TWI499426B - 與發炎性腸病有關之抗原 - Google Patents

Description

與發炎性腸病有關之抗原

本發明係關於發炎性腸病(inflammatory bowel disease(IBD))之治療及偵測。本發明牽涉結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體的專一性結合構體之使用，特別是結合纖維連接蛋白之結構域ED-A的專一性結合構體。該專一性結合構體可(例如)共軛至免疫抑制性或抗發炎性分子，例如介白素-10。

發炎性腸病(Inflammatory Bowel Disease(IBD))係一群影響結腸與小腸的發炎性病況。IBD的主要類型為克隆氏症(Crohn’s disease(CD))及潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis(UC))。IBD致病機轉的特徵為造成及維持腸處於慢性發炎狀態的不同血管新生調節作用(Chidlow et al.,2006,Am J Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,29,G5-G18)。克隆氏症可影響腸胃道的任何部分，而潰瘍性結腸炎則通常受限於結腸及直腸(Summers RW,Elliott DE,Qadir K,Urban JF,Thompson R, Weinstock JV(2003)Am.J.Gastroentol.,98：2034-2041)。依據其嚴重性，潰瘍性結腸炎之治療可能需要抑制免疫作用以控制症狀，且治療經常牽涉施予抗發炎性分子。

已知IBD的特徵為發炎前細胞激素(pro-inflammatory cytokine)之上調，例如：IFN-γ、IL-6及IL-12(如IL-12p70)。例如已知克隆氏症與過量的IL-12/IL-23及IFN-γ/IL-17產生有關(Strober et al.(2007),The Journal of Clinical Investigation,117(3),514-521)。亦已有克隆氏症活躍期間，IL-12p70與IL-23合成的報導(Fuss et al.2006,Inflamm.Bowel Dis.12：9-15)。

纖維連接蛋白(Fibronectin(FN))係一種醣蛋白，且廣泛表現在多種正常組織及體液中。其係胞外基質(extracellular matrix(ECM))的組分之一，並參與許多生物過程，包括細胞附著、細胞遷移、血液凝集、血栓形成、創傷癒合、組織分化及致癌轉化。

不同的FN同功異形體係藉由原始轉錄體FN前mRNA(pre-mRNA)之三個區域(ED-A、ED-B、IIICS)的選擇性剪接而產生，其係由細胞激素及胞外pH所調節之過程(Balza(1988)FEBS Lett.,228,42-44；Carnemolla(1989)J.Cell Biol.,106,1139-1148；Borsi(1990)FEBS Lett.261,175-178)。纖維連接蛋白含有二個第III型球狀外結構域(globular extra-domains)，其可進行選擇性剪接：ED-A及ED-B(ffrench-Constant(1995)Exp.Cell Res.,22,261-271,Kaspar et al.(2006)Int.J.cancer,118,1331-1339)。小鼠纖維連接蛋白之ED-A及人纖維連接蛋白之ED-A的同一性為96.7%(此二個90胺基酸序列之間僅有3個胺基酸不同)。

經報導乳癌(Jacobs et al.(2002)Human Pathol,33,29-38,Matsumoto et al.(1999)Jpn.J.Cancer Res.,90,320-325)及肝癌(Oyama et al.(1989)JBC,264,10331-10334,Tavian et al.(1994)Int.J.Cancer,56,820-825)的腫瘤細胞及固體腫瘤中有纖維連接蛋白ED-A之mRNA的表現，而纖維肉瘤(fibrosarcoma)、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)及黑色素瘤亦有單離蛋白質的報導(Borsi et al.(1987)J.Cell Biol.,104,595-560)。除了癌症，已報導風濕性關節炎有纖維連接蛋白之ED-A的表現(WO2009/056268)。WO2010/078950亦報導纖維連接蛋白之ED-A在子宮內膜異位、牛皮癬及牛皮癬性關節炎的表現，然而組織化學分析顯示在多發性硬化症及潰瘍性結腸炎中，ED-A的表現很弱至實際上無表現。Brenmoehl等人發表之免疫組織化學分析(Int.J.Colorectal Dis.(2007)22：611-623)顯示相較於對照組黏膜，ED-A表現在CD患者的發炎腸黏膜的表現降低，而在潰瘍性結腸炎則升高。Brenmoehl等人(2007)亦報導在CD患者的纖維性黏膜(fibrotic mucosa)中，ED-A及ED-B同功異形體的表現升高。因為已知彼等纖維連接蛋白同功形體與創傷癒合相關，故可預期纖維性黏膜中有 ED-A及ED-B同功異形體表現。以CD患者的發炎腸繫膜中ED-A表現較取自對照組患者的黏膜低，Brenmoehl等人(2007)並未提出CD(活躍)期間有ED-A之表現。此文件中亦無揭露結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體的結合構體用於治療或診斷IBD的用途。

介白素-10(IL-10)係一抗發炎性細胞激素，其功能為免疫系統之重要調控者。雖然已知IL-10在免疫系統中具有許多不同的角色，其之二個主要活性包括抑制巨噬細胞產生細胞激素，以及在T細胞活化期間抑制巨噬細胞的附屬功能(Abbas A,Lichtman A,Pober J.,1994,Cellular and Molecular Immunology.2nd Ed.Philadelphia：W.B.Saunders Company)。彼等活性的效果使得IL-10在免疫系統中主要扮演抗發炎性角色。IL-10最初被稱為細胞激素合成抑制因子(cytokine synthesis inhibiting factor(CSIF))，且此蛋白質的發現係基於其之生物活性(Delves P,Roitt I(eds),1998,Encyclopedia of Immunology,2nd Ed.San Diego：Academic Press)。因為其眾所周知的抗發炎性特性，IL-10療法被引入作為克隆氏症(CD)可能的新穎抗發炎性治療(Fedorak et al.,Gastroenterology(2000)119,1473-1482.；Schreiber et al.,Gastroenterology(2000)119,1461-1472；Colombel et al.,Gut(2001)49,42-46)。

Asadullah等人(Pharmacology Reviews,(2003),55,245-269)回顧了介白素-10療法在數種發炎性疾病的技術 領域狀態。回顧至慢性發炎性腸病時，Asadullah等人報導許多大型多中心臨床試驗(multicenter trial)之進行，以患有輕微/中度CD或治療抗性CD的患者測試多個IL-10劑量，以及藉由全身性施予進行治療性迴腸或迴腸結腸切除術之患者，以預防內視鏡術後遺症(Fedorak et al.,Gastroenterology(2000)119,1473-1482.；Schreiber et al.,Gastroenterology(2000)119,1461-1472；Colombel et al.,Gut(2001)49,42-46.)。數據資料顯示IL-10療法係安全的且耐受性良好。然而，與安慰劑治療相較，IL-10並未造成顯著較高的緩解率或臨床症狀改善。

整體而言，臨床結果並不讓人滿意，而Herfarth及Scholmerich則有許多關於此治療策略令人失望的討論(Gut(2002)50,146-147)。

因此，仍有多種IBD狀態之有效治療的需求。

本發明人意外發現融合至IL-10的抗EDA抗體能夠：(i)在IBD患病小鼠活體中選擇性區域定位至發炎結腸處，及(ii)降低IBD患病小鼠血清中某些發炎前細胞激素(pro-inflammatory cytokine)的量，特別是干擾素-γ、IL-6及IL-12p70。

經由施予融合至IL-10之抗EDA抗體而下調發炎前細胞激素特別令人意外，因為Tilg等人(Gut(2002),50,191-195)報導以重組之人IL-10治療克隆氏症患者會引發 干擾素-γ。Shibata等人(J.Immunol.,(1998)161,4283-4288)亦報導IL-10強化NK細胞產生INF-γ，但抑制巨噬細胞產生INF-γ引發性因子。

於是，在第一態樣中，本發明提供一種專一性結合構體(例如：抗體分子)，其結合纖維連接蛋白(A-FN)之外結構域-A(Extra Domain-A(ED-A))同功異形體以用於治療IBD之方法。本發明亦提供結合纖維連接蛋白之外結構域-A(ED-A)同功異形體的專一性結合構體(例如：抗體分子)，用於製造供治療IBD之藥物的用途。本發明亦提供一種治療患者IBD的方法，該方法包含施予患者治療有效量之藥物，其包含結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體的專一性結合構體。較佳為該專一性結合構體結合人纖維連接蛋白之ED-A同功異形體。

用於本發明之第一態樣的專一性結合構體(例如：抗體分子)，可結合纖維連接蛋白之ED-A。

用於本發明之第一態樣的專一性結合構體(例如：抗體分子)，可共軛至具有免疫抑制性或抗發炎性活性之分子、可偵測標定物、放射性同位素或生物活性分子，例如：細胞激素、內分泌激素、治療性放射性同位素、細胞毒性藥物。該專一性結合構體可由可截切之連接子共軛至該生物活性分子。

在較佳實施例中，該專一性結合構體(例如：抗體分子)係共軛至具有免疫抑制性或抗發炎性活性之分子，例如：IL-10。

IBD，如本文所稱，可為活躍性IBD。具體而言，該IBD可為克隆氏症(Crohn’s disease(CD))、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis(UC))、膠原性結腸炎(collagenous colitis)、淋巴球性結腸炎(lymphocytic colitis)、缺血性結腸炎(ischaemic colitis)、分流性結腸炎(diversion colitis)、貝賽特氏病(Behçet’s disease)或未定型結腸炎(indeterminate colitis)。該IBD可為CD或UC。該IBD可為CD、膠原性結腸炎、淋巴球性結腸炎、缺血性結腸炎、分流性結腸炎、貝賽特氏病或未定型結腸炎。在一實施例中，該IBD非為UC。該IBD可為非典型發炎作用限於結腸及直腸之IBD，例如：CD。IBD可為不僅止影響結腸內膜之IBD。較佳為該IBD係CD。本文所使用之術語CD、UC、膠原性結腸炎、淋巴球性結腸炎、缺血性結腸炎、分流性結腸炎、貝賽特氏病及未定型結腸炎，可分別代表活躍性CD、活躍性UC、活躍性膠原性結腸炎、活躍性淋巴球性結腸炎、活躍性缺血性結腸炎、活躍性分流性結腸炎、活躍性貝賽特氏病及活躍性未定型結腸炎。

在第二態樣中，本發明提供結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體的專一性結合構體(例如：抗體分子)，用於將共軛至該專一性結合構體的分子傳遞至IBD組織。本發明亦提供結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體的專一性結合構體(例如：抗體分子)，用於製造供將共軛至該專一性結合構體的分子傳遞至IBD組織的藥物。本發明亦 提供一種將分子傳遞至人或動物IBD組織的方法，其中該分子係共軛至結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體的專一性結合構體以形成共軛體，且該方法包含將該共軛體施予該人或動物。較佳為，該專一性結合構體結合人纖維連接蛋白之ED-A同功異形體。

本發明之第二態樣中使用的專一性結合構體(例如：抗體分子)可結合纖維連接蛋白之ED-A。

本發明之第二態樣中使用的專一性結合構體(例如：抗體分子)可共軛至可偵測性標定物、放射性同位素或生物活性分子，例如：細胞激素、內分泌激素、治療性放射性同位素或細胞毒性藥物。該專一性結合構體可藉由可截切之連接子共軛至該生物活性分子。

該專一性結合構體(例如：抗體分子)較佳為共軛至IL-10。

在第三態樣中，本發明提供一種結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體的專一性結合構體(例如：抗體分子)以用於診斷IBD之方法。本發明亦提供結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體的專一性結合構體，用於製造供診斷IBD之診斷產品的用途。本發明亦提供一種偵測或診斷人或動物IBD的方法，其中該方法包含下列步驟：(a)施予該人或動物結合纖維連接蛋白之ED-A結構域的專一性結合構體，及(b)測定該專一性結合構體存在或不存在於該人體或動物體中之IBD位置，其中該專一性結合構 體區域定位至IBD之位置代表IBD存在。

較佳為，該專一性結合構體結合人纖維連接蛋白之ED-A同功異形體。

本發明之第三態樣中使用的專一性結合構體(例如：抗體分子)可結合纖維連接蛋白之ED-A。

本發明之第三態樣中使用的專一性結合構體(例如：抗體分子)可共軛至可偵測標定物或放射性同位素。

在第四態樣中，本發明提供一種結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體的專一性結合構體以用於攝影IBD組織的方法。本發明亦提供結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體的專一性結合構體，用於製造供攝影IBD組織的造影劑的用途。本發明亦提供一種偵測或攝影人或動物IBD組織之方法，其中該方法包含下列步驟：(a)施予該人或動物結合纖維連接蛋白之ED-A結構域的專一性結合構體，及(b)偵測該專一性結合構體於人體或動物體結合至IBD組織的情形。

