KR20210098450A - 세포의 선택 및 자극을 위한 방법 및 이를 위한 장치 - Google Patents

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KR20210098450A
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로살 젤메로스
크리스챤 스템베르게르
매츄즈 파웰 폴토락
토마스 슈미트
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주노 테라퓨틱스 게엠베하
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Abstract

컬럼 크로마토그래피를 사용하여 세포 샘플에서 복수의 세포를 선택 및 자극하고, 컬럼으로 부터 세포의 분리를 용이하게하기 위하여 추가 단계 또는 시약을 사용하지 않고 세포를 수집하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 방법은 기존 방법과 비교하여 유전자 조작 및 궁극적으로 세포 요법에 유용한 선택 및 자극된 세포의 집단을 생성하는데 필요한 시간을 감소시킨다. 또한, 이의 제조 물품 및 장치가 제공된다.

Description

세포의 선택 및 자극을 위한 방법 및 이를 위한 장치
본 개시 내용은 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 세포의 샘플에서 복수의 세포를 선택 및 자극하고, 컬럼으로부터 세포의 분리를 용이하게하기 위해 추가 단계 또는 시약을 사용하지 않고 세포를 수집 및/또는 용리하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 방법은 기존 방법과 비교하여 유전자 조작 및 궁극적으로 세포 요법에 유용한 선택 및 자극된 세포의 집단을 생성하는데 필요한 시간을 감소시킨다. 또한, 이의 제조 물품 및 장치가 제공된다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 10월 31일에 "METHODS FOR SELECTION AND STIMULATION OF CELLS AND KITS AND APPARATUS FOR SAME”(세포의 선택과 자극을 위한 방법 및 이를 위한 키트 및 장치)의 제목으로 출원된 미국 가출원 제62/753,911호, 2019년 5월 2일에 "METHODS FOR SELECTION AND STIMULATION OF CELLS AND KITS AND APPARATUS FOR SAME”(세포의 선택과 자극을 위한 방법 및 이를 위한 키트 및 장치)의 제목으로 출원된 미국 가출원 번호 제62/842,511호, 2019년 6월 13일에 "METHODS FOR SELECTION AND STIMULATION OF CELLS AND KITS AND APPARATUS FOR SAME”(세포의 선택과 자극을 위한 방법 및 이를 위한 키트 및 장치)의 제목으로 출원된 미국 가출원 번호 제62/861,314호에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 모든 목적을 위해 전체가 참조로 통합된다.
서열 목록의 참조 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다.　 서열 목록은 2019년 10월 29일에 생성된 7350423019240SeqList.txt라는 제목의 파일로 제공되며 파일 크기는 94,112 킬로바이트이다.　 전자 형식의 서열 목록 내 정보는 그 전체가 참조로 포함된다.
질병 및 병태를 치료하기 위한 다양한 세포 치료 방법이 이용 가능하다. 세포 치료 방법 중에는 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체로 유전자 조작된 T 세포(예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T cells)와 같은 면역 세포를 포함한 방법이 있다. 적절한 세포 집단을 생성하는 방법, 예를 들어, 이러한 세포 요법에 사용하기 위해 선별된(농축 된) 및 자극된 세포 집단을 생성하는 방법은 종종 별도의 선택 및 자극 단계를 필요로 하며, 이는 제조 공정을 연장시킬 수 있다. 또한, 선별 기술은 선별-관련된 입자, 예를 들어, Fab 단편 및 경쟁 g시약(competition reagents) 및/또는 고정상으로부터 세포의 분리를 촉진하기 위하여 사용되는 자유 결합 제제(free binding agents)로 선별된 세포를 오염시키는 단계를 포함 할 수 있으며. 따라서 생산된 조성물을 정제하기 위해 추가적인 세척 및/또는 배지 교환 단계가 필요하다. 추가적 프로세싱 단계는 완료하는데 상당한 시간이 필요할 뿐만 아니라 다운스트림 세포 프로세싱 또는 심지어 세포 생물학에 잠재적으로 영향을 미치는 세포 스트레스를 초래할 수 있다.
따라서 예를 들어 세포 취급 및 프로세싱 시간을 최소화하는 세포 요법에서 사용하기에 적합한 세포 집단을 생성하는 개선된 방법이 필요하다. 이러한 요구를 충족시키는 방법, 제조 물품 및 장치가 제공된다.
T 세포의 온-컬럼 자극(on-column stimulation) 방법이 제공되며, 상기 방법은 복수의 고정된 T 세포를 포함하는 정지 상에 T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 올리고머 자극 시약을 첨가하고, 이로써 하나 이상의 T 세포와 함께 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계-여기서: 상기 정지 상은 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브세트의 표면 상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 선택 제제를 포함하고; 상기 올리고머 자극 시약은 (i) 항-CD3 항체인 제1 자극제, 및 (ii) 항-CD28 항체인 제2 자극제를 포함하는 하나 이상의 자극제를 포함함-; 및 상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여 자극된 T 세포를 함유하는 조성물을 생성하는 단계;를 포함한다. 제공된 방법에서, 상기 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브 세트의 표면상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 상기 선택 제제는 상기 정지 상에 상기 복수의 T 세포를 고정시킨다.
T 세포의 온-컬럼 자극 방법이 제공되며, 상기 방법은 T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 올리고머 자극 시약을 정지 상에 고정된 복수의 T 세포와 함께 인큐베이션 하여, 이로써 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계-여기서: 상기 정지 상은 상기 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브 세트의 표면 상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 선택 제제를 포함하고; 상기 올리고머 자극 시약은 (i) 항-CD3 항체인 제1 자극제, 및 (ii) 항-CD28 항체인 제2 자극제를 포함하는 하나 이상의 자극제를 포함하고; 및 상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 함유하는 조성물을 생성하는 단계를 포함한다. 제공된 방법에서, 상기 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브 세트의 표면상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 상기 선택 제제는 상기 정지 상에 상기 복수의 T 세포를 고정시킨다.
T 세포의 온-컬럼 자극 방법이 제공되며, 상기 방법은 정지 상에 고정된 복수의 T 세포와 함께 T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 올리고머 자극 시약을 조합하여, 이로써 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계-여기서: 상기 정지 상은 상기 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브 세트의 표면 상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 선택 제제를 포함하고; 상기 올리고머 자극 시약은 (i) 항-CD3 항체인 제1 자극제, 및 (ii) 항-CD28 항체인 제2 자극제를 포함하는 하나 이상의 자극제를 포함함-; 및 상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 함유하는 조성물을 생성하는 단계를 포함한다. 제공된 방법에서, 상기 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브 세트의 표면상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 상기 선택 제제는 상기 정지 상에 상기 복수의 T 세포를 고정시킨다.
T 세포의 온-컬럼 자극 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상에 자극신호를 전달하기 위한 하나 이상의 자극제와 함께 정지 상에 고정된 복수의 T 세포를 인큐베이션 하는 단계-상기 정지 상은 상기 하나 이상의 T 세포의 표면상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 선택 제제를 포함하며, 상기 하나 이상의 T 세포에 의해 발현되는 상기 선택 마커에 대한 상기 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 상기 하나 이상의 T 세포의 고정화에 영향을 미침-; 및 상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제(competiton agent) 또는 자유 결합 제제의 추가 없이 중력 흐름에 의해 정지 상으로부터 상기 하나 이상의 T 세포를 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 함유하는 조성물을 생성하는 단계를 포함한다. T 세포의 온-컬럼 자극 방법이 제공되며, 상기 방법은 복수의 T 세포 중 하나 이상에 자극신호를 전달하기 위한 하나 이상의 자극제와 함께 정지 상에 고정된 복수의 T세포를 인큐베이션 하는 단계-상기 정지 상은 상기 하나 이상의 T 세포의 표면상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 선택 제제를 포함하며, 상기 하나 이상의 T 세포에 의해 발현되는 상기 선택 마커에 대한 상기 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 상기 하나 이상의 T 세포를 고정시킴-; 및 상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 상기 하나 이상의 T 세포를 수집하여 자극된 T 세포를 함유하는 조성물을 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상은 상기 하나 이상의 T 세포에서 자극 신호를 전달할 수 있는 상기 하나 이상의 자극제 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 자극제는 제1자극제이고, 상기 정지 상은 상기 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형(modifying) 시킬 수 있는 하나 이상의 제2 자극제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극제는 제1자극제이고, 여기서 상기 인큐베이션 전에 상기 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형 시킬 수 있는 하나 이상의 제2 자극제를 함유한 자극 시약을 정지 상에 첨가한다. 일부 구현예에서, 상기 자극제는 제1자극제이고, 여기서 상기 인큐베이션 전에 상기 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형 시킬 수 있는 하나 이상의 제2 자극제를 함유한 자극 시약을 정지 상에 첨가한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 자극제는 제1 자극제 및 제2 자극제이고, 여기서 상기 인큐베이션 전에 상기 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형 시킬 수 있는 상기 제2 자극제를 함유한 자극 시약을 상기 정지 상에 첨가한다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션 전에 상기 정지 상에 자극 시약을 첨가하고, 상기 자극 시약은 상기 하나 이상의 자극제 중 적어도 하나를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 자극제는 제1자극제이고, 상기 하나 이상의 자극제는 상기 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형(modifying) 시킬 수 있는 하나 이상의 제2 자극제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 자극제 중 적어도 하나인, 선택적으로 제1 자극제는 자극 신호를 전달할 수 있고, 여기서 상기 자극 신호는 T 세포에서 TCR/CD3 컴플렉스, T 세포에서 CD3-함유 컴플렉스, 및/또는 T 세포에서 ITAM-함유 분자를 통한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 제1 자극제 중 적어도 하나는, 자극 신호를 전달할 수 있고, 여기서 상기 자극 신호는 T 세포에서 TCR/CD3 컴플렉스, T 세포에서 CD3-함유 컴플렉스, 및/또는 T 세포에서 ITAM-함유 분자를 통한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 제2 자극제는 상기 하나 이상의 T 세포 상에 공동자극분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제1 자극제는 T 세포에서 TCR/CD3 컴플렉스, T 세포에서 CD3-함유 컴플렉스, 및/또는 T 세포에서 ITAM-함유 분자를 통해서 자극 신호를 전달하고, 상기 제2 자극제는 상기 T 세포 상의 공동자극분자와 결합한다.
T 세포의 온-컬럼 자극 방법이 제공되며, 상기 방법은 정지 상에 복수의 T 세포를 포함하는 샘플을 첨가하여, 이로써 상기 정지 상에 상기 복수의 T 세포 중 상기 하나 이상을 고정시키는 단계-상기 정지상은 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 표면 상에 선택 마커와 결합하는 선택 제제를 포함함-; 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상에 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제를 포함하는 자극 시약을 상기 정지 상에 첨가하여, 이로써 상기 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계; 및 상기 인큐베이션 개시 24시간 내에, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가 없이 중력 흐름에 의하여 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 함유한 조성물을 생성시키는 단계를 포함한다.
T 세포의 온-컬럼 자극 방법이 제공되며, 상기 방법은 정지 상에 복수의 T 세포를 포함하는 샘플을 첨가하여, 이로써 상기 정지 상에 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 고정시키는 단계-상기 정지상은 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 표면 상에 선택 마커와 결합하는 선택 제제를 포함함-; 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상에 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제를 함유하는 자극 시약을 상기 정지 상에 첨가하여, 이로써 상기 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계; 및 상기 인큐베이션 개시 24시간 내에, 중력 흐름에 의하여 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 자극된 T 세포를 함유한 조성물을 생성시키는 단계를 포함한다.
T 세포의 온-컬럼 자극 방법이 제공되며, 상기 방법은 정지 상에 복수의 T 세포를 포함하는 샘플을 인큐베이션 하여, 이로써 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상에서 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 선택 제제를 함유하는 자극시약으로 상기 정지 상에 상기 하나 이상의 T 세포를 고정시키며, 이로써 상기 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계-상기 정지 상은 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 표면 상에 상기 선택 마커와 결합하는 상기 선택 제제를 포함함-; 및 상기 인큐베이션 개시 24시간 내에, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가 없이 중력 흐름에 의하여 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 함유한 조성물을 생성시키는 단계를 포함한다.
T 세포의 온-컬럼 자극 방법이 제공되며, 상기 방법은 (1) (a) 복수의 T 세포를 포함하는 샘플 및 (b) 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 표면 상에 발현된 선택 마커에 특이적으로 결합하는 선택 제제를 포함하는 정지 상을 조합하는 단계-여기서 선택 마커에 대한 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 상기 복수의 T 세포의 고정에 영향을 미침-; (2) T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제를 함유한 자극 시약을 상기 정지 상에 첨가하여, 이로써 상기 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계; 및 (3) 상기 인큐베이션 개시 24시간 내에, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가 없이 중력 흐름에 의하여 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 함유한 조성물을 생성시키는 단계를 포함한다.
T 세포의 온-컬럼 자극 방법이 제공되며, 상기 방법은 (1) (a) 복수의 T 세포를 포함하는 샘플 및 (b) 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 표면 상에 발현된 선택 마커와 특이적으로 결합하는 선택 제제를 함유한 정지 상을 조합하는 단계-여기서 선택 마커에 대한 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 고정시킴-; (2) 상기 정지 상에 T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제를 함유한 자극 시약을 첨가하여, 이로써 상기 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계; 및 (3) 상기 인큐베이션 개시 24시간 내에, 중력 흐름에 의하여 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 함유한 조성물을 생성시키는 단계를 포함한다.
T 세포의 온-컬럼 자극 방법이 제공되며, 상기 방법은 복수의 고정된 T 세포를 함유하는 정지 상에 올리고머 자극 시약을 첨가하여, 상기 복수의 고정된 T 세포 중 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계를 포함하며, 여기서: 상기 정지 상은 하나 이상의 T 세포의 표면 상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 선택 제제를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 T 세포에 의해 발현된 상기 선택 마커에 대한 상기 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 상기 하나 이상의 T 세포의 고정에 영향을 미치며; 상기 올리고머 자극 시약은 (i) 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자, 및 (ii) 하나 이상의 T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제를 포함하며, 여기서 올리고머 자극 시약의 크기는 i) 50 nm 초과의 반경, ii) 적어도 5 x 106g/mol의 분자량; 및/또는 (iii) 올리고머 자극 시약 당 적어도 100 개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 함유하는 조성물을 생성하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션 개시 24시간 내에, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가 없이 중력 흐름에 의하여 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 함유한 조성물을 생성시키는 단계를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시 후 약 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시 후 약 2 내지 24, 3 내지 24, 4 내지 24, 5, 내지 24, 6 내지 24, 7 내지 24, 8 내지 24, 9 내지 24, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 13 내지 24, 14 내지 24, 15 내지 24, 16 내지 24, 17 내지 24, 18 내지 24, 19 내지 24, 20 내지 24, 21 내지 24, 22 내지 24, 23 내지 24, 2 내지23, 2 내지 22, 2 내지 21, 2 내지 20, 2 내지 19, 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 2 내지 15, 2 내지 14, 2 내지 13, 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 2 내지 3 시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시 후 약 12, 10, 8, 6, 4, 또는 2 시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시 후 6 시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시 후 5 시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시 후 (약) 4.5 시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시 후 4 시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시 후 3 시간 이내에 일어난다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 10분 이내 또는 약 10분 이내, 20분 이내 또는 약 20분 이내, 30분 이내 또는 약 30분 이내, 45분 이내 또는 약 45분 이내, 60분 이내 또는 약 60분 이내, 90분 이내 또는 약 90분 이내, 120분 이내 또는 약 120분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 20 내지 100 분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 30 내지 90 분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 30 내지 80 분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 30 내지 70 분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 30 내지 60 분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 30 내지 50 분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 30 내지 40 분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 30분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 40분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 50분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 60분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 70분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 80분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 함유하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 정지 상과 조합시킨 후 (약) 90분 이내에 수행된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 자극제 중 적어도 하나는 자극 신호를 전달할 수 있고, 여기서 상기 자극 신호는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체, T 세포에서 CD3-함유 복합체, 및/또는 T 세포에서 ITAM-함유 분자를 통한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 자극제는 제1자극제이고, 상기 자극 시약은 상기 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형(modifying) 시킬 수 있는 하나 이상의 제2 자극제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제2 자극제는 상기 하나 이상의 T 세포 상에 공동자극분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 공동자극분자는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 또는 HVEM 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 제2 자극제는 CD28과 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제1 자극제는 CD3와 특이적으로 결합하고, 상기 제2 자극제는 CD28과 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 상기 자극제는 항체 단편, 1가 항체 단편, 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자, Ig 도메인을 함유하는 분자, 사이토카인, 케모카인, 압타머, MHC 분자, MHC-펩타이드 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 제제; 수용체 리간드; 및 이의 결합 단편; 이거나 이를 함유하고 및/또는 자극제는 항체 단편을 함유하고; 자극제는 Fab 단편이거나 이를 함유하고; 자극제는 (Fab)2'-단편 및 2가 단일 사슬 Fv(scFv) 단편으로 이루어진 2가 항체 단편의 군으로부터 선택되고; 자극제는 Fab 단편, Fv 단편 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된 1가 항체 단편이고; 및/또는 자극제는 압타머, 리포칼린(lipocalin) 계열의 폴리펩타이드를 기반으로 하는 뮤테인, 글루바디(glubodies), 안키린(ankyrin) 스캐 폴드를 기반으로 하는 단백질, 결정성 스캐폴드를 기반으로 하는 단백질, 아드넥틴(adnectins) 및 아비머(avimers)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 결합 분자이다.
일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 자극제는, 독립적으로, 항체 단편, 1가 항체 단편, 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자, Ig 도메인을 함유하는 분자, 사이토카인, 케모카인, 압타머, MHC 분자, MHC-펩타이드 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 제제; 수용체 리간드; 및 이의 결합 단편; 이거나 이를 함유하고 및/또는 제1 및 제2 자극제는, 각각 독립적으로, 항체 단편을 함유하고; 제1 및 제2 자극제는, 각각 독립적으로, Fab 단편이거나 이를 함유하고; 제1 및 제2 자극제는, 각각 독립적으로, (Fab)2'-단편 및 2가 단일 사슬 Fv(scFv) 단편으로 이루어진 2가 항체 단편의 군으로부터 선택되고; 제1 및 제2 자극제는, 각각 독립적으로, Fab 단편, Fv 단편 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된 1가 항체 단편이고; 및/또는 제1 및 제2 자극제는, 각각 독립적으로, 압타머, 리포칼린(lipocalin) 계열의 폴리펩타이드를 기반으로 하는 뮤테인, 글루바디(glubodies), 안키린(ankyrin) 스캐 폴드를 기반으로 하는 단백질, 결정성 스캐폴드를 기반으로 하는 단백질, 아드넥틴(adnectins) 및 아비머(avimers)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 결합 분자이다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 자극제는 1가 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 자극제는, 각각 독립적으로, 1가 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 자극제는 CD3에 결합하는 1가 항체 단편을 포함하고, 상기 제2자극제는 CD28에 결합하는 1가 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 1가 항체 단편은 Fab 단편, Fv 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 제1 자극 시약은 항-CD3 Fab이고, 상기 제2 자극 시약은 항-CD28 Fab이다.
T 세포의 온-컬럼 자극 방법이 제공되며, 상기 방법은 복수의 고정된 T 세포를 함유하는 정지 상에 T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 올리고머 자극 시약을 첨가하여, 이로써 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계-여기서: 상기 정지 상은 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브세트의 표면 상의 선택 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 선택 제제를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브세트에 의해 발현된 선택 마커에 대한 상기 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 적어도 복수의 T 세포의 고정에 영향을 미치며, 여기서 상기 선택 제제는 CD3, CD4, 및 CD8로 이루어진 군에서 선택된 선택 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이며; 상기 올리고머 자극 시약은 (i) 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자, (ii) 하나 이상의 T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 제1 자극제, 여기서 제1 자극제는 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이고, 및 (iii) 상기 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형시킬 수 있는 제2 자극제를 포함하며, 여기서 상기 제2 자극제는 CD28에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이며, 및 상기 올리고머 자극 시약의 크기는 i) 50 nm 초과의 반경, ii) 적어도 5 x 106 g/mol의 분자량; 및/또는 (iii) 올리고머 자극 시약 당 적어도 100 개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함함-; 및 상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제(competiton agent) 또는 자유 결합 제제의 추가 없이 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 함유하는 조성물을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, T 세포는 전체 혈액 샘플, 연막(buffy coat) 샘플, 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 샘플, 비분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분 채집술 생성물 또는 백혈구 성분 채집술 생성물이거나 이를 포함하는 샘플 유래이다. 일부 구현예에서, 샘플은 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술 생성물이다. 일부 구현예에서, 상기 성분 채집술 또는 백혈구 성분 채집술 생성물은 이전에 동결된 적이 있다.
일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 자극제와의 인큐베이션은 상기 정지 상으로부터 복수의 고정된 T 세포 중 하나 이상을 방출한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 자극제와의 인큐베이션은 상기 정지 상으로부터 복수의 고정된 T 세포 중 하나 이상을 방출한다.
일부 구현예에서, 상기 자극제는 비오틴, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체, Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드, 칼모듈린에 가역적으로 결합하는 칼모듈린 결합 펩타이드, 항체 결합 FLAG 펩타이드에 가역적으로 결합하는 FLAG 펩타이드, 및 항체 결합 올리고히스티딘 태그(tag)에 가역적으로 결합하는 올리고히스티딘 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 자극제는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 자극제는 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16)를 갖는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제1 자극제 및 상기 제2 자극제는, 각각 독립적으로, 비오틴, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체, Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드, 칼모듈린에 가역적으로 결합하는 칼모듈린 결합 펩타이드, 항체 결합 FLAG 펩타이드에 가역적으로 결합하는 FLAG 펩타이드, 및 항체 결합 올리고히스티딘 태그에 가역적으로 결합하는 올리고히스티딘 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 자극제 각각은 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 자극제 각각은 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16)를 갖는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 항체 단편, 1가 항체 단편, 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자, Ig 도메인을 함유하는 분자, 사이토카인, 케모카인, 압타머, MHC 분자, MHC-펩타이드 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 제제; 수용체 리간드; 및 이의 결합 단편; 이거나 이를 함유하고 및/또는 선택 제제는 항체 단편을 함유하고; 자극제는 Fab 단편이거나 이를 함유하고; 자극제는 (Fab)2'-단편 및 2가 단일 사슬 Fv(scFv) 단편으로 이루어진 2가 항체 단편의 군으로부터 선택되고; 선택 제제는 Fab 단편, Fv 단편 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된 1가 항체 단편이고; 및/또는 선택 제제는 압타머, 리포칼린(lipocalin) 계열의 폴리펩타이드를 기반으로 하는 뮤테인, 글루바디(glubodies), 안키린(ankyrin) 스캐 폴드를 기반으로 하는 단백질, 결정성 스캐폴드를 기반으로 하는 단백질, 아드넥틴(adnectins) 및 아비머(avimers)로 이루어진 군으로부터 선택된 항체-유사 결합 특성을 갖는 단백질성 결합 분자이다.
일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 비오틴, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체, Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드, 칼모듈린에 가역적으로 결합하는 칼모듈린 결합 펩타이드, 항체 결합 FLAG 펩타이드에 가역적으로 결합하는 FLAG 펩타이드, 및 항체 결합 올리고히스티딘 태그에 가역적으로 결합하는 올리고히스티딘 태그를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 비오틴, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체,Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16)를 갖는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 선택 마커는 T 세포 공수용체(coreceptor)이고; 상기 선택 마커는 T 세포 항원 수용체 복합체의 구성원이거나 이를 함유하며; 상기 선택 마커는 CD3 사슬이거나 이를 함유하고; 상기 선택 마커는 CD3 제타 사슬이거나 이를 함유하며; 상기 선택 마커는 CD8이거나 이를 함유하며; 상기 선택 마커는 CD4이거나 이를 함유하고; 상기 선택 마커는 CD45RA이거나 이를 함유하고; 상기 선택 마커는 CD27이거나 이를 함유하며; 상기 선택 마커는 CD28이거나 이를 함유하고; 및/또는 상기 선택 마커는 CCR7이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 선택 마커는 CD3, CD4 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 선택 마커는 CD3이다.
일부 구현예에서, 상기 선택 제제 및 상기 선택 마커 간 특이적 결합은 상기 T 세포에 대한 신호를 유도하지 않거나, 또는 자극 또는 활성화 또는 증식 신호를 유도하지 않는다. 일부 구현예에 있어서, 상기 선택 제제는 CD3, CD8 또는 CD4에 결합하는 1가 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 항-CD3 Fab, 항-CD8 Fab 또는 항-CD4 Fab이다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 항-CD3 Fab이다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 Fab은 OKT3 항체 Fab 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항-CD3 Fab은 서열 번호: 31에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄 및 서열 번호: 32에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 가용성이다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 고체 지지체, 정지 상, 비드, 마이크로입자, 자성입자, 및/또는 매트릭스가 아니며, 이에 결합되거나 이와 연합되지 않는다; 및/또는 상기 시약은 가요성이고, 금속 또는 자성코어를 함유하지 않으며, 전체적으로 또는 주로 유기 다량체를 포함하고, 구상이 아니고, 실질적으로 구상이 아니며 또는 형상이 균일하지 않고 및/또는 단단하지 않다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 비오틴, 비오틴 유사체 또는 이의 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 뮤테인; 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 뮤테인; 적어도 2개의 킬레이팅 작용기 K를 함유하는 시약, 여기서 적어도 2개의 킬레이트 작용기는 전이금속 이온에 결합할 수 있음; 올리고히스티딘 친화성 태그(affinity tag)에 결합할 수 있는 제제; 글루타치온-S-전이효소에 결합할 수 있는 제제; 칼모듈린 또는 이의 유사체; 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP)에 결합할 수 있는 제제; FLAG-펩타이드에 결합할 수 있는 제제; HA-태그에 결합할 수 있는 제제; 말토오스 결합 단백질(MBP)에 결합할 수 있는 제제; HSV 에피토프에 결합할 수 있는 제제; myc 에피토프에 결합할 수 있는 제제; 또는 비오티닐화된 수송 단백질에 결합할 수 있는 제제이거나 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 비오틴 또는 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비딘 뮤테인이거나 또는 이를 포함하고; 상기 자극 시약은 비오틴 유사체 또는 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비딘 뮤테인이거나 또는 이를 포함하며; 및/또는 상기 자극 시약은 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비딘 뮤테인이거나 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 함유하는 올리고머 자극 시약이고, 여기서 상기 올리고머 자극 시약의 크기는 i) 50 nm 초과의 반경, ii) 적어도 5 x 106 g/mol의 분자량; 및/또는 (iii) 올리고머 자극 시약 당 적어도 100 개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 자극 시약은 가용성이다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 고체 지지체, 정지 상, 비드, 마이크로입자, 자성입자, 및/또는 매트릭스가 아니며, 이에 결합되거나 이와 관련되지 않고; 및/또는 상기 시약은 가요성이고, 금속 또는 자성코어를 함유하지 않으며, 전체적으로 또는 주로 유기 다량체를 포함하고, 구상이 아니고, 실질적으로 구상이 아니며 또는 형상이 균일하지 않고 및/또는 단단하지 않다.
일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하거나 또는 가역적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47인 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 Va144-Thr45-Ala46-Arg47인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK (서열 번호: 15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 19)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 60nm 초과, 70nm 초과, 80nm 초과, 또는 90nm 초과의 반경을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 50 nm 및 150 nm 사이, 75 nm 및 125 nm 사이, 80 nm 및 115 nm 사이, 또는 90 nm 및 110 nm 사이(수치 포함)의 반경을 폭넓게 포함하고; 또는 90 nm ±15 nm, 또는 95 nm ± 20-25nm의 반경을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 반경은 유체역학적 반경이다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 적어도 5 x 107 g/mol, 또는 적어도 1 x 108 g/mol; 및/또는 5 x 107 g/mol 및 5 x 108 g/mol 사이, 1 x 108 g/mol 및 5 x 108 g/mol 사이, 또는 1 x 108 g/mol 및 2 x 108 g/mol 사이의 분자량을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 입자 시약은 적어도 500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 적어도 1000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 적어도 1,500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머 또는 적어도 2000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머; 및/또는 1,000 및 20,000개 사이의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 1,000 및 10,000개 사이의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 또는 2,000 및 5,000개 사이의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 자극 시약은 약 1 내지 약 2μg/1백만개 세포 사이의 농도로 상기 정지 상에 첨가된다.
일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 상기 정지 상에 직접 또는 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 상기 선택 제제가 가역적으로 결합하는 선택 시약을 통해서 상기 정지 상에 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 상기 선택 시약은 비오틴, 비오틴 유사체 또는 이의 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 뮤테인; 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 뮤테인; 적어도 2개의 킬레이팅 작용기 K를 함유하는 시약, 여기서 적어도 2개의 킬레이트 작용기는 전이금속 이온에 결합할 수 있음; 올리고히스티딘 친화성 태그(affinity tag)에 결합할 수 있는 제제; 글루타치온-S-전이효소에 결합할 수 있는 제제; 칼모듈린 또는 이의 유사체; 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP)에 결합할 수 있는 제제; FLAG-펩타이드에 결합할 수 있는 제제; HA-태그에 결합할 수 있는 제제; 말토오스 결합 단백질(MBP)에 결합할 수 있는 제제; HSV 에피토프에 결합할 수 있는 제제; myc 에피토프에 결합할 수 있는 제제; 또는 비오티닐화된 수송 단백질에 결합할 수 있는 제제이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선택 시약은 비오틴, 비오틴 유사체 또는 이의 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비딘 뮤테인이거나 또는 이를 포함하고; 상기 자극 시약은 비오틴 유사체 또는 이의 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비딘 뮤테인이거나 또는 이를 포함하며; 및/또는 상기 자극 시약은 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비딘 뮤테인이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하거나 또는 가역적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47인 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 Va144-Thr45-Ala46-Arg47인 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK (서열 번호: 15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호:16)를 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 상기 방법은 (약) 37ºC에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 수집은 배지로 상기 정지 상을 세척하는 것을 포함하고, 상기 배지는 상기 정지 상으로부터 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 중력 흐름에 의한 상기 수집은 배지를 상기 정지 상에 첨가하고, 상기 배지는 상기 정지 상으로부터 상기 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 자극된 T 세포를 함유하는 조성물은 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제는 비오틴 또는 비오틴 유사체이거나 이를 함유하며, 선택적으로 여기서 비오틴 유사체는 D-비오틴이다. 일부 구현예에서, 상기 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제는 D-비오틴이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 수집 후 상기 자극된 T 세포를 함유하는 상기 조성물을 추가 인큐베이션 하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 추가 인큐베이션은 (약) 37 ºC ± 2 ºC에서 수행되며; 및/또는 상기 추가 인큐베이션은 T 세포에 신호를 전달할 수 있는 추가 제제의 존재 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 추가 제제는 상기 정지 상을 세척하기 위해 사용되는 배지에 함유된다. 일부 구현예에서, 상기 추가 제제는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 강화 또는 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 추가 제제는 IL-2, IL-15 및 IL-7 중에서 선택된 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 72시간, 48시간 이하, 24시간 이하, 또는 12시간 이하의 시간동안 수행된다.
일부 구현예에서, 방법은 재조합 핵산 분자를 조성물의 자극된 T 세포에 도입시키는 것을 더 포함하고, 여기서 핵산 분자는 재조합 단백질을 암호화하고, 이에 의해 형질도입된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질은 항원 수용체이다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질은 키메라 항원 수용체이다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체(CAR)는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원 인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 추가로 포함된 것은 세포외 도메인과 세포내 신호 전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 T 세포 공동자극분자의 세포내 신호 전달 도메인을 더 함유한다. 일부 T 세포 CD28 및 41BB로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 핵산은 재조합 항원 수용체를 암호화 하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 더 함유한다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산의 도입은 바이러스 입자를 사용한 형질도입에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 레트로바이러스 벡터 입자이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 렌티바이러스 벡터 입자이다.
일부 구현예에서, 방법은 바이러스 통합(viral integration)을 위한 조건 하에서, 선택적으로 37º ± 2ºC의 온도 또는 약 37º ± 2ºC의 온도에서 형질도입된 세포를 포함하는 조성물을 인큐베이션 하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포를 포함하는 조성물의 인큐베이션은 도입 후 최대 96시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포를 포함하는 조성물의 인큐베이션은 도입 후 최대 72시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포를 포함하는 조성물의 인큐베이션은 도입 후 최대 48시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포를 포함하는 조성물의 인큐베이션은 도입 후 최대 24시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 형질도입된 세포를 포함하는 조성물의 인큐베이션은 도입 후 최대 18시간 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 방법은 바이러스 통합 조건 하에서 형질도입된 세포를 함유하는 조성물을 배양하여 배양된 T 세포를 함유하는 조성물을 생성하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 T 세포를 증폭(expand)시키는 조건 하에서 형질도입된 세포를 함유하는 조성물을 배양하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 배양은 14일 이하, 12일 이하, 10일 이하, 8일 이하 또는 6일 이하의 시간동안 수행된다. 일부 구현예에서, 5일 이하이다.
일부 구현예에서, 방법은 조작된 T 세포를 수확하여 조작된 T 세포의 산출 집단을 생성하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 자극 시약에 노출이 시작된 후 48 시간 내지 120 시간(수치 포함)의 시간에 수확하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 수확은 자극제에 노출이 시작된 후 120 시간 내에 수행된다. 일부 구현예에서, 수확은 자극제에 노출이 시작된 후 96 시간 내에 수행된다. 일부 구현예에서, 수확은 자극제에 노출이 시작된 후 72 시간 내에 수행된다. 일부 구현예에서, 수확은 자극제에 노출이 시작된 후 48 시간 내에 수행된다.
일부 구현예에서, 수확 시점에 나이브-유사 세포의 백분율은 집단 내 전체 T 세포, 집단 내 CD4+ T 세포, 집단 내 CD8+ T 세포, 또는 집단 내 이의 재조합 단백질-발현 세포 중 (약) 60%초과이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD27+CCR7+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 도입은 무혈청 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 무혈청 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양은 무혈청 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 무혈청배지는 기본 배지 중에 0.5 mM 내지 5 mM의 디펩타이드 형태의 L-글루타민; 0.5 mM 내지 5 mM의 L-글루타민; 및 선택적으로 하나 이상의 단백질(여기서 상기 배지는 무혈청)을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 IL-2, IL-15 및 IL-7, 선택적으로(optionally) 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-15, 및/또는 재조합 인간 IL-7 중에 선택된 재조합 사이토카인을 함유한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 IL-2, IL-15 및 IL-7, 선택적으로 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-15, 및/또는 재조합 인간 IL-7 중에 선택된 재조합 사이토카인을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 형질도입된 세포를 함유하는 조성물을 인큐베이션 하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 (약) 24 시간 ± 6 시간, 48 시간 ± 6 시간 또는 72 시간 ± 6 시간 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 가역적 결합(들)을 파괴하기 위하여 자극된 T 세포를 함유하는 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 가역적 결합(들)을 파괴하기 위하여 형질도입된 T 세포를 함유하는 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 가역적 결합을 파괴하기 위하여 배양된 T 세포를 함유하는 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 조작된 세포, 선택적으로 조작된 세포를 함유하는 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 제제는 조성물에서 올리고머 자극 시약으로부터 하나 이상의 자극제를 해리시키는 조건 하에서 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 선택적으로 조성물에서 올리고머 자극 시약으로부터 하나 이상의 자극제를 해리시키는 조건 하에서 인큐베이션된 T 세포를 함유하는 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 선택적으로 조성물에서 올리고머 자극 시약으로부터 하나 이상의 자극제를 해리시키는 조건 하에서, 배양된 T 세포를 함유하는 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제 첨가는 수확 전에 수행된다.
일부 구현예에서, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제는 T 세포에 대해 해롭지 않으며, 및/또는 상기 물질의 첨가는 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제 없이 비교가능하거나 또는 동일한 조건 하에서 T 세포의 인큐베이션에 대비해 생존 T 세포의 백분율을 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 또는 50% 미만으로 감소시키지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 파괴는 T 세포에서 자극 신호를 종결시키거나 감소시킨다. 일부 구현예에서, 경쟁 제제 및 자유 결합 제제는 독립적으로 스트렙타비딘-결합 분자; 비오틴; D-비오틴; 비오틴 유사체; 야생형 스트렙타비딘의 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47인 아미노산 서열을 갖는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 유사체에 특이적으로 결합하는 비오틴 유사체;로 이루어진 군에서 선택된 분자를 포함하거나 또는 경쟁 제제 및 자유 결합 제제는 독립적으로 금속 킬레이터를 포함하며, 이는 임의로 EDTA 또는 EGTA이다. 일부 구현예에서, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제는 D-비오틴이며, 임의로 1mM의 D-비오틴이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 세척하는 단계를 더 포함하며, 임의로 상기 세척하는 단계는 조성물 내 자극 시약 및/또는 하나 이상의 자극을 감소시키거나 제거한다. 일부 구현예에서, 상기 세척하는 단계는 수확 전에 수행한다.
일부 구현예에서, T 세포는 항원-특이적 T 세포 또는 이의 집단, 도움 T 세포 또는 이의 집단, 세포독성 T 세포 또는 이의 집단, 기억 T 세포 또는 이의 집단, 또는 조절 T 세포 또는 이의 집단을 함유한다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD3+ T 세포를 포함하거나 또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 도입하는 단계 전에 자극된 T 세포의 조성물로부터 T 세포 서브세트를 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 재조합 핵산 분자는 선택된 T 세포 서브세트로 도입된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인큐베이션 전에 형질도입된 세포를 함유하는 조성물로부터 T 세포의 서브세트를 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 선택된 T 세포의 서브세트는 바이러스 통합 조건 하에서 인큐베이션 된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 배양하는 단계 전에 조작된 세포 세포를 함유하는 조성물로부터 T 세포의 서브세트를 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 선택된 T 세포의 서브세트는 T 세포가 증폭되기 위한 조건 하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 수확하는 단계 전에 조작된 세포를 함유하는 조성물로부터 T 세포의 서브세트를 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 선택된 T 세포의 서브세트가 조작된 T 세포의 산출 집단을 생산하기 위하여 수확되는, 일부 구현예에서, T 세포의 서브세트는 나이브-유사 T 세포 상에 발현된 마커에 대한 표면 양성이 CCR7+CD45RA+, CD27+CCR7+ 또는 CD62L-CCR7+인 나이브-유사 T 세포 또는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD27+CCR7+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CCR7+CD45RA+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 T 세포의 서브세트는 선택적으로 키메라 항원 수용체인 재조합 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, T 세포의 서브세트를 선택하는 단계는 친화도 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)에 의해 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 선택적으로 제약 상 허용되는 부형제(excipient)의 존재 하에 대상체에게 동결 보존 및/또는 투여를 위해 수확된 세포를 제제화 하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는 동결보호제의 존재 하에서 제제화 된다. 일부 구현예에서,
일부 구현예에서, 상기 정지 상은 크로마토그래피 매트릭스이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상은 정지 상의 mL 당 약 7천5백만 내지 약 1억 2천5백만개의 T 세포의 결합능력(binding capacity), 선택적으로 정적 결합능력 또는 동적 결합능력을 갖는다. 일부 구현예에서, (a) 상기 정지 상은 약 20mL; 및/또는 (b) 상기 정지 상은 20억 ± 5억개 세포의 결합능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 2개의 정지 상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 2개의 정지 상은 병행(parallel) 배열된다. 일부 구현예에서, 상기 2개의 정지 상은 순차적으로 배열된다.
T 세포의 온-컬럼 자극을 위한 제조 물품이 제공되며, 상기 제조 물품은 T 세포 표면 상의 제1 분자 및 제2 분자에 각각 특이적으로 결합하여 이로써 상기 T 세포를 자극하는 제1 자극제 및 제2 자극제; 및 T 세포 상의 선택 마커에 특이적으로 결합하여 이로써 상기 정지 상에 상기 T 세포를 고정시킬 수 있는 선택 제제를 포함하는 정지 상;을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상은 제1 자극제 및 제2 자극제를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 자극제, 상기 제2 자극제, 및 상기 선택 제제는 선택 시약을 통해서 상기 정지 상에 간접적으로 결합되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 물품은 자극 시약을 더 포함하며, 여기서 상기 제1 및 제2 자극제는 가역적으로 결합되거나 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 올리고머 자극 시약이다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 선택 시약을 통해서 상기 정지 상에 간접적으로 결합된다.
일부 구현예에서, 상기 정지 상은 크로마토그래피 매트릭스이거나 이를 포함하며, 상기 제조 물품은 상기 크로마토그래피 매트릭스가 전부 또는 일부 함유된 컨테이너를 더 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 제조 물품은 2개의 정지 상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 2개의 정지 상은 병행(parallel) 배열된다. 일부 구현예에서, 상기 2개의 정지 상은 순차적으로 배열된다.
제조 물품 및 이의 구현예를 포함하는 장치가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 장치는 장치의 하나 이상의 구성요소에 유체적으로 연결된 유체 입구 및/또는 상기 장치의 하나 이상의 구성요소에 유체적으로 연결된 유체 출구를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 장치는 폐쇄 또는 멸균된 시스템에 있다. 일부 구현예에서, 상기 장치는 폐쇄 및 멸균된 시스템에 있다.
구현예를 포함하는 본원에 제공된 방법 중 임의의 것을 사용하기 위한 장치 및/또는 제조 물품이 제공되며, 여기서 상기 방법은 선택적으로 자동화된 방식으로 수행된다.
도 1은 표적 세포를 자극하고 선택하기 위한 예시적인 구현예의 개략도를 제공하며, 여기서 자극은 지지체(6)의 존재 하에 적어도 부분적으로 발생하는 상기 세포의 인큐베이션에 의해 수행되고, 표적 세포의 일부 또는 전부 상에 존재하는 분자(선택 마커)(4)에 결합할 수 있는 선택 제제(2)에 대한 결합 부위를 갖는 세포 선택을 위한 선택 시약(1)의 성분(들)이 고정된 정지 상으로써 도시된다(패널 A). 상기 선택 제제(2)는 시약 및 제제가 예를 들어(e.g.) 결합 부위를 통해 가역적으로 결합하여 그 위에 다량체화된(multimerized) 제제와 올리고머 복합체를 생성하는 조건 하에서 고정된 선택 시약(1)과 함께 지지체에 첨가된다(패널 B). 상기 선택 제제는 둘 이상의 제제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 제제 및 시약의 상기 가역적 결합된 복합체는 고정화를 위한 복합체로써 상기 정지 상에 첨가될 수 있다. 도시된 바와 같이, 표적 세포를 포함하는 세포(3)는 상기 정지 상 및 다량체화된 선택 제제 복합체와 결합되고, 이에 의해 표적 세포는 상기 선택 제제(2) 및 시약(선택 시약)(1)을 통해 상기 지지체(6)에 가역적으로 고정된다(패널 C). 선택적으로, 결합되지 않은 세포는 자극제를 첨가하기 전 또는 그 후에 제거된다. 올리고머 자극제(7)에 가역적으로 결합된 다량체화된 자극제(5)를 함유하는 복합체는 상기 자극제(5)가 표적 세포 상의 분자에 특이적으로 결합하여 마커를 발현하는 고정된 표적 세포에서 신호를 유도 또는 조절하는 조건 하에서 첨가된다(패널 D).
도 2a 및 2b는 상이한 배치(batch)의 올리고머 시약 상에서 다량체화된 항-CD3/항-CD28과 함께 인큐베이션된 3 개의 상이한 공여자로부터의 T 세포의 WST 대사 분석 결과를 나타낸다. 도 2a는 평균 유체 역학적 반경이 36nm 또는 101nm인 올리고머 백본에 다량체화된 항-CD3/항-CD28을 함유하는 참조 배치(batch)와 비교하여 모든 시험된 배치(풀링됨)에 대한 WST 대사 활성을 요약한 것이다. 개별 시험된 배치 및 기준 시약에 대한 상기 상이한 공여자로부터의 T 세포 간의 평균 WST 대사 활성도가 도 2b에 도시되어 있다.
도 3은 크로마토그래피 컬럼의 정지 상에 고정된 세포에 각각의 분자가 선택 마커로써 사용될 때, CD3, CD4 및 CD8 표면 발현에 항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약을 사용한 24 시간 온-컬럼 자극의 효과를 보여준다. 표면 발현 패턴은 항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약을 사용한 온-컬럼 자극을 포함하지 않는 제어 조건과 비교된다. 세포는 상기 정지 상에 적용된 성분채집술 샘플로부터 분리되었다.
도 4는 CD3를 컬럼 상에 세포를 고정시키기 위한 선택 마크로써 사용할 때 항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약을 사용한 온-컬럼 자극 시 TCR/CD3 복합체의 하향 조절 및 재-발현의 예시적인 동적역학을 보여준다. 세포는 상기 정지 상에 적용된 성분채집술 샘플로부터 분리되었다. 알파-베타 TCR 사슬에 대항하는 항체는 CD3/TCR 복합체를 평가하기 위해 사용되었다.
