ES2332175T3 - Anticuerpo que tiene una especificidad tipo receptor de celulas t, con una afinidad aun mayor y el uso del mismo en la deteccion y tratamiento del cancer, infecciones viricas y enfermedades autoinmunes. - Google Patents

Anticuerpo que tiene una especificidad tipo receptor de celulas t, con una afinidad aun mayor y el uso del mismo en la deteccion y tratamiento del cancer, infecciones viricas y enfermedades autoinmunes. Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido, donde dicho anticuerpo no se une a dicho MHC clase I humano en ausencia de dicho antígeno HLA restringido, donde dicho anticuerpo no se une a dicho antígeno HLA restringido en ausencia de dicho MHC clase I humano y donde dicho anticuerpo se une a células infectadas por virus que presentan dicho MHC clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno HLA restringido, donde dicho antígeno HLA restringido es un antígeno viral que caracteriza al virus causante de la infección vírica o se une a células tumorales que presentan dicho MHC clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno HLA restringido, donde dicho antígeno HLA restringido es un antígeno tumoral que caracteriza al cáncer.

Description

Anticuerpo que tiene una especificidad tipo receptor de células T, con una afinidad aún mayor y el uso del mismo en la detección y tratamiento del cáncer, infecciones víricas y enfermedades autoinmunes.
Campo y antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a las realizaciones como se caracterizan en las reivindicaciones.
Se demostró que la expresión de péptidos específicos en complejo con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I en células estaba asociada con cáncer y enfermedades autoinmunes (1-3) e infecciones víricas. En el cáncer, el descubrimiento de estos péptidos surgía de la observación ahora bien establecida de que las células tumorales humanas expresan con frecuencia antígenos que son reconocidos por linfocitos T citotóxicos (CTL) obtenidos de pacientes (1-5).
Además, se ha demostrado que la respuesta inmune contra el tumor es insuficiente para causar la regresión tumoral y que las células tumorales pueden desarrollar mecanismos eficaces para escapar a dicho ataque inmune (6-9). Por lo tanto, se están desarrollando numerosas estrategias en el campo de la vacunación contra tumores en un intento por aumentar las respuestas inmunes antitumorales, incluyendo vacunas de péptidos contra el cáncer, vacunas autólogas contra el cáncer y la vacuna híbrida de células cancerosas-dendríticas (7, 10, 11).
Debido a que la especificidad de la respuesta inmune está regulada e impuesta por estos complejos de MHC clase I-péptido debería ser posible usar estos marcadores moleculares de superficie celular específicos y únicos como dianas para eliminar las células cancerosas, al tiempo que se evitan las células normales. Pueden emprenderse una estrategia similar para erradicar células infectadas por virus y células que presenten dianas para ataque autoinmune. Por lo tanto, sería muy deseable encontrar nuevas moléculas en una forma soluble que mimeticen la especificidad única refinada del receptor de antígeno de célula T (TCR) para los complejos de MHC-péptido asociados con cáncer/infecciones víricas/enfermedades autoinmunes.
Una estrategia prometedora es generar anticuerpos recombinantes que se unirán al complejo de MHC-péptido expresado en las superficies de células cancerosas con la misma especificidad que el TCR. Estos anticuerpos únicos pueden equiparse posteriormente con un resto citotóxico efector tal como un radioisótopo, un fármaco citotóxico o una toxina. Por ejemplo, se fusionaron genéticamente anticuerpos que se dirigen a células cancerosas con toxinas potentes obtenidas tanto de plantas como de bacterias, generando de este modo moléculas denominadas inmunotoxinas recombinantes (12).
Los anticuerpos con la especificidad de células T restringida por MHC son poco frecuentes y han sido difíciles de generar mediante técnicas de hibridoma convencionales debido a que las células B no aprenden a autorrestringirse por MHC (13-16). Las ventajas de la tecnología de anticuerpos presentados en fagos también hace posible seleccionar grandes repertorios de anticuerpos para anticuerpos únicos y poco frecuentes contra epítopos muy definidos. Esto se ha demostrado por la capacidad para aislar mediante presentación en fagos un anticuerpo restringido similar a TCR contra un H-2K^{k} de MHC clase I murino formando un complejo con un epítopo viral (17). Evidentemente, este anticuerpo, que está dirigido al MHC de ratón, es inútil en el tratamiento y diagnóstico de seres humanos. Hasta ahora, han fracasado los intentos realizados por el mismo grupo para desarrollar un anticuerpo restringido similar a TCR contra un MHC clase I humano. Más recientemente se aisló un anticuerpo reactivo con el antígeno de melanoma MAGE-A1 en un complejo con HLA-A1; sin embargo, este anticuerpo presentaba una baja afinidad y podía usarse para detectar los complejos específicos en la superficie de células presentadoras de antígeno sólo cuando se expresan de una forma multimérica en un fago y no como un anticuerpo soluble (18).
El documento WO-A-9702342 describe un método para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que reconozca específicamente un complejo de péptido-MHC. También se refiere a anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invención que están conjugados con un agente farmacéutico o con un superantígeno. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la invención para la prevención o tratamiento de enfermedades infecciosas y autoinmunes y del cáncer, y a composiciones para el diagnóstico de dichas enfermedades.
El documento WO-A-91/12332 se refiere a anticuerpos monoclonales restringidos caracterizados por su capacidad para reconocer específicamente un complejo que consiste en un péptido, que es característico de un antígeno de agente patógeno o un trastorno celular, y una molécula del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) que tiene la capacidad de reconocer y fijar este péptido, siendo dichos anticuerpos anticuerpos monoclonales restringidos en el sentido de que son incapaces de reconocer dicho péptido combinado con una molécula de MHC de haplotipo inespecífico de péptido. Estos anticuerpos pueden usarse para diagnosticar afecciones causadas por agentes infecciosos o trastornos celulares que se encontrarán, por ejemplo, en tumores o enfermedades autoinmunes.
Reither et al, Natl. Acad. Sci. USA, vol. 94, Abril 1997, páginas 4631-4636 se refiere a la destrucción específica de péptido de células presentadoras de antígeno mediante una proteína de fusión recombinante de anticuerpo-toxina dirigida contra complejos de complejo mayor de histocompatibilidad/péptido clase I con especificidad similar a receptor de célula T.
El documento WO-A-01/96401 describe un método para construir un anticuerpo scFv que tiene una proteína fluorescente fusionada con el mismo y que muestra una actividad de unión a un antígeno. Se prepara una biblioteca de anticuerpos scFv compuesta por clones de fagos con la expresión de anticuerpo scFv en la superficie. A partir de esta biblioteca, se selecciona un clon que exprese un anticuerpo que reconozca un antígeno específico. Después, se obtiene un gen de scFv a partir de este clon y se transfiere a un vector de expresión en el que se ha integrado previamente un gen que codifica una proteína fluorescente. Mediante la expresión del vector en un hospedador, puede producirse un anticuerpo scFv que tenga la proteína fluorescente fusionada con el mismo.
Chames et al describe la selección directa de un fragmento de anticuerpo humano dirigido contra el epítopo de célula T tumoral HLA-A1-MAGE-A1 a partir de una biblioteca no inmunizada de fagos-Fab, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA vol. 97, no. 14, 05 Julio 2000, páginas 7969-7974.
Cohen et al se refieren a la detección directa y a la cuantificación de un epítopo de célula T diferente obtenido de mucina asociada con células epiteliales específicas de tumor usando anticuerpos recombinantes humanos dotados con la especificidad restringida por complejo específico de antígeno de células T, Cancer Research vol. 62, 15 de Octubre de 2002, páginas 5835-5844.
Por lo tanto existe la necesidad ampliamente reconocida, y sería altamente ventajoso, tener un anticuerpo restringido similar a TCR contra un MHC clase I humano desprovisto de las limitaciones anteriores.
Sumario de la invención
En los últimos años, se han aislado muchos péptidos restringidos por MHC asociados con cáncer, asociados con infecciones víricas y enfermedades autoinmunes, y debido a su especificidad refinada altamente restringida, son dianas deseables para nuevas estrategias en inmunoterapia e inmunodiagnóstico. Los anticuerpos que son capaces de reconocer complejos de MHC-péptido asociados con cáncer, asociados con infecciones víricas y enfermedades autoinmunes, con la misma especificidad que el receptor de antígeno de célula T serían reactivos valiosos para estudiar la presentación de antígenos por células tumorales, células infectadas por virus y células relacionadas con enfermedades autoinmunes, para visualizar complejos de MHC-péptido en dichas células y, en última instancia, para desarrollar nuevos agentes de direccionamiento para inmunoterapia e inmunodiagnóstico del cáncer, infecciones víricas y enfermedades autoinmunes.
Cuando se reduce la presente invención a la práctica, y para generar moléculas ejemplares con una especificidad refinada única de este tipo, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 con un HLA-A2 de cadena sencilla soluble, formando un complejo con un epítopo restringido por HLA-A2 de célula T antigénico común obtenido del antígeno de diferenciación de melanoma gp100. Usando presentación en fagos, se aisló un anticuerpo scFv recombinante de alta afinidad que presenta una especificidad de unión similar a TCR característica con el epítopo derivado de gp100, aunque a diferencia de los TCR, lo hace con una afinidad en el intervalo nanomolar. El anticuerpo similar a TCR reconoce el complejo de MHC-péptido nativo expresado en la superficie de células presentadoras de antígeno. Además, cuando se fusionaba con una molécula efectora citotóxica muy potente en forma de una toxina bacteriana truncada, era capaz de destruir específicamente células presentadoras de antígeno de una forma dependiente de péptido y con una especificidad similar a TCR. Estos resultados demuestran por primera vez la capacidad para aislar anticuerpos recombinantes humanos de alta afinidad con la especificidad restringida por MHC específica de antígeno de células T dirigida hacia epítopos de células T cancerosas humanas. Los anticuerpos similares a TCR seleccionados son útiles para controlar y visualizar la expresión de complejos de MHC-péptido específicos en la superficie de células tumorales, otras células que presentan antígenos y tejidos linfoides, así como para desarrollar una nueva familia de agentes de direccionamiento para inmunoterapia.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona una molécula aislada que comprende un anticuerpo que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar, preferiblemente inferior a 10 nanomolar, a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido, como se caracteriza adicionalmente en las reivindicaciones adjuntas.
De acuerdo con características adicionales en realizaciones preferidas de la invención que se describe a continuación, la molécula aislada comprende además un resto identificable que se conjuga con el anticuerpo.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la molécula aislada comprende además un resto terapéutico que se conjuga con el anticuerpo.
En un ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº:9.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula que comprende un anticuerpo que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido, comprendiendo la molécula además un resto terapéutico que se conjuga con el anticuerpo, como se ha definido anteriormente. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporciona una composición de diagnóstico que comprende una molécula que comprende un anticuerpo como se ha definido anteriormente, que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que forman un complejo con un antígeno HLA restringido, comprendiendo la molécula además un resto identificable que se conjuga con el anticuerpo.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporciona una molécula aislada que comprende un primer polinucleótido que codifica un anticuerpo que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido.
En un ejemplo, el primer polinucléotido codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº:9. En un ejemplo específico, el primer polinucleótido tiene una secuencia de ácido nucleico como se expone en la SEC ID Nº:8.
De acuerdo con características adicionales en realizaciones preferidas de la invención descrita a continuación, la molécula aislada comprende además un segundo polinucleótido que se une al primer polinucleótido y que codifica un resto terapéutico.
De acuerdo con características alternativas en realizaciones preferidas de la invención que se describe a continuación, la molécula aislada de la reivindicación 24 comprende además un segundo polinucleótido que se une al primer polinucleótido y que codifica un resto identificable.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el resto identificable se selecciona del grupo que consiste en un miembro de un par de unión y un marcador.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el miembro del par de unión es un antígeno.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas el marcador se selecciona del grupo que consiste en una proteína fluorescente y una enzima.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método de producción de un anticuerpo que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido, comprendiendo el método: inmunizar a un mamífero no humano modificado genéticamente que tiene células que expresan el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano con una forma soluble de una molécula de MHC clase I que está formando un complejo con el antígeno HLA restringido; aislar moléculas de ARNm a partir de células productoras de anticuerpos del mamífero no humano; producir una biblioteca de presentación en fagos que presenten moléculas proteicas codificadas por las moléculas de ARNm; y aislar al menos un fago de la biblioteca de presentación en fagos, presentando el al menos un fago el anticuerpo que puede unirse específicamente con la afinidad inferior a 10 nanomolar al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con el antígeno HLA restringido.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el mamífero no humano está desprovisto de moléculas de MHC clase I propias.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el antígeno HLA restringido es un antígeno HLA restringido tumoral.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el antígeno HLA restringido es un antígeno HLA restringido viral.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el antígeno HLA restringido es un antígeno HLA restringido autoinmune.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, la forma soluble de una molécula de MHC clase I es un polipéptido de MHC clase I de cadena sencilla que incluye una secuencia de aminoácidos de \beta-2 microglobulina humana funcional unida covalentemente directa o indirectamente a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de MHC clase I humana funcional.