較佳為，該專一性結合構體結合人纖維連接蛋白之ED-A同功異形體。

本發明之第四態樣中使用的專一性結合構體(例如：抗體分子)可結合纖維連接蛋白之ED-A。

本發明之第四態樣中使用的專一性結合構體(例如：抗體分子)可共軛至可偵測標定物或放射性同位素。

在第五態樣中，本發明提供一種共軛物，其包含共軛 至IL-10之結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體(例如：ED-A)的專一性結合構體，其中該共軛物具有如SEQ ID NO：13所示之序列。此共軛物在本文中稱為F8-IL10。因為此共軛物之VH及VL結構域係藉由5胺基酸連接子連接(參見圖1B)，預期該共軛物在溶液中形成非共價性同質二聚體。

本發明使用之專一性結合構體可為結合纖維連接蛋白之ED-A同功異形體及/或纖維連接蛋白之ED-A的抗體分子，其中該抗體包含一或多個本文所述之F8抗體的互補決定區域(complementarity determining region(CDR))。彼等序列提供於下文(參見SEQ ID NO：1-6)。F8抗體之CDR序列亦顯示於圖1。

本發明使用之專一性結合構體可包含一或多個本文所述之CDR(例如：CDR3)，且亦選擇性包含CDR1及CDR2以形成一組CDR。

較佳為，本發明使用之專一性結合構體包含一組本文所述之F8抗體的H及/或L抗體CDR，且在所揭露之H及/或LCDR組中帶有十個或更少(例如：一個、二個、三個、四個或五個)胺基酸取代。

取代作用可能在該組CDR中的任何殘基發生，且可在CDR1、CDR2及/或CDR3中。

本發明使用之專一性結合構體可包含抗體分子，例如：人抗體分子。該專一性結合構體通常包含抗體VH及/或VL結構域。專一性結合構體之VH結構域亦提供用於 本發明中。在各VH及VL結構域中係互補決定區域(CDR)及骨架區域(FR)。VH結構域包含一組HCDRs，而VL結構域包含一組LCDR。抗體分子可包含抗體VH結構域，其包含VH CDR1、CDR2及CDR3與骨架。其可替代性或同時包含抗體VL結構域，其包含VLCDR1、CDR2及CDR3與骨架。所有本文所揭露之VH及VL序列、CDR序列、CDR組及HCDR組及LCDR組，均代表本發明使用之專一性結合構體的實施例。如本文所述，「一組CDR」包含CDR1、CDR2及CDR3。因此，一組HCDR代表HCDR1、HCDR2及HCDR3，而一組LCDR代表LCDR1、LCDR2及LCDR3。除非另有指明，「一組CDR」包括HCDR及LCDR。

本發明使用之專一性結合構體可包含抗體VH結構域，其包含互補決定區域HCDR1、HCDR2及HCDR3與骨架，其中HCDR1係SEQ ID NO：1，且其中HCDR2係選擇性為SEQ ID NO：2及/或HCDR3係選擇性為SEQ ID NO：3。

一般而言，VH結構域係與VL結構域配對以提供抗體抗原結合位，雖然如下文之進一步論述，VH或VL結構域單獨即可用來結合抗原。因此，本發明使用之專一性結合構體可進一步包含抗體VL結構域，其包含互補決定區域LCDR1、LCDR2及LCDR3與骨架，其中LCDR1係SEQ ID NO：4，且其中LCDR2係選擇性為SEQ ID NO：5及/或LCDR3係選擇性為SEQ ID NO：6。

本發明使用之專一性結合構體較佳為包含纖維連接蛋白之ED-A的抗體分子，其中該抗體分子包含VH結構域及VL結構域，其中該VH結構域包含骨架及一組互補決定區域HCDR1、HCDR2及HCDR3，且其中該VL結構域包含互補決定區域LCDR1、LCDR2及LCDR3與骨架，且其中HCDR1具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列；HCDR2具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列；HCDR3具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列；LCDR1具有SEQ ID NO：4之胺基酸序列；LCDR2具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及LCDR3具有SEQ ID NO：6之胺基酸序列。

一或多個CDR或抗體之一組CDR可被移植至骨架(例如：人骨架)中，以提供用於本發明之抗體分子。骨架區域可包含人生殖細胞係基因區段序列。因此，該骨架可為經生殖細胞系化的，藉以改變骨架內之一或多個殘基，以使之與最相似之人生殖細胞系骨架中相當位置的殘基相符。本發明使用之專一性結合構體可為具有VH結構域之單離抗體分子，該VH結構域包含一組人生殖細胞系骨架中的HCDR(例如：DP47)。該專一性結合構體通常亦具有包含一組LCDR(例如在人生殖細胞系骨架中)之VL結構域。該VL結構域之人生殖細胞系骨架可為DPK22。

本發明使用之VH結構域較佳為具有胺基酸序列SEQ ID NO：7，其係F8抗體之VH結構域。本發明使用之VL結構域較佳為具有胺基酸序列SEQ ID NO：8，其係野生型F8抗體之VL結構域。

本發明使用之專一性結合構體可為或包含單鏈Fv(scFv)，其包含由胜肽連接子連結之VH結構域及VL結構域。熟稔技術者可選擇連接子的適當長度與序列，例如：至少為5個或至少為10個胺基酸長，至多約15個、至多約20個或至多約25個胺基酸長。該連接子可具有胺基酸序列GGSGG(SEQ ID NO：9)。

該專一性結合構體可為雙功能抗體(diabody)，其係由基因融合所建構之多價或多專一性片段(WO94/13804；Holliger et al.(1993a),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448)。

較佳為，該專一性結合構體係scFv，其在溶液中形成(穩定)非共價性同質二聚體。例如：本文所述之F8抗體及F8-IL10共軛物均包含scFv，其被預期在溶液中形成(穩定)非共價性同質二聚體。

單鏈Fv(scFv)可被包含在微型免疫球蛋白(mini-immunoglobulin)或小型免疫蛋白(small immunoprotein(SIP))中(例如Li et al.,(1997),Protein Engineering,10：731-736所述)。SIP可包含融合至人IgE分泌性同功異形體IgE-S2之CH4結構域的scFv分子(ε_S2 -CH4；Batista et al.,(1996),J.Exp.Med.,184：2197-205)，形成同質二聚體性微型免疫球蛋白抗體分子。

或者，本發明使用之專一性結合構體可包含非抗體分子中的抗原結合位，一般由一或多個CDR提供，例如：非抗體蛋白質支架中的一組CDR。專一性結合構體(包括非抗體及抗體分子)在本文他處有更詳細之描述。

本發明使用之專一性結合構體可為抗體分子，其包含如SEQ ID NO：7所示之F8抗體的VH結構域及/或如SEQ ID NO：8所示之F8抗體的VL結構域。本發明使用之專一性結合構體可為包含如SEQ ID NO：11所示之序列的抗體分子。本發明之共軛至IL-10之專一性結合構體可包含如SEQ ID NO：13所示之序列。

本發明使用之專一性結合構體亦可包含一或多個(例如：全部六個)抗ED-A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F1、B7、E8或G9或其變體之CDR，或者抗ED-A抗體H1、B2、C5、D5、E5、C8、F1、B7、E8或G9或其變體之VH及/或VL結構域。彼等抗體之CDR序列與VH及VL結構域序列揭露於WO2010/078950。

本發明使用之適當變異體包含抗體抗原結合位，其包含本文所述之F8抗體的VH結構域及VL結構域，其中如SEQ ID NO：7所示之VH結構域於位置5的白胺酸(L)殘基被異戊胺酸(V)所取代，及/或如SEQ ID NO：8所示之VL結構域於位置18的左旋精胺酸(R)殘基被離胺酸(K)所取代。

本發明之彼等及其他態樣在下文有更詳細之描述。

圖1A顯示抗ED-A F8抗體重鏈(VH)之胺基酸序列(SEQ ID NO：7)。抗ED-A F8抗體之重鏈CDR1的胺基酸序列(SEQ ID NO：1)以底線強調。抗ED-A F8抗體之重鏈CDR2的胺基酸序列(SEQ ID NO：2)以斜體字加底線呈現。抗ED-A F8抗體之重鏈CDR3的胺基酸序列(SEQ ID NO：3)以粗體字加底線呈現。圖1B顯示VH及VL結構域之間抗ED-A F8抗體連接子序列的胺基酸序列(SEQ ID NO：9)。圖1C顯示抗ED-A F8抗體輕鏈(VL)之胺基酸序列(SEQ ID NO：8)。抗ED-A F8抗體之輕鏈CDR1的胺基酸序列(SEQ ID NO：4)以底線強調。抗ED-A F8抗體之輕鏈CDR2的胺基酸序列(SEQ ID NO：5)以斜體字加底線呈現。抗ED-A F8抗體之輕鏈CDR3的胺基酸序列(SEQ ID NO：6)以粗體字加底線呈現。圖1D顯示當抗體共軛至IL-10時，F8抗體及IL-10之間連接子的胺基酸序列。圖1E顯示人IL-10之胺基酸序列。

圖2顯示IBD小鼠及健康小鼠的結腸自動放射線攝影結果。收集結腸並將其暴露於放射性磷掃描屏(Molecular Dynamics)24小時，並經由Storm 860成像。第1道：注射後6小時收集自第0組之結腸(健康小鼠)；第2道：注射後6小時收集自第2組之結腸(IBD小鼠)；

第3道：注射後24小時收集自第0組之結腸(健康小鼠)；第4道：注射後24小時收集自第2組之結腸 (IBD小鼠)。

圖3顯示¹²⁵ I-F8-IL10在健康及患病小鼠中之生物分布。圖表顯示注射後6小時(A)注射後24小時(B)及注射後96小時(C)¹²⁵ I-F8-IL10在健康及患病小鼠中之生物分布。於96小時，相較於健康小鼠明顯可見¹²⁵ I-F8-IL10傾向累積在患病小鼠的結腸及腸繫膜淋巴結(L.N.)。彼等實驗中所用之F8-IL10共軛物的序列如SEQ ID NO：13所示。

圖4顯示經F8-IL10處理之小鼠的細胞激素量。上述圖表代表在健康小鼠(水)、未接受治療之患病小鼠(3% DSS)、接受小型免疫蛋白(Small Immune Protein)形式F8抗體之患病小鼠(F8SIP)、接受F8-IL10之患病小鼠(F8-IL10)的血清中細胞激素的量。報告之細胞激素量(表示為每ml血清中之pg蛋白質)為：介白素1β(IL1-b)、介白素12(IL-12p70)、干擾素γ(IFNγ)及介白素6(IL6)。

圖5顯示經F8-IL10處理之小鼠的細胞激素量。上述圖表代表在健康小鼠(水)、未接受治療之患病小鼠(3% DSS)、接受小型免疫蛋白(Small Immune Protein)形式F8抗體之患病小鼠(F8SIP)、接受F8-IL10之患病小鼠(F8-IL10)的血清中細胞激素的量。報告之細胞激素量(表示為每ml血清中之pg蛋白質)為：角質細胞衍生趨化激素(KC)、介白素10(IL10)及腫瘤壞死因子α(TNFa)。

圖6顯示組織化學分析來自罹患潰瘍性結腸炎及克隆氏症之患者的結腸組織樣本，以偵測SIP形式之F8抗體及溫韋伯氏因子。以F8抗體及溫韋伯因子觀察到的染色結果顯示，F8會將罹患潰瘍性結腸炎及克隆氏症之患者的新形成血管而非正常血管染色。(溫韋伯因子常規上作為正常血管的標記。)

圖7顯示罹患潰瘍性結腸炎及克隆氏症患者之患部結腸組織樣本(右)及非患部結腸樣本(左)的組織化學分析。以F8抗體觀察到的染色結果顯示F8染色在患病結腸的新形成血管中更為強烈。

術語 纖維連接蛋白

纖維連接蛋白係一種易進行選擇性剪接之抗原，且如本文在他處所述，目前已知數種選擇性同功異形體。外結構域-A(Extra Domain-A(EDA或ED-A))亦已知為ED、外部第III型重複A(extra type III repeat A(EIIIA))或EDI。人ED-A之序列已經由Kornblihtt等人((1984),Nucleic Acids Res.12,5853-5868)及Paolella等人((1988),Nucleic Acids Res.16,3545-3557)公開。人ED-A之序列亦可在SwissProt資料庫取得，為寄存在登錄號P02751底下之胺基酸序列的胺基酸1631-1720(第III型纖維連接蛋白12；外結構域2)。小 鼠ED-A之序列可在SwissProt資料庫取得，為寄存在登錄號P11276底下之胺基酸序列的胺基酸1721-1810(第III型纖維連接蛋白13；外結構域2)。