도 5a-5b는 항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약으로 온-컬럼 자극 동안 자발적으로 분리된 배양된 T 세포의 표현형 및 기능적 특성을 보여준다. 도 5a는 온-컬럼 자극 후 24 시간 및 5 일차에 T 세포 크기 및 CD3, CD69 및 CD25 발현을 보여준다. 도 5b는 자발적으로 분리된 배양된 T 세포의 증식 능력을 보여준다. 세포는 정지 상에 적용된 성분채집술 샘플로부터 분리되고, 세척 단계를 사용하여 수집하였다.
도 6a-6d는 mTor 신호 전달 및 생존력 및 성장 동역학에 대한 화합물 63의 존재 또는 부재 하에 항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약과 함께 T 세포를 인큐베이션 하는 예시적인 효과를 보여준다. 도 6a는 기억 서브세트에 의한 살아 있는 CD8+ T 세포에서의 pS6 발현을 보여준다. 도 6b는 지시된 바와 같은 처리에 의한 전체 CD8 T 세포의 평균 형광 강도 (mfi)를 보여준다. 도 6c-6d는 자극("입력") 개시 후 배양에서 시간(일수, d1 등으로 표시됨)에 따른 생존율 및 총 T 세포 수를 각각 보여준다.
도 7a-7f는 화합물 63의 존재 또는 부재 하에 항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약과의 인큐베이션을 채용하는 방법을 사용하여 생성된 동결 보존된 CAR-T 세포의 예시적인 기능 및 표현형 특성을 보여준다. 도 7a는 해동 시 카스파제의 세포 내 발현을 나타낸다. 도 7b 및 7d는 각각의 CD27 및/또는 CCR7의 서브 세트 발현에 의한 CD8 CAR-T 세포 및 CD4 CAR-T 세포 표현형 프로파일을 나타낸다. 도 7c 및 7e는 각각 항원 보유 표적으로 자극된 CD8 CAR-T 세포 및 CD4 CAR-T 세포 중 세포 내 IL2, IFNg 또는 TNF(왼쪽 패널) 또는 IL2 및/또는 IFNg 또는 TNF의 조합(오른쪽 패널)을 나타낸다. 도 7f는 항-CAR 비드로 자극된 CAR-T 세포에 대한 12일 동안의 증폭 및 생존(왼쪽 패널) 및 곡선(오른쪽 패널) 아래 부분에 의해 계산된 총 증폭 메트릭(metric)을 나타낸다.
도 8a는 실시예 5에 기재된 바와 같은 온-컬럼 자극 프로세스 또는 대체 프로세스를 사용하여 세포 선택 후 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포 수율을 나타낸다. 도 8b-8c는 실시예 5에 기재된 바와 같은 온-컬럼 자극 또는 대체 프로세스를 사용 이후 회수된 총 세포 수(도 8b) 및 살아있는 세포의 백분율(도 8c)을 나타낸다.
도 9a-9d는 살아있는 세포의 백분율(예를 들어, 순도; 도 9a), 예시적인 CAR을 발현하는 살아있는 세포의 백분율(도 9b), 선택 및 프로세스 8 일째에 CD4를 발현하는 살아있는 세포의 백분율(도 9c), 및 실시예 5에 기재된 온-컬럼 자극 또는 대체 프로세스에 대한 배양 5일(프로세스의 시작으로부터 8 일)에 각 공여자에 대한 T 세포 표현형 분포(백분율)(도 9d)을 나타낸다.
도 10은 실시예 5에 기재된 바와 같이 온-컬럼 자극 또는 대체 프로세스를 사용하여 조작된 항-CD19 CAR T 세포와의 배양 동안 및 대조군 조건 하에 시간에 따른 CD19+ HEK 세포 용해를 나타낸다.
도 11a-11c는 실시예 5에 기재된 바와 같은 온-컬럼 자극 또는 대체 프로세스를 사용하여 조작된 CD4 및 CD8 T 세포에 대한 항원-특이적 CAR T 세포 IFNg (도 11a), IL-2(도 11b) 및 TNF-a(도 11c) 생산을 나타낸다.
도 12a-12c는 실시예 5에 기재된 바와 온-컬럼 자극 또는 대체 프로세스를 사용하여 생성된 CD4 : CD8 비율(도 12a), 조작된 T 세포의 형질 도입 효율 (CD4 및 CD8 세포 결합; 도 12b), 및 생존 세포의 백분율(도 12c)을 나타낸다. 각 프로세스에 대해 3 개의 제조 실행(manufacturing runs) 을 나타낸다.
도 13은 마우스에 B 세포 림프종 세포주(Raji)를 주사(i.v.)하고 6 일 후 처리 그룹에 걸친 평균 광채(radiance)에 의한 종양 크기를 나타낸다.
도 14는 각 치료군에 대해 시간에 따른 B 세포 림프종 세포주(Raji) 주사된 마우스에서의 종양 부담을 나타낸다. 3개의 제조 실행 각각에서 실시예 5에 기술된 바와 같은 온-컬럼 자극 또는 대체 프로세스에 대한 CAR T 세포 치료 효과를 나타낸다(도 12a-12c 참조).
표적 세포(예를 들어, T 세포, CD3+, CD4+, CD8+ T 세포)를 포함하는 샘플로부터 세포를 선택하고 크로마토그래피 컬럼의 정지 상에 상기 표적 세포를 고정시키고, 정지 상에 고정된 세포를 자극하며(또한 본원에서 온-컬럼 자극으로 지칭 됨), 및 분리를 촉진하기 위해 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 사용없이 정지 상으로부터 자발적으로 분리되는 자극된 세포를 수집 및/또는 용리하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 제공된 방법 중에는 표적 세포(예를 들어, T 세포, CD3+, CD4+, CD8+ T 세포)를 포함하는 샘플에서 세포를 선택하고, 상기 표적 세포를 크로마토그래피 컬럼의 정지 상에 고정하고, 정지 상에 고정된 세포를 자극하며, 중력 흐름에 의해 선택 및 자극된 세포를 용리시키는 것을 포함하는 방법이 있다. 제공된 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼의 정지 상에 표적 세포(예를 들어, CD3+, CD4+ 또는 CD8+ T 세포)를 자극하면 세포 선택에 사용되는 분자(즉, 선택 마커)의 하향 조절이 촉진되어 정지 상으로부터 자발적인 분리 또는 방출이 발생한다. 상기 세포의 방출 또는 분리는 어떠한 추가적 단계 또는 시약 없이 발생할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 세포는 크로마토그래피 컬럼에 배지 또는 기타 용액을 첨가하는 것과 같은 중력 흐름에 의해 수집될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 첨가되는 배지 또는 기타 용액은 정지 상으로부터 세포의 분리를 촉진시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 선택 및 자극된 세포는 T 세포가 복수의 T 세포를 함유하는 생물학적 샘플(예를 들어, 성분채집술 또는 전혈 샘플)로부터 선택 및 자극된 T 세포를 함유하는 조성물이다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상으로부터 자발적인 분리되는 상기 선택 및 자극된 세포의 수집 및/또는 용리는 예를 들어 세척 단계 동안에 중력에 의해 달성된다. 본원에서 제공되는 상기 방법은 세포 선택, 자극, 수집 및/또는 용리 단계를 결합하고, 정지 상으로부터 선택 및 자극된 세포의 분리를 용이하게 하기 위한 별도의 단계 및 분리를 용이하게 하기 위해서 사용된 제제(예를 들어, 경쟁 제제 및/또는 자유 결합 제제)를 제거하기 위한 정제단계를 필요로 하지 않는다. 이와 같이, 상기 방법은 다운스트림 프로세싱(예: 유전자 조작, 증폭, 후속 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예: 초기 선택 및/또는 연마(polishing)))에 적합한 선택 및 자극된 세포 조성물을 생성하는데 필요한 프로세싱 단계의 수를 감소시키며, 제조시간을 단축하고 잠재적인 세포 스트레스를 최소화하며 오염 가능성을 감소시킨다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 24시간 이내와 같은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 (약) 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2시간 이내와 같은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 (약) 6, 5, 4, 3, 또는 2시간 이내와 같은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 (약) 6시간 미만 내와 같은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 (약) 5.5시간 미만 내와 같은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 (약) 5시간 미만 내와 같은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 (약) 4.5시간 미만 내와 같은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 (약) 4시간 미만 내와 같은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 (약) 3시간 미만 내와 같은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 예컨대 3 내지 6시간 이내 또는 이 보다 적은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 예컨대 4 내지 6시간 이내 또는 이 보다 적은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 예컨대 5 내지 6시간 이내 또는 이 보다 적은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 예컨대 4 내지 5시간 이내 또는 이 보다 적은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 5일 내 조작된 T 세포(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 상기 방법은 (약) 4 내지 5일에 조작된 T 세포(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 상기 단계는 길이가 (약) 4 또는 5일인 제조 공정을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 상기 단계는 길이가 약 4 내지 5일인 제조 공정을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 상기 단계는 길이가 (약) 4일이거나 또는 (약) 96± 6시간인 제조 공정을 초래한다.
상기 제공된 방법은 샘플 내 다른 세포와 같은 다른 성분으로부터 세포, 예를 들어 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 선택, 및 크로마토그래피 컬럼의 정지 상에 세포를 고정시키는 단계; 상기 정지 상에 고정된 선택된 세포를 자극시키는 단계; 및 상기 정지 상으로부터 세포를 분리시키기 위한 프로세싱 단계 및 선택 및 자극된 세포의 상기 산출 조성물로부터 상기 분리를 용이하게 하기 위해 사용되는 제거 제제(예를 들어, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제)의 부재 하에서 선택 및 자극된 세포를 수집하는 단계를 위한 방법을 포함한다. 특정한 구현예에서, 상기 제공된 방법은 샘플 내 다른 세포와 같은 다른 성분으로부터 세포, 예를 들어 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 선택, 및 크로마토그래피 컬럼의 정지 상에 상기 세포를 고정시키는 단계; 상기 정지 상에 고정된 상기 선택된 세포를 자극시키는 단계; 및 중력 흐름에 의해 선택 및 자극된 세포를 용리 및/또는 수집하는 단계를 위한 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 상기 제공된 방법은 자극 전에 세포 선택(예를 들어, 면역친화성-기반 선택) 후 하나 이상의 추가 단계를 포함하는 세포 요법과 같이 조작된 세포(예를 들어, T 세포)를 생성하기 위한 많은 기존 방법에 대비해 개선된다. 일부 구현예에서, 기존 방법에 존재하는 하나 이상의 추가 단계에는 경쟁 시약 또는 자유 결합 제제를 사용하여 선택된 세포를 회수하거나 수집하기 위한 용출 단계 또는 단계들 및/또는 선택에 사용된 시약(예: 자기 비드 시약 또는 항체)을 제거하기 위한 단계가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 추가 단계는 세포 요법을 위해 세포를 조작하는 공정을 연장할 수 있고 및/또는 분화 상태, 생존력 또는 세포 수에 영향을 미칠 수 있는 공정 동안 세포의 조작(manipulations)을 초래할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 제공된 방법은 별도의 선택 및 자극 단계를 포함하고, 상기 정지 상에서 세포를 분리 및 분리를 촉진하는데 사용되는 제제를 제거하기 위한 추가 단계를 필요로 하는 방법에 비해 짧은 시간에 선택 및 자극된 세포의 집단을 생성한다.
특정 측면에서, 상기 방법은 또한 본원에서 온-컬럼 자극으로서 기재한, 컬럼 상에서 자극 개시의 24시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단(산출 조성물이라고도 함)을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 컬럼 상에서 자극 개시의 (약) 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단(예를 들어, 산출 조성물)을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (약) 6, 5, 4, 3 또는 2 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (약) 3 내지 6 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (약) 4 내지 6 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (약) 5 내지 6 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (약) 4 내지 5 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (약) 6 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (약) 5.5 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (약) 5 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (약) 4.5 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (약) 4 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단을 생성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (약) 3 시간 이내에, 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 유전자 조작, 증폭 및/또는 후속 라운드의 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 집단을 생성한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 세포의 표면 상의 분자에 결합할 수 있는 자극제의 사용에 의하여 세포에 자극 신호를 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극제는 상기 정지 상에 첨가될 수 있는 올리고머 자극 시약 (예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)에 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 자극은 상기 정지 상으로부터 상기 선택된 세포의 자발적 분리를 초래하고, 상기 정지 상으로부터 세포를 분리하고 상기 산출 자극된 세포 조성물로부터 상기 분리를 용이하게 하는 제제를 제거시키기 위한 추가 프로세싱 단계의 부재 하에서 선택 및 자극된 세포의 수집 및/또는 용출을 허용한다. 일부 구현예에서, 상기 자극은 상기 정지 상으로부터 상기 선택된 세포의 자발적인 분리 또는 방출을 초래하여 중력 흐름에 의해 상기 선택 및 자극된 세포의 수집 및/또는 용리를 허용한다. 일부 구현예에서, 중력 흐름은 상기 컬럼(예: 정지 상)에서 상기 자발적으로 분리된 세포를 수집하거나 용리하는데 의존한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 중력 흐름이 함께 조합된 세척단계는 상기 컬럼(예를 들어, 정지 상)으로부터 상기 자발적으로 분리된 세포를 용리시키 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세척단계는 상기 정지 상에 세포를 첨가하거나 고정시키기 전에 사익 세포 투입 조성물에 존재하는 동일한 배지와 같은 세포 배지(예를 들어, 무혈청 배지)를 컬럼에 첨가하는 것을 간단하게 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 방법은 온-컬럼 자극 개시 24 시간 이내에, 추가 프로세싱, 예를 들어 유전자 조작, 증폭, 인큐베이션, 또는 후속 라운드의 자극 및/또는 선택(예를 들어, 연마)에 적합한 선택 및 자극된 세포의 오염되지 않은 (예를 들어, 분리에 사용되는 제제(예: 경쟁 제제, 자유 결합 제제) 및/또는 선택 제제가 없음) 조성물을 성공적으로 생성한다. 또한, 이의 제조 물품 및 장치가 제공된다.
다양한 방법이 세포 요법(예를 들어, 재조합 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체)을 발현하도록 조작된, 선별된(농축된(enriched)) 및 자극된 세포 집단)에 사용하기에 적합한 세포 집단을 생성하기 위해서 이용될 수 있다. 그러나, 일부 측면에서, 이러한 방법은 적어도 부분적으로 다중 프로세싱 단계를 수행해야 하는 필요로 인해 세포를 생성하는데 오랜 시간 또는 비교적 긴 시간이 필요할 수 있다. 다중 프로세싱 단계는 또한 세포 스트레스를 유발할 수 있으므로 다운스트림 프로세싱에서 세포의 유용성에 영향을 미친다. 세포 조성물을 생성하는 추가방법이 필요하다.
특정 측면에서, 제공된 상기 방법은, 크로마토그래피 컬럼의 정지 상에 표적 세포(예를 들어, CD3+, CD4+ 또는 CD8+ T 세포)를 선택하고 자극하는 관찰을 기반으로 하며, 여기서 자극은 세포 선택에 사용되는 상기 분자(즉, 선택 마커)의 하향 조절을 촉진시키며, 상기 정지 상으로부터 상기 세포의 자발적인 분리를 일어나게 한다. 일부 구현예에서, 상기 크로마토그래피 컬럼의 상기 정지 상은 표적 세포 표면 상의 분자(예를 들어, 선택 마커)에 특이적으로 결합 할 수 있는 작용제(예를 들어, 선택 제제)로 기능화 된다. 이러한 방식으로, 상기 선택 마커(예를 들어, CD3, CD4, CD8)를 함유하는 표적 세포를 포함하는 샘플이 상기 정지 상에 조합될 때(예를 들어, 정지 상에 샘플을 추가), 표적 세포(예를 들어, CD3+, CD4+, CD8+ T 세포)는 상기 정지 상에 간접적으로 고정된다. 특정 측면에서, 상기 표적 세포(예를 들어, T 세포)는 예를 들어, 자극제, 자극제를 포함하는 자극 시약의 첨가에 의해, 및/또는 상기 정지 상에 직접 또는 간접적으로 연결된 자극제를 통해, 상기 정지 상에 고정된 동안 자극된다(예를 들어, 온-컬럼 자극). 특정한 구현예에서, 상기 자극제는 항-CD3/항-CD28 항체(예를 들어 Fab) 제제와 같은 T 세포를 활성화 또는 자극하는 제제를 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 상기 제공된 방법 및 다른 구현예는 다중 프로세싱 단계 (예를 들어, 선택 및 자극)를 압축하고 및/또는 프로세싱 단계(예를 들어, 분리를 용이하게 하는데 사용되는 선택 시약 및/또는 제제를 제거하기 위한 단계)를 제거시키며 압축된 프로세스가 동일한 컨테이너 및/또는 폐쇄 시스템 내에서 발생하도록 하여 효율성과 멸균성을 높일 수 있는 점에서 이점이 있다.
특정 측면에서, 상기 방법은 표적 세포(예를 들어, T 세포)에 자극 신호를 전달할 수 있는 자극제를 포함하는 올리고머 자극 시약의 사용을 포함한다. 예시적인 올리고머 시약은 자극 신호를 표적 세포, 예를 들어, T 세포에 전달할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 이의 단편에 가역적으로 결합되거나 컨쥬게이트된 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 자극 시약은 항-CD3 및 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머이다. 외인성 성장 인자가 없거나 적은 양의 외인성 성장 인자와 같이 시험관 내에서 T 세포를 자극하는데 사용하기 위한 기존 시약이 알려져 있다(예 미국 특허 6,352,694 B1 및 유럽 특허 EP 0 700 430 B1 참조). 일반적으로, 이러한 시약은 비드, 예를 들어 다양한 결합제(예: 항-CD3 항체 및/또는 항 -CD28 항체)가 고정된 직경 1㎛ 초과의 자기 비드를 사용할 수 있다. 그러나, 일부 경우에, 이러한 자기 비드는 예를 들어 임상 시험 또는 치료 목적에 필요한 조건 하에서 세포를 자극하는 방법에 통합하기 어려운데, 이는 개체에 조작된 T 세포를 투여하기 전에 이러한 자기 비드가 실질적으로 또는 완전히 제거되었는지 확인해야하기 때문이다. 일부 측면에서, 예를 들어 세포를 자기장에 노출시키는 것에 의한 이러한 제거는 세포 요법에 이용 가능한 생존 세포의 수율을 감소시킬 수 있다. 특정 경우에, 이러한 시약, 예를 들어 자기 비드를 포함하는 자극 시약은 자극 시약으로부터 T 세포가 충분한 양으로 분리될 수 있도록 최소한의 시간 동안 세포와 함께 인큐베이션 되어야 한다. 또한, 비드와 같은 시약은 물리적 제약으로 인해 컬럼 크로마토그래피와 쉽게 호환되지 않는다.
올리고머 자극 시약(예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 항체, 예컨대 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)을 사용하는 상기 제공된 방법은 이러한 잠재적 한계를 극복한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 자극을 개시하기 위해 고체 지지체(예를 들어, 비드)에 결합되지 않은 가용성 올리고머 시약을 정지 상에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 세포 요법을 위해 세포를 조작하는 전체 공정의 끝에 존재할 수 있는 잔류 올리고머 자극 시약의 양을 감소시키거나 최소화하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생성되거나 생산된 산출 세포, 예를 들어 조작된 세포에서 잔류 시약의 위험은 경쟁 시약 또는 자유 결합 제제의 첨가가 상기 세포를 함유하는 조성물에서 상기 자극제로부터 상기 올리고머 자극 시약을 해리(예를 들어, 결합을 파괴)시키기 위해 사용될 수 있기 때문에 상기 올리고머 시약의 사용에 의해 감소또는 회피된다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 자극 시약은 가용성이므로 경쟁 시약 또는 자유 결합 제제를 첨가 할 필요없이 하나 이상의 세척 단계에 의해 조성물에서 세포로부터 올리고머 자극 시약을 감소시키거나 제거하기에 충분할 수 있다. 일부 구현예에서, 이는 또한 투여를 위한 최종 집단에 비드가 없음을 보장하기 위해 추가 조치가 취해져야 하는 것과 같은 다른 방법에 대비해 GMP 표준에 순응하는 프로세스가 더 쉽게 확립될 수 있음을 의미한다. 따라서, 일부 측면에서, 예를 들어 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가 또는 하나 이상의 세척 단계에 의해 세포로부터 올리고머 자극 시약의 제거 또는 분리는 비드 기반 자극 시약의 제거 또는 분리에 대비해 세포 손실을 거의 또는 전혀 발생시키지 않는다. 일부 측면에서, 상기 자극 시약 또는 올리고머 자극 시약 감소, 제거 또는 분리의 상기 시점은 제한되지 않거나 비드 기반 자극 시약의 제거 또는 분리보다 덜 제한된다. 따라서, 일부 측면에서, 상기 자극 시약 또는 올리고머 자극 시약은 상기 제공된 방법 동안 임의의 시간 또는 단계에서 상기 세포로부터 감소, 제거 또는 분리될 수 있다.
특정 측면에서, 상기 제공된 방법의 상기 기간은 세포, 예를 들어 투입 세포 집단 또는 샘플의 T 세포가 처음 접촉되거나 자극 조건에 노출될 때(예를 들어, 섹션 I-C에서와 같이 본원에 기재된 바와 같이) 측정 될 수 있고, 본원에서 대안적으로 자극제와 함께 또는 자극 조건 하에서, 예를 들어 상기 자극 시약에 대한 노출이 개시될 때 인큐베이션의 개시로 지칭된다. 일부 구현예에서, 자극된 표적 세포(예를 들어, CD3+, CD4+, CD8+ T 세포)를 함유하는 산출 집단(본원에서 산출 조성물이라고도 함)을 수집하기 위한 상기 시간은 상기 자극 시약과 함께(예를 들어, 자극 시약을 첨가하거나 자극 시약에 노출) 표적 세포의 인큐베이션 개시, 즉 자극 시약이 컬럼에 첨가될 때로부터 측정된다. 일부 구현예에서, 상기 수집은 상기 인큐베이션 개시 후 한 번에 컬럼으로부터 세포의 중력 흐름에 의해 수행되며, 일부 경우 컬럼으로부터 자발적으로 방출된 세포의 회수를 보장하기 위해 컬럼의 하나 이상의 세척을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 세포가 수집될 때까지 상기 인큐베이션 기간은 (약) 24 시간, 23 시간, 22 시간, 21 시간, 20 시간, 19 시간, 18 시간, 17 시간, 16 시간, 15 시간, 14 시간, 13 시간, 12 시간, 11 시간, 10 시간, 9 시간, 8 시간, 7 시간, 6 시간, 5 시간, 4 시간, 3 시간 또는 2 시간, 또는 24 시간, 23 시간, 22 시간, 21 시간, 20 시간, 19 시간, 18 시간, 17 시간, 16 시간, 15 시간, 14 시간, 13 시간, 12 시간, 11 시간, 10 시간, 9 시간, 8 시간, 7 시간, 6 시간, 5 시간, 4 시간, 3 시간 또는 2 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 세포가 용리 및/또는 수집될 때까지 상기 인큐베이션 기간은 (약) 12 시간, 11 시간, 10 시간, 9 시간, 8 시간, 7 시간, 6 시간, 5 시간, 4 시간, 3 시간 또는 2 시간 또는 12 시간, 11 시간, 10 시간, 9 시간, 8 시간, 7 시간, 6 시간, 5 시간, 4 시간, 3 시간 또는 2 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 세포가 용리 및/또는 수집될 때까지 상기 인큐베이션 기간은 (약) 6 시간, 5 시간, 4 시간, 3 시간 또는 2 시간이거나, 6 시간, 5 시간, 4 시간, 3 시간 또는 2 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 세포가 용리 및/또는 수집될 때까지 상기 인큐베이션 기간은 (약) 6 시간이거나 또는 6 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 세포가 용리 및/또는 수집될 때까지 인큐베이션 기간은 (약) 5 시간이거나 또는 5 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 세포가 용리 및/또는 수집될 때까지 인큐베이션 기간은 (약) 4.5 시간이거나 또는 4.5 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 세포가 용리 및/또는 수집될 때까지 인큐베이션 기간은 (약) 4 시간이거나 또는 4 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 세포가 용리 및/또는 수집될 때까지 인큐베이션 기간은 (약) 3 시간이거나 또는 3 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 세포가 용리 및/또는 수집될 때까지 인큐베이션 기간은 (약) 3 내지 6시간이다. 일부 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 세포가 용리 및/또는 수집될 때까지 인큐베이션 기간은 (약) 4 내지 6시간이다. 일부 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 세포가 용리 및/또는 수집될 때까지 인큐베이션 기간은 (약) 4 내지 5시간이다. 일부 구현예에서, 상기 컬럼으로부터 수집하기 전에 자극 시약과 함께 제공된 인큐베이션 기간, 예를 들어 재조합 수용체를 사용하여 세포를 유전적으로 조작하는 것과 관련하여 사용하기 위해 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물을 생성하기 위해, 예를 들어 형질 도입에 의해, 대체 또는 예를 들어 선택과 자극이 개별적으로 수행되고/되거나 자극이 컬럼 상에서 수행되지 않는 기존 프로세스의(약) 75%, 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 15% 또는 10%이거나 또는 75% 미만, 60%미만, 50%미만, 40%미만, 30%미만, 25%미만, 15% 미만 또는 10% 미만이다.
본원에서 선택 및 자극된 세포의 상기 산출 조성물이 추가로 가공될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 상기 산출 세포는 키메라 항원 수용체와 같은 재조합 단백질을 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있고/있거나 산출 세포는 추가 인큐베이션, 자극, 증폭, 선택(예를 들어, 연마) 및/또는 제제화(formulation)를 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 및 자극된 세포의 상기 산출 조성물은 조작된 세포의 산출 조성물, 예를 들어 환자의 질병 치료에 유용한 치료 세포 조성물을 생성하기 위해 추가로 가공(예를 들어, 조작, 연마) 될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 예를 들어, 채취, 버피 코트 또는 전혈과 같은 샘플에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플은 생물학적 샘플이다. 일부 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 인간 대상체로부터 수집된다. 일부 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 질병 또는 병태(condition)를 앓고있는 환자로부터 수집된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 전에 단리되고, 강화되고 또는 샘플로부터 선택된, 세포 집단, 예를 들어 CD3+ T 세포에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 전에 분리되고, 농축되고 또는 샘플로부터 선택된, 세포 집단, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 샘플 또는 상기 샘플로부터 단리된 세포는 동결 보존됐을 수 있다.
또한 약제학적 집단 및 제형, 및 키트, 시스템 및 상기 방법을수행하기 위한 장치를 포함하여 상기 방법에 의해 제조된 세포 및 집단이 제공된다. 입양 세포 요법과 같은 치료 방법을 포함하는 방법에 의해 제조된 세포 및 집단의 사용 방법, 및 대상체에게 투여하기 위한 약제학적 집단이 추가로 제공된다.
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본원에 사용된 섹션 제목은 단지 조직화를 위한 목적이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
I. 세포를 선택, 자극, 및 조작하기 위한 방법
세포의 산출 집단(산출 조성물이라고도 함), 예를 들어 선택 및 자극된 T 세포, 예로써 CD3+ T, CD4+ T, 및 CD8+ T 세포를 생성하는 방법이 본원에서 제공되며, 세포의 선택, 자극 및 수집을 위한 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 및 선택된 세포의 산출 집단은 치료 세포 조성물을 생성하는데 적합하다. 특정 측면에서, 상기 방법은 분리를 용이하게하기 위해 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 사용 없이 상기 정지 상으로부터 자발적으로 분리되는 선택 및 자극된 세포의 수집 및/또는 용리를 허용하는 선택 및 자극 단계를 조합한다. 따라서, 본원에서 제공되는 상기 방법은 세포 선택, 자극 및 수집/용리 단계를 결합하고, 상기 정지 상으로부터 상기 선택 및 자극된 세포의 분리를 용이하게 하기 위한 별도의 단계 및 분리를 용이하게 하기 위해서 사용된 제제(예를 들어, 경쟁 제제 및/또는 자유 결합 제제)를 제거하기 위한 정제단계를 필요로 하지 않는다. 이와 같이, 상기 방법은 다운스트림 프로세싱(예: 유전자 조작, 증폭, 후속 인큐베이션, 자극 및/또는 선택(예: 연마(polishing)))에 적합한 선택 및 자극된 세포 산출 조성물을 생성하는데 필요한 프로세싱 단계의 수를 감소시키며, 제조시간을 단축하고 잠재적인 세포 스트레스를 최소화하며 오염 가능성을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 24시간 이내와 같은 설정된 시간 내에 다운스트림 프로세싱에 적합한 선택 및 자극된 세포의 조성물을 생성시킨다. 일부 구현예에서, 선택 및 자극된 세포의 상기 산출 집단은 투입 집단으로써 사용되거나, 후속 단계, 예를 들어 섹션 I-E에 기재된 바와 같은 유전자 조작을 위한 투입 집단으로써 사용하기 위한 공급원이다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 상기 방법은 세포 요법의 제조, 생성 또는 생산과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 산출 조성물, 예를 들어 선택 및 자극된 T 세포를 생성 또는 생산하는 상기 방법은 대상체로부터 세포를 분리하고, 자극 조건 하에서 세포를 인큐베이션 하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 상기 산출 조성물은 세포를 유전적으로 조작하기 위한 것과 같은 세포 요법을 생산하기 위한 추가 다운스트림 프로세싱을 위한 투입 세포의 공급원으로서 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포, 예를 들어 1차 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 생물학적 샘플에서 선택 또는 분리와 같이 단리 되고, 자극 조건 하에서 인큐베이션 되며, 단일 단계에서 수집 또는 용출하고, 후속적으로 예컨대 형질 도입 또는 형질 감염에 의해 세포에 재조합 수용체를 암호화하는 재조합 폴리 뉴클레오티드를 도입시키기 위해 유전적으로 조작하고; 및 이후 수집, 수확, 또는 예를 들어, 백(bag) 또는 바이알과 같은 컨테이너에 조작된 세포의 산출 집단으로서 충진시키는 순서로 수행되는 프로세싱 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 세포의 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는 선택적으로 세포를 동결 보존 및 저장 한 후에 동일한 대상체로 재-도입된다. 일부 구현예에서, 상기 조작된 세포의 산출 집단은 요법, 예를 들면, 자가 세포 요법에 사용하기에 적합하다.
특정 구현예에서, 제공된 상기 방법은 초기 또는 투입 세포 집단으로부터 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포의 산출 집단을 생성하는 것과 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 투입 집단은 제공된 방법에 의해 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물로서 수집된 세포를 제공, 조합, 혼합 및/또는 풀링함으로써 생산(produced), 생성(generated) 및/또는 제조된다. 일부 구현예에서, 상기 세포의 투입 집단은 농축된 T 세포, 농축된 CD3+ T 세포, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포(이하 각각을 농축된 T 세포의 집단, 농축된 CD3+ T 세포의 집단, 농축된 CD4+ T 세포의 집단, 및 농축된 CD8+ T 세포의 집단이라고도 함)를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 세포의 투입 집단은 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 집단이거나 또는 CD4+, 및 CD8+ T 세포의 조합(combined), 혼합 및/또는 풀링된 집단이다. 일부 구현예에서, 세포의 투입 집단은 CD3+ 세포의 집단이다. 특정 구현예에서, 제공된 방법은 예를 들어, 형질도입 또는 형질감염에 의해 재조합 단백질 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드를 도입시키기 위한, 선택 및 자극된 세포를 유전적으로 조작하는 것과 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 방법은 자극되어진 농축된 T 세포의 투입 집단을 생성하기 위하여, 생물학적 샘플(예를 들어, 전혈, 채혈), 예를 들어 대상체로부터 채취, 수집 및/또는 수득된 생물학적 샘플로부터 세포를 단리(isolate) 또는 선택하고, 세포를 자극하기 위하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포가 조작, 형질 도입 및/또는 배양 된 후 농축된 T 세포의 집단을 수확, 수집 및/또는 제형화하는 것을 더 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 세포 내로 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것, 예를 들어, 본원, 예를 들어 섹션 I-E에 기재된 방법에 의해 세포를 형질 도입 또는 형질 감염시키는 것과 관련하여 수행된다. 제공된 방법의 특정 구현예에서, 세포는 세포를 유전적으로 조작하는 동안 또는 후에, 예를 들어 재조합 단백질을 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드의 통합을 허용하거나 재조합 단백질의 발현을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션 된다. 특정 구현예에서, 세포는 18 시간 초과 또는 4 일 미만의 시간 양과 같은, 설정 또는 고정된 시간 동안 인큐베이션 된다. 일부 구현예에서, 상기 조작하는 단계는 자극이 시작되거나 개시되는 시점으로부터 설정된 시간 내에, 예를 들어 세포가 자극제에 노출된 시점으로부터 24 시간 이내에 시작되거나 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 조작하는 단계는 세포가 자극제에 노출된 시점으로부터 (약) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 시간 이내에 시작되거나 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 조작하는 단계는 세포가 자극제에 노출된 시점으로부터 (약) 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간 이내에 시작되거나 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 조작하는 단계는 세포가 자극제에 노출된 시점으로부터 (약) 3시간 또는 6시간 이내에 시작되거나 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 조작하는 단계는 세포가 자극제에 노출된 시점으로부터 (약) 4시간 또는 6시간 이내에 시작되거나 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 조작하는 단계는 세포가 자극제에 노출된 시점으로부터 (약) 4시간 또는 5시간 이내에 시작되거나 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 조작하는 단계는 세포가 자극제에 노출된 시점으로부터 (약) 6시간 이내에 시작되거나 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 조작하는 단계는 세포가 자극제에 노출된 시점으로부터 (약) 5시간 이내에 시작되거나 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 조작하는 단계는 세포가 자극제에 노출된 시점으로부터 (약) 4.5시간 이내에 시작되거나 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 조작하는 단계는 세포가 자극제에 노출된 시점으로부터 (약) 4시간 이내에 시작되거나 개시된다. 일부 구현예에서, 상기 조작하는 단계는 세포가 자극제에 노출된 시점으로부터 (약) 3시간 이내에 시작되거나 개시된다. 일부 구현예에서, 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드의 존재 하에, 선택적으로 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드가 바이러스(예를 들어, 바이러스 벡터)에 함유 된 경우, 인큐베이션은 (약) 1시간, 또는 적어도 1시간의 기간 동안 지속된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공정 단계는 적어도 부분적으로 무혈청 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 정의되거나(defined) 또는 잘-정의된(well-defined) 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 가공된, 예를 들어 저해제 및/또는 성장 인자를 제거하기 위해 여과된 제어된 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 사이토카인 또는 재조합 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 재조합 IL-2, IL-15 및/또는 IL-7을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 글루타민을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 글루타민 및 재조합 IL-2, IL-15, 및 IL-7을 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 예를 들어 입양 세포 요법에서 임상적 이용을 위한 세포의 제조에서 하나, 그 이상 또는 모든 단계가 세포를 비멸균 조건에 노출시키지 않고 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 모든 폐쇄계, 멸균 시스템 또는 디바이스 내에서, 선택, 자극, 형질 도입, 세척, 및 제형화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단계는 폐쇄 시스템 또는 디바이스와 별개로 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어 별도의 폐쇄 시스템으로의 멸균 전달에 의한 것과 같은, 멸균 조건 하에서 폐쇄 시스템 또는 디바이스로부터 분리되어 전달된다.
특정한 구현예에서, 샘플 및/또는 샘플의 단리된 부분, 예를 들어 상기 방법의 하나 이상의 단계와 관련된 세포를 포함하는 샘플(예를 들어, 버피 코트, 농축된 T 세포 집단)은 수집되고, 동결 보호를 위해 제형화되고, 동결(예를 들어, 동결 보호), 및/또는 0°C 미만, -20°C 미만, 또는 -70°C 또는 -80°C 미만에서 본원에 제공된 방법의 단계 전, 단계 동안, 또는 임의의 단계 후에 저장된다. 일부 구현예에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 일 미만의 시간 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 주 미만의 시간, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 주, 또는 8 주 초과 동안에 저장될 수 있다. 저장 후, 세포의 샘플 또는 샘플의 단리된 부분은 해동되고, 상기 방법에 따른 프로세싱을 상기 공정에서 동일한 지점으로부터 재개할 수 있다. 특정한 구현예에서, 농축된 T 세포(예를 들어, 조작된 T 세포)의 배양 및/또는 제형화된 집단은, 예를 들어 자가 세포 요법으로서 대상체에게 투여되기 전에 동결 보호되고 저장된다.
특정 구현예에서, 프로세스의 임의의 단계 또는 단계에서, 예를 들어 폐쇄 시스템에서 집단이 잔존하는 동안에 세포가 세포의 집단(예를 들어 T 세포의 집단)으로부터 채취되는 것과 같이 세포의 일부를 샘플링하거나 수집할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 세포는 생존력, 세포자연사, 활성화, 자극, 성장 및/또는 고갈을 포함하지만 이에 제한되지 않는 메이커, 특징 또는 특성에 대해 분석될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 자동화 프로세스(예를 들어, 섹션 I-E-3a 참조)에 의해 샘플링되거나 수집된다. 일부 구현예에서, 샘플링되거나 수집된 세포의 분석은 자동화 된다. 특정 구현예에서, 분석은 멸균 조건 하에서 폐쇄 시스템으로 수행된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법에 의한 생산되거나 가공된 세포 또는 세포의 집단은 예시적 및/또는 대체 프로세스에 의해 처리되거나 생성된 세포 또는 세포의 집단과 비교될 수 있다. 특정 구현예에서, 대체 및/또는 예시적 프로세스는 하나 이상의 특정 측면에서 상이할 수 있지만, 예시적 또는 대체 프로세스에 대비되는 제공된 방법의 구현예 또는 측면의 동일하거나 유사한 특징, 측면, 단계(step), 스테이지, 시약, 또는 조건을 함유한다. 예를 들어, 상기 제공된 방법에 의해 생성된 선택 및 자극된 세포, 예를 들어 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물은 정지 상으로부터 선택된 세포를 분리시키기 위하여 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 사용을 필요로 하는 별도의 선택 및 자극 단계를 포함하는 프로세스로 생성된 세포와 대비될 수 있다. 일부 구현예에서, 달리 명시되지 않는 한, 상기 제공된 방법 및 상기 예시적 또는 대체 프로세스는 선택, 농축, 자극, 조작, 형질 감염, 형질 도입, 배양 및/또는 제제화에 대하여 유사하거나 동일한 단계와 같이 유사하고/하거나 동일할 것이다. 일부 구현예에서, 달리 명시되지 않는 한, 상기 제공된 방법 및 상기 대체 프로세스는 동일하거나 유사한 유형의 생물학적 샘플 및/또는 동일한 세포 유형의 프로세스 세포 및/또는 투입 세포로부터 세포를 선택 및/또는 농축시킨다.
본원에 제공된 상기 방법은 조작된 세포의 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)을 생성하는데 필요한 시간을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 조작된 세포의 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)을 생성하는데 필요한 상기 시간은 대체 프로세스에 필요한 시간보다 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 미만이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 상기 방법은 5일 내 조작된 세포의 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)을 생산한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 상기 방법은 (약) 4일 안에, 또는 (약) 96시간 안에 조작된 세포의 산출 세포 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)을 생산한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 상기 방법은 (약) 4 내지 5일 안에 또는 (약) 96 내지 120 시간 안에 조작된 세포의 산출 세포 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)을 생산한다.
A. 샘플 및 세포 준비
특정한 구현예에서, 제공된 방법은 생물학적 샘플로부터 세포를 선택 및/또는 강화하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 특정 질환 또는 병태를 갖거나 세포 요법이 필요하거나 세포 요법이 투여될 대상체로부터 얻어지거나 유래된 것과 같은 생물학적 샘플로부터의 세포 또는 이의 집단을 선택하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 대상체는 세포가 단리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법과 같은 특정 치료적 개입이 필요한 환자인 대상체와 같은 인간이다. 따라서, 일부 구현예에서 세포는 일차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 샘플은 대상체에서 직접 채취한 조직, 유체 및 기타 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득된 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플에는 체액, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 장기 샘플 (이로부터 유래된 가공 샘플 포함)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나 또는 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 산물이거나 이로부터 유래한다. 예시적인 샘플에는 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 창자, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도 또는 기타 장기 및/또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 샘플에는 세포 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법의 맥락에서 자가 및 동종이계 공급원으로부터의 샘플이 포함된다.
일부 실시예에서, 대상체의 순환 혈액으로부터의 세포는 예를 들어 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 수득된다. 일부 측면에서, 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함한 림프구를 함유하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 수집된 혈액 세포는, 예를 들어 혈장 분획을 제거하고 후속 가공 단계를 위한 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 배치하기 위해 세척한다. 일부 구현예에서, 세포는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 세척 용액에는 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 결여되어 있다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 반자동 "플로우-쓰루(flow-through)" 원심 분리기(예를 들어, Cobe 2991 셀 프로세서, Baxter)로 달성된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조업체의 지침에 따라 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF)에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충제, 예를 들어 Ca++/Mg++이 없는 PBS에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고 이 세포는 배양 배지에서 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어 성분채집술 산물 또는 백혈구 성분채집술 산물)를 함유하는 세포는 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 동안에 첨가된 헤파린과 같은 하나 이상의 항-응집제를 제거하기 위하여 세척된다.
일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 전혈 샘플, 연막 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 비분획화된 T 세포, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집술 산물, 또는 백혈구 성분채집술 산물)를 함유하는 샘플은 세포의 집단을 단리, 선택, 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염, 인큐베이션, 배양, 수확, 제형화 및/또는 제형화된 세포집단을 대상체에 투여하기 위한 임의의 단계 전에 냉동 보존 및/또는 냉동 보호(예: 동결)한 다음 해동한다.
일부 구현예에서, 대상체로부터 자가 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 함유하는 샘플은 제조를 위한 적절한 품질을 보장하기에 적합한 방법으로 수집된다. 일 측면에서, PBMC를 함유하는 샘플은 분획된 전혈로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 대상체로부터 전혈은 원심력을 사용하고, 자가 단핵 세포(MNC)가 적혈구와 같은 다른 세포 표현형이 수집된 세포 조성물에서 감소되는 동안에 우선적으로 풍부할 때 세포 표현형 간의 밀도 차이를 사용하는 백혈구 성분채집술에 의해 분획된다. 일부 구현예에서, 자가 혈장은 MNC 수집 동안 동시에 수집되며, 이는 일부 측면에서 연장된 백혈구 성분채집술 산물 안정성을 허용할 수 있다. 일 측면에서, 자가 혈장은 백혈구 성분채집술 산물 매트릭스의 완충용량 개선을 위하여 백혈구 성분채집술 산물에 첨가된다. 일부 측면에서, 백혈구 성분채집술 산물을 생성하기 위하여 가공된 전혈의 총 부피는 (약) 2L, 4L, 6L, 8L, 10L, 12L, 14L, 16L, 18L, 또는 20L이거나 전술된 임의의 것 사이의 임의의 값이다. 일부 구현예에서, 수집된 자가 혈장 부피는 (약) 10mL, 50mL, 100mL, 150mL, 200mL 250mL, 또는 300mL 이상이거나 전술된 임의의 것 사이의 부피이다. 일부 구현예에서, 백혈구 성분채집술 산물은 백혈구 성분채집술 완료 약 48 시간 이내에 절차, 예를 들어 공정 중 동결보존을 위한 세척 및 제형화에 투입된다. 일부 구현예에서, 백혈구 성분채집술 산물은 예를 들어, 백혈구 성분채집술 완료 약 2 시간, 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간 이내에 하나 이상의 세척 단계에 투입된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 세척 단계는 백혈구 성분채집술 수집 동안 항응고제, 백혈구 성분채집술 산물에 축적될 수 있는 세포 폐기물, 잔류 혈소판 및/또는 세포 파편을 제거한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 완충제 교환은 하나 이상의 세척 단계 동안 수행된다.
특정한 구현예에서, 성분채집술 산물 또는 백혈구 성분채집술 산물은 아래에(infra) 기재된 바와 같이 세포 선택 또는 단리 단계(예를 들어, T 세포 선택 또는 단리 단계)를 거치기 전에 동결 보존 및/또는 동결 보호(예를 들어, 동결)된 다음 해동된다. 일부 구현예에서, 동결 보존 및/또는 동결 보호된 성분채집술 산물 또는 백혈구 성분채집술 산물이 T 세포 선택 또는 단리 단계를 거친 후, 추가 동결 보존 및/또는 동결 보호 단계는 활성화, 자극, 조작, 형질 도입, 형질 감염, 인큐베이션, 배양, 수확, 세포 집단 제제화 및/또는 제제화된 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계와 같은 임의의 후속 단계 동안 또는 그 사이에 수행되지 않는다. 예를 들어, 해동된 동결 보존 및/또는 동결 보호된 성분채집술 산물 또는 백혈구 성분채집술 산물으로부터 선택된 T 세포는 형질 도입과 같은 다운스트림 프로세싱을 위해 해동되기 전에 다시 동결 보존 및/또는 동결 보호되지 않는다.