De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención se proporciona un uso del anticuerpo como se ha descrito anteriormente que comprende además un resto terapéutico que se conjuga con el anticuerpo para la fabricación de un medicamento para que la molécula de MHC clase I que se selecciona coincida con el MHC clase I endógeno del sujeto.
De acuerdo con otro aspecto adicional de la presente invención se proporciona un uso del anticuerpo como se ha descrito anteriormente que comprende además un resto terapéutico que se conjuga con el anticuerpo para la fabricación de un medicamento para que la molécula de MHC clase I que se selecciona coincida con el MHC clase I endógeno del sujeto.
De acuerdo con características adicionales en realizaciones preferidas de la invención descrita a continuación, la molécula de MHC clase I se selecciona del grupo que consiste en HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 y HLA-Cw8.
De acuerdo con otras características adicionales en las realizaciones preferidas descritas, el resto terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un resto citotóxico, un resto tóxico, un resto de citocina y un resto de anticuerpo biespecífico.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método de preparación de una inmunotoxina, comprendiendo el método ligar un primer polinucleótido que codifica un anticuerpo como se ha caracterizado anteriormente, que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido en fase de lectura con un segundo polinucleótido que codifica un resto de toxina, para obtener un polinucleótido ligado y expresar el polinucleótido ligado en un sistema de expresión para obtener la inmunotoxina.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método de preparación de un inmunomarcador, comprendiendo el método ligar un primer polinucleótido que codifica un anticuerpo como se ha caracterizado anteriormente, que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido en fase de lectura con un segundo polinucleótido que codifica un resto identificable, para obtener un polinucleótido ligado y expresar el polinucleótido ligado en un sistema de expresión para obtener el inmunomarcador.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método de detección de la presencia y/o nivel de células presentadoras de antígeno que presentan un antígeno HLA restringido en una muestra de células, comprendiendo el método hacer interaccionar las células de la muestra con un anticuerpo como se ha caracterizado anteriormente, que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido; y controlar la interacción, detectando por lo tanto la presencia y/o nivel de las células presentadoras de antígeno que presentan el antígeno HLA restringido.
Dependiendo de la aplicación, el antígeno HLA restringido se selecciona del grupo que consiste en un antígeno HLA restringido tumoral, un antígeno HLA restringido viral y un antígeno HLA restringido autoinmune.
La presente invención aborda con éxito los defectos de las configuraciones actualmente conocidas proporcionando un anticuerpo que tiene una especificidad de receptor de célula T y alta afinidad con su antígeno y el uso del mismo en inmunoterapia e inmunodiagnóstico.
Breve descripción de los dibujos
La invención se describe en este documento, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se insiste en que las particularidades que se muestran son a modo de ejemplo y con el fin de una discusión ilustrativa de las realizaciones preferidas de la presente invención solamente, y se presentan con motivo de proporcionar la que se piensa que es la descripción más útil y fácilmente entendible de los principios y aspectos conceptuales de la invención. A este respecto, no se pretende mostrar detalles estructurales de la invención en más detalle que el necesario para un entendimiento fundamental de la invención, haciendo evidente la descripción tomada con los dibujos para los especialistas en la técnica cómo las varias formas de la invención pueden incorporarse en la práctica.
En los dibujos:
Las Figuras 1A-B muestran gráficas de barras que demuestran ELISA de fagos policlonal en complejos de scHLA-A2-péptido recombinantes. Las placas se recubrieron con el complejo de scMHC-péptido indicado como se describe en la sección de Ejemplos a continuación. Se muestra la unión de la población de fagos policlonal de la biblioteca inicial (L) o fagos eluidos después de cada ronda de selección (I-IV). Figura 1A - fagos de la biblioteca pCANTAB scFv; Figura 1B - fagos de la biblioteca scFv-CBD. Se realizaron estudios de especificidad de unión mediante ELISA usando complejos de scMHC-péptido biotinilados. Se recubrieron placas de ELISA (Falcon) durante una noche con BSA-biotina (1 \mug/pocillo), se lavaron, se incubaron (1 h, temperatura ambiente) con estreptavidina (1 \mug/pocillo), se lavaron de nuevo exhaustivamente y se incubaron adicionalmente (1 h, temperatura ambiente) con 0,5 \mug de complejos de MHC/péptido. Las placas se bloquearon con PBS/leche al 2% (30 min, temperatura ambiente), se incubaron con clones de fagos (\sim10^{9} fagos/pocillo, 1 h, temperatura ambiente) o 0,5-1 \mug de scFv o scFv-PE38 soluble, y después se lavaron con anti-M13 conjugado con HRP, anticuerpo anti-myc o anticuerpo anti-PE, 1:1000, respectivamente. Los péptidos restringidos por HLA-A2 usados para estudios de especificidad son gp100 (154): KTWGQYWQV (SEC ID Nº:1); gp100 (209): IMDQVPFSV (SEC ID Nº:2); gp100 (280): YLEPGPVTV (SEC ID Nº:3); MUC1: LLLTVLTVL (SEC ID Nº:4); HTLV-1 (TAX): LLFGYPVYV (SEC ID Nº:5); hTERT (540): ILAKFLHWL (SEC ID Nº:6); hTERT (865): RLVDDFLLV (SEC ID Nº:7).
Las Figuras 2A-B muestran gráficas de barras que demuestran la unión diferencial de clones de fagos monoclonales a complejos de scHLA-A2/gp100. Se ensayó un fago monoclonal para determinar la unión a scHLA-A2 inmovilizado que está formando un complejo con los epítopos derivados de gp100. Figura 2A - G9-209M; Figura 2B - G9-280V. Los ensayos se realizaron de forma similar a la descrita en la Figura 1 anterior.
La Figura 3A muestra las secuencias de ácido nucleico (SEC ID Nº: 8) y aminoácidos (SEC ID Nº:9) del anticuerpo G1 scFv. Las CDR están marcadas en negrita, el péptido enlazador que conecta los dominios VH y VL esta subrayado.
Las Figuras 3B-C muestran el análisis de SDS-PAGE de G1scFv purificado y G1scFv-PE38. El gen de G1 scFv se rescató del clon de fagos por PCR y se subclonó en el vector fagémido pCANTAB6 mediante los sitios de clonación SfiI-NotI. Se fusionaron unos marcadores Myc y hexahistidina con el extremo C-terminal del gen de scFv. El anticuerpo scFv se expresó en células BL21 \lambdaDE3 como se ha descrito anteriormente (29) y se purificó a partir de la fracción periplásmica mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos. Para la expresión de la proteína de fusión G1scFv-PE38, el gen de scFv se subclonó como un fragmento NcoI-NotI en el plásmido pIB-NN, que codifica los dominios de translocación y ADP-ribosilación de PE (PE38). La expresión en células BL21 \lambdaDE3, el replegamiento a partir de cuerpos de inclusión y la purificación de G1scFv-PE38 se realizaron como se ha descrito anteriormente
(30).
La Figura 4 es una gráfica de barras que demuestra la especificidad de unión de G1 scFv-PE38. Se recubrieron inmunoplacas con diversos complejos de scHLA-A2-péptido indicados como se describe y se detectó la unión del G1 scFv-PE38 a complejos inmovilizados con anticuerpo anti-PE.
Las Figuras 5A-B muestran representaciones que demuestran las características de unión del G1 scFv similar a TCR. 5A - ELISA de titulación de G1 scFv soluble purificado. Se recubrieron pocillos con los complejos de MHC-péptido como se describe en la sección de Ejemplos a continuación. 5B - Análisis de unión competitiva de la capacidad de G1 scFv-PE38 purificado para inhibir la unión de G1 scFv-PE38 marcado con 125I al complejo de HLA-A2/G9-209M. La afinidad de unión aparente del scFv recombinante se determinó como la concentración de competidor (G1scFv-PE38 purificado soluble) necesaria para una inhibición del 50% de la unión del indicador marcado con ^{125}I. Se recubrieron placas de ELISA flexibles con BSA-biotina y se inmovilizaron complejos de scMHC-péptido (10 \mug en 100 \mul) como se ha descrito anteriormente. El G1scFv-PE38 recombinante se marcó con [^{125}I] usando el reactivo de Bolton-Hunter. Se añadió proteína marcada a pocillos como indicador (3-5 x 10^{5} CPM/pocillo) en presencia de concentraciones crecientes de G1scFv-PE38 frío como competidor y se incubó a temperatura ambiente durante 1 h en PBS. Las placas se lavaron minuciosamente con PBS y se determinó la radiactividad unida mediante un contador gamma. La afinidad aparente del G1scFv-PE38 se determinó por extrapolación de la concentración de un competidor necesario para conseguir una inhibición del 50% de la unión de G1scFv-P38 marcado con [^{125}I] al complejo de scMHC-péptido inmovilizado. Se determinó la unión inespecífica por adición de un exceso de 20-40 veces de Fab sin
marcar.
Las Figuras 6A-C muestran representaciones que demuestran la unión de G1 scFv a APC. Se cargaron células RMAS-HHD o JY con los péptidos restringidos por HLA-A2 indicados. Después, las células cargadas con péptido se incubaron con el anticuerpo G1 scFv purificado soluble. La detección de la unión era con anti-Myc marcado con FITC. Las células RMAS-HHD se cargaron con los péptidos G9-209 y G9-280 y se tiñeron junto con células sin cargar de control con el anticuerpo anti-HLA w6/32 (6A) o el anticuerpo anti-HLA-A2 BB7.2 (6B) para demostrar la estabilización/expresión de complejos de HLA-A2 en la superficie de péptido cargado pero no en células no cargadas con péptido. Las células cargadas con los péptidos G9-209 o G9-280 se tiñeron con G1 scFv y se muestra la tinción diferencial (6C). La línea de células B RMAS-HHD transfectada con un gen de \beta2M-HLA-A2 de cadena sencilla (26) o las células JY linfoblásticas B transformadas con EBV (10^{6} células) se lavaron dos veces con RPMI sin suero y se incubaron durante una noche a 26ºC o 37ºC, respectivamente, en medio que contenía 100 \muM del péptido. Las APC se incubaron posteriormente a 37ºC durante 2-3 horas para estabilizar la expresión en superficie celular de complejos de MHC-péptido seguido de incubación con scFv recombinante (10-50 \mug/ml, 60-90 minutos, 4ºC) en 100 \mul. Después las células se lavaron, se incubaron con anticuerpo anti-Myc marcado con FITC (30-45 minutos, 4ºC) y por último se lavaron y se analizaron mediante un citómetro de flujo FACStar (Becton Dickinson). Las células de melanoma se estimularon a 37ºC con 1-10 \muM de péptido y después se tiñeron con el scFv como se describe en este
documento.
Las Figuras 7A-C muestran representaciones y una gráfica de barras que demuestra la actividad citotóxica de G1 scFv-PE38 sobre APC cargadas con péptido. Se cargaron células RMAS-HHD (7A) o JY (7B) con los péptidos restringidos por HLA-A2 como se indica, seguido de incubación con concentraciones crecientes de G1 scFv-PE38. Se determinó la síntesis de proteína por incorporación de ^{3}H-leucina en proteínas celulares. Se añadió un exceso (0,15-0,25 mg/ml) (7C) del complejo de scHLA-A2-péptido indicado a los pocillos antes de la adición de G1 scFv-PE38 (25-50 ng/ml). Se cargaron APC RMAS-HHD y JY con el péptido G9-209 y péptidos de control como se ha descrito anteriormente. Las células cargadas con péptido se incubaron posteriormente con concentraciones crecientes de G1scFv-PE38 y la inhibición de la síntesis de proteína se determinó por medición de la captación de ^{3}H-leucina en proteínas celulares, como se ha descrito anteriormente (30). Se determinó la CI_{50} como la concentración de G1scFv-PE38 necesaria para inhibir la síntesis de proteína en el 50%. En ensayos de competición, se añadieron excesos de complejos de HLA-A2-péptido específicos e inespecíficos (35-50 \mug/pocillo) a pocillos 15 minutos antes de la adición de G1scFv-PE38.
Descripción de las realizaciones preferidas
La presente invención es de un anticuerpo como se ha definido anteriormente que tiene una especificidad de receptor de célula T y una afinidad aún mayor, conjugados del mismo con restos identificables y/o terapéuticos, para generar inmunotoxinas e inmunomarcadores, un método de generación del anticuerpo y los conjugados, polinucleótidos que codifican el anticuerpo y los conjugados y métodos de uso de los conjugados en la detección y tratamiento del cáncer, una infección vírica y una enfermedad autoinmune.
Los principios y el funcionamiento de la presente invención pueden entenderse mejor con referencia a los dibujos y descripciones adjuntas.