纖維連接蛋白之ED-A同功異形體含有外結構域A(Extra Domain-A(ED-A))。人A-FN之序列可從相對應的人纖維連接蛋白前驅序列推論得到，該前驅序列可在SwissProt資料庫於登錄號P02751底下取得。小鼠A-FN之序列可從相對應的小鼠纖維連接蛋白前驅序列推論得到，該前驅序列可在SwissProt資料庫於登錄號P11276底下取得。A-FN可為人纖維連接蛋白之ED-A同功異形體。ED-A可為人纖維連接蛋白之外結構域A。

ED-A係90胺基酸序列，其係藉由選擇性剪接插入纖維連接蛋白(FN)中，並位於FN之結構域11與12之間(Borsi et al.,1987,J.Cell Biol.,104,595-600)。ED-A大體上不存在FN之原生質形式中，但在胚胎形成、組織重塑、纖維化、心臟移植及固體腫瘤形成期間卻含量豐富。

選擇性剪接

選擇性剪接代表剪接DNA之原始RNA轉錄體時，發生不同剪接方式而產生不同mRNA。在刪除內含子之後，選擇作用可決定哪些外顯子被剪接在一起而形成mRNA。選擇性剪接產生含有不同外顯子及/或不同數量之外顯子的不同同功異形體。例如一同功異形體可包含相對應於一 或多個外顯子的額外胺基酸序列，其可包含一或多個結構域。

專一性結合構體

此術語描述一專一性結合至彼此之成對分子的構體。專一性結合分子對的組成員可為自然衍生或全體或部分由人工合成。該分子對之一組成員在其表面上具有結合至並因而與該分子對之另一組成員的特定空間與極性結構互補的範圍或凹腔。結合分子對類型之實例係抗原-抗體、生物素-抗生物素蛋白、內分泌激素-內分泌激素受體、受體-配體、酶-受質。本發明係關於抗原-抗體類型反應。

專一性結合構體一般包含具有抗原結合位之分子。例如：專一性結合構體可為抗體分子或包含抗原結合位之非抗體蛋白質。本文中所稱之專一性結合構體較佳為抗體分子。

抗原結合位可藉由在非抗體蛋白質支架(例如纖維連接蛋白或細胞色素B等)上安排互補決定區域(CDR)之方法提供(Haan & Maggos,(2004),BioCentury,12(5)：A1-A6；Koide et al.,(1998),Journal of Molecular Biology,284：1141-1151；Nygren et al.,(1997),Current Opinion in Structural Biology,7：463-469)，或藉由將蛋白質支架中環的胺基酸殘基隨機排列或突變之方式提供，以賦予對於所欲目標之結合專一性。用於在蛋白質中建立新穎結合位之工程的支架已由Nygren等人詳盡回顧(1997) (Current Opinion in Structural Biology,7：463-469)。用於抗體模擬物的蛋白質支架揭露於WO/0034784，在該文獻中發明人描述之蛋白質(抗體模擬物)包括纖維連接蛋白第III型結構域，其具有至少一個隨機環。移植一或多個CDR(例如：一組HCDR)的適當支架，可由免疫球蛋白基因超家族(gene superfamily)之任何結構域構體提供。該支架可為人或非人蛋白質。非抗體蛋白質支架的優勢為其可在相較於至少某些抗體分子而言，較小及/或較容易操作的支架分子中提供抗原結合位。小尺寸之結合構體可賦予有用的生理特性，例如：能夠進入細胞、穿透至組織深處或到達在其他結構中的目標、或結合至目標抗原的蛋白質凹腔中。抗原結合位於非抗體蛋白質支架中的用途回顧於Wess,2004,In：BioCentury,The Bernstein Report on BioBusiness,12(42),A1-A7。一般為具有適當骨架及一或多個變異環之蛋白質，在其中該環之胺基酸序列經專一性或隨機突變，以創造結合目標抗原之抗原結合位。該蛋白質包括來自金黃葡萄球菌(S.aureus )之蛋白質A的IgG結合性結構域、運鐵蛋白、四締素(tetranectin)、纖維連接蛋白(例如：第10纖維連接蛋白第III型結構域)及脂質運載蛋白(lipocalin)。其他方式包括以大環寡肽(cyclotide)為主合成「微小體(Microbody)」(Selecore GmbH)-具有分子內雙硫鍵之小蛋白質。

除了抗體序列及/或抗原結合位之外，本發明使用之 專一性結合構體可包含諸如經摺疊結構域之其他胺基酸(例如：形式胜肽或多肽)，或除了結合抗原之能力外，給予該分子另一功能特性之胺基酸。本發明使用之結合構體可帶有一可偵測標定物，或共軛至毒素、具免疫抑制效果或抗發炎效果之分子或標靶部分或酵素(例如：透過胜肽鍵或連接子)。較佳為，本發明使用之結合構體共軛至介白素10。

例如：結合構體可包含催化位置(如於酶結構域中)以及抗原結合位，其中該抗原結合位結合至結合至抗原並因此使該催化位置抵達該抗原。該催化位置可抑制抗原之生物功能，例如：經由截切。

如所述的，雖然CDR可由非抗體支架攜帶，但用於攜帶CDR或CDR組之結構通常係抗體重鏈或輕鏈序列或其實質上的部分，其中該CDR或CDR組位於對應於由重排的免疫球蛋白基因編碼之天然存在的VH及VL抗體可變結構域之CDR或CDR組之位置。免疫球蛋白變異結構域之結構與位置可參考Kabat等人之文獻(1987)(Sequences of Proteins of Immunological Interest.4^th Edition.US Department of Health and Human Services.)決定，其更新內容可在網際網路上找到(於immuno.bme.nwu.edu，或使用關鍵字「Kabat」以搜尋引擎檢索)。

提到CDR區域或CDR，其意圖指稱由Kabat等人在1987年所發表之文獻以及之後版本((1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest,4^th Edition,US Department of Health and Human Services(Kabat et al.,(1991a),Sequences of Proteins of Immunological Interest,5^th Edition,US Department of Health and Human Services,Public Service,NIH,Washington,and later editions)中所定義之免疫球蛋白的重鏈與輕鏈之高度變異區域。抗體通常包含3個重鏈CDR及3個輕鏈CDR。根據情況，本文中所用之術語CDR意指此等區域之一或許多，或甚至此等區域之全部，含有因應該抗體對該抗原或其辨識的抗原決定部位之結合親和力之主要的胺基酸殘基。

在六個短CDR序列之中，該重鏈之第三個CDR(HCDR3)具較大的尺寸可變性(較佳的多樣性，主要因為該基因重排之機制提高其之可變性)。雖然已知最長的尺寸為26個胺基酸，但其可短如2個胺基酸。在功能上，HCDR3參與部分決定該抗體之專一性(Segal et al.,(1974),PNAS,71：4298-4302；Amit et al.,(1986),Science,233：747-753；Chothia et al.,(1987),J.Mol.Biol.,196：901-917；Chothia et al.,(1989),Nature,342：877-883；Caton et al.,(1990),J.Immunol.,144：1965-1968；Sharon et al.,(1990a),PNAS,87：4814-4817；Sharon et al.,(1990b),J.Immunol.,144：4863-4869；Kabat et al.,(1991b),J.Immunol.,147：1709-1719)。

抗體分子

抗體分子描述天然或部分或全部人工合成之免疫球蛋白。該術語亦關於任何包含抗體抗原結合位之多肽或蛋白質。在此須了解，本發明無關天然形式之抗體，也就是說其等並非存在天然環境中，而是已從天然來源經純化而單離或獲得，或其他經由基因重組而獲得，或經由化學合成，且其可包括如下文所述之非天然胺基。包含抗體抗原結合位之抗體片段包括(但不限於)諸如Fab、Fab’、Fab’-SH、scFv、Fv、dAb、Fd；及雙功能抗體之抗體分子。

取得單株以及其他抗體，以及使用重組DNA技術產生其他結合標靶抗原之抗體或嵌合分子係可能的。此技術可涉及將編碼抗體之免疫球蛋白變異區域或CDR之DNA，導入不同免疫球蛋白之恆定區域或恆定區域加上骨架區域。參見，例如：EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400，以及後來的大部分文獻。可使產生抗體之融合瘤或其他細胞接受基因突變或其他改變之處理，其可能或可能不會改變所產生抗體之結合專一性。

因為抗體可經多種方式修飾，所以術語「抗體分子」應被解釋為涵蓋任何具有所需專一性及/或結合至抗原之抗體抗原結合位的結合構體或物質。因此，此術語涵蓋抗體片段以及衍生物，包括不管是天然的或者是全部或部分人工合成的任何包含抗體抗原結合位之多肽。因此包括含有抗體抗原結合位(或相等物)與另一多肽(例如：由另一物種衍生而來，或屬於另一抗體類型或亞型)融合成的 嵌合分子。嵌合抗體之選殖以及表現描述於EP-A-0120694及EP-A-0125023，以及後來的大部分文獻。

於抗體工程之技術領域中可得之更進一步技術，已使得可能分離人以及人化抗體。例如，人類融合瘤可以由Kontermann & Dubel所述之方式製得(Kontermann & Dubel(2001),S,Antibody Engineering, Springer-Verlag New York,LLC；ISBN：3540413545)。噬菌體表現，另一種已建立用於產生結合構體之技術，於許多公開文獻中已有詳細的說明，諸如：WO92/01047(進一步於下文討論)及美國專利第US5969108號、第US5565332號、第US5733743號、第US5858657號、第US5871907號、第US5872215號、第US5885793號、第US5962255號、第US6140471號、第US6172197號、第US6225447號、第US6291650號、第US6492160號、第US6521404號及Kontermann & Dubel(2001)(S,Antibody Engineering, Springer-Verlag New York,LLC；ISBN：3540413545)。將小鼠抗體基因去活化並以人抗體基因功能取代，同時留下小鼠免疫系統之完整的其他組份的基因轉殖鼠，可用來分離人抗體(Mendez et al.,(1997),Nature Genet,15(2)：146-156)。

合成抗體分子之製造可藉由從以寡核苷酸合成之手段產生之基因，然後裝在適合的表達載體內而表達出來，例如：於Knappik等人(2000)(J.Mol.Biol.296,57-86)或Krebs等人(2001)(Journal of Immunological Methods,25467-84)發表之文章所述。

已顯示出，-整個抗體之片段可進行結合抗原之功能。結合片段之實例為(i)由VL、VH、CL及CH1結構域組成之Fab片段；(ii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iii)由單一抗體之VL及VH結構域組成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward et al.(1989)Nature 341,544-546；McCafferty et al.,(1990)Nature,348,552-554；Holt et al.(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490)，其係由VH或VL結構域組成；(v)單離CDR區域；(vi)F(ab')2片段，一種包含二個相連接之Fab片段的二架片段(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結構域及VL結構域經由胜肽連接子連接，使得此二個結構域能結合形成抗原結合位(Bird et al.(1988)Science,242,423-426；Huston et al.(1988)PNAS USA,85,5879-5883)；(viii)雙專一性單鏈Fv二聚物(PCT/US92/09965)及(ix)因基因融合構成之「雙功能性抗體(diabodies)」、多價或多專一性片段(WO94/13804；Holliger et al.(1993a),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448)。Fv、scFv或雙功能性抗體分子可藉由併入二硫基橋連結該VH與VL結構域予以安定化(Reiter et al.(1996),Nature Biotech,14,1239-1245)。亦可製造包含結合至CH3結構域之scFv的微體(Hu et al.(1996),Cancer Res.,56(13)：3055-61)。結合片段之其他實例為Fab’，其與Fab片段之差異為在重鏈CH1結構域之羧端處 添加了一些殘基，包括一或多個來自該抗體樞紐區域之半胱胺酸，以及Fab’-SH，其係恆定結構區之半胱胺酸殘基帶有游離硫代基團的Fab’片段。

本發明所用之抗體片段可從任何本文所述之抗體分子(例如：包含VH及/或VL結構域或任何本文所述之抗體的CDR的抗體分子)開始，利用諸如酵素(例如：胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化之方法及/或利用化學還原打斷雙硫橋之方法而得到。於另一方法中，本發明之抗體片段可利用熟諳此技藝之人士熟知之基因重組的技術製得，或利用其他胜肽合成方法，例如，使用諸如Applied Biosystems等公司所提供的自動胜肽合成器，或核酸合成以及表現製得。

