominios de unión a IgG de la proteína A de 5. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por ejemplo, décimo dominio de fibronectina tipo III) y lipocalinas. Otros procedimientos incluyen "microcuerpos" sintéticos (Selecore GmbH), los cuales se basan en cielótidos - pequeñas proteínas que tienen enlaces disulfuro intramoleculares.

Además de secuencias de anticuerpo y/o un sitio de unión al antígeno, un miembro de unión específico para su uso en la presente invención puede comprender otros aminoácidos, por ejemplo, formando un péptido o polipéptido, tal como un dominio plegado, o imparte a la molécula otra característica funcional además de la capacidad para unirse al antígeno. Los miembros de unión para su uso en la invención pueden poseer un marcador detectable, o pueden ser conjugados con una toxina, una molécula que ejerza un efecto inmunosupresor o antiinflamatorio, o una porción de focallzación o enzima (por ejemplo, por medio de un enlace de peptidilo o enlazador). De preferencia, un miembro de unión para su uso en ia Invención es conjugado con ¡nterleuc¡na-10.

Por ejemplo, un miembro de unión puede comprender un sitio catalítico (por ejemplo, en un dominio de enzima), así como un sitio de unión al antígeno, en donde el sitio de unión al antígeno se une al antígeno y de esta manera focaliza el sitio catalítico hacia el antígeno. El sitio catalítico puede Inhibir la función biológica del antígeno, por ejemplo, mediante escisión.

Aunque, como se indicó, las CDRs pueden ser llevadas por andamios no de anticuerpo, la estructura para llevar una CDR o una serie de CDRs será generalmente una secuencia de cadena ligera o pesada de anticuerpo o porción sustancial de la misma en la cual la CDR o serie de CDRs se localizan en un sitio que corresponde a la CDR o serie de CDRs de dominios variables de anticuerpo VH y VL de ocurrencia natural codificados por genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y los sitios de los dominios variables de inmunoglobulina pueden determinarse haciendo referencia a Kabat et al. (1987) (Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a. edición. US Department of Health and Human Services), y actualizaciones de la misma, ahora disponibles en la internet (en immuno.bme.nwu.edu, o encontradas como "Kabat" usando cualquier máquina de búsqueda).

Por el término región CDR o CDR, se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina como es definido por Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a. edición, US Department of Health and Human Services (Kabat et al. (1991a), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. edición, US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington, y ediciones posteriores). Un anticuerpo contiene típicamente 3 CDRs de cadena pesada y 3 CDRs de cadena ligera. El término CDR o CDRs se usa aquí para indicar, de acuerdo con el caso, una de estas regiones o varias, o incluso la totalidad, de estas regiones que contienen la mayoría de los residuos de aminoácido responsables de la unión por afinidad del anticuerpo por el antígeno o el epítope que reconoce.

Entre las seis secuencias de CDR cortas, la tercer CDR de la cadena pesada (HCDR3) tiene una mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad esencialmente debido a los mecanismos de disposición de los genes que dan lugar a la misma). Puede ser tan corta como 2 aminoácidos, aunque el tamaño más largo conocido es 26. Funcionalmente, la HCDR3 desempeña una función en parte en la determinación de la especificidad del anticuerpo (Segal et al. (1974), PNAS, 71: 4298-4302; Amit et al. (1986), Science, 233: 747-753; Chothia et al. (1987), J. Mol. Biol., 196: 901-917; Chothia et a!. (1989), Nature, 342: 877-883; Catón et a!. (1990), J. Immunol., 144: 1965-1968; Sharon et al. (1990a), PNAS, 87: 4814-4817; Sharon et a (1990b), J. Immunol., 144: 4863-4869; Kabat etal. (1991b), J. Immunol., 147: 1709-1719).

Molecula de anticuerpo Esta describe una ¡nmunoglobulina ya sea natural o producida parcialmente o enteramente por vía sintética. El término se refiere también a cualquier polipéptido o proteína que comprenda un sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Debe entenderse aquí que la invención no se relaciona con los anticuerpos en forma natural, es decir, no están en su ambiente natural, sino que han sido capaces de ser aislados u obtenidos mediante purificación de fuentes naturales, u obtenidos también mediante recombinación genética, o mediante síntesis química, y que pueden contener entonces aminoácidos no naturales como se describirá más adelante. Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de unión al antígeno del anticuerpo incluyen, pero no están limitados a, moléculas de anticuerpo tales como Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd; y cuerpos bivalentes.

Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usar téenicas de la tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que se unen al antígeno objetivo. Dichas técnicas pueden implicar introducir ADN que codifica para la región variable de ¡nmunoglobulina, o las CDRs, de un anticuerpo para las regiones constantes, o regiones constantes más regiones de estructura, de una ¡nmunoglobulina diferente. Véase, por ejemplo, los documentos EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400, y un gran cuerpo de literatura subsiguiente. Un hibridoma u otra célula que produzca un anticuerpo, puede estar sujeto a mutación genética u otros cambios, los cuales pueden o no alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.

Puesto que los anticuerpos pueden ser modificados de muchas maneras, debe considerarse que el término "molécula de anticuerpo" abarca cualquier miembro de unión o sustancia que tiene un sitio de unión al antígeno del anticuerpo con la especificidad requerida y/o la unión al antígeno. De esta manera, este término abarca fragmentos y derivados de anticuerpo, que incluyen cualquier polipéptido que comprenda un sitio de unión al antígeno del anticuerpo, ya sea natural o totalmente o parcialmente sintético. Se incluyen por lo tanto moléculas quiméricas que comprenden un sitio de unión al antígeno del anticuerpo, o equivalente, fusionadas con otro polipéptido (por ejemplo, derivadas de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo). La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describen en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023, y un gran cuerpo de literatura subsiguiente.

Otras técnicas disponibles en la materia del diseño de anticuerpos han hecho posible aislar anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, pueden obtenerse hibridomas humanos como es descrito por Kontermann y Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545. La exhibición de fagos, otra téenica establecida para generar miembros de unión, ha sido descrita en detalle en muchas publicaciones tales como el documento W092/01047 (discutido más adelante), y las patentes de los Estados Unidos US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 y US6521404, y en Kontermann y Dubel (2001), 5, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545. Ratones transgénicos en los cuales los genes de anticuerpo de ratón son inactivados y funcionalmente reemplazados con genes de anticuerpos humanos mientras que dejan intactos otros componentes del sistema inmune del ratón, pueden usarse para aislar anticuerpos humanos (Mendez etai. (1997), Nature Genet, 15(2): 146-156).

Pueden crearse moléculas de anticuerpo sintéticas mediante la expresión de genes generados por medio de oligonucleótidos sintetizados y ensamblados dentro de vectores de expresión adecuados, por ejemplo, como es descrito por Knappik etai. (2000) 1 Mol. Biol. 296, 57-86, o Krebs etai. (2001) Journal of Immunological Methods, 25467-84.

Se ha mostrado que fragmentos de un anticuerpo entero pueden llevar a cabo la función de los antígenos de unión. Ejemplos de fragmentos de unión son (i) el fragmento Fab que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (¡ii) el fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un anticuerpo individual; (iv) el fragmento dAb (Ward etai. (1989) Nature 341, 544-546; McCafferty etai. (1990) Nature, 348, 552-554; Holt et ai. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490) que consiste de un dominio VH o un dominio VL; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL son enlazados por un enlazador de péptidos que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión al antígeno (Bird et ai. (1988) Science, 242, 423-426; Huston et ai. (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883); (viii) dímeros de Fv de cadena sencilla biespecíficos (PCT/US92/09965); y (ix) "cuerpos bivalentes", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante la fusión de genes (WO94/13804; Holliger et ai. (1993a), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 6444-6448). Las moléculas de Fv, scFv o cuerpos bivalentes pueden ser estabilizadas mediante la incorporación de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Reiter et a!. (1996), Nature Biotech, 14, 1239-1245). Pueden obtenerse también minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 (Hu et ai. (1996), Cáncer Res., 56 (13): 3055-61). Otros ejemplos de fragmentos de unión son Fab', el cual difiere de los fragmentos Fab por la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de gozne del anticuerpo, y Fab'-SH, el cual es un fragmento Fab' en el cual los residuos de cisterna de los dominios constantes poseen un grupo tiol libre.

Los fragmentos de anticuerpo para su uso en la invención pueden obtenerse partiendo de cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas en la presente, por ejemplo, moléculas de anticuerpo que comprendan dominios VH y VL o CDRs de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente, mediante métodos tales como digestión por enzimas tales como pepsina o papaína y/o mediante escisión de los puentes disulfuro mediante reducción química. En otra modalidad, los fragmentos de anticuerpo de la presente invención pueden obtenerse mediante téenicas de recombinación genética asimismo bien conocidas por los expertos en la técnica, o también mediante la síntesis de péptidos por medio de, por ejemplo, sintetizadores automáticos de péptidos tales como los provistos por la compañía Applied Biosystems, etc., o mediante la síntesis y expresión de ácidos nucleicos.

Los fragmentos de anticuerpo funcionales de conformidad con la presente invención incluyen cualquier fragmento funcional cuya vida media sea incrementada por una modificación química, especialmente mediante PEGilación, o mediante la incorporación en un liposoma.

Un dAb (anticuerpo de dominio) es un pequeño fragmento monomérico de unión al antígeno de un anticuerpo, a saber, la región variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpo (Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490). Los dAbs de VH ocurren naturalmente en camélidos (por ejemplo, camello, llama), y pueden producirse inmunizando a un camélido con un antígeno objetivo, aislando células B específicas del antígeno, y clonando directamente los genes del dAb de células B individuales. Los dAbs son también producibles en cultivo de células. Su pequeño tamaño, buena solubilidad y estabilidad a la temperatura, los hace en particular fisiológicamente útiles y adecuados para selección y maduración por afinidad. Un miembro de unión de la presente invención puede ser un dAb que comprenda un dominio VH o VL sustancialmente como se expone en la presente, o un dominio VH o VL que comprenda una serie de CDRs sustancialmente como se expone en la presente.