El sistema inmune está controlado y regulado por el receptor de células T (TCR) que reconoce específicamente péptido/moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).
La llegada de la aplicación de complejos de MHC clase I-péptido recombinantes y sus matrices tetraméricas permite ahora detectar y estudiar poblaciones poco frecuentes de células T específicas de antígeno (25, 35, 36). Sin embargo, todavía están sin respuesta cuestiones fundamentales en inmunología en general, y en inmunología tumoral en particular, respecto a la presentación de antígenos debido a la ausencia de reactivos que permitan un análisis fenotípico de la presentación de antígenos (MHC-péptido), la otra cara de la moneda para interacciones de MHC-péptido-TCR. Un modo de generar dichos reactivos es generando anticuerpos similares a TCR; sin embargo, sólo unas pocas publicaciones han descrito la generación de anticuerpos autorrestringidos por MHC por medios convencionales tales como la tecnología del hibridoma (13-16). La razón principal para estas dificultades del pasado puede encontrarse en la naturaleza molecular y las estructuras resueltas de los complejos de MHC-péptido. Más específicamente, los péptidos están profundamente enterrados en el interior de la hendidura de unión a MHC y por lo tanto se presentan como mosaicos extendidos de restos peptídicos entremezclados con los restos de MHC. Se ha demostrado que no más de 100-300 \ring{A}^{2} de péptido unido a MHC clase I mira hacia fuera y, por lo tanto, está disponible para reconocimiento directo, mientras que los anticuerpos que reconocen moléculas proteicas se acoplan con aproximadamente 800 \ring{A}^{2} de su ligando (17). Por lo tanto, cuando se generan anticuerpos similares a TCR, presumiblemente estas moléculas reconocerán el péptido pero también tendrán que estar dominadas por el MHC.
Hasta ahora, se han generado anticuerpos con especificidad similar a TCR contra complejos de MHC murino-péptido empleando diversas estrategias de inmunización (17). Recientemente, se usó una gran biblioteca de Fab humanos para seleccionar anticuerpos de unión específicos de HLA-A1-MAGE-A1 (18). Se seleccionó un clon específico, G8, que presentaba especificidad similar a TCR pero puso de manifiesto una afinidad relativamente reducida de 250 nM.
Cuando se reduce la presente invención a la práctica, se demostró la capacidad para seleccionar a partir de un repertorio inmune de fragmentos scFv murinos un anticuerpo de alta afinidad dirigido hacia un epítopo de célula T humano.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona un método de producción de un anticuerpo como se ha definido anteriormente, que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido. El método de acuerdo con este aspecto de la invención se efectúa por (i) inmunización de un mamífero no humano modificado genéticamente que tiene células que expresan el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano, como se define adicionalmente en las reivindicaciones, con una forma soluble de una molécula de MHC clase I que está formando un complejo con el antígeno HLA restringido; (ii) aislamiento de moléculas de ARNm a partir de células productoras de anticuerpos, tales como esplenocitos, del mamífero no humano; (iii) producción de una biblioteca de presentación en fagos que presenten moléculas proteicas codificadas por las moléculas de ARNm; y (iv) aislamiento de al menos un fago de la biblioteca de presentación en fagos, presentando el al menos un fago el anticuerpo que puede unirse específicamente con la afinidad inferior a 10 nanomolar al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con el antígeno HLA restringido. El material genético del aislado de fago se usa después para preparar un anticuerpo de cadena sencilla u otras formas de anticuerpos como se describe adicionalmente en este documento a continuación. El material genético del aislado de fago se usa después para preparar un anticuerpo de cadena sencilla u otras formas de anticuerpos como se describe adicionalmente en este documento a continuación, y que se conjugan con restos identificables o terapéuticos. Preferiblemente, el mamífero no humano está desprovisto de moléculas de MHC clase I propias. Aún preferiblemente, la forma soluble de una molécula de MHC clase I es un polipéptido MHC clase I de cadena sencilla que incluye una secuencia de aminoácidos de \beta-2 microglobulina humana funcional unida covalentemente directa o indirectamente a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de MHC clase I humano funcional.
Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula aislada que comprende un anticuerpo, como se define en las reivindicaciones, que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido. Dicho anticuerpo tiene una especificidad de receptor de célula T, y una afinidad aún mayor. En un ejemplo no limitante, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla que tiene una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº:9, codificada, por ejemplo, por el polinucleótido como se expone en la SEC ID Nº:8.
Una vez que se clona un polinucleótido que codifica un anticuerpo que tiene una especificidad de receptor de célula T como se describe en este documento, puede modificarse de una de muchas formas para producir un espectro de productos relacionados.
En un ejemplo, el polinucleótido que codifica un anticuerpo que tiene una especificidad de receptor de célula T se liga con un segundo polinucleótido que codifica un resto identificable para producir un anticuerpo que tiene una especificidad de receptor de célula T conjugado con el resto identificable, un inmunomarcador. Dicho conjugado o inmunomarcador puede usarse en un método de detección de la presencia y/o nivel de células presentadoras de antígeno que presentan un antígeno HLA restringido en una muestra de células y sirven para el diagnóstico del cáncer, una infección vírica o una enfermedad autoinmune. Como se usa en este documento, la expresión "célula presentadora de antígeno" incluye todas las células que expresan moléculas de MHC clase I en su superficie y que son capaces de presentar antígenos restringidos por HLA. Una célula presentadora de antígeno puede ser una célula cancerosa, una célula del sistema inmune o cualquier otra células que exprese moléculas de MHC clase I en su superficie.
Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método de generación de un inmunomarcador, comprendiendo el método ligar un primer polinucleótido que codifica un anticuerpo, como se define en las reivindicaciones, que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido en fase de lectura con un segundo polinucleótido que codifica un resto identificable, para obtener un polinucleótido ligado y expresar el polinucleótido ligado en un sistema de expresión para obtener el inmunomarcador.
Y, de acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporciona un método de detección de la presencia y/o nivel de células presentadoras de antígeno que presentan un antígeno HLA restringido en una muestra de células, comprendiendo el método hacer interaccionar las células de dicha muestra con un anticuerpo, como se define en las reivindicaciones, que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido; y controlar dicha interacción, detectando de este modo la presencia y/o nivel de dichas células presentadoras de antígeno que presentan dicho antígeno HLA restringido.
Dependiendo de la aplicación, el antígeno HLA restringido puede ser un antígeno HLA restringido tumoral, un antígeno HLA restringido viral y un antígeno HLA restringido autoinmune, proporcionándose ejemplos de los mismos en este documento a continuación.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente invención se proporciona una composición de diagnóstico que comprende una molécula que comprende un anticuerpo, como se define en las reivindicaciones, que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido, comprendiendo la molécula además un resto identificable que se conjuga con el anticuerpo.
El resto identificable puede ser un miembro de un par de unión, que es identificable por su interacción con un miembro adicional del par de unión y un marcador que se visualiza directamente. En un ejemplo, el miembro del par de unión es un antígeno que se identifica por un anticuerpo marcado correspondiente. En un ejemplo, el marcador es una proteína fluorescente o una enzima que produce una reacción colorimétrica.
En otro ejemplo, el polinucleótido que codifica un anticuerpo que tiene una especificidad de receptor de célula T se liga con un segundo polinucleótido que codifica un resto terapéutico para producir un anticuerpo que tiene una especificidad de receptor de célula T conjugado con el resto terapéutico. Dicho conjugado o inmunotoxina puede usarse en un método de tratamiento del cáncer, una infección vírica o una enfermedad autoinmune.
Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un método de generación de una inmunotoxina, comprendiendo el método ligar un primer polinucléotido que codifica un anticuerpo como se define en las reivindicaciones, que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido en fase de lectura con un segundo polinucleótido que codifica un resto de toxina, para obtener un polinucléotido ligado y expresar dicho polinucleótido ligado en un sistema de expresión para obtener dicha inmunotoxina.
La inmunotoxina puede usarse en uno cualquiera de los siguientes protocolos terapéuticos:
(i) Un método de tratamiento del cáncer, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula que comprende un anticuerpo que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido tumoral que caracteriza al cáncer, comprendiendo la molécula además un resto terapéutico que se conjuga con el anticuerpo, seleccionándose la molécula de MHC clase I para que coincida con el MHC clase I endógeno del sujeto.
(ii) Un método de tratamiento de una infección vírica, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula que comprende un anticuerpo que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido viral que caracteriza un virus causante de la infección vírica, comprendiendo la molécula además un resto terapéutico que se conjuga con el anticuerpo, seleccionándose la molécula de MHC clase I que coincida con el MHC clase I endógeno del sujeto.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula que comprende un anticuerpo como se define en las reivindicaciones, que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido, comprendiendo la molécula además un resto terapéutico que se conjuga con el anticuerpo. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El resto terapéutico puede ser, por ejemplo, un resto citotóxico, un resto tóxico, un resto de citocina y un resto de anticuerpo biespecífico, proporcionándose ejemplos de los mismos en este documento a continuación.
En todas las aplicaciones, el MHC clase I puede ser, por ejemplo, HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 y HLA-Cw8.
Las siguientes secciones proporcionan ejemplos específicos y alternativas para cada uno de los diversos aspectos de la invención que se describe en este documento.
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Anticuerpo
El término "anticuerpo" como se usa para describir esta invención incluye moléculas intactas así como fragmentos funcionales de las mismas, tales como Fab, F(ab')_{2}, Fv y scFv que son capaces de una unión específica de alta afinidad a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano clase I que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido. Estos fragmentos de anticuerpos funcionales se definen de la forma siguiente: (i) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, puede producirse por digestión de un anticuerpo completo con la enzima papaína para dar una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada; (ii) Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo que puede obtenerse por tratamiento de un anticuerpo completo con pepsina, seguido de reducción, para dar una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo; (iii) F(ab')_{2}, el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse por tratamiento de un anticuerpo completo con la enzima pepsina sin una reducción posterior; F(ab')_{2} es un número de dos fragmentos Fab' mantenidos unidos por dos enlaces disulfuro; (iv) Fv, definido como un fragmento modificado genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresada como dos cadenas; y (c) scFv o "anticuerpo de cadena sencilla" ("SCA"), una molécula modificada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada unidas por un enlazador polipeptídico adecuado como una molécula de cadena sencilla fusionada
genéticamente.
Se conocen en la técnica métodos de generación de estos fragmentos. (Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988).
Pueden prepararse fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención por hidrólisis proteolítica del anticuerpo o por expresión en E. coli o células de mamífero (por ejemplo, cultivo de células de ovario de hámster chino u otros sistemas de expresión de proteínas) de ADN que codifica el fragmento.
Pueden obtenerse fragmentos de anticuerpo por digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos por métodos convencionales. Por ejemplo, pueden producirse fragmentos de anticuerpo por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')_{2}. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol y, opcionalmente, un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo resultantes de la escisión de enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. Como alternativa, una escisión enzimática usando pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, Patentes de Estados Unidos Nº 4.036.945 y 4.331.647 y referencias contenidas en las mismas. Véase también Porter, R. R., Biochem. J., 73: 119-126, 1959. También pueden usarse otros métodos de escisión de anticuerpos tales como separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, escisión adicional de fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas siempre que los fragmentos se unan al antígeno que se reconoce por el anticuerpo intacto.
Los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas V_{H} y V_{L}. Esta asociación puede ser no covalente, como se describe en Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69: 2659-62, 1972. Como alternativa, las cadenas variables pueden unirse mediante un enlace disulfuro intermolecular o entrecruzarse por compuestos químicos tales como glutaraldehído. Preferiblemente, los fragmentos Fv comprenden cadenas V_{H} y V_{L} conectadas por un enlazador peptídico. Estas proteínas de unión a antígeno de cadena sencilla (sFv) se preparan por construcción de un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios V_{H} y V_{L} conectados por un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión que se introduce posteriormente en una célula hospedadora tal como E. coli. Las células hospedadoras recombinantes sintetizan una cadena polipeptídica sencilla con un péptido enlazador que enlaza los dos dominios V. Se describen métodos para producir sFv, por ejemplo, por Whitlow y Filpula, Methods, 2: 97-105,1991; Bird et al., Science 242: 423-426, 1988; Pack et al., Bio/Technology 11: 1271-77, 1993; y Ladner et al., Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778.
Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica una sola región determinante de complementariedad (CDR). Pueden obtenerse péptidos de CDR ("unidades de reconocimiento mínimas") por construcción de genes que codifiquen la CDR de un anticuerpo de interés. Dichos genes se preparan, por ejemplo, por uso de la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable a partir del ARN de células productoras de anticuerpos. Véase, por ejemplo, Larrick y Fry, Methods, 2: 106-10, 1991.
Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son moléculas quiméricas de inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígeno de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo de receptor) en las que los restos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo de donante) tal como ratón, rata o conejo, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos flanqueantes de Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los restos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo de receptor ni en la CDR o las secuencias flanqueantes importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno y, típicamente dos dominios variables, donde todas o sustancialmente todas las regiones CDR se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana.