本發明之功能性抗體片段包括任何半衰期經化學修飾(特別是聚乙烯二醇化)或經併入微脂體中而延長之功能性片段。

dAb(結構域抗體)係一種抗體之小單體抗原結合片段，即抗體重鏈或輕鏈之變異結構域(Holt et al.(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490)。VH dAbs自然存在於駱駝科(例如：駱駝、駱馬)中，可經由以標靶抗原免疫駱駝科動物、分離抗原專一性B細胞，及直接從個別B細胞中選殖dAb基因而產生。dAb亦可於細胞培養中生產。彼等之小尺寸、良好的溶解性以及溫度安定性，使彼等特別有利於生理上的應用，可適合用於選擇以及親和力成熟。本發明之結合構體可為包含實質上如本文所述之 VH或VL結構域之dAb，或包含含有實質上如本文所述之CDR組之VH或VL結構域的dAb。

本文中所用之片語「實質上如...所述」代表本文中所述之結合構體的VH或VL結構域的相關CDR，其特徵會與本文中所述之序列的指定區域相同或高度相似。本文中所述之片語與一或多個變異結構域之指定區域「高度相似」，可以預期在CDR及/或VH或VL結構域中有1至約5個(例如：1至4個，包括1至3個，或1或2個，或3個或4個)胺基酸取代。

雙專一性或雙官能性抗體形成第二代單株抗體，在其中二個相異之變異區域於相同分子中結合(Holliger and Bohlen 1999 Cancer and metastasis rev.18：411-419)。由彼等能夠恢復新的效能作用(effector function)或將許多分子標靶至腫瘤細胞表面，已證實彼等可用於診斷領域以及治療領域。使用雙專一性抗體時，彼等可為常見的雙專一性抗體(其可以各種方法製成(Holliger et al.(1993b),Current Opinion Biotechnol 4,446-449)，例如：由化學方法製得或從雜交融合瘤製得)，或可為如前文所述之雙專一性抗體片段中之任一種。彼等抗體可經由化學方法(Glennie et al.,(1987)J.Immunol.139,2367-2375；Repp et al.,(1995)J.Hemat.377-382)或體細胞方法(Staerz U.D.and Bevan M.J.(1986)PNAS 83；Suresh et al.(1986)Method.Enzymol.121：210-228)製得，但又較傾向基因工程技術，其使得異源二聚體化作用加速，並因而 促進所搜尋到抗體之純化過程(Merchand et al.,1998Nature Biotech.16：677-681)。雙專一性抗體之實例包括該等具有BiTE^TM 技術者，其中可使用具有不同專一性之二個抗體的結合結構域，並透過短可撓性胜肽直接連接。這結合二個抗體於短的單一多肽鏈上。雙功能性抗體及scFv可在沒有Fc區域之情況下僅使用變異結構域構成，但可能會降低抗特異性反應的效用。

雙專一性抗體可建構為IgG、為雙專一性Fab'2、為Fab'PEG、為雙功能性抗體或為其他雙專一性scFv。再者，二個雙專一性抗體可使用技術領域習知的例行方法連繫在一起以形成四價抗體。

與雙專一性完整抗體相反，雙專一性雙功能性抗體亦可特別有用，因為彼等可輕易地建構成且可在E.coli 中表現。使用噬菌體表現系統(WO94/13804)，可從基因庫中輕易地選擇具有適當結合專一性之雙功能性抗體(及許多其他多肽，諸如抗體片段)。假如該雙功能性抗體之一個臂需要保持恆定(例如，具有對抗標靶抗原之專一性)，則可建立一個基因庫，其中另一臂係可變的並選擇為適當專一性的抗體。雙專一性完整抗體可經由在Ridgeway等人發表之文獻(1996)(Protein Eng.,9,616-621)中所述的替代性工程方法製得。

技術領域中有各種方法可用於獲得抗標靶抗原之抗體。該抗體可為單株抗體，特別係人、鼠科動物、嵌合或人化來源之單株抗體，其可依照熟諳此技術人士所習知的 標準方法製得。

一般而言，在製備單株抗體或彼等之官能片段(特別是鼠科動物來源)之方面，可能參照特別是說明於手冊「Antibodies」(Harlow and Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor N.Y.,pp.726,1988)中之技術，或由Kohler及Milstein(1975,Nature,256：495-497)所述之從融合瘤製備之技術。

單株抗體可從，例如，經A-FN或其含有可被該單株抗體辨識之抗原決定部位之片段(例如：包含或由ED-A組成之片段，或ED-A之胜肽片段)中之一者免疫的動物細胞取得。該A-FN(或彼等片段之一者)可特別根據一般的操作方法，利用基因重組，從編碼A-FN(或其片段)之cDNA序列中所含的核酸序列開始，利用胜肽合成，從A-FN及/或其片段之胜肽序列中所包含之胺基酸序列開始，來加以製造。

例如，單株抗體可在親和性管柱(於其上A-FN或彼等含有可被該單株抗體辨識之抗原決定部位之片段(例如：包含或由ED-A組成之片段，或ED-A之胜肽片段)之一者已預先被固定在該管柱上)上純化。單株抗體可經由色層分析於蛋白質A及/或蛋白質G上純化，接著使用或不使用離子交換色層分析，其目的為消除殘留的蛋白質污染物以及其本身中之DNA與LPS，接著使用或不使用Sepharose凝膠上的排阻層析法，其目的為消除因二聚物 或其他多聚物之存在而可能產生的凝集。可同時使用或依續使用彼等技術之全體。

抗原結合位

此術語描述結合至並互補於標靶抗原之全部或部分的分子部分。於抗體分子中，其代表抗體抗原結合位，並包含結合至並互補於標靶抗原之全部或部分的抗體部分。當抗原較大時，抗體可能僅結合至該抗原之特定部分，此部分被稱為抗原決定部位。抗體抗原結合位可由一或多個抗體變異結構域提供。抗體抗原結合位可包含抗體輕鏈變異區域(VL)及抗體重鏈變異區域(VH)。

單離

單離意指一種狀態，其中本發明使用之專一性結合構體或編碼此專一性結合構體之核酸，通常與本發明一致。因此，如本發明之專一性結合構體、VH及/或VL結構區，可(例如)從彼等之天然環境中單離及/或純化而得，呈實質上純的或均勻形式，或在核酸之情況下，呈無或實質上無除了編碼具有所需官能之多肽的序列外之其他來源的核酸或基因。單離構體以及單離核酸無或實質上無與彼等天然相關之材料，諸如其他於彼等之天然環境中可找到之多肽或核酸，或當彼等係於體外或活體內實施重組DNA技術製備時，於製備彼等之環境(例如：細胞培養)中所找到之多肽或核酸。專一性結合構體及核酸可以 稀釋劑或佐劑配製，且仍需考慮單獨使用之實用目的，例如：該構體通常可與明膠或其他載劑(若有使用)混合，以塗覆在供免疫分析使用的微滴定盤，或當應用於診斷或治療時，可與藥學可接受之載劑或稀釋劑混合。專一性結合構體可為天然糖化的，或經異源真核細胞(例如：CHO或NS0(ECACC 85110503))細胞糖化的，或彼等可為(例如，假如係於原核細胞中表達而產生者)非糖化的。

包含抗體分子之異源製品亦可用於本發明。例如，此製品可為具有全長重鏈與缺少C端離胺酸之重鏈，具有各種糖化程度及/或衍生之胺基酸(諸如N端麩胺酸之環化，以形成焦麩胺酸殘基)的抗體之混合物。

抗原(例如：A-FN、纖維連接蛋白之ED-A)之一或多個專一性結合構體可藉由使本發明之專一性結合構體庫與抗原或其片段(例如：包含ED-A或由ED-A組成之片段，或ED-A之胜肽片段)接觸，並選擇該庫中能夠與該抗原結合之一或多個專一性結合構體。

抗體庫可利用Iterative Colony Filter Screening(ICFS)篩選。ICFS中，含有多種結合專一性之編碼DNA的細菌生長在液體培養液中，當已達指數成長階段時，將大量該等細菌分散在由預處理之適當薄膜濾紙組成的生長基上，並培養直到完全匯聚之菌落出現為止。第二阱基底(trap substrate)由另一種薄膜濾紙(經預先濕潤並以所欲之抗原覆蓋)組成。

接著將該阱薄膜濾紙以被菌落覆蓋之面朝上的方式置 於含有適當培養基的盤上，並以生長薄膜覆蓋。將所得到的夾層結構物在室溫培養約16小時。因此有可能得到擴散狀之抗體片段scFv編碼基因之表現，因而該些與存在於該阱薄膜濾紙表面之抗原專一性結合的片段即被捕捉住。接著將該阱薄膜以此處常用之比色技術處理以將結合的抗體片段指示出來。

該阱濾紙上彩色斑點的位置使得能夠回溯至存在於生長薄膜上的對應菌落，以及製造被捕捉的抗體片段。收集該等菌落並使細菌生長-將數以百萬計的該等細菌重複前述步驟而分散在新的培養薄膜上。進行類似的循環直到阱薄膜上的陽性信號對應至單一陽性菌落為止，各陽性菌落代表抗篩選中所用抗原之單株抗體片段的可能來源。ICFS描述於，例如WO0246455。

庫亦可展示在粒子或分子複合體(例如：可複製的基因封包，諸如嗜菌體(例如：T7)粒子或其他體外展示系統)上，各粒子或分子複合體含有展示於其上之抗體VH變異結構域的編碼核苷酸，如存在亦選擇性含有所展示的VL結構域編碼核苷酸。嗜菌體展示法描述於WO92/01047及例如：美國專利第US5969108號、第US5565332號、第US5733743號、第US5858657號、第US5871907號、第US5872215號、第US5885793號、第US5962255號、第US6140471號、第US6172197號、第US6225447號、第US6291650號、第US6492160號及第US6521404號。

篩選能夠結合至抗原並展示在嗜菌體或其他庫粒子或 分子複合體的結合構體之後，可從展示該被選定結合構體的嗜菌體或其他粒子或分子複合體取得核苷酸。該核苷酸可用於後續結合構體或抗體VH或VL變異結構域的製造，其係藉由表現帶有取自展示該被選定結合構體之嗜菌體或其他粒子或分子複合體之核苷酸序列的核苷酸而得。

帶有該被選定結合構體之抗體VH變異結構域之胺基酸序列的抗體VH變異結構域可以單離形式提供為包含該VH結構域之結合構體。

可進一步檢測結合至A-FN或纖維連接蛋白之ED-A或其他標靶抗原或同功異形體的能力，例如：與抗ED-A抗體F8競爭結合至A-FN或A-FN之片段(例如：纖維連接蛋白之ED-A)的能力。

本發明使用之專一性結合構體可專一性結合A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A。本發明之專一性結合構體可以與抗ED-A抗體F8(例如：scFv形式)相同或更佳之親和力結合A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A。本發明使用之專一性結合構體可以K_D 為3×10^-8 M或更佳之親和力結合A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A。較佳為，本發明使用之專一性結合構體以K_D 為2×10^-8 M或更佳之親和力結合A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A。更佳為，本發明使用之專一性結合構體以K_D 為1.7×10^-8 M或更佳之親和力結合A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A。然更佳為，本發明使用之專一性結合構體以K_D 為1.4×10^-8 M或更佳之親和力結合A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A。最佳為，本 發明使用之專一性結合構體以K_D 為3×10^-9 M或更佳之親和力結合A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A。

本發明之專一性結合構體可結合至A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A上與抗ED-A抗體F8相同的抗原決定位。

本發明使用之專一性結合構體不會顯著結合至除了A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A以外的分子。特別是該專一性結合構體不會結合纖維連接蛋白之其他同功異形體，例如纖維連接蛋白之ED-B同功異形體及/或IIICS同功異形體。

本文所揭露之抗體分子的變異體可製造並使用於本發明。在CDR、抗體VH或VL結構域(特別是抗體VH及VL結構域之骨架區域)及結合構體之胺基酸序列中進行取代的技術為技術領域中可取得者。可製造變異序列(帶有可或不可預期對活性具有最小或有益影響之取代)並測試結合A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A的能力，及/或任何其他所欲之性質。