특정한 구현예에서, 동결 보존 및/또는 동결 보호된 성분채집술 산물 또는 백혈구 성분채집술 산물은 은행에 보관되며(예를 들어, 샘플을 동결하기 전에 세포 선택없이), 일부 측면에서 후속 제조 단계에 대해 더 많은 유연성을 허용 할 수 있다. 일부 측면에서, 동결 보존 및/또는 동결 보호된 성분채집술 산물 또는 백혈구 성분채집술 산물은 백(bag)과 같은 다중 동결 보존 컨테이너에 분취되며, 이는 각각이 제품의 프로세싱에 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 일 측면에서, 선택 전의 뱅킹 셀(banking cells)은 다운 스트림 프로세스에 대한 세포 수율을 증가시키고, 뱅킹 셀은 더 건강하고 제조 성공 기준을 충족하는 것이 더 쉬울 수 있음을 의미 할 수 있다. 또 다른 측면에서, 한 번 해동되면, 동결 보존 및/또는 동결 보호된 성분채집술 산물 또는 백혈구 성분채집술 산물은 하나 이상의 상이한 선택 방법에 적용될 수 있다. 이 접근법의 장점은 무엇보다도 샘플의 공여자 및/또는 다른 수령자에서와 같이 대상체의 질병 또는 병태를 치료하기 위한 세포 요법 세포의 가용성, 효능 및/또는 다른 측면을 강화시키는 것이다.
일부 구현예에서, 샘플(예를 들어, 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 샘플)은 공여자가 질병이나 병태로 진단 된 후 한 번에, 수집되고 사전 세포 선택 전 또는 선택 없이 동결보존 되고/되거나 동결 보호된다. 일부 측면에서, 동결 보존 시간은 또한 기증자가 다음 중 하나 이상을 받기 전이다: 질병 또는 병태에 대한 임의의 초기 치료, 질병 또는 병태에 대한 임의의 표적 치료 또는 치료용으로 표지된 임의의 치료 또는 치료 방사선 및/또는 화학 요법 이외의 임의의 치료. 일부 구현예에서, 샘플은 질환에 대한 초기 치료 후 질환의 최초 재발 후 및 공여자 또는 대상체가 질환에 대한 후속 치료를 받기 전에 수집된다. 초기 및/또는 후속 치료는 세포 요법 이외의 요법일 수 있다. 일부 구현예에서, 수집된 세포는 초기 및/또는 후속 치료 후 세포 요법에 사용될 수 있다. 일 측면에서, 사전 세포 선택이 없는 동결보존 및/또는 동결보호된 샘플은, 예를 들어, 교차하고 향후 치료가 필요할 수 있는 무작위 임상 시험에서 비-치료 환자와 관련된 비용과 같은 선행 비용을 줄이는데 도움이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플(예를 들어, 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 샘플)은 질병에 대한 2 차 치료 후 질병의 2차 재발 후, 및 공여자 또는 대상체가 질병에 대한 후속 치료를 받기 전 한번에 수집되고, 사전 세포 선택 또는 선택 없이(예: 크로마토그래피에 의한 선택과 같이 사전 T 세포 선택 없이) 동결보존 되고/되거나 동결 보호된다. 일부 구현예에서, 환자는 예를 들어 특정 위험 인자를 평가함으로써 2 차 치료 후 재발할 가능성이 있는 것으로 확인된다. 일부 구현예에서, 위험 인자는 이중-적중 림프종, 원발성 불응성 암(primary refractory cancer) 또는 활성화된 B 세포 림프종과 같은 질병 유형 및/또는 유전학에 기초한다. 일부 구현예에서, 위험 인자는 1 차 치료 후 조기 재발, 또는 치료 후 다른 불량한 예후 지표(예를 들어, IPI (International Prognostic Index)> 2)와 같은 임상 증상을 기반으로 한다.
일부 구현예에서, 샘플(예를 들어, 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 샘플)은 공여자 또는 대상체가 질병이나 병태로 진단되기 전 한 번에, 수집되고 사전 세포 선택 전 또는 선택 없이 동결보존 되고/되거나 동결 보호된다. 일부 측면에서, 공여자 또는 대상체는 질병에 걸릴 위험이 있는 것으로 결정될 수 있다. 일부 측면에서, 공여자 또는 대상체는 건강한 대상체일 수 있다. 특정 경우에, 공여자 또는 대상체는 삶의 후기 단계에서 세포 요법이 필요한 경우 질병이 발병할 위험이 있는 것으로 간주 또는 질병 진단 없이 세포를 보관하거나 저장하도록 선택할 수 있다. 일부 구현예에서, 공여자 또는 대상체는 유전적 돌연변이, 유전적 이상, 유전적 파괴, 가족력, 단백질 이상(단백질 생산 및/또는 프로세싱의 결핍과 같은), 및 질병 발병 위험을 증가시킬 수 있는 생활 방식 선택과 같은 요인을 기반으로 질병이 발병할 위험이 있는 것으로 간주 될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 예방약(prophylactic)으로써 수집된다.
일부 구현예에서, 사전 세포 선택 되지 않은 세포의 샘플(예를 들어, 크로마토그래피에 의한 선택과 같은 사전 T 세포 선택 없이)과 같은 세포의 동결보존 되고/되거나 동결보호된 샘플(예를 들어, 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 샘플)은 12시간 이상, 24시간 이상, 36시간 이상, 또는 48 시간 이상의 기간 동안 저장되거나 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플은 1주 이상, 2주 이상, 3주 이상 또는 4주 이상의 기간 동안 저장되거나 보관된다. 일부 구현예에서, 샘플은 장기 저장소 또는 장기 은행에 배치된다. 일부 측면에서, 샘플은 1개월 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 7개월 이상, 8개월 이상, 9개월 이상, 10개월 이상, 11개월 이상, 1년 이상, 2년 이상, 3년 이상, 4년 이상, 5년 이상, 6년 이상, 7년 이상, 8년 이상, 9년 이상, 10년 이상, 11년 이상, 12년 이상, 13년 이상, 14년 이상, 15년 이상, 16년 이상, 17년 이상, 18년 이상, 19년 이상, 20년 이상, 25년 이상, 30년 이상, 35년 이상, 40년 이상, 또는 그 이상 기간동안 저장된다.
일부 구현예에서, 공여자로부터 채취된 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 샘플은 냉각된 환경에서 저장 또는 가공 시설로 선적되고 /되거나 저장 시설에서 극저온으로 저장되거나 가공 시설에서 처리된다. 일부 구현예에서, 선적 전에, 샘플은 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포와 같은 T 세포를 선택하는 것에 의해 가공된다. 일부 구현예에서, 이러한 처리는 선적 후 샘플을 극저온으로 저장하기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 처리는 극저온 저장 후 샘플을 해동한 후에 수행된다.
공여자 및 그에 따른 세포가 질병에 대해 광범위한 치료를 받지 않았거나 질병이나 병태의 수축 또는 이의 진단 전에 공여자가 세포를 저장하도록 허용함으로써, 이러한 세포는 1회 또는 여러 차례의 치료 후 수확된 세포와 비교하여 세포 요법에 사용에 있어 특정 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, 1회 이상의 치료 전에 수확된 세포는 더 건강할 수 있고, 더 높은 수준의 특정 세포 활성을 나타낼 수 있으며, 더 빠르게 성장할 수 있고/있거나 여러 차례의 치료를 받은 세포보다 유전자 조작에 더 잘 수용될 수 있다. 본원에 기재된 구현예에 따른 이점의 다른 예시는 편의를 포함한다. 예를 들어, 세포 요법에 필요하기 전에 공여자의 세포를 수집, 선택적으로 처리 및 저장함으로써 만일 수령자가 향후 그들을 필요로 하거나 및 필요로 할 때 세포를 쉽게 사용할 수 있다. 이것은 성분채집술 실험실 용량을 증대시켜 기술자에게 성분채집술 수집 공정을 스케쥴링 하는데 더 큰 유연성을 제공할 수 있다.
성분채집술 샘플과 같은 샘플로부터의 세포를 극저온 저장 및 처리하기 위한 예시적인 방법 및 시스템에는 문헌[국제공개번호 제WO2018170188호]에 기술된 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법 및 시스템은 환자가 세포 요법을 필요로 하기 전에 성분채집술 수집한 다음, 예를 들어 재조합 수용체(예를 들어, CAR)가 있는 T 세포와 같은 세포를 조작하기 위한 공정에 나중에 사용하기 위해 성분채집술 샘플을 냉동 보존하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 프로세스는 본원에 기술된 프로세스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 성분채집술 샘플은 대상체로부터 수집되고 사전 후속 T 세포 선택, 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염, 인큐베이션, 배양, 수확, 세포 집단의 제형화, 및/또는 대상체에 제형화된 세포 집단의 투여 전에 동결 보존된다. 이러한 예에서, 동결 보존된 성분채집술 샘플은 본원에 기술된 것으로서 임의의 것과 같이 하나 이상의 선택 단계에 적용하기 전에 해동된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 사전 세포 선택을 받지 않은(예를 들어, 크로마토그래피에 의한 선택과 같은 사전 T 세포 선택 없이) 세포의 샘플과 같은 동결 보존 및/또는 동결 보호된 세포 샘플(예를 들어, 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 샘플)은 예를 들어 CAR+ T 세포를 포함하는 T 세포 집단과 같은 세포 요법을 위한 세포 집단의 제조를 위한 다운스트림 프로세싱에 사용하기 전에 해동된다. 일부 구현예에서, 이러한 동결 보존 및/또는 동결 보호된 세포 샘플(예를 들어, 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 샘플)은 CAR+ T 세포 요법과 같은 조작된 T 세포 요법을 위해 본원에 제공된 공정과 관련하여 사용된다. 특정 예에서, 수확/제형화 단계 이전 또는 동안에 동결보존의 추가 단계는 수행되지 않는다.
B. 크로마토그래피에 의한 세포 선택
본원에 제공된 방법의 측면에서, 샘플의 세포, 예를 들어 T 세포는 크로마토그래피 단리, 예컨대 친화성 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 선택된다. 일부 구현예에서, 방법은 표적 세포, 예를 들어 단리, 선택 또는 농축될 세포의 표면에 위치하는 선택 마커에 결합하는 선택 제제를 사용한다. 이러한 방법은 (흔적없는(traceless)) 세포 친화성 크로마토그래피 기술 (CATCH)로 기술될 수 있으며, PCT 출원번호 WO2013124474 및 WO2015164675에 기술된 임의의 방법 또는 기술을 포함할 수 있으며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에 있어서, 동결 보존 및/또는 동결 보호된 성분채집술 산물 또는 백혈구 성분채집술 산물은 해동된다. 일부 구현예에서, 해동된 세포 조성물은 희석(예를 들어, 무혈청 배지로) 및/또는 세척(예를 들어, 무혈청 배지로)되며, 이는 일부 경우에 원치 않거나 원하지 않는 성분을 제거하거나 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 희석 및/또는 세척은 동결보호제, 예를 들어 해동된 샘플에 함유된 DMSO의 존재를 제거하거나 감소시키며, 그렇지 않을 경우 장기간 실온 노출 시 세포 생존력, 수율, 회복에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 희석 및/또는 세척은 해동된 동결보존된 산물을 본원의 섹션 III 또는 본원의 참조로써 포함된 PCT/US2018/064627에 기술된 것과 같은 무혈청 배지로 배지 교환을 허용한다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물이 보충된 기본 배지 (예를 들어, OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher),를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물은 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 세포(예를 들어, T 세포)의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분, 예를 들어 추가적 보충물 (예를 들어, OpTmizer ™ T- 세포 증폭 보충물 (ThermoFisher))에 의해 제공되는 것으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체물, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체물, 또는 문헌[Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체물을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 L-글루타민과 같은 유리 형태의 아미노산을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무 혈청 배지는 Glutamax™ (ThermoFisher)의 디펩타이드와 같은 디펩타이드 형태의 L-글루타민(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15와 같은 하나 이상의 재조합 사이토카인을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 표적 세포는 세포 표면 상에 본원에 기술된 바와 같은 선택 마커를 갖거나 발현하여, 단리, 선택 또는 농축될 세포가 하나 이상의 공통 특정 수용체 분자의 존재에 의해 정의된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 또한 선택 마커가 없는 추가 세포를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예서, T 세포는 다중 세포 유형, 예를 들어 적혈구 또는 B 세포를 함유하는 샘플로부터 선택, 분리 또는 농축된다.
일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 크로마토그래피 컬럼에 포함되고, 예를 들어 상기 크로마토그래피 매트릭스에 직접 또는 간접적으로 결합된다(예를 들어, 정지 상). 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 상기 샘플이 상기 컬럼에 첨가될 때 상기 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)에 존재한다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 시약, 예를 들어 본원, 예를 들어 섹션 II-A에 기재된 바와 같은 선택 시약을 통해서 크로마토그래피 매트릭스 (예를 들어, 정지 상)에 간접적으로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 선택 시약은 상기 컬럼의 상기 정지 상에 공유 또는 비공유 결합된다. 일부 구현예에서, 상기 선택 시약은 상기 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상) 상에 가역적으로 고정된다. 일부 경우, 상기 선택 시약은 상기 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상) 상에 공유결합을 통해 고정된다. 일부 측면에서, 상기 선택 시약은 비공유적으로 상기 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상) 상에 가역적으로 고정된다.
일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 예를 들어 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 컬럼 (예를 들어, 정지 상)에 첨가될 때 상기 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상) 상에 직접적(예를 들어 공유 또는 비공유) 또는 선별 시약을 통하여 간접적으로 결합하여 존재할 수 있다. 따라서 상기 샘플을 첨가하면 표적 세포는 상기 선택 제제에 의해 결합되고 상기 컬럼의 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상) 상에 고정될 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 상기 샘플에 첨가될 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 선택 제제는 상기 샘플에서 표적 세포(예를 들어, T 세포)에 결합하고, 상기 샘플은 상기 선택 시약을 포함하는 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)에 첨가될 수 있으며, 여기서 상기 선택 제제는 이미 상기 표적 세포에 결합되며, 상기 선택 시약에 결합하고, 이에 의해 상기 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상) 상에 상기 표적 세포를 고정한다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제는 상기 선택 제제에 포함된 본원에 기술된 바와 같은 결합 파트너 C를 통해, 예를 들어 섹션 II-A 및 섹션 II-B에 기술된 바와 같이 본원에 기술된 상기 선택 시약에 결합한다.
일부 측면에서, 상기 선택 제제는 상기 샘플에 첨가된다. 특정 구현예에서, 상기 선택 제제는 예를 들어 상기 표적 세포인 세포 표면 상에 수용체 분자(예를 들어 선택 마커)에 특이적으로 결합하는 결합 부위(binding site) B를 갖는다. 예를 들어, 섹션 II-B 및 이하를 참조하라. 일부 측면에서, 상기 선택 제제는 또한 선택 시약의 결합 부위 Z에 특이적이고 가역적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C를 포함한다.
특정 측면에서, 상기 선택 시약은 또한 결합 파트너 C에 의해 결합될 수 있는 2 개 이상의 결합 부위 Z를 함유하여 상기 수용체 결합 시약의 다량체화(multimerization)를 제공할 수 있다. 본원에서 사용된 이 선택 시약은 또한, 다량체화 시약일 수 있다. 상기 선택 시약은 예를 들어, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 일부 측면에서, 상이한 크로마토그래피 매트릭스는 상이한 선택 시약에 커플링되고, 분리를 위한 다성분 시스템을 형성하는 컬럼에 적층될 수 있다.
일부 구현예에서, 2 개 이상의 선택 제제는 예를 들어 선택 시약에 존재하는 하나 또는 복수의 결합 부위 Z를 통해 상기 선택 시약에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합되는 것과 같이 결합한다. 일부 경우에, 이것은 세포 표면 분자(예를 들어, 선택 마커)를 (적어도 2부(two copies)) 갖는 표적 세포가 특정 분자(예를 들어, 선택 마커)에 결합할 수 있는 상기 선택 제제에 접촉되면 결합 효과가 발생할 수 있도록 상기 선택 제제가 서로 밀접하게 배열되도록 한다.
일부 구현예에서, 동일한, 즉 동일한 선택 마커 결합 특이성을 갖는 둘 이상의 상이한 선택 제제는 상기 선택 시약에 가역적으로 결합 될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 상이한 선택 제제, 및 일부 경우에는 상이한 선택 마커에 결합하는 3 개 또는 4 개의 상이한 선택 제제를 사용하는 것이 가능하다. 일부 측면에서, 적어도 2개의 선택 제제 각각은 제1 분자, 제2분자 등과 같은 상이한 분자(예를 들어, 선택 마커)에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 세포 표면 분자와 같은 상기 상이한 분자(예를 들어, 선택 마커)는 동일한 표적 세포에 존재할 수 있다. 다른 경우에, 세포 표면 분자와 같은 상기 상이한 분자(예를 들어, 선택 마커)는 동일한 세포 집단에 존재하는 상이한 표적 세포에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 제3, 제4 등의 선택 제제는 각각 추가로 상이한 결합 부위를 함유하는 동일한 시약에 연관될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 2개 이상의 상이한 선택 제제는 동일한 결합 파트너 C를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 2개 이상의 상이한 선택 제제는 상이한 결합 파트너를 함유한다. 일부 측면에서, 제1 선택 제제는 상기 선택 시약 상에 존재하는 결합 부위 Z1에 특이적으로 결합 할 수 있는 결합 파트너 C1을 가질 수 있고, 제2 선택 제제는 상기 선택 시약에 존재하는 결합 부위 Z1 또는 결합 부위 Z2에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C2를 가질 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 상기 선택 시약에 의해 포함된 상기 복수의 결합 부위 Z는 상기 선택 제제에 포함된 결합 파트너 C1 및 C2에 각각 가역적으로 결합할 수 있는 결합 부위 Z1 및 Z2를 포함한다. 일부 구현예에서, C1 및 C2는 동일하고/거나 Z1 및 Z2는 동일하다. 다른 측면에서, 하나 이상 복수의 결합 부위 Z는 상이할 수 있다. 다른 측면에서, 하나 이상 복수의 결합 파트너 C는 상이할 수 있다. 각각의 결합 파트너 C가 하나의 결합 부위 Z를 가지고 특이적으로 결합하는 것과 같은 상호 작용을 할 수 있는 한, 결합 부위 Z를 함유하는 선택 시약과 호환되는 상이한 결합 파트너 C의 임의의 조합을 선택하는 것은 통상의 기술자의 수준 내이다.
특정 구현예에서, 상기 샘플, 예를 들어 상기 세포 및 상기 선택 시약을 함유하는 상기 샘플은 부착되거나(attached) 또는 고정된(immobilized) 선택 시약을 함유하는 크로마토그래피 매트릭스에 첨가되거나 접촉된다. 특정 측면에서, 상기 선택 시약은 상기 선택 제제의 결합 파트너 C에 특이적으로 결합하는 복수의 결합 부위 Z를 가진다. 특정 측면에서, 상기 선택 제제는 결합 파트너 C 및 결합 부위 Z 간의 상호작용에 의해 상기 선택 시약에 결합된다. 따라서, 일부 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 표적 세포는 상기 크로마토그래피 매트릭스 상에 상기 선택 시약의 상기 하나 이상의 결합 부위 Z 및 선택 제제의 상기 결합 부위 Z에 의해 형성된 상기 복합체를 통해 고정된다. 추가 측면에서, 상기 세포, 예를 들어 상기 표적 세포는 상기 크로마토그래피 매트릭스로부터 남아 있는 샘플을 헹구거나, 방출하거나, 세척함으로써 상기 샘플로부터 대폭 감소할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 선택 제제는 상기 세포를 함유하는 상기 샘플에 포함될 수 있거나, 예를 들어 상기 샘플이 상기 크로마토그래피 매트릭스에 첨가되기 전에 부착된 선택 또는 다량체화 시약에 결합하기 위해 상기 크로마토그래피 매트릭스에 적용되거나 접촉될 수 있다 .
일부 구현예에서, 결합 파트너 C 및 결합 부위 Z 간에 형성된 가역적 결합은 경쟁 제제 및/또는 자유 결합 제제에 의해 파괴될 수 있다. 일부 구현예에서, 경쟁 제제 및/또는 자유 결합 제제는 하나 이상의 결합 부위 Z에 대한 결합 파트너 C와의 결합에 경쟁할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 결합 파트너 C 및 상기 경쟁 제제 및/또는 자유 결합 제제는 상이하고, 상기 경쟁 제제 및/또는 자유 결합 제제는 상기 결합 파트너의 상기 친화도에 대비해 상기 하나 이상의 결합 부위 Z에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타낸다. 본원에 제공된 임의의 방법의 특정 측면에서, 상기 선택 시약에 상기 선택 제제의 결합을 파괴하기 위하여 상기 크로마토그래피 컬럼의 상기 정지 상에 경쟁 제제 및/또는 자유 결합 제제를 추가하는 것은 상기 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)로부터 상기 표적 세포(예를 들어, T 세포)를 분리하는데 필요하지 않다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 샘플의 표적 세포는 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 정지 상)로부터 남아 있는 샘플을 헹구거나, 방출하거나, 세척함으로써 샘플로부터 대폭 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, 1회 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6)의 세척 단계는 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 정지 상)으로부터 비결합 세포 및 파편을 제거하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 적어도 2번의 세척단계가 수행된다. 일부 구현예에서, 샘플은 1회 이상의 세착단계가 수행되기 전에 (약) 5, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분 동안 또는 적어도 5, 10, 15, 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분 동안 매트릭스에 침투하도록 허용된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분 동안, 또는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60분 동안, 또는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60분 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 120, 100, 90, 80, 70, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5 분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 또는 5분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 60분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 50분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 40분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 30분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 20분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 5 내지 10분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 10 내지 60분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 20 내지 60분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 30 내지 60분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 40 내지 60분 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 세척 단계는 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 50 내지 60분 이내에 수행된다.
일부 예에서, 다수 회의 선택 단계가 수행되고, 여기서 한 단계에서 양성 또는 음성 선택된 분획은 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 또 다른 선택 단계를 거친다. 특정 구현예에서, 선택, 단리, 및 농축을 위한 방법, 기술, 및 시약은 예를 들어 PCT 출원번호 WO2015164675에 기재되며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
일부 구현예에서, 단일 선택 단계는 샘플로부터 표적 세포(예를 들어, CD3+ T 세포)를 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 선택 단계는 싱글 크로마토그래피 컬럼에서 수행될 수 있다. 일부 예시에서, 단일 선택 단계는 다중 마커를 동시에 발현하는 세포를 대폭으로 감소시킬 수 있다. 마찬가지로, 여러 세포 유형은 동시에 양성 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 선택 단계가 반복되고 또는 1회 이상 수행되며, 여기서 한 단계로부터 양성 또는 음성 선택된 분획은 반복할 양성 또는 음성 선택과 같은 동일한 선택 단계를 거친다. 일부 예시에서, 단일 선택 단계는 반복 되고/거나 1 회 이상 수행되어, 예를 들어 선택된 세포의 순도를 증가시키고/거나 음성으로 선택된 분획으로부터 음성으로 선택된 세포를 추가로 제거 및/또는 대폭 감소시킨다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 2 회, 3 회, 4 회, 5 회, 6 회, 7 회, 8 회, 9 회, 10 회 또는 10 회 초과 수행된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 1회 내지 10회 사이로, 1회 내지 5회 사이로, 또는 3번 내지 4번 사이로 수행되고/거나 반복된다. 일부 구현예에서, 2회의 선택 단계가 수행된다.
세포 선택은 하나 이상 크로마토그래피 컬럼을 이용해 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼은 폐쇄 시스템에 포함된다. 일부 구현예에서, 폐쇄 시스템은 예를 들어 사용자(예를 들어, 인간) 입력을 최소화하거나 전혀 요구하지 않는 자동화된 폐쇄 시스템이다. 일부 구현예에서, 세포 선택은 순차적으로 수행된다(예를 들어, 순차적 선택 기술). 일부 구현예에서, 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼은 순차적으로 배열된다. 예를 들어, 제1 컬럼은 예를 들어 연결된 튜빙을 통해서 컬럼의 산출물(예를 들어, 용리액)이 제2 크로마토그래피 컬럼에 공급될 수 있도록 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 크로마토그래피 컬럼은 순차적으로 배열된다. 일부 구현예에서, 세포 선택은 순차적인 양성 및 음성 선택 단계를 수행함으로써 달성 될 수 있으며, 후속 단계는 이전 단계의 음성 및/또는 양성 분획을 추가 선택을 처리하고, 여기서 전체 공정은 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나를 농축시키기 위해 제1 선택이 수행되고, 제1 선택으로부터 비-선택된 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 다른 것을 농축시키기 위한 제2 선택을 위한 세포 공급원으로써 사용되는 순차적 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택은 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나 또는 둘 모두의 하위 집단, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+인 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 또는 이를 높은 수준으로 발현하는, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 세포를 농축시키기 위해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 제1 선택이 CD3+ 집단을 농축시키기 위해 수행되며, 선택된 세포가 CD3+ 집단을 농축시키기 위한 제2 선택을 위한 세포 공급원으로써 사용되는 순차적 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 제1선택이 제1 정지 상(예를 들어, 제 1 크로마토그래프 컬럼에서) 상에 CD3+ 집단을 농축시키기 위해 수행되고, 결합되지 않은 세포를 함유하는 흐름이 제 2 정지 상(예를 들어, 제2 크로마토 그래프 컬럼에서) 상에 CD3+ 집단을 농축시키기 위한 제2 선택을 위한 세포 공급원으로써 사용되며, 여기서 제1 및 제2 정지 상이 순차적으로 배열되는 순차 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택은 CD3+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 또는 이를 높은 수준으로 발현하는 세포, 예컨대 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+를 농축시키기 위해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 제1 선택이 CD3+ 집단을 농축시키기 위해 수행되며, 선택된 세포가 CD4+ 집단을 농축시키기 위한 제2 선택을 위한 세포 공급원으로써 사용되는 순차적 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택은 CD3+CD4+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 또는 이를 높은 수준으로 발현하는 세포, 예컨대 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+를 농축시키기 위해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 제1 선택이 CD3+ 집단을 농축시키기 위해 수행되며, 선택된 세포가 CD8+ 집단을 농축시키기 위한 제2 선택을 위한 세포 공급원으로써 사용되는 순차적 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 CD3+CD8+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 또는 이를 높은 수준으로 발현하는 세포, 예컨대 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+를 농축시키기 위해 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 예컨대 하나 이상의 표면 마커를 높은 수준으로 발현하거나 양성인 세포, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포와 같은, T 세포(예를 들어, CD3+ 세포)의 특정 하위 집단은 양성 또는 음성 순차적 선택 기술에 의해 선택되는 것이 고려된다.
일부 구현예에서, 세포 선택은 병행 수행된다(예를 들어, 병행 선택 기술). 일부 구현예에서, 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼은 병렬 배열된다. 예를 들어, 2개 이상의 컬럼은 예를 들어 샘플이 제1 컬럼을 통해 통과할 필요 없이, 샘플이 각 컬럼에 추가될 수 있도록 허용하는 튜빙을 통해 동시에 2개 이상의 컬럼에 로드될 수 있다. 예를 들어, 병행 선택 기술을 사용하는 세포 선택은 예를 들어 전체 공정이 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행되는 폐쇄 시스템에서, 양성 및/또는 음성 선택 단계를 동시에 수행함으로써 달성 될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 샘플이 2 개 이상의 크로마토그래피 컬럼에 로드되는 병행 선택에 적용되며, 여기서 각 컬럼은 세포 집단의 선택에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 개별적으로 CD3+, CD4+, 또는 CD8+ 집단의 선택에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 독립적으로 동일한 세포 집단의 선택에 영향을 미친다. 예를 들어, 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 CD3+ 세포의 선택에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 독립적으로 상이한 세포 집단들의 선택에 영향을 미친다. 예를 들어, 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 독립적으로 CD3+ 세포, CD4+ 세포, 및 CD8+ 세포의 선택에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 순차적 선택 기술을 사용하는 추가 선택 또는 선택들은 병행 선택을 통해 선택된 하나 또는 모든 세포 집단의 하위-집단을 농축시키기 위해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 선택된 세포는 중앙 기억 T (TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 또는 이를 높은 수준으로 발현하는 세포, 예컨대 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+에 대해 추가로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 병행 선택이 2개 이상의 컬럼 상에 CD3+ 집단을 농축시키기 위하여 영향을 받는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 CD3+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 또는 이를 높은 수준으로 발현하는 세포, 예컨대 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+를 농축시키기 위해 영향을 받을 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 선택이 2개 이상의 컬럼 상에 CD3+ 집단 및 CD4 집단을 농축시키기 위하여 각각 독립적으로 영향을 받는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택은 CD3+ 및 CD4+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 또는 이를 높은 수준으로 발현하는 세포, 예컨대 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+를 농축시키기 위해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 병행 선택이 CD3+ 집단 및 CD8+ 집단을 농축시키기 위하여 영향을 받는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 CD3+ 및 CD8+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 또는 이를 높은 수준으로 발현하는 세포, 예컨대 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+를 농축시키기 위해 영향을 받을 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 병행 선택이 CD4+ 집단 및 CD8+ 집단을 농축시키기 위하여 영향을 받는 병행 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 CD4+ 및 CD8+ 집단의 하위 집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포, 및/또는 하나 이상의 표면 마커에 양성이거나 또는 이를 높은 수준으로 발현하는 세포, 예컨대 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+를 농축시키기 위해 영향을 받을 수 있다. 일부 측면에서, 예컨대 하나 이상의 표면 마커를 높은 수준으로 발현하거나 양성인 세포, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포와 같은, T 세포(예를 들어, CD3+, CD4+, CD8+ 세포)의 특정 하위 집단은 양성 또는 음성 병행 선택 기술에 의해 선택되는 것이 고려된다. 일부 구현예에서, 순차적 또는 병행 선택 기술은 조합되어 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개 컬럼은 병행 선택을 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 2개 컬럼은 동일한 세포 유형(예를 들어, 동일한 선택 마커)을 선택한다. 일부 구현예에서, 2개 컬럼은 각각 CD3+ T 세포를 선택한다.
일반적으로, 정지 상(예: 선택 수지)의 결합 능력은 특정 수의 표적 모이어티, 예를 들어 T 세포와 같은 표적 세포를 선택하기 위해 얼마나 많은 정지 상이 필요한지에 영향을 미친다. 상기 결합 능력, 예를 들어, 정지 상(예를 들어, 선택 수지)의 mL 당 고정될 수 있는 표적 세포의 수는 하나 이상의 컬럼에서 포획된 표적 세포의 수를 결정하거나 제어하는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼이 본원에 개시된 온-컬럼 세포 선택 및 자극을 위해 사용될 수 있다. 여러 컬럼이 사용되는 경우 그것들을 순차적으로, 병렬로 또는 적절한 조합으로 배열 할 수 있다. 따라서 정지 상(예를 들어, 선택 수지)의 상기 결합 능력은 단일 컬럼 접근법에서 시약 양을 표준화하거나 다중 컬럼 접근법에서 각 컬럼에 대한 시약 양을 표준화하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 사용된 상기 정지 상의 상기 결합 능력은 과잉의 표적 세포가 정지 상에 로딩 될 때 주어진 용매 및 세포 농도 조건에서 정지 상에 결합된 표적 세포의 최대 수이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 능력은 정지 상 mL 당 표적 세포(예를 들어, T 세포) 1억 ± 2,500 만개 또는 약 1억 ± 2,500 만개이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 상기 정지 상(예를 들어, 선택 수지)의 상기 정적 결합 능력은 정지 상 mL 당 표적 세포 약 7,500 만 내지 약 1 억 2,500 만 개의 범위이다. 일 측면에서, 온-컬럼 세포 선택 및 자극을 위해 본원에 사용된 상기 정지 상의 상기 결합 능력은 정적 결합 능력이다. 일부 구현예에서, 상기 정적 결합 능력은 예를 들어, 특정 용매 및 세포 농도 조건에서 정지 상에 고정될 수있는 세포의 최대량이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 상기 정지 상(예를 들어, 선택 수지)의 상기 정적 결합 능력은 정지 상 mL 당 표적 세포 약 500만 내지 약 1억 개의 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 정적 결합 능력은 정지 상 mL 당 표적 세포(예를 들어, T 세포) (약) 1억 ± 2,500 만개이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 상기 정지 상(예를 들어, 선택 수지)의 상기 정적 결합 능력은 정지 상 mL 당 표적 세포 약 7,500 만 내지 약 1 억 2,500 만 개의 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상(예를 들어, 선택 수지)의 상기 정적 결합 능력은 정지 상 mL 당 표적 세포 약 1천만 내지 약 2천만개 사이, 약 2천만 내지 약 3천만개 사이, 약 3천만 내지 약 4천만개 사이, 약 4천만 내지 약 5천만개 사이, 약 5천만 내지 약 6천만개 사이, 약 6천만 내지 약 7천만개 사이, 약 7천만 내지 약 8천만개 사이, 약 8천만 내지 약 9천만개 사이, 약 9천만 내지 약 1억개 사이, 약 1억 내지 약 1억 천만개 사이, 약 1억 천만 내지 약 1억 2천만개 사이, 약 1억 2천만 내지 약 1억 3천만개 사이, 약 1억 3천만 내지 약 1억 4천만개 사이, 약 1억 4천만 내지 약 1억 5천만개 사이, 약 1억 5천만 내지 약 1억 6천만개 사이, 약 1억 6천만 내지 약 1억 7천만개 사이, 약 1억 7천만 내지 약 1억 8천만개 사이, 약 1억 8천만 내지 약 1억 9천만개 사이,약 1억 9천만 내지 약 2억개 사이일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 사용된 상기 정지 상의 상기 결합 능력은 결합되지 않은 표적 세포의 상당한 돌파( breakthrough)가 발생하기 전에 주어진 유동 조건(flow conditions) 하에서 정지 상에 결합하는 표적 세포의 수이다. 일 측면에서, 온-컬럼 세포 선택 및 자극을 위해 본원에 사용된 상기 정지 상의 결합 능력은 동적 결합 능력, 즉 샘플 적용 동안 패킹된 크로마토그래피 컬럼에서 작동 조건 하에서의 결합 능력이다. 일부 구현예에서, 상기 동적 결합 능력은 공지된 농도의 표적 세포를 함유하는 샘플을 로딩하고 플로우-쓰루(flow-through)를 모니터링함으로써 결정되며, 표적 세포는 결합되지 않은 표적 세포가 컬럼을 통과하기 전에 특정 중단점에 정지 상에 결합할 것이다. 일부 구현예에서, 상기 동적 결합 능력은 정지 상 mL 당 표적 세포(예를 들어, T 세포) (약) 1억 ± 2,500 만개이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 상기 정지 상(예를 들어, 선택 수지)의 동적 결합 능력은 정지 상 mL 당 표적 세포 7,500 만 내지 1 억 2,500 만 개 또는 약 7,500 만 내지 약 1 억 2,500 만 개 사이이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 상기 정지 상(예를 들어, 선택 수지)의 동적 결합 능력은 정지 상 mL 당 표적 세포 약 500만 내지 약 1억 개의 범위이다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상(예를 들어, 선택 수지)의 동적 결합 능력은 정지 상 mL 당 표적 세포 약 1천만 내지 약 2천만개 사이, 약 2천만 내지 약 3천만개 사이, 약 3천만 내지 약 4천만개 사이, 약 4천만 내지 약 5천만개 사이, 약 5천만 내지 약 6천만개 사이, 약 6천만 내지 약 7천만개 사이, 약 7천만 내지 약 8천만개 사이, 약 8천만 내지 약 9천만개 사이, 약 9천만 내지 약 1억개 사이, 약 1억 내지 약 1억 천만개 사이, 약 1억 천만 내지 약 1억 2천만개 사이, 약 1억 2천만 내지 약 1억 3천만개 사이, 약 1억 3천만 내지 약 1억 4천만개 사이, 약 1억 4천만 내지 약 1억 5천만개 사이, 약 1억 5천만 내지 약 1억 6천만개 사이, 약 1억 6천만 내지 약 1억 7천만개 사이, 약 1억 7천만 내지 약 1억 8천만개 사이, 약 1억 8천만 내지 약 1억 9천만개 사이,약 1억 9천만 내지 약 2억개 사이일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 정지 상은 20mL이다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상은 20억 ± 5억개 세포의 결합 능력을 갖는다.
임의의 물질은 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)로써 채용될 수 있다. 일반적으로, 적합한 크로마토그래피 물질은 필수적으로 무해하며, 즉 원하는 조건 하에서 패킹된 크로마토그래피 컬럼에서 사용될 때와 같이 세포 생존력에 해롭지 않다. 일부 실시예에서, 상기 정지 상은 미리 정의된 적소(position)와 같은 미리 정의된 위치(location)에 남아있는 반면, 샘플의 위치(location)는 변경된다. 따라서, 일부 구현예에서 상기 정지 상은 이동상이 플로우-쓰루(flow through)에 의해 또는 배치 모드로) 통과하며, 상 사이에 (용해된 또는 분산된) 액체상에 함유된 성분의 분포가 발생하는 크로마토그래피의 일부이다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스는 고상 또는 반고상 형태를 갖는 반면에, 단리/분리될 표적 세포를 함유하는 샘플은 유체상이다. 크로마토그래피 매트리스는 미립자 물질(임의의 적절한 크기 및 형상) 또는 종이 기재 또는 멤브레인을 포함하는 모놀리식 크로마토그래피 물질일 수 있다. 따라서, 일부 측면에서 크로마토그래피는 평면 크로마토그래피 뿐만 아니라 컬럼 크로마토그래피일 수 있다. 일부 구현예에서, 표준 크로마토그래피 컬럼에 더하여, PhyNexus, Inc. San Jose, CA, U.S.A.에서 입수 할 수 있는 PhyTip®컬럼과 같은 양방향 흐름을 허용하는 컬럼 또는 파이펫 팁이 컬럼 기반/플로우 스루 모드 기반 방법에 사용할 수 있다. 따라서, 어떤 경우에는 파이펫 팁 또는 양방향 흐름을 허용하는 컬럼도 본 방법에 유용한 크로마토그래피 컬럼에 포함된다. 일부 경우, 예를 들어 미립자 매트릭스 물질이 사용되는 경우, 미립자 매트릭스 물질은 예를 들어 약 5μm 내지 약 200μm, 또는 약 5μm 내지 약 400μm, 또는 약 5 μm 내지 약 600 μm의 평균 입자 크기를 가질 수 있다. 일부 측면에서, 크로마토그래피 매트릭스는 예를 들어 폴리머 레진 또는 금속 산화물 또는 준금속 산화물이거나 또는 포함할 수 있다. 평면 크로마토그래피가 사용되는 경우와 같은 일부 측면에서, 매트릭스 물질은 통상적 인 셀룰로스-기반 또는 유기 폴리머 기반 멤브레인(예를 들어, 종이 멤브레인, 니트로셀룰로스 멤브레인 또는 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF) 멤브레인) 또는 실리카 코팅 유리판과 같은 평면 크로마토그래피에 적합한 임의의 물질일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스/정지 상은 비-자성 물질 또는 비-자화성(non-magnetizable) 물질이다.
일부 구현예에서, 본 방법에 적합한 비-자성 또는 비-자화성 크로마토그래피 정지 상은 유도된(derivatized) 실리카 또는 가교 결합된 겔을 포함한다. 일부 측면에서, 가교 결합된 겔은 자연에서 발생하는 폴리머 부류와 같은 천연 폴리머를 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 크로마토그래피 정지 상이 기반으로 할 수 있는 천연 폴리머는 다당류이다. 일부 경우에, 각각의 다당류는 일반적으로 가교된다. 다당류 매트릭스의 예는 아가로오스 겔(예를 들어, 상이한 비드 및 기공 크기로 시판되는 Superflow ™ Sepharose®와 같은 Superflow ™ 아가로오스 또는 Sepharose® 재료) 또는 가교된 덱스트란(들)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가의 구체적인 예시로는 덱스트란이 공유 결합된 미립자 가교 결합 아가로오스 매트릭스가 있으며, 이는 Sephadex® 또는 Superdex®로 (다양한 비드 크기 및 다양한 공극 크기로) 상업적으로 이용 가능하고, 모두 GE Healthcare에서 이용 가능하다. 이러한 크로마토그래피 물질의 또 다른 구체적인 예시로는 GE Healthcare로부터 상이한 비드 및 공극 크기로 또한 이용 가능한 Sephacryl®이 있다.
일부 구현예에서, 가교 결합된 겔은 자연에서 발생하지 않는 폴리머 부류와 같은 합성 폴리머를 기반으로 할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 크로마토그래피 정지 상이 기반으로 하는 그러한 합성 폴리머는 극성 모노머 유닛을 가지며 따라서 그 자체가 극성인 폴리머이다. 따라서, 일부 경우에서, 그러한 극성 폴리머는 친수성이다. 소유성이라고도 하는 친수성 분자는, 일부 측면에서 물 분자와 쌍극자-쌍극자 상호 작용을 형성할 수 있는 부분을 함유한다. 일반적으로, 친유성이라고도 하는 소수성 분자는, 물로부터 분리되는 경향이 있다.
일반적으로, 크로마토그래피 방법은 유체 크로마토그래피, 전형적으로 액체 크로마토그래피이다. 일부 측면에서, 크로마토그래피는, 세포, 예를 들어 표적 세포를 함유하는 유체 샘플이, 예를 들어 중력 흐름에 의해 또는 크로마토그래피 매트릭스를 함유하는 컬럼의 한쪽 말단에서 펌프에 의해 적용되고, 상기 유체 샘플이 컬럼의 나머지 말단의 컬럼에 존재하는 플로우 쓰루 모드(flow through mode)로 수행될 수 있다. 또한, 크로마토그래피는, 단리될 세포를 함유하는 유체 샘플이, 예를 들어 파이펫 팁 내에 패킹된 크로마토그래피 매트릭스를 함유하는 컬럼의 한쪽 말단에서 파이펫에 의해 적용되고, 상기 유체 샘플이 들어가서 컬럼의 나머지 다른 말단에 있는 크로마토그래피 매트릭스/파이펫 팁에 존재하는 “상하(up and down)” 방식으로 수행될 수 있다. 대안적으로, 상기 크로마토그래피는 또한 크로마토그래피 물질(정지 상)이, 예를 들어 흔들기, 회전 또는 예를 들어 파이펫에 의해 유체 샘플의 반복적인 접촉 및 제거 하에서 세포를 함유하는 샘플과 인큐베이션 되는 배치 모드(batch mode)로 수행될 수 있다.
일부 측면에서, 물질이 세포의 크로마토그래피 단리, 예를 들어 세포의 선택에 적합한 한, 임의의 물질이 본 발명의 맥락에서 크로마토그래피 매트릭스로 채용될 수 있다. 특정 측면에서, 적합한 크로마토그래피 물질은, 세포 단리 및/또는 세포 분리를 위해 원하는 조건 하에서 패킹된 크로마토그래피 컬럼으로 사용될 경우, 세포 생존 능력에 적어도 무해하거나 본질적으로 무해하거나, 예를 들어 유해하지 않다. 일부 측면에서, 크로마토그래피 매트릭스는 미리 정의된 위치(location), 전형적으로 미리 정의된 적소(position)에 남아있는 반면, 분리될 샘플 및 그 안에 포함된 성분의 위치는 변경된다. 따라서, 일부 측면에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스는 "정지 상(stationary phase)"이다.
전형적으로 각각의 크로마토그래피 매트릭스는 고상 또는 반-고상 형태를 갖는 반면에, 단리/분리될 표적 세포를 함유하는 샘플은 유체상이다. 크로마토그래피 분리를 달성하는데 사용되는 이동상은 마찬가지로 유체상이다. 크로마토그래피 매트리스는 미립자 물질(임의의 적절한 크기 및 형상) 또는 종이 기재 또는 멤브레인을 포함하는 모놀리식 크로마토그래피 물질일 수 있다. 따라서 크로마토그래피는 평면 크로마토그래피 및 컬럼 크로마토그래피 일 수 있다. 표준 크로마토그래피 컬럼 외에, 본원에 기재된 바와 같은 컬럼 기반/플로우 쓰루 모드 기반 세포의 크로마토그래피 분리를 위해 양방향 흐름 또는 파이펫 팁을 허용하는 컬럼이 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 미립자 매트릭스 물질이 사용되는 경우, 미립자 매트릭스 물질은 예를 들어 약 5μm 내지 약 200μm, 또는 약 5μm 내지 약 400μm, 또는 약 5 μm 내지 약 600 μm의 평균 입자 크기를 가질 수 있다. 일부 측면에서, 평면 크로마토그래피가 사용되고, 매트릭스 물질은 통상적인 셀룰로스-기반 또는 유기 폴리머 기반 멤브레인(예를 들어, 종이 멤브레인, 니트로셀룰로스 멤브레인 또는 폴리비닐리덴디플루오라이드(PVDF) 멤브레인) 또는 실리카 코팅 유리판과 같은 평면 크로마토그래피에 적합한 임의의 물질일 수 있다.