El anticuerpo humanizado también comprenderá de forma óptima al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2: 593-596 (1992)].
Se conocen bien en la técnica métodos para humanizar anticuerpos no humanos. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos aminoacídicos introducidos en el mismo de una fuente que no es humana. Estos restos aminoacídicos no humanos se denominan con frecuencia restos importados que se toman típicamente a partir de un dominio variable importado. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)], sustituyendo las CDR o secuencias de CDR de roedor a las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567), donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR se sustituyen por restos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.
También pueden producirse anticuerpos humanos usando diversos procedimientos conocidos en la técnica incluyendo bibliotecas de presentación en fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cole et al. y Boerner et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991)]. De forma similar, pueden generarse anticuerpos humanos introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcialmente o completamente. Tras la exposición, se observa producción de anticuerpos humanos, que se parece mucho a la observada en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo reorganización de genes, ensamblaje y repertorio de anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y en las publicaciones científicas siguientes: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).
Se apreciará que una vez que se identifican las CDR de un anticuerpo, usando técnicas de modificación por ingeniería genética convencionales, pueden usarse para elaborar polinucleótidos que puedan expresarse que codifiquen cualquiera de las formas o fragmentos de anticuerpos descritos en este documento.
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Un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano
El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) es un complejo de antígenos codificado por un grupo de loci relacionados que se denominan en conjunto H-2 en el ratón y HLA en seres humanos. Las dos clases principales de los antígenos de MHC clase I y clase II comprenden cada una un conjunto de glicoproteínas de superficie celular que desempeñan un papel en la determinación del tipo tisular y compatibilidad de trasplantes. En reacciones de trasplante, las células T citotóxicas (CTL) responden principalmente contra glicoproteínas clase I extrañas mientras que las células T auxiliares responden principalmente contra glicoproteínas clase II extrañas.
Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I se expresan en la superficie de casi todas las células. Estas moléculas funcionan presentando péptidos que proceden principalmente de proteínas sintetizadas endógenamente a células T CD8 más mediante una interacción con el receptor de células T \alpha\beta. La molécula de MHC clase I es un heterodímero compuesto por una cadena pesada de 46 kDa que se asocia de forma no covalente con la cadena ligera de 12 kDa \beta-2 microglobulina. En seres humanos, existen varios haplotipos de MHC, tales como, por ejemplo, HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 y HLA-Cw8, pudiendo encontrarse sus secuencias en la base de datos de kabbat http://immuno.bme.nwu.edu/.
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Péptidos que se unen a moléculas de MHC clase I; antígenos restringidos por HLA
Los péptidos restringidos por MHC clase I (también denominados en este documento indistintamente antígenos restringidos por HLA, péptidos restringidos por HLA, antígenos restringidos por MHC) que son típicamente de 8-10 aminoácidos de longitud se unen a la hendidura \alpha1-\alpha2 de la cadena pesada a través de dos o tres restos de anclaje que interaccionan con los bolsillos de unión correspondientes en la molécula de MHC. La cadena \beta-2 microglobulina desempeña un papel importante en el transporte intracelular de MHC clase I, la unión a péptido y la estabilidad conformacional. Para la mayoría de moléculas clase I, la formación de un heterodímero que consiste en la cadena pesada de MHC clase I, un péptido (propio o antigénico) y \beta-2 microglobulina, es necesaria para la maduración biosintética y la expresión en superficie celular.
Estudios de investigación realizados sobre la unión de péptidos a moléculas de MHC clase I permiten definir motivos de MHC específicos funcionales para presentar péptidos procedentes de antígenos virales, tumorales y propios que sean potencialmente inmunogénicos y pudieran generar una respuesta específica de linfocitos T citotóxicos (CTL).
Como se usa en este documento, el término "péptido" se refiere a péptidos nativos (productos de degradación o péptidos sintetizados sintéticamente) y adicionalmente a peptidomiméticos, tales como peptoides y semipeptoides que son análogos peptídicos que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que hacen a los péptidos más estables mientras estén en un cuerpo, o más inmunogénicos. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, ciclación, modificación N-terminal, modificación C-terminal, modificación de enlaces peptídicos incluyendo, pero sin limitación, CH_{2}-NH, CH_{2}-S, CH_{2}S=O, O=C-NH, CH_{2}-O, CH_{2}-CH_{2}, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, modificación de la cadena principal y modificación de restos. Se conocen bien en la técnica métodos para preparar compuestos peptidomiméticos y se especifican en Quantitative Drug Design, C. A. Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992). Se proporcionan en este documento a continuación detalles adicionales a este respecto.
Como se usa en este documento en la memoria descriptiva y en la sección de reivindicaciones a continuación, se entiende que el término "aminoácido" incluye los 20 aminoácidos de origen natural; los aminoácidos modificados con frecuencia postraduccionalmente in vivo incluyendo, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos poco habituales incluyendo, pero sin limitación, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina y ornitina. Además, el término "aminoácido" incluye aminoácidos tanto D como L. La elaboración adicional de los aminoácidos posibles que pueden usarse de acuerdo con la presente invención y ejemplos de aminoácidos no naturales útiles en antígenos peptídicos reconocibles por MHC-I HLA-A2 se proporcionan en este documento a continuación.
Basándose en los datos experimentales acumulados, en la actualidad es posible predecir cuáles de los péptidos de una proteína se unirán a MHC clase I. El MHC clase I HLA-A2 se ha caracterizado hasta ahora mejor que otros haplotipos de HLA, aunque están disponibles datos predictivos y/o esporádicos para todos los demás haplotipos.
Con respecto a los péptidos de unión a HLA-A2, se asumen las siguientes posiciones (P1-P9) en un péptido de 9 aminoácidos:
P1-P2-P3-P4-P5-P6-P7-P8-P9
Las posiciones P2 y P2 incluyen los restos de anclaje que son los restos principales que participan en la unión a moléculas de MHC. Los restos aminoacídicos que se acoplan en las posiciones P2 y P9 son aminoácidos naturales no cargados alifáticos hidrófilos (siendo ejemplos Ala, Val, Leu, Ile, Gln, Thr, Ser, Cys, preferiblemente Val y Leu) o de un aminoácido no cargado alifático hidrófilo no natural (siendo ejemplos norleucina (Nle), norvalina (Nva), ácido \alpha-aminobutírico). También se sabe que las posiciones P1 y P3 incluyen restos aminoacídicos que participan o contribuyen a la unión a moléculas de MHC, sin embargo estas posiciones pueden incluir cualquier aminoácido natural o no natural. Las otras posiciones se acoplan por restos aminoacídicos que típicamente no participan en la unión, sino que estos aminoácidos se presentan a las células inmunes. Pueden encontrarse detalles adicionales que se refieren a la unión de péptidos a moléculas de MHC en Parker, K. C., Bednarek, M. A., Coligan, J. E., Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J Immunol. 152, 163-175, 1994., véase la Tabla V, en particular. Por lo tanto, la puntuación de péptidos de unión a HLA-A2.1 puede realizarse usando el programa informático HLA Peptide Binding Predictions accesible a través de una interfaz de página web en la dirección http.//www.bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html. Este programa informático se basa en datos y puntuaciones acumuladas de cada péptido posible en una proteína analizada para determinar su unión posible a MHC HLA-A2.1 de acuerdo con la contribución de cada aminoácido en el péptido. Las puntuaciones de unión teóricas representan la semivida calculada del complejo de HLA-A2.1-péptido.
Pueden sustituirse aminoácidos naturales alifáticos hidrófilos en P2 y P9 por aminoácidos sintéticos, preferiblemente Nleu, Nval y/o ácido \alpha-aminobutírico. P9 también puede sustituirse por aminoácidos alifáticos de la fórmula general -HN(CH_{2})_{n}COOH, donde n = 3-5, así como por derivados ramificados de la misma, tales como, pero sin limitación,
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donde R es, por ejemplo, metilo, etilo o propilo localizado en cualquiera de uno o más de los n carbonos.
El resto aminoterminal (posición P1), puede sustituirse por ácidos carboxílicos alifáticos cargados positivamente, tales como, pero sin limitación, H_{2}N(CH_{2})_{n}COOH, donde n = 2-4 y H_{2}N-C(NH)-NH(CH_{2})_{n}COOH, donde n = 2-3, así como por hidroxi-lisina, N-metil-lisina u ornitina (Orn). Además, el resto aminoterminal puede sustituirse por restos aromáticos extendidos tales como, pero sin limitación, H_{2}N-(C_{6}H_{6})-CH_{2}-COOH, p-aminofenilalanina, H_{2}N-F(NH)-NH-(C_{6}H_{6})-CH_{2}-COOH, p-guanidinofenilalanina o piridinoalanina (Pal). Estos últimos restos pueden formar un enlace de hidrógeno con los restos OH^{-} de los restos tirosina en el bolsillo de unión N-terminal de MHC-1, así como generar al mismo tiempo interacciones entre compuestos aromáticos.
La derivatización de restos aminoacídicos en posiciones P4-P8, debiendo tener estos restos una cadena lateral, tal como OH, SH o NH_{2}, como Ser, Tyr, Lys, Cys u Orn, puede ser por alquilo, arilo, alcanoílo o aroílo. Además, los grupos OH en estas posiciones también pueden derivatizarse por fosforilzación y/o glicosilación. Se ha demostrado en algunos casos que estas derivatizaciones potencian la unión al receptor de célula T.
Los derivados más largos en los que el segundo aminoácido de anclaje está en posición P10 pueden incluir en P9 la mayoría de aminoácidos L. En algunos casos también son aplicables derivados más cortos en los que el ácido C terminal sirve como el segundo resto de anclaje.
Los derivados de aminoácidos cíclicos pueden acoplarse en posición P4-P8, preferiblemente en posiciones P6 y P7. Puede obtenerse ciclación por formación de enlaces amida, por ejemplo, por incorporación de Glu, Asp, Lys, Orn, ácido di-aminobutírico (Dab), ácido di-aminopropiónico (Dap) en diversas posiciones en la cadena (enlaces -CO-NH o -NH-CO). También puede obtenerse ciclación de cadena principal con cadena principal por incorporación de aminoácidos modificados de las fórmulas H-N((CH_{2})_{n}-COOH)-C(R)H-COOH o H-N((CH_{2})_{n}-COOH)-C(R)H-NH_{2}, donde n = 1-4 y adicionalmente donde R es cualquier cadena lateral natural o no natural de un aminoácido.
También es posible la ciclación por formación de enlaces S-S por incorporación de dos restos Cys. Puede obtenerse ciclación de cadena lateral con cadena lateral adicional por formación de un enlace de interacción de la fórmula -(-CH_{2}-)_{n}-S-CH_{2}-C-, donde n = 1 ó 2, que es posible, por ejemplo, por incorporación de Cys u homoCys y reacción de su grupo SH libre con, por ejemplo, Lys, Orn, Dab o Dap bromoacetilado.
Pueden sustituirse enlaces peptídicos (-CO-NH-) dentro del péptido por enlaces N-metilados (-N(CH_{3})-CO-), enlaces éster (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), enlaces cetometileno (-CO-CH_{2}-), enlaces \alpha-aza (-NH-N(R)-CO-), donde R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH_{2}-NH-), enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH_{2}-), enlaces tioamida (-CS-NH-), dobles enlaces olefínicos (-CH=CH-), enlaces retroamida (-NH-CO-), derivados peptídicos (-N(R)-CH_{2}-CO-), donde R es la cadena lateral "normal", presente de forma natural en el átomo de carbono.
Estas modificaciones pueden darse en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídico, e incluso en varios (2-3) al mismo tiempo. Preferiblemente, pero no necesariamente en todos los casos, estas modificaciones deberían excluir aminoácidos de anclaje.
Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tyr y Phe pueden sustituirse por ácidos no naturales sintéticos tales como TIC, naftilelanina (Nol), derivados de anillo metilado de Phe, derivados halogenados de Phe o o-metil-Tyr.
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Antígenos restringidos por HLA tumorales
Las referencias enumeradas en la siguiente Tabla proporcionan ejemplos de péptidos restringidos por HLA tumorales de MHC clase I humana derivados de antígenos asociados con tumores (TAA) o marcadores proteicos asociados con diversos cánceres. Pueden encontrarse péptidos restringidos por HLA tumorales adicionales derivados de antígenos asociados con tumores (TAA) en http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/
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Antígenos restringidos por HLA virales
Las referencias enumeradas en la siguiente Tabla proporcionan ejemplos de péptidos restringidos por HLA virales de MHC clase I humano derivados de antígenos virales asociados con diversos cánceres.
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Antígenos restringidos por HLA autoinmunes
La página web http://www.bmi-heidelberg.com/syfpeithi/ proporciona ejemplos de péptidos restringidos por HLA autoinmunes de MHC clase I humano derivados de antígenos autoinmunes.