任何VH及VL結構域之變異結構域胺基酸序列變異體，其序列具體揭露於本文者，可如所討論的依據本發明而使用。具體變異體可包括一或多個胺基酸序列改變(alteration)(胺基酸殘基之增加、刪除、取代及/或插入)，可為少於約20個改變、少於約15個改變、少於約10個改變或少於約5個改變，可能為5、4、3、2或1個。改變可製造於一或多個骨架區域及/或一或多個CDR。該改變一般不會造成功能喪失，故包含經此等改變 之胺基酸序列的專一性結合構體可保留結合A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A的能力。例如：其可保留與未製造改變之專一性結合構體相同的定量性結合(例如：如本文所述之檢驗法所測得)。包含經此等改變之胺基酸序列的專一性結合構體可具有更佳的結合A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A的能力。例如：結合如本文所提及之ED-A同功異形體或纖維連接蛋白之ED-A的專一性結合，可包含如SEQ ID NO：7所示之VH結構域及如SEQ ID NO：8所示之VL結構域，在該VH及/或VL結構域的骨架區域之中帶有10個或更少(例如：5、4、3、2或1個)胺基酸取代。該等專一性結合構體可以相同或實質上相同於包含如SEQ ID NO：7所示之VH結構域及如SEQ ID NO：8所示之VL結構域的專一性結合構體的親和力，結合ED-A同功異形體或纖維連結蛋白之ED-A，或者以比包含如SEQ ID NO：7所示之VH結構域及如SEQ ID NO：8所示之VL結構域的專一性結合構體更高的親和力結合ED-A同功異形體或纖維連結蛋白之ED-A。

本發明使用之帶有CDR衍生序列的新穎VH或VL區域，可利用一或多個被選定VH及/或VL基因之隨機突變以在整個變異結構域中產生突變而製造。在一些實施例中，係於整個變異結構域或CDR組中製造一或二個胺基酸取代。另一種可使用的方法為定點突變VH或VL基因之CDR區域。

如前文所述，實質如本文所載之CDR胺基酸序列可 攜帶為人抗體變異結構域或其主要部分中的CDR。實質如本文所載之HCDR3序列代表本發明之實施例，且例如彼等序列之個別可攜帶為人重鏈變異結構域或其主要部分中的HCDR3。

本發明所用之變異結構域可取自或衍生自任何生殖細胞系或重排人變異結構域，或可為以已知人變異結構域之一致或真實序列為主的人工合成變異結構域。變異結構域可衍生自非人抗體。本發明使用之CDR序列(例如：CDR3)可利用重組DNA技術導入缺少CDR(例如：CDR3)之變異結構域庫(repertoire)。例如：Marks等人(1992)描述製造製造抗體變異結構域庫的方法，其中將針對或鄰近變異結構域範圍5'端的共同引子(consensus primer)與針對人VH基因之第三骨架區域的共同引子一起使用以提供缺少CDR3之VH變異結構域庫。Marks等人進一步描述如何將此庫與特定抗體之CDR3結合。使用類比技術(analogous techniques)的情況下，本發明之CDR3衍生序列可與缺少CDR3的VH或VL結構域庫改組，而經改組的完整VH或VL結構域與同源VL或VH結構域結合以提供本發明使用之結合構體。接著可將該庫展示於適當宿主系統中(諸如WO92/01047或任何後續的大部分文獻，包括Kay,Winter & McCafferty(1996)的嗜菌體系統)，以便篩選適當的結合構體。庫可由任何大於10⁴ 以上之個別組成員組成，例如：至少10⁵ 、至少10⁶ 、至少10⁷ 、至少10⁸ 、至少10⁹ 或至少10¹⁰ 個組成 員。

相同的，一或多個或全部三個CDR可被移植到VH或VL結構域庫中，然後用來篩選結合A-FN及/或纖維連結蛋白之ED-A的結合構體。

可使用抗體F8之HCDR1、HCDR2及HCDR3之一或多個或抗體F8之HCDR組，及/或可使用抗體F8之LCDR1、LCDR2及LCDR3之一或多個或抗體F8之LCDR組。

相同的，本使用本文所揭露之其他VH及VL結構域、CDR組及HCDR組及/或LCDR組。

A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A可用於篩選用來製備供治療IBD之藥物的專一性結合構體(例如：抗體分子)。該篩選可為篩選本文他處所揭露之庫。

免疫球蛋白變異結構域之主要部分可包含至少該三個CDR區域，以及彼等中間之骨架區域。該部分亦可包括至少約50%的第一及第四骨架區域之一者或兩者，該50%為第一骨架區域之C端的50%及第四骨架區域之N端的50%。位於該變異結構域主要部分之N端或C端的額外殘基可為該些一般不與天然存在之變異結構域區域相連接的殘基。例如：由重組DNA技術所製造的本發明之專一性結合構體的構築體(construction)，可能造成導入由連接子編碼的N或C端殘基以促進選殖或其他操作步驟。其他操作步驟包括導入連接子以將本文他處所揭露之變異結構域連接至另外的蛋白質，包括：抗體恆定區域、其他變 異結構域(for example in the production of diabodies)或如本文他處詳盡描述的可偵測/功能性標定物。

雖然專一性結合構體可包含一對VH及VL結構域，以VH或VL結構域序列為主之單一結構域亦可用於本發明中。已知單一免疫球蛋白結構域(特別是VH結構域)能夠以特定方式結合標靶抗原。例如：參見前文所述之dAbs。

以單一結合結構域而言，彼等結構域可用於篩選互補結構域，其能夠形成可以結合A-FN及/或纖維連接蛋白之ED-A的二結構域結合構體。此可由利用如WO92/01047中所揭露之所謂階層式雙重結合方法(hierarchical dual combinatorial approach)的嗜菌體展示篩選法達成，其中含有H或L鏈選殖株的個別菌落被用來感染編碼另一鏈(L或H)之選殖株的完整基因庫，並根據諸如彼等描述於參考文獻中的嗜菌體展示技術選擇所生成的二鏈結合構體。此技術亦揭露於Marks 1992。

本發明使用之專一性結合構體可進一步包含抗體恆定區域或其部分，例如人抗體恆定區域或其部分。例如：VL結構域可在其C端連接至包括人Cκ或Cλ鏈之抗體輕鏈恆定結構域(例如：Cλ)。相同的，以VH結構域為主的專一性結合構體可在其C端連接至全部或部分(例如：CH1結構域)之衍生自任何抗體同型(isotype)(例如：IgG、IgA、IgE及IgM)及任何同型子分類(特別是IgG1及IgG4)的免疫球蛋白重鏈。任何具有彼等性質並穩定 化變異區域的人工合成或其他的恆定區域變異體，亦可用於本發明之實施例。

本發明使用之專一性結合構體可以可偵測或功能性標定物進行標定。標定物可為任何產生信號或可以被引發產生信號的分子，包括但不限於螢光增白劑、放射性標定物、酶、化學發光劑或光增感劑。因此可藉由偵測螢光或冷光、放射活性、酶活性或光吸收度而偵測及/或測量結合。可偵測標定物可利用技術領域中習知的常用化學連接到本發明使用之抗體。

標定物可以許多方法產生可藉由外部手段偵測的信號，例如：藉由目測檢查、電磁輻射、熱及化學試劑。該標定物亦可結合至另一個結合至本發明使用之抗體的專一性結合構體，或結合至支持物。

經標定的專一性結合構體(例如：以可偵測標定物標定之scFv)可於診斷上及/或治療上使用於體內(in vivo )、擬體內(ex vivo )或體外(in vitro )。

例如：經放射標定之結合構體(例如：共軛至放射性同位素之結合構體)可使用於放射性診斷及放射性治療。可共軛至本發明使用之結合構體的放射性同位素包括諸如^94m Tc、^99m Tc、¹⁸⁶ Re、¹⁸⁸ Re、²⁰³ Pb、⁶⁷ Ga、⁶⁸ Ga、⁴⁷ Sc、¹¹¹ In、⁹⁷ Ru、⁶² Cu、⁶⁴ Cu、⁸⁶ Y、⁸⁸ Y、⁹⁰ Y、¹²¹ Sn、¹⁶¹ Tb、¹⁵³ Sm、¹⁶⁶ Ho、¹⁰⁵ Rh、¹⁷⁷ Lu、¹²³ I、¹²⁴ I、¹²⁵ I、¹³¹ I、¹⁸ F、²¹¹ At及²²⁵ Ac之同位素。較佳為使用諸如¹⁸ F及¹²⁴ I之正子發射體或諸如^99m Tc、¹¹¹ In及¹²³ I之γ發射體於診斷應 用(例如：用於PET)，而諸如¹³¹ I、⁹⁰ Y及¹⁷⁷ Lu之β發射體則較佳為使用於治療應用。諸如²¹¹ At及²²⁵ Ac之α發射體亦可用於治療。

例如：經可偵測標定物標定之本發明使用之專一性結合構體可用於偵測、診斷或監測人或動物之IBD。

本發明使用之專一性結合構體可用於製造供診斷IBD之診斷產品。

本發明使用之結合構體及對於病灶中標靶細胞發揮殺生物效果、細胞毒性免疫抑制效果或抗發炎性效果的分子及直接針對存在於該病灶之胞外基質的抗體之間的共軛物或融合物可使用於本發明中。例如：該共軛分子可為介白素-10。該共軛物可用於治療上，例如：用於治療本文所提及之IBD。

專一性結合構體與殺生物性或細胞毒性分子之融合物或共軛物的製造及用途係描述於例如WO01/62298之中。

本發明使用之專一性結合構體可為下列之共軛物：(i)藉由細胞交互作用對標靶細胞發揮抗發炎性效果的分子，抗發炎性分子，細胞激素(例如：IL-10)以及(ii)纖維連接蛋白之ED-A同功異形體及/或纖維連接蛋白之ED-A的專一性結合構體。

本發明使用之專一性結合構體可為下列之共軛物：(i)發揮免疫抑制性或抗發炎性效果的分子及(ii)纖維連接蛋白之ED-A同功異形體及/或纖維連接蛋白之ED-A的專一性結合構體。

本發明使用之專一性結合構體較佳為下列之共軛物：(i)介白素-10(IL10)及(ii)纖維連接蛋白之ED-A同功異形體及/或纖維連接蛋白之ED-A的專一性結合構體。該專一性結合構體可用於本文所揭露之發明的關於治療IBD之態樣中。

本文亦述及下列之共軛物：(i)藉由細胞交互作用發揮殺生物性或細胞毒性效果之分子，或發揮免疫抑制性或抗發炎性效果之分子及(ii)纖維連接蛋白之ED-A同功異形體及/或纖維連接蛋白之ED-A的結合構體。該共軛體較佳為包含融合蛋白質，該融合蛋白質包含殺生物性、細胞毒性、免疫抑制性或抗發炎性分子以及該結合構體，或者，當該結合構體為二鏈或多鏈時，該融合蛋白質包含該殺生物性、細胞毒性、免疫抑制性或抗發炎性分子以及該結合構體的多肽鏈組分。較佳為該結合構體係單鏈多肽，例如：諸如scFv的單鏈抗體分子。

本文所稱之共軛物可表現為融合蛋白質。因此，包含免疫抑制性或抗發炎性分子以及單鏈Fv抗體分子的融合蛋白可用於本發明中。

該藉由細胞交互作用對標靶細胞發揮其之效果的免疫抑制性或抗發炎性分子，可直接與該標靶細胞交互作用、可與結合至標靶細胞之細胞膜上的受體交互作用或擾亂細胞膜的電化學電位。較佳為該分子係IL-10。

較佳為該共軛至專一性結合構體之分子係IL-10。

如下文所詳述，本發明中使用之專一性結合構體較佳 為抗體分子或包含抗體抗原結合位。該專一性結合構體較適合為單鏈多肽，諸如單鏈抗體。如此得以方便製造包含單鏈抗體及(例如)免疫抑制性或抗發炎性分子的融合蛋白(例如：介白素-10或TGFβ)。抗體抗原結合位可藉由連結分離之多肽中(例如：在完整的抗體中或在諸如Fab或雙功能抗體之抗體片段中)的抗體VH結構域與抗體VL結構域而提供。專一性結合構體係二鏈或多鏈分子(分別例如Fab或完整抗體)時，免疫抑制性或抗發炎性分子(例如)可共軛為專一性結合構體中有一或多個多肽鏈的融合多肽。

專一性結合構體可藉由肽鍵之手段與免疫抑制性或抗發炎性分子共軛，意即：在融合多肽中包含該分子及該專一性結合構體或其多肽鏈組分(參見例如Trachsel等人之文獻)。其他用於共軛之手段包括化學共軛，特別是利用雙功能試劑進行交聯(例如：利用DOUBLE-REAGENTS^TM Cross-linking Reagents Selection Guide,Pierce)。