일부 측면에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스/정지 상은 비-자성 물질 또는 비-자화성 물질이다. 이러한 물질은 유도된 실리카 또는 가교 결합된 겔을 포함할 수 있다. (전형적으로 비드 형태로 제조된) 가교 결합된 겔은 가교결합된 다당류와 같은 천연 폴리머 기반일 수 있다. 적합한 예시는 아가로오스 겔 또는 가교 결합된 덱스트란(들)의 겔을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 가교 결합된 겔은 자연에서 발생하지 않는 폴리머 부류와 같은 합성 폴리머를 기반으로 할 수 있다. 일반적으로, 세포 분리를 위하여 크로마토그래피 정지 상이 기반으로 하는 폴리머인 그러한 합성 폴리머는 극성 모노머 유닛을 가지며, 따라서 그 자체가 극성인 폴리머이다.
적합한 합성 중합체의 예시적인 예는 폴리아크릴아미드(들), 스티렌-디비닐벤젠 겔 및 아크릴레이트 및 디올의 공중합체 또는 아크릴아미드 및 디올의 공중합체이다. 예시적인 예는 Fractogel®로 상업적으로 이용가능한, 폴리메타크릴레이트 겔이다. 추가 예는 Toyopearl®로 상업적으로 이용가능한, 에틸렌 글리콜 및 메타크릴레이트의 공중합체이다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 정지 상은 또한 천연 및 합성 폴리머 성분, 예컨대 복합 매트릭스 또는 복합물 또는 다당류 및 아가로오스의 공중합체, 예를 들어 폴리아크릴아미드/아가로오스 복합물 또는 다당류 및 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체를 포함할 수 있다. 덱스트란 및 N, N'-메틸렌비스아크릴아미드의 공중합체의 예시적인 예는 상기 언급된 Sephacryl® 계열 물질이다. 유도된 실리카는 합성 또는 천연 폴리머에 결합된 실리카 입자를 포함할 수 있다. 이러한 구현예의 예시는 다당류 그래프트된 실리카, 폴리비닐-피롤리돈 그래프트된 실리카, 폴리에틸렌 옥사이드 그래프트된 실리카, 폴리(2-히드록시에틸아스파트아미드) 실리카 및 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 그래프트된 실리카를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 채용되는 크로마토그래피 매트릭스는, 일부 구현예에서, 예를 들어 겔 여과(크기 배제로도 공지) 매트릭스이다. 겔 여과는 적어도 본질적으로 분리될 세포와 상호 작용을 하지 않도록 설계된 속성으로 특성화될 수 있다. 따라서, 겔 여과 매트릭스는 주로 크기를 기준으로 본원에 정의된 바와 같은 세포 또는 기타 생물학적 독립체의 분리를 가능하게 한다. 각각의 크로마토그래피 매트릭스는 상기 언급된 바와 같은 전형적으로 미립자 다공성 물질이다. 크로마토그래피 매트릭스는 특정 배제 한계를 가질 수 있으며, 이는 전형적으로 분자가 기공에 들어가는 것에서 완전히 배제되는 상기 분자량의 관점에서 정의된다. 크기 배제 한계를 정의하는 각각의 분자량은, 분리될 표적 세포(또는 생물학적 독립체)의 무게에 해당하는 무게 미만으로 선택될 수 있다. 상기 구현예에서, 표적 세포는 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스의 기공으로 들어가는 것이 방지된다. 마찬가지로, 친화도 크로마토그래피 매트릭스인 정지 상은 선택된 표적 세포의 크기보다 더 작은 크기의 기공을 가질 수 있다. 예시적인 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 매트릭스 및/또는 겔 여과 매트릭스는 0 내지 약 500 nm의 평균 기공 크기를 갖는다.
예컨대, 자극제 및/또는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)과 같은 샘플에 존재하는 다른 성분은 기공의 배제 한계 미만의 크기를 가질 수 있고, 이것은 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스의 기공에 들어갈 수 있게 한다. 기공 부피에 부분적으로 또는 완전히 들어갈 수 있는 상기 성분 중, 기공 부피에 덜 접근하는 보다 큰 분자는 일반적으로 먼저 용출되는 반면, 가장 작은 분자는 마지막에 용출된다. 일부 구현예에서, 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스의 배제 한계는 표적 세포의 최대 폭 미만이 되도록 선택된다. 그러므로, 기공 부피에 접근하는 성분은, 일반적으로 표적 세포 보다 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스 안/상에서 더 오래 머무를 것이다. 따라서, 표적 세포는 샘플의 다른 물질/성분과 별개로 크로마토그래피 컬럼의 용리액에서 수집될 수 있다. 따라서, 자극 시약과 같은 성분은 표적 세포보다 겔 여과 매트릭스에서 보다 나중 시점에 용출된다. 만일 겔 투과 매트릭스가 샘플에 존재하는 선택 시약 및/또는 경쟁 시약과 같은 시약에 결합할 수 있는 결합 부위, 예를 들어 결합 부위 Z를 포함하는 (일반적으로, 상기 상에 공유결합된) 선택 시약을 포함하는 경우 상기 분리 효과는 더 증가될 것이다. 선택 시약 및/또는 경쟁 시약은 친화도 시약의 결합 부위 Z에 의해 결합될 것이고, 이로써 겔 투과 매트릭스 상에 고정될 것이다. 상기 방법은 일반적으로 제거 카트리지에서 수행되고, 일부 구현예에서 본 발명에 따른 방법, 조합 및 키트는 이러한 겔 여과 매트릭스를 포함하고/거나 채용한다. 그러므로 각 방법에서, 세포는 크기를 기준으로 분리된다.
본 발명에 이용되는 크로마토그래피 매트릭스는 또한 하나 이상의 자기적 유인 가능 입자 또는 자성 유체와 같은 자기적 유인 가능 물질을 포함할 수 있다. 각각의 자기적 유인 가능 입자는 크로마토그래피 매트릭스 상에 표적 세포에 결합할 수 있고 고정되는 결합 부위를 갖는 선택 시약(예를 들어, 선택 제제)을 포함할 수 있다. 자기적 유인 가능 입자는 반자성, 강자성, 상자성 또는 초상자성 물질을 함유할 수 있다. 초상자성 물질은 영구 자화를 초래하지 않으면서 유도 자기장이 있는 자기장에 반응한다. 산화철을 기반으로 한 자성 입자는, 예를 들어 Dynal Biotech의 Dynabeads®, Miltenyi Biotec의 자성 마이크로비드, CPG Inc.의 자성 다공성 유리 비드뿐만 아니라 예컨대 Roche Applied Science, BIOCLON, BioSource International Inc., micromod, AMBION, Merck, Bangs Laboratories, Polysciences 또는 Novagen Inc.와 같은 다양한 다른 출처로부터 상업적으로 이용 가능하다. 초상자성 Co 및 FeCo에 기초한 자성 나노 입자 및 강자성 Co 나노 결정이, 예를 들어 문헌[Hutten, A. et al. (J.Biotech. (2004), 112, 47-63)]에 기재되어 있다. 그러나, 일부 구현예에서, 본 발명에 이용된 크로마토그래피 매트릭스는 임의의 자기적 유인 가능 물질이 없다.
선택 제제
전술한 바와 같이, 특정 측면에서, 본원에 제공된 방법은 선택 제제를 이용한다. 일부 구현예에서, 섹션 II-B에 기재된 바와 같은 제제는 선택 제제이다. 일부 구현예에서, 선택 제제는 세포 표면 분자와 같은 세포의 표면 상의 분자에 결합한다. 일부 예에서, 세포 표면 분자는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 선택 제제는 샘플에서 하나 이상의 세포에 의해 발현되는 선택 마커에 특이적으로 결합 할 수 있다. 일부 구현예에서, 개시 전체에 걸쳐 세포 표면 분자 또는 세포 표면 수용체와 같은 분자에 대한 특이적 결합에 대한 언급은 제제가 이러한 분자에만 결합한다는 것을 반드시 의미하지는 않는다. 예를 들어, 분자에 특이적으로 결합하는 제제는 일반적으로 예를 들어 면역 분석, BIAcore®, KinExA 3000 기기(Sapidyne Instruments, Boise, ID), 또는 기타 분석에 의해 결정된 훨씬 낮은 친화도로 다른 분자에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 특정 결합 조건 하에서, 표적 분자에 결합하는 제제의 능력, 그것의 친화성 또는 결합력(avidity)은 충분한 통계적 크기의 무작위 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 집합에 대한 동일한 제제의 평균 친화성 또는 결합력보다 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250 또는 500배 더 크거나 심지어 적어도 1000 배 더 큰 것과 같이 적어도 5 배가 더 크다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 표적 세포(예를 들어, T 세포)는 세포 표면 상에 분자, 예를 들어 선택 마커를 갖거나 발현하여, 선택될 세포가 적어도 하나의 공통 특정 분자(예를 들어, 선택 마커)의 존재에 의해 정의되도록 한다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플은 또한 분자(예를 들어, 선택 마커)가 없는 추가 세포를 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예서, T 세포는 다중 세포 유형, 예를 들어 적혈구 또는 B 세포를 함유하는 샘플로부터 선택될 수 있다. 선택 마커 및 수용체 분자는 세포 표면 분자를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 표면, 예를 들어 표적 세포 표면에 위치하는 선택 마커(예를 들어, 수용체 분자)는 본 발명에 따른 방법에서 크로마토그래피 분리 공정 동안에 그것이 세포 표면에 공유 또는 비공유 결합된 채로 남아 있는 한 임의의 분자 일 수 있다. 선택 마커(예를 들어, 수용체 분자)는 선택 제제가 지시될 수 있는 분자이다. 일부 구현예에서 선택 마커는 펩타이드 또는 단백질, 예를 들어 막 수용체 단백질이다. 일부 구현예 에서 선택 마커는 지질, 다당류 또는 핵산이다. 단백질인 선택 마커(예를 들어, 수용체 분자)는 외재성 막 단백질 또는 내재성 막 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서 막에 걸쳐있는 하나 이상의 도메인을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 선택 마커는 면역 세포의 표면 단백질, 예를 들어 CD3, CD4 또는 CD8이다. 일부 구현예에서 선택 마커는 원하는 세포 집단 또는 하위 집단, 예를 들어 혈액 세포의 집단 또는 하위 집단, 예를 들어 림프구(예를 들어, T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포)를 정의하는 항원일 수 있다.
일부 측면에서, 세포 표면 분자, 예를 들어 선택 마커는 원하는 세포 집단 또는 하위 집단, 예를 들어 혈액 세포의 집단 또는 하위 집단, 예를 들어 림프구(예를 들어, T 세포, 도움 T 세포, 예를 들어 CD3+ T 세포, CD8 T 세포, CD4+ 도움 T 세포, B세포 또는 자연살 세포), 단핵구, 또는 줄기세포, 예를 들어 CD34 양성 말초 줄기 세포 또는 Nanog 또는 Oct-4 발현 줄기 세포를 정의하는 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 T 세포 또는 T 세포의 서브 세트의 표면 상에 발현된 마커, 예컨대 CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA 및/또는 CD45RO일 수 있다. T 세포의 예로는 CMV 특이적 CD8+ T 림프구, 세포 독성 T 세포, 기억 T 세포 및 조절 T 세포(Treg)와 같은 세포가 포함된다. Treg의 예시적인 예는 CD4 CD25 CD45RA Treg 세포를 포함하고, 기억 T 세포의 예시적인 예는 CD62L CD8+ 특이적 중앙 기억 T 세포를 포함한다.
전술한 것과 같이, 일부 구현예에서, 선택 시약은 결합 부위 B를 갖거나 함유한다. 특정 구현예에서, 결합 부위 B는 1가이다. 일부 측면에서, 1가 결합 부위 B는 면역글로불린 유사 기능, 압타머 또는 MHC 분자를 가진 1가 항체 단편 또는 단백질성 결합 분자이거나 상기를 함유한다. 1가 항체 단편의 예는 Fab 단편, FV 단편 및 2가 단일 사슬 Fv 단편을 포함한 단일 사슬 Fv 단편(scFv)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. (재조합) 항체 단편의 예는 Fab 단편, FV 단편, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 2가 항체 단편, 예컨대 (Fab)2'-단편, 디아바디, 트리아바디(Iliades, P., et al., FEBS Lett (1997) 409, 437-441), 데카바디(Stone, E., et al., Journal ofImmunological Methods (2007) 318, 88–94) 및 기타 도메인 항체(Holt, L.J., et al., Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490)이다. 일부 구현예에서, 선택 제제의 하나 이상의 결합 부위는 "듀오칼린(duocalin)"으로도 공지된 이량체 리포칼린 뮤테인과 같은 2가 단백질성 인공 결합 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체 결합 시약은 단일 제2 결합 부위를 가질 수 있으며, 즉 1가일 수 있다. 1가 수용체 결합 시약의 예는, 1가 항체 단편, 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 결합 분자 또는 MHC 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
적합한 단백질성 결합 분자의 또 다른 예는 EGF 유사 도메인, 크링글 도메인(Kringle-domain), 피브로넥틴 유형 I 도메인, 피브로넥틴 유형 Ⅱ 도메인, 피브로넥틴 유형 Ⅲ 도메인, PAN 도메인, G1a 도메인, SRCR 도메인, Kunitz/Bovine 췌장 트립신 억제제 도메인, 텐다미스타트(tendamistat), Kazal-유형 세린 프로테아제 억제제 도메인, Trefoil(P-유형) 도메인, von Willebrand 인자 유형 C 도메인, 아나필라톡신 유사 도메인, CUB 도메인, 다이로글로블린(thyroglobulin) 유형 I 반복, LDL-수용체 클래스 A 도메인, Sushi 도메인, 결합 도메인, 트롬보스폰딘(Thrombospondin) 유형 I 도메인, 면역 글로불린 도메인 또는 면역 글로불린 유사 도메인 (예를 들어, 도메인 항체 또는 낙타 중쇄 항체), C-유형 렉틴 도메인, MAM 도메인, von Willebrand 인자 유형 A 도메인, 소마토메딘(Somatomedin) B 도메인, WAP-유형 4개의 이황화물 코어 도메인, F5/8 유형 C 도메인, 헤모펙신(Hemopexin) 도메인, SH2 도메인, SH3 도메인, 라미닌-유형 EGF 유사 도메인, C2 도메인, "카파바디(Kappabodies)"(Ill. et al., Protein Eng (1997) 10, 949-57 참조, 소위 "미니바디(minibody)"(Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309), 디아바디(Holliger et al., PNAS USA (1993)90, 6444-6448. 참조), 소위 “야누시스(Janusis)”(Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659 또는 Traunecker et al., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52. 참조), 나노바디, 마이크로바디, 아필린(affilin), 아피바디(affibody), 크노틴(knottin), 유비퀴틴, 아연-핑거 단백질, 자가 형광 단백질 또는 류신-리치 반복 단백질이다. 항체 유사 기능을 갖는 핵산 분자의 예는 압타머이다. 압타머는 정의된 3 차원 모티프로 접히고, 주어진 표적 구조에 대해 높은 친화도를 나타낸다.
특정 측면에서, 선택 제제는 결합 파트너 C를 함유한다. 일부 측면에서, 선택 제제에 포함된 결합 파트너 C는, 예를 들어 탄화수소 기반(중합체 포함)일 수 있고, 질소-, 인-, 황-, 카르벤-, 할로겐- 또는 슈도할로겐 기를 포함할 수 있다. 상기는 알코올, 유기산, 무기산, 아민, 포스핀, 티올, 이황화물, 알칸, 아미노산, 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 당류, 올리고당류 또는 다당류일 수 있다. 추가 예로서, 상기는 또한 양이온, 음이온, 다중 양이온, 다중 음이온, 다중 양이온, 전해질, 고분자 전해질, 탄소 나노튜브 또는 탄소 나노폼(nanofoam)일 수 있다. 일반적으로, 상기 결합 파트너는 다른 물질에 대해서 보다 선택 또는 다량체화 시약의 결합 부위에 대해 보다 높은 친화도를 갖는다. 각각의 결합 파트너의 예는 크라운 에테르, 면역글로불린, 이의 단편 및 항체 유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 선택 제제에 포함된 결합 파트너 C는 비오틴을 포함하고, 선택 시약은 비오틴에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 제제에 포함된 결합 파트너 C는 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체를 포함하고, 선택 시약은 각각의 비오틴 유사체에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 제제에 포함된 결합 파트너 C는 스트렙타비딘 또는 아비딘 결합 펩타이드를 포함하고, 선택 시약은 각각의 스트렙타비딘 또는 아비딘 결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 제제에 포함된 결합 파트너는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드 서열은 일반적인 화학식 His-Pro-Xaa(여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴 또는 메티오닌)를 갖는 서열을 함유하고, 예컨대 서열 번호: 9에 제시된 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 서열은 예컨대 서열 번호: 12에 제시된 서열과 같은 서열 번호: 11에 제시된 일반식(formula)을 가진다. 일 예에서, 펩타이드 서열은 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(Strep-tag®라고도 함, 서열 번호: 7에 제시)이다. 일 예에서, 펩타이드 서열은 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(Strep-tag® Ⅱ라고도 함, 서열 번호: 8에 제시)이고, 이는 미국 특허 6,103,493에 기재되어 있고, 예를 들어 Strep-Tactin® 상표로 시판된다. 스트렙타비딘 결합 펩타이드는, 예를 들어 문헌[미국 특허5,506,121에 기재된 "Strep-tag®"와 같은 단일 펩타이드 또는 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 02/077018 또는 미국 특허 7,981,632]에 기재된 바와 같은 2개 이상의 개별 결합 분자의 순차적 배열을 갖는 스트렙타비딘 결합 펩타이드일 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 시약의 결합 파트너 C는 친화도 태그로서 당업자에게 공지된 모이어티를 포함한다. 상기 구현예에서, 선택 시약은 상응하는 결합 파트너, 예를 들어 친화도 태그에 결합하는 것으로 공지된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 공지된 친화도 태그의 몇 가지 예시적인 예로서, 선택 시약에 포함된 결합 파트너는 디니트로페놀 또는 디곡시게닌, 올리고히스티딘, 폴리히스티딘, 면역글로불린 도메인, 말토오스-결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase, GST), 키틴 결합 단백질(chitin binding protein, CBP) 또는 티오레독신, 칼모둘린 결합 펩타이드(calmodulin binding peptide, CBP), FLAG'-펩타이드, HA-태그, VSV-G- 태그, HSV-태그, T7 에피토프, 말토오스 결합 단백질(MBP), 단순 포진 바이러스 당단백질 D 서열의 HSV 에피토프, 전사 인자 c-myc 서열의 "myc" 에피토프, V5-태그 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 선택 시약의 하나 이상의 결합 부위 사이에 형성된 복합체, 이 경우 항체 또는 항체 단편, 및 항원은 자유 항원, 즉 자유 펩타이드(에피토프 태그) 또는 자유 단백질(예컨대 MBP 또는 CBP)을 첨가함으로써 경쟁적으로 파괴될 수 있다. 친화도 태그는 올리고뉴클레오티드 태그일 수도 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 태그는, 예를 들어, 선택 시약에 연결되거나 포함된 상보적 서열을 가진 올리고뉴클레오티드와 혼성화하는 데 사용될 수 있다.
국제 특허 출원 PCT/EP2012/063969(WO 2013/011011로 공개)에 따라(모든 목적을 위해 이의 전문이 여기에 참조로 포함됨), 선택 제제와 표적 세포 상의 선택 마커 사이의 결합 강도는, 선택 제제를 통해 선택 시약에 대한 표적 세포의 결합 가역성에 필수적이지 않을 수 있다. 오히려, 결합의 강도와 관계없이, 결합 부위 B를 통한 선택 제제와 선택 마커 사이의 결합에 대한 해리 상수(KD)가, 예를 들어, 약 10-3 내지 약 10-7M 의 KD 범위로 낮은 친화성인지, 예를 들어, 약 10-7 내지 약 1 Х 10-10 M의 KD 범위로 높은 친화도인지를 의미하며, 표적 세포는 결합 부위 B를 통한 선택 시약과 수용체 분자의 결합의 해리가 충분히 빠르게 발생하는 한 가역적으로 염색될 수 있다. 이와 관련하여 결합 부위 B를 통한 선택 제제와 선택 제제 사이의 결합에 대한 해리 속도 상수(koff)는 약 3 Х 10-5sec-1 이상의 값을 가질 수 있다(상기 해리 속도 상수는 선택 제제의 결합 부위 B와 표적 세포 표면 상의 선택 마커 사이에 형성된 복합체의 해리 반응을 특징짓는 상수이다). 선택 제제의 결합 부위 B와 표적 세포 표면 상의 선택 마커 사이의 결합 반응에 대한 결합 속도 상수(kon)는 임의의 값을 가질 수 있다. 선택 마커와 선택 제제 사이의 충분히 가역적인 결합을 보장하기 위해, 약 3 Х 10-5 sec-1 이상, 약 5 Х 10-5 sec-1 이상, 예컨대 (약) 1 Х 10-4 sec-1 이상, 5 Х 10-4 sec-1 이상, 1 Х 10-3 sec-1 이상, 5 Х 10-3 sec-1 이상, 1 Х 10-2 sec-1 이상, 1 Х 10-1 sec-1 이상 또는 5 Х 10-1 sec-1 이상의 값을 갖는 결합 평형의 koff 값을 선택하는 것이 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 동역학 및 열역학 상수의 값은 대기압, 즉 1.013 bar 및 실온, 즉 25 ℃의 조건을 의미한다는 점에 유의한다.
일부 구현예에서, 선택 제제는 선택 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 단일(1가) 결합 부위 B를 갖는다. 일부 구현예에서, 선택 제제는 선택 마커에 결합할 수 있는 2개 이상(즉, 3, 4 또는 또한 5개의 동일한 결합 부위 B를 포함하는 복수의 결합 부위 B)을 갖는다. 상기 임의의 구현예에서, 결합 부위(들) B (각각)을 통한 선택 마커의 결합은 약 3 Х 10-5 sec-1 이상의 koff 값을 가질 수 있다. 따라서, 선택 제제는 1가(예를 들어 1가 항체 단편 또는 1가 인공 결합 분자(단백질 또는 기타), 예컨대 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드("Anticalin®"으로도 공지)에 기초한 뮤테인 또는 두 결합 부위가 유지되는 항체 또는 단편과 같은 2가 분자, 예컨대 F(ab')2 단편일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체 분자는 3 Х 10-5 sec-1 이상의 koff 속도를 제공하는 펜타머 IgE 분자와 같은 다가 분자일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본원에 기재된 가역적인 세포 친화도 크로마토그래피 기술을 통한 생물학적 물질의 (흔적이 없는) 단리를 제공하는 것은 표적 세포 상의 선택 마커와 적어도 결합 부위 B를 통한 선택 제제의 결합의 koff 속도(3 Х 10-5 sec-1 이상)가 아닌 분자 수준 상에서 이다. 오히려, 예를 들어 문헌[미국 특허 7,776,562 또는 국제 특허 출원 WO02/054065]에 기재된 바와 같이, 고정된 선택 시약을 통해 매개된 결합 효과와 함께 선택 제제의 결합 부위 B와 선택 마커 사이의 낮은 친화도 결합은 표적 세포의 가역적이고 흔적 없는 단리를 허용한다. 상기 구현예에서, 선택 시약의 2개 이상의 결합 부위 Z와 2개 이상의 선택 제제의 결합 파트너 C 사이에 복합체를 형성할 수 있고, 친화도 크로마토그래피 매트릭스에서 표적 세포의 가역적인 고정을 허용한다. 전술된 것과 같이, 상기 낮은 결합 친화도는, 결합 부위 B를 통한 선택 제제와 표적 세포 표면 상의 선택 마커의 결합에 대해 약 1.0 Х 10-3 M 내지 약 1.0 Х 10-7 M 범위의 해리 상수(KD)로 특징지어질 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD4 일 수 있고, 선택 제제는 CD4에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD4에 특이적으로 결합하는 선택 제제는, 항-CD4 항체, 항-CD4 항체의 2가 항체 단편, 항-CD4 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD4 결합 분자로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD4 항체, 예컨대 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편(예를 들어 CD4 Fab 단편)은 13B8.2 항체 또는 CD4에 대한 특이적 결합을 유지하는 13B8.2의 기능적 활성 뮤테인에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 13B8.2 항체 또는 m13B8.2의 예시적인 뮤테인은 문헌[미국 특허 번호 7,482,000, 미국 특허 출원 번호 US2014/0295458 또는 국제 특허 출원 번호 WO2013/124474; 및 Bes, C, et al. J Biol Chem 278, 14265-14273 (2003)]에 기재되어 있다. “ml3B8.2"로 명명된 뮤테인 Fab 단편은, 문헌[미국 특허 7,482,000]에 기재된 바와 같이, CD4 결합 뮤린 항체 13B8.2의 가변 도메인 및 중쇄에 대해 감마 유형의 인간 불변 CH1 도메인 및 카파 유형의 인간 불변 경쇄 도메인을 함유하는 불변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD4 항체, 예를 들어 13B8.2 항체의 뮤테인은, 카바트(Kabat) 넘버링에 의해 각각, 가변 경쇄에서 H91A 아미노산 대체, 가변 경쇄에서 Y92A 아미노산 대체, 가변 중쇄에서 H35A 아미노산 대체 및/또는 가변 중쇄에서 R53A 아미노산 대체를 함유한다. 일부 측면에서, ml3B8.2에서 13B8.2 Fab 단편의 가변 도메인에 비해, 경쇄의 91번 위치(서열 번호: 30의 93번 위치)에서 His 잔기가 Ala으로 돌연변이되고, 중쇄의 53번 위치(서열 번호: 29의 55번 위치)에서 Arg 잔기는 Ala으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 항-CD4 또는 이의 단편에 가역적으로 결합하는 시약은 상업적으로 이용 가능하거나 상업적으로 이용 가능한 시약(예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-206 또는 6-8000-205 또는 6-8002-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 선택 제제는 항-CD4 Fab단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD4 Fab 단편은 서열 번호: 29에 제시된 가변 중쇄 및 서열 번호: 30에 제시된 가변 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD4 Fab 단편은 서열 번호: 29에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄의 CDRs 및 서열 번호: 30에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄의 CDRs를 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD8 일 수 있고, 선택 제제는 CD8에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD8에 특이적으로 결합하는 선택 제제는, 항-CD8 항체, 항-CD8 항체의 2가 항체 단편, 항-CD8 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD8 결합 분자로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD8 항체, 예컨대 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편(예를 들어 CD8 Fab 단편)은 OKT8 항체(예를 들어 ATCC CRL-8014) 또는 CD8에 대한 특이적 결합을 유지하는 기능적 활성 뮤테인에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD8 또는 이의 단편에 가역적으로 결합하는 시약은 상업적으로 이용 가능하거나 상업적으로 이용 가능한 시약(예를 들어 카탈로그 번호 6-8003 또는 6-8000-201; IBA GmbH, Gottingen, Germany)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 선택 제제는 항-CD8 Fab단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD8 Fab 단편은 서열 번호: 36에 제시된 가변 중쇄 및 서열 번호: 37에 제시된 가변 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD8 Fab 단편은 서열 번호: 36에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄의 CDRs 및 서열 번호: 37에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄의 CDRs를 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 마커는 CD3 일 수 있고, 선택 제제는 CD3에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD3에 특이적으로 결합하는 선택 제제는, 항-CD3 항체, 항-CD3 항체의 2가 항체 단편, 항-CD3 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD3 결합 분자로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체, 예컨대 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편(예를 들어 CD3 Fab 단편)은 OKT3 항체(예를 들어 ATCC CRL-8001; 예를 들어 Stemberger et al. PLoS One. 2012; 7(4): e35798 참조) 또는 CD3에 대한 특이적 결합을 유지하는 기능적 활성 뮤테인에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3 또는 이의 단편에 가역적으로 결합하는 시약은 상업적으로 이용 가능하거나 상업적으로 이용 가능한 시약(예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-201,6-8001-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany)에서 유래된다. 일부 구현예에서, 선택 제제는 항-CD3 Fab단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab 단편은 서열 번호: 31에 제시된 가변 중쇄 및 서열 번호: 32에 제시된 가변 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab 단편은 서열 번호: 31에 제시된 서열을 갖는 가변 중쇄의 CDRs 및 서열 번호: 32에 제시된 서열을 갖는 가변 경쇄의 CDRs를 포함한다.
임의의 상기 예에서, 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 임의의 상기 예에서, 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩타이드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)일 수 있다.
C. 온-컬럼 자극
본원에서 제공된 방법은 자극과 컬럼 크로마토그래피 단계에 의한 세포 선택을 조합하는 것을 포함한다. 따라서, 특정 측면에서, 자극은 세포가 컬럼 상에 고정 될 때(예를 들어, 선택 제제에 의해) 선택 단계의 적어도 일부 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 컬럼이 선택을 위해 사용되고, 자극은 각 컬럼 상에서 수행된다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 컬럼이 선택을 위해 사용되고, 자극은 총 컬럼 수 보다 적은 수에 대해서 수행된다. 일부 구현예에서, 2 개 이상의 컬럼이 선택을 위해 사용되고, 자극은 적어도 하나의 컬럼 상에서 수행된다. 일부 구현예에서, 병행 선택이 사용되고, 자극은 각 컬럼 상에서 수행된다. 일부 구현예에서, 병행 선택이 사용되고, 자극은 적어도 하나의 컬럼 상에서 수행된다. 일부 구현예에서, 순차적 선택이 사용되고, 자극은 각 컬럼 상에서 수행된다. 일부 구현예에서, 순차적인 선택이 사용되고, 자극은 적어도 하나의 컬럼 상에서 수행된다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 세포, 예를 들어 CD3+, CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 신호, 예컨대 TCR 및/또는 공수용체에서 생성된 신호를 자극 또는 활성화시키고/거나 자극 또는 활성화시킬 수 있는 조건을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극 조건은 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상) 상에 고정된 표적 세포 (예를 들어, T 세포)를 자극제, 예를 들어 자극 신호를 전달하거나 자극 신호를 전달할 수 있어서 선택된 세포를 자극시키는 제제, 또는 올리고머 자극 시약과 같은 자극제를 포함하는 자극 시약과 함께 배양하거나 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극제는 TCR 및/또는 공동자극분자에 결합하고 자극하며/하거나 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 예를 들어, 섹션 I-C-1a에 기재된 바와 같이 본원에 제공된 올리고머 자극 시약이다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에서 세포 집단의 자극은 선택 및 자극된 세포의 집단(본원에서 세포의 자극된 집단으로도 지칭)을 생성하거나 생산한다. 선택 및 자극된 세포의 집단은 본원에서 자극 및 선택된 세포의 산출 집단으로서 지칭될 수 있다. 일부 경우, 선택 및 자극된 세포의 집단은 투입 집단으로써 사용되거나, 다운스트림 프로세싱, 예를 들어 섹션 I-E에 기재된 바와 같은 유전자 조작을 위한 투입 집단으로서 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플의 세포는 세포에 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 도입시키기 전에, 예를 들어 본원, 예컨대 섹션 I-E에 기술된 방법, 단계, 또는 기술에 의해 선택 및 자극된다. 일부 구현예에서, 선택 및 자극된 세포의 산출 집단은 이종 또는 재조합 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체)을 발현하기 위해 조작된다.
일부 구현예에서, 자극은, 집단의 세포가 세포에 신호, 예컨대 TCR 및/또는 공수용체에서 생성된 신호를 자극 또는 활성화시키고/거나 자극 또는 활성화시킬 수 있는 조건에 처음 노출되거나 자극된 경우 개시될 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 자극은 세포가 자극제 또는 자극시약, 예컨대 섹션 I-C-1a 및/또는 섹션 II-A와 같은 본원에 개시된 자극제를 함유하는 섹션 II-A 및/또는 섹션 I-C-1b에 기술된 것에 처음 접촉되거나 노출되었을 때 개시된다. 특정 측면에서, 상기 자극(본원에 인큐베이션의 개시로도 지칭됨)의 개시는 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)에 고정된 샘플의 표적 세포(예를 들어 T 세포)가 자극제 또는 (예를 들어, 올리고머 자극 시약, 예컨대 섹션 I-C-1b 아래에 기술된 것과 같은) 자극제를 함유하는 자극 시약에 처음 접촉되거나 이에 노출된 경우 발생한다. 일부 구현예에서, 세포는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극시약) 또는 자극제의 첨가 전에 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100 또는 120분 동안 컬럼에 침투되도록 허용된다. 일부 구현예에서, 컬럼은 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극시약) 또는 자극제의 첨가 전에 적어도 1(1, 2, 3, 4, 5)회 이상 세척된다. 일부 구현예에서, 컬럼은 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극시약) 또는 자극제의 첨가 전에 적어도 두 번 세척된다.
일부 구현예에서, 상기 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분에, 또는 적어도 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분에 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후 (약) 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분에, 또는 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 120 분에 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 크로마토그래피 컬럼(예를 들어 정지 상)에 첨가된 후, (약) 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60분에, 또는 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60분에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 15 내지 약 120분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 15 내지 약 100분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 15 내지 약 90분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 15 내지 약 80분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 15 내지 약 70분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 15 내지 약 60분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 15 내지 약 50분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 15 내지 약 40분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 15 내지 약 30분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 30 내지 약 120분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 30 내지 약 100분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 30 내지 약 90분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 30 내지 약 80분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 30 내지 약 70분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 30 내지 약 60분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 30 내지 약 50분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 샘플이 컬럼에 첨가된 후 약 30 내지 약 40분 사이에 첨가된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 세척 단계는 컬럼에 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)를 첨가하기 전에 수행된다.
일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건에서 고정된 세포를 인큐베이션 하는 것은 (약) 1일 동안, 또는 1일 미만 동안에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건에서 고정된 세포를 인큐베이션 하는 것은 (약) 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 시간 동안, 또는 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 시간 미만 동안에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건에서 고정된 세포를 인큐베이션 하는 것은 (약) 2 내지 24 시간, 3 내지 24 시간, 4 내지 24 시간, 5, 내지 24 시간, 6 내지 24 시간, 7 내지 24 시간, 8 내지 24 시간, 9 내지 24 시간, 10 내지 24 시간, 11 내지 24 시간, 12 내지 24 시간, 13 내지 24 시간, 14 내지 24 시간, 15 내지 24 시간, 16 내지 24 시간, 17 내지 24 시간, 18 내지 24 시간, 19 내지 24 시간, 20 내지 24 시간, 21 내지 24 시간, 22 내지 24 시간, 23 내지 24 시간, 2 내지 23 시간, 2 내지 22 시간, 2 내지 21 시간, 2 내지 20 시간, 2 내지 19 시간, 2 내지 18 시간, 2 내지 17 시간, 2 내지 16 시간, 2 내지 15 시간, 2 내지 14 시간, 2 내지 13 내지, 2 내지 12 시간, 2 내지 11 시간, 2 내지 10 시간, 2 내지 9 시간, 2 내지 8 시간, 2 내지 7 시간, 2 내지 6 시간, 2 내지 5 시간, 2 내지 4 시간, 또는 2 내지 3 시간 사이에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건에서 고정된 세포를 인큐베이션 하는 것은 (약) 24시간 동안, 또는 적어도 24시간 동안에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건에서 고정된 세포를 인큐베이션 하는 것은 (약) 12시간 동안, 또는 적어도 12시간 동안에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건에서 고정된 세포를 인큐베이션 하는 것은 (약) 5시간 동안, 또는 적어도 5시간 동안에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건에서 고정된 세포를 인큐베이션 하는 것은 (약) 4.5시간 동안, 또는 적어도 4.5시간 동안에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건에서 고정된 세포를 인큐베이션 하는 것은 (약) 4시간 동안, 또는 적어도 4시간 동안에 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건에서 고정된 세포를 인큐베이션 하는 것은 (약) 2시간 동안, 또는 적어도 2시간 동안에 수행된다.
특정한 구현예에서, 샘플로부터 선택된 50 x 106, 100 x 106, 150 x 106, 200 x 106, 250 x 106, 300 x 106, 350 x 106, 400 x 106, 450 x 106, 500 x 106, 550 x 106, 600 x 106, 700 x 106, 800 x 106, 900 x 106, 1,000 x 106, 1250 x 106, 1500 x 106, 1750 x 106, 2000 x 106, 2250 x 106, 2500 x 106, 2750 x 106, 3000 x 106 3250 x 106, 3500 106, 3750 x 106, 4000 x 106, 4250 x 106, 4500 x 106, 4750 x 106, 또는 5000 x 106 개 세포, 약 또는 적어도 50 x 106, 100 x 106, 150 x 106, 200 x 106, 250 x 106, 300 x 106, 350 x 106, 400 x 106, 450 x 106, 500 x 106, 550 x 106, 600 x 106, 700 x 106, 800 x 106, 900 x 106, 1,000 x 106, 1250 x 106, 1500 x 106, 1750 x 106, 2000 x 106, 2250 x 106, 2500 x 106, 2750 x 106, 3000 x 106 3250 x 106, 3500 106, 3750 x 106, 4000 x 106, 4250 x 106, 4500 x 106, 4750 x 106, 또는 5000 x 106 개 세포, 또는 상기 중 임의의 사이 임의의 수가 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 선택된 세포는 (예를 들어, 크로마토그래피 매트릭스가 함유된) 단일 컬럼 상에 고정된다. 예를 들어, 샘플로부터 선택된 세포의 총량이 단일 컬럼 상에 고정되고 단일 컬럼 상에 고정된 세포는 자극 조건 하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 선택된 세포는 (예를 들어, 크로마토그래피 매트릭스가 각각 함유된) 2개 컬럼 상에 고정된다. 예를 들어, 샘플로부터 선택된 세포 총량은 (예를 들어, 각 컬럼(예를 들어 크로마토그래피 매트릭스)은 상기 상에 고정된 전체 세포의 절반 또는 약 절반을 함유함) 2개 컬럼 상에 고정되고 2개 컬럼 상에 고정된 세포는 자극 조건 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상) 상에 고정된 선택된 세포(예를 들어, T 세포)는 자극, 예컨대 (약) 0.01 x 106 세포/mL, 0.1 x 106 세포/mL, 0.5 x 106 세포/mL, 1.0 x 106 세포/mL, 1.5 x 106 세포/mL, 2.0 x 106 세포/mL, 2.5 x 106 세포/mL, 3.0 x 106 세포/mL, 4.0 x 106 세포/mL, 5.0 x 106 세포/mL, 10 x 106 세포/mL, 50 x 106 세포/mL, 75 x 106 세포/mL, 100 x 106 세포/mL, 125 x106 세포/mL, 150 x 106 세포/mL, 또는 200 x 106 세포/mL, 또는 적어도 0.01 x 106 세포/mL, 0.1 x 106 세포/mL, 0.5 x 106 세포/mL, 1.0 x 106 세포/mL, 1.5 x 106 세포/mL, 2.0 x 106 세포/mL, 2.5 x 106 세포/mL, 3.0 x 106 세포/mL, 4.0 x 106 세포/mL, 5.0 x 106 세포/mL, 10 x 106 세포/mL, 50 x 106 세포/mL, 75 x 106 세포/mL, 100 x 106 세포/mL, 125 x106 세포/mL, 150 x 106 세포/mL, 또는 200 x 106 세포/mL 밀도에서 자극제의 존재와 같은 자극 조건 하에서 인큐베이션 된다. 특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상) 상에 고정된 선택된 세포(예를 들어, T 세포)는, 자극되거나 자극의 대상, 예를 들어 (약) 100 ± 25 백만 세포/mL 밀도에서 자극제의 존재와 같은 자극 조건 하에서 인큐베이션 된다. 특정 구현예에서, 상기 세포, 예를 들어 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상) 상에 고정된 선택된 세포(예를 들어, T 세포)는 자극되거나 자극의 대상, 예를 들어 (약) 3.0 x 10 6 세포/mL, 또는 적어도 3.0 x 10 6 세포/mL 밀도에서 자극제의 존재와 같은 자극 조건 하에서 인큐베이션 된다. 일부 구현예에서, 선택된 세포는 살아있는 T 세포이다.
일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함한 자극 시약은 세포 1 x 106 개 당 (약) 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3 μg, 또는 적어도 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3 μg의 농도로 컬럼에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함한 자극 시약은 세포 1 x 106 개 당 (약) 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25 μg, 또는 적어도 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25 μg의 농도로 고정된 세포가 함유된 컬럼에 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함한 자극 시약은 세포 1 x 106 개 당 (약) 1 내지 2 μg의 농도로 컬럼에 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 올리고머 자극 시약이다. 일부 구현예에서 올리고머 자극 시약은 세포 1 x 106 개 당 (약) 1 내지 2 μg 사이의 농도로 고정된 세포를 함유하는 컬럼에 첨가된다. 일부 구현예에서, 5 x 108 올리고머 자극 시약 시약은 고정된 세포를 함유하는 컬럼에 첨가된다. 2 개 이상의 컬럼이 자극을 위해 고정된 세포를 포함하는 경우, 본원에 기술된 농도 또는 양의 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극시약)이 각 컬럼에 추가되거나 적용된다.
일부 구현예에서, 자극을 위한 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 온도는 (약) 37oC이다. 일부 구현예에서, 산소 및 이산화탄소 함량은 가스 교환기를 사용해 조절된다.
특정한 구현예에서, 자극 조건은 세포, 예를 들어 샘플로부터 선택된 세포를 하나 이상의 사이토카인과 함께 및/또는 존재 하에서 배양하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 선택된 세포(예를 들어, T 세포)에 대해 내인성이고/거나 선택된 세포(예를 들어, T 세포)에 의해 발현되는 수용체에 결합하고/거나 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스 번들 패밀리의 멤버이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4-알파-헬릭스 번들 패밀리의 멤버는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9 (IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)를 포함하되 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-2이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인의 양 또는 농도는 국제 단위(IU)로 측정되고/거나 정량화 된다. 국제 단위는 비타민, 호르몬, 사이토카인, 백신, 혈액 산물, 및 유사 생물학적 활성 물질을 정량하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, IU는 특정 중량 및 강도의 국제 참조 표준, 예를 들어, 인간 IL-2, 86/504에 대한 WHO 제1 국제 표준과 비교한 생물학적 제제의 효능의 측정 단위이거나 이를 포함한다. 국제 단위는 공개되고 국제적인 협력 연구 노력에서 유래된 생물학적 활성 단위를 보고하는 유일한 인식되고 표준화된 방법이다. 특정 구현예에서, 사이토카인의 집단, 샘플 또는 소스에 대한 IU는 유사한 WHO 표준 생성물과 의 생성물 비교 테스트를 통해 수득될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 인간 재조합 IL-2, IL-7 또는 IL-15 집단, 샘플 또는 소스의 IU/mg는 WHO 표준 IL-2 생성물(NIBSC 코드: 86/500), WHO 표준 IL-17 생성물(NIBSC 코드: 90/530) 및 WHO 표준 IL-15 생성물(NIBSC 코드: 95/554)과 각각 비교된다.