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Moléculas MHC clase I solubles
Se describen complejos de MHC clase I y clase II recombinantes que son solubles y que pueden producirse en grandes cantidades, por ejemplo, en las referencias 23, 24 y 41-53 y adicionalmente en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 09/534.966 y PCT/IL01/00260 (publicada como documento WO 01/72768). Están disponibles moléculas de MHC clase I solubles o pueden producirse para cualquiera de los haplotipos de MHC, tales como, por ejemplo, HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 y HLA-Cw8, siguiendo, por ejemplo, los contenidos del documento PCT/IL01/00260, ya que se conocen sus secuencias y pueden encontrarse en la base de datos de kabbat en la dirección http://immuno.bme.nwu.edu/. Dichas moléculas de MHC clase I solubles pueden cargarse con antígenos restringidos por HLA adecuados y usarse para la vacunación de mamíferos no humanos que tienen células que expresan el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano, como se detalla adicionalmente en este documento a continuación.
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Mamíferos no humanos que tienen células que expresan el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano
Pueden producirse mamíferos no humanos que tienen células que expresan un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano y desprovistos de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I propio usando (i) la información de secuencia proporcionada en la base de datos de kabbat en la dirección http://immuno.bme.nwu.edu/ que pertenece a haplotipos de MHC humano, tales como, por ejemplo, HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A24, HLA-A28, HLA-A31, HLA-A33, HLA-A34, HLA-B7, HLA-B45 y HLA-Cw8, (ii) técnicas de preparación de construcciones convencionales como se describen en, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley y Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); y (iii) técnicas de introducción/anulación de genes convencionales como se exponen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 5.487.992, 5.464.764, 5.387.742, 5.360.735, 5.347.075, 5.298.422, 5.288.846, 5.221.778, 5.175.385, 5.175.384, 5.175.383, 4.736.866; en las Publicaciones Internacionales WO 94/23049, WO93/14200, WO 94/06908 y WO 94/28123; así como en Burke y Olson, Methods in Enzymology, 194: 251-270, 1991; Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989; Davies et al, Nucleic Acids Research, 20 (11) 2693-2698, 1992; Dickinson et al, Human Molecular Genetics, 2 (8): 1299-1302, 1993; Duff y Lincoln, "Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expression in ES cells", Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders, 1995; Huxley et al, Genomics, 9: 742-750 1991; Jakobovits et al, Nature, 362: 255-261, 1993; Lamb et al, Nature Genetics, 5: 22-29, 1993; Pearson y Choi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993. 90: 10578-82; Rothstein, Methods in Enzymology, 194: 281-301, 1991; Schedl et al, Nature, 362: 258-261, 1993; Strauss et al, Science, 259: 1904-1907, 1993.
Es de interés particular el artículo por Pascolo et al, publicado en J. Exp. Med. 185: 2043-2051, 1997, que describe la preparación de ratones que expresan las moléculas de MHC clase I HLA-A2.1, H-2Db y HHD humanas y desprovistos totalmente de MHC clase I de ratón.
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Restos identificables
En algunos aspectos de la misma, la presente invención emplea conjugados de un anticuerpo y un resto identificable. Con este fin, en un ejemplo, un primer y un segundo polinucleótidos que codifican el anticuerpo y el resto identificable, respectivamente, se ligan en fase de lectura para codificar un inmunomarcador. La siguiente tabla proporciona ejemplos de secuencias de restos identificables.
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Restos terapéuticos
En algunos aspectos de la misma, la presente invención emplea conjugados de un anticuerpo y un resto terapéutico. Con este fin, en un ejemplo, un primer y un segundo polinucleótidos que codifican el anticuerpo y el resto terapéutico, respectivamente, se ligan en fase de lectura para codificar una inmunotoxina. La siguiente tabla proporciona ejemplos de secuencias de restos terapéuticos.
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Conjugados químicos
Se conocen muchos métodos en la técnica para conjugar o fusionar (acoplar) moléculas de diferentes tipos, incluyendo péptidos. Estos métodos pueden usarse de acuerdo con la presente invención para acoplar a un anticuerpo otro resto, tal como un resto terapéutico o un resto identificable, para proporcionar de este modo una inmunotoxina o inmunomarcador.
Dos péptidos aislados pueden conjugarse o fusionarse usando cualquier método de conjugación conocido por un especialista en la técnica. Un péptido puede conjugarse con un anticuerpo de interés, usando un éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridiltio)propiónico (también denominado N-succinimidil 3-(2piridilditio)propionato ("SDPD") (Sigma, Nº Cat. P-3415), un procedimiento de conjugación con glutaraldehído o un procedimiento de conjugación con carbodiimida.
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Conjugación con SPDP
Puede usarse cualquier método de conjugación con SPDP conocido por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, en una realización ilustrativa se usa una modificación del método de Cumber et al. (1985, Methods of Enzymology 112: 207-224) como se describe a continuación.
Un péptido, tal como un resto identificable o terapéutico, (1,7 mg/ml) se mezcla con un exceso de 10 veces de SPDP (50 mM en etanol) y el anticuerpo se mezcla con exceso un de 25 veces de SPDP en fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,10 M pH 7,2 y cada una de las reacciones incubadas, por ejemplo, durante 3 horas a temperatura ambiente. Después las reacciones se dializan contra PBS.
El péptido se reduce, por ejemplo, con DTT 50 mM durante 1 hora a temperatura ambiente. El péptido reducido se desaliniza por equilibrado en una columna G-25 (hasta el 5% del volumen de muestra/columna) con KH_{2}PO_{4} 50 mM pH 6,5. El péptido reducido se combina con el SPDP-anticuerpo en una proporción molar de 1:10 de anticuerpo:péptido y se incuba a 4ºC durante una noche para formar un conjugado de péptido-anticuerpo.
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Conjugación con glutaraldehído
La conjugación de un péptido (por ejemplo, un resto identificable o terapéutico) con un anticuerpo puede realizarse por métodos conocidos por los especialistas en la técnica usando glutaraldehído. Por ejemplo, en una realización ilustrativa, se usa el método de conjugación por G. T. Hermanson (1996, "Antibody Modification and Conjugation, en Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego) descrito a continuación.
El anticuerpo y el péptido (1,1 mg/ml) se mezclan en un exceso de 10 veces con glutaraldehído al 0,05% en fosfato 0,1 M, NaCl 0,15 M pH 6,8 y se deja reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Puede añadirse lisina 0,01 M para bloquear los sitios en exceso. Después de la reacción, el glutaraldehído en exceso se elimina usando una columna G-25 equilibrada con PBS (10% v/v de volúmenes de muestra/columna).
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Conjugación con carbodiimida
La conjugación de un péptido con un anticuerpo puede realizarse por métodos conocidos por los especialistas en la técnica usando un agente de deshidratación tal como una carbodiimida. Más preferiblemente, la carbodiimida se usa en presencia de 4-dimetil aminopiridina. Como saben bien los especialistas en la técnica, puede usarse la conjugación con carbodiimida para formar un enlace covalente entre un grupo carboxilo de péptido y un grupo hidroxilo de un anticuerpo (dando como resultado la formación de un enlace éster) o un grupo amino de un anticuerpo (dando como resultado la formación de un enlace amida) o un grupo sulfhidrilo de un anticuerpo (dando como resultado la formación de un enlace tioéster).
Así mismo, puede usarse el acoplamiento con carbodiimida para formar enlaces covalentes análogos entre un grupo carbono de un anticuerpo y un grupo hidroxilo, amino o sulfhidrilo del péptido. Véase, en general, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reaction's, Mechanism, and Structure, págs. 349-50 y 372-74 (3ª ed.), 1985. A modo de ilustración, y sin limitación, el péptido se conjuga con un anticuerpo mediante un enlace covalente usando una carbodiimida, tal como diciclohexilcarbodiimida. Véanse en general los métodos de conjugación por B. Neises et al. (1978, Angew Chem., Int. Ed. Engl. 17: 522; A. Hassner et al. (1978, Tetrahedron Lett. 4475); E. P. Boden et al. (1986, J. Org. Chem. 50: 2394) y L. J. Mathias (1979, Synthesis 561).
Objetos, ventajas y nuevas características adicionales de la presente invención se harán evidentes para un especialista en la técnica tras el examen de los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Además, cada una de las diversas realizaciones y aspectos de la presente invención como se ha descrito en este documento anteriormente y como se reivindican en la sección de reivindicaciones a continuación encuentra apoyo experimental en los siguientes ejemplos.
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Ejemplos
Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores, ilustran la invención de una forma no limitante.
Generalmente, la nomenclatura usada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican minuciosamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se exponen en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volúmenes I-IH Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Tercera Edición; "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8ª Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía de patentes y científica, véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); incorporándose todas por referencia como si se expusieran con todo detalle en este documento. Se proporcionan otras referencias generales por todo este documento. Se piensa que los procedimientos en las mismas son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la comodidad del lector.
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Materiales y métodos experimentales Producción de Complejos de scMHC/péptido Biotinilados
Se produjeron complejos de MHC de cadena sencilla/péptido por replegamiento in vitro de cuerpos de inclusión producidos en E. coli, como se ha descrito anteriormente (23, 24, Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 09/534.966 y PCT/IL01/00260 (publicada como documento WO 01/72768). Se realizó la biotinilación usando la enzima BirA (Avidity, Denver, CO) como se ha descrito anteriormente (25).
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Inmunización de ratones
Se inmunizaron ratones anulados D^{b-}/^{-} X \beta2 microglobulina (\beta2m), transgénicos para un HLA-A2.1/D^{b}-cadena sencilla \beta2 microglobulina recombinante (ratones HHD) (26) con una emulsión que contenía péptido de tuberculina derivado de proteína purificada (PPD) covalentemente acoplado con complejos de HLA-A2/G9-209 como se ha descrito anteriormente (17). En resumen, los ratones se inmunizaron inicialmente por vía subdérmica y posteriormente por vía subcutánea durante intervalos de dos semanas durante un periodo de 3-5 meses con 20-30 \mug/ratón de la mezcla antigénica en adyuvante incompleto de Freund. Se recogieron los bazos dos semanas después de la última inmunización.
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Construcción de biblioteca y selección de anticuerpos en fagos en complejos biotinilados
Se aisló el ARN total de ratones inmunizados y se construyó una biblioteca de anticuerpo scFv mediante PCR a temperatura ambiente a partir de la ARNm como se describe (27). El repertorio de scFv se clonó como un fragmento de SfiI-NotI en los vectores fagémidos pCANTAB5E o pCC-CBD (28). La complejidad de ambas bibliotecas era de 1 x 10^{8} clones independientes. Para la selección, se incubaron complejos de scHLA-A2/G9-209M biotinilados (20 \mug) con perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (2 x 10^{8}), se lavaron y se incubaron con 10^{11} ufc de las bibliotecas (1 hora a temperatura ambiente). Partiendo con la 2ª vuelta, se realizó la selección en presencia de un exceso (5 \mug) de complejos de scHLA-A2/G9-280V. Se lavaron las perlas exhaustivamente 10-12 veces con MPBS al 2% + TWEEN20 al 0,1%. Los fagos unidos se eluyeron usando 1 ml de Trietilamina (100 mM, pH 12) durante 5 minutos a temperatura ambiente seguido de neutralización con 0,1 ml de Tris-HCl 1 M, pH 7,4. Los fagos eluidos se expandieron en células E. coli TG1 en fase de crecimiento exponencial que después se superinfectaron con fago auxiliar M13KO7 como se describe (28).
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Expresión y purificación de scFv recombinante soluble y proteína de fusión scFv-P38
El gen de G1 scFv se rescató del clon de fago mediante PCR y se subclonó en el vector fagémido pCANTAB6 mediante el uso de los sitios de clonación SfiI-NotI. Se fusionaron marcadores Myc y hexahistidina con el extremo C-terminal del gen de scFv. El anticuerpo scFv se expresó en células BL21 \lambdaDE3 como se ha descrito anteriormente (29) y se purificó a partir de la fracción periplásmica mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos. Para la expresión de la proteína de fusión G1scFv-PE38, el gen de scFv se subclonó como un fragmento NcoI-NotI en el plásmido pIB-NN, que codifica los dominios de translocación y ADP-ribosilación de PE (PE38). La expresión en células BL21 \lambdaDE3, el replegamiento a partir de cuerpos de inclusión y la purificación de G1scFv-PE38 se realizó como se ha descrito anteriormente (30).