Como se usa en la presente, la frase "sustancialmente como se expone" se refiere a que las características de las CDRs relevantes del dominio VH o VL de los miembros de unión descritos en la presente serán idénticas o altamente similares a las regiones especificadas de las cuales la secuencia se expone en la presente. Como se describe en la presente, en la frase "altamente similar" con respecto a regiones especificadas de uno o más dominios variables, se contempla que de 1 a aproximadamente 5, por ejemplo, de 1 a 4, incluyendo 1 a 3, o 1 o 2, o 3 o 4, sustituciones de aminoácido, pueden hacerse en la CDR y/o el dominio VH o VL.

Los anticuerpos biespecíficos o bifuncionales forman una segunda generación de anticuerpos monoclonales en los cuales dos diferentes regiones variables se combinan en la misma molécula (Holliger y Bohlen 1999 Cáncer and metástasis rev. 18: 411-419). Su uso se ha demostrado en el campo de diagnóstico y en el campo de terapia por su capacidad para reclutar nuevas funciones efectoras o para focalizar varias moléculas sobre la superficie de las células tumorales. En donde se usen anticuerpos biespecíficos, estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, los cuales pueden sintetizarse en una variedad de maneras (Holliger et al. (1993b), Current Opinión Biotechnol 4, 446-449), por ejemplo, preparados químicamente o de hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpo biespecíficos mencionados anteriormente. Estos anticuerpos pueden obtenerse mediante métodos químicos (Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139, 2367-2375; Repp et al. (1995) J. Hemat. 377-382) o métodos somáticos (Staerz U. D. y Bevan M. (1986) PNAS 83; Suresh et al. (1986) Method. Enzymol. 121: 210-228), pero asimismo mediante téenicas de ingeniería genética que permiten que la heterodimerización sea forzada y de esta manera facilite el procedimiento de purificación del anticuerpo buscado (Merchand et ai, 1998 Nature Biotech. 16: 677-681). Ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen aquellos de la tecnología BiTE™, en la cual los dominios de unión de dos anticuerpos con diferente especificidad pueden usarse y pueden ser enlazados directamente por medio de péptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos en una cadena de polipéptidos individual corta.

Los cuerpos bivalentes y el scFv pueden construirse sin una región Fe, usando sólo dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de la reacción antiidiotípica.

Los anticuerpos biespecíficos pueden construirse como una molécula de IgG entera, como Fab'2 biespecífico, como Fab'PEG, como cuerpos bivalentes o también como un scFv biespecífico. Además, dos anticuerpos biespecíficos pueden ser enlazados usando métodos de rutina conocidos en la técnica para formar anticuerpos tetravalentes.

Los cuerpos bivalentes biespecíficos, opuestamente a los anticuerpos enteros biespecíficos, pueden ser también particularmente útiles debido a que pueden ser fácilmente construidos y expresados en E coli. Los cuerpos bivalentes (y muchos otros polipéptidos tales como los fragmentos de anticuerpo) de especificidades de unión apropiadas, pueden seleccionarse fácilmente usando la exhibición de fagos (WO94/13804) de colecciones. Si un brazo del cuerpo bivalente se mantendrá constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra un antígeno objetivo, entonces puede obtenerse una colección en donde el otro brazo se hace variar y se selecciona un anticuerpo de especificidad apropiada. Pueden obtenerse anticuerpos enteros biespecíficos mediante métodos de síntesis alternativos como se describe en Ridgeway etal. (1996), Protein Eng., 9, 616-621.

Varios métodos están disponibles en la técnica para obtener anticuerpos contra un antígeno objetivo. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, especialmente originados de humano, murino, quiméricos o humanizados, los cuales pueden obtenerse de acuerdo con los métodos estándar bien conocidos por los expertos en la téenica.

En general, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente originados de murino, es posible referirse a las técnicas que se describen en particular en el manual "Antibodles" (Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Sprlng Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988), o a la técnica de preparación de hlbrldomas descrita por Kohler y Milsteln, 1975, Nature, 256: 495-497.

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales, por ejemplo, de una célula animal Inmunizada contra A-FN, o uno de sus fragmentos que contengan el epítope reconocido por dichos anticuerpos monoclonales, por ejemplo, un fragmento que comprenda o que consista del ED-A, o un fragmento de péptido del ED-A. La A-FN, o uno de sus fragmentos, puede producirse especialmente de acuerdo con los métodos de trabajo usuales, mediante recomblnaclón genética partiendo con una secuencia de ácido nucleico contenida en la secuencia de ADNc que codifica para la A-FN, o fragmento de la misma, mediante síntesis de péptidos partiendo de una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia de péptidos de la A-FN y/o fragmento de la misma.

Pueden purificarse anticuerpos monoclonales, por ejemplo, sobre una columna de afinidad sobre la cual la A-FN, o uno de sus fragmentos que contengan al epítope reconocido por dichos anticuerpos monoclonales, por ejemplo, un fragmento que comprenda o que consista del ED-A, o un fragmento de péptido del ED-A, haya sido Inmovilizado previamente. Pueden purificarse anticuerpos monoclonales mediante cromatografía sobre proteína A y/o G, seguida o no seguida de cromatografía de intercambio iónico dirigida a eliminar los contaminantes de proteína residuales, así como el ADN y el LPS, en sí mismo, seguida o no seguida de cromatografía de exclusión sobre gel de Sepharose para eliminar los agregados potenciales debido a la presencia de dímeros o de otros multímeros. La totalidad de estas técnicas pueden usarse simultáneamente o sucesivamente.

Sitio de unión al antíaeno El sitio de unión al antígeno describe la parte de una molécula que se une a y es complementarla, a la totalidad o parte del antígeno objetivo. En una molécula de anticuerpo es referido como el sitio de unión al antígeno del anticuerpo, y comprende la parte del anticuerpo que se une a y es complementaria, a la totalidad o parte del antígeno objetivo. En donde un antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse sólo a una parte particular del antígeno, cuya parte se denomina un epítope. Un sitio de unión al antígeno del anticuerpo puede ser provisto por uno o más dominios variables de un anticuerpo. Un sitio de unión al antígeno del anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada del anticuerpo (VH).

Aislado El término aislado se refiere al estado en el cual los miembros de unión específicos para su uso en la invención o el ácido nucleico que codifique para dichos miembros de unión específicos, estarán generalmente de conformidad con la presente invención. De esta manera, los miembros de unión específicos, dominios VH y/o VL de la presente invención, pueden ser provistos aislados y/o purificados, por ejemplo, de su ambiente natural, en forma sustancialmente pura u homogénea o, en el caso de un ácido nucleico, libres o sustancialmente libres del ácido nucleico o los genes de origen diferente de la secuencia que codifica para un polipéptido con la función requerida. Los miembros aislados y el ácido nucleico aislado estarán libres o sustancialmente libres de material con el cual están asociados naturalmente, tal como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los cuales se encuentran en su ambiente natural, o el ambiente en el cual son preparados (por ejemplo, cultivo de células) cuando dicha preparación es mediante la teenología de ADN recombinante puesta en práctica in vitro o in vivo. Los miembros de unión específicos y el ácido nucleico pueden formularse con diluyentes o adyuvantes, y ser aislados aún para propósitos prácticos - por ejemplo, los miembros se mezclarán normalmente con gelatina u otros vehículos si se usan para recubrir placas de microtítulo para su uso en inmunoensayos, o se mezclarán con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se usan en diagnóstico o terapia. Los miembros de unión específicos pueden ser glucosilados, ya sea naturalmente o mediante sistemas de células eucarióticas heterólogas (por ejemplo, células CHO o NSO (ECACC 85110503), o pueden ser no glucosilados (por ejemplo, si se producen mediante expresión en una célula procariótica).

Preparaciones heterogéneas que comprenden moléculas de anticuerpo pueden usarse también en la invención. Por ejemplo, dichas preparaciones pueden ser mezclas de anticuerpos con cadenas pesadas de longitud completa y cadenas pesadas que carecen de la lisina C-terminal, con varios grados de glucosilación y/o con aminoácidos derivatizados, tal como la cielización de un ácido glutámico N-terminal que forma un residuo de ácido piroglutámico.

Uno o más miembros de unión específicos para un antígeno, por ejemplo, la A-FN, el ED-A de la fibronectina, pueden obtenerse poniendo en contacto una colección de miembros de unión específicos de conformidad con la invención, y el antígeno o un fragmento del mismo, por ejemplo, un fragmento que comprenda o que consista del ED-A, o un fragmento de péptido del ED-A, y seleccionando uno o más miembros de unión específicos de la colección capaces de unirse al antígeno.

Una colección de anticuerpos puede seleccionarse usando la selección iterativa con filtro de colonias (ICFS). En la ICFS, bacterias que contienen al ADN que codifica para varias especificidades de unión se cultivan en un medio líquido y, una vez que se ha alcanzado la etapa de crecimiento exponencial, algunos billones de ellas son distribuidas sobre un soporte de crecimiento que consiste de un filtro de membrana convenientemente pre-tratado el cual es incubado hasta que aparezcan colonias bacterianas completamente confluentes. Un segundo substrato trampa consiste de otro filtro de membrana, pre-humidificado y cubierto con el antígeno deseado.

El filtro de la membrana trampa se pone entonces sobre una placa que contiene un medio de cultivo adecuado y se cubre con el filtro de crecimiento con la superficie cubierta con colonias bacterianas que apuntan hacia arriba. El sandwich obtenido de esta manera se incuba a temperatura ambiente por aproximadamente 16 horas. De esta manera, es posible obtener la expresión de los genes que codifican para el scFv de los fragmentos de anticuerpo que tienen una acción de despliegue, de modo que aquellos fragmentos que se unen específicamente con el antígeno que está presente en la membrana trampa, son atrapados. La membrana trampa se trata entonces para indicar el scFv de los fragmentos de anticuerpo unidos con téenicas colorimétricas usadas comúnmente para este propósito.