일부 구현예에서, IU/mg으로 생물학적 활성은 (ng/ml으로 ED50)-1 x106과 동등하다 특정 구현예에서, 재조합 인간 IL-2 또는 IL-15의 ED50은 CTLL-2 세포로 세포 증식(XTT 절단)의 최대 절반 자극에 필요한 농도와 동일하다. 특정 구현예에서, 재조합 인간 IL-7의 ED50은 PHA-활성화 인간 말초 혈액 림프구의 증식을 위한 최대 절반 자극에 필요한 농도와 동일하다. IL-2에 대한 IU의 분석 및 계산에 관한 세부 사항은 문헌[Wadhwa et al., Journal of Immunological Methods (2013), 379 (1-2): 1-7; 및 Gearing and Thorpe, Journal of Immunological Methods (1988), 114 (1-2): 3-9]에서 논의되고; IL-15에 대한 IU의 분석 및 계산에 관한 세부 사항은 문헌[Soman et al. Journal of Immunological Methods (2009) 348 (1-2): 83-94]에서 논의된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 샘플의 선택 세포는, 1 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 10 IU/mL 내지 50 IU/mL, 50 IU/mL 내지 100 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 100 IU/mL 내지 500 IU/mL, 250 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 500 IU/mL 내지 1,000 IU/mL의 농도로 사이토카인, 예를 들어 재조합 인간 사이토카인의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 샘플의 선택 세포는, 1 IU/mL 내지 500 IU/mL, 10 IU/mL 내지 250 IU/mL, 50 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 150 IU/mL, 75 IU/mL 내지 125 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL 또는 10 IU/mL 내지 100 IU/mL의 농도로 재조합 IL-2, 예를 들어 인간 재조합 IL-2의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 샘플의 선택 세포는 (약) 50 IU/mL, 60 IU/mL, 70 IU/mL, 80 IU/mL, 90 IU/mL, 100 IU/mL, 110 IU/mL, 120 IU/mL, 130 IU/mL, 140 IU/mL, 150 IU/mL, 160 IU/mL, 170 IU/mL, 180 IU/mL, 190 IU/mL 또는 100 IU/mL의 농도로 재조합 IL-2의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 샘플의 선택 세포는 (약) 100 IU/mL의 재조합 IL-2, 예를 들어 인간 재조합 IL-2의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 샘플의 선택 세포는, 100 IU/mL 내지 2,000 IU/mL, 500 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 100 IU/mL 내지 500 IU/mL, 500 IU/mL 내지 750 IU/mL, 750 IU/mL 내지 1,000 IU/mL 또는 550 IU/mL 내지 650 IU/mL의 농도로 재조합 IL-7, 예를 들어 인간 재조합 IL-7의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 투입 세포는, (약) 50 IU/mL, 100 IU/mL, 150 IU/mL, 200 IU/mL, 250 IU/mL, 300 IU/mL, 350 IU/mL, 400 IU/mL, 450 IU/mL, 500 IU/mL, 550 IU/mL, 600 IU/mL, 650 IU/mL, 700 IU/mL, 750 IU/mL, 800 IU/mL, 750 IU/mL, 750 IU/mL, 750 IU/mL 또는 1,000 IU/mL의 농도로 IL-7의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 샘플의 선택 세포는 (약) 600 IU/mL의 재조합 IL-7, 예를 들어 인간 재조합 IL-7의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 샘플의 선택 세포는, 1 IU/mL 내지 500 IU/mL, 10 IU/mL 내지 250 IU/mL, 50 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 150 IU/mL, 75 IU/mL 내지 125 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL 또는 10 IU/mL 내지 100 IU/mL의 농도로 재조합 IL-15, 예를 들어 인간 재조합 IL-15의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 입력 집단의 세포는 (약) 50 IU/mL, 60 IU/mL, 70 IU/mL, 80 IU/mL, 90 IU/mL, 100 IU/mL, 110 IU/mL, 120 IU/mL, 130 IU/mL, 140 IU/mL, 150 IU/mL, 160 IU/mL, 170 IU/mL, 180 IU/mL, 190 IU/mL 또는 200 IU/mL의 농도로 재조합 IL-15의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 샘플의 선택 세포는 (약) 100 IU/mL의 재조합 IL-15, 예를 들어 인간 재조합 IL-15의 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다.
특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 샘플의 선택 세포는 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15의 존재로 자극 조건 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15는 재조합이다. 특정 구현예에서, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15는 인간이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 샘플의 선택 세포는 재조합 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15의 존재로 자극 조건 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 100 IU/mL의 재조합 IL-2, (약) 600 IU/mL의 재조합 IL-7 및 (약) 100 IU/mL의 재조합 IL-15의 존재로 자극 조건 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 글루타민을 더 포함한다.
상기 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제, 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 자극 예컨대 문헌[미국 특허 번호 6,040, 1 77 Riddell et al., Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]에 기술된 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 자극 무혈청 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 정의(defined)되고/되거나 또는 잘-정의된(well-defined) 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 가공된, 예를 들어 저해제 및/또는 성장 인자를 제거하기 위해 여과된 제어된 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극은 여기 섹션 III 또는 문헌[국제 출원 PCT/US2018/064627]에 기재된 무혈청 배지로 수행된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물이 보충된 기본 배지 (예를 들어, OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher),를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물은 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 세포(예를 들어, T 세포)의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분, 예를 들어 추가적 보충물 (예를 들어, OpTmizer ™ T- 세포 증폭 보충물 (ThermoFisher))에 의해 제공되는 것으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체물, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체물, 또는 문헌[Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체물을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 L-글루타민과 같은 유리 형태의 아미노산을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 디펩타이드 형태의 L-글루타민(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민), 예컨대 Glutamax™(ThermoFisher)의 디펩타이드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15와 같은 하나 이상의 재조합 사이토카인을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 인큐베이션은 실온(예를 들어, (약) 23 oC)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 자극, 예를 들어 자극 조건 하에서 인큐베이션은 (약) 37 oC에서 수행된다.
본원에 제공된 방법은 상기 정지 상으로부터 세포를 용리하기 위해 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가없이 크로마토그래피 컬럼으로부터 선택된 세포를 수집하거나 용리할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 온-컬럼 자극은 컬럼으로부터 선택된 세포의 분리에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 예를 들어 상기 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약이 예를 들어 크로마토그래피 컬럼의 정지 상에 직접 또는 간접적으로 결합되지 않은 경우, 분리 된 세포는 자극제 또는 자극제를 함유하는 자극 시약과 결합된 상태로 남아있을 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 분리된 세포는 컬럼으로부터 분리된 후 및/또는 수집 및/또는 용리 될 때 자극 조건 하에 남아있을 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 컬럼으로 부터 제거(예를 들어, 수집 또는 용리) 후 일정 기간 동안 유지된다. 일부 구현예에서, 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약의 존재 하에서 자극의 적어도 일부는 인큐베이션의 적어도 일부는 예를 들어 국제 공개 번호 WO2016/073602에 기재된 바와 같은 원심분리 회전 하에서, 원심분리기 챔버의 내부 공동에서 수행된다.
일부 구현예에서, 컬럼으로부터 세포를 수집 또는 용리 후 수행된 자극은 일반적으로 스피닝(spinning)이 존재하는 것과 같은 혼합 조건 하에서 수행되며, 일반적으로 이는 상대적으로 낮은 힘 또는 속도, 예컨대 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 것보다 더 낮은 속도, 예컨대 (약) 600rpm 내지 (약) 1700rpm(예를 들어, (약) 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 600rpm, 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 이상)에서, 예컨대 (약) 80g 내지 100g(예를 들어, (약) 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 이상)의 챔버 또는 다른 컨테이너의 벽 또는 샘플에서 RCF로 수행된다. 일부 구현예에서, 스핀은 상기와 같은 낮은 속도의 스핀과 이어지는 휴지 기간(rest period), 예컨대 스핀 및/또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10초 동안의 휴지, 예컨대, 대략 1 또는 2초의 스핀과 이어지는 대략 5, 6, 7 또는 8초 동안의 휴지의 구간을 반복하여 수행된다. 일부 구현예에서, 컬럼으로부터 세포를 수집 또는 용리 후 수행된 자극은 흔들림(rocking)과 같은 혼합 조건 하에서 수행된다. 특정 구현예에서, 자극은 원심 분리, 떨림, 회전, 흔들림 또는 관류, 예를 들어 배지의 연속 또는 반 연속 관류를 수반하지 않는 조건과 같은 정적 조건 하에서 수행된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 용리되고/거나 수집된 세포, 예를 들어 자극제 또는 자극제를 포함하는 자극 시약에 여전히 결합된 세포는 예를 들어 백 또는 바이알과 같은 컨터이너로 전달(예를 들어, 멸균 조건 하에서 전달)되고, 인큐베이터에 배치된다. 특정 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 16℃, 24℃ 또는 35℃ 또는 16℃, 24℃ 또는 35℃ 이상으로 설정된다. 일부 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 37℃ 또는 37℃ ±2℃, ±1℃, ±0.5℃ 또는 ±0.1℃로 설정된다. 특정 구현예에서, 정적 조건 하의 자극은 인큐베이터에 배치된 세포 배양 백에서 수행된다. 일부 구현예에서, 흔들림 조건 하의 자극은 인큐베이터에 배치된 세포 배양 백에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양 백은, 단핵구가 존재하는 경우 백 표면에 부착할 수 있는 단일 웹 폴리올레핀 기체 투과성 필름으로 구성된다.
1. 온-컬럼 자극을 위한 자극제 및 자극 시약의 사용
특정 측면에서, 상기 자극 조건은 하나 이상 자극제와 함께 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상) 상에 고정된 표적 세포(예를 들어, T 세포)를 인큐베이션 하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극제는 자극 시약에 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 자극제는, 크로마토그래피 컬럼의 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)에 직접 또는 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 상기 자극제는 크로마토그래피 컬럼의 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)에, 예를 들어 본원, 예컨대 섹션 II-A 및/또는 섹션 I-B에 기술된 자극 시약 또는 본원, 예컨대 섹션 II-A 및/또는 섹션 I-C-1b에 기술된 자극 시약을 통해 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 상기 자극제는 자극 시약에 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 자극시약은, 크로마토그래피 컬럼의 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)에 결합된다. 일부 구현예에서, 상기 자극시약은 시약은 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 상기 자극제는 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)에 비공유 결합된다.
일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 고체 지지체, 정지 상, 비드, 마이크로입자, 자성 입자, 및/또는 매트릭스(예를 들어, 크로마토그래피 매트릭스)에 결합되지 않거나 연관되지 않는다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 유연하고, 금속 또는 자성 코어를 함유하지 않으며, 유기 다량체를 전체적으로 또는 주로 포함하며, 및/또는 단단하지 않다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 가용성이다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 올리고머 자극 시약이다(예를 들어, 섹션 I-C-1b를 참조). 일부 구현예에서, 상기 올리고머 자극 시약은 가용성이다.
특정 구현예에서, 자극의 개시는 세포가 인큐베이션 되거나 자극제에 접촉할 때 발생한다. 따라서, 상기 자극제가 직접 또는 간접적으로 예컨대 선택 시약 또는 자극 시약을 통해서 컬럼의 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)에 결합되는 일부 구현예에서, 표적 세포을 포함하는 샘플이 컬럼의 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)에 첨가 시 자극의 개시는 발생한다. 일부 구현예에서, 자극 시약에 포함된 상기 자극제가 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어 정지 상)와 연관되지 않을 경우, 자극의 개시는 자극 시약(예를 들어 올리고머 자극 시약)이 샘플의 표적 세포가 고정된 정지 상에 첨가될 때 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 자극제가 크로마토그래피 매트릭스 (예를 들어, 정지 상)에 직접 또는 간접적으로 결합되지 않고 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)에 포함되지 않은 경우, 자극의 개시는 자극제가 크로마토그래피 매트릭스(예를 들어, 정지 상)에 첨가될 때 발생한다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 도메인을 자극할 수 있는 하나 이상의 자극제를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극제는 TCR 복합체의 세포내 신호 전달 도메인을 자극할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 자극제는 RNA, DNA, 단백질(예를 들어, 효소), 항원, 다클론 항체, 단클론 항체, 항체 단편, 탄수화물, 지질 렉틴 또는 원하는 표적에 대한 친화도를 갖는 임의의 기타 생체 분자를 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 일부 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 수용체 및/또는 T 세포 수용체의 성분이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 CD3이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 공동자극분자, 예를 들어 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS이다. 일부 구현예에서, 자극제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 Fab이다.
일부 구현예에서, 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 세포(예를 들어, T 세포) 상에 다음과 같은 하나 이상의 거대 분자와 결합하는 하나 이상의 자극제를 함유한다: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL- 10R, CD18/CDl la (LFA-1), CD62L (L-셀렉틴), CD29/CD49d (VLA-4), 노치 리간드 (예를 들어 델타 유사 1/4, Jagged 1/2 등), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7 및 CXCR3 또는 상기 거대 분자에 상응하는 리간드 또는 이의 단편에 상응하는 리간드를 포함하는 이의 단편. 일부 구현예에서, 자극제는 세포(예를 들어, T 세포) 상에 다음과 같은 하나 이상의 거대 분자와 특이적으로 결합한다: CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO.
일부 구현예에서, 자극제는 T 세포 수용체의 하나 이상의 성분에 결합하고/거나 인식하는 항체이다 특정 구현예에서, 자극제는 제제는 항-CD3 항체이다. 특정 구현예에서, 자극제는 공동자극분자에 결합하고/거나 인식하는 항체이다 일부 구현예에서, 자극제는 제제는 항-CD28 항체이다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD28 항체 및 항-CD3 항체(예를 들어, 자극제)를 포함한다 일부 구현예에서, 자극 시약은 하나 이상의 자극제를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 제1 자극제 및 제2 자극제를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 자극제는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 제2 자극제는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 제1 자극제는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 항-CD3 Fab이고, 제2 자극제는 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 항-CD28 Fab이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 자극제가 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약) 또는 선택 시약에 결합하지 않는 경우, 자극제는 항체, 2가 항체 단편, F(ab)2, 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편이다. 일부 구현예에서, PMA/이오노마이신은 세포를 자극하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 샘플의 선택된 세포는 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1 비율의 자극제 대 세포 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정한 구현예에서, 자극제 대 세포의 비율은 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 특정한 구현예에서, 자극제 대 세포의 비율은 (약) 1:1이다. 특정한 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 0.3:1이다. 특정한 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 0.2:1이다.
일부 구현예에서, 세포는 106 세포 당 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.03 ㎍, 0.04 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 1.2 ㎍, 1.4 ㎍, 1.6 ㎍, 1.8 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍ 또는 10 ㎍, 약 또는 적어도 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.03 ㎍, 0.04 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 1.2 ㎍, 1.4 ㎍, 1.6 ㎍, 1.8 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍ 또는 10 ㎍의 자극 시약의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 4 ㎍의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 3 ㎍의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 2.5 ㎍의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 2 ㎍의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 1.8 ㎍의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 1.6 ㎍의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 1.4 ㎍의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 1.2 ㎍의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 1 ㎍의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 0.8 ㎍의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 다양한 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 0.8 ㎍의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다.
a. 자극제
전술한 바와 같이, 특정 측면에서, 본원에 제공된 방법은 자극제를 이용한다. 일부 구현예에서, 섹션 II-B에 기재된 바와 같은 제제는 자극제이다. 일부 구현예에서, 자극제는 세포 표면 상의 분자에 결합하며, 자극제와 분자 사이의 결합은 세포에서 자극 신호를 유도, 전달 또는 조절(modulating)할 수 있다. 일부 예에서, 세포 표면 분자는 예를 들어 신호 분자(signaling molecule)이다. 일부 상기 경우에, 자극제는 하나 이상의 표적 세포에 의해 발현되는 신호 분자에 특이적으로 결합 할 수 있다. 일부 예에서, 자극제는 수용체와 같은 세포 표면 분자에 결합할 때, 세포(예를 들어, T 세포)에 자극 신호를 유도 또는 전달할 수 있는 임의의 제제이다. 일부 구현예에서, 자극 신호는 면역 자극성일 수 있으며, 이 경우 자극제는 상기 세포(예를 들어, T 세포)에 의한 면역 반응에 관여하거나 면역 반응을 자극하는, 예컨대 면역 세포 증식 또는 증폭, 면역 세포 활성화, 면역 세포 분화, 사이토카인 분비, 세포 독성 활성 또는 면역 세포의 하나 이상의 기타 기능적 활성을 증가시키는 신호를 유도, 전달, 또는 조절(modulating)할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 신호는 억제성일 수 있으며, 이 경우 자극제는 면역 반응에 관여하거나 면역 반응을 저해하는, 예컨대 면역 세포 증식 또는 증폭, 면역 세포 활성화, 면역 세포 분화, 사이토카인 분비, 세포 독성 활성 또는 면역 세포의 하나 이상의 기타 기능적 활성을 저해 또는 감소시키는 세포(예를 들어, T 세포)에서 자극 신호를 유도, 전달 또는 조절(modulating)할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 자극제는 제1 자극제이다. 일부 구현예에서, 제1 자극제는 샘플의 선택된 세포의 표면 상에 수용체 분자와 결합한다 따라서, 이 경우 제1 자극제는 자극 신호를 전달, 유도, 또는 조절한다. 일부 측면에서, 제1 자극제에 의한 자극 신호의 전달, 유도, 또는 조절은 세포의 자극에 영향을 미친다. 따라서, 일부 경우에, 제1 자극제는 자극 신호를 전달하거나 세포에 1차 활성 신호를 제공하며, 이에 의해 세포를 자극 및/또는 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 제1 자극제는 선택 마커의 하향조절을 유도한다. 본원에 사용된 바와 같이, 하향조절은 이전 시점과 비교하여 선택 마커의 발현, 예를 들어 세포 표면 발현 감소를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어, T 세포)는 TCR/CD3 복합체 및 공동자극분자, 예컨대 CD28을 포함한다. 이 경우에, 제1 자극제는 TCR/CD3에 결합하고, 이에 의해 T 세포에 자극 신호(예를 들어, 1차 신호, 예컨대 1차 활성신호)를 전달하고, 제2 자극제는 공동자극 CD28 분자에 결합한다. 특정 측면에서, 제1 자극제 및/또는 제2 자극제는 선택 마커(예를 들어, 선택 마커는 표적 세포(예를 들어 T 세포)의 고정을 위해 사용됨)의 하향조절을 더 유도한다.
일부 구현예에서, 제1 자극제는 세포, 예를 들어 T 세포에 TCR/CD3 복합체-연관 자극 신호(예를 들어, 1차 신호)를 전달한다. 일부 구현예에서, 제1 자극제는 면역수용체 타이로신-기반 활성 모티프 또는 ITAM을 함유하는 분자에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서,제1 자극제는 CD3과 특이적으로 결합한다. 일부 경우에, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 자극제는 항-CD3 항체, 항-CD3 항체의 2가 항체 단편, 항-CD3 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성이 있는 단백질성 CD3 결합 분자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 2가 항체 단편은 (Fab’)2-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 일부 경우, 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 CD3 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩타이드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)일 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD3 Fab 단편은 하이브리도마 세포주 OKT3(ATCC®CRL-8001™미국 특허 제4,361,549호도 참조)에 의해 생성된 CD3 결합 단클론 항체로부터 생산될 수 있다. 상기 중사슬의 가변 도메인 및 항-CD3 항체 OKT3의 경사슬의 가변 도메인은 문헌 Arakawa et al., J. Biochem. 120, 657-662 (1996)에 기술되어 있으며, 각각 서열 번호: 31 및 32로 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab는 서열 번호: 31 및 32에 제시된 가변 중사슬 및 경사슬의 CDRs을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 자극제는 제2자극제이다. 일부 구현예에서, 제2 자극제는 예를 들어 세포 표면 분자, 예컨대 수용체 분자와 같은 세포의 표면 상의 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 제2 자극제는 제1 자극제에 의해 결합된 분자를 통해 전달된 자극 신호를 증강(enhancing), 약화(dampening), 또는 변경(modifying)할 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 자극제는 자극 신호, 예를 들어 제2 또는 추가적인 자극 신호를 전달, 유도, 또는 변경한다. 일부 측면에서, 제2 자극제는 제1 자극제에 의해 유도된 자극 신호를 증강 또는 강화(potentiate)한다. 일부 구현예에서, 제2 자극제는 보조 분자(accessory molecule)에 결합하고/거나 세포에 보조 또는 2차 자극신호를 유도한다. 일부 측면에서, 제2 자극제는 공동자극분자에 결합하고/하거나 공동자극 신호를 제공한다.
일부 구현예에서, 제2 자극제일 수 있는, 자극제는 공동자극분자, 보조 분자, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 면역체크포인트 분자, 또는 TNF 패밀리나 TNF 수용체 패밀리의 구성원일 수 있는 제2 분자에 결합, 예컨대 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD28일 수 있고, 예를 들어 제2 자극제일 수 있는 자극제는 CD28에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD28에 특이적으로 결합하는 (예컨대, 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 항-CD28 항체, 항-CD28 항체의 2가 항체 단편, 항-CD28 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD28 결합 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 2가 항체 단편은 (Fab’)2-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 CD28 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩타이드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)일 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD28 Fab 단편은 항체 CD28.3으로부터 유래될 수 있으며 (GenBank 수탁번호 AF451974.1 하에 합성 단일 사슬 Fv 구조물로서 기탁됨; 문헌 Vanhove et al., BLOOD, 15 July 2003, Vol.102, No. 2, pages 564-570도 참조), 상기 항체의 중사슬 및 경사슬은 각각 서열 번호: 33 및 34를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD28 Fab는 서열 번호: 33 및 34에 제시된 가변 중사슬 및 경사슬의 CDRs을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD90이고, 예를 들어 제2 자극제일 수 있는 자극제는 CD90에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD90에 특이적으로 결합하는 (예컨대, 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 항-CD90 항체, 항-CD90 항체의 2가 항체 단편, 항-CD90 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD90 결합 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예컨대, 항-CD90 항체 G7 (Biolegend, cat. no. 105201)을 참조하라.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD95이고, 예를 들어 제2 자극제일 수 있는 자극제는 CD95에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD95에 특이적으로 결합하는 (예컨대, 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 항-CD95 항체, 항-CD95 항체의 2가 항체 단편, 항-CD95 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD95 결합 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 상기 항-CD90 항체는 단클론성 마우스 항-인간 CD95 CH11일 수 있거나 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) 또는 예컨대, Paulsen et al.Cell Death & Differentiation 18.4 (2011): 619-631에 기술된 임의의 것과 같이 항-CD95 mAb 7C11 또는 항-APO-1일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 또는 B 세포 상의 분자는 CD137일 수 있고, 자극제(예를 들어, 제2 자극제일 수 있다)는 CD137에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD137에 특이적으로 결합하는 (예컨대, 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 항-CD137 항체, 항-CD137 항체의 2가 항체 단편, 항-CD137 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD137 결합 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 항-CD137 항체는 문헌[Taraban et al. Eur J Immunol. 2002 Dec;32(12):3617-27]에 기술된 바와 같이 LOB12, IgG2a 또는 LOB12.3, IgG1일 수 있다. 예컨대, 문헌[US6569997, US6303121, Mittler et al. Immunol Res. 2004;29(1-3):197-208]도 참조한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 B 세포 상의 분자는 CD40일 수 있고, 자극제, 예를 들어, 자극제(예를 들어 제2 자극제, 예를 들어 제2 자극제일 수 있음)는 CD40에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD40에 특이적으로 결합하는 자극제(제2 자극제일 수 있는, 예컨대 제2 자극제)는 항-CD40 항체, 항-CD40 항체의 2가 항체 단편, 항-CD40 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD40 결합 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD40L(CD154)일 수 있고, (예를 들어 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 CD40L에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD40L에 특이적으로 결합하는 (예를 들어 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 항-CD40L 항체, 항-CD40L 항체의 2가 항체 단편, 항-CD40L 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD40L 결합 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 항-CD40L 항체는 경우에 따라, 문헌 Blair et al. JEM vol. 191 no. 4 651-660에 기술된 바와 같이 Hu5C8일 수 있다. 예컨대, 문헌 WO1999061065, US20010026932, US7547438, WO2001056603도 참조하라.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 T 세포 공동자극자(ICOS)일 수 있고, (예를 들어 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 ICOS 에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, ICOS 에 특이적으로 결합하는 (예를 들어 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 항- ICOS 항체, 항- ICOS 항체의 2가 항체 단편, 항-ICOS 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 ICOS 결합 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예컨대, 문헌 US20080279851 및 Deng et al. Hybrid Hybridomics. 2004 Jun;23(3):176-82를 참조하라.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 T 세포 활성화를 위한 링커(LAT)일 수 있고, (예를 들어 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 LAT 에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, LAT 에 특이적으로 결합하는 (예를 들어 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 항- LAT 항체, 항- LAT 항체의 2가 항체 단편, 항-LAT 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 LAT 결합 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 CD27일 수 있고, 예를 들어 제2 자극제일 수 있는 자극제는 CD27에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, CD27에 특이적으로 결합하는 (예컨대, 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 항-CD27 항체, 항-CD27 항체의 2가 항체 단편, 항-CD27 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 CD27 결합 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예컨대, 예를 들어 문헌 WO2008051424를 참조한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 OX40일 수 있고, 예를 들어 제2 자극제일 수 있는 자극제는 OX40에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, OX40에 특이적으로 결합하는 (예를 들어 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 항-OX40 항체, 항-OX40 항체의 2가 항체 단편, 항-OX40 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 OX40 결합 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예컨대, 문헌 WO2013038191 및 Melero et al. Clin Cancer Res. 2013 Mar 1;19(5):1044-53을 참조한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 T 세포 상의 분자는 HVEM 일 수 있고, 예를 들어 제2 자극제일 수 있는 자극제는 HVEM 에 특이적으로 결합한다. 일부 측면에서, HVEM 에 특이적으로 결합하는 (예를 들어 제2 자극제일 수 있는) 자극제는 항- HVEM 항체, 항- HVEM 항체의 2가 항체 단편, 항-HVEM 항체의 1가 항체 단편 및 항체 유사 결합 특성을 갖는 단백질성 HVEM 결합 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예컨대, 문헌 WO2006054961, WO2007001459, Park et al. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61(2):203-14도 참조한다.
임의의 상기 예에서, 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, FV 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 임의의 상기 예에서, 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 결합 분자는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩타이드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 기초한 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)일 수 있다.
일부 측면에서, 자극제는 구체적으로 표적 세포의 표면 상에 발현된 분자를 표적으로 하며, 상기 분자는 TCR, 키메라 항원 수용체, 또는 면역수용체 타이로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 포함하는 분자이다. 예를 들어, 표적 세포의 표면 상에 발현되는 분자는 T 세포 또는 B 세포 항원 수용체 복합체, CD3 사슬, CD3 제타, T 세포 또는 B 세포의 항원 결합 부분, 또는 키메라 항원 수용체로부터 선택된다. 일부 경우에, 자극제는 펩타이드 MHC 클래스 I 복합체를 표적으로 한다.
일부 구현예에서, 자극제는 표적 세포 표면 상에 발현된 분자의 His-태그된 세포외 도메인에 결합한다. 일부 경우, 자극제는 니켈로 충전된 trisNTA(His-STREPPER 또는 His/Strep-tag®Adapter라고도 함)와 컨쥬게이션된 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(Strep-tag® II라고도 함, 서열 번호: 8에 제시) 펩타이드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, His-태그된 표적 세포의 표면 상에 발현된 분자는 CD19이다.
일부 구현예에서, 자극제는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 항체 부분에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에. 재조합 수용체의 항체 부분은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일 부분, 예를 들어 힌지 영역, 예컨대, IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG의 것이다. 일부 경우에 시약은 IgG4를 인식하는 αIgG로 로드된다.
일부 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 수용체 및/또는 T 세포 수용체의 성분이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 CD3이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 공동자극분자, 예를 들어 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 자극제가 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약) 또는 선택 시약에 결합하지 않는 경우, 자극제는 항체, 2가 항체 단편, F(ab)2, 또는 2가 단일 사슬 Fv 단편이다. 일부 구현예에서, 자극제가 시약에 결합되지 않는 경우, 자극제는 결합 파트너 C를 포함하지 않는다.
b. 올리고머 자극 시약
상기 제안된 바와 같이, 특정 구현예에서, 자극 시약은 하나 이상의 자극제에 콘쥬케이트, 연결(linked) 또는 부착된 올리고머 자극 시약, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 함유한다. 전술된 것과 같이, 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극제는 특정 결합 부위(예를 들어, 결합 부위 Z)에서 올리고머 자극 시약에 결합할 수 있는 부착된 결합 도메인 또는 결합 파트너(예를 들어, 결합 파트너 C)를 갖는다. 일부 구현예에서, 복수의 자극제가 올리고머 자극 시약에 가역적으로 결합된다. 다양한 구현예에서, 올리고머 자극 시약은, 특정 구현예에서 결합 도메인(예를 들어, 결합 파트너 C)에서 복수의 자극제에 가역적으로 결합되는 복수의 특정 결합 부위, Z를 갖는다. 일부 구현예에서, 결합된 제제의 양은, 경쟁 제제, 예를 들어 특정 결합 부위(예를 들어, 결합 부위 Z)에 또한 결합할 수 있는 제제의 존재 하에 감소하거나 줄어든다.
일부 구현예에서, 올리고머 자극 시약은, 하나 이상의 자극제(예를 들어, 세포, 예컨대 T 세포에서 신호를 생성할 수 있는 자극제)가 올리고머 자극 시약과 연합, 예를 들어 가역적으로 연합하는 가역적 시스템이거나 이를 포함한다. 올리고머 자극 시약의 비제한적인 예는 예를 들어 문헌[국제 공개된 PCT 출원번호 WO 2018/197949]에서 찾을 수 있고, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 시약은 자극제에 결합, 예를 들어 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 경우에, 시약은, T 세포와 같은 세포에서 신호(예를 들어, 자극 신호)를 생성할 수 있는 하나 이상의 부착된 제제를 갖는 올리고머 자극 시약이다. 일부 구현예에서, 자극제는 분자의 에피토프 또는 영역(예컨대, 세포 표면 분자 또는 수용체)에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 부위, 예를 들어 결합 부위 B를 함유하고, 올리고머 자극 시약의 하나 이상의 결합 부위, 예를 들어 시약의 결합 부위 Z에 특이적으로 결합하는 결합 파트너(여기에서 결합 파트너 C로도 지칭됨)를 또한 함유한다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C와 하나 이상의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용은 비공유 상호작용이다. 일부 경우에, 결합 파트너 C와 하나 이상의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용은 공유 상호작용이다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C와 하나 이상의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용, 예컨대 비공유 상호작용은 가역적이다.
상기 가역적 시스템에서 올리고머 자극 시약으로 사용될 수 있는 물질은 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[미국 특허 번호 5,168,049; 5,506,121; 6,103,493; 7,776,562; 7,981,632; 8,298,782; 8,735,540; 9,023,604; 및 국제 공개된 PCT 출원 번호 WO2013/124474 및 WO2014/076277]을 참조한다. 상기 결합을 반전시킬 수 있는 물질(예를 들어 경쟁 제제)뿐만 아니라 가역적 상호 작용을 형성할 수 있는 시약 및 결합 파트너의 비제한적인 예가 하기에 설명된다.
일부 구현예에서, 올리고머 자극 시약은 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 유사체(예컨대 뉴트라비딘) 또는 이의 혼합물의 올리고머이고, 여기에서 상기 올리고머 자극 시약은 자극제(예를 들어, 결합 파트너 C)의 결합 도메인과 가역적 연합을 위한 하나 이상의 결합 부위를 함유한다. 일부 구현예에서, 자극제의 결합 도메인은, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘 결합 펩타이드 또는 기타 분자일 수 있다
특정 구현예에서, 하나 이상의 자극제(예컨대 섹션 I-C-1a에 기술된 바와 같은, 예를 들어, T 세포와 같은 세포에서 신호를 생성할 수 있는 제제)는, 예컨대 올리고머 자극 시약에 존재하는 복수의 특정 결합 부위(예를 들어, 결합 부위 Z)를 통해 올리고머 자극 시약에 가역적으로 결합하는 것과 같이 연합한다. 　일부 경우에, 상기는 자극제가 서로 밀접하게 배열되는 결과를 초래하여, 만일 자극제에 의해 인식되거나 결합되는 (2 이상의 카피의) 세포 표면 분자를 갖는 표적 세포가 제제와 접촉이 야기될 경우 결합 효과가 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머 자극 시약은 스트렙타비딘 올리고머, 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머, 스트렙타비딘 유사체 올리고머, 아비딘 올리고머, 아비딘 뮤테인 또는 아비딘 유사체(예컨대 뉴트라비딘)로 구성된 올리고머 또는 이의 혼합물이다. 특정 구현예에서, 올리고머 자극 시약은 자극제의 결합 도메인(예를 들어, 결합 파트너 C)에 결합할 수 있는 특정 결합 부위를 함유한다. 일부 구현예에서, 결합 도메인은, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘 결합 펩타이드 또는 기타 분자일 수 있다. 올리고머 자극 시약 시스템에 포함되는 것으로 고려되는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인, 스트렙타비딘 유사체, 아비딘, 아비딘 뮤테인, 아비딘 유사체(예를 들어 뉴트라비딘) 및 결합 도메인 분자(예컨대 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘 결합 펩타이드 또는 기타 분자)의 예는 아래 섹션 II-A에 설명되어 있다. 본원에서 제공된 방법은 올리고머 자극 시약은 올리고히스티딘 친화도 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 칼모듈린 또는 이의 유사체, 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP), FLAG-펩타이드, HA-태그, 말토오스 결합 단백질(MPB), HSV 에피토프, myc 에피토프 및/또는 비오티닐화 수송 단백질(섹션 II-A를 참조)에 결합할 수 있는 분자를 포함할 수 있음이 더 고려된다.
특정한 구현예에서, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머로 구성되고/거나 이를 함유하는 올리고머 자극 시약이 본원에 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 올리고머 자극 시약은 하나 이상의 자극제에 가역적으로 결합하거나 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 구현예에서, 올리고머 자극 시약은 반경, 예를 들어, 70 nm 내지 125 nm(수치포함)의 평균 반경; 1 × 107g/몰 내지 1 × 109g/몰(수치포함)의 분자량; 및/또는 1,000 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머(수치포함);를 갖는다. 일부 구현예에서, 올리고머 자극 시약은 분자, 예컨대 세포의 표면 상의 수용체에 결합하는 제제와 같은 하나 이상의 자극제에 결합, 예를 들어 가역적으로 결합된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극제는 본원, 예를 들어 섹션 I-C-1a에 기술된 제제이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극제는 1가 결합부위(예컨대, 결합 부위 B)를 함유한다. 일부 구현예에서, 1가 결합부위는 CD3에 결합한다. 일부 구현예에서, 1가 결합 부위는 예를 들어 본원에 기술된 것과 같은 공동자극분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 1가 결합부위는 CD28에 결합한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자극제는 CD3+ 및/또는 CD28에 결합할 수 있는 1가 결합부위를 함유한다. 일부 구현예에서, 자극제는 예를 들어 결합 파트너, C, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩타이드, 예컨대 Strep-tag® II를 함유하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정한 구현예에서, 하나 이상의 자극제는, 결합 파트너, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩타이드, 예를 들어 Strep-tag® Ⅱ를 함유하는 항-CD3 및/또는 항-CD28 Fab이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극제는, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘 기반 올리고머, 예컨대 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 자극 시약은 국제 출원 WO2015/158868 또는 WO2018/197949에 기재된 바와 같은 임의의 것이다.
일부 구현예에서,복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머로 구성되고/거나 이를 함유하는 올리고머 자극 시약이 여기에 제공된다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 올리고머 자극 시약은 하나 이상의 자극제에 가역적으로 결합하거나 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자는 반경, 예를 들어, 80 nm 내지 120 nm(수치포함)의 평균 반경; 7.5 × 106g/몰 내지 2 × 108g/몰(수치포함)의 중량평균분자량; 및/또는 500 내지 10,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머(수치포함);를 갖는다. 일부 구현예에서, 올리고머 자극 시약은 분자, 예컨대 세포의 표면 상의 수용체에 결합하는 제제와 같은 하나 이상의 자극제에 결합, 예를 들어 가역적으로 결합된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극제는 본원, 예를 들어 섹션 I-B-2-a에 기술된 제제이다. 일부 구현예에서, 자극제는 예를 들어 결합 파트너, C, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩타이드, 예컨대 Strep-tag® II를 함유하는 항체 또는 이의 항원 단편과 같은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정한 구현예에서, 하나 이상의 제제는, 결합 파트너, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩타이드, 예를 들어 Twin-Strep-태그,(예를 들어, 서열 번호: 16)를 함유하는 항-CD3 및/또는 항-CD28 Fab이다.
일부 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약 ) 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.03 ㎍, 0.04 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 1.2 ㎍, 1.4 ㎍, 1.6 ㎍, 1.8 ㎍, 2 ㎍, 2.2 ㎍, 2.4 ㎍, 2.6 ㎍, 2.8 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍ 또는 10 ㎍, 또는 적어도 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.03 ㎍, 0.04 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 1.2 ㎍, 1.4 ㎍, 1.6 ㎍, 1.8 ㎍, 2 ㎍, 2.2 ㎍, 2.4 ㎍, 2.6 ㎍, 2.8 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍ 또는 10 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 4 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 3 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 2.75 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 2.5 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 2.25 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 2 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 1.8 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 1.6 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 1.4 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 1.2 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 1 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 106 세포 당 (약) 0.8 ㎍의 올리고머 자극 시약(예컨대, Strep-태그된 항-CD3 및 Strep-태그된 항-CD28 Fab에 컨쥬게이트된 스트렙타비딘-기반 올리고머, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머)의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 10 x 108, 9 x 108, 8 x 108, 7 x 108 , 6 x 108 , 5 x 108 , 4 x 108, 3 x 108, 2 x 108 , 1 x 108 인 올리고머 자극 시약의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 7 x 108 , 6 x 108 , 5 x 108 , 4 x 108, 3 x 108 인 올리고머 자극 시약의 존재 하에 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서 세포는 (약) 7 x 108 내지 3 x 108 인 올리고머 자극 시약 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 6 x 108 내지 4 x 108 인 올리고머 자극 시약 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서 세포는 (약) 6 x 108 내지 5 x 108 인 올리고머 자극 시약 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 세포는 5 x 108 올리고머 자극 시약 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 샘플의 선택된 세포는 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1 비율의 올리고머 자극 시약 대 세포 존재 하에서 자극되거나 자극의 대상이 된다. 특정한 구현예에서, 올리고머 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1이다. 특정한 구현예에서, 올리고머 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 1:1이다. 특정한 구현예에서, 올리고머 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 0.3:1이다. 특정한 구현예에서, 올리고머 자극 시약 대 세포의 비율은 (약) 0.2:1이다.
특정 측면에서, 올리고머 자극 시약 내에서, 올리고머 입자 및 부착된 제제 간의 질량비는 약 3:1이다. 특정 측면에서, 올리고머 자극 시약 내에서, 올리고머 입자, 부착된 항-CD3 Fab 및 부착된 항-CD28 Fab 간의 질량비는 약 3: 3:0.5이다. 특정 측면에서, 4 μg의 올리고머 자극 시약은 3 μg의 올리고머 입자 및 예를 들어 0.5 μg의 항-CD3 Fab 및 0.5 μg의 항-CD28 Fab인 1 μg의 부착된 제제이거나 이를 포함한다. 다른 예에서, 세포 106 당 1.2 μg의 올리고머 자극 시약은 세포 106 당, 0.9 μg의 올리고머 입자 및 예를 들어 0.15 μg의 항-CD3 Fab 및 0.15 μg의 항-CD28 Fab인 0.3 μg의 부착된 제제이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 자극 시약은 무혈청 배지에 첨가되고, 자극은 예를 들어 본원 섹션 III 또는 PCT/US2018/064627에 기술된 것과 같은 무혈청 배지에서 수행된다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물이 보충된 기본 배지 (예를 들어, OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher),를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물은 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 세포(예를 들어, T 세포)의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분, 예를 들어 추가적 보충물 (예를 들어, OpTmizer ™ T- 세포 증폭 보충물 (ThermoFisher))에 의해 제공되는 것으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체물, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체물, 또는 문헌[Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체물을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 L-글루타민과 같은 유리 형태의 아미노산을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무 혈청 배지는 Glutamax™ (ThermoFisher)의 디펩타이드와 같은 디펩타이드 형태의 L-글루타민(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15와 같은 하나 이상의 재조합 사이토카인을 더 포함한다.
D. 용리
본원에 제공된 방법의 측면에서, 크로마토그래피 컬럼으로부터 자극제와 함께 인큐베이션 후 세포, 예를 들어 표적 세포(예컨대, T 세포)의 용리는 본원에 기술된 것처럼 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 사용 없이 달성된다. 일부 구현예에서, 상기 자극제와 함께 인큐베이션 하는 동안에 크로마토그래피 매트릭스(예컨대, 정지 상) 상에 선택 제제를 통해 고정된 세포는 자발적으로 선택 제제로부터 분리된다. 일부 구현예에서, 자발적인 분리는 자극제와 함께 인큐베이션 시작으로부터 1일 이내에 발생한다. 일부 구현예에서, 자발적 분리는 자극제와 함께 인큐베이션 시작으로부터 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2시간 내에 발생한다. 일부 구현예에서, 자발적인 분리는 자극제와 함께 인큐베이션 시작 후 (약) 2 내지 24, 3 내지 24, 4 내지 24, 5, 내지 24, 6 내지 24, 7 내지 24, 8 내지 24, 9 내지 24, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 13 내지 24, 14 내지 24, 15 내지 24, 16 내지 24, 17 내지 24, 18 내지 24, 19 내지 24, 20 내지 24, 21 내지 24, 22 내지 24, 23 내지 24, 2 내지23, 2 내지 22, 2 내지 21, 2 내지 20, 2 내지 19, 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 2 내지 15, 2 내지 14, 2 내지 13, 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 2 내지 3 시간 이내에 일어난다. 일부 구현예에서, 컬럼으로부터 분리는 자극제와 함께 인큐베이션 시작 후 (약) 4 내지 5시간 이내, 예를 들어 4.5 시간 이내에 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스(예컨대, 정지 상) 상에 선택 제제를 통해 고정된 복수의 표적 세포(예를 들어 T 세포)의 대다수는 자극제와 함께 인큐베이션 시작으로부터 1일 미만에 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스(예컨대, 정지 상) 상에 선택 제제를 통해 고정된 복수의 표적 세포(예를 들어 T 세포)의 대다수는 자극제와 함께 인큐베이션 시작으로부터 24시간 미만에 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스(예컨대, 정지 상) 상에 선택 제제를 통해 고정된 복수의 표적 세포(예를 들어 T 세포)의 대다수는 자극제와 함께 인큐베이션 시작으로부터 12시간 미만에 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스(예컨대, 정지 상) 상에 선택 제제를 통해 고정된 복수의 표적 세포(예를 들어 T 세포)의 대다수는 자극제와 함께 인큐베이션 시작으로부터 5시간 미만에 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스(예컨대, 정지 상) 상에 선택 제제를 통해 고정된 복수의 표적 세포(예를 들어 T 세포)의 대다수는 자극제와 함께 인큐베이션 시작으로부터 4시간 미만에 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 크로마토그래피 매트릭스(예컨대, 정지 상) 상에 선택 제제를 통해 고정된 복수의 표적 세포(예를 들어 T 세포)의 대다수는 자극제와 함께 인큐베이션 시작으로부터 2시간 미만에 분리된다.
일부 구현예에서, 상기 자발적으로 분리된 세포는 크로마토그래피 컬럼으로부터 중력 흐름을 통해서 용리되고/거나 수집된다. 일부 구현예에서, 자발적으로 분리된 세포는 세척 단계를 이용해서 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 세척 단계는 자극제 또는 자극제를 함유하는 자극 시약과 함께 인큐베이션의 개시 후 (약) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 시간, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 시간에 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 단계는 자극제 또는 자극제를 함유하는 자극 시약과 함께 인큐베이션 후 자극제를 정지 상)에 첨가된 후 (약) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 시간, 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 시간에 수행된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세척 단계는 자극제 또는 자극제를 함유하는 자극 시약과 함께 인큐베이션 시작 후 (약) 2 내지 24, 3 내지 24, 4 내지 24, 5, 내지 24, 6 내지 24, 7 내지 24, 8 내지 24, 9 내지 24, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 13 내지 24, 14 내지 24, 15 내지 24, 16 내지 24, 17 내지 24, 18 내지 24, 19 내지 24, 20 내지 24, 21 내지 24, 22 내지 24, 23 내지 24, 2 내지23, 2 내지 22, 2 내지 21, 2 내지 20, 2 내지 19, 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 2 내지 15, 2 내지 14, 2 내지 13, 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 2 내지 3 시간 이내에 수행된다.