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ELISA con clones de fagos y scFv o scFv-PE38 purificado
Se realizaron estudios de especificidad de unión mediante ELISA usando complejos de scMHC-péptido biotinilados. En resumen, se recubrieron placas de ELISA (Falcon) durante una noche con BSA-biotina (1 \mug/pocillo), se lavaron, se incubaron (1 hora, a temperatura ambiente) con estreptavidina (1 \mug/pocillo), se lavaron de nuevo exhaustivamente y se incubaron adicionalmente (1 hora, a temperatura ambiente) con 0,5 \mug de complejos de MHC/péptido. Las placas se bloquearon con PBS/leche al 2% (30 minutos, a temperatura ambiente), se incubaron con clones de fagos (aproximadamente 10^{9} fagos/pocillo, 1 hora, a temperatura ambiente) o 0,5-1 \mug de scFv o scFv-PE38 soluble y después se lavaron con 1:1000 de anti-M13 conjugado con HRP, anticuerpo anti-myc o anticuerpo anti-PE, respectivamente. Los péptidos restringidos por HLA-A2 usados para estudios de especificidad eran gp100 (154): KTWGQYWQV (SEC ID Nº: 1); gp100 (209): IMDQVPFSV (SEC ID Nº: 2); gp100 (280): YLEPGPVTV (SEC ID Nº: 3); MUC1: LLLTVLTVL (SEC ID Nº: 4); HTLV-1 (TAX): LLFGYPVYV (SEC ID Nº: 5); hTEtemperatura ambiente (540): ILAKFLHWL (SEC ID Nº: 6); hTEtemperatura ambiente (865): RLVDDFLLV (SEC ID Nº:7).
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Citometría de Flujo
La línea de células B RMAS-HHD transfectada con un gen de \beta2M-HLA-A2 de cadena sencilla (26) o las células JY linfoblásticas B transformadas con EBV (10^{6} células) se lavaron dos veces con RPMI sin suero y se incubaron durante una noche a 26ºC o 37ºC, respectivamente, en medio que contenía 100 \muM del péptido. Las APC se incubaron posteriormente a 37ºC durante 2-3 horas para estabilizar la expresión en superficie celular de complejos de MHC-péptidos seguido de incubación con scFv recombinante (10-50 \mug/ml, 60-90 minutos, 4ºC) en 100 \mul. Después, las células se lavaron, se incubaron con anticuerpo anti-Myc marcado con FITC (30-45 minutos, 4ºC) y por último se lavaron y se analizaron mediante un citómetro de flujo FACStar (Becton Dickinson).
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Ensayos de unión de competición
Se recubrieron placas de ELISA flexibles con BSA-biotina y se inmovilizaron en las mismas complejos de scMHC-péptido (10 \mug en 100 \mul). El G1scFv-PE38 recombinante se marcó con [^{125}I] usando el reactivo de Bolton-Hunter. Se añadió proteína marcada a los pocillos con un indicador (3-5 x 10^{5} CPM/pocillo) en presencia de concentraciones crecientes del G1scFv-PE38 frío como competidor y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora en PBS. Las placas se lavaron minuciosamente con PBS y se determinó la radiactividad unida mediante un contador gamma. La afinidad aparente del G1scFv-PE38 se determinó por extrapolación de la concentración de un competidor necesario para conseguir una inhibición del 50% de la unión de G1scFv-PE38 marcado con [^{125}I] al complejo de scMHC-péptido inmovilizado. Se determinó la unión inespecífica por adición de un exceso de 20-40 veces de Fab sin marcar.
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Ensayos de citotoxicidad
Se cargaron APC RMAS-HHD y JY con el péptido G9-209 y péptidos de control como se ha descrito anteriormente. Las células cargadas con péptido se incubaron posteriormente con concentraciones crecientes de G1scFv-PE38 y la inhibición de la síntesis de proteínas se determinó por medición de la captación de ^{3}H-Leucina en proteínas celulares, como se ha descrito previamente (30). Se determinó la CI_{50} como la concentración de G1scFv-PE38 necesaria para inhibir la síntesis de proteína el 50%. En ensayos de competición, se añadió un exceso de complejos de HLA-A2-péptido específicos e inespecíficos (35-50 \mug/pocillo) a pocillos 15 minutos antes de la adición de G1scFv-PE38.
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Resultados experimentales Generación de complejos de MHC de cadena sencilla-péptido recombinantes con el péptido derivado de gp100 de melanoma G9-209M
La gp100 es una glicoproteína de membrana específica de linaje de melanocitos que consiste en 661 aminoácidos que se expresan en la mayoría de células de melanoma (19-22). Esta proteína se reconoce por muchos linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) restringidos por HLA-A2 reactivos con melanoma que se han aislado de pacientes con melanoma. Se han identificado varios epítopos restringidos por HLA-A2 de células T en gp100; se han mejorado en las posiciones de anclaje a MHC para una inmunogenicidad aumentada sin alterar la especificidad de célula T (31). El péptido G9-209M (IMDQVPFSV, SEC ID Nº: 2) es uno de tres epítopos inmunogénicos principales (19-22). Se generaron complejos de MHC-péptido recombinantes que presentan el péptido G9-209M usando una construcción de MHC de cadena sencilla (scMHC) expresada en E. coli que se ha descrito anteriormente (23, 24, Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 09/534.966 y PCT/IL01/00260 (publicada como documento WO 01/72768). Los complejos de scMHC-péptido se producen por replegamiento in vitro de cuerpos de inclusión en presencia del G9-209M u otros péptidos restringidos por HLA-A2, seguido de un protocolo de purificación que emplea cromatografía de intercambio iónico. Los complejos de scHLA-A2-péptido replegados derivados de gp100 y de control eran muy puros, homogéneos y monoméricos, como se determinó por análisis en SDS-PAGE y cromatografía de filtración en gel. Se ha demostrado anteriormente que los complejos de scHLA-A2 que contienen G9-209M son funcionales por su capacidad para estimular líneas y clones de CTL específicos y teñir células T específicas de G9-209M en forma de tetrámeros (23, 24).
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Construcción de una biblioteca en fago de anticuerpo scFv y selección de un fago que se une a complejos de HLA-A2/G9-209M con especificidad similar a TCR
Para los fines de inmunización se acopló PPD al complejo purificado y los ratones anulados D^{b-}/^{-} X \beta2 microglobulina (\beta2m) para un HLA-A2.1/D^{b}-cadena sencilla \beta2 microglobulina recombinante (ratones HHD) (26) se humanizaron con el mismo. Estos ratones combinan la transgénesis de HLA clásica con destrucción selectiva de H-2 clase I murino. Por lo tanto, a diferencia de los transgénicos HLA clásicos, estos ratones mostraban solamente respuestas restringidas por HLA-A2.1 con proteínas multiepítopo tales como virus intactos. Además, se supone que estos ratones son una herramienta útil para la inmunización con complejos de HLA-A2-péptido porque deberían ser enormemente tolerantes a HLA-A2 como un inmunógeno de células B y, por lo tanto, pueden favorecer la generación de una respuesta de anticuerpos dirigida contra el epítopo restringido por MHC cuando está formando un complejo con HLA-A2 (el péptido asociado a tumor específico). Se usó PPD para la conjugación porque es un inmunógeno de célula T altamente reactivo (17).
Se aisló ARNm de bazo total a partir de ratones inmunizados y se realizó su transcripción inversa a ADNc. Se usaron conjuntos específicos de cebadores degenerados para amplificar por PCR los segmentos de ADNc correspondientes a los dominios variables de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina (27). Las combinaciones de PCR de VH y VL se ensamblaron en un repertorio de scFv mediante una reacción de extensión por solapamiento por PCR y posteriormente se clonaron en el vector fagémido pCANTAB5E o en el vector fagémico pCC-Ga16(Fv), en el que el scFv se expresa como una proteína de fusión en fase de lectura con un domino de unión a celulosa (CBD) (28). Las bibliotecas resultantes se usaron para transducir células E. coli TG1 por electroporación y se expresaron como una fusión con la proteína de cubierta de fago minoritaria pIII después del rescate con un fago auxiliar. La complejidad de la biblioteca consistía en 1 x 10^{8} clones independientes usando ambos tipos de vectores.
La biblioteca se sometió a 3-4 ciclos de selección seguidos de elución de los fagos unidos y reamplificación en E. coli. Para aumentar la eficacia de selección se usaron complejos de scMHC-péptido biotinilados. Se modificó un marcador de secuencia BirA para biotinilación específica de sitio en el extremo C-terminal del gen de HLA-A2 como se ha descrito anteriormente (25). Se emplearon varias estrategias de selección, dando como resultado la más exitosa de las mismas el aislamiento de agentes de unión específicos, y consistiendo en protocolos de selección con una etapa de reducción negativa partiendo de la 2ª ronda de selección. Los complejos biotinilados de HLA-A2/G9-209M específicos se inmovilizaron en perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina y la biblioteca se incubó con el complejo inmovilizado en presencia de un gran exceso de complejos de HLA-2 que presentaban un epítopo derivado de gp100 diferente, el péptido G9-280V. Cuando se usa esta estrategia el fago específico de G9-209M se unirá a complejos inmovilizados con estreptavidina-biotina que se capturan mediante una fuerza magnética, mientras que los agentes de unión pan-MHC que no son específicos para el péptido G9-209M en el complejo se unirán al complejo inespecífico en la solución y por lo tanto pueden separarse y eliminarse del fago específico. Como se muestra en la Tabla 1 a continuación, se observa un enriquecimiento progresivo marcado para fagos que se unen a los complejos inmovilizados después de 3-4 rondas de selección, realizándose dos de las mismas con la estrategia de reducción negativa.
TABLA 1 Selección de fagos en complejos de scHLA-A2/G9-209M
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Una 4º ronda de selección dio como resultado enriquecimientos similares a los observados en la ronda 3.
Se realizó un ELISA de fagos policlonal para determinar la especificidad de fagos sobre complejos de scMHC-péptido recombinantes biotinilados inmovilizados en inmunoplacas recubiertas con BSA-Biotina-estreptavidina. El espaciador de BSA-biotina-estreptavidina permite la presentación correcta de los complejos, que pueden deformarse por unión directa a plástico. Los fagos analizados ya después de la 2ª y, más espectacularmente después de la 3ª ronda de selección pusieron de manifiesto un patrón de especificidad único dirigido solamente hacia los complejos de HLA-A2 que contenían G9-209M específicos (Figuras 1A-B). No se observó unión con complejos de HLA-A2 de control que presentan el epítopo derivado de gp100, G9-280V o el epítopo derivado de telomerasa 654.
Se aislaron clones de fagos monoclonales individuales a partir de la población de fagos de la última ronda de selección (no se observó un enriquecimiento adicional después de la 4ª ronda) y se volvieron a explorar para determinar la especificidad por ELISA de fagos (Figuras 2A-B). De los 93 clones ensayados, 85 (91%) reaccionaron con el complejo de HLA-A2/G9-209M (Figura 2A). Setenta y siete de los 85 clones reactivos (90%) reaccionaron específicamente con el complejo de HLA-A2/G9-209 específico pero no con el complejo que contenía G9-280V de control (Figura 2B). Sólo un pequeño porcentaje de los clones (5/93; 5%) no presentaba especificidad de péptido (Figura 2B). Por lo tanto, el procedimiento de selección proporcionaba un enriquecimiento exitoso de anticuerpos de fagos con especificidad similar a TCR hacia el complejo de HLA-A2/G9-209M. Un análisis de identificación genética por medio de digestión con enzimas de restricción con múltiples puntos de corte puso de manifiesto que 50 clones específicos de HLA-A2/G9-209M positivos tenían un patrón de digestión similar, indicando que eran todos similares (no se muestran los datos). Se obtuvieron resultados similares con las dos bibliotecas. Puesto que se construyeron a partir del mismo material genético (la misma combinación de ARNm), sólo los clones de fagos derivados de la biblioteca pCANTAB5E scFv se caracterizaron adicionalmente.
La secuenciación de ADN de dominios variables VH y VL a partir de 10 clones puso de manifiesto que todos eran idénticos (no se muestran los datos) sugiriendo que todos procedían de un solo acontecimiento combinatorio de VH/VL de anticuerpos productivo.