亦提供者為編碼本發明使用之專一性結合構體的單離核酸。核酸可包括DNA及/或RNA。核酸可為CDR或CDR組或VH結構域或VL結構域或抗體抗原結合位或抗體分子之編碼，例如：如前文定義之scFv或IgG(例如：IgG1)。核苷酸序列可編碼本文所揭露之VH及/或VL結構域。

本文進一步詳述者為質體(plasmid)、載體 (vectors)、轉錄或表現匣(cassette)形式之構築體，其包含至少一種前文所述之多核苷酸。

亦提供包含一或多種如前述之構築體的重組宿主細胞。編碼任何CDR或CDR組或VH結構域或VL結構域或抗體抗原結合位或抗體分子(例如所提供之scFv或IgG1或IgG4)之核酸係描述為製造所編碼之產物的方法，該方法包含從編碼核酸進行表現。表現可藉由在適當之條件下培養含有該核酸之重組宿主細胞而達成。在藉由表現而製造之後，VH或VL結構域或專一性結合構體可利用合適的技術進行單離及/或純化，接著在適當時使用。

核酸可包含DNA或RNA並可為完整或部分人工合成的。提及如本文所載之核苷酸序列時，含括帶有具體指明之序列的DNA分子，並含括帶有具體指明之序列又除非另有說明否則其中之T被U取代的RNA分子。

一種製造抗體VH變異結構域之方法，亦述及包括致使從編碼核酸進行表現之方法。該方法可包含將宿主細胞培養在用於製造該抗體VH變異結構域的條件下。

製造方法可包含單離及/或純化產物之步驟。製造方法可包含將產物調配為包括至少一種額外組分(諸如醫藥上可接受之賦形劑)之組成物。

用於在多種不同宿主細胞中選殖及表現多肽的系統為技術領域所熟知。適當的宿主細胞包括細菌、哺乳類細胞、植物細胞、絲狀真菌、酵母菌及桿狀病毒系統及基因 轉殖植物及動物。在原核細胞中表現抗體及抗體片段為技術領域中所確立。回顧文獻參見例如Plückthun(1991),Bio/Technology 9：545-551。常見的細菌宿主為E.coli 。

在培養的真核細胞中表現亦為技術領域中熟諳技術者可取得來製造專一性結合構體的選擇，例如Chadd等人之文獻(2001)(Current Opinion in Biotechnology 12：188-194)；Andersen等人之文獻(2002)(Current Opinion in Biotechnology 13：117)；Larrick & Thomas(2001)(Current Opinion in Biotechnology 12：411-418)。技術領域中可取得來表現異源多肽的哺乳類細胞株包括中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary(CHO))細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞(baby hamster kidney cell)、NS0小鼠黑色素瘤細胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細胞、人胚胎腎細胞、人胚胎網膜細胞及多種其他細胞。

可選擇或構築含有適當調節序列之合適載體，該適當調節序列包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因及適用的其他序列。載體可為質體(例如：噬質體(phagemid))或適用的病毒(例如：'噬菌體)。更進一步的細節參見，例如：Sambrook & Russell(2001)(Molecular Cloning：a Laboratory Manual ：3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。許多用於操縱核酸(例如：核酸構築體之製備、突變、定序、將DNA導入細胞及基因表現)與分析蛋白質的已知技術及實驗流程細節詳述於Ausubel等人之 文獻(1999)(4^th eds.,Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons)。

宿主細胞可含有如本文所述之核酸。該宿主細胞可於體外(in vitro )或於培養中。該宿主細胞可於體內(in vivo )。存在於體內(in vivo )之宿主細胞使得本發明使用之結合構體能夠細胞內表現為「內抗體(intrabody)」或細胞內抗體(intracellular antibody)。內抗體可用於基因治療。

本文亦描述一種包含將本文所揭露之核酸導入宿主細胞之方法。該導入作用(introduction)可利用任何可取得之技術。以真核細胞來說，合適的技術可包括磷酸鈣轉染法、DEAE-葡萄聚糖法、電穿孔法、微脂體調介之轉染法及利用反轉錄病毒或其他病毒(例如：牛痘病毒)之轉導法，以昆蟲細胞而言則包括桿狀病毒。將核酸導入宿主細胞(特別是真核細胞)可使用病毒或以質體為主之系統。該質體系統可保持為游離於基因體的或可合併入宿主細胞或併入人工染色體。合併作用可為一或多個基因複本(copy)在單一或多個基因座的隨機或標靶嵌合。以細菌細胞而言，合適的技術可包括氯化鈣轉形法(transformation)、電穿孔法及利用噬菌體之轉染法。

在導入作用之後可接著引發或使該核酸得以表現，例如：藉由將宿主細胞培養在表現基因的條件下。所表現產物之純化可藉由技術領域中熟諳技術者已知的方法達成。

核酸可嵌入宿主細胞之基因體(例如：染色體)。可藉由根據標準技術納入促進與基因體重組之序列而促進嵌合作用(Integration)。

本文亦描述一種在表現系統中利用前文說明之構築體以表現如前述之專一性結合構體或多肽的方法。

本發明使用之專一性結合構體係設計來用於診斷或治療人或動物個體(例如：人)之方法。本發明使用之專一性結合構體可用於診斷或治療IBD。

因此，本發明提供包含施予如所述之專一性結合構體的治療方法、包含該專一性結合構體之醫藥組成物及該專一性結合構體用於製造供施予之藥物的用途，例如：製造藥物或醫藥組成物的方法，其包含將專一性結合構體與醫藥上可接受之賦形劑一起調配。醫藥上可接受之媒液為技術領域中熟諳技術者已知並可依照活性化合物之性質及所選擇的施予模式調整。

本發明使用之專一性結合構體通常會以醫藥組成物的形式施予，其可包含除該專一性結合構體以外的至少一種組分。因此，本文所述並根據本發明所用之醫藥組成物，除活性成分外，可包含醫藥上可接受之賦形劑、載劑、緩衝劑、安定劑或其他技術領域中熟諳技術者習知的物質。該物質應為無毒的且不應干擾活性成分的功效。載劑或其他物質的確切性質將視施予的途徑而定，該途徑可為口服、吸入或注射(例如：靜脈注射)。

用於口服施予之醫藥組成物(諸如例如奈米抗體 (nanobody)等)亦於本發明之設想中。該口服配方可為片劑、膠囊、粉劑、液體或半固體形式。片劑可包含諸如明膠之故體載劑或佐劑。液體醫藥組成物一般包含諸如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油之液體載劑。生理食鹽水溶液、葡萄糖或其他醣類溶液或諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇之二元醇可被包括在內。

以靜脈注射或注射於患部而言，活性成分之型態將為非口服上可接受之水溶液，其不含熱源(pyrogen-free)並具有適當的pH值、等張力性及安定性。該等技術領域中之相關技術可用來製備合適的溶液，例如：諸如Sodium Chloride Injection、Ringer's Injection、Lactated Ringer's Injection之等張媒液。如有需要，可使用防腐劑、安定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。許多醫藥調配物的製備方法為技術領域中熟諳技術者所已知。參見例如Robinson ed.,Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

視所治療的病況而定，組成物可單獨或與其他治療合併，同時或依序或作為與其他治療劑或試劑之組合製劑而施予。

本發明使用之專一性結合構體可與額外藥品組分結合結合用作為組合療法之部分。組合治療可用來提供顯著的加乘效應，特別是將本發明使用之專一性結合構體與一或多種其他藥品組合。本發明使用之專一性結合構體可同時 或依序或作為與其他治療劑或試劑之組合製劑而施予，用來治療一或多種本文所列之病況。

例如：本發明使用之專一性結合構體可與既存之治療劑組合使用來治療IBD。

本發明使用之專一性結合構體及一或多個前述之額外藥品組分可用於製造藥物。該藥物可分別或結合的形式施予個體，據此可為包含專一性結合構體及額外組分的組合製劑或分別製劑形式。分別製劑有助於分別的及依序或同時施予，並容許組分之施予得以經由不同途徑(例如：口服及非口服施予)為之。

依據本發明，所提供之組成物可施予哺乳類。可以「治療有效劑量」施予，此劑量足以對患者展現益處。該益處可為至少改善至少一種病徵。因此「IBD之治療」代表改善至少一種病徵。施予的真實劑量及施予的頻率與時程，將依治療之性質及嚴重性、所治療的特定哺乳類動物、個別患者之臨床病況、失去調控之起因、傳遞組成物之位置、專一性結合構體的類型、施予之方法、施予之排程及其他醫療實務已知的因素而定。治療處方(例如：劑量等之決定)係在一般開業者及其他醫生的職責範圍內，且可視病徵之嚴重性及/或所欲治療之疾病的進程而定。抗體的合適劑量為技術領域所習知(Ledermann et al.(1991)Int.J.Cancer 47：659-664；and Bagshawe et al.(1991)Antibody,Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4：915-922)。當適用於所施予的藥物類型時，可使用本文 或在Physician's Desk Reference(2003)中所指出的具體劑量。本發明使用之專一性結合構體的治療有效劑量或合適劑量可藉由比較其之體外活性及在動物模式之體內活性而測定。已知小鼠或其他試驗動物至人之有效劑量的推斷方法。精確劑量將視數個因素而定，包括：抗體係用於診斷、預防或治療，所欲治療之範圍大小及位置，確切的抗體性質(例如：完整抗體、片段或雙功能抗體)，以及任何附著至抗體的可偵測標定物或其他分子之性質。一般的抗體劑量於全身性應用會在100μg至1g範圍內，局部應用則會在1μg至1mg範圍內。初始可施予較高的載入劑量，接著施予一或多個較低劑量。抗體可為完整抗體，例如：IgG1或IgG4同型。此係用於成年患者之單一治療的劑量，其可依比例調整而用於孩童及嬰幼兒，亦可依其他抗體形式之分子量比例調整。治療可依醫師判斷以日、雙週、週或月為間隔重複。治療於皮下施予的情況可為每二至四週一次，而於靜脈施予則為每四到八週一次。在本發明之一些實施例中，治療可為週期性的，且兩次施予之間的間隔係約二週或更久，例如：約三週或更久、約四週或更久或約一個月一次。在本發明之其他實施例中，可在手術前及/或手術後給予治療，並可直接施予或施用至手術治療的解剖位置。

發炎性腸病(IBD)

發炎性腸病係一群影響結腸及小腸的發炎性病況。 IBD的主要類型為克隆氏症(Crohn’s disease(CD))及潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis(UC))，而其他類型的IBD包括膠原性結腸炎(collagenous colitis)、淋巴球性結腸炎(lymphocytic colitis)、缺血性結腸炎(ischaemic colitis)、分流性結腸炎(diversion colitis)、貝賽特氏病(Behçet’s disease)及未定型結腸炎(indeterminate colitis)。CD可影響腸胃道的任何部分，然而UC通常僅侷限在結腸及直腸。

本文中所稱之IBD可為CD、UC、膠原性結腸炎、淋巴球性結腸炎、缺血性結腸炎、分流性結腸炎、貝賽特氏病或未定型結腸炎。特別是本文中所使用之術語CD、UC、膠原性結腸炎、淋巴球性結腸炎、缺血性結腸炎、分流性結腸炎、貝賽特氏病及未定型結腸炎，可分別指稱活躍性CD、活躍性UC、活躍性膠原性結腸炎、活躍性淋巴球性結腸炎、活躍性缺血性結腸炎、活躍性分流性結腸炎、活躍性貝賽特氏病及活躍性未定型結腸炎。在一實施例中，該IBD可為CD或UC。在另一實施例中，該IBD可為CD、膠原性結腸炎、淋巴球性結腸炎、缺血性結腸炎、分流性結腸炎、貝賽特氏病或未定型結腸炎。在進一步實施例中，該IBD不為UC。該IBD可為一種通常不侷限於結腸及直腸發炎的IBD，諸如CD。該IBD可為一種不僅止影響結腸內膜之IBD。在較佳實施例中，該IBD係CD。最佳為該IBD係活躍性CD。

技術領域中熟諳技術者以包括下列實驗範例之本揭露 文件，將能明白了解本發明之更多態樣及實施例。

所有在此說明書中提及之文件均以引用方式將彼等之全文併入本文中。

本文中所使用的「及/或」被視為明確的揭示二個特定特徵或組份中之每一個，具有或不具有另一個。例如「A及/或B」被視為明確的揭示(i)A、(ii)B及(iii)A與B的每一個，就如同在此個別地敘述該每一個。