La posición de las manchas coloreadas sobre el filtro trampa permite regresar a las colonias bacterianas correspondientes que están presentes sobre la membrana de crecimiento y que producen los fragmentos de anticuerpo atrapados. Dichas colonias se obtienen y se cultivan, y las bacterias - unos cuantos millones de ellas - se distribuyen sobre una nueva membrana de cultivo, repitiendo los procedimientos descritos anteriormente. Ciclos análogos se llevan a cabo entonces hasta que las señales positivas sobre la membrana trampa correspondan a las colonias positivas individuales, cada una de las cuales representa una fuente potencial de fragmentos de anticuerpo monoclonales dirigidos contra el antígeno usado en la selección. Se describen la ICFS, por ejemplo, en el documento WO0246455.

Una colección puede ser exhibida también sobre partículas o complejos moleculares, por ejemplo, paquetes genéticos replicables tales como partículas de bacteriófagos (por ejemplo, T7), u otros sistemas de exhibición in vitro, cada partícula o complejo molecular conteniendo ácido nucleico que codifica para el dominio variable VH del anticuerpo exhibido sobre el mismo, y opcionalmente también un dominio VL exhibido, si está presente. La exhibición de fagos se describe en el documento W092/01047 y, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 y US6521404.

Después de la selección de los miembros de unión capaces de unirse al antígeno y ser exhibidos sobre el bacteriófago u otras partículas o complejos moleculares de la colección, el ácido nucleico puede ser tomado de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que exhiba dicho miembro de unión seleccionado. Dicho ácido nucleico puede usarse en la producción subsiguiente de un miembro de unión o un dominio variable VH o VL del anticuerpo mediante la expresión del ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico tomada de un bacteriófago u otra partícula o complejo molecular que exhiba dicho miembro de unión seleccionado.

Un dominio variable VH del anticuerpo con la secuencia de aminoácidos de un dominio variable VH del anticuerpo de dicho miembro de unión seleccionado, puede proveerse en forma aislada, como puede ser un miembro de unión que comprenda dicho dominio VH.

La capacidad para unirse a la A-FN, o el ED-A de la fibronectina, u otra isoforma o antígeno objetivo puede ponerse a prueba adicionalmente, por ejemplo, la capacidad para competir con el anticuerpo F8 anti-ED-A para unirse a la A-FN o un fragmento de la A-FN, por ejemplo, el ED-A de la fibronectina.

Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede unirse a la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina específicamente. Un miembro de unión específico de la presente invención puede unirse a la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina, con la misma afinidad que el anticuerpo F8 anti-ED-A, por ejemplo, en el formato del scFv, o con una afinidad que sea mejor. Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede unirse a la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina, con una KD de 3 x 108 M o una afinidad que sea mejor. De preferencia, un miembro de unión específico para su uso en la invención se une a la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina, con una KD de 2 x 108 M o una afinidad que sea mejor. Más preferiblemente, un miembro de unión específico para su uso en la invención se une a la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina, con una KD de 1.7 x 108 M o una afinidad que sea mejor. Aún más preferiblemente, un miembro de unión específico para su uso en la invención se une a la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina, con una KD de 1.4 x 108 M o una afinidad que sea mejor. Más preferiblemente, un miembro de unión específico para su uso en la invención se une a la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina, con una KD de 3 x 10~9 M o una afinidad que sea mejor.

Un miembro de unión específico de la presente invención puede unirse al mismo epítope en la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina del anticuerpo F8 anti-ED-A de la fibronectina.

Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede no mostrar unión significante alguna con moléculas diferentes de la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina. En particular, el miembro de unión específico puede no unirse a otras isoformas de la fibronectina, por ejemplo, la isoforma del ED-B y/o la isoforma del IIICS de la fibronectina.

Las variantes de las moléculas de anticuerpo descritas en la presente pueden producirse y usarse en la presente invención. Las téenicas requeridas para hacer sustituciones dentro de las secuencias de aminoácidos de las CDRs, los dominios VH o VL del anticuerpo, en particular las regiones de estructura de los dominios VH y VL, y los miembros de unión, generalmente están disponibles en la técnica. Pueden obtenerse secuencias variantes, con sustituciones que puede predecirse o no tienen un efecto mínimo o benéfico sobre la actividad, y pueden ponerse a prueba para su capacidad para unirse a la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina, y/o para alguna otra propiedad deseada.

Las variantes de las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL cuyas secuencias se describen específicamente en la presente, pueden usarse de conformidad con la presente invención, según se discute. Las variantes particulares pueden incluir una o más alteraciones de la secuencia de aminoácidos (adición, deleción, sustitución y/o inserción de un residuo de aminoácido), pueden tener menos de aproximadamente 20 alteraciones, menos de aproximadamente 15 alteraciones, menos de aproximadamente 10 alteraciones o menos de aproximadamente 5 alteraciones, que pueden ser 5, 4, 3, 2 o 1. Las alteraciones pueden hacerse en una o más regiones de estructura y/o una o más CDRs. Las alteraciones normalmente no darán como resultado pérdida de función, de modo que un miembro de unión específico que comprenda una secuencia de aminoácidos alterada de esta manera puede retener una capacidad para unirse a la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina. Por ejemplo, puede retener la misma unión cuantitativa que un miembro de unión específico en el cual la alteración no se hace, por ejemplo, según se mide en una prueba descrita en la presente. El miembro de unión específico que comprende una secuencia de aminoácidos alterada de esta manera puede tener una capacidad mejorada para unirse a la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina. Por ejemplo, un miembro de unión específico que se une a la isoforma del ED-A o el ED-A de la fibronectina, como es referido en la presente, puede comprender el dominio VH mostrado en SEQ ID NO: 7 y el dominio VL mostrado en SEQ ID NO: 8 con 10 o menos, por ejemplo, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoácido dentro de la región de estructura del dominio VH y/o VL. Dicho miembro de unión específico puede unirse a la isoforma del ED-A o el ED-A de la fibronectina, con la misma o sustancialmente la misma afinidad que el miembro de unión específico que comprende el dominio VH mostrado en SEQ ID NO: 7 y el dominio VL mostrado en SEQ ID NO: 8, o puede unirse a la isoforma del ED-A o el ED-A de la fibronectina, con una afinidad mayor que un miembro de unión específico que comprenda el dominio VH mostrado en SEQ ID NO: 7 y el dominio VL mostrado en SEQ ID NO: 8.

Regiones de VH o VL novedosas que poseen secuencias derivadas de la CDR para su uso en la invención, pueden generarse usando la mutagénesis aleatoria de uno o más genes de VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones dentro del dominio variable entero. En algunas modalidades, una o dos sustituciones de aminoácido se hacen dentro del dominio variable entero o serie de CDRs. Otro método que puede usarse es dirigir la mutagénesis hacia las regiones CDR de genes de VH o VL.

Como se indicó anteriormente, una secuencia de aminoácidos de la CDR sustancialmente como se expone en la presente, puede ser llevada como una CDR en un dominio variable de anticuerpo humano o una porción sustancial del mismo. Las secuencias de HCDR3 sustancialmente como se expone en la presente representan modalidades de la presente Invención y, por ejemplo, cada una de estas puede ser llevada como una HCDR3 en un dominio variable de cadena pesada humana o una porción sustancial del mismo.

Los dominios variables usados en la invención pueden obtenerse o pueden derivarse de cualquier dominio variable humano reordenado o de la línea germinal, o puede ser un dominio variable sintético basado en las secuencias consenso o real de dominios variables humanos conocidos. Un dominio variable puede derivarse de un anticuerpo no humano. Una secuencia de la CDR para su uso en la invención (por ejemplo, CDR3), puede ser introducida en un repertorio de dominios variables que carezcan de una CDR (por ejemplo, CDR3), usando la teenología de ADN recombinante. Por ejemplo, Marks et al. (1992) describen métodos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpo en los cuales iniciadores consenso dirigidos en o adyacentes al extremo 5' del área del dominio variable, se usan en conjunto con iniciadores consenso hacia la tercera región de estructura de genes de VH humanos para proveer un repertorio de dominios variables de VH que carecen de una CDR3. Marks et al. describen además cómo este repertorio puede combinarse con una CDR3 de un anticuerpo particular. Mediante el uso de técnicas análogas, las secuencias derivadas de ia CDR3 de la presente invención pueden ser entremezcladas con repertorios de dominios VH o VL que carecen de una CDR, y los dominios VH o VL completos entremezclados combinados con un dominio VL o VH cognado proveen miembros de unión para su uso en la invención. El repertorio puede ser exhibido entonces en un sistema de hospedero adecuado tal como el sistema de exhibición de fagos del documento W092/01047, o cualquiera de un gran cuerpo de literatura subsiguiente, que incluye a Kay, Winter y McCafferty (1996), de modo que pueden seleccionarse miembros de unión adecuados. Un repertorio puede consistir de cualquiera de 104 miembros individuales hacia arriba, por ejemplo, por lo menos 105, por lo menos 106, por lo menos 107, por lo menos 108, por lo menos 109 o por lo menos 1010 miembros.

De igual manera, una o más, o las tres CDRs, pueden ser injertadas en un repertorio de dominios VH o VL que sean seleccionados entonces para un miembro de unión o miembros de unión para la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina.

Pueden usarse una o más de las HCDR1, HCDR2 y HCDR3 del anticuerpo F8 o la serie de HCDRs del anticuerpo F8, y/o pueden usarse una o más de las LCDR1, LCDR2 y LCDR3 del anticuerpo F8 de la serie de LCDRs del anticuerpo F8.