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Caracterización del anticuerpo scFv recombinante soluble con especificidad similar a TCR
La secuenciación de ADN puso de manifiesto que la secuencia VH del anticuerpo pertenece a las cadenas pesadas de ratón subgrupo III (D) y la secuencia VL a las cadenas ligeras kappa de ratón grupo IV (de acuerdo con Kabbat). La secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº: 8) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº: 9) se muestran en la Figura 3A. Para caracterizar adicionalmente la especificidad de unión y las propiedades biológicas del anticuerpo scFv seleccionado, denominado G1, se usaron dos sistemas de expresión; para el primero el scFv se subclonó en el vector fagémido pCANTAB6 en el que un marcador myc y hexahistidina se fusionan con el extremo C-terminal del gen de scFv. El segundo era un sistema de expresión dirigido por el promotor de T7 en el que el gen de scFv se fusiona con una forma truncada de la Exotoxina A de Pseudomonas (PE38) para generar un scFv-inmunotoxina (12). Esta forma truncada de PE contiene los dominios de translocación y ADP-ribosilación de la PE completa pero carece del dominio de unión a células que se sustituye por el fragmento scFv fusionado en el extremo N-terminal de la toxina truncada. El G1 scFv se produjo en células E. coli BL21 (\lambdaDE3) por secreción y se purificó a partir de fracciones periplásmicas por cromatografía de afinidad por metales usando el marcador de hexahistidina fusionado al extremo C-terminal (Figura 3B). El G1 scFv-PE38 se expresó en células BL21 y tras la inducción con IPTG, se acumularon grandes cantidades de proteína recombinante como cuerpos de inclusión intracelulares. El SDS-PAGE mostraba que los cuerpos de inclusión de cultivos que expresan G1 scFv-PE38 contenían más del 90% de proteína recombinante. Usando protocolos de renaturalización establecidos, el G1 scFv-PE38 se volvió a plegar a partir de cuerpos de inclusión solubilizados en un tampón de replegamiento de intercambio redox y se purificó después de eso por cromatografía de intercambio iónico en columnas de Q-Sepharose y MonoQ y posteriormente por cromatografía de exclusión por tamaño. Se obtuvo una proteína de fusión de G1 scFv-PE38 altamente purificada con el tamaño esperado de 63 kDa según se analizó por SDS-PAGE en condiciones no reductoras (Figura 3C). El perfil molecular del G1scFv y G1scFv-inmunotoxina se analizó por cromatografía de exclusión por tamaño y puso de manifiesto un solo pico de proteína en una forma monomérica con una masa molecular esperada de 26 y 63 kDa, respectivamente (no se muestran los datos). El rendimiento del G1 scFv-inmunotoxina replegado era de aproximadamente el 2%, por lo tanto, podían obtenerse de forma rutinaria 2 mg de proteína altamente pura a partir del replegamiento de 100 mg de proteína obtenida de cuerpos de inclusión que contenían el 80-90% de proteína recombinante. Este rendimiento es similar a scFv-inmunotoxinas descritas anteriormente que se expresaban bien y se producían usando un sistema de expresión y replegamiento similar (30). El rendimiento del G1scFv era de 3 mg a partir de un cultivo bacteriano de 1 litro.
La especificidad de unión del anticuerpo G1 scFv purificado soluble y la proteína de fusión G1 scFv-P38 se determinó por ensayos de ELISA en complejos de MHC-péptido biotinilados inmovilizados en pocillos a través de BSA-biotina-estreptavidina para asegurar un plegamiento correcto de los complejos, que podían deformarse por unión directa a plástico. El plegamiento correcto de los complejos unidos y su estabilidad durante los ensayos de unión se determinaron por su capacidad para reaccionar con el anticuerpo monoclonal específico de conformación w6/32, que se une a complejos de HLA sólo cuando están plegados correctamente y cuando contienen péptido (no se muestran los datos). Cuando se usó la proteína G1 scFv o G1scFv-PE38 purificada soluble, los ensayos de ELISA ponían de manifiesto un patrón de reconocimiento muy específico que se corresponde con las características diferenciales de la especificidad de célula T restringida por MHC (Figura 4). El G1 scFv seleccionado para unirse al complejo de HLA-A2 que contiene G9-209M reaccionaba solamente con el complejo específico y no con complejos que presentaban los complejos de MHC-péptido derivados de gp100 G9-280 y G9-154 ni con otros complejos de control que contenían los epítopos derivados de telomerasa restringidos por HLA-A2 540 y 865 (32), un péptido derivado de MUC1 (33) o el péptido TAX derivado de HTLV-1 (34) (Figura 4). En estos ensayos se detectó la unión con un anticuerpo anti-PE38. Se obtuvieron resultados similares cuando se usaba el anticuerpo G1 scFv sin fusionar cuando la detección se realizó con anticuerpo anti-marcador Myc (no se muestran los datos). Por lo tanto, este fragmento scFv específico de antígeno presenta características de unión y la especificidad refinada de una molécula similar a TCR. El G1 scFv o G1 scFv-PE38 no reconocían el péptido en solitario ni moléculas de HLA-A2 vacías (que son difíciles de producir porque son inestables en ausencia de un péptido) ni estreptavidina ni otros antígenos proteicos (no se muestran los datos).
A continuación, se determinaron las propiedades de unión del G1 scFv-PE38 purificado soluble similar a TCR usando un ensayo de ELISA de saturación en el que se unieron complejos biotinilados a placas recubiertas de BSA-biotina-estreptavidina a las que se añadieron cantidades crecientes de G1 scFv-PE38. La unión de G1scFv-PE38 al complejo de HLA-A2/G9-209M derivado de gp100 específico era dependiente de la dosis y saturable (Figura 5A). La extrapolación de la señal de unión al 50% puso de manifiesto que este anticuerpo poseía una gran afinidad, con una afinidad de unión en el intervalo nanomolar. Para determinar la afinidad de unión aparente de los fragmentos scFv similares a TCR con su complejo de MHC-péptido afín, se realizó un ensayo de unión competitiva en el que se hacía competir la unión de G1scFv-PE38 marcado con ^{125}I con concentraciones crecientes de proteína sin marcar. Estos ensayos de unión pusieron de manifiesto una afinidad de unión aparente en el intervalo nanomolar bajo de 5 nM (Figura 5B). De forma importante, estos resultados recalcan un éxito previo en el asilamiento de un anticuerpo scFv de alta afinidad con especificidad similar a TCR a partir del repertorio de anticuerpos presentados en fagos de ratones transgénicos HLA-A2 inmunizados.
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Unión de G1 scFv a APC que presentan el epítopo derivado de gp100
Para demostrar que el G1 scFv soluble aislado puede unirse al complejo de MHC-péptido específico, no sólo en su forma soluble recombinante sino también en la forma nativa, como se expresa en la superficie celular, se utilizaron dos sistemas de APC. Uno consistía en las células RMA-S deficientes en TAP2 murinas que se transfectaron con el gen de HLA-A2 humano en un formato de cadena sencilla (26) (HLA-A2.1/Db-cadena sencilla \beta2m) (células RMA-S-HHD). El péptido derivado de gp100 y péptidos de control se cargaron en las células RMA-S-HHD y la capacidad del anticuerpo G1 scFv seleccionado para unirse a células cargadas con péptido se controló mediante FACS (Figuras 6A-C). La estabilización de MHC inducida por péptido de las células RMA-S-HHD mutantes para TAP2 se determinó por análisis de la reactividad del anticuerpo anti-HLA conformacional w6/32 y el MAb anti-HLA-A2 BB7.2 con células cargadas y no cargadas con péptido (Figuras 6A y B). El G1 scFv que reconocía el complejo de HLA-A2 que contenía G9-209M reaccionaba solamente con células RMA-S-HHD cargadas con el péptido G9-209M pero no con células cargadas con el péptido G9-280 (Figura 6C) o células de control no cargadas con péptido. El G1 scFv no se unía a células cargadas con otros péptidos de control restringidos por HLA-A2 tales como péptidos derivados de TAX, MUC1 o telomerasa usados para los análisis de especificidad (véase la Figura 4).
También se usó un segundo tipo de APC, en concreto las células JY linfoblásticas B transformadas con EBV que expresan HLA-A2; estas células se incubaron con los péptidos derivados de gp100 o de control. Son TAP+ y, por consiguiente, la presentación del péptido suministrado exógenamente se facilita por intercambio peptídico. Usando esta estrategia, se observó una especificidad de unión similar con el anticuerpo G1 scFv (no se muestran los datos). Estos resultados demuestran que el anticuerpo scFv puede reconocer específicamente su complejo de HLA-A2 nativo correspondiente in situ en la superficie de las células.
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Actividad citotóxica de G1scFv-PE38 hacia APC
Para determinar la capacidad del anticuerpo G1 scFv para servir como resto de direccionamiento para la eliminación específica similar a célula T de células presentadoras de antígeno, se construyó una molécula de G1scFv-PE38 en la que la forma truncada muy potente de exotoxina A de Pseudomonas se fusiona con el extremo C-terminal del gen de scFv y se ensayó su capacidad para destruir APC cargadas con péptido. Se cargaron células RMAS-HHD o JY con los epítopos derivados de gp100 G9-209M y G9-280V, así como con otros péptidos restringidos por HLA-A2 de control. El análisis de FACS con anticuerpo anti-HLA-A2 puso de manifiesto un patrón de expresión similar de moléculas de HLA-A2 con G9-209M, G9-280V y otras células cargadas con péptido de control (Figura 6B). Como se muestra en la Figura 7A, se observó citotoxicidad por G1scFv-Pe38 sólo en células RMAS-HHD cargadas con el péptido G9-209 con una CI_{50} de 10-20 ng/ml. No se observó actividad citotóxica en células RMAS-HHD que se cargaron con el epítopo G9-280V derivado de gp100 o con otros péptidos restringidos por HLA-A2 de control o células que no se cargaron con péptido. Las células RMAS-HHD cargadas con G9-209M no se destruyeron con una inmunotoxina irrelevante en la que un anticuerpo scFv anti-Lewis Y humano se fusiona con PE38 [B3(Fv)-PE38] (Figura 7A). En las células JY transformadas con EBV que expresan TAP normal, la presentación del péptido suministrado exógenamente se facilita por intercambio peptídico. Usando esta estrategia, se observó una actividad específica similar en la que el G1scFv-PE38 destruye sólo células cargadas con el péptido G9-209M (Figura 7B). Se mostró una prueba adicional de especificidad en experimentos de competición en los que estaba presente complejo de scHLA-A2-péptido soluble específico y de control en exceso en solución para competir por la unión e inhibir la citotoxicidad por G1 scFv-PE38. Un ejemplo de este tipo de ensayo se muestra en la Figura 7C, en la que un exceso de HLA-A2 que contiene G9-209M soluble pero no de complejo de G9-280V/HLA-A2 competía e inhibía la actividad citotóxica de G1 scFv-PE38 hacia células JY cargadas con G9-209M. Estos resultados demuestran adicionalmente la especificidad refinada y única del anticuerpo G1scFv y su capacidad para servir como resto de direccionamiento para suministrar una molécula efectora citotóxica con especificidad restringida por MHC específica de antígeno (péptido) de células T dirigida hacia un epítopo de célula T tumoral humana.
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Discusión de los resultados
En este ejemplo, se demostró la capacidad para seleccionar a partir de un repertorio inmune de fragmentos scFv murinos un anticuerpo de alta afinidad (denominado en este documento G1scFv) dirigido hacia un epítopo de célula T humana derivado de un antígeno canceroso, el antígeno asociado a melanoma gp100.
El G1scFv presenta un patrón de unión muy específico y especial; puede unirse de una forma específica de péptido a complejos de HLA-A2. Por lo tanto, es un anticuerpo recombinante con especificidad similar a receptor de antígeno de célula T. Al contrario que la baja afinidad intrínseca de los TCR, esta molécula presenta las características de unión con alta afinidad de anticuerpos al tiempo que conserva la especificidad de TCR.
Este ejemplo demuestra sorprendentemente el poder de la estrategia de presentación en fagos y su capacidad para seleccionar especificidades especialmente refinadas a partir de un gran repertorio de anticuerpos diferentes.
La capacidad para seleccionar anticuerpos similares a TCR de alta afinidad, a pesar del hecho de que se piensa que dichos agentes de unión específicos de péptido son poco frecuentes y por lo tanto difíciles de aislar, puede ser el resultado de las siguientes consideraciones.
Uno es el modo de inmunización y selección que incluía inmunización de animal transgénico combinada con el poder de diversas estrategias de selección empleadas por presentación en fagos. Se piensa que el uso de ratones transgénicos HLA tales como ratones transgénicos HLA-A2 es una ventaja porque habitualmente son tolerantes a complejos de HLA a menos que se presente un nuevo péptido extraño en el complejo. Esta capacidad para aislar moléculas de anticuerpo similares a TCR puede representar una situación en la que los linfocitos que eran tolerantes a HLA-A2 se exponen ahora a nuevos epítopos aportados por, en el ejemplo proporcionado en este documento, el péptido derivado de gp100 de melanoma presentado en HLA-A2. El procedimiento de selección que combinaba un exceso de complejo inespecífico en solución contribuía significativamente al proceso de selección y permitía aislar un clon de anticuerpo poco frecuente (uno de 10^{8}).