除非另有說明，否則前文所載之特徵的描述及定義並不侷限於任何本發明的特定態樣或實施例，並同等的適用於所有所述之態樣及實施例。

本發明之某些態樣及實施例現在將以實例之說明並參照至前文所述之圖式。

實驗 材料及方法 小鼠IBD模式

與施予DSS相關的IBD小鼠模式為技術領域中所已知。適當小鼠模式之描述亦見於例如：Okayasu等人之文章(1990)(Gastroenterology,98,694-702)。

本文所述之實驗係藉由在飲用水中加入3%葡聚糖硫酸酯鈉鹽(DSS)(MP BioMedicals)7天，接著給予3至5天之正常飲用水，而在C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)中引發結腸炎。在本研究 之全程中均給予對照組小鼠一般的水。利用第3至5天之潛血檢測以及每日的體重變化作為監測小鼠疾病引發/進展之證明。於停止在水中添加DSS後3至5天的不同時間犧牲小鼠，以評估F8-IL-10之標靶、區域定位及藥理學效果。

¹²⁵ I-F8/IL10放射性碘標定、純化、特性分析及用劑溶液製備

¹²⁵ I-F8/IL10係利用琥珀酸二亞胺基-碘苯甲酸酯(SIB)(Zalutsky & Narula(1988)Cancer Research,48,1446-1450；Zalutsky & Narula(1987)Appl.Radiat.Isot.38,1051-1055；Cheng,et al.(2002)J.Med.Chem. 45,3048-3056)製備。簡言之，將一分量的碘-125(20μL~2.0mCi)(Perkin Elmer,Waltham,MA)與2.5μg N-琥珀酸二亞胺基-3-(三-正丁錫烷基)苯甲酸酯(C₂₃ H₃₅ NO₄ Sn；MW=508.23，由Texas Biochemicals,Inc.College Station,TX合成)和作為氧化劑之10μg NCS(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在50μL之含有1.5%醋酸(v：v)的甲醇(均購自Sigma-Aldrich)中反應。在室溫培養15分鐘後，添加10μg硫酸氫鈉(還原劑)(Sigma-Aldrich)並在室溫額外培養5分鐘，以將反應溶液中剩餘之氧化劑淬熄。於室溫在pH 8.0培養20分鐘，以將經¹²⁵ I標定之SIB共軛結至F8-IL10抗體(約0.2mg，起始莫耳比係中間物對抗體約為2.5：1)。將經過放射標定之產物(¹²⁵ I-F8/IL10) 利用經預平衡之PD-10管柱(GE Healthcare,Little Chalfont,Buckinghamshire,UK)(利用牛血清白蛋白使管柱上可能的非專一性蛋白結合位飽和，接著以至少三倍管柱體積之PBS沖洗管柱)純化，洗提於PBS中。所得之放射化學產率約為30%。

分別以粒徑排阻層析法(size exclusion chromatogram(SEC))及EDA-親和性管柱特性化分析¹²⁵ I-F8/IL10的放射化學純度(radiochemical purity(RCP))及生物活性。在SEC分析方面，將約略1μCi之¹²⁵ I-F8/IL10產物溶液注射至配備有粒徑排阻管柱(G3000SWx1,TOSOH Biosciences,Tokyo,Japan)的HPLC(Agilent 1100，配備有同軸放射活性偵測器)中，並以25mM磷酸鹽緩衝液、0.15M NaCl、pH 6.8之流動溶劑用每分鐘1mL之流速洗滌。比較¹²⁵ I-F8/IL10在放射測量層析法中的滯留時間與參考F8/IL10在UV(280nm)層析法中的滯留時間以確認其特性。¹²⁵ I-F8/IL10的RCP大於99%，放射性比活性(radioactive specific activity)約略為4.5mCi/mg。

透過EDA親和性管柱檢測法測定¹²⁵ I-F8-IL10之生物活性。簡言之，將一分量(約略1μCi)¹²⁵ I-F8/IL10填裝至經預平衡的EDA親和性管柱(含有250μL EDA樹脂，藉由以2mL BSA(2mg/mL於PBS中)阻斷非專一性結合位接著以8mL PBS洗滌管柱而實施預平衡)。以6mL之BSA(2mg/mL於PBS中)洗滌該親和性管柱並等分收集析出液。在γ計數器中測量所收集之析出液的放射活 性及該親和性管柱上所殘留之放射活性。計算殘留在EDA-樹脂管柱之放射活性對總填裝放射活性的百分比。以¹²⁵ I-F8/IL10而言，殘留在親和性管柱上之放射活性百分比為64%。

將¹²⁵ I-F8/IL10與未經標定之F8/IL10(F8/IL10儲存溶液)以及製劑緩衝液混合，成為用於PK及組織分布研究之用劑溶液所需之最終濃度。受試品(test article)溶液係在給藥當日製備，並在施予動物之前才帶到室溫下。

¹²⁵ I-F8/IL10在IBD小鼠模式中的生物分布及區域定位至結腸

在投藥(開始DSS處理後的第5至7天)的約略2至4天之前，將未經或經DSS處理之小鼠均以碘化鉀(KI)水(20mM)處理，以阻斷甲狀腺吸收任何在體內可能產生的未結合之游離I-125。在開始DSS處理後的第9天，經由靜脈(IV)注射施予單劑¹²⁵ I-F8/IL10。每組之劑量及放射活性說明如下：

i)第0組-每隻小鼠的約略劑量：5mg/kg

第0組-每隻小鼠的約略放射活性：7.5μCi(比活性75uCi/mg)。

ii)第1組-每隻小鼠的約略劑量：5mg/kg

第1組-每隻小鼠的約略放射活性：10μCi(比活性100uCi/mg)。

iii)第2組-每隻小鼠的約略劑量：0.15mg/kg，

第2組-每隻小鼠的約略放射活性：12μCi(比活性 4490uCi/mg)。

分別在5分鐘、1、3、6、24、48及96小時將次群體小鼠進行採血及收集不同組織。血液樣本係藉由心臟穿刺或眼後採血收集至血清分離收集管。藉由將血液樣本在10,000g離心5分鐘收集血清樣本。組織收集方面，則係於犧牲動物並在採集血液樣本及全身性灌流之後，立刻收集感興趣之組織。全身性血液灌流係藉由在約略10分鐘期間施予約略20mL之肝素-PBS(每mL 25單位)而實施。收集並秤重感興趣之組織，包括：腦、腸繫膜淋巴結、皮膚、脂肪、大腿肌肉、肺、心、脾、肝、胃、小腸、大腸及。將GI中的內容物移除。直接以γ計數器測量組織樣本中的放射活性(以cpm表達之總計數)。

患病及健康小鼠之結腸自動放射攝影

在來自第0組及第2組小鼠之結腸進行結腸放射線自動攝影(radio-autography)。收集結腸、清除彼等之內容物並將組織暴露於放射性磷掃描屏(phosphor-imaging screen)(Molecular Dynamics)24小時，並經由Storm 860攝影。結果顯示於圖2。第1道：注射6小時之後，收集自第0組(健康小鼠)之結腸；第2道：注射6小時之後，收集自第2組(經DSS處理小鼠)之結腸；第3道：注射24小時之後，收集自第0組(健康小鼠)之結腸；第4道：注射24小時之後，收集自第2組(經DSS處理小鼠)之結腸。沿著經DSS處理小鼠之結腸，可觀 察到不均勻塊狀的¹²⁵ I-F8/IL10局部定位(localization)，在正常小鼠中則未能觀察到，此結果與本模式中不規則的結腸發炎及相關的標靶EDA表現剖繪數據(profile)相符。

測定血清及組織中的放射活性當量濃度與藥物動力學計算

¹²⁵ I-F8/IL10之血清當量濃度(ng eq./g)係以所測得的TCA(三氯乙酸)沈澱性(與蛋白質連接)放射活性為基礎進行估算。為了進行TCA沈澱作用，將等分量(50μL)之血清樣本與50μL小鼠血清混合，接著添加100μL之20% TCA溶液。將樣本混合物在10,000g旋轉5分鐘以沈澱蛋白質。測定總體放射活性及上清液中的TCA可溶性放射活性。利用一給定樣本中的TCA-沈澱性放射活性(cpm)、用劑溶液之比活性(每mg蛋白質的TCA-沈澱性cpm)，以及採樣(t_S )與用劑溶液(t_D )測量之日期，以下列方程式計算給定樣本中受試品的當量濃度(ng eq./mL)：[TCA-沈澱性cpm/EXP(-0.693/60.2*(t_S -t_d ))]/[比活性(以cpm/mg表示)*樣本體積(以mL表示)]。

¹²⁵ I-F8/IL10在組織中的當量濃度(ng eq./g)定量係以在樣本中測得之總體放射活性及校正¹²⁵ I之物理性衰退半衰期後用劑溶液之比活度為基礎，利用下列方程式計算：[樣本cpm/EXP(-0.693/60.2*(t_S -t_D ))]/[比活性(以cpm/mg表示)*樣本重量(以mg表示)]。組織樣本沒有進行均質作用或TCA-沈澱作用。除了放射活性當量濃度 (血清為ng eq./mL，組織為ne eq./g)之外，亦計算血清及感興趣之組織的每克注射劑量百分比(%ID/g)及/或注射劑量百分比(%ID)。

在注射後6小時(圖3A)、24小時(圖3B)及96小時(圖3C)，測定正常小鼠(第0組)及經DSS處理小鼠(第1組)中¹²⁵ I-F8/IL10的生物分布。

利用受測時間點之平均血清或組織濃度計算PK參數。使用藥物動力學套裝軟體WinNonlin(第5.1版，Pharsight)的非模室數據分析(non-compartmental analysis)模組。利用線性梯形法(linear trapezoidal method)計算濃度對時間曲線(AUC)底下之面積。

IBD小鼠模式中F8-IL10治療性處理對血清細胞激素量之效用

既已知IL-10會降低發炎前細胞激素(proinflammatory cytokine)，吾人測試在IBD小鼠模式中施予F8-IL10是否會影響此模式中的血清細胞激素反應。在開始DSS處理後第3、6及9天，靜脈注射施予每隻小鼠200μg之F8-IL10或對照組小型免疫蛋白(small Immune Protein(F8-SIP))(n=10小鼠/組)。此給藥方式與膠原蛋白引發關節炎模式中的有效方式相同(Schwager K,et al.Arthritis Research and Therapy,(2009)11：R142)。對照組包括無患病組(一般水)及未經治療之患病組(n=10小鼠/組)。在開始DSS處理之後的第10天，收集血液並 以如前文所述區域定位研究之方式取得血清。利用MSD技術平台及小鼠7plex MSD套組，根據製造商之說明估測血清中IL-1β、IL-12p40、IFNg、IL-6、KC、IL-10及TNFa的量(Mesoscale Discovery,Gaithersburg,MD)。圖4及5中細胞激素量表示為每ml血清中有多少pg蛋白質。

EDA表現的人組織染色

以免疫組織化學分析OCT包埋的冷凍結腸組織樣本，樣本係來自患有潰瘍性結腸炎的60歲女性患者及患有克隆氏症(Crohn’s disease)的42歲男性患者。二樣本均以SIP形式之F8抗體及溫韋伯氏因子(von Willebrand factor)進行探測。

此外，來自患有克隆氏症或潰瘍性腸炎相同患者(n=3克隆氏症患者及n=5 UC患者)的患部及非患部冷凍切片配對樣本係自Analytical Biological Services(Wilmington,DE)取得。將冷凍樣本置於乾冰上以避免融化，將其包埋於充滿O.C.T.化合物(Tissue-Tek #4583)的Cryomolds標準模具(Tissue-Tek 4557)中並在經過乾冰冷卻之異戊烷中快速冷凍。將組織塊以Leica CM1850冷凍切片機切片為4微米，將切片放置於玻片上並儲存於-80℃直到進行免疫組織化學染色(IHC)為止。開始IHC時，將組織浸入冷的(-20 F)甲醇(Fisher Scientific A412P-4)中以除去儲存可能形成的溼氣，並在 室溫風乾20分鐘。接著將組織浸入冷的(-20F)丙酮(ACROS CAS # 67-64-1)10分鐘，並在室溫風乾10分鐘。