De igual manera, pueden usarse otros dominios VH y VL, series de CDRs y series de HCDRs y/o series de LCDRs descritas en la presente.

La A-FN y/o el ED-A de la fibronectina pueden usarse en una selección para miembros de unión específicos, por ejemplo, moléculas de anticuerpo, para su uso en la preparación de un medicamento para e! tratamiento de la IBD. La selección puede ser una selección de un repertorio como se describe en otra parte en la presente.

Una porción sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina puede comprender por lo menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones de estructura intermedias. La porción puede incluir también por lo menos aproximadamente 50% de cualquiera o ambas de la primera y cuarta regiones de estructura, siendo el 50% el 50% C-terminal de la primera región de estructura, y el 50% N-terminal de la cuarta reglón de estructura. Residuos adicionales en el extremo N-termlnal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable, pueden ser aquellos no asociados normalmente con las regiones del dominio variable de ocurrencia natural. Por ejemplo, la construcción de los miembros de unión específicos de la presente invención obtenidos mediante las téenicas de ADN recombinante, puede dar como resultado la introducción de residuos N- o C-terminales codificados por enlazadores introducidos que facilitan la clonación u otros pasos de manipulación. Otros pasos de manipulación incluyen la introducción de enlazadores que unen los dominios variables descritos en otra parte en la presente, con otras secuencias de proteína que incluyen regiones constantes de anticuerpo, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de cuerpos bivalentes) o marcadores detectables/funcionales como se discute en más detalle en otra parte en la presente.

Aunque los miembros de unión específicos pueden comprender un par de dominios VH y VL, dominios de unión individuales basados en secuencias de dominio VH o VL pueden usarse también en la invención. Se sabe que los dominios de inmunoglobulina individuales, especialmente los dominios VH, son capaces de unirse a antígenos objetivo en una manera específica. Véase, por ejemplo, la discusión de los dAbs anterior.

En el caso de cualquiera de los dominios de unión individuales, estos dominios pueden usarse para seleccionar para dominios complementarios capaces de formar un miembro de unión de dos dominios capaz de unirse a la A-FN y/o el ED-A de la fibronectina. Esto puede lograrse mediante métodos de selección de exhibición de fagos usando el denominado procedimiento combinatorio doble jerárquico como se describe en el documento W092/01047, en el cual una colonia individual que contiene un clon de la cadena H o L se usa para infectar a una colección completa de clones que codifican para la otra cadena (L o H), y el miembro de unión de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con técnicas de exhibición de fagos tales como las descritas en esa referencia. Esta técnica se describe también en Marks 1992.

Los miembros de unión específicos para su uso en la presente invención pueden comprender además regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas, por ejemplo, regiones constantes de anticuerpo humano o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL puede ser unido en su extremo C-terminal con los dominios constantes de cadena ligera de anticuerpo incluyendo las cadenas CK O C humanas, por ejemplo, C . De igual manera, un miembro de unión específico basado en un dominio VH puede ser unido en su extremo C-terminal con la totalidad o parte (por ejemplo, un dominio CH1) de una cadena pesada de ¡nmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM, y cualquiera de las subclases de isotipos, en particular IgGl e IgG4. Cualquier región sintética u otra región constante variante que tenga estas propiedades y estabilice a las regiones variables, es también útil en las modalidades de la presente invención.

Los miembros de unión específicos para su uso en la invención pueden ser marcados con un marcador detectable o funcional. Un marcador puede ser cualquier molécula que produzca o pueda ser inducida para que produzca una señal Incluyendo, pero no limitado a, agentes fluorescentes, marcas radiactivas, enzimas, agentes quimioluminiscentes o fotosensibilizadores. De esta manera, la unión puede detectarse y/o medirse detectando la fluorescencia o luminiscencia, radiactividad, actividad enzimátlca o absorbancia de luz. Los marcadores detectables pueden ser unidos a anticuerpos para su uso en la invención usando química convencional conocida en la téenica.

Existen numerosos métodos por los cuales el marcador puede producir una señal detectable mediante medios externos, por ejemplo, mediante examen visual, radiación electromagnética, calor y reactivos químicos. El marcador puede ser unido también a otro miembro de unión específico que se une al anticuerpo para su uso en la invención, o a un soporte.

Los miembros de unión específicos marcados, por ejemplo, scFv marcado con un marcador detectable, pueden usarse para diagnóstico in vivo, ex vivo o in vitro, y/o terapéuticamente.

Por ejemplo, los miembros de unión radiomarcados (por ejemplo, miembros de unión conjugados con un radioisótopo) pueden usarse en radiodiagnóstico y radioterapia. Los radioisótopos que pueden ser conjugados con un miembro de unión para su uso en la invención, incluyen isótopos tales como 94mTc, 99mTc, 186Re, 188Re, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 47Sc, mIn, 97Ru, 62Cu, 64Cu, 86Y, 88g, 90y, 121Sn, 161Tb, 153Sm, 166Ho, 105Rh, 177Lu, 123I, 124I, 125I, 131I, 18F, 211At y 225Ac. De preferencia, se usan emisores de positrones, tales como 18F y 124I, o emisores gamma, tales como 99mTc, mn y 123I, para aplicaciones de diagnóstico (por ejemplo, para PET), mientras que se usan de preferencia emisores beta, tales como 1311, 90Y y 177Lu, para aplicaciones terapéuticas. Emisores alfa, tales como 2uAt y 225Ac, pueden usarse también para terapia.

Por ejemplo, un miembro de unión específico para su uso en la invención marcado con un marcador detectable, puede usare para detectar, diagnosticar o monitorear la IBD en un humano o animal.

Un miembro de unión específico de la presente invención puede usarse en la fabricación de un producto de diagnóstico para su uso en el diagnóstico de la IBD.

Un conjugado o fusión entre un miembro de unión para su uso en la invención y una molécula que ejerce un efecto biocida, inmunosupresor citotóxico o antiinflamatorio sobre células objetivo en las lesiones y un anticuerpo dirigido contra un componente de la matriz extracelular el cual está presente en dichas lesiones, puede usarse en la presente invención. Por ejemplo, la molécula conjugada puede ser ¡nterleucina-10. Dichos conjugados pueden usarse terapéuticamente, por ejemplo, para el tratamiento de la IBD como es referido en la presente.

La producción y el uso de fusiones o conjugados de miembros de unión específicos con moléculas biocidas o citotóxicas se describen, por ejemplo, en el documento WOOl/62298.

El miembro de unión específico para su uso en la invención puede ser un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto antiinflamatorio sobre células objetivo mediante interacción celular, una molécula antiinflamatorla, una citocina, por ejemplo IL-10, y (ii) un miembro de unión específico para la isoforma del ED-A de la fibronectina y/o el ED-A de la fibronectina.

Un miembro de unión específico para su uso en la invención puede ser un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto inmunosupresor o antiinflamatorio, y (ii) un miembro de unión específico para la isoforma del ED-A de la fibronectina y/o el ED-A de la fibronectina.

El miembro de unión específico para uso en la invención es de preferencia un conjugado de (i) interleucina-10 (IL-10) y (ii) un miembro de unión específico para la isoforma del ED-A de la fibronectina y/o el ED-A de la fibronectina. Dicho miembro de unión específico es útil en los aspectos de la invención descritos en la presente que se refieren al tratamiento de la IBD.

Descrito también en la presente, es un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre células objetivo mediante interacción celular, o un efecto inmunosupresor o antiinflamatorio, y (ii) un miembro de unión para la isoforma del ED-A de la fibronectina y/o el ED-A de la fibronectina. Dicho conjugado comprende de preferencia una proteína de fusión que comprende la molécula biocida, citotóxica, inmunosupresora o antiinflamatoria y dicho miembro de unión o, en donde el miembro de unión es una proteína de fusión de dos cadenas o de cadenas múltiples que comprende la molécula biocida, citotóxica, inmunosupresora o antiinflamatoria y un componente de la cadena de polipéptidos de dicho miembro de unión. De preferencia, el miembro de unión es un polipéptido de cadena sencilla, por ejemplo, una molécula de anticuerpo de cadena sencilla, tal como scFv.

Un conjugado, como es referido en la presente, puede ser expresado como una proteína de fusión. De esta manera, una proteína de fusión que comprende la molécula inmunosupresora o antiinflamatoria y una molécula de anticuerpo de Fv de cadena sencilla, puede usarse en la invención.

La molécula ¡nmunosupresora o antünflamatorla que ejerce su efecto sobre células objetivo mediante interacción celular, puede interactuar directamente con las células objetivo, puede interactuar con un receptor unido a la membrana sobre la célula objetivo, o perturbar el potencial electroquímico de la membrana celular. De preferencia, la molécula es IL-10.

De preferencia, la molécula que es conjugada con el miembro de unión específico es IL-10.

Como se discute además más adelante, el miembro de unión específico para su uso en la invención es de preferencia una molécula de anticuerpo o comprende un sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Convenientemente, el miembro de unión específico puede ser un polipéptido de cadena sencilla, tal como un anticuerpo de cadena sencilla. Esto permite la producción conveniente de una proteína de fusión que comprenda un anticuerpo de cadena sencilla y, por ejemplo, una molécula ¡nmunosupresora o antiinflamatoria (por ejemplo, interleucina-10 o TGF beta). Un sitio de unión al antígeno del anticuerpo puede proveerse por medio de la asociación de un dominio VH del anticuerpo y un dominio VL del anticuerpo en polipéptidos separados, por ejemplo, en un anticuerpo bivalente o en un fragmento de anticuerpo tal como Fab o cuerpo bivalente. En donde el miembro de unión específico es una molécula de dos cadenas o de cadenas múltiples (por ejemplo, Fab o anticuerpo entero, respectivamente), una molécula ¡nmunosupresora o antiinflamatoria, por ejemplo, puede ser conjugada como un polipéptido de fusión con una o más cadenas de polipéptidos en el miembro de unión específico.