Otra cuestión importante se refiere al estado del antígeno usado en el proceso de selección. La conformación del antígeno tiene que ser tan "natural" como sea posible, especialmente cuando se produce de una forma recombinante. Como se describe en las referencias 23 y 24 y en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 09/534.966 y PCT/IL01/00260 (publicada como documento WO 01/72768) se descubrió que el replegamiento in vitro a partir de cuerpos de inclusión producidos en E. coli de una molécula de MHC de cadena sencilla que está formando un complejo con diversos péptidos produce grandes cantidades de proteína correctamente plegada y funcional. El hecho de que el anticuerpo ejemplar G1scFv se aisló a partir de una biblioteca relativamente pequeña de aproximadamente 10^{8} clones, aunque es altamente específico con una afinidad en el intervalo nanomolar, indica firmemente que el ratón transgénico HLA-A2 que se usó para la inmunización desarrollaba de hecho anticuerpos de gran afinidad contra los complejos de HLA-A2/G9-209. La observación de que sólo se aisló un solo anticuerpo anti-HLA-A2/G9-209 puede reflejar que sólo existe una especificidad de este tipo o que no se generaron otras especificidades durante la respuesta inmune debido a que dicha respuesta no podía generarse fácilmente y tolerarse por los ratones transgénicos HLA-A2. Es muy sorprendente el hecho de que se describieran resultados similares en el pasado para un sistema de MHC-péptido murino en el que, usando presentación en fagos, se aisló un anticuerpo similar a TCR recombinante dirigido hacia una molécula H-2K^{k} murina clase I que estaba formando un complejo con el péptido de hemaglutinina de influenza Ha_{255-262} (17). De forma similar a los resultados que se presentan en este documento, de los 50 clones ensayados, siete reaccionaban específicamente con los complejos de H-2K^{k}/Ha_{255-262} solamente y no con otros complejos de H-2K^{k}/péptido. Curiosamente, se determinaron las secuencias de ADN de estos clones específicos y se descubrió que eran idénticas (17). Sin embargo, estos anticuerpos anti-complejos de H-2K^{k}/Ha_{255-262} no pueden usarse para controlar la presentación de antígenos y/o destruir células presentadoras de antígeno de origen humano.
A pesar del hecho de que los anticuerpos que tienen una especificidad similar a receptor de antígeno de célula T son poco frecuentes, la estrategia de presentación en fagos puede aplicarse para aislar anticuerpos recombinantes con especificidad similar a TCR contra una diversidad de complejos de MHC-péptido relacionados con diversas afecciones patológicas tales como cáncer, infecciones víricas y enfermedades autoinmunes.
Los anticuerpos recombinantes con especificidad similar a TCR representan una nueva herramienta valiosa para investigaciones futuras en dos áreas principales de la inmunología tumoral. En primer lugar, estos anticuerpos pueden usarse ahora para detectar y visualizar directamente la presencia de epítopos de células T específicos o complejos de MHC-péptido por métodos convencionales de citometría de flujo e inmunohistoquímica. Deberían ser muy útiles para el estudio y análisis de la presentación de antígenos en cáncer por determinación de la expresión de complejos de MHC-péptido relacionados con tumores específicos en la superficie de células tumorales, metástasis, células presentadoras de antígeno y células linfoides. Además, dichos anticuerpos pueden usarse para analizar estrategias basadas en inmunoterapia determinando las alteraciones en la expresión de complejo MHC-péptido en células presentadoras de antígeno antes, durante y después de los protocolos de vacunación con péptidos o con APC cargadas con extractos de células tumorales o vacunaciones híbridas de células dendríticas-tumorales (7-11). Por lo tanto, por primera vez pueden abordarse directamente cuestiones relacionadas con cómo y dónde se producen ciertos acontecimientos durante la presentación de antígenos, y la expresión de epítopos de células T en la célula presentadora de antígeno puede visualizarse y cuantificarse.
En segundo lugar, los anticuerpos con dicha especificidad exquisitamente refinada dirigidos contra un antígeno tumoral humano muy específico y único representan nuevas oportunidades para el uso como restos de direccionamiento para diversas estrategias inmunoterapéuticas basadas en anticuerpos. Esto incluye el uso de dichos anticuerpos para construir inmunotoxinas recombinantes (12), fusión con moléculas de citocina (37) o para terapia con anticuerpos biespecíficos (38). La cuestión abierta con respecto a estas aplicaciones se refiere a la baja densidad del epítopo específico en la superficie de la célula diana. Se ha demostrado previamente, usando el complejo de H-2K^{k}/péptido de hemaglutinina de influenza y un sistema presentador de antígeno similar para conseguir una destrucción eficaz con una molécula de inmunotoxina similar a TCR, que es necesaria una densidad de varios miles de complejos de MHC-péptido particulares para la eliminación selectiva de APC (39). Los resultados descritos en este documento confirman estos descubrimientos, consiguiendo un potencial citotóxico similar de una inmunotoxina similar a célula T. Para mejorar las capacidades de direccionamiento de estas moléculas de anticuerpos similares a TCR, pueden emplearse dos estrategias de modificación genética de anticuerpos: (i) aumentar la afinidad del anticuerpo parental por estrategias de maduración de la afinidad sin alterar su especificidad refinada similar a TCR (40); y (ii) aumentar la avidez de estas moléculas monovalentes recombinantes haciéndolas bivalentes (38). La combinación de estas estrategias dará como resultado en la segunda generación moléculas mejoradas que serán herramientas valiosas para estrategias inmunoterapéuticas, así como servirán como herramientas de investigación innovadoras para estudiar la interacción de células tumorales y el sistema inmune humano.
Se aprecia que ciertas características de la invención, que por claridad se describen en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. A la inversa, diversas características de la invención que por brevedad se describen en el contexto de una sola realización también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada.
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<110> Reiter, Yoram
\hskip1cm
Denkberg, Galit 
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<120> ANTICUERPO QUE TIENE UNA ESPECIFICIDAD TIPO RECEPTOR DE CÉLULAS T, UNA AFINIDAD AÚN MAYOR Y EL USO DEL MISMO EN LA DETECCIÓN Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER, INFECCIONES VÍRICAS Y ENFERMEDADES AUTOINMUNES
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<130> 25595
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<160> 11
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido restringido por HLA-A2, gp100 (154)
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<400> 1
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7 
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<210> 2
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido restringido por HLA-A2, gp100 (209)
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<400> 2
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8 
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<210> 3
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido restringido por HLA-A2, gp100 (280)
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<400> 3
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9 
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<210> 4
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido restringido por HLA-A2, MUC1
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<400> 4
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10 
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<210> 5
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido restringido por HLA-A2, HTLV-1 (TAX)
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<400> 5
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11 
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<210> 6
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido restringido por HLA-A2, hTEtemperatura ambiente (540)
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<400> 6
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12 
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido restringido por HLA-A2, hTEtemperatura ambiente (865)
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<400> 7
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13 
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<210> 8
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<211> 711
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Secuencia de ADN de anticuerpo recombinante Fv de cadena sencilla G1
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<400> 8
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14 
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<210> 9
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<211> 237
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia proteica de anticuerpo recombinante Fv de cadena sencilla G1
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<400> 9
15 
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<210> 10
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<213> Secuencia artificial
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<223> Péptido restringido por HLA derivado de influenza
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<400> 10
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16 
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<223> Péptido restringido por HLA derivado de hepatitis B
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<400> 11
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17

Claims (38)

1. Un anticuerpo aislado que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido, donde dicho anticuerpo no se une a dicho MHC clase I humano en ausencia de dicho antígeno HLA restringido, donde dicho anticuerpo no se une a dicho antígeno HLA restringido en ausencia de dicho MHC clase I humano y donde dicho anticuerpo se une a células infectadas por virus que presentan dicho MHC clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno HLA restringido, donde dicho antígeno HLA restringido es un antígeno viral que caracteriza al virus causante de la infección vírica o se une a células tumorales que presentan dicho MHC clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno HLA restringido, donde dicho antígeno HLA restringido es un antígeno tumoral que caracteriza al cáncer.
2. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la reivindicación 1 y un resto terapéutico que se conjuga con dicho anticuerpo.
3. Una composición de diagnóstico que comprende una molécula que comprende al anticuerpo aislado de la reivindicación 1 y un resto identificable que se conjuga con dicho anticuerpo.
4. Una molécula aislada que comprende un primer polinucleótido que codifica el anticuerpo aislado de la reivindicación 1.
5. Un método de producción de un anticuerpo que puede unirse específicamente con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar a un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con un antígeno HLA restringido, comprendiendo el método:
inmunizar un mamífero no humano modificado genéticamente que tiene células que expresan dicho complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano con un complejo de MHC clase I de cadena sencilla y dicho antígeno HLA restringido, incluyendo dicho MHC clase I de cadena sencilla una secuencia de aminoácidos de \beta-2 microglobulina humana funcional unida covalentemente directa o indirectamente a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de MHC clase I humano funcional que se produce por bacterias en cuerpos de inclusión de E. coli;
aislar moléculas de ARNm a partir de células productoras de anticuerpos de dicho mamífero no humano;
producir una biblioteca de fagos que presenten moléculas proteicas codificadas por dichas moléculas de ARNm; y
aislar al menos un fago de dicha biblioteca por selección contra dicho complejo de dicho MHC clase I de cadena sencilla y dicho antígeno HLA restringido, presentando al menos dicho fago dicho anticuerpo que puede unirse específicamente con dicha afinidad inferior a 20 nanomolar a dicho complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I humano que está formando un complejo con dicho antígeno HLA restringido.
6. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado de la reivindicación 1 conjugado con un resto terapéutico para la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer.
7. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo aislado de la reivindicación 1 que conjugado con un resto terapéutico para la fabricación de un medicamento para tratar una infección vírica.
8. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende un fragmento de anticuerpo.
9. El anticuerpo aislado de la reivindicación 8, en el que dicho fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Fab, Fab', Fv y Fv de cadena sencilla (scFv).
10. Un método de generación de una inmunotoxina, comprendiendo el método ligar el primer polinucleótido de la reivindicación 4 en fase de lectura con un segundo polinucleótido que codifica un resto de toxina, para obtener un polinucleótido ligado y expresar dicho polinucleótido ligado en un sistema de expresión para obtener dicha inmunotoxina.
11. Un método de generación de un inmunomarcador, comprendiendo el método ligar el primer polinucleótido de la reivindicación 4 en fase de lectura con un segundo polinucleótido que codifica un resto identificable, para obtener un polinucleótido ligado y expresar dicho polinucleótido ligado en un sistema de expresión para obtener dicho inmunomarcador.
12. Un método de detección de la presencia y/o el nivel de células presentadoras de antígeno que presentan un antígeno HLA restringido en una muestra de células, comprendiendo el método:
hacer interaccionar las células de dicha muestra con el anticuerpo aislado de la reivindicación 1; y
controlar dicha interacción, detectando de este modo la presencia y/o el nivel de dichas células presentadoras de antígeno que presentan dicho antígeno HLA restringido.
13. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7 o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A2.
14. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que comprende además un resto identificable que se conjuga con dicho anticuerpo.
15. La molécula aislada de la reivindicación 4, que comprende además un segundo polinucleótido que se une a dicho primer polinucleótido y que codifica un resto identificable.
16. El anticuerpo aislado de la reivindicación 14, la molécula aislada de la reivindicación 15 o la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, donde dicho resto identificable se selecciona del grupo que consiste en un miembro de un par de unión y un marcador.
17. El anticuerpo aislado, la molécula aislada o la composición de diagnóstico de la reivindicación 16, donde dicho miembro de dicho par de unión es un antígeno.
18. El anticuerpo aislado, la molécula aislada o la composición de diagnóstico de la reivindicación 16, donde dicho marcador se selecciona del grupo que consiste en una proteína fluorescente y una enzima.
19. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que comprende además un resto terapéutico que se conjuga con dicho anticuerpo.
20. El anticuerpo aislado de la reivindicación 19, la composición farmacéutica de la reivindicación 2 o el uso de la reivindicación 6 ó 7, donde dicho resto terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un resto citotóxico, un resto tóxico, un resto de citocina y un resto de anticuerpo biespecífico.
21. El método de la reivindicación 5, en el que dicho antígeno HLA restringido es un antígeno HLA restringido tumoral.
22. El método de la reivindicación 5, en el que dicho antígeno HLA restringido es un antígeno HLA restringido viral.
23. El método de la reivindicación 5, en el que dicho antígeno HLA restringido es un antígeno HLA restringido autoinmune.
24. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
25. La molécula aislada de la reivindicación 4, que comprende además un segundo polinucleótido que se une a dicho primer polinucleótido y que codifica un resto citotóxico.
26. El método de la reivindicación 5, en el que dicho mamífero no humano está desprovisto de moléculas de MHC clase I propias.
27. Un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido como se expone en la SEC ID Nº: 8.
28. Una proteína aislada que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en la SEC ID Nº: 9.
29. Un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido como se expone en la SEC ID Nº: 9.
30. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A3.
31. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A24.
32. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A28.
\newpage
33. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A31.
34. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A33.
35. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-A34.
36. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-B7.
37. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-B45.
38. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, la composición de diagnóstico de la reivindicación 3, la molécula aislada de la reivindicación 4, el uso de la reivindicación 6 ó 7, o el método de la reivindicación 5 ó 10 a 12, donde dicha molécula de MHC clase I es HLA-Cw8.
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