일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극 후 상기 용리 및/또는 수집 단계는 예를 들어 본원 섹션 I-A에 기재된 것과 같이, 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, 정지 상)에 샘플이 첨가된 후 (약) 2 시간 이내에 수행된다.일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극 후 상기 용리 및/또는 수집 단계는 예를 들어 본원 섹션 I-A에 기재된 것과 같이, 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, 정지 상)에 샘플이 첨가된 후 (약) 1 내지 2 시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극 후 상기 용리 및/또는 수집 단계는 예를 들어 본원 섹션 I-A에 기재된 것과 같이, 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, 정지 상)에 샘플이 첨가된 후 (약) 1 일 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극 후 상기 용리 및/또는 수집 단계는 예를 들어 본원 섹션 I-A에 기재된 것과 같이, 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, 정지 상)에 샘플이 첨가된 후 (약) 1 일 미만에 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극 후 상기 용리 및/또는 수집 단계는 예를 들어 본원 섹션 I-A에 기재된 것과 같이, 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, 정지 상)에 샘플이 첨가된 후 (약) 48, 36, 24, 12, 6, 4, 또는 2 시간 이내(수치 포함)에 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극 후 상기 용리 및/또는 수집 단계는 크로마토그래피 컬럼(예를 들어, 정지 상)에 샘플이 첨가된 후 (약) 2 내지 48, 2 내지 36, 2 내지 24, 2 내지 12, 2 내지 6, 2 내지 4, 4 내지 48, 4 내지 36, 4 내지 24, 4 내지 12, 4 내지 6, 6 내지 48, 6 내지 36, 6 내지 24, 6 내지 12, 12 내지 48, 12 내지 36, 12 내지 24, 24 내지 48, 24 내지 36, 또는 36 내지 48 시간 이내에 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극으로부터 용리 또는 수집까지의 단계에 포함된 공정 기간은 48, 36, 24, 12, 6, 4, 또는 2 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극으로부터 용리 또는 수집까지의 단계에 포함된 공정 기간은 36 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극으로부터 용리 또는 수집까지의 단계에 포함된 공정 기간은 24 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극으로부터 용리 또는 수집까지의 단계에 포함된 공정 기간은 12 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극으로부터 용리 또는 수집까지의 단계에 포함된 공정 기간은 (약) 7 시간, 또는 7 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극으로부터 용리 또는 수집까지의 단계에 포함된 공정 기간은 (약) 6.5 시간, 또는 6.5 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극으로부터 용리 또는 수집까지의 단계에 포함된 공정 기간은 (약) 6 시간, 또는 6 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극으로부터 용리 또는 수집까지의 단계에 포함된 공정 기간은 (약) 5.5 시간, 또는 5.5 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극으로부터 용리 또는 수집까지의 단계에 포함된 공정 기간은 (약) 5 시간, 또는 5 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극으로부터 용리 또는 수집까지의 단계에 포함된 공정 기간은 (약) 4.5 시간, 또는 4.5 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 선택 및 온-컬럼 자극으로부터 용리 또는 수집까지의 단계에 포함된 공정 기간은 (약) 4 시간, 또는 4 시간 미만이다.
일부 구현예에서, 세척 배지는 배양 배지이다. 따라서, 일부 구현예에서, 용리된 세포는 다운스트림 프로세싱(예를 들어, 후속 선택 단계, 자극 단계, 인큐베이션 단계, 유전자 조작)으로 직접 진행될 수 있다. 일부 구현예에서, 세척 배지는 글루타민 및 재조합 IL-2, IL-15, 및 IL-7을 함유하는 무혈청 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 배지는 글루타민을 함유하고 재조합 IL-2, IL-15, 및 IL-7 중 하나 이상이 결여된 무혈청 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 세척 배지는 글루타민 및 재조합 IL-2, IL-15, 및 IL-7 중 하나 이상이 결여된 무혈청 기본 배지를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리액은 자극 시약(예를 들어 올리고머 자극 시약)을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택된 세포는 여전히 자극제(예를 들어, 올리고머 자극 시약에 결합된 자극제)에 결합된다. 일부 구현예에서, 용리액에 함유된 자극제는 용리된 세포 및 자극 시약(예를 들어 올리고머 자극 시약)에 결합된다. 따라서, 수집 및/또는 용리된 세포는 자극 조건 하에서 여전히 고려될 수 있다. 일부 구현예에서, 분리 및 용리된 세포는 (예를 들어, 여전히 자극되는) 자극 조건 하에 있다. 일부 구현예에서, 용리된 세포는 예를 들어 섹션 I-C에 기술된 것과 같이, 자극 조건 하에서 계속될 수 있다.
일부 구현예에서, 컬럼 및 수집 컨테이너는 폐쇄 시스템에 연결된다. 일부 구현예에서, 폐쇄 시스템은 멸균이다. 일부 구현예에서, 선택, 자극, 및 용리 단계는 사람, 작동, 또는 간섭과 같이 수동이 거의 없거나 전혀 없는 자동화된 시스템에 의해 수행된다.
E. 유전자 조작
일부 구현예에서, 제공된 방법은 유전적으로 조작되는 세포(예를 들어, 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물), 예를 들어 재조합 단백질을 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것을 포함한다. 상기 재조합 단백질은 섹션 IV에 기재된 임의의 것과 같은 재조합 수용체를 포함할 수 있다. 예를 들어 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드와 같은 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포로 도입시키는 것은 임의의 다수의 공지된 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 벡터는 렌티바이러스 및 감마레트로바이러스가 포함된 바이러스 시스템을 포함한다. 예시적인 방법은 예를 들어 바이러스, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 통한 형질 도입을 포함한 수용체를 암호화 하는 이종 폴리뉴클레오타이드의 전달을 위한 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극된 세포 집단(예를 들어, 선택 및 자극된 세포의 산출 조성물)은, 재조합 수용체를 암호화 하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것과 같이 유전자 조작되고, 이로써 형질 전환된 세포 집단(여기서 형질 전환된 집단의 세포로도 지칭)을 생성한다.
특정 구현예에서, 세포는 예컨대 본원, 예를 들어 섹션 I-C에 제공된 임의의 방법에 의한 것과 같은 온-컬럼 자극을 수행한 후 세포(예를 들어, T 세포, CD3+, CD4+, CD8+ T 세포)는 유전자 조작, 형질 전환 또는 형질 도입된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극된 집단은 이전에 동결 보존 및 보관되었고, 세포를 유전자 조작, 형질 전환, 형질 감염 또는 형질도입하기 전에 해동된다.
특정 구현예에서, 세포가 자극되거나 자극의 대상 또는 자극 조건(예를 들어 온-컬럼 자극) 하에서 배양된 후에, 세포(예를 들어, T 세포, CD3+, CD4+, CD8+ T 세포)는 유전자 조작, 형질 전환 또는 형질 도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 자극 개시로부터 (약) 72 시간, 60 시간, 48 시간, 36 시간, 24 시간, 12 시간, 5 시간, 4 시간, 또는 2 시간 또는 72 시간, 60 시간, 48 시간, 36 시간, 24 시간, 12 시간, 5 시간, 4 시간, 또는 2 시간 이내(수치 포함), 유전자적으로 조작, 형질 전환 또는 형질 도입된다. 일부 구현예에서, 세포는 온-컬럼 자극의 개시로부터 (약) 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간에 유전적으로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 온-컬럼 자극의 개시로부터 (약) 4 내지 5 시간에 유전적으로 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작 동안에 여전히 자극 조건 하에 있다. 특정 구현예에서, 세포는 자극의 개시 후 (약) 2 시간 내지 6 시간 또는 6 시간 내지 12 시간 사이에 유전적으로 조작, 형질 전환, 또는 형질 도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 자극 개시 후 (약) 12 시간 내지 48 시간, 16 시간 내지 36 시간, 또는 18 시간 내지 30 시간 사이에 유전자적으로 조작, 형질 전환 또는 형질 도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 자극의 개시 후 (약) 18 내지 30 시간 사이에 유전자적으로 조작, 형질 전환 또는 형질 도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 자극의 개시 후 (약) 22 시간 또는 24 시간에 유전적으로 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 자극의 개시 후 (약) 6 시간 또는 12 시간에 유전적으로 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 자극의 개시 후 (약) 4 시간 또는 5 시간에 유전적으로 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다. 특정 구현예에서, 세포는 자극의 개시 후 (약) 2 시간 또는 3 시간에 유전적으로 조작, 형질전환, 또는 형질도입된다.
특정 구현예에서, 유전자 조작 방법은 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드와 집단(예를 들어 선택 및 자극된 세포의 산출 집단)의 하나 이상의 세포를 접촉시키거나 상기를 도입시킴으로써 수행된다. 특정 구현예에서, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 세포에 대한 이종이다. 특정 구현예에서, 이종 핵산 분자 또는 이종 폴리뉴클레오타이드는 세포에 고유하지 않다. 특정 구현예에서, 이종 핵산 분자 또는 이종 폴리 뉴클레오티드는 세포에 의해 고유하게 발현되지 않는 단백질, 예를 들어 재조합 단백질을 암호화한다. 특정 구현예에서, 이종 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 접촉 또는 도입 전에 세포에서 발견되지 않는 핵산 서열이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 산출 조성물은, 형질 도입 보조제의 존재 하에 조작, 예를 들어 형질 도입된다. 예시적인 형질 도입 보조제는 다가양이온, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴-유래 단편 또는 변이체 및 레트로넥틴(RetroNectin)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 특정 구현예에서, 세포는 다가양이온, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴-유래 단편 또는 변이체 및/또는 레트로넥틴의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 폴리브렌, DEAE-덱스트란, 프로타민 설페이트, 폴리-L-리신 또는 양이온성 리포솜인 다가양이온의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 프로타민 설페이트의 존재 하에 조작된다.
일부 구현예에서, 유전자 조작, 예를 들어 형질 도입은 예를 들어 본원 섹션 III 또는 국제 출원 PCT/US2018/064627에 기재된 무혈청 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 정의되거나(defined) 또는 잘-정의된(well-defined) 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 가공된, 예를 들어 저해제 및/또는 성장 인자를 제거하기 위해 여과된 제어된 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 배지는 글루타민을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포 대해 내인성이고/거나 T 세포에 의해 발현되는 수용체에 결합하고/거나 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스 번들 패밀리의 멤버이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4-알파-헬릭스 번들 패밀리의 멤버는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9 (IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)를 포함하되 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 IL-2이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 자극된 세포는 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15의 존재로 자극 조건 하에서 조작된다. 특정 구현예에서, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15는 재조합이다. 특정 구현예에서, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15는 인간이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15이거나 이를 포함한다. 특정한 구현예에서, 세포는 조작, 예를 들어 형질도입 되거나 재조합 IL-2, IL-7, 및 IL-15의 존재 하에서 자극 조건하에서 조작된다.
일부 구현예에서, 세포는 자극 동안 존재했던 것과 동일하거나 유사한 배지의 존재 하에 유전적으로 조작, 형질 전환 또는 형질 도입된다. 일부 구현예에서, 세포는 자극 중 존재하는 배지와 동일한 사이토카인을 갖는 배지에서 유전자적으로 조작, 형질 전환 또는 형질 도입된다. 일부 구현예에서, 세포는 자극 중 존재하는 배지와 동일한 농도로 동일한 사이토카인을 갖는 배지에서 유전자적으로 조작, 형질 전환 또는 형질 도입된다.
1. 형질도입
일부 구현예에서, 세포를 유전자 조작하는 것은 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 형질 도입에 의해 세포 내로 도입하는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 형질 도입되거나 형질 도입의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 형질 도입되거나 형질 도입의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 바이러스는 감마레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 형질도입 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌[Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 형질도입은 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 분자와 집단(예를 들어, 산출 조성물)의 하나 이상의 세포를 접촉시킴으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉은 회전 접종(예를 들어 원심분리 접종)과 같은 원심분리로 달성될 수 있다. 상기 방법은 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기재된 바와 같은 임의의 것을 포함한다. 예시적인 원심분리 챔버는 Biosafe SA에 의해 생산 및 판매되는 챔버를 포함하며, Sepax® 및 Sepax® 2 시스템과 함께 사용하기 위한 챔버를 포함하고, A-200/F 및 A-200 원심분리 챔버 및 상기 시스템과 함께 사용하기 위한 다양한 키트를 포함한다. 예시적인 챔버, 시스템 및 프로세스 기기 및 캐비닛은 예를 들어 문헌[미국 특허 번호 6,123,655, 미국 특허 번호 6,733,433 및 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0171951 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/38762]에 기재되어 있고, 각각의 내용은 전문이 여기에 참조로 포함된다. 상기 시스템과 함께 사용하기 위한 예시적인 키트는 제품 이름 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2로 BioSafe SA에서 판매되는 일회용 키트를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 바이러스 벡터를 자극된 세포 집단 중 (약) 300 × 106개 또는 이의 미만의 세포, 예를 들어, 자극된 세포 집단의 생존 가능한 T 세포로 형질도입하는 것과 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 자극된 세포 집단 중 (약) 100 × 106개의 세포, 예를 들어, 생존 가능한 T 세포가 형질 도입되거나 형질 도입의 대상이 된다. 특정 구현예에서, mL 당 1 × 106개의 세포, 예를 들어 자극된 세포 집단 중 생존 가능한 T 세포가 형질 도입되거나 형질 도입의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 투입량(dose)은 세포 1 x 106개 당 (약) 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 μL이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 투입량은 세포 1 x 106개 당 (약) 6 내지 4 μL 사이이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 투입량은 세포 1 x 106개 당 (약) 5 μL이다.
일부 구현예에서, 형질도입은 무혈청 배지에서 수행된다. 특정한 구현예에서, 형질도입은 IL-2, IL-7, 및 IL-15의 존재 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 형질도입을 위한 바이러스 벡터는 동결되고 사용되기 전 해동되며, 해동된 바이러스 벡터는 무혈청 배지로 희석된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 희석 및 형질도입을 위한 무혈청 배지는 본원 섹션 III 또는 국제 출원 PCT/US2018/064627에 기재된 것이다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충물이 보충된 기본 배지 (예를 들어, OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher),를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물은 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 세포(예를 들어, T 세포)의 유지, 증폭 및/또는 활성화를 위한 하나 이상의 추가 성분, 예를 들어 추가적 보충물 (예를 들어, OpTmizer ™ T- 세포 증폭 보충물 (ThermoFisher))에 의해 제공되는 것으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체물, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체물, 또는 문헌[Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체물을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 L-글루타민과 같은 유리 형태의 아미노산을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 Glutamax™ (ThermoFisher)의 디펩타이드와 같은 디펩타이드 형태의 L-글루타민(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15와 같은 하나 이상의 재조합 사이토카인을 더 포함한다.
특정 구현예에서, 세포, 예를 들어 자극된 세포 집단(예를 들어, 산출 조성물)의 세포는, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포인 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 형질 도입 후 인큐베이션을 포함한 형질 도입은 24 내지 48 시간, 36 내지 12 시간, 18 내지 30 시간에 또는 (약) 24 시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 형질 도입 후 인큐베이션을 포함한 형질 도입은 (약) 72 ± 6 시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 형질도입은 (약) 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 또는 5 시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 형질도입은 (약) 0.5, 1, 1.5, 또는 2 시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 형질도입은 (약) 0.5 내지 1.5 시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 형질도입은 (약) 1시간 동안 수행된다.
특정 구현예에서, 형질 도입 단계는, 인큐베이션, 예를 들어 자극 조건 하의 인큐베이션 시작 또는 개시의 2 일 이내, 36 시간 이내, 30 시간 이내, 24 시간 이내, 12 시간 이내, 5 시간 이내, 4 시간 이내 또는 2 시간 이내에 개시된다. 특정 구현예에서, 형질 도입 단계는, 인큐베이션, 예를 들어 자극 조건 하의 인큐베이션 시작 또는 개시의 4 내지 5시간 내에 개시된다. 특정 구현예에서, 형질 도입 단계는, 인큐베이션, 예를 들어 자극 조건 하의 인큐베이션 시작 또는 개시의 약 20시간에 개시된다. 특정 구현예에서, 형질 도입 단계는, 인큐베이션, 예를 들어 자극 조건 하의 인큐베이션 시작 또는 개시의 (약) 4 내지 5시간에 개시된다.
일부 구현예에서, 시스템은 형질 도입 단계 및 시스템, 예를 들어 본 명세서 또는 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기재된 바와 같은 원심분리 챔버로 수행되거나 이와 연합하여 수행될 수 있는 하나 이상의 프로세싱 단계에서 수행되는 하나 이상의 다양한 다른 프로세싱 단계의 측면을 작동, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하기 위한 기기를 포함하여 다른 기기와 공동으로 포함되고/거나 이와 공동으로 배치된다. 일부 구현예에서 상기 기기는 캐비닛 내에 포함되어 있다. 일부 구현예에서, 기기에는 제어 회로, 원심분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 수용한 하우징을 포함한 캐비닛이 포함된다. 예시적인 디바이스가 문헌[미국 특허 번호 6,123,655, 미국 특허 번호 6,733,433 및 US 2008/0171951]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 시스템은 일련의 컨테이너, 예를 들어 백, 튜브, 스톱콕, 클램프, 커넥터 및 원심분리 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 백과 같은 컨테이너는 동일한 백 또는 별도의 백과 같은 동일한 컨테이너 또는 별도의 컨테이너에 형질도입될 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 백과 같은 하나 이상의 컨테이너를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 챔버 내로 들어오는 희석제 및/또는 세척 용액 및/또는 방법 중에 성분 및/또는 집단을 희석, 재현탁 및/또는 세척하기 위한 기타 성분 같은 배지를 함유하는, 백 같은 하나 이상의 컨테이너를 추가로 포함한다. 컨테이너는 시스템의 하나 이상의 위치에, 예컨대 입력 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 출력 라인에 대응하는 위치에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 챔버는 예컨대 회전축 주위로 챔버를 회전시킬 수 있는 원심분리기와 결합되어 있다. 회전은 세포의 형질도입과 관련하여 및/또는 다른 프로세싱 단계 중 하나 이상에서 인큐베이션 이전, 동중 및/또는 이후에 발생할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 하나 이상의 다양한 프로세싱 단계는 예를 들어, 특정 힘으로 회전되면서 수행된다. 챔버는 챔버가 원심분리 중에 수직으로 위치하고 측면 벽과 축은 수직 또는 일반적으로 수직이며, 말단 벽은 수평 또는 일반적으로 수평이 되도록, 챔버는 전형적으로 수직 또는 일반적으로 수직 회전할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포를 함유하는 집단 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 집단, 및 선택적으로 공기는 공동에 집단을 제공하기 전에 결합 또는 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 함유하는 집단 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 집단, 및 선택적으로 공기는 별도로 제공되고, 공동에서 결합 또는 혼합된다. 일부 구현예에서, 세포를 함유하는 집단, 바이러스 벡터 입자를 함유하는 집단, 및 선택적으로 공기는 임의의 순서로 내부 공동에 제공될 수 있다. 상기 임의의 일부 구현예에서, 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 집단은, 원심분리 챔버 내부 또는 외부에서 결합 또는 혼합되고/거나 세포 및 바이러스 벡터 입자가 원심분리 챔버에 같이 또는 별도로, 예컨대 동시에 또는 순차적으로 제공되든지 상관없이 일단 결합 또는 서로 혼합되면 투입 집단이 된다.
일부 구현예에서, 공기와 같은 가스 부피의 유입은, 형질 도입 방법에서 회전과 같은 세포 및 바이러스 벡터 입자를 인큐베이션 하기 전에 발생한다. 일부 구현예에서, 공기와 같은 가스 부피의 유입은, 형질 도입 방법에서 회전과 같은 세포 및 바이러스 벡터 입자를 인큐베이션 하는 동안 발생한다.
일부 구현예에서, 형질 도입 집단을 구성하는 세포 또는 바이러스 벡터 입자의 액체 부피, 및 선택적으로 공기의 부피는 미리 결정된 부피일 수 있다. 상기 부피는 시스템과 관련된 회로에 의해 프로그램되고/거나 제어되는 부피일 수 있다.
일부 구현예에서, 형질 도입 집단 및 선택적으로 공기와 같은 가스의 유입은, 원하는 또는 미리 결정된 부피가 챔버의 내부 공동으로 유입될 때까지 수동, 반자동 및/또는 자동으로 제어된다. 일부 구현예에서, 시스템과 관련된 센서는, 예컨대 색상, 유속 및/또는 밀도를 통해 원심분리기 챔버로 흘러가고 오는 액체 및/또는 가스를 검출할 수 있고, 상기 원하는 또는 미리 결정된 부피의 유입이 달성될 때까지 필요에 따라 유입을 중지하거나 계속하기 위해 관련 회로와 통신할 수 있다. 일부 측면에서, 가스(예를 들어 공기)가 아닌 시스템의 액체만을 검출하도록 프로그램되거나 검출할 수 있는 센서는 유입을 중단시키지 않고 시스템으로 공기와 같은 가스의 통과가 가능하도록 제조될 수 있다. 상기 일부 구현예에서, 불투명한 튜브 조각이 공기와 같은 가스의 유입이 필요한 동안 센서 근처의 라인에 배치될 수 있다. 일부 구현예에서, 공기와 같은 가스의 유입을 수동으로 제어할 수 있다.
제공된 방법의 측면에서, 원심분리기 챔버의 내부 공동은 고속 회전에 노출된다. 일부 구현예에서, 회전은 액체 투입 집단, 및 선택적으로 공기의 유입과 전, 동시에, 후속적으로 또는 간헐적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 액체 입력 집단 및 선택적으로 공기의 유입 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 회전은 내부 공동의 측면 벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면 층에서 (약) 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g, 3200 g, 3500 g 또는 4000 g, 또는 (약) 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 1000 g, 1100 g, 1500, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2500 g, 3000 g, 3200 g, 3500 g 또는 4000 g 이상의 상대적인 원심력으로 원심분리기 챔버의 원심분리에 의한다. 일부 구현예에서, 회전은, 약 1100 g 또는 초과, 예컨대 약 1200 g 또는 초과, 약 1400 g 또는 초과, 약 1600 g 또는 초과, 약 1800 g 또는 초과, 약 2000 g 또는 초과, 약 2400 g 또는 초과, 약 2800 g 또는 초과, 약 3000 g 또는 초과 또는 약 3200 g 또는 초과한 힘의 원심분리에 의한다. 특정 구현예에서, 원심분리에 의한 회전은 600 g 내지 800 g의 힘에 의한다. 특정 구현예에서, 원심분리에 의한 회전은 (약) 693 g의 힘에 의한다. 일부 구현예에서, 회전은 (약) 1600 g 힘의 원심분리에 의한다.
일부 구현예에서, 챔버의 공동에 있는 공기와 같은 가스가 챔버에서 배출된다. 일부 구현예에서, 공기와 같은 가스가 원심 분리 챔버를 가진 폐쇄 시스템의 일부로서 작동 가능하게 연결된 컨테이너로 배출된다. 일부 구현예에서, 컨테이너는 비어있는 또는 빈 컨테이너이다. 일부 구현예에서, 챔버의 공동에 있는 가스와 같은 공기는 멸균 튜브 라인을 경유하여 챔버의 내부 공동에 작동 가능하게 연결된 필터를 통해 배출된다. 일부 구현예에서, 공기는 수동, 반자동 또는 자동 프로세스를 사용하여 배출된다. 일부 구현예에서, 공기는, 인큐베이션된 세포 및 바이러스 벡터 입자, 예컨대 형질 도입이 개시된 세포 또는 챔버의 공동에서 바이러스 벡터로 형질 도입된 세포를 함유하는 산출 집단을 발현하기 전, 동시에, 간헐적으로 또는 후속 적으로 챔버에서 배출된다.
일부 구현예에서, 형질 도입 및/또는 다른 인큐베이션은 연속 또는 반-연속 프로세스로서 또는 상기의 일부로서 수행된다. 일부 구현예에서, 연속 프로세스는 세포 및 바이러스 벡터 입자, 예를 들어 형질 도입 조성물 (단일 기존 조성물로서 또는 동일한 컨테이너, 예를 들어 공동으로의 연속 유입에 의해 및 이로써 상기 일부의 혼합)의 연속 유입 및/또는 배양의 적어도 일부 동안, 예를 들어 원심 분리 동안 컨테이너에서 액체의 연속적인 발현 또는 배출 및 선택적으로 가스(예를 들어, 공기)의 배출을 수반한다. 일부 구현예에서, 연속 유입 및 연속 발현은 적어도 부분적으로 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 연속 유입은 인큐베이션의 일부 중, 예를 들어, 원심분리의 일부 중 발생하고, 연속 발현은 인큐베이션의 별개의 부분 중 발생한다. 둘은 번갈아 가며 할 수 있다. 따라서, 인큐베이션을 수행하는 동안, 연속 유입 및 발현은 전반적인 보다 많은 부피의 샘플의 가공, 예를 들어, 형질 도입을 가능하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 연속 프로세스의 일부이며, 방법은 적어도 인큐베이션의 일부 중, 챔버의 회전 중 공동으로 상기 형질 도입 조성물의 연속 유입을 달성하고, 인큐베이션의 일부 중, 챔버의 회전 중 1회 이상의 개방을 통해 공동에서 액체의 연속 발현 및 선택적으로 가스(예를 들어 공기)의 배출을 달성하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 반연속 인큐베이션은 공동으로 조성물의 유입, 인큐베이션, 공동에서 액체의 발현 및 선택적으로 공동에서, 예컨대 산출 컨테이너로 가스(예를 들어 공기)의 배출을 수행하고 이어서 보다 많은 세포 및 프로세싱을 위한 다른 시약, 예를 들어 바이러스 벡터 입자를 함유하는 후속적인(예를 들어, 제2, 제3 등) 조성물의 유입 및 상기 프로세스의 반복을 교대로 함으로써 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 인큐베이션은 반연속 프로세스의 일부이고, 방법은 인큐베이션 전, 상기 1회 이상의 개방을 통해 공동으로 형질 도입 조성물의 유입 및 후속적인 인큐베이션을 수행, 공동에서 액체의 발현을 수행하고; 상기 내부 공동으로 세포 및 바이러스 벡터 입자를 포함하는 또 다른 형질 도입 조성물의 유입을 수행하고; 조건 하에서 상기 내부 공동의 또 다른 형질 도입 조성물을 인큐베이션함으로서, 상기 또 다른 형질 도입 조성물의 상기 세포가 상기 벡터로 형질 도입되거나 형질 도입의 대상이 되는 것;을 포함한다. 프로세스는 여러 번의 추가 라운드에 대해 반복적인 방식으로 계속될 수 있다. 상기 측면에서, 반연속 또는 연속적인 방법은 훨씬 더 많은 부피 및/또는 세포 수의 생산을 허용할 수 있다.
일부 구현예에서, 형질 도입 인큐베이션의 일부는, 회전 또는 원심분리를 포함하는 조건 하에서 수행되는 원심 분리 챔버에서 수행된다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터로 세포의 형질 도입은 회전 접종, 예를 들어, 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 혼합물의 원심분리이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 및 바이러스 입자를 함유하는 조성물을 일반적으로 상대적으로 작은 힘 또는 낮은 속도, 예컨대 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 것보다 더 낮은 속도, 예컨대 (약) 600 rpm 내지 1700 rpm(예를 들어 (약) 600 rpm, 1000 rpm 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm 또는 600 rpm, 1000 rpm 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm 이상)으로 회전시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은 예를 들어 챔버 또는 공동의 내벽 또는 외벽에서 측정된 바와 같은, (약) 100g 내지 4000g의 힘(예를 들어 (약) 100g, 200g, 300g, 400g, 500g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1000g, 1500g, 2000g, 2500g, 3000g 또는 3500g 또는 (약)100g, 200g, 300g, 400g, 500g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1000g, 1500g, 2000g, 2500g, 3000g 또는 3500g 이상)으로, 예를 들어, 상대 원심력으로 수행된다.
일부 구현예에서, 세포는 (약) 100 g 내지 4000 g, 200 g 내지 1,000 g, 500 g 내지 1200 g, 1000 g 내지 2000 g, 600 g 내지 800 g, 1200 g 내지 1800 g 또는 1500 g 내지 1800 g의 힘, 예를 들어, 상대적인 원심력에서 바이러스 벡터로 회전 접종된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1000 g, 1200g, 1500 g, 1600g, 2000 g, 2500 g, 3000 g, 3200 g 또는 3500 g 또는 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 600 g, 700 g, 800 g, 900 g, 1000 g, 1200g, 1500 g, 1600g, 2000 g, 2500 g, 3000 g, 3200 g 또는 3500 g 이상 동안 바이러스 벡터 입자로 회전 접종된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 692 g의 힘에서 바이러스 벡터로 형질 도입되거나 형질 도입의 대상이 된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 1600 g의 힘에서 바이러스 벡터로 형질 도입되거나 형질 도입의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 힘은 내부 공동의 측면 벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면 층에서의 힘이다.
특정 구현예에서, 세포는 회전 접종, 예를 들어, 세포 및 바이러스 벡터를 함유하는 세포 조성물이 약 5 분 또는 초과, 예컨대 약 10 분 또는 초과, 약 15 분 또는 초과, 약 20 분 또는 초과, 약 30 분 또는 초과, 약 45 분 또는 초과, 약 60 분 또는 초과, 약 90 분 또는 초과 또는 약 120 분 또는 초과; 또는 (약) 5 분 내지 120 분, 30 분 내지 90 분, 15 분 내지 60 분, 15 분 내지 45 분, 30 분 내지 60 분 또는 45 분 내지 60 분(각각의 수치 포함) 동안 회전된다. 일부 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 (약) 30분 동안 회전 접종된다. 특정 구현예에서, 세포는 바이러스 벡터로 (약) 60 분 동안 회전 접종된다.
일부 구현예에서, 형질 도입 방법은, 약 5 분 또는 초과, 예컨대 약 10 분 또는 초과, 약 15 분 또는 초과, 약 20 분 또는 초과, 약 30 분 또는 초과, 약 45 분 또는 초과, 약 60 분 또는 초과, 약 90 분 또는 초과 또는 약 120 분 또는 초과 동안 회전 접종, 예를 들어, 원심분리기 챔버에서 형질 도입 조성물 및 선택적으로 공기의 회전 또는 원심분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 형질 도입 조성물, 및 선택적으로 공기는 5 분 초과이나 60 분 이내, 45 분 이내, 30 분 이내 또는 15 분 이내 동안 원심분리기 챔버에서 회전되거나 원심분리된다. 특정 구현예에서, 형질 도입은 (약) 60 분 동안 회전 또는 원심분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 형질 도입 방법은 (약) 10 분 내지 60 분, 15 분 내지 60 분, 15 분 내지 45 분, 30 분 내지 60 분 또는 45 분 내지 60 분(각 수치 포함) 동안 내부 공동의 측면 벽의 내부 표면 및/또는 세포의 표면 층에서 (약) 1000 g, 1100 g, 1200 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 1800 g, 2000 g, 2200 g, 2400 g, 2800 g, 3200 g 또는 3600 g의 힘으로 원심분리기 챔버에서 형질 도입 조성물 및 선택적으로 공기의 회전 또는 원심분리를 포함한다. 특정 구현예에서, 형질 도입 방법은, (약) 1600 g에서 (약) 60 분 동안 형질 도입 조성물, 예를 들어 세포 및 바이러스 벡터 입자의 회전 또는 원심분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 형질도입의 방법은 회전 또는 원심분리를 포함하지 않는다.
2. 바이러스 벡터 입자
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포 내로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다(예를 들어 문헌[Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조).
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat sequence, LTR), 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수증식 육종바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV), 뮤린 배아줄기세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus, MESV), 뮤린 줄기세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV), 비장 병소 형성 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV) 또는 아데노 연관 바이러스(AAV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터를 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유래된 것을 포함한다. 레트로바이러스는 통상적으로 인간을 포함하여 몇몇 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미하는, 암포트로픽(amphotropic)이다. 일 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스의 gag(객), pol(폴) 및/또는 env(엔브) 서열을 대체한다. 수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 문헌[예를 들어, 미국 특허 번호 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109]에 기재되어 있다.
바이러스 벡터 유전체는 전형적으로 패키징 또는 생산자 세포주로 형질감염될 수 있는 플라스미드 형태로 작제된다. 상기 예 중 어느 하나에서, 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 암호화하는 핵산은 일반적으로 바이러스 게놈의 비필수 영역에서와 같이 바이러스 벡터의 영역으로 삽입되거나 위치된다. 일부 구현예에서, 핵산은 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈으로 삽입되어 복제 결함이 있는 바이러스를 생성한다.
유전체가 바이러스 벡터 유전체의 RNA 카피를 함유하는 레트로바이러스 입자를 생성하기 위해 다양한 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 성분이 바이러스 기반 유전자 전달 시스템을 만드는데 관여하는데, 첫째, 구조 단백질뿐만 아니라 바이러스 벡터 입자를 생성하는데 필요한 효소를 포함하는 패키징 플라스미드이고, 둘째, 바이러스 벡터 자체, 즉, 전달될 유전 물질이다. 생물학적 안전성 보호 장치를 상기 성분 중 하나 또는 둘 다의 설계에 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 패키징 플라스미드는 외피 단백질 이외의 HIV-1과 같은 모든 레트로바이러스 단백질을 함유할 수 있다(Naldini et al., 1998). 다른 구현예에서, 바이러스 벡터에는 독성과 관련된 유전자, 예를 들어 vpr, vif, vpu 및 nef 및/또는 Tat, 즉 HIV의 1차 전이 활성 인자(transactivator)와 같은 추가 바이러스 유전자가 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV 기반 렌티바이러스 벡터와 같은 렌티바이러스 벡터는 모 바이러스의 3가지 유전자: gag, pol 및 rev만을 포함하며, 이는 재조합을 통한 야생형 바이러스의 재구성 가능성을 감소 시키거나 제거한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 유전체는 바이러스 벡터 유전체로부터 전사된 바이러스 유전체 RNA를 바이러스 입자로 패키징하는 데 필요한 모든 성분을 함유하는 패키징 세포주에 도입된다. 대안적으로, 바이러스 벡터 게놈은 하나 이상의 서열, 예를 들어, 관심 재조합 핵산뿐만 아니라 바이러스 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나, 일부 측면에서, 표적 세포에서 유전체의 복제를 방지하기 위하여, 복제에 필요한 내인성 바이러스 유전자는 제거되고 패키징 세포주에 별도로 제공된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 입자를 생성하는데 필요한 성분을 함유하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질주입된다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 LTR, 시스-작용(cis-acting) 패키징 서열 및 관심 서열, 즉 CAR과 같은 항원 수용체를 암호화하는 핵산; 및 바이러스의 효소 성분 및/또는 구조 성분, 예컨대 Gag, pol 및/또는 rev를 암호화하는 하나 이상의 헬퍼 플라스미드를 포함한 바이러스 벡터 유전체를 함유하는 플라스미드로 형질주입된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전 성분을 분리하기 위해 다중 벡터가 이용된다. 상기 일부 구현예에서, 패키징 세포에 별도의 벡터를 제공하는 것은 달리 복제 가능 바이러스를 생성할 수 있는 재조합 사건의 기회를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 모든 레트로바이러스 성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자는 숙주 세포의 형질도입 효율을 증가시키기 위한 유사형이다. 예를 들어, 일부 구현예에서 레트로바이러스 벡터 입자, 예컨대 렌티바이러스 벡터 입자는 VSV-G 당단백질을 갖는 유사형이고(pseudotyped), 이는 형질도입될 수 있는 세포 유형을 증폭하여 광범위한 세포 숙주 범위를 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 예컨대 신드비스(Sindbis) 바이러스 외피, GALV 또는 VSV-G와 같은 이종향성(xenotropic), 다방성(polytropic) 또는 암포트로픽(amphotropic) 외피를 포함하는 비천연 외피 당단백질을 암호화하는 플라스미드 또는 폴리뉴클레오타이드로 형질주입된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 바이러스 유전체 RNA를 렌티바이러스 벡터 입자로 패키징하기 위해 트랜스에서 요구되는 바이러스 조절 및 구조 단백질을 포함한 성분을 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 렌티바이러스 단백질을 발현하고 기능성 렌티바이러스 벡터 입자를 생성할 수 있는 임의의 세포주일 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 패키징 세포주에는 293(ATCC CCL X), 293T, HeLA(ATCC CCL 2), D17(ATCC CCL 183), MDCK(ATCC CCL 34), BHK(ATCC CCL-10) 및 Cf2Th(ATCC CRL 1430) 세포가 포함된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 안정적으로 바이러스 단백질(들)을 발현한다. 예를 들어, 일부 측면에서, gag, pol, rev 및/또는 기타 구조 유전자를 함유하나 LTR 및 패키징 성분은 함유하지 않는 패키징 세포주가 작제될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 이종 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 외피 당단백질을 암호화하는 핵산을 함유하는 바이러스 벡터 유전체와 함께 하나 이상의 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 일시적으로 형질주입될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 및 패키징 및/또는 헬퍼 플라스미드는 패키징 세포주 내로 형질주입 또는 감염을 통해 도입된다. 패키징 세포주는 바이러스 벡터 유전체를 함유하는 바이러스 벡터 입자를 생산한다. 형질주입 또는 감염을 위한 방법은 잘 알려져 있다. 비제한적인 예에는 인산 칼슘, DEAE-덱스트란 및 리포펙션(lipofection) 방법, 전기 천공법 및 미세주입이 포함된다.
재조합 플라스미드, 및 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열이 특수 세포주로(예를 들어, 인산 칼슘 침전에 의해) 도입될 때, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사물이 바이러스 입자로 패키징되도록 허용할 수 있으며, 이어서 이는 배양 배지로 분비될 수 있다. 이어서 일부 구현예에서 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지가 수집되고, 임의적으로 농축 및 유전자 전달을 위해 사용된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 패키징 플라스미드 및 패키징 세포주로의 전달 벡터와의 공형질 감염 후, 바이러스 벡터 입자는 배양 배지로부터 회수되고 당업자들에 의해 사용되는 표준 방법에 의해 적정된다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 입자의 생성을 허용하는 플라스미드의 도입에 의해 예시적인 HEK 293T 세포주와 같은 패키징 세포주에서 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포는 형질주입되고/거나 gag 및 pol을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체(예를 들어 CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 rev 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 임의적 및/또는 추가적으로 형질주입되고/거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 VSV-G와 같은 비천연 외피 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 임의적 및/또는 추가적으로 형질주입되고/거나 이를 함유한다. 일부 상기 구현예에서, 세포(예를 들어, HEK 293T 세포)의 형질주입 후 대략 2일 후에, 세포 상청액은 재조합 렌티바이러스 벡터를 함유하고 이는 회수되어 적정될 수 있다.
회수 및/또는 생성된 레트로바이러스 벡터 입자는 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 표적 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 일단 표적 세포에서, 바이러스 RNA는 역전사되고, 핵으로 들어가서 안정적으로 숙주 유전체에 통합된다. 바이러스 RNA의 통합 후 1 또는 2일 후, 재조합 단백질(예를 들어, 항원 수용체, 예컨대 CAR)의 발현이 검출될 수 있다.
3. 세포의 인큐베이션
특정 구현예에서, 예컨대 바이러스 벡터로 세포(예를 들어, 산출 조성물)의 형질 전환(예를 들어 형질 도입)에 의한 유전자 조작은 바이러스 벡터를 갖는 세포의 도입 또는 접촉 후 세포를 인큐베이션 하는 하나 이상의 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포 집단의 세포는 세포로 바이러스 벡터를 도입시키기 위하여 세포의 유전자 조작, 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염을 위한 후속적인 프로세스에서 인큐베이션 된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 인큐베이션된 세포의 집단(여기서 인큐베이션된 세포 집단으로도 지칭)을 초래한다.
일부 구현예에서, 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 바이러스 벡터 입자의 도입이 세포의 추가적인 프로세싱 없이 수행된 후에, 세포는 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션 전에 세포는 세척되어 예컨대, 회전 접종 후 유전자 조작 프로세스 후에 배지에 남아있는 것과 같은 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 바이러스 벡터 입자를 암호화하는 외인성 또는 남아있는 폴리뉴클레오타이드를 제거하거나 실질적으로 제거한다.
상기 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션이 하나 이상의 세포의 숙주 게놈으로 바이러스 벡터의 통합을 초래하는 조건 하에서 수행된다. 인큐베이션이 숙주 게놈으로 바이러스 벡터 입자의 통합을 초래했는지 여부를 평가하거나 결정하고, 따라서 추가 인큐베이션에 대한 조건을 경험적으로 결정하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. 일부 구현예에서, 숙주 게놈으로 바이러스 벡터의 통합은, 인큐베이션 후 바이러스 벡터 입자의 게놈에 함유된 핵산에 의해 암호화된 이종 단백질과 같은 재조합 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. 재조합 분자의 발현 수준을 평가하기 위한 다수의 잘 알려진 방법으로, 예컨대 유세포 분석에 의해 예를 들어, 세포 표면 단백질의 맥락에서 예컨대, 친화도 기반 방법, 예를 들어, 면역 친화도 기반 방법에 의한 검출이 사용될 수 있다. 일부 예에서, 발현은 형질 도입 마커 및/또는 리포터 작제물의 검출에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 절단형 표면 단백질을 암호화하는 핵산은 벡터 내에 포함되고, 발현 및/또는 이의 증진 마커로서 사용된다.
특정 구현예에서, 인큐베이션은 원심 분리, 떨림, 회전, 흔들림 또는 관류, 예를 들어 배지의 연속 또는 반 연속 관류를 수반하지 않는 조건과 같은 정적 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 개시 전 또는 직후, 예를 들어 5 분, 15 분 또는 30 분 이내에, 세포는 백 또는 바이알과 같은 컨테이너로 전달(예를 들어, 멸균 조건 하에서 전달)되고, 인큐베이터에 배치된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 예를 들어, 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기재된 바와 같은 원심분리기 챔버의 내부 공동에서 수행된다.
일부 구현예에서, 이종 또는 재조합 폴리펩타이드, 예를 들어, 바이러스 벡터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 도입되었던 세포는 인큐베이션을 위한 컨테이너로 전달된다. 일부 구현예에서, 컨테이너는 바이알(vial)이다. 특정 구현예에서, 컨테이너는 백(bag)이다. 일부 구현예에서, 세포 및 선택적으로 이종 또는 재조합 폴리펩타이드는 폐쇄되거나 또는 멸균 조건 하에서 컨테이너로 전달된다. 일부 구현예에서, 이어서 컨테이너, 예를 들어, 바이알 또는 백은 인큐베이션의 전부 또는 일부를 위해 인큐베이터에 배치된다. 특정 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 16℃, 24℃ 또는 35℃ 또는 16℃, 24℃ 또는 35℃ 이상으로 설정된다. 일부 구현예에서, 인큐베이터는 (약) 37℃ 또는 37℃ ±2℃, ±1℃, ±0.5℃ 또는 ±0.1℃로 설정된다.
일부 측면에서, 인큐베이션을 위한 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 무혈청 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 정의(defined)되고/되거나 또는 잘-정의된(well-defined) 세포 배양 배지이다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 가공된, 예를 들어 저해제 및/또는 성장 인자를 제거하기 위해 여과된 제어된 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 단백질을 함유한다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 혈청 알부민, 가수분해물, 성장 인자, 호르몬, 담체 단백질 및/또는 부착 인자를 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포 대해 내인성이고/거나 T 세포에 의해 발현되는 수용체에 결합하고/거나 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스 번들 패밀리의 멤버이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4-알파-헬릭스 번들 패밀리의 멤버는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9 (IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)를 포함하되 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 IL-2이거나 이를 포함한다.
특정한 구현예에서, 세포는 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15의 존재 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15는 재조합이다. 특정 구현예에서, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15는 인간이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15이거나 이를 포함한다. 특정한 구현예에서, 세포는 재조합 IL-2, IL-7, 및 IL-15의 존재 하에서 인큐베이션 된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포는, 1 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 10 IU/mL 내지 50 IU/mL, 50 IU/mL 내지 100 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 100 IU/mL 내지 500 IU/mL, 250 IU/mL 내지 500 IU/mL 또는 500 IU/mL 내지 1,000 IU/mL의 농도로 사이토카인, 예를 들어 재조합 인간 사이토카인과 함께 인큐베이션 된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포는, 1 IU/mL 내지 500 IU/mL, 10 IU/mL 내지 250 IU/mL, 50 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 150 IU/mL, 75 IU/mL 내지 125 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL 또는 10 IU/mL 내지 100 IU/mL의 농도로 IL-2, 예를 들어 인간 재조합 IL-2와 함께 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포는 (약) 50 IU/mL, 60 IU/mL, 70 IU/mL, 80 IU/mL, 90 IU/mL, 100 IU/mL, 110 IU/mL, 120 IU/mL, 130 IU/mL, 140 IU/mL, 150 IU/mL, 160 IU/mL, 170 IU/mL, 180 IU/mL, 190 IU/mL 또는 100 IU/mL의 농도로 재조합 IL-2와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포는 (약) 100 IU/mL의 재조합 IL-2, 예를 들어 인간 재조합 IL-2의 존재 하에 인큐베이션 된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포는, 100 IU/mL 내지 2,000 IU/mL, 500 IU/mL 내지 1,000 IU/mL, 100 IU/mL 내지 500 IU/mL, 500 IU/mL 내지 750 IU/mL, 750 IU/mL 내지 1,000 IU/mL 또는 550 IU/mL 내지 650 IU/mL의 농도로 재조합 IL-7, 예를 들어 인간 재조합 IL-7과 함께 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포는 (약) 50 IU/mL, 100 IU/mL, 150 IU/mL, 200 IU/mL, 250 IU/mL, 300 IU/mL, 350 IU/mL, 400 IU/mL, 450 IU/mL, 500 IU/mL, 550 IU/mL, 600 IU/mL, 650 IU/mL, 700 IU/mL, 750 IU/mL, 800 IU/mL, 750 IU/mL, 750 IU/mL, 750 IU/mL 또는 1,000 IU/mL의 농도로 IL-7과 함께 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포는 (약) 600 IU/mL의 IL-7의 존재 하에 인큐베이션 된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포는, 1 IU/mL 내지 500 IU/mL, 10 IU/mL 내지 250 IU/mL, 50 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 150 IU/mL, 75 IU/mL 내지 125 IU/mL, 100 IU/mL 내지 200 IU/mL 또는 10 IU/mL 내지 100 IU/mL의 농도로 재조합 IL-15, 예를 들어 인간 재조합 IL-15와 함께 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포는 (약) 50 IU/mL, 60 IU/mL, 70 IU/mL, 80 IU/mL, 90 IU/mL, 100 IU/mL, 110 IU/mL, 120 IU/mL, 130 IU/mL, 140 IU/mL, 150 IU/mL, 160 IU/mL, 170 IU/mL, 180 IU/mL, 190 IU/mL 또는 200 IU/mL의 농도로 재조합 IL-15와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포는 (약) 100 IU/mL의 재조합 IL-15, 예를 들어 인간 재조합 IL-2의 존재 하에 인큐베이션 된다.