El miembro de unión específico puede ser conjugado con la molécula ¡nmunosupresora o antiinflamatoria por medio de un enlace peptídico, es decir, dentro de un polipéptido de fusión que comprenda dicha molécula y el miembro de unión específico o un componente de la cadena de polipéptidos del mismo (véase, por ejemplo, Trachsel et al.). Otros medios para la conjugación incluyen la conjugación química, especialmente entrelazamiento usando un reactivo bifuncional (por ejemplo, usando la guía de selección de reactivos de entrelazamiento DOUBLE-REAGENTS™, de Pierce).

Provisto también es un ácido nucleico aislado que codifica para un miembro de unión específico para su uso en la presente invención. El ácido nucleico puede incluir ADN y/o ARN. Un ácido nucleico puede codificar para una CDR o serie de CDRs o dominio VH o dominio VL o sitio de unión al antígeno del anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG, por ejemplo, IgGl, como se definió anteriormente. Las secuencias de nucleótidos pueden codificar para los dominios VH y/o VL descritos en la presente.

Descritos además en la presente, son construcciones en la forma de plásmidos, vectores, o cassettes de transcripción o expresión que comprenden por lo menos un polinucleótido ¡ como se describió anteriormente.

Provista también es una célula hospedera recombinante que comprende una o más construcciones como se describió anteriormente. Se describe un ácido nucleico que codifica para una CDR o serie de CDRs o dominio VH o dominio VL o un sitio de unión al antígeno del anticuerpo o molécula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgGl o IgG4 como se provee, y es un método de producción del producto codificado, cuyo método comprende la expresión del ácido nucleico codificante. La expresión puede lograrse convenientemente mediante el cultivo, bajo condiciones apropiadas, de células hospederas recombinantes que contienen al ácido nucleico. Después de la producción mediante la expresión de un dominio VH o VL, el miembro de unión específico puede ser aislado y/o purificado usando cualquier téenica adecuada, y usado entonces según sea apropiado.

Un ácido nucleico puede comprender ADN o ARN, y puede ser completamente o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia de nucleótidos como se expone en la presente abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada en la cual la U sustituye a la T, a menos que el contexto lo requiera de otra manera.

Se describe también un método de producción de un dominio variable VH de anticuerpo, el método incluyendo causar la expresión del ácido nucleico codificante. Dicho método puede comprender cultivar células hospederas bajo condiciones para la producción de dicho dominio variable VH de anticuerpo.

Un método de producción puede comprender un paso de aislamiento y/o purificación del producto. Un método de producción puede comprender formular el producto en una composición que incluya por lo menos un componente adicional, tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células hospederas, son bien conocidos. Células hospederas adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, células de plantas, hongos filamentosos, levaduras y sistemas de baculovirus, y plantas y animales transgénicos. La expresión de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en células procarióticas, está bien establecido en la técnica. Para una revisión véase, por ejemplo, Plückthun (1991), Bio/Technology 9: 545-551. Una bacteria hospedera común es F. co/i.

La expresión en células eucarióticas en cultivo está también disponible para los expertos en la técnica como una opción para la producción de un miembro de unión específico, por ejemplo, como se describe en Chadd et ai (2001), Current Opinión in Biotechnology 12: 188-194); Andersen et ai (2002) Current Opinión in Biotechnology 13: 117; y Larrick y Thomas (2001) Current Opinión in Biotechnology 12: 411-418. Líneas de células de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo, incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células de melanoma de ratón NS0, células de mieloma de rata YB2/0, células de riñón embrionario humano, células de retina embrionaria humana, y muchas otras.

Pueden seleccionarse o construirse vectores adecuados que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias de promotor, secuencias de terminador, secuencias de poliadenilación, secuencias de intensificador, genes marcadores y otras secuencias, según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, por ejemplo, fagémidos, o virus, por ejemplo, "fagos", según sea apropiado. Para más detalles véase, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual·. 3a. edición, Coid Spring Harbor Laboratory Press. Muchas téenicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, así como en mutagénesis, secuenciación, introducción de ADIM en células y expresión génica, y análisis de proteínas, se describen en detalle en Ausubel et al· (1999) 4a. ed., Short Protoco/s in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protoco/s in Molecular Biology, John Wilcy & Sons.

Una célula hospedera puede contener un ácido nucleico como se describe en la presente. Dicha célula hospedera puede estar in vitro y puede estar en cultivo. Dicha célula hospedera puede estar in vivo. In vivo, la presencia de la célula hospedera puede permitir la expresión intracelular de un miembro de unión para su uso en la presente invención como "intracuerpos" o anticuerpos intracelulares. Los intracuerpos pueden usarse para terapia génica.

Se describe también un método que comprende introducir un ácido nucleico descrito en la presente en una célula hospedera. La introducción puede usar cualquier técnica disponible. Para células eucarióticas, técnicas adecuadas pueden incluir las técnicas de transfección con fosfato de calcio, DEAE-Dextrán, electroporación, transfección mediada por liposomas, y transducción usando retrovirus y otros virus, por ejemplo, virus de la vaccinia o, para células de insecto, baculovirus. El ácido nucleico que se introduce en la célula hospedera, en particular una célula eucariótica, puede usar un sistema viral o un sistema basado en plásmidos. El sistema basado en plásmidos puede ser mantenido episómicamente, o puede ser incorporado en la célula hospedera o en un cromosoma artificial. La incorporación puede ser mediante la integración aleatoria o focalizada de una o más copias en loci individuales o múltiples. Para células bacterianas, técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección usando bacteriófagos.

La introducción puede ir seguida de que se cause o se permita la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células hospederas bajo condiciones para la expresión del gen. La purificación del producto expresado puede lograrse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.

El ácido nucleico puede ser integrado en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula hospedera. La integración puede ser promovida mediante la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de conformidad con téenicas estándar.

Se describe también un método que comprende el uso de una construcción como se estableció anteriormente, en un sistema de expresión que expresa un miembro de unión específico o polipéptido como se indicó anteriormente.

Miembros de unión específicos para su uso en la presente invención, son diseñados para su uso en métodos de diagnóstico o tratamiento en sujetos humanos o animales, por ejemplo, humano. Los miembros de unión específicos para su uso en la invención, pueden usarse en el diagnóstico o el tratamiento de la IBD.

Por consiguiente, la invención provee métodos de tratamiento que comprenden la administración de un miembro de unión específico como se describió, composiciones farmacéuticas que comprenden dicho miembro de unión específico, y el uso de dicho miembro de unión específico en la fabricación de un medicamento para administración, por ejemplo, en un método de producción de un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el miembro de unión específico con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y serán adaptados por el experto en la técnica como una función de la naturaleza y del modo de administración de los compuestos activos elegidos.

Los miembros de unión específicos para su uso en la presente invención serán administrados usualmente en la forma de una composición farmacéutica, la cual puede comprender por lo menos un componente además del miembro de unión específico. De esta manera, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente, y para su uso de conformidad con la presente invención pueden comprender, además del ingrediente activo, un excipiente, vehículo, regulador de pH, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos materiales deben ser no tóxicos y no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de administración, la cual puede ser oral, inhalada o por inyección, por ejemplo, intravenosa.

Composiciones farmacéuticas para administración oral tales como, por ejemplo, nanocuerpos, etc., son también contempladas en la presente invención. Dichas formulaciones orales pueden estar en la forma de tableta, cápsula, polvo, líquido o semisólido. Una tableta puede comprender un vehículo sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas comprenden generalmente un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse una solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para inyección intravenosa, o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable la cual está libre de pirógenos y tiene pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos con aptitud relevante en la téenica son capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer o inyección de Ringer lactada. Pueden usarse conservadores, estabilizadores, reguladores de pH, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. Muchos métodos para la preparación de formulaciones farmacéuticas son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, concurrentemente o secuencialmente, o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, dependiendo de la condición que se va a tratar.

Un miembro de unión específico para su uso en la presente invención puede usarse como parte de una terapia de combinación en conjunto con un componente medicinal adicional. Los tratamientos de combinación pueden usarse para proveer efectos sinérgicos significantes, en particular la combinación de un miembro de unión específico para su uso en la presente invención con uno o más de otros fármacos. Un miembro de unión específico para su uso en la presente invención puede administrarse concurrentemente o secuencialmente o como una preparación combinada con otro agente o agentes terapéuticos, para el tratamiento de una o más de las condiciones enlistadas en la presente.

Por ejemplo, un miembro de unión específico para su uso en la invención puede usarse en combinación con un agente terapéutico existente para el tratamiento de la IBD.

Un miembro de unión específico para su uso en la invención y uno o más de los componentes medicinales adicionales anteriores, pueden usarse en la fabricación de un medicamento. El medicamento puede ser para administración separada o combinada a un individuo, y por consiguiente puede comprender el miembro de unión específico y el componente adicional como una preparación combinada o como preparaciones separadas. Pueden usarse preparaciones separadas que faciliten la administración separada y secuencial o simultánea, y que permitan la administración de los componentes mediante vías diferentes, por ejemplo, mediante la administración parenteral y oral.