以適當的Ventana條碼標記組織玻片，並將其置入Ventana Discovery XT進行Fibronectin F8 SIP或KSF SIP(對照組抗體)IHC。將內生性生物素以Ventana S Block(Ventana 760-4212)中的5%正常小鼠血清(Jackson Immuno Research 015-000-120)阻斷20分鐘，並以Ventana Biotin Blocking kit(Ventana 760-050)阻斷8分鐘。將纖維連接蛋白F8SIP或KSF以1：200濃度(每片玻片100ul)稀釋在Dako抗體稀釋液(S0908)(Dako North America,Carpinteria,CA)中，並培養40分鐘。在完成運轉程序前，將玻片以蘇木色素(hematoxylin)及藍色試劑進行對比染色(各4分鐘)。將玻片取出並置入Ventana Symphony，以進行接下來的脫水及封片。IHC之代表性照相顯示於圖7。來自潰瘍性腸炎患者UH0501-34(上)及克隆氏症患者UH0405-09(下)之非患部(左)及患部(右)組織樣本的IHC。

結果 結腸自動放射攝影

圖2顯示非患病小鼠(水)(第1及3道)或患病小鼠(經DSS處理)(第2及4道)的結腸，在施予經放射標定之F8-IL10後第6小時(第1及2道)或第24小 時(第3及4道)之自動放射攝影。此結果顯示F8-IL10在發炎結腸中的累積確實比正常結腸多。F8-IL10在患病結腸中局部定位的不均勻塊狀現象，與此模式中沿結腸所觀察到的發炎及EDA表現量的多變性相符合，進一步支持F8-IL10會區域定位於發炎處的理論。

¹²⁵ I-F8-IL10在患病小鼠及健康小鼠中的生物分布

圖3顯示患病(DSS)小鼠與正常(水)小鼠比較，¹²⁵ I-F8-IL10在第6、24及96小時時間點積聚在結腸及腸繫膜淋巴結(L.N.)之情形。相似於圖2，彼等資料顯示在經DSS處理之小鼠中，F8-IL10會標靶至結腸及相連之淋巴結。從彼等研究亦可看出，血清半衰期測定為約略3.5小時，而結腸中的F8-IL10半衰期則為約略35小時；10倍上升量代表組織持久性增強。此結果指出在結腸發炎期間，F8-IL10不僅標靶至以結腸及腸繫膜淋巴結，一旦抵達後，其相較於在循環中亦滯留較久。總結來說，彼等資料代表在結腸發炎之情況下(例如人的克隆氏症及潰瘍性結腸炎)，F8-IL10傾向於標靶至並滯留於彼等位置。

來自患病小鼠及健康小鼠之血清中的細胞激素量

圖4顯示相較於對照組，以治療形式施予F8-IL10使得血清中發炎性細胞激素、IL-1β、IL12p40、IFNγ及IL-6的量顯著降低。

圖5顯示相較於對照組，以治療形式施予F8-IL10不會造成TNF-α及角質細胞衍生趨化激素(KC)升高，而會造成IL-10量升高。DSS模式中彼等圖4之細胞激素量的升高與在結腸中疾病之引發有關。圖4彼等發炎性細胞激素的下降與IL-10的升高，均與已知的IL-10生物作用一致(Abbas A,Lichtman A,Pober J.,1994,Cellular and Molecular Immunology.2nd Ed.Philadelphia：W.B.Saunders Company；Delves P,Roitt I(eds),1998,Encyclopedia of Immunology,2nd Ed.San Diego：Academic Press)。於是F8-IL10藉由降低與IBD確立過程中發炎作用及病理相關的細胞激素，而展現其在此IBD模式中的藥理學活性。因為已知彼等發炎前細胞激素(pro-inflammatory cytokine)在IBD患者體內會被上調，又經由施予F8-IL10可將彼等細胞激素下調，顯示F8-IL10對於在活體內治療IBD可能是有益的。尤其是已知CD患者體內之干擾素γ及IL-12p70會被上調，因此本文所揭露之資料指出，施予F8-IL10因而可能特別有用於在活體中治療CD。

免疫組織化學染色

圖6顯示F8 SIP抗體會將潰瘍性結腸炎患者的新生血管染色，但不會將正常血管染色。(溫韋伯氏因子常規上係作為正常血管之標記。)

圖7顯示克隆氏症或UC配對活組織切片樣本，經由 EDA免疫組織化學染色之代表性影像。箭頭指出每張照相中的血管。患部血管之血管周圍的染色強度較來自相同患者的非患部樣本高。此結果代表在彼等人類疾病建立的過程中，EDA表現量上升可造成標靶至結腸中發炎區域的情形增加。總結來說，在鼠類IBD模式中以F8-IL10觀察到的結腸標靶分布與血清細胞激素降低，以及在人克隆氏症及潰瘍性腸炎之患部結腸組織中血管周圍的EDA表現上升，共同提供證據顯示施予F8-IL10可標靶至目標並對患有IBD之患者有正面效用。

申請案所揭露之序列

SEQ ID NO：1(F8抗體VH結構域CDR1)

LFT

SEQ ID NO：2(F8抗體VH結構域CDR2)

SGSGGS

SEQ ID NO：3(F8抗體VH結構域CDR3)

STHLYL

SEQ ID NO：4(F8抗體VL結構域CDR1)

MPF

SEQ ID NO：5(F8抗體VL結構域CDR2)

GASSRAT

SEQ ID NO：6(F8抗體VL結構域CDR3)

MRGRPP

SEQ ID NO：7(F8抗體VH結構域)

SEQ ID NO：8(F8抗體VL結構域)

SEQ ID NO：9(F8抗體VH結構域及VL結構域之間的連接子)

GGSGG

SEQ ID NO：10(F8抗體之VL結構域及IL-10之間的連接子)

SSSSGSSSSGSSSSG

SEQ ID NO：11(人IL-10)

SEQ ID NO：12(F8抗體)

SEQ ID NO：13(F8-IL10)

<110> Neri,Giovanni

Schwager,Kathrin

Ruzek,Melanie

O'Hara,Denise

Chen,Jianqing

<120> 與發炎性腸病有關之抗原

<130> 5026-P05632WO01

<140> PCT/US2012/058574

<141> 2012-10-03

<160> 13

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8抗體VH結構域CDR1

<400> 1

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8抗體VH結構域CDR2

<400> 2

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8抗體VH結構域CDR3

<400> 3

<210> 4

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8抗體VL結構域CDR1

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8抗體VL結構域CDR2

<400> 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8抗體VL結構域CDR3

<400> 6

<210> 7

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8抗體VH結構域

<400> 7

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8抗體VL結構域

<400> 8

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8抗體的VH結構域及VL結構域間之連接子

<400> 9

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8抗體VL結構域及IL-10之間的連接子

<400> 10

<210> 11

<211> 160

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

<210> 12

<211> 231

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

<210> 13

<211> 406

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F8-IL10

<400> 13

Claims (28)

1. 一種抗體共軛物用於製備供治療發炎性腸病(IBD)的藥物之用途，其中該抗體共軛物包含結合纖維連接蛋白之外部結構域A(Extra Domain-A(ED-A))且係共軛至免疫抑制性或抗發炎性分子之抗體或其抗原結合片段，該抗體包含V_H 結構域及V_L 其中，其中該V_H 結構域包含一組互補決定區域HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：1、2及3；以及該V_H 結構域包含一組互補決定區域LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：4、5及6。
2. 一種抗體共軛物用於製備供投遞免疫抑制性或抗發炎性分子至病患發炎性腸病(IBD)位置的藥物之用途，其中該抗體共軛物包含結合纖維連接蛋白之外部結構域A(Extra Domain-A(ED-A))且係共軛至該免疫抑制性或抗發炎性分子之抗體或其抗原結合片段，該抗體包含V_H 結構域及V_L 其中，其中該V_H 結構域包含一組互補決定區域HCDR1、HCDR2及HCDR3，其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：1、2及3；以及該V_L 結構域包含一組互補決定區域LCDR1、LCDR2及LCDR3，其分別包含胺基酸序列SEQ ID NO：4、5及6。
3. 如請求項1或2之用途，其中該V_H 結構域及/或 該V_L 結構域包含人生殖細胞系骨架(human germline framework)。
4. 如請求項3之用途，其中該V_H 結構域之人生殖細胞系骨架係DP47及/或該V_L 結構域之人生殖細胞系骨架係DPK22。
5. 如請求項1或2之用途，其中該抗體或抗原結合片段包含：(i)V_H 結構域，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；及/或(ii)V_L 結構域，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。
6. 如請求項1或2之用途，其中該抗原結合片段包含單鏈Fv(scFv)或係雙功能抗體(diabody)。
7. 如請求項1或2之用途，其中該抗原結合片段包含小型免疫蛋白(small immunoprotein(SIP))。
8. 如請求項1或2之用途，其中該抗體或抗原結合片段係共軛至可偵測性標定物(detectable label)。
9. 如請求項1或2之用途，其中該抗體或抗原結合片段係共軛至放射性同位素。
10. 如請求項1或2之用途，其中該抗發炎性分子係細胞激素(cytokine)。
11. 如請求項1或2之用途，其中該免疫抑制性或抗發炎性分子係介白素-10(IL-10)。
12. 如請求項11之用途，其中該IL-10係人IL-10。
13. 如請求項1或2之用途，其中該抗體或抗原結合片段係藉由可截切之連接子共軛至該免疫抑制性或抗發炎性分子。
14. 如請求項1或2之用途，其中該抗體或抗原結合片段係經由胜肽連接子共軛至該免疫抑制性或抗發炎性分子。
15. 如請求項14之用途，其中該胜肽連接子包含15個胺基酸。
16. 如請求項14之用途，其中該胜肽連接子包含胺基酸殘基(SSSSG)₃ (SEQ ID NO：10)。
17. 如請求項1或2之用途，其中該抗原結合片段包含scFv或係雙功能抗體，且其中該V_H 結構域係經由胺基酸連接子共軛至該V_L 結構域。
18. 如請求項17之用途，其中該胺基酸連接子包含5至25個胺基酸。
19. 如請求項17之用途，其中該胺基酸連接子包含5個胺基酸。
20. 如請求項17之用途，其中該胺基酸連接子包含胺基酸殘基GGSGG(SEQ ID NO：9)。
21. 如請求項1或2之用途，其中該抗體共軛物包含：(i)該抗原結合片段，其中該抗原結合片段包含scFv或係雙功能抗體，該抗原結合片段包含該V_H 結構域及該V_L 結構域， 其中該V_H 結構域係經由包含胺基酸殘基GGSGG(SEQ ID NO：9)的5個胺基酸之連接子共軛至該V_L 結構域；以及(ii)人介白素-10(IL-10)，其中該V_L 結構域係經由包含胺基酸殘基(SSSSG)₃ (SEQ ID NO：10)的胜肽連接子共軛至該人IL-10。
22. 如請求項1或2之用途，其中該抗體共軛物由下列組成：(i)該抗原結合片段，其中該抗原結合片段係雙功能抗體，其包含該V_H 結構域及該V_L 結構域；(ii)5個胺基酸之連接子，其包含胺基酸殘基GGSGG(SEQ ID NO：9)，其中該V_H 結構域係經由該5個胺基酸之連接子共軛至該V_L 結構域；(iii)人介白素-10(IL-10)；以及(iv)胜肽連接子，其包含胺基酸殘基(SSSSG)₃ (SEQ ID NO：10)，其中該V_L 結構域係經由該胜肽連接子共軛至該人IL-10。
23. 如請求項12之用途，其中該人IL-10包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
24. 一種抗體共軛物用於製備供治療發炎性腸病(IBD)的藥物之用途，其中該抗體共軛物包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
25. 一種抗體共軛物用於製備供治療發炎性腸病(IBD)的藥物之用途，其中該抗體共軛物由SEQ ID NO： 13之胺基酸序列組成。
26. 一種抗體共軛物用於製備供投遞免疫抑制性或抗發炎性分子至病患發炎性腸病(IBD)位置的藥物之用途，其中該抗體共軛物包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列。
27. 一種抗體共軛物用於製備供投遞免疫抑制性或抗發炎性分子至病患發炎性腸病(IBD)位置的藥物之用途，其中該抗體共軛物由SEQ ID NO：13之胺基酸序列組成。
28. 2及24至27項中任一項之用途，其中該IBD係選自下列任一者：潰瘍性結腸炎(UC)、膠原性結腸炎(collagenous colitis)、淋巴球性結腸炎(lymphocytic colitis)、缺血性結腸炎(ischaemic colitis)、分流性結腸炎(diversion colitis)、貝賽特氏病(Behcet's disease)、未定型結腸炎(indeterminate colitis)、及克隆氏症(Crohn's disease)(CD)。