특정한 구현예에서, 세포, 예를 들어, 형질 전환된 세포는 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15의 존재 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15는 재조합이다. 특정 구현예에서, IL-2, IL-7 및/또는 IL-15는 인간이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15이거나 이를 포함한다. 특정한 구현예에서, 세포는 재조합 IL-2, IL-7, 및 IL-15의 존재 하에서 인큐베이션 된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 비증폭 프로세스 중 인큐베이션의 전부 또는 일부가 기본 배지(예를 들어, CTS OpTmizer 기본 배지(Thermofisher)), 글루타민 및 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예컨대 재조합 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15를 포함하는 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배지는 섹션 III에 제시된 것과 같은 하나 이상의 추가 성분을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 디펩타이드 형태의 L-글루타민(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 추가 보충물, 예를 들어 OpTmizer® 보충물(Thermofisher)에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 배지는 무혈청 배지이고, 임의의 혈청 성분을 함유하지 않는다. 일부 측면에서, 배지는 하나 이상의 혈청 대체 단백질, 예컨대 알부민, 인슐린 또는 트랜스페린(예를 들어, CTS™ 면역 세포 혈청 대체제) 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 예시적인 무혈청 배지 또는 이의 성분이 섹션 III에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 세포는 예컨대 상기 기재된 자극(예를 들어 온-컬럼 자극) 방법 또는 프로세스와 관련하여 수행된 세포의 자극 중에 존재했던 것과 동일하거나 유사한 배지의 존재 하에 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 예컨대 상기 기재된 자극 방법 또는 프로세스와 관련하여 수행된 세포의 자극 중에 존재한 배지와 동일한 사이토카인을 갖는 배지에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 예컨대 상기 기재된 자극 방법 또는 프로세스와 관련하여 수행된 세포의 자극 중에 존재한 배지와 동일한 농도로 동일한 사이토카인을 갖는 배지에서 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 세포는 재조합 사이토카인의 부재로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 여기에 기재된 바와 같은 하나 이상의 사이토카인의 부재로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 여기에 기재된 모든 사이토카인의 부재로 인큐베이션 된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션의 전부 또는 일부는 기본 배지, 예컨대 하나 이상의 재조합 사이토카인이 없거나 임의의 재조합 사이토카인이 없는 기본 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예컨대 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 인큐베이션은 임의의 재조합 사이토카인이 없이 수행된다. 특정 구현예에서, 기본 배지는 추가 첨가제로 보충된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 임의의 추가 첨가제로 보충되지 않는다. 세포 배양 배지에 대한 첨가제는 영양소, 설탕, 예를 들어 포도당, 아미노산, 비타민 또는 ATP 및 NADH와 같은 첨가제를 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다. 다른 첨가제도 첨가될 수 있으나, 일반적으로 특정 첨가제 및 양은 세포와 배지의 인큐베이션이 세포의 유지를 촉진하나, 배양 중에 세포의 대사 활성을 최소화, 제한 및/또는 유도하지 않도록 한다.
특정 구현예에서, 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인을 함유하지 않고, 혈청 성분을 함유하지 않는, 즉 무혈청 배지인 기본 배지이나 섹션 III.B에 기재된 것과 같은 하나 이상의 추가 성분을 함유할 수 있다. B 특정 구현예에서, 예를 들어, 예컨대 섹션 I-E-3에 따른 비증폭 프로세스 중 인큐베이션의 전부 또는 일부에서 상기 무혈청 배지의 사용은, 세포의 유지를 제공하나 세포를 대사적으로 활성화시키거나 활성화시킬 수 있는 특정 인자를 포함하지 않음으로써 휴지 상태 또는 비활동 상태이거나 상태일 가능성이 있는 상태로 세포를 기르는 린(lean) 배지를 제공한다. 일부 측면에서, 상기 무혈청 배지의 존재 하에 (예를 들어 섹션 I-E-3에 따른) 인큐베이션은 세포가 자극 및 유전자 조작(예를 들어, 형질 도입) 후에 회복되거나 휴식하게 한다. 일부 측면에서, 상기 무혈청 배지의 존재 하에 (예를 들어 섹션 I-E-3에 따른) 인큐베이션은, 예를 들어, 제조 프로세스 중 또는 후 및 수확/제형화된 세포가 동결 보존되고 이어서 사용 직전에 해동된 경우, 생존 능력의 손상 또는 손실에 덜 취약한 세포를 함유하는 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)을 초래한다. 일부 구현예에서, 해동된 경우 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는, 유사한 배지이나 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 동결 보존 시 세포를 대사적으로 보다 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 재조합 사이토카인, 혈청 또는 기타 인자를 함유하는 배지에서 인큐베이션 되었던 세포보다 카스파제 또는 세포 자멸사의 다른 마커의 수준이 보다 낮다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 무기염, 설탕, 아미노산 및 선택적으로 비타민, 유기산 및/또는 완충제 또는 기타 잘 알려진 세포 배양 영양소의 혼합물을 함유한다. 영양소 외에 배지는 또한 pH와 오스몰 농도 유지를 돕는다. 일부 측면에서, 기본 배지 시약은 세포 성장, 증식 및/또는 증폭을 지원한다. 상업적으로 이용 가능한 다양한 기본 배지가 당업자에게 잘 알려져 있으며, DMEM(Dulbeccos' Modified Eagles Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), Iscove modified Dulbeccos' 배지 및 Hams 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 이스코브의 변형 둘벡코 배지(Iscove's Modified Dulbeccos' Medium), RPMI-1640 또는 α-MEM이다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 균형 잡힌 염용액(예를 들어, PBS, DPBS, HBSS, EBSS)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 DMEM(둘베코’스 변형된 이글’스 배지), MEM(미니멀 필수적 배지), BME(기본 배지 이글), F-10, F-12, RPMI 1640, GMEM(글라스고우’스 미니멀 필수적 배지), 알파 MEM(알파 미니멀 필수적 배지), 일스코브’스 변형된 둘베코’스 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 및 M199로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 복합 배지(예를 들어, RPMI-1640, IMDM)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 OpTmizer™ CTS™ T 세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher)이다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 단백질이 없다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 인간 단백질(예를 들어, 인간 혈청 단백질)이 없다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 혈청이 없다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 인간으로부터 유래된 혈청이 없다. 일부 구현예에서, 기본 배지에는 재조합 단백질이 없다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 인간 단백질과 재조합 단백질이 없다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 여기에 기재된 바와 같은 하나 이상 또는 모든 사이토카인이 없다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 비증폭 프로세스 중 인큐베이션의 전부 또는 일부가 임의의 추가 첨가제 또는 재조합 사이토카인이 없는 기본 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 임의의 추가 첨가제 또는 재조합 사이토카인이 없는 CTS OpTmizer 기본 배지(ThermoFisher)이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 비증폭 프로세스 중 인큐베이션의 전부 또는 일부가 기본 배지 및 글루타민을 포함하는 배지, 예를 들어 글루타민을 갖는 CTS OpTmizer 기본 배지(ThermoFisher)에서 수행된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 비증폭 프로세스 중 인큐베이션의 전부 또는 일부가, 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예컨대 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15가 없는 기본 배지(예를 들어, CTS OpTmizer 기본 배지(Thermofisher))를 포함하는 배지에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배지는, 섹션 III.B에 제시된 것과 같은 하나 이상의 추가 비혈청 성분으로 보충된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물은 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 L-글루타민과 같은 유리 형태의 아미노산을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 혈청 대체 보충물를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 디펩타이드 형태의 L-글루타민(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 임의의 재조합 사이토카인을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는, T 세포 보충물 및 유리 형태의 L-글루타민으로 보충된 기본 배지를 포함하고, 임의의 면역 세포 혈청 대체제, 임의의 디펩타이드 형태의 L-글루타민 또는 임의의 재조합 사이토카인을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 기본 배지(예를 들어 OpTmizer™ T 세포 증폭 기본 배지 보충된), L-글루타민 및 보충물(예를 들어 OpTmizer™ T 세포 증폭 보충물)에 의해 제공되는 것과 같은 하나 이상의 추가 성분을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.25×106 세포/mL, 0.5×106 세포/mL, 0.75×106 세포/mL, 1.0×106 세포/mL, 1.25×106 세포/mL, 1.5×106 세포/mL, 1.75×106 세포/mL, 또는 2.0×106 세포/mL의 농도로 무혈청 배지에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.25×106 세포/mL 내지 1.0×106 세포/mL농도로 무혈청 배지에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.25×106 세포/mL 내지 0.75×106 세포/mL농도로 무혈청 배지에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.5×106 세포/mL 내지 0.75×106 세포/mL농도로 무혈청 배지에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.25×106 세포/mL 내지 0.5×106 세포/mL농도로 무혈청 배지에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.75×106 세포/mL농도로 무혈청 배지에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.5×106 세포/mL농도로 무혈청 배지에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 18 시간 내지 30 시간 동안이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 24 시간 또는 (약) 1 일 동안이다.
특정 구현예에서, 세포는 사이토카인의 부재에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 임의의 재조합 사이토카인의 부재에서 인큐베이션된다. 특정한 구현예에서, 세포는 예를 들어 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15의 부재 하에서 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 비증폭 프로세스 중 인큐베이션의 전부 또는 일부가 기본 배지, 글루타민, 및 하나 이상 재조합 사이토카인의 포함하는 배지, 예를 들어 글루타민 및 재조합 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15을 갖는 CTS OpTmizer 기본 배지(ThermoFisher)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 비증폭 프로세스 중 인큐베이션의 전부 또는 일부가 기본 배지, 글루타민, 하나 이상 재조합 사이토카인, 및 T 세포 보충물을 포함하는 배지, 예를 들어 글루타민, 재조합 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15, 및 OpTmizer® 보충물(Thermofisher)을 갖는 CTS OpTmizer 기본 배지(ThermoFisher)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 예를 및 들어, 비증폭 프로세스 중 인큐베이션의 전부 또는 일부가 기본 배지, 글루타민, 하나 이상 재조합 사이토카인, T 세포 보충물 및 하나 이상 혈청-대체 단백질을 포함하는 배지, 예를 들어 글루타민, 재조합 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15, OpTmizer® 보충물(Thermofisher), 및 하나 이상의 알부민, 인슐린, 트랜스페린과 같은 혈청-대체 단백질을 갖는 CTS OpTmizer 기본 배지(ThermoFisher)에서 수행된다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 L-글루타민과 같은 글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, 글루타민은 L-글루타민과 같은, 유리 형태의 글루타민이다. 일부 구현예에서, 기본 배지 중 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5mM-1mM, 0.5mM-1.5mM, 0.5mM-2mM, 0.5mM-2.5mM, 0.5mM-3mM, 0.5mM-3.5mM, 0.5mM-4mM, 0.5mM-4.5mM, 0.5mM-5mM, 1mM-1.5mM, 1mM-2mM, 1mM-2.5mM, 1mM-3mM, 1mM-3.5mM, 1mM-4mM, 1mM-4.5mM, 1mM-5mM, 1.5mM-2mM, 1.5mM-2.5mM, 1.5mM-3mM, 1.5mM-3.5mM, 1.5mM-4mM, 1.5mM-4.5mM, 1.5mM-5mM, 2mM-2.5mM, 2mM-3mM, 2mM-3.5mM, 2mM-4mM, 2mM-4.5mM, 2mM-5mM, 2.5mM-3mM, 2.5mM-3.5mM, 2.5mM-4mM, 2.5mM-4.5mM, 2.5mM-5mM, 3mM-3.5mM, 3mM-4mM, 3mM-4.5mM, 3mM-5mM, 3.5mM-4mM, 3.5mM-4.5mM, 3.5mM-5mM, 4mM-4.5mM, 4mM-5mM 또는 4.5mM-5mM(각각의 수치 포함) (미만)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 유리 형태의 글루타민, 예컨대 L-글루타민의 농도는 (약) 0.5mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM 또는 5mM 이상이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 글루타민, 예컨대 L-글루타민의 농도는 최대 약 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM, 5mM이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 글루타민, 예컨대 L-글루타민의 농도는 약 2 mM이다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 단백질 또는 펩타이드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 비포유류 기원이 아니다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 인간 또는 인간 유래 단백질이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 재조합이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 알부민, 트랜스페린, 인슐린, 피브로넥틴, 아프로티닌 또는 페투인을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 하나 이상의 알부민, 인슐린 또는 트랜스페린, 선택적으로 하나 이상의 인간 또는 재조합 알부민, 인슐린 또는 트랜스페린을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질은 알부민 또는 알부민 대체재이다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간 유래 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 재조합 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 천연 인간 혈청 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간이 아닌 공급원으로부터의 재조합 알부민이다. 알부민 대체재는 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드 공급원일 수 있다. 상기 단백질 또는 폴리펩타이드 샘플의 예로는 소 뇌하수체 추출물, 식물 가수분해물(예를 들어, 쌀 가수분해물), 태아 송아지 알부민(페투인), 달걀 알부민, 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 또는 다른 동물 유래 알부민, 병아리 추출물, 소 배아 추출물, AlbuMAX® I 및 AlbuMAX® II를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드는 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드는 피브로넥틴(fibronectin)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드는 아프로티닌(aprotinin)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 페투인(fetuin)를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 단백질은 기본 배지에 첨가된 혈청 대체 보충물의 일부이다. 혈청 대체 보충물의 예는, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체제(ThermoFisher, #A2598101) 또는 문헌[Smith et al. ClinTransl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 세포는, 이종 또는 재조합 단백질, 예를 들어 바이러스 벡터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 후에 (약) 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간 또는 96 시간 초과 또는 적어도 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간, 48 시간, 54 시 간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간 또는 96 시간 초과 동안 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는, 이종 또는 재조합 단백질, 예를 들어 바이러스 벡터를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 도입 후에 (약) 1 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 4 일 이상 또는 적어도 1 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 4 일 이상 동안 인큐베이션된다 일부 구현예에서, 유전자 조작 전 30 분 내지 2 시간, 1 시간 내지 8 시간, 6 시간 내지 12 시간, 12 시간 내지 18 시간, 16 시간 내지 24 시간, 18 시간 내지 30 시간, 24 시간 내지 48 시간, 24 시간 내지 72 시간, 42 시간 내지 54 시간, 60 시간 내지 120 시간 96 시간 내지 120 시간, 90 시간 내지 1 일 내지 7 일, 3 일 내지 8 일, 1 일 내지 3 일, 4 일 내지 6 일 또는 4 일 내지 5 일의 시간량 동안 인큐베이션이 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 18 시간 내지 30 시간 동안이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 24 시간 또는 (약) 1 일 동안이다.
특정 구현예에서, 인큐베이션의 총 지속 기간은 (약) 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간, 또는 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 이상이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 총 지속 기간은 (약) 1 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 또는 1 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 이상이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 120 시간, 108 시간, 96 시간, 84 시간, 72 시간, 60 시간, 54 시간, 48 시간, 42 시간, 36 시간, 30 시간, 24 시간, 18 시간 또는 12 시간 또는 120 시간, 108 시간, 96 시간, 84 시간, 72 시간, 60 시간, 54 시간, 48 시간, 42 시간, 36 시간, 30 시간, 24 시간, 18 시간 또는 12 시간 이내에 완료된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 1 일, 2 일, 3일, 4 일 또는 5 일 또는 1 일, 2 일, 3 일, 4 일 또는 5 일 이내에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 총 지속 기간은 (약) 12 시간 내지 120 시간, 18 시간 내지 96 시간, 24 시간 내지 72 시간 또는 24 시간 내지 48 시간(수치 포함)이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 총 지속 기간은 (약) 1 시간 내지 48 시간, 4 시간 내 지 36 시간, 8 시간 내지 30 시간 또는 12 시간 내지 24 시간(수치 포함)이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 또는 (약) 1 일, 2 일 또는 3 일 동안 각각 수행된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 24 시간 ± 6 시간, 48 시간 ± 6 시간, 또는 72 시간 ± 6 시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 72 시간 또는 (약) 3 일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 세포의 게놈으로 이종 또는 재조합 단백질을 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드의 통합이 허여되기 위한 충분한 지속기간 동안 수행된다.
특정 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시 후 (약) 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간 또는 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간 이상에 개시된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시 후 (약) 0.5 일, 1 일, 1.5 일 또는 2 일 또는 0.5 일, 1 일, 1.5 일 또는 2일 이상에 개시된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시의 (약) 120 시간, 108 시간, 96 시간, 84 시간, 72 시간, 60 시간, 54 시간, 48 시간, 42 시간, 36 시간, 30 시간, 24 시간, 18 시간 또는 12 시간 또는 120 시간, 108 시간, 96 시간, 84 시간, 72 시간, 60 시간, 54 시간, 48 시간, 42 시간, 36 시간, 30 시간, 24 시간, 18 시간 또는 12 시간 이내에 개시된다. 특정한 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시의 (약) 11 시간, 10 시간, 8 시간, 7 시간, 6 시간, 5 시간, 또는 4시간, 또는 11 시간, 10 시간, 8 시간, 7 시간, 6 시간, 5 시간, 또는 4시간 이내에 개시된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시의 (약) 5 일, 4 일, 3 일, 2 일, 1 일 또는 0.5 일 또는 5 일, 4 일, 3 일, 2 일, 1 일 또는 0.5 일 이내에 개시된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시 후 (약) 24 시간 내지 120 시간, 36 시간 내지 108 시간, 48 시간 내지 96 시간 또는 48 시간 내지 72 시간(수치 포함)에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시로부터 (약) 120 시간, 108 시간, 96 시간, 72 시간, 48 시간 또는 36 시간 또는 120 시간, 108 시간, 96 시간, 72 시간, 48 시간 또는 36 시간 이내에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시로부터 (약) 5 일, 4.5 일, 4 일, 3 일, 2 일 또는 1.5 일 또는 5 일, 4.5 일, 4 일, 3 일, 2 일 또는 1.5 일 이내에 완료된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시 후 24 시간 ± 6 시간, 48 시간 ± 6 시간 또는 72 시간 ± 6 시간 후에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 72 시간 또는 (약) 3 일 후에 완료된다.
임의의 상기 구현예 중 일부에서, 조작된 세포는 세포 집단(예를 들면, 생존 가능한 T 세포 수)을 증폭시키기 위한 배양 조건 하에서 인큐베이션 되지 않는다. 임의의 상기 구현예 중 일부에서, 세포는 인큐베이션 또는 배양 동안에 생존 가능한 세포의 양을 증가시키는 배양 조건 하에서 인큐베이션 되지 않는다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포는 인큐베이션의 초기에 총 생존 가능한 세포 수에 대비해 인큐베이션 말기에 총 생존 가능한 세포 양을 증가시키는 조건(예를 들어, 배양 조건) 하에서 인큐베이션 되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는 증폭을 초래할 수 있는 조건 하에서 인큐베이션 되지만, 인큐베이션 조건은 세포 집단을 증폭시키기 위한 목적으로 수행되지 않는다. 일부 구현예에서, 증폭 또는 증식을 촉진 또는 용이하게 하지 않는 조건 하에서 인큐베이션된 세포는 비-증폭 또는 최소한으로 증폭된으로 지칭될 수 있다(섹션 I-G 참조).
일부 구현예에서, 형질도입된 또는 조작된 세포는 유전자 조작 단계, 예를 들어 형질도입 또는 형질감염에 의해 재조합 폴리펩타이드를 세포에 도입하는 단계 이후에 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 세포는 재조합 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)로 세포가 형질도입되거나 형질감염된 후, 배양된다. 일부 구현예에서, 상기 배양은 조작된 T 세포의 하나 이상의 배양 조성물을 생산한다. 일부 구현예에서, 상기 배양 조건은 집단에서 증식, 증폭, 활성화, 및/또는 생존을 위해 설계될 수 있다. 특정한 구현예에서, 상기 배양 조건은 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 제제(agents), 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포를 성장, 분열, 및/또는 증폭을 촉진시키기 위해 설계된 임의의 기타 제제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식 및/또는 증폭을 촉진하는 조건 하에서 인큐베이션된 세포는 증폭된 세포로 지칭될 수 있다(섹션 I-G 참조).
특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.25×106 세포/mL, 0.5×106 세포/mL, 0.75×106 세포/mL, 1.0×106 세포/mL, 1.25×106 세포/mL, 1.5×106 세포/mL, 1.75×106 세포/mL, 또는 2.0×106 세포/mL의 농도로 (예컨대, 배양되는) 배양 조건 하에서 인베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.25×106 세포/mL 내지 1.0×106 세포/mL농도로 배양 조건 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.25×106 세포/mL 내지 0.75×106 세포/mL농도로 배양 조건 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.5×106 세포/mL 내지 0.75×106 세포/mL농도로 배양 조건 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.25×106 세포/mL 내지 0.5×106 세포/mL농도로 배양 조건 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.75×106 세포/mL농도로 배양 조건 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 0.5×106 세포/mL농도로 배양 조건 하에서 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는 첨가된 세포의 배양을 위한 세포 배지 및/또는 세포로, 예를 들어, 급이 포트(feed port)를 통해, 채워질 수 있는 컨테이너에서 배양(cultivated, 예컨대 cultured)된다. 세포의 배양이 예를 들어, 세포의 증폭 및/또는 증식을 위해 바람직한 임의의 세포 공급원으로부터 세포가 유래될 수 있다.
일부 측면에서, 배양 배지는 T 세포와 같은 세포의 성장, 증폭 또는 증식을 지원하는 적응된 배양 배지이다. 일부 측면에서, 배지는 염, 아미노산, 비타민, 설탕 또는 이의 임의의 조합물의 혼합물을 함유하는 액체일 수 있다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 예컨대 인큐베이션 동안 세포의 증폭 또는 증식을 자극하기 위한 하나 이상의 자극 조건 또는 제제를 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 예를 들어 IL-2, IL-7 또는 IL-15로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포 대해 내인성이고/거나 T 세포에 의해 발현되는 수용체에 결합하고/거나 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스 번들 패밀리의 멤버이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4-알파-헬릭스 번들 패밀리의 멤버는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9 (IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)를 포함하되 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 IL-2이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양 동안 배양 배지에서 하나 이상의 사이토카인의 농도는 독립적으로 (약) 1 IU/mL 내지 1500 IU/mL, 예컨대 (약) 1 IU/mL 내지 100 IU/mL, 2 IU/mL 내지 50 IU/mL, 5 IU/mL 내지 10 IU/mL, 10 IU/mL 내지 500 IU/mL, 50 IU/mL 내지 250 IU/mL 또는 100 IU/mL 내지 200 IU/mL, 50 IU/mL 내지 1500 IU/mL, 100 IU/mL 내지 1000 IU/mL 또는 200 IU/mL 내지 600 IU/mL이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인의 농도는 독립적으로 (약) 1 IU/mL, 5 IU/mL, 10 IU/mL, 50 IU/mL, 100 IU/mL, 200 IU/mL, 500 IU/mL, 1000 IU/mL 또는 1500 IU/mL 이상이다.
일부 구현예에서, 조작된 세포의 조성물은 25 내지 38°C 온도, 예컨대 30 내지 37°C, 예를 들어 (약) 37°C± 2 ºC에서 배양된다. 일부 구현예에서, 배양 조건(cultivating condition)은 배양(culture), 예를 들어, 배양(cultivation) 이 원하는 또는 임계 밀도, 농도, 세포 수 또는 세포의 단위 용량으로 귀결될 때까지 기간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 배양, 예를 들어, 배양 또는 증폭이 원하는 또는 임계 밀도, 농도, 생존 가능한 세포 수 또는 생존 가능한 세포의 단위 용량으로 귀결될 때까지 기간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 (약) 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 그 이상 초과, 또는 (약) 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 그 초과 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 세포는 세포 배양 중 이산화탄소의 표적량을 유지하기 위한 조건 하에서 인큐베이션 또는 배양된다. 일부 측면에서, 이는 성장 중 세포의 최적 배양, 증폭 및 증식을 보장한다. 일부 측면에서, 이산화탄소(CO2)의 양은 상기 가스의 10% 내지 0% (v/v) 사이, 예컨대 상기 가스의 8% 내지 2% (v/v)사이 , 예를 들어 (약) 5% (v/v) CO2의 양이다.
특정 구현예에서, 배양은 폐쇄 시스템에서 수행된다. 특정 구현예에서, 배양은 멸균 조건 하에서 폐쇄 시스템으로 수행된다. 일부 구현예에서 조작된 T 세포 조성물은 폐쇄 시스템에서 제거되어 배양을 위한 생물 반응기에 배치되고/거나 연결된다. 배양에 적합한 생물 반응기의 예에는 GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems 및 Pall XRS Bioreactor Systems이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 생물 반응기는 배양 단계 중 적어도 일부 동안 세포를 관류 및/또는 혼합하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 생물 반응기로 둘러싸인, 연결된 및/또는 제어 하에 배양된 세포는 생물 반응기 없이 배양된 세포, 예를 들어 예컨대 혼합, 흔들림, 이동 및/또는 관류 없이 정적 조건 하에서 배양된 세포보다 배양 도중 더 빠르게 증폭된다. 일부 구현예에서, 생물 반응기로 둘러싸인, 연결된 및/또는 제어 하에 배양된 세포는 14일, 10일, 9일, 8일, 7일, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 60시간, 48시간, 36시간, 24시간 또는 12시간 내에 임계 증폭, 세포 수 및/또는 밀도에 도달하거나 이를 달성한다. 일부 구현예에서, 생물 반응기로 둘러싸인, 연결된 및/또는 제어 하에 배양된 세포는 생물 반응기로 둘러싸인, 연결된 및/또는 제어 하에 세포가 배양되지 않은 예시적 및/또는 대안 적 공정에서 배양된 세포보다 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배 임계 증폭, 세포 수 및/또는 밀도에 도달하거나 이를 달성한다.
일부 구현예에서, 혼합은 흔들림 및/또는 움직임이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 생물 반응기와 관련하여 사용되는 컨테이너(예를 들어, 백)를 사용하여 인큐베이션된다. 일부 경우에, 생물 반응기는 움직임이나 흔들림에 노출될 수 있고, 이는 일부 측면에서, 산소 전달을 증가시킬 수 있다. 생체 반응기를 움직이는 것은 수평 축을 따라 회전하는 것, 수직 축을 따라 회전하는 것, 생물 반응기의 경사진 또는 기울어진 수평 축을 따라 흔들리는 움직임 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 흔들리면서 수행된다. 흔들리는 속도 및 흔들리는 각도는 원하는 교반을 달성하기 위해 조정될 수 있다. 일부 구현예에서 흔들기 각도는 (약) 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2° 또는 1°이다. 특정 구현예에서, 흔들기 각도는 6 내지 16°이다. 다른 구현예에서, 흔들기 각도는 7-16°이다. 다른 구현예에서, 흔들기 각도는 8-12°이다. 일부 구현예에서, 흔들기 속도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 1 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 rpm이다. 일부 구현예에서, 흔들기 속도는 4 내지 12rpm, 예컨대 4 내지 6rpm(수치 포함) 사이이다. 세포 배양 증폭의 적어도 일부는 흔들림 동작, 예컨대 5° 내지 10° 사이, 예컨대 6°의 각도에서, 일정한 흔들림 속도, 예컨대 5 내지 15RPM 사이, 예컨대 6RMP 또는 10RPM의 속도로 수행된다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 조작된 세포, 예컨대 조작된 T 세포, 조작된 CD3+ T 세포, 조작된 CD4+ T 세포 또는 조작된 CD8+ T 세포를 포함하는 조성물은, 계면활성제의 존재 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 상기 조성물의 세포를 배양하는 것은 예를 들어 혼합, 락킹, 모션, 및/또는 관류에 기인하여 상기 배양 도중에 발생할 수 있는 전단 응력의 양을 감소시킨다. 특정한 구현예에서, 세포, 예를 들어 조작된 세포, 예컨대 조작된 T 세포, 예를 들어, 조작된 CD3+ T 세포, 조작된 CD4+ T 세포 또는 조작된 CD8+ T 세포의 조성물은 계면활성제와 함께 배양되며 배양이 종료된 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 7일 초과 동안, 또는 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 7일 초과 동안 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.9%,의 T 세포가 생존, 예를 들어 생존 가능하고/거나 괴사, 프로그램된 세포 사멸, 또는 세포자연사되지 않는다. 특정한 구현예에서, 세포, 예를 들어 조작된 세포, 예컨대 조작된 T 세포, 예를 들어, 조작된 CD3+ T 세포, 조작된 CD4+ T 세포 또는 조작된 CD8+ T 세포의 조성물은 계면활성제의 존재 하에서 배양되고 50 % 미만, 40 % 미만, 30 % 미만, 25 % 미만, 20 % 미만, 15 % 미만, 10 % 미만, 5 % 미만, 1 % 미만, 0.1 % 미만 또는 0.01 % 미만의 세포가 예를 들어 전단 또는 전단 유도 스트레스로 인해 세포 사멸, 예를 들어 프로그램된 세포 사멸, 세포자연사 및/또는 괴사를 겪는다.
특정한 구현예에서, 세포, 예를 들어 조작된 세포, 예컨대 조작된 T 세포, 예를 들어, 조작된 CD4+ T 세포 또는 조작된 CD8+ T 세포의 조성물은 0.1 μl/ml 내지 10.0 μl/ml, 0.2 μl/ml 내지 2.5 μl/ml, 0.5 μl/ml 내지 5 μl/ml, 1 μl/ml 내지 3 μl/ml, 또는 2 μl/ml 내지 4 μl/ml 의 계면활성제 존재 하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어 조작된 세포, 예컨대 조작된 T 세포, 예를 들어, 조작된 CD4+ T 세포 또는 조작된 CD8+ T 세포의 조성물은 (약) 0.1 μl/ml, 0.2 μl/ml, 0.4 μl/ml, 0.6 μl/ml, 0.8 μl/ml, 1 μl/ml, 1.5 μl/ml, 2.0 μl/ml, 2.5 μl/ml, 5.0 μl/ml, 10 μl/ml, 25 μl/ml, 또는 50 μl/m 또는 적어도 0.1 μl/ml, 0.2 μl/ml, 0.4 μl/ml, 0.6 μl/ml, 0.8 μl/ml, 1 μl/ml, 1.5 μl/ml, 2.0 μl/ml, 2.5 μl/ml, 5.0 μl/ml, 10 μl/ml, 25 μl/ml, 또는 50 μl/m의 계면활성제 존재 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 세포의 조성물은 (약) 2 μl/ml 의 계면활성제의 존재 하에서 배양된다.
일부 구현예에서, 계면활성제는 액체 및/또는 고체의 표면 장력을 감소시키는 제제이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 계면활성제는 지방 알코올(예를 들어 스테릴 알코올), 폴리옥시에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르(예를 들어 Triton X-100) 또는 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르(예를 들어 폴리소르베이트 20, 40, 60)를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트(Polysorbate) 80(PS80), 폴리소르베이트 20(PS20), 폴록사머(poloxamer) 188(P188)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 구현예에서, 화학적으로 정의된 공급 배지에서 계면 활성제의 농도는 PS80의 약 0.0025 % 내지 약 0.25 % (v / v); PS20의 약 0.0025 % 내지 약 0.25 % (v / v); 또는 P188의 약 0.1 % 내지 약 5.0 % (w / v)이다.
일부 구현예에서, 계면 활성제는 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양쪽이온성 계면 활성제 또는 이에 첨가된 비이온성 계면활성제이거나 이를 포함한다. 적합한 음이온성 계면 활성제는 알킬 설포네이트, 알킬 포스페이트, 알킬 포스포네이트, 포타슘 라우레이트, 트리에탄올 아민 스테아레이트, 소듐 라우릴설페이트, 소듐 도데실설페이트, 알킬 폴리옥시에틸렌 설페이트, 소듐 알기네이트, 디옥틸 소듐 설포석시네이트, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜 이노신, 포스파티딜이노시톨, 디포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜세린, 포스파티드산 및 이들의 염, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 콜산 및 다른 담즙산(예를 들어, 콜산, 데옥시콜산, 글리코콜산, 타우로콜산, 글리코데옥시 콜산) 및 이의 염 (예를 들어, 데옥시콜레이트 나트륨)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 적합한 비이온성 계면 활성제는 다음을 포함한다: 글리세릴 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방 알코올 에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (폴리소르베이트), 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 소르비탄 에스테르, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 세틸 알코올, 세토스테아릴 알코올, 스테아릴 알코올, 아릴 알킬 폴리에테르 알코올, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중 합체 (폴록사머), 폴록사민, 메틸셀룰로스, 하이드록시메틸 셀룰로스, 하이드록시 프로필 셀룰로스, 하이드록시 프로필메틸 셀룰로스, 비결정질 셀룰로스, 전분 및 전분 유도체를 포함하는 다당류 예를 들어 하이드록시에틸 전분 (hydroxyethylstarch, HES), 폴리비닐알코올 및 폴리비닐피롤리돈. 특정 구현예에서, 비이온성 계면 활성제는 폴리 옥시 에틸렌 및 폴리 옥시 프로필렌 공중합체, 바람직하게는 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜의 블록 공중합체이다. 이러한 중합체는 PLURONIC®F68 또는 Kolliphor®P188이라고도 하는 상표명 POLOXAMER로 판매된다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르 중에는 알킬 사슬이 짧은 것이 포함된다. 이러한 계면활성제의 일례는 SOLUTOL®HS 15, 폴리에틸렌-660-하이드록시스테아레이트이다.
일부 구현예에서, 적합한 양이온성 계면 활성제는 천연 인지질, 합성 인지질, 4 급 암모늄 화합물, 벤즈 알코늄 클로라이드, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 키토산, 라우릴 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드, 아실 카르니틴 히드로클로라이드, 디메틸 디옥타데실 브롬화 암모늄 (DDAB), 디올레올 트리메틸 암모늄 프로판(DOTAP), 디미리스토일 트리메틸 암모늄 프로판 (DMTAP), 디메틸 아미노 에탄 카르바모일 콜레스테롤 (DC-Chol), 1,2- 디아실 글리세로-3-(O-알킬) 포스포 콜린, O- 알킬 포스파티딜콜린 알킬 피리디늄 할라이드, 또는 장쇄 알킬 아민, 예를 들어 n-옥틸 아민 및 올레일 아민을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
양쪽이온성 계면 활성제는 전기적으로 중성이지만 동일한 분자 내에 국소 양전하 및 음전하를 갖는다. 적합한 양쪽이온성 계면 활성제에는 양쪽이온성 인지질이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 적합한 인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜 에탄올 아민, 디아실-글리세로 포스포 에탄올 아민 (예를 들어 디미리스토일-글리세로 포스포 에탄올 아민 (DMPE), 디팔미토일-글리세로-포스포 에탄올 아민 (DPPE), 디스테아로일-글리세로 포스포 에탄올 아민 (DSPE), 및 다이올레오일-글리세로-포스포에탄올 아민 (dioleolyl-glycerophosphoethanolamine DOPE))을 포함한다. 음이온성 및 양쪽이온성 인지질을 포함하는 인지질의 혼합물이 본 발명에 이용될 수 있다. 이러한 혼합물은 리소 인지질, 난 (egg) 또는 대두 인지질 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 음이온성, 양쪽이온성 또는 인지질의 혼합물이든 간에 인지질은 가염(salted)되거나 또는 탈염될 수 있고, 수소화되거나 또는 부분 수소화 되거나 또는 천연 반-합성 또는 합성될 수 있다.
특정 구현예에서, 상기 계면활성제는 폴록사머, 예를 들어 폴록사머 188이다. 일부 구현예에서, 세포의 조성물은 0.1 μl/ml 내지 10.0 μl/ml, 0.2 μl/ml 내지 2.5 μl/ml, 0.5 μl/ml 내지 5 μl/ml, 1 μl/ml 내지 3 μl/ml, 또는 2 μl/ml 내지 4 μl/ml 의 폴록사머 존재 하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 세포의 조성물은 (약) 0.1 μl/ml, 0.2 μl/ml, 0.4 μl/ml, 0.6 μl/ml, 0.8 μl/ml, 1 μl/ml, 1.5 μl/ml, 2.0 μl/ml, 2.5 μl/ml, 5.0 μl/ml, 10 μl/ml, 25 μl/ml, 또는 50 μl/m 또는 적어도 0.1 μl/ml, 0.2 μl/ml, 0.4 μl/ml, 0.6 μl/ml, 0.8 μl/ml, 1 μl/ml, 1.5 μl/ml, 2.0 μl/ml, 2.5 μl/ml, 5.0 μl/ml, 10 μl/ml, 25 μl/ml, 또는 50 μl/m의 계면활성제 존재 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 세포의 조성물은 (약) 2 μl/ml 의 폴록사머의 존재 하에서 배양된다.
일부 측면에서, 조작된 T 세포 집단(예컨대, CD4, CD8)은 그들 각각이 임계치 양 또는 세포 밀도에 도달할 때까지 별개로 증폭되거나 또는 함께 증폭될 수 있다. 특정한 구현예에서, 세포가 임계치 양, 농도, 및/또는 증폭에 도달할 때, 배양은, 예를 들어 세포를 수확함으로써 종료된다. 특정한 구현예에서, 배양은, 예를 들어, 배양의 시작 또는 개시 시 세포의 밀도의 양과 관련하여, 세포가 (약) 1.5 배 증폭, 2 배 증폭, 2.5 배 증폭, 3 배 증폭, 3.5 배 증폭, 4 배 증폭, 4.5 배 증폭, 5 배 증폭, 6 배 증폭, 7 배 증폭, 8 배 증폭, 9 배 증폭, 10 배 증폭 또는 10 배 초과 증폭, 또는 적어도 1.5 배 증폭, 2 배 증폭, 2.5 배 증폭, 3 배 증폭, 3.5 배 증폭, 4 배 증폭, 4.5 배 증폭, 5 배 증폭, 6 배 증폭, 7 배 증폭, 8 배 증폭, 9 배 증폭, 10 배 증폭 또는 10 배 초과 증폭을 달성할 때 종료된다. 일부 구현예서에서, 임계치 증폭은 예를 들어 배양의 시작 또는 개시 시 세포의 밀도의 양에 대하여 4 배 증폭이다. 일부 구현예에서, 세포가 임계치 총량의 세포, 예를 들어 임계치 세포 수를 달성할 때, 예를 들어 세포를 수확함으로써 배양이 종료된다. 일부 구현예에서, 배양은 세포가 임계치의 총 유핵 세포 (total nucleated cell, TNC) 수를 달성할 때 종료된다. 일부 구현예에서, 배양은 세포가 임계치의 생존 가능한 양의 세포, 예를 들어 임계치의 생존 가능한 세포 수를 달성할 때 종료된다. 일부 구현예에서, 임계 세포 수(threshold cell count)는 (약) 50 x106 개의 세포, 100 x106 개의 세포, 200 x106 개의 세포, 300 x106 개의 세포, 400 x106 개의 세포, 600 x106 개의 세포, 800 x106 개의 세포, 1000 x106 개의 세포, 1200 x106 개의 세포, 1400 x106 개의 세포, 1600 x106 개의 세포, 1800 x106 개의 세포, 2000 x106 개의 세포, 2500 x106 개의 세포, 3000 x106 개의 세포, 4000 x106 개의 세포, 5000 x106 개의 세포, 10,000 x106 개의 세포, 12,000 x106 개의 세포, 15,000 x106 개의 세포 또는 20,000 x106 개의 세포, 또는 적어도 50 x106 개의 세포, 100 x106 개의 세포, 200 x106 개의 세포, 300 x106 개의 세포, 400 x106 개의 세포, 600 x106 개의 세포, 800 x106 개의 세포, 1000 x106 개의 세포, 1200 x106 개의 세포, 1400 x106 개의 세포, 1600 x106 개의 세포, 1800 x106 개의 세포, 2000 x106 개의 세포, 2500 x106 개의 세포, 3000 x106 개의 세포, 4000 x106 개의 세포, 5000 x106 개의 세포, 10,000 x106 개의 세포, 12,000 x106 개의 세포, 15,000 x106 개의 세포 또는 20,000 x106 개의 세포, 또는 생존 가능한 세포의 상기 임계치 중 임의의 값이다.
특정 실시양태에서, 배양은 세포가 임계치의 세포 수를 달성할 때 종료된다. 일부 실시양태에서, 배양은 임계치의 세포 수가 달성된 후, (약) 6 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 또는 7 일 또는 그 이상 또는 6 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 또는 7 일 또는 그 이상의 기간 이내에 종료된다. 특정 실시양태에서, 배양은 임계치의 세포 수 달성 후 (약) 1 일 후에 종료된다. 일부 구현예에서, 임계 밀도는 (약) 0.1 x106 세포/ml, 0.5 x106 세포/ml, 1 x106 세포/ml, 1.2 x106 세포/ml, 1.5 x106 세포/ml, 1.6 x106 세포/ml, 1.8 x106 세포/ml, 2.0 x106 세포/ml, 2.5 x106 세포/ml, 3.0 x106 세포/ml, 3.5 x106 세포/ml, 4.0 x106 세포/ml, 4.5 x106 세포/ml, 5.0 x106 세포/ml, 6 x106 세포/ml, 8 x106 세포/ml, 또는 10 x106 세포/ml, 또는 적어도 0.1 x106 세포/ml, 0.5 x106 세포/ml, 1 x106 세포/ml, 1.2 x106 세포/ml, 1.5 x106 세포/ml, 1.6 x106 세포/ml, 1.8 x106 세포/ml, 2.0 x106 세포/ml, 2.5 x106 세포/ml, 3.0 x106 세포/ml, 3.5 x106 세포/ml, 4.0 x106 세포/ml, 4.5 x106 세포/ml, 5.0 x106 세포/ml, 6 x106 세포/ml, 8 x106 세포/ml, 또는 10 x106 세포/ml, 또는 생존 가능한 세포의 상기 임계치 중 임의의 값이다. 특정 구현예에서, 배양은 세포가 임계치의 밀도를 달성할 때 종료된다. 일부 실시양태에서, 배양은 임계치의 밀도가 달성된 후, (약) 6 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 또는 7 일 또는 그 이상 또는 6 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 또는 7 일 또는 그 이상의 기간 이내에 종료된다. 특정 실시양태에서, 배양은 임계치의 밀도 달성 후 (약) 1 일 후에 종료된다.
일부 구현예에서, 배양(cuiltivation)의 적어도 일부는 정적 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 배양의 적어도 일부는 예컨대 배양(culture) 중에 소비된 배지를 외부로 관류하고 신선한 배지를 안으로 관류하는 관류로 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 예컨대 급이 포트를 통해 세포 배양에 신선한 배양 배지를 관류하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 관류 중에 추가된 배양 배지는 하나 이상의 자극제, 예를 들어 하나 이상의 재조합 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15를 함유한다. 일부 구현예에서, 관류 중에 첨가된 배양 배지는 정적 인큐베이션 중에 사용된 것과 동일한 배양 배지이다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 이후, 컨테이너(예를 들어, 백)는 원심분리 챔버를 보유한 시스템에 다시 연결되는 것과 같이, 세포 요법을 제조, 생성 또는 생산하기 위한 하나 이상의 다른 프로세싱 단계를 수행하기 위한 시스템에 다시 연결된다. 일부 측면에서, 배양된 세포는 배양된 세포의 제형을 위해 백에서 챔버의 내부 공동으로 전달된다.