De conformidad con la presente invención, las composiciones provistas pueden administrarse a mamíferos. La administración puede ser en una "cantidad terapéuticamente efectiva", siendo esta suficiente para mostrar beneficio para un paciente. Dicho beneficio puede ser por lo menos mejora de por lo menos un síntoma. De esta manera, el "tratamiento de la IBD" se refiere a la mejora de por lo menos un síntoma. La cantidad real administrada, y la tasa y el curso de tiempo de la administración, dependerá de la naturaleza y la severidad de lo que está siendo tratado, el mamífero particular que está siendo tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro de la composición, el tipo de miembro de unión específico, el método de administración, el plan de administración y otros factores conocidos por los médicos generales. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificación, etc., están dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros médicos, y pueden depender de la severidad de los síntomas y/o la progresión de la enfermedad que está siendo tratada. Dosis apropiadas de anticuerpos son bien conocidas en la téenica (Ledermann et ai. (1991) Int. J. Cáncer 47: 659-664; y Bagshawe et al (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). Pueden usarse las dosificaciones específicas indicadas en la presente, o en la Physician's Desk Reference (2003), según sea apropiado para el tipo de medicamento que está siendo administrado. Una cantidad terapéuticamente efectiva o dosis adecuada de un miembro de unión específico para su uso en la invención, puede determinarse comparando su actividad in vitro y actividad in vivo en un modelo animal. Se conocen métodos para la extrapolación de dosificaciones efectivas en ratones y otros animales de prueba a humanos. La dosis precisa dependerá de muchos factores, que incluyen si el anticuerpo es para diagnóstico, prevención o para tratamiento, el tamaño y la ubicación del área que se va a tratar, la naturaleza precisa del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo entero, fragmento o cuerpo bivalente), y la naturaleza de cualquier marcador detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis de anticuerpo típica estará en la escala de 100 mg a 1 g para aplicaciones sistémicas, y 1 pg a 1 mg para aplicaciones tópicas. Puede administrarse una dosis de carga mayor inicial, seguida de una o más dosis menores. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo entero, por ejemplo, el isotipo IgGl o IgG4. Esta es una dosis para un tratamiento individual de un paciente adulto, la cual puede ser proporcionalmente ajustada para niños e infantes, y ajustada también para otros formatos de anticuerpo en proporción al peso molecular. Los tratamientos pueden repetirse a intervalos diarios, dos veces por semana, semanalmente o mensualmente, a la discreción del médico. Los tratamientos pueden ser cada dos a cuatro semanas para administración subcutánea, y cada cuatro a ocho semanas para administración intravenosa. En algunas modalidades de la presente invención, el tratamiento es periódico, y el período entre las administraciones es aproximadamente dos semanas o más, por ejemplo, aproximadamente tres semanas o más, aproximadamente cuatro semanas o más, o aproximadamente una vez al mes. En otras modalidades de la invención, el tratamiento puede darse antes, y/o después de una cirugía, y puede administrarse o aplicarse directamente en el sitio anatómico del tratamiento quirúrgico.

Enfermedad inflamatoria del intestino (?BR? La enfermedad inflamatoria del intestino es un grupo de condiciones inflamatorias que afectan el colon y el intestino delgado. Los tipos principales de IBD son la enfermedad de Crohn (CD) y la colitis ulcerosa (UC), mientras que otros tipos de IBD incluyen colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis diverticular, enfermedad de Behget y colitis indeterminada. La CD puede afectar a cualquier parte del tracto gastrointestinal, mientras que la UC se restringe típicamente al colon y recto.

La IBD, como es referida en la presente, puede ser CD, UC, colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis diverticular, enfermedad de Behget o colitis indeterminada. En particular, los términos CD, UC, colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis diverticular, enfermedad de Behget y colitis indeterminada, como se usan en la presente, pueden referirse a CD activa, UC activa, colitis colagenosa activa, colitis linfocítica activa, colitis isquémica activa, colitis diverticular activa, enfermedad de Behget activa y colitis indeterminada activa, respectivamente. En una modalidad, la IBD puede ser CD o UC. En otra modalidad, la IBD puede ser CD, colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis diverticular, enfermedad de Behget o colitis indeterminada. En otra modalidad, la IBD no es UC. La IBD puede ser una IBD que no se restringe típicamente a inflamación en el colon y el recto, tal como CD. La IBD puede ser una IBD que no afecta sólo el revestimiento del colon. En una modalidad preferida, la IBD es CD. Más preferiblemente, la IBD es CD activa.

Otros aspectos y modalidades de la invención serán evidentes para los expertos en la téenica dada la presente descripción que incluye la siguiente ejemplificación experimental.

Todos los documentos mencionados en esta especificación se incorporan enteramente en la presente como referencia.

El término "y/o", en donde se use en la presente, se considerará como una descripción específica de cada uno de los dos componentes o características especificados, con o sin el otro. Por ejemplo, se considerará a "A y/o B" como una descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, tal como si cada uno se expone individualmente en la presente.

A menos que el contexto indique de otra manera, las descripciones y definiciones de los rasgos expuestos anteriormente no se limitan a algún aspecto o modalidad particular de la invención, y se aplican igualmente a todos los aspectos y modalidades que se describen.

Ciertos aspectos y modalidades de la invención se ilustrarán ahora por medio de ejemplo y con relación a las figuras descritas anteriormente.

Sección experimental Materiales v metodos Modelo de IBP de ratón Modelos para IBD de ratón que incluyen la administración de DSS, se conocen en la téenica. Un modelo de ratón adecuado se describe también, por ejemplo, en Okayasu et al. (1990), Gastroenterology, 98, 694-702.

Para los experimentos descritos en la presente, se indujo colitis en ratones C57BL/6 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) mediante la inclusión de sulfato sódico de dextrán (DSS) a 3% (MP BioMedicals) en el agua de beber por 7 días, seguida de 3 a 5 días de agua de beber normal. Se les dio a ratones control agua estándar durante el curso del estudio. Se monitoreó a los ratones para inducción/progresión de la enfermedad, como es evidenciado por un hemocultivo en los días 3 a 5, así como por el cambio de peso diario. Se sometió a los ratones a eutanasia en varios tiempos 3 a 5 días después del cese del DSS en el agua para evaluar la focalización, localización y efectos farmacológicos de F8-IL-10.

Radiovodación de 125I-F8/IL10, purificación, caracterización v preparación de la solución de dosificación Se preparó 125I-F8/IL10 usando yodobenzoato de succinimidilo (SIB) (Zalutsky y Narula (1988) Cáncer Research, 48, 1446-1450; Zalutsky y Narula (1987) Appl. Radiat. Isot. 38, 1051-1055; Cheng, et al. (2002) 1 Med. Chem. 45, 3048-3056). En resumen, una alícuota de yodo 125 (20 mL, ~2.0 mCi) (Perkin Elmer, Waltham, MA) se hizo reaccionar con 2.5 mg de benzoato de N-succinimidil-3-(tri-n-butilestanilo) (C23H35N04Sn; PM = 508.23, sintetizado por Texas Biochemicals, Inc. College Station, TX), junto con 10 pg de NCS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) como un oxidante en 50 mL de metanol conteniendo ácido acético a 1.5% (v:v) (ambos de Sigma-Aldrich). Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, el oxidante restante en la solución de reacción se extinguió mediante la adición de 10 pg de bisulfato de sodio (agente reductor) (Sigma-Aldrich), y se incubó a temperatura ambiente por otros 5 minutos. El SIB marcado con 125I se conjugó con el anticuerpo F8-IL10 (~ 0.2 mg, con una relación molar de partida de aproximadamente 2.5:1 para el intermediario por anticuerpo) mediante incubación a temperatura ambiente por 20 minutos a pH 8.0. El producto radiomarcado (125I-F8/IL10) se purificó usando una columna PD-10 pre-balanceada (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino unido) (los sitios de unión a proteína no específicos potenciales en la columna se saturaron usando albúmina de suero de bovino, seguida de enjuague de la columna con por lo menos tres volúmenes de columna de PBS), eluida en PBS. Se obtuvo un rendimiento radioquímico de aproximadamente 30%.

La pureza radioquímica (RCP) y bioactividad de 125I-F8/IL10 se caracterizaron por medio de un cromatograma de exclusión por tamaño (SEC) y columna de afinidad por EDA, respectivamente. Para el análisis con SEC, aproximadamente 1 pCi de solución del producto 125I-F8/IL10 se inyectó en la CLAR (Agilent 1100, equipada con un detector radiactivo en línea) equipada con una columna de exclusión por tamaño (G3000SWxl, TOSOH Biosciences, Tokio, Japón) y eluida con una magnitud de flujo de 1 mL por minuto con solvente móvil de regulador de pH de fosfato 25 mM, NaCI 0.15 M, pH 6.8. La identidad de 125I-F8/IL10 se confirmó comparando su tiempo de retención en un cromatograma radiométrico con el de la referencia F8/IL10 en un cromatograma UV (280 nm). Una RCP de más de 99% se obtuvo para 125I-F8/IL10, con una actividad específica radiactiva de aproximadamente 4.5 mCi/mg.

La bioactividad de 125I-F8-IL10 se determinó por medio de una prueba en columna de afinidad por EDA. En resumen, una alícuota (aproximadamente 1 pCi) de 125I-F8/IL10 se cargó sobre una columna de afinidad por EDA pre-balanceada (conteniendo 250 mL de resina de EDA, el pre-balance se llevó a cabo bloqueando los sitios de unión no específicos con 2 mL de BSA, 2 mg/mL en PBS, y entonces lavando la columna con 8 mL de PBS). La columna de afinidad se lavó con 6 mL de BSA (2 mg/mL en PBS), y el eluato se colectó fraccionalmente. La radiactividad en el eluato colectado y que quedó sobre la columna de afinidad, se midió en un contador gamma. Se calculó el porcentaje de radiactividad retenida en la columna de EDA-resina, de la radiactividad cargada total. Un porcentaje de 64% de radiactividad retenida en la columna de afinidad se obtuvo para 125I-F8/IL10.

Las soluciones de dosificación usadas para los estudios de PK y de distribución en los tejidos se prepararon mezclando 125I-F8/IL10 con F8/IL10 no marcado (solución de repuesto de F8/IL10) y regulador de pH de formulación, a la concentración final requerida. La solución del artículo de prueba se preparó en el día de la dosificación y se llevó a temperatura ambiente antes de su administración a los animales.

Biodistribución v localización de 125I-F8/IL10 hacia el colon en el modelo de ratón con IBP Ratones no tratados y tratados con DSS fueron tratados con yoduro de potasio (KI) y agua (20 mM), aproximadamente 2 a 4 días antes de la dosificación (días 5 a 7 después del inicio de la DSS), para bloquear la absorción de la tiroides de cualquier 1-125 libre no unido potencial generado in vivo. En el día 9 después del Inicio del tratamiento con DSS, una dosis individual de 125I- F8/IL10 se administró por vía intravenosa (IV). La dosis y la radiactividad por grupo se esbozan a continuación: i) Grupo 0 - dosis aproximada por ratón: 5 mg/kg ii) Grupo 0 - radiactividad aproximada por ratón: 7.5 pCi (actividad específica, 75 pCi/mg). ii) Grupo 1 - dosis aproximada por ratón: 5 mg/kg Grupo 1 - radiactividad aproximada por ratón: 10 pCi (actividad específica, 100 pCi/mg). ¡ii) Grupo 2 - dosis aproximadas por ratón: 0.15 mg/kg Grupo 2 - radiactividad aproximada por ratón: 12 pCi (actividad específica, 4490 pCi/mg).

Subgrupos de ratones fueron sangrados a 5 minutos, 1, 3, 6, 24, 48 y 96 horas, y entonces se colectaron varios tejidos. Se colectaron muestras de sangre ya sea mediante punción cardiaca o sangría retro-orbital en tubos de colecta con separador de suero. Se cosecharon muestras de suero mediante centrifugación de las muestras de sangre a 10,000 g por 5 minutos. Para la colecta de tejidos se sacrificó al animal, y los tejidos de interés se colectaron inmediatamente después del muestreo de la sangre y perfusión del cuerpo entero. La perfusión de la sangre del cuerpo entero se llevó a cabo administrando aproximadamente 20 mL de heparina-PBS (25 unidades por mL) por aproximadamente 10 minutos. Los tejidos de interés de cerebro, nodulos linfáticos mesentéricos, piel, grasa, músculo esquelético del muslo, pulmón, corazón, bazo, hígado, estómago, intestino delgado, intestino grueso y riñón se colectaron y se pesaron. Se removió el contenido en el GI. Se midió directamente la radiactividad (conteos totales en cpm) de las muestras de tejido mediante un contador gamma.

Autorradioarafía del colon de ratones sanos v enfermos Se llevó a cabo autorradiografía del colon en cólones de ratones del grupo 0 y el grupo 2. Se cosecharon los cólones, se removió su contenido, y se expuso el tejido a una pantalla de formación de imágenes luminiscentes (Molecular Dynamics) por 24 horas, y se representó con una imagen por medio de Storm 860. Los resultados se muestran en la figura 2. Campo 1: colon cosechado a 6 horas post-inyección del grupo 0 (ratón sano); campo 2: colon cosechado a 6 horas post-inyección del grupo 2 (ratón tratado con DSS); campo 3: colon cosechado a 24 horas postinyección del grupo 0 (ratón sano); campo 4: colon cosechado a 24 horas post-inyección del grupo 2 (ratón tratado con DSS). Se observó la localización desigual de 125I-F8/IL10 a lo largo del colon en los ratones tratados con DSS y no en los ratones normales, consistente con la inflamación colónica irregular y el perfil de expresión asociado del ED-A objetivo en este modelo.

Determinación de las concentraciones equivalentes radiactivas en el suero v los tejidos, v cálculos farmacocineticos La concentración equivalente (ng eq./g) de I-F8/IL10 en el suero se estimó con base en la radiactividad medida (asociada con proteína) precipitable con TCA (ácido tricloroacético). Para la precipitación con TCA, una alícuota (50 pL) de la muestra de suero se mezcló con 50 mL de suero de ratón, seguida de la adición de 100 pL de solución de TCA a 20%. La mezcla de la muestra se centrifugó a 10,000 g por 5 minutos para precipitar la proteína. Se determinó la radiactividad total y soluble en el TCA en el sobrenadante. La radiactividad precipitable con el TCA (cpm) en una muestra dada, la actividad específica de la solución de dosificación (cpm precipltables con TCA por mg de proteína), así como las fechas de las mediciones de la solución de muestra (ts) y dosificación (tD), se usaron para calcular la concentración equivalente del artículo de prueba (ng eq./mL) en una muestra dada, usando la fórmula: [cpm precipitables con TCA/EXP (-0.693/60.2* (ts-tD))]/[actividad específica (en cpm/mg) * volumen de muestra (en mL)].

La cuantificación de la concentración equivalente (ng eq./g) de 125I-F8/IL10 en los tejidos se calculó con base en la radiactividad total medida en la muestra y la actividad específica de la solución de dosificación después de una corrección para la vida media de descomposición física de 125I, usando la fórmula: [cpm de la muestra/EXP (-0.693/60.2* (ts-tD))]/ [actividad específica (en cpm/mg) *peso de la muestra (en mg)]. Ninguna homogeneización o precipitación con TCA se llevó a cabo para las muestras de tejido. Además de la concentración equivalente radiactiva (ng eq./mL para suero, ne eq./g para tejido), el porcentaje de dosis inyectada por gramo (% de ID/g) y/o el porcentaje de dosis inyectada (% de ID), se calcularon también para suero y tejidos de interés.

Se determinó la biodistribución de 125I-F8/IL10 en ratones normales (grupo 0) y tratados con DSS (grupo 1) 6 horas (figura 3A), 24 horas (figura 3B) y 96 horas post-inyección (figura 3C).

Se calcularon los parámetros PK con las concentraciones medias en suero o tejido en los puntos de tiempo medidos. Se usó un módulo de análisis no compartimentado del paquete de software farmacocinético WinNonlin (versión 5.1, Pharsight). Se calculó el área bajo la curva (AUC) de concentración contra tiempo, usando el método trapezoidal lineal.

Efecto sobre los niveles de citocinas en suero con el tratamiento terapéutico de F8- IL10 en el modelo de ratón con IBP Puesto que se sabe que la IL-10 disminuye las citocinas proinflamatorias, los presentes inventores pusieron a prueba si la administración de F8TL10 en el modelo de ratón con IBD afectaría las respuestas de las citocinas en suero en este modelo. Se administró a ratones 200 mg/ratón de F8-IL10, o pequeña proteína inmune control (F8-SIP) IV en los días 3, 6 y 9 después del inicio del tratamiento con DSS (n=10 ratones/grupo). Este régimen de dosis fue el mismo que los regímenes efectivos en modelos de artritis inducida por colágena (Schwager K, et al. Arthritis Research and Therapy, (2009) 11: R142). Los grupos control incluyeron no enfermos (agua regular) y enfermos no tratados (n=10 ratones/grupo). En el día 10 después del inicio de DSS, se colectó sangre y se obtuvo suero como se describió anteriormente para estudios de localización. Se evaluó el suero para los niveles de IL-lb, IL-12p40, IFNgamma, IL-6, KC, IL-10 y FNTalfa, usando la plataforma de teenología MSD y un kit de MSD 7plex de ratón, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mesoscale Discovery, Gaithersburg, MD). Los niveles de citocina se expresan como mg de proteína por mi de suero en las figuras 4 y 5.

Tinción de tejido humano para la expresión del ED-A Se llevó a cabo el análisis inmunohistoquímico de especímenes congelados embebidos en OCT de tejido del colon de un paciente femenino de 60 años afectado con colitis ulcerosa, y de un paciente masculino de 42 años afectado con enfermedad de Crohn. Ambos especímenes fueron sondeados con el anticuerpo F8 en el formato de SIP y el factor de Von Willebrand.

Además, especímenes de biopsia congelados afectados y no afectados pareados de los mismos pacientes con enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa (n=3 pacientes con enfermedad de Crohn, y n=5 pacientes con UC) se obtuvieron de Analytical Biological Services (Wilmington, DE). Las muestras congeladas fueron orientadas sobre hielo seco para prevenir la descongelación, embebidas en Cryomolds, estándar (Tissue-Tek 4557), llenas con compuesto O.C.T. (Tissue-Tek #4583) y congeladas instantáneamente en isopentano que había sido enfriado mediante hielo seco. Los bloques de tejido fueron seccionados sobre un crióstato Leica CM1850 a 4 mieras, puestos sobre portaobjetos de vidrio y almacenados a -80°C hasta que se llevara a cabo la inmunohistoquímica (IHC). Tras el inicio de la IHC, los tejidos fueron sumergidos en metanol frío (-28.89°C) (Fisher Scientific A412P-4) para remover cualquier humedad que pudiera formarse con el almacenamiento y secados al aire por 20 minutos a temperatura ambiente. Los tejidos se sumergieron entonces en acetona fría (-28.89°C) (ACROS CAS # 67-64-1) por 10 minutos y se secaron al aire por 10 minutos a temperatura ambiente.

Los portaobjetos con el tejido fueron marcados con el código de barras Ventana apropiado, y puestos en un Ventana Discovery XT para IHC de SIP de fibronectina F8 o SIP de KSF (anticuerpo control). La biotina endógena fue bloqueada con suero de ratón normal a 5% (Jackson Immuno Research 015-000-120) en un bloque Ventana S (Ventana 760-4212) por 20 minutos y un kit de bloqueo de biotina Ventana (Ventana 760-050) por 8 minutos. La SIP de fibronectina F8 o KSF fue diluida en diluyente de anticuerpos Dako (S0908) (Dako North America, Carpintería, CA) a una concentración de 1:200 (100 ml por portaobjetos), e incubada por 40 minutos. Los portaobjetos fueron contrateñidos con hematoxilina y reactivo de añil (4 minutos cada uno) antes de que concluyera la prueba. Los portaobjetos se removieron y se pusieron en un Ventana Symphony para deshidratación subsiguiente y la aplicación de un cubreobjetos. Imágenes representativas de la IHC se muestran en la figura 7. Se ilustra la IHC de muestras de tejido no afectado (izquierda) y afectado (derecha) de pacientes con colitis ulcerosa UH0501-34 (arriba) y con enfermedad de Crohn UH0405-09 (abajo).

Resultados Autorradioarafía del colon La figura 2 muestra la autorradlografía de cólones de ratones no enfermos (agua) (campos 1 y 3) o enfermos (tratados con DSS) (campos 2 y 4) a 6 (campos 1 y 2) o 24 (campos 3 y 4) horas después de la administración de F8-IL10 radiomarcado. Esto demuestra que F8-IL10 se acumula en el tejido inflamado más que en el colon normal. La apariencia desigual de la localización del colon enfermo de F8-IL10 es consistente con los niveles variables de inflamación y expresión del ED-A observados a lo largo de la longitud del colon en este modelo, apoyando adicionalmente la localización de F8-IL10 con la inflamación.

Biodistribución de 1251-F8-IL10 en ratones enfermos v sanos Las figuras 3A a 3C muestran la acumulación de 125I-F8-IL10 en los puntos de tiempo de 6, 24 y 96 horas en el colon y los nodulos linfáticos mesentéricos (L.N.) en ratones enfermos (DSS), en comparación con ratones normales (agua). En forma similar a la figura 2, estos datos demuestran la focalización de F8-IL10 hacia el colon y los nodulos linfáticos asociados en los ratones tratados con DSS. Asimismo de estos estudios, se determinó que la vida media en suero es de aproximadamente 3.5 horas, mientras que la vida media de F8-IL10 en el colon fue de aproximadamente 35 horas: un incremento de 10 veces que sugiere persistencia incrementada en el tejido. Esto indica que no sólo es F8-IL10 que focaliza el colon y los nodulos linfáticos mesentéricos durante la inflamación del colon, sino que una vez persiste también por períodos más largos que en la circulación. En conjunto, estos datos sugieren que bajo condiciones de inflamación en el colon, tal como en la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa en humanos, F8-IL10 de preferencia focalizará y persistirá en estos sitios.

Niveles de atocinas en el suero de ratones enfermos v sanos La figura 4 muestra que en comparación con los grupos control, la administración de F8-IL10 en una modalidad terapéutica da como resultado una disminución significativa en los niveles de atocinas inflamatorias, IL-Ib, IL12p40, IFNy e IL-6 en suero.

La figura 5 muestra que en comparación con los grupos control, la administración de F8-IL10 en una modalidad terapéutica no da como resultado un incremento de FNT-alfa y quimiocina derivada de queratinocitos (KC), y da como resultado niveles incrementados de IL-10. Los niveles incrementados de estas citocinas de la figura 4 en el modelo de DSS están asociados con la inducción de la enfermedad en el colon. Los decrementos en estas citocinas inflamatorias de la figura 4 y los incrementos en IL-10, son consistentes con los efectos biológicos conocidos de la IL-10 (Abbas A, Lichtman A, Pober J., 1994, Cellular and Molecular Immunology. 2a. ed. Filadelfia: W.B. Saunders Company; Delves P, Roitt I (eds), 1998, Encyclopedia of Immunology, 2a. ed. San Diego: Academic Press). De esta manera, F8-IL10 demuestra actividad farmacológica en este modelo de IBD, reduciendo las citocinas asociadas con la inflamación y la patología en el ambiente de la IBD. Puesto que se sabe que estas citocinas proinflamatorias son sobrerreguladas en los pacientes con IBD, la subregulación de estas citocinas a través de la administración de F8-IL10 sugiere que es probable que F8-IL10 sea benéfico en el tratamiento de la IBD in vivo. El interferón y y IL-12p70, en particular, son conocidos por ser sobrerregulados en los pacientes con CD, y los datos descritos en la presente sugieren que es probable que la administración de F8-IL10 sea por lo tanto particularmente útil para el tratamiento de la CD in vivo.

Inmunohistoauímica La figura 6 muestra que el anticuerpo de SIP F8 tiñe los vasos sanguíneos recién formados, pero no los vasos sanguíneos normales en un paciente afectado por colitis ulcerosa (el factor de Von Willebrand se usa habltualmente como un marcador de vasculatura normal).

La figura 7 muestra imágenes representativas de muestras de biopsia pareadas de UC y de enfermedad de Crohn teñidas mediante ¡nmunohistoquímica para el ED-A. Las flechas indican vasos dentro de cada imagen. La intensidad de la tinción alrededor de los vasos en los vasos afectados se incrementa en comparación con las muestras no afectadas de los mismos pacientes. Esto sugiere que la expresión incrementada del ED-A podría dar como resultado focalización incrementada hacia las áreas inflamadas del colon en esos ambientes de enfermedad humana. En resumen, el colon focalizó la distribución y disminuyó las citocinas en suero observadas con F8-IL10 en un modelo de IBD de murino, y la expresión incrementada del ED-A alrededor de los vasos en el tejido del colon afectado con colitis ulcerosa y con enfermedad de Crohn, proveen en conjunto evidencia que sugiere que la administración de F8-IL10 podría focalizar y afectar positivamente a los pacientes con IBD.

Breve descripción de secuencias SEQ ID NO: 1 (CDR1 del dominio VH del anticuerpo F8): LFT SEQ ID NO: 2 (CDR2 del dominio VH del anticuerpo F8): SGSGGS SEQ ID NO: 3 (CDR3 del dominio VH del anticuerpo F8): STHLYL SEQ ID NO: 4 (CDR1 del dominio VL del anticuerpo F8): MPF SEQ ID NO: 5 (CDR2 del dominio VL del anticuerpo F8): GASSRAT SEQ ID NO: 6 (CDR3 del dominio VL del anticuerpo F8): MRGRPP SEQ ID NO: 7 (dominio VH del anticuerpo F8): EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 8 (dominio VL del anticuerpo F8): EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTI SRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 9 (enlazador entre el dominio VH y el dominio VL del anticuerpo F8): GGSGG SEQ ID NO: 10 (enlazador entre el dominio VL del anticuerpo F8 y la IL-10): SSSSGSSSSGSSSSG SEQ ID NO: 11 (IL-10 humana): SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEE VMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIE AYMTMKIRN SEQ ID NO: 12 (anticuerpo F8): EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRAS QSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQ GTKVEIK SEQ ID NO: 13 (F8-IL-10): EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRF?SRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGSGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRAS QSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFimSRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQ GTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLL EDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLK LRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAF NKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un miembro de unión específico que se une a la isoforma del dominio extra-A (ED-A) de la fibronectina, para usarse en un método de tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), tal como enfermedad de Crohn (CD) o colitis ulcerosa (UC).

2.- El uso de un miembro de unión específico que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la IBD, tal como CD o UC.

3.- Un método de tratamiento de IBD en un paciente, el método comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un medicamento que comprende un miembro de unión específico que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina.

4.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con la reivindicación 1, el uso de la reivindicación 2, o el método de conformidad con la reivindicación 3, en donde el miembro de unión específico se une al ED-A de la fibronectina.

5.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con la reivindicación 1 o 4, el uso de la reivindicación 2 o 4, o el método de conformidad con la reivindicación 3 o 4, en donde el miembro de unión específico es conjugado con una molécula inmunosupresora o antiinflamatoria, tal como IL-10.

6.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con la reivindicación 5, en donde el miembro de unión específico es conjugado con la molécula bioactiva mediante un enlazador escindible.

7.- Un miembro de unión específico que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina, para usarse en un método de diagnóstico de IBD.

8.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con la reivindicación 7, en donde el miembro de unión específico se une al ED-A de la fibronectina.

9.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con la reivindicación 7 u 8, en donde el miembro de unión específico es conjugado con un marcador detectable o un radioisótopo.

10.- Un miembro de unión específico que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina para usarse en el suministro hacia la neovasculatura del tejido con IBD, de una molécula conjugada con el miembro de unión específico.

11.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con la reivindicación 10, en donde el miembro de unión específico se une al ED-A de la fibronectina.

12.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con la reivindicación 10 u 11, en donde la molécula es una molécula inmunosupresora o antiinflamatoria, tal como IL-10.

13.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 12, el uso de la reivindicación 2, o el método de conformidad con la reivindicación 3, en donde el miembro de unión específico comprende un dominio VH que comprende una región de estructura y una serie de regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en donde la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, y la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3; o en donde el dominio VH comprende una serie de regiones determinantes de complementariedad que tienen diez o menos sustituciones de aminoácido dentro de las regiones determinantes de complementariedad HCDR1, HCDR2 y HCDR3.

14.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con la reivindicación 13, en donde la región de estructura del dominio VH es una región de estructura de la línea germinal humana.

15.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el dominio VH tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.

16.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde el miembro de unión específico comprende además un dominio VL que comprende una serie de regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y una región de estructura.

17.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con la reivindicación 16, en donde la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, y la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6; o en donde el dominio VL comprende una serie de regiones determinantes de complementariedad que tienen diez o menos sustituciones de aminoácido dentro de las regiones determinantes de complementariedad LCDR1, LCDR2 y LCDR3.

18.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con la reivindicación 16 o 17, en donde la región de estructura del dominio VL es una región de estructura de la línea germinal humana.

19.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con la reivindicación 18, en donde el dominio VL tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8.

20.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en donde el miembro de unión específico comprende un Fv de cadena sencilla.

21.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el miembro de unión es una inmunoproteína pequeña (SIP).

22.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la IBD no es colitis ulcerosa (UC).

23.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la IBD es colitis colagenosa.

24.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la IBD es colitis linfocítica.

25.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la IBD es colitis isquémica.

26.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la IBD es colitis diverticular.

27.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la IBD es enfermedad de Behget.

28.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la IBD es colitis indeterminada.

29.- El miembro de unión específico para usarse de conformidad con, el uso o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la IBD es enfermedad de Crohn.

30.- Un conjugado que comprende un miembro de unión que se une a la isoforma del ED-A de la fibronectina conjugado con IL-10, en donde el conjugado tiene la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 13.