인큐베이션 동안 세포 모니터링
일부 구현예에서, 인큐베이션 단계, 예를 들어 증폭(예컨대, 배양) 하 또는 최소한으로 증폭된/비증폭된(예컨대, 인큐베이션) 동안에 상기 세포는 모니터링된다. 모니터링은 예를 들어 세포 형태, 세포 생존율, 세포 사멸 및/또는 세포 농도(예를 들어, 생존 가능한 세포 농도)를 확인(예를 들어 측정, 정량화)하기 위해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서,모니터링은 인간 작동에 의한 것과 같이 수동으로 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 자동화된 시스템에 의해 수행된다. 자동화된 시스템은 배양된 세포를 모니터링하기 위해 최소한의 수동 투입 (manual input)이 필요할 수 있거나 또는 수동 투입 (manual input)이 필요하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 모니터링은 수동 및 자동 시스템에 둘 모두에 의해 수행된다.
일부 구현예에서, 세포는 수동 투입이 요구되지 않는 자동화된 시스템에 의해 모니터링된다. 일부 구현예에서, 자동화된 시스템은 배양 중인 세포가 생물 반응기로부터 제거되고, 모니터링되고, 이어서 생물 반응기로 되돌아갈 수 있도록 생물 반응기, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 생물 반응기, 또는 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은, 증폭된 또는 최소 증폭된 조건 하에서 인큐베이션 중인 인큐베이터와 호환이 가능하다. 일부 구현예에서, 상기 모니터링 및 인큐베이션은 폐쇄된 루프 배치(closed loop configuration)에서 일어난다. 일부 측면에서, 폐쇄된 루프 배치에서, 상기 자동화된 시스템 및 바이오리엑터 또는 인큐베이터는 멸균 상태를 유지한다. 일부 구현예에서, 상기 자동화된 시스템은 멸균 상태이다. 일부 구현예에서, 상기 자동화된 시스템은 인-라인 시스템(in-line system)이다.
일부 구현예에서, 상기 자동화된 시스템은 세포 형태, 세포 생존율, 세포 사멸 및/또는 세포 농도(예를 들어 생존 세포 농도)를 검출하기 위한 광학 기술 (예를 들어 현미경의 사용)의 사용을 포함한다. 예를 들어, 세포 특징, 생존률, 농도를 결정하는데 적합한 임의의 광학 기술이 본원에서 고려된다. 유용한 광학 기술의 비제한적 예는 명시야 현미경(bright field microscopy), 형광 현미경, 시차 간섭 콘트라스트 현미경, 위상 콘트라스트(DIC) 현미경(phase contrast microscopy), 디지털 홀로그래피 현미경(DHM), 시차 디지털 홀로그래피 현미경(DDHM), 또는 이들의 조합물을 포함한다. 시차 디지털 홀로그래피 현미경(DDHM), 및 시차 DHM이 본원에서 교환가능하게 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 자동화된 시스템은 시차 디지털 홀로그래피 현미경을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 자동화된 시스템은 조명 수단(예를 들어 레이저, led)을 포함한 시차 디지털 홀로그래피 현미경을 포함한다. DDHM 방법론(methodology) 및 사용법에 관한 설명은 예를 들어 미국특허 제7,362,449호; 유럽특허 제1,631,788호; 미국특허 제9,904,248호; 및 미국특허 제9,684,281호에서 찾을 수 있으며, 상기 특허문헌 전체가 본원에 참조로써 포함된다.
DDHM은 라벨 없는 비파괴 세포 이미징을 가능하게 하여 고-콘트라스트 홀로그래픽 이미지를 생성한다. 상기 이미지는 이미지화된 객체(object)(예를 들어 배양된 세포, 세포 부스러기)를 정량적으로 묘사하는 복수의 형태학적 특징을 얻기 위해 객체 분할(object segmentation) 및 추가 분석을 행할 수 있다. 가령, 다양한 특징들(예를 들어 세포 형태, 표현형, 세포 생존율, 세포 농도)이 예를 들어 이미지 획득, 이미지 처리, 이미지 분할 및 기능 추출의 단계를 이용하여 DDHM으로부터 직접 분석 또는 계산될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 자동화된 시스템은 홀로그래픽 이미지를 기록하는 디지털 기록 장치를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자동화된 시스템은 홀로그램 이미지를 분석하기 위한 알고리즘을 포함하는 컴퓨터를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자동화된 시스템은 홀로그램 이미지 분석 결과를 표시하기 위한 모니터 및/또는 컴퓨터를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분석은 자동화된다(즉, 사용자 입력의 부재하에 수행될 수 있는). 상기 배양 단계 도중에 세포를 모니터링하는데 적합한 자동화된 시스템의 예는 제한되지는 않지만 Ovizio iLine F(Ovizio Imaging Systems NV/SA, 브뤼셀, 벨기에)을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 모니터링은 인큐베이션 단계 동안 연속적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 모니터링은 실시간으로 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 모니터링은 개별 시점에서 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 15분 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 30분 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 45분 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 2 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 4 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 6 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 8 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 10 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 12 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 14 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 16 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 18 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 20 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 매 22 시간 마다 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 1일에 한번 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 기간 동안에 적어도 2일에 한번 수행된다. 일부 구현예에서, 모니터링은 인큐베이션 단계의 동안에 적어도 한 번 수행된다.
일부 구현예에서, DHM 또는 DDHM와 같은 광학 기술을 이용하는 것을 비롯한 상기 모니터링에 의해서 결정될 수 있는 세포의 특징은 세포 생존율, 세포 농도, 세포수 및/또는 세포 밀도를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 생존율이 특성화되거나 결정된다. 일부 구현예에서, 세포 농도, 밀도, 및/또는 수가 특성화되거나 결정된다. 일부 구현예에서, 생존 가능한 세포 농도, 생존 가능한 세포 수 및/또는 생존 가능한 세포 밀도가 특성화되거나 결정된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 세포가 증폭을 위한 배양 조건 하에서 인큐베이션될 때, 세포는 증폭의 임계치, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 집단의 더블링에 도달할 때까지 자동화된 시스템에 의해서 모니터링 된다. 일부 구현예에서, 일단 증폭의 임계치에 도달하면, 상기 배양된 세포는 예를 들어 자동 또는 수동 방법, 예를 들어 인간 작업자에 의해서 수확된다. 상기 증폭의 임계치는 상기 자동화된 시스템에 의해서 결정된 배양된 세포의 총 농도, 밀도, 및/또는 수에 의존할 수 있다. 다르게는, 증폭의 임계치는 생존 가능한 세포의 농도, 밀도, 및/또는 수에 의존할 수 있다.
일부 구현예에서, 수확된 세포는 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 담체와 존재 하에서 기술된 바와 같이 제제화 된다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는 동결보호제의 존재 하에서 제제화 된다.
F. 프로세스 중 소분자
일부 구현예에서, 조절제(modulating agent)의 존재 하에 조작된 세포(예를 들어, CAR-T 세포)를 제조 또는 생산하고, 이로써 상기 방법에 의해 제조 또는 생산된 조작된 세포의 지속성, 고갈의 결여 및/또는 효능의 개선을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은, 조절제의 존재 하에 수행되지 않은 대안적인 방법과 같은 대안적인 방법에 의해 생산된 조작된 세포 조성물에 비해, (i) 고갈된 세포 및/또는 고갈과 관련된 마커 또는 표현형을 나타내는 세포를 보다 적게 함유하고/거나; (ii) 장기 생존 기억 T 세포와 같은 기억 유사 T 세포의 증가된 백분율을 함유하고/거나; (iii) 덜 분화되고/거나; (iv) 개선 또는 향상된 생존, 증폭, 지속성 및/또는 항종양 활성을 나타내고/거나; (v) 개선된 치료 효능을 나타내고/거나; (vi) 개선된 임상 반응 내구성을 나타내는; 예컨대 세포 요법에 사용하기 위한 재조합 수용체를 발현하도록 조작된 1차 T 세포를 포함하는 세포 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 대체 프로세스에 대한 비교는, 대체 프로세스가 조절제의 존재 하에 수행되지 않는다는 점만이 상이한 동일한 공정에 대해 이루어진다
일부 구현예에서, 조절제는 세포를 수집, 수확 또는 제형화하기 전에 세포 또는 세포 집단과 접촉(예를 들어, 조절제는 세포 안에 있거나 하나 이상의 세포 표면 분자와 상호 작용한다)한다. 일부 구현예에서, 조절제는, 세포가 자극, 예를 들어, T 세포 활성화의 대상이 되기 전, 중 또는 후에 존재한다. 일부 구현예에서, 조절제는 자극, 예를 들어, 여기 예컨대 섹션 I-C에 기재된 자극 전 또는 중에 세포 또는 세포 집단과 접촉(예를 들어, 조절제는 세포 안에 있거나 하나 이상의 세포 표면 분자와 상호 작용한다)한다. 일부 구현예에서, 조절제는, 세포가 조작, 예를 들어, 형질도입 대상이 되기 전, 중 또는 후에 존재한다. 일부 구현예에서, 조절제는 조작,예를 들어, 본원 예컨대 섹션 I-E에 기재된 조작 전 또는 중에 세포 또는 세포 집단과 접촉(예를 들어, 조절제는 세포 안에 있거나 하나 이상의 세포 표면 분자와 상호 작용한다)한다. 일부 구현예에서, 조절제는 인큐베이션, 예를 들어, 여기 예컨대 섹션 I-E-3에 기재된 인큐베이션 중 또는 후에 세포 또는 세포 집단과 접촉(예를 들어, 조절제는 세포 안에 있거나 하나 이상의 세포 표면 분자와 상호 작용한다)한다. 일부 구현예에서, 조절제는 자극(예를 들어, 여기 예컨대 섹션 I-C에 기재된 자극) 중, 조작(여기 예컨대 섹션 I-E에 기재된 조작) 중 및/또는 인큐베이션(예를 들어, 여기 예컨대 섹션 I-E-3에 기재된 인큐베이션) 중에 세포 또는 세포 집단과 접촉(예를 들어, 조절제는 세포 안에 있거나 하나 이상의 세포 표면 분자와 상호 작용한다)한다. 특정 구현예에서, 세포 또는 세포 집단은 인큐베이션 후이나 세포의 수집, 수확 또는 제형화 단계 전에 조절제의 존재 하에 프로세스, 절차, 단계 또는 기술에 노출된다. 특정 구현예에서, 세포 또는 세포 집단은 인큐베이션 후에 조절제의 존재 하에 프로세스, 절차, 단계 또는 기술에 노출된다.
일부 구현예에서, 조작(예를 들어, 형질 도입)될 세포는 조작 전에 예를 들어, 배양 배지에서 조절제와 접촉(예를 들어, 인큐베이션)된다. 일부 구현예에서, 세포는 조절제의 존재 하에 조작된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 조작된 세포는 예를 들어, 배양 배지 예컨대 하나 이상의 재조합 사이토카인이 없거나 임의의 재조합 사이토카인이 없는 기본 배지에서 조절제와 접촉(예를 들어, 인큐베이션)된다. 또한, 예를 들어 세포 기반 치료를 위해, (i) 조절제 및 (ii) 조작될 세포 및/또는 조작의 대상이 된 세포(조작된 세포 포함), 예컨대 1차 면역 세포(예를 들어, T 세포)를 포함하는 조작된 세포의 제조 또는 생산 중 조성물인 일부 구현예가 제공된다.
일부 구현예에서, 조절제는 PI3K 억제제, Akt 경로, mTOR 억제제, Ras/ERK 억제제, NF-κΒ 억제제, BET 억제제, CDK 억제제, CRAC 채널 억제제, Cox 억제제, 도파민 길항제, ERK5 억제제, 글루코코르티코이드, IGF-1R 억제제, IKK 억제제, JAK 억제제, Lck 억제제, PDKl 억제제, Raf 억제제 및 Syk 억제제로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, Src 억제제는 다사티닙, 사라카티닙, 보수티닙, KX01 및 레바스티닙(DCC-2036)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Src 억제제는 레바스티닙(DCC-2036)을 포함한다. 본 개시의 조절제로서 유용한 특정 제제는, 문헌[국제 출원 WO2019018603, WO2018106595 및 PCT/US2018/058812]에 개시되어 있으며, 이들의 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 조절제는 화합물, 소분자, 예를 들어, 작은 유기 분자, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 폴리펩타이드 또는 mTOR과 같은 표적의 하나 이상의 활성을 억제, 감소, 방지하고/거나 억제, 감소 또는 방지할 수 있는 이의 단편, 동형 단백질, 변이체, 유사체 또는 유도체이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 제제는 10 kD 미만, 9 kD 미만, 8 kD 미만, 7 kD 미만, 6 kD 미만, 5 kD 미만, 4 kD 미만, 3 kD 미만, 2 kD 미만, 1 kD 미만, 0.5 kD 미만 또는 0.1 kD 미만의 분자량을 갖는 소분자이다.
일부 구현예에서, 조절제는 mTOR 활성을 억제하는 제제이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 조작(예를 들어, 형질 도입)될 세포는 조작 전에 mTOR 억제제와 접촉(예를 들어, 인큐베이션)된다. 일부 구현예에서, 세포는 mTOR 억제제의 존재 하에 조작된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 조작된 세포는 예를 들어, 배양 배지 예컨대 하나 이상의 재조합 사이토카인이 없거나 임의의 재조합 사이토카인이 없는 기본 배지에서 mTOR 억제제와 접촉(예를 들어, 인큐베이션)된다. 또한, (i) mTOR 억제제 및 (ii) 조작될 세포 및/또는 조작의 대상이 된 세포(조작된 세포 포함)를 포함하는 조작된 세포의 제조 또는 생산 중 조성물인 일부 구현예가 제공된다.
일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 mTOR의 하나 이상의 활성을 억제, 감소 및/또는 저하시키고/거나 억제, 감소 및/또는 저하시킬 수 있다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 mTOR 키나아제 활성을 억제, 감소 및/또는 저하시키고/거나 억제, 감소 및/또는 저하시킬 수 있다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는, mTORC1 활성, 예를 들어 mTORC1 키나아제 활성 및/또는 mTORC2 활성을 억제, 감소 및/또는 저하시키고/거나 억제, 감소 및/또는 저하시킬 수 있다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 mTORC1 복합체 형성을 방지하고/거나 불안정하게 만든다. 특정 구현예에서, 활성을 억제하는 제제는 mTORC2 복합체 형성을 방지하고/거나 불안정하게 만든다.
특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 하나 이상의 추가 키나아제의 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 키나아제는 PI3K이다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는: (i) PI3K 활성을 억제하지 않고/거나; (ii) mTOR 활성에 대한 IC50에서 PI3K 활성을 검출 가능하게 억제하지 않고/거나; (iii) mTOR 활성을 검출 가능하게 억제하는 모든 농도에서 PI3K를 검출 가능하게 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 PI3K 활성에 비해 mTORC1 및 mTORC2 키나아제 활성을 억제, 예를 들어, 선택적으로 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 mTORC1 및 mTORC2 키나아제 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는, mTORC1 활성, 예컨대 mTORC1 키나아제 활성을 선택적으로 억제한다.
특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는: (i) mTORC2 활성을 억제하지 않고/거나; (ii) mTORC1 활성에 대한 IC50에서 mTORC2 활성을 검출 가능하게 억제하지 않고/거나; (iii) mTORC1 검출 가능하게 억제하는 모든 농도에서 mTORC2를 검출 가능하게 억제하지 않는다.
일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는, CC214-1 (Celgene), CC214-2 (Celgene), CC0470324, GDC0980, SAR245409, VS5584, PI-103, SF1126, BGT226, XL765, PF-04691502, 닥톨리십(Dactolisib) (코드명 NVP-BEZ235 및 BEZ-235), 피라졸로피리딘(pyrazolopyrimidine), 토린(Torin) l, 토르키닙(Torkinib) (PP242), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth), DS3078a, 라파마이신(시롤리무스), 템시롤리무스 (CC1779), 에버롤리무스 (RAD001), 데포롤리무스 (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca) 및 OSI-027 (OSI)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 화학식 (I), 화학식 (Ⅱ) 또는 화학식 (Ⅲ)으로 제공된 화학식을 갖거나 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 화합물 155, 화합물 246 또는 화합물 63이다
특정 구현예에서, 제제는 하기 화학식 (I)을 포함하고,
Figure pct00001
[화학식 (I)]
여기에서 R1　은 치환 또는 비치환 C1-8 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬이고, R2　는 치환 또는 비치환 C1-8알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클로 알킬이며 R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-8 알킬이다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 용매 화합물이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는, 2-(3-하이드록시페닐)-9-(2-이소프로필페닐)-8-옥소8,9-디히드로-7H-퓨린-6-카르복사미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 용매 화합물이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는, 또는 약학적으로 허용 가능한 이의 염이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 제제는 하기 화학식 (II)로 제시된 화학식을 포함하고,
Figure pct00002
[화학식 (II)]
여기에서 L은 직접적인 결합, NH 또는 O이고, Y는 N 또는 CR3이며, 여기에서 R1은 H, 치환 또는 비치환 C1-8 알킬, 치환 또는 비치환 C2-8 알케닐, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬이고, R2　는 H, 치환 또는 비치환 C1-8 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬이며, R3　는 H, 치환 또는 비치환 C1-8 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, -NHR4 또는 -N(R4)2이며 R4　는 각각의 경우 독립적으로 치환 또는 비치환 C1-8 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬이다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 화학식 (II)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 용매 화합물이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는, 6-(4-(2H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)-1-(2-(테트라히드로-2H-피란-4-일)에틸)-1H-이미다조 [4,5-b]피라진-2(3H)-원 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 용매 화합물이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는, 또는 약학적으로 허용 가능한 이의 염이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 제제는 하기 화학식 (III)으로 제시된 화학식을 포함하고,
Figure pct00003
[화학식 (III)]
여기에서 R1은 치환 또는 비치환 C1-8 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클일 또는 치환 또는 비치환 헤테로시클일알킬이고, R2는 H, 치환 또는 비치환 C1-8 알킬, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클일, 치환 또는 비치환 헤테로시클일알킬, 치환 또는 비치환 아랄킬 또는 치환 또는 비치환 시클로알킬알킬이며, R3　는 H 또는 치환 또는 비치환 C1-8 알킬이다. 특정 구현예에서, R1은 치환 또는 비치환 아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, R1은 치환된 피리딜이다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 화학식 (III)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 용매 화합물이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는 화학식 (Ⅲ)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는, 7-(6-,2-하이드록시프로판-2-일)-3-일)-1-((1r,4r)-4-메톡시사이클로헥실)-3,4-디하이드로피라지노[2,3-b]피라진-2(1H)-원 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 용매 화합물이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 제제는, 또는 약학적으로 허용 가능한 이의 염이거나 이를 포함한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 범위는 또한 이의 표적에 기초한 각각의 클래스 하에서 기능적으로 범주화된 다른 모든 제제의 유사체 또는 유도체를 포함하며, 유사체 또는 유도체는 염, 에스테르, 에테르, 용매 화합물, 수화물, 입체 이성질체 또는 전구 약물을 포함하나 이에 국한되지 않는다
G. 세포 수확 및 수집
일부 구현예에서, 세포는 수확되거나 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는 예를 들어 섹션 I-E-3에 기재된 것과 같이 인큐베이션 완료 후에 수집 또는 수확된다. 특정 구현예에서, 수집 또는 수확된 세포는 산출 집단의 세포이다. 일부 구현예에서, 산출 집단은 생존가능한, CD3+, CD4+, CD8+ 및/또는 재조합 수용체에 양성인, 예를 들어 CAR+세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 수확된 CD4+ T 세포 및 제제화된 CD8+ T 세포는 산출 CD4+ 및 CD8+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 제형화된 세포 집단, 예를 들어 농축된 CD4+ 및 CD8+ 세포의 제형화된 집단은 산출 세포 집단, 예를 들어 농축된 CD4+ 및 CD8+ 세포의 산출 집단이다.
일부 구현예에서, 수확, 수집 또는 제형화된 세포 또는 세포 집단은 임의의 증폭, 예를 들어 세포가 인큐베이션 또는 배양 중 생존 가능한 세포의 양이 증가되는 조건 하에서 인큐베이션 또는 배양되는 임의의 조건을 거치지 않는다. 예를 들어, 일부 측면에서, 수확된 세포는, 인큐베이션 또는 배양 초기의 생존 가능한 총 세포 수에 비해 인큐베이션 또는 배양 말기에 생존 가능한 총 세포의 양이 증가되는 임의의 인큐베이션 또는 배양을 거치지않았다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는, 상기 인큐베이션 또는 배양 프로세스의 초기에 비해 인큐베이션 또는 배양 프로세스의 말기에 생존 가능한 총 세포 수를 명백하게 증가시킬(예를 들어, 증폭시킬) 목적을 위한 임의의 인큐베이션 또는 배양 단계를 거치지 않았다. 일부 구현예에서, 세포는 증폭을 초래할 수 있는 조건 하에서 인큐베이션 또는 배양되나, 인큐베이션 또는 배양 조건이 세포 집단을 증폭시킬 목적으로 수행되지 않는다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는 증폭 단계를 포함하지 않는 프로세스로 제조되었음에도 불구하고 증폭되었을 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭 단계를 포함하지 않는 제조 프로세스는 비증폭 또는 최소한으로 증폭된 프로세스로 지칭된다. “비증폭(non-expanded)” 프로세스는 “최소한으로 증폭된(minimally expanded)” 프로세스로도 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 비증폭 또는 최소한으로 증폭된 프로세스는 증폭 단계를 포함하지 않는 프로세스임에도 증폭을 거친 세포를 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는 전체적으로 세포 집단의 증폭을 감소, 억제, 최소화 또는 제거하도록 설계된 배지 조성물을 포함하는 인큐베이션 또는 배양 단계를 거쳤을 수 있다. 일부 구현예에서, 수집, 수확 또는 제형화된 세포는, 세포가 인큐베이션 또는 배양의 전부 또는 일부 동안 흔들림, 회전, 떨림 또는 관류되는 조건 하에서 또는 생물 반응기에서 수행된 인큐베이션 또는 배양을 이전에 거치지 않았다.
일부 구현예에서, 수확, 수집 또는 제형화된 세포 또는 세포 집단은 증폭, 예를 들어 세포가 인큐베이션 또는 배양 중 생존 가능한 세포의 양이 증가되는 조건 하에서 세포가 인큐베이션 되거나 배양되는 조건을 거쳤다. 예를 들어, 일부 측면에서, 수확된 세포는, 인큐베이션 또는 배양 초기의 생존 가능한 총 생존 가능한 세포 수에 비해 인큐베이션 또는 배양 말기에 생존 가능한 총 세포의 양이 증가되는 인큐베이션 또는 배양을 거쳤다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는, 상기 인큐베이션 또는 배양 프로세스의 시작에 비해 인큐베이션 또는 배양 프로세스의 말기에 생존 가능한 총 세포 수를 명백하게 증가시킬(예를 들어, 증폭시킬) 목적을 위한 인큐베이션 또는 배양 단계를 거쳤다. 일부 구현예에서, 수확된 세포는 전체적으로 세포 집단의 증폭을 용이하게 하거나 촉진시키도록 설계된 배지 조성물을 포함하는 인큐베이션 또는 배양 단계를 거쳤다. 일부 구현예에서, 수집, 수확 또는 제형화된 세포는, 세포가 인큐베이션 또는 배양의 전부 또는 일부 동안 흔들림, 회전, 떨림 또는 관류되는 조건 하에서 또는 생물 반응기에서 수행된 인큐베이션 또는 배양을 이전에 거쳤다.
일부 구현예에서, 세포 선택, 단리, 분리, 농축 및/또는 정제 단계는, 세포 또는 세포 집단이 수확, 수집 또는 제형화되기 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 세포 선택, 단리, 분리, 농축 및/또는 정제 단계는, 여기 개시된 바와 같은 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피에 의한 T 세포 선택 단계는 T 세포 형질 도입 후이나 세포의 수확 전, 수집 전 및/또는 제형화 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피에 의한 T 세포 선택 단계는 세포의 수확 직전에 수행된다.
특정 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 24 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간이거나, 24 시간, 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지 조작된 세포를 생성하기 위해 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 12 시간 내지 24시간, 36시간 내지 120 시간, 48시간 내지 96시간 또는 48 시간 내지 72시간 (수치포함)이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지의 시간량은 (약) 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 또는 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 미만이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지의 시간량은 48 시간 ± 6 시간, 72 시간 ± 6 시간 또는 96 시간 ± 6 시간이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지의 시간량은 96 시간 또는 4일이다.
특정 구현예에서, 세포는, 무혈청 배지, 예컨대 본원 섹션 III 또는 참조로서 본원에 통합된 국제 출원 PCT/US2018/064627에 기재된 것에서 수확, 수집 또는 제형화된다. 일부 구현예에서, 세포는, 예를 들어 본원 섹션 I-E-3에 기재된 바와 같은 인큐베이션 중 사용된 것과 동일한 무혈청 배지로 수확, 수집 또는 제형화된다.
특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 재조합 사이토카인을 함유하지 않고, 혈청 성분을 함유하지 않는, 즉 무혈청 배지이나 섹션 III. B에 기재된 것과 같은 하나 이상의 추가 성분을 함유할 수 있는 기본 배지에서 수확, 수집 또는 제형화된다. 특정 구현예에서, 상기 무혈청 배지의 사용은, 세포의 유지를 제공하나 세포를 대사적으로 활성화시키거나 활성화시킬 수 있는 특정 인자를 포함하지 않는 린(lean) 배지를 제공한다. 일부 측면에서, 상기 무혈청 배지의 존재 하에 (예를 들어 섹션 에 따른) 인큐베이션은 세포가 자극 I-C 및 유전자 조작(예를 들어, 형질 도입) 후에 회복되게 한다. 일부 측면에서, 상기 무혈청 배지의 존재 하에 세포의 수확, 수집 또는 제형화는, 예를 들어, 수확/제형화된 세포가 동결 보존되고 이어서 사용 직전에 해동된 경우, 생존 능력의 손상 또는 손실에 덜 취약한 세포를 함유하는 산출 조성물의 제형화를 초래한다. 일부 구현예에서, 해동된 경우 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는, 유사한 배지이나 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 동결 보존 시 세포를 대사적으로 보다 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 재조합 사이토카인, 혈청 또는 기타 인자를 함유하는 배지에서 인큐베이션 되었던 세포보다 카스파제 또는 세포 자멸사의 다른 마커의 수준이 보다 낮다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포 집단이 제형화된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포 집단은, 하나 이상의 집단이 조작 및/또는 배양된 후에 제형화된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 집단은 투입 집단 또는 산출 조성물(예를 들어, 선택 및 자극된 세포)이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 투입 집단 또는 산출 조성물은 이전에 동결 보호되고 저장되었고, 세포를 인큐베이션(예를 들어, 본원 섹션 I-E-3에 기재된 바와 같은 인큐베이션) 하기 전에 해동된다.
특정 구현예에서, 세포는 세포 집단의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 또는 그 이상의 세포 집단의 배가(예를 들어, 인큐베이션 중에 발생하는 배가) 전, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 또는 그 이상의 세포 집단의 배가 전에 수확된다.
특정 구현예에서, 세포는, 총 세포 수, 예를 들어 인큐베이션된 세포 또는 인큐베이션(예를 들어, 본원 섹션 I-E-3에 기재된 바와 같은 인큐베이션)을 경험하는 세포의 총 수가, 투입 집단의 세포 수, 예를 들어 자극 시약과 접촉되었던 총 세포 수의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 또는 20 배 이상을 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 일부 구현예에서, 세포는, 인큐베이션된 총 세포 수가 형질 전환, 형질 도입 또는 회전 접종되었던 총 세포 수, 예를 들어 바이러스 벡터와 접촉되었던 총 세포 수의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 또는 20 배 이상을 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 특정구현예에서, 세포는 T 세포, 생존 가능한 T 세포, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CAR 발현 T 세포 또는 상기 중 임의의 조합물이다. 특정 구현예에서, 세포는 총 세포 수가 입력 집단의 총 세포 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 다양한 구현예에서, 세포는 생존 가능한 CD3+ T 세포의 총 수가 투입 집단의 생존 가능한 CD3+ 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 특정 구현예에서, 세포는, 총 세포 수가 형질 전환, 형질 도입 또는 회전 접종된 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다. 다양한 구현예에서, 세포는, 생존 가능한 CD3+ T 세포의 총 수가 형질 전환, 형질 도입 또는 회전 접종된 세포의 생존 가능한 CD3+ 세포의 총 수를 초과하기 전의 시기에 수확 또는 수집된다.
특정 구현예에서, 제형화된 세포는 산출 세포이다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 제형화된 집단은 농축된 T 세포의 산출 집단이다. 특정 구현예에서, 제형화된 CD4+ T 세포 및 제형화된 CD8+ T 세포는 산출 CD4+ 및 CD8+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 제형화된 세포 집단, 예를 들어 농축된 CD4+ 및 CD8+ 세포의 제형화된 집단은 산출 세포 집단, 예를 들어 농축된 CD4+ 및 CD8+ 세포의 산출 집단이다.
일부 구현예에서, 세포는 컨테이너, 예컨대 백 또는 바이알로 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 약학적으로 허용 가능한 완충제로 제형화되며, 이는 일부 측면에서 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로세싱은 약학적으로 허용 가능하거나 대상체에 투여하기에 바람직한 배지 또는 제형화 완충제로 배지의 교환을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로세싱 단계는 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있는 약학적으로 허용 가능한 완충제에서 세포를 교체하기 위해 형질 도입 및/또는 증폭된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한 상기 약학적 형태의 예시는 대상체에게 세포 및 조성물을 투여하기 위해 허용 가능한 형태와 함께 하기에 기재된 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예에서 약학 조성물은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량과 같이 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 세포를 함유한다.
“약학적으로 허용 가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)”는 활성 성분 외의 약학적 제형 안에 있는 성분을 지칭하고, 이는 대상체에 무독성이다. 약학적으로 허용 가능한 운반체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 담체의 선택은 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 적합한 제형이 다양하게 존재한다. 예를 들어, 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산 나트륨 및 염화 벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2개 이상의 보존제가 혼합되어 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 통상적으로 전체 조성물의 약 0.0001% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 운반체는, 예를 들어, 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기술되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 운반체는 일반적으로 사용된 용량 및 농도에서 수용체(recipient)에게 무독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로 헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 설탕; 나트륨과 같은 염 형성 카운터 이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온 계면활성제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서 완충제는 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는 예를 들어, 구연산, 구연산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2개 이상의 완충제 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 통상적으로 전체 조성물의 약 0.001% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 상세하게 기술되어 있다.
제형에는 수용액이 포함될 수 있다. 제형 또는 조성물은 또한 세포, 바람직하게는 세포에 상보적인 활성을 가진 것으로 치료될 특정 징후, 질병 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 활성이 서로 악영향을 미치지 않는다. 상기 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은 화학 요법제, 예를 들어 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴 및/또는 빈크리스틴과 같은 다른 약학적 활성제 또는 약물을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서 조성물은 멸균 액체 제제로서, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 에멀션, 분산액 또는 점성 조성물로 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 조성물은 예를 들어, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 멸균 주사용 용액은 적합한 담체, 희석제 또는 멸균수, 생리 식염수, 포도당, 덱스트로스 등과 같은 부형제와의 혼화물과 같은 용매에 세포를 통합시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 제조 경로에 따라 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들어, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 방부제, 향미제 및/또는 색소와 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 제조를 위하여 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이팅제 및 완충제를 포함한, 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제를 첨가할 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 소르브산에 의해 보장될 수 있다. 주사용 약학적 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 초래될 수 있다.
일부 구현예에서, 제형화 완충제는 냉동 보존제를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포는 1.0% 내지 30% DMSO 용액, 예컨대 5% 내지 20% DMSO 용액 또는 5% 내지 10% DMSO 용액을 함유하는 냉동 보존 용액으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 냉동보존 용액은 예를 들어, 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 기타 적합한 세포 동결 배지를 함유하는 PBS이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 용액은 예를 들어 7.5% DMSO 이상 또는 약 7.5% DMSO이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 프로세싱 단계는 냉동보존 용액에서 세포를 교체하기 위해 형질 도입된 및/또는 증폭된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는, (약) 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9. 0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5% 또는 5.0% DMSO 또는 1% 내지 15%, 6% 내지 12%, 5% 내지 10% 또는 6% 내지 8% DMSO의 최종 농도로 배지 및/또는 용액에서 냉동, 예를 들어 동결 보호 또는 동결 보존된다. 특정 구현예에서, 세포는, (약) 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5% 또는 0.25% HSA 또는 0.1% 내지 5%, 0.25% 내지 4%, 0.5% 내지 2% 또는 1% 내지 2% HSA의 최종 농도로 배지 및/또는 용액에서 냉동, 예를 들어 동결 보호 또는 동결 보존된다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포, 예를 들어 자극, 조작 및/또는 배양된 T 세포 조성물은 제형화, 동결 보호되고, 이어서 시간량 동안 보관된다. 특정 구현예에서, 제형화, 동결보호된 세포는 세포가 주입을 위해 방출될 때까지 보관된다. 특정 구현예에서, 제형화 동결 보호된 세포는 1 일 내지 6 개월, 1 개월 내지 3 개월, 1 일 내지 14 일, 1 일 내지 7 일, 3 일 내지 6 일, 6 개월 내지 12 개월 또는 12 개월보다 더 오래 동안 보관된다. 일부 구현예에서, 세포는 (약) 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 또는 7 일 또는 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일 또는 7 일 미만 동안 동결 보호 및 보관된다. 특정 구현예에서, 세포는 해동되고 보관 후에 대상체에 투여된다. 특정 구현예에서, 세포는 (약) 5 일 동안 보관된다. 일부 구현예에서, 제형화된 세포는 동결 보존되지 않는다.
일부 구현예에서, 제형은 배양 또는 증폭된 세포와 같은 세포를 세척, 희석 또는 농축시키는 것을 포함하는 하나 이상의 프로세싱 단계를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 프로세싱은 주어진 단위 용량 또는 이의 분획으로 투여를 위한 세포의 수를 포함하는 단위 투여 용량 형태 조성물과 같은 원하는 농도 또는 수로 세포의 희석 또는 농축을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로세싱 단계는 원하는 대로 세포의 농도를 증가시키기 위해 부피 감소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로세싱 단계는 원하는 대로 세포의 농도를 감소시키기 위해 부피 첨가를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로세싱은 형질 도입 및/또는 증폭된 세포에 제형 완충액의 부피를 추가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 완충제의 부피는 (약) 10 mL 내지 1000 mL, 예컨대 (약) 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL 또는 1000 mL 이상 또는 (약) 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL 또는 1000 mL mL이다.
일부 구현예에서, 세포 조성물을 제형화하기 위한 상기 프로세싱 단계는 폐쇄된 시스템에서 수행된다. 예시적인 상기 프로세싱 단계는 Sepax® 또는 Sepax 2® 세포 프로세싱 시스템과 함께 사용하기 위한 것을 포함하여 Biosafe SA에 의해 생산 및 판매되는 원심분리 챔버와 같은 세포 프로세싱 시스템과 연합된 하나 이상의 시스템 또는 키트와 함께 컨쥬게이션된 원심분리 챔버를 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 시스템 및 공정이 문헌[국제 공개 번호 WO2016/073602]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 방법은 기재된 바와 같이, 상기 구현예 중 어느 하나에서 제형 완충제, 예컨대 약학적으로 허용 가능한 완충제에서 제형화된 세포의 생성된 조성물인 제형화된 조성물을 원심분리 챔버의 내부 공동에서 발현을 달성하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형화된 조성물의 발현은 원심 분리 챔버를 가진 폐쇄 시스템의 일부로서 작동적으로 연결된 백과 같은 컨테이너이다. 일부 구현예에서, 백과 같은 컨테이너는 산출 라인 또는 산출 위치에서 시스템에 연결된다.
일부 구현예에서, 예컨대 원심분리기 챔버 또는 세포 프로세싱 시스템과 연관된 폐쇄 시스템은, 하나 또는 복수의 컨테이너가 제형화된 조성물의 발현을 위해 연결될 수 있는 포트를 가진 튜브 라인의 각 끝에 결합된 다중 튜브 매니폴드를 함유하는 다중 포트 산출 키트를 포함한다. 일부 측면에서, 원하는 수 또는 복수의 산출 컨테이너, 예를 들어 백은 다중 포트 출력 중 하나 이상, 일반적으로 2 이상, 예컨대 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 이상의 포트에 멸균적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 컨테이너, 예를 들어, 백은 포트에 부착될 수 있거나 또는 모든 포트보다 더 적게 부착될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 시스템은 복수의 산출 백으로 산출 조성물의 발현을 달성할 수 있다.
일부 측면에서, 세포는 투여 용량, 예컨대 단일 단위 투여 용량 또는 다중 투여 용량을 위한 양으로 하나 이상의 복수의 산출 백으로 발현될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 산출 백은 주어진 용량 또는 이의 분획으로 투여를 위한 세포의 수를 각각 함유할 수 있다. 따라서, 각 백은, 일부 측면에서, 투여를 위한 단일 단위 용량을 함유할 수 있거나 또는 원하는 용량의 분획을 함유하여 하나 이상의 복수의 산출 백, 예컨대 2개의 산출 백 또는 3개의 산출 백이 함께 투여를 위한 용량을 구성할 수 있다
따라서, 컨테이너, 예를 들어 산출 백은 일반적으로 투여될 세포를 예를 들어, 하나 이상의 이의 단위 용량으로 함유한다. 단위 용량은 대상체에 투여될 세포의 양 또는 수 또는 투여될 세포의 2배(이상)의 수일 수 있다. 이는 대상체에 투여될 세포의 가장 적은 용량 또는 가능한 가장 적은 용량일 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 컨테이너, 예를 들어 백은 개별적으로 단위 용량의 세포를 포함한다. 따라서 일부 구현예에서, 각각의 컨테이너는 동일하거나 대략 또는 실질적으로 동일한 수의 세포를 포함한다. 일부구현예에서, 각 단위 용량은 (약) 1 x 106, 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 또는 1 x 108 이상의 조작된 세포, 총 세포, T 세포 또는 PBMC를 함유한다. 일부 구현예에서, 각 백에서 제형화된 세포 조성물의 부피는 10 mL 내지 100 mL, 예컨대 (약) 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL 또는 100 mL 이상이다.
일부 구현예에서, 본 방법에 의해 생산된 상기 세포 또는 상기 세포를 포함하는 조성물은 질병 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에 투여된다.
H. 자극 시약의 제거
일부 구현예에서, 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 세포를 수집, 수확 또는 제형화하기 전에 세포 또는 세포 집단에서 제거되거나 분리된다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 크로마토그래피 컬럼으로부터 수집, 예를 들어 본원 예컨대 섹션 I-D에 기재된 바와 같은 용리 및 세포 수집의 단계 후에 세포 또는 세포 집단에서 제거되거나 분리된다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 인큐베이션, 예를 들어 본원, 예컨대 섹션 I-E-3에 기재된 바와 같은 인큐베이션 후 또는 중에 세포 또는 세포 집단에서 제거되거나 분리된다. 특정 구현예에서, 세포 또는 세포 집단은 인큐베이션 후이나 세포의 수집, 수확 또는 제형화 단계 전에 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)을 제거하기 위한 프로세스, 절차, 단계 또는 기술을 거친다. 특정 구현예에서, 세포 또는 세포 집단은 인큐베이션 후 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)을 제거하기 위한 프로세스, 절차, 단계 또는 기술을 거친다. 일부 측면에서, 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)이 인큐베이션 중 세포에서 분리 또는 제거된 경우, 세포는 나머지 인큐베이션 기간 동안 분리 또는 제거 전과 동일한 인큐베이션 조건으로 돌아간다.
특정 구현예에서, 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 세포에서 제거 및/또는 분리된다. 이론에 구속되길 바라지 않으면서, 특정 구현예는 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)과 세포 사이의 결합 및/또는 연합이 일부 상황에서 인큐베이션 동안 시간이 지남에 따라 감소될 수 있음을 고려한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 제제가 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 연합을 감소시키도록 추가될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 배양(culture) 조건의 변화, 예를 들어 제제(예를 들어, 예컨대, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제와 같은 물질)의 첨가는 자극 시약과 세포 사이의 결합 및/또는 연합을 감소시킬 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 또한 예를 들어, 인큐베이션, 세포 배양 시스템 및/또는 용액에서 세포를 제거하지 않고 세포와 별개로 인큐베이션, 세포 배양시스템 및/또는 용액에서 제거될 수 있다.
특정 구현예에서, 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은 소정의 시간 후에 세포에서 분리 및/또는 제거된다 특정 구현예에서, 상기 소정의 시간은 자극이 개시로부터의 시간 양이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 시작은 세포가 자극 시약 및/또는 자극 시약을 함유하는 배지 또는 용액과 접촉하는 시점 또는 대략적인 시점으로 간주된다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 자극 개시의 (약) 120 시간, 108 시간, 96 시간, 84 시간, 72 시간, 60 시간, 48 시간, 36 시간, 24 시간, 12 시간, 6 시간, 5시간, 4시간, 3시간, 또는 2시간 (수치 포함) 이내에 세포에서 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)은, 자극이 개시된 후 (약) 48 시간에 세포에서 제거 또는 분리된다 특정 구현예에서, 자극 시약은 자극이 개시된 후 (약) 72 시간에 세포에서 제거 또는 분리된다 특정 구현예에서, 자극 시약은 자극이 개시된 후 (약) 96 시간에 세포에서 제거 또는 분리된다
1. 올리고머 자극 시약의 제거
일부 구현예에서, 자극된 세포(즉, 본원에서 기술된 바와 같은 컬럼 크로마토그래피로 선택 및 온-컬럼 자극 되었던 세포)의 집단은 본원에 제공된 임의의 방법에 따라 생산 또는 생성되었으며, 예컨대 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제와 같은 물질이 첨가되어 자극제 또는 제제들의 신호 전달을 예컨대 완화 및/또는 종료시켰다. 일부 구현예에서, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가는 본원(섹션 I-D 참조)에 기술된 바와 같은 용리 단계 후에 발생한다. 일부 구현예에서, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가는 본원에 기술된 바와 같은 유전자 조작 단계 후에 발생한다. 일부 구현예에서, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가는 본원에 기술된 바와 같은 수확 단계 후에 발생한다. 따라서, 일부 구현예에서, 자극된 세포의 집단은 물질, 예를 들어 경쟁 제제, 예컨대, 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 D-비오틴의 존재를 함유한다. 일부 구현예에서, 경쟁 제제, 예컨대 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴과 같은 물질은, 상기 물질이 전술된 단계 중 어느 하나 동안에 외인성으로 첨가되지 않은 참조 집단 또는 배양된(cultured) 세포(예를 들어, T 세포)의 조제(preparation)에서 상기 물질의 양보다 적어도 1.5 배 초과, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 10 배, 적어도 100 배, 적어도 1000 배 또는 그 이상을 초과한 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 자극된 세포의 집단에서 경쟁 제제, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴과 같은 물질의 양은, (약) 10 μΜ 내지 100 μΜ, 100 μΜ 내지 1 mM, 100 μΜ 내지 500 μΜ 또는 10 μΜ 내지 100 μΜ이다. 일부 구현예에서, (약) 10 μΜ의 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴이 세포 또는 세포 집단에 첨가되어 세포 또는 세포 집단에서 올리고머 자극 시약이 분리 또는 제거된다. 일부 구현예에서, (약) 1 μΜ의 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴이 세포 또는 세포 집단에 첨가되어 세포 또는 세포 집단에서 올리고머 자극 시약이 분리 또는 제거된다. 일부 구현예에서, (약) 1 μΜ의 D-비오틴이 세포 또는 세포 집단에 첨가되어 세포 또는 세포 집단에서 올리고머 자극 시약이 분리 또는 제거된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 자극제(예를 들어, TCR 및/또는 공동자극분자를 자극 또는 활성화하는 제제)는, 예컨대 올리고머 시약에 존재하는 복수의 특정 결합 부위(예를 들어, 결합 부위 Z)를 통해 올리고머 시약에 가역적으로 결합하는 것과 같이 연합한다 일부 경우에, 상기는 자극제가 서로 밀접하게 배열되는 결과를 초래하여, 만일 자극제에 의해 인식되거나 결합되는 (2 이상의 카피의) 세포 표면 분자를 갖는 표적 세포가 제제와 접촉이 야기될 경우 결합 효과가 발생할 수 있다. 일부 측면에서, 자극제는 결합 부위 B에서 세포의 분자를 향한 낮은 친화도를 가져서, 수용체 결합 시약은 경쟁 시약의 존재 하에 세포에서 해리된다. 따라서, 일부 구현예에서, 자극제는 경쟁 시약의 존재 하에 세포에서 제거된다.
일부 구현예에서, 올리고머 자극 시약은 항-CD3 및 항-CD28 Fab에 가역적으로 부착된 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머이다. 일부 구현예에서, 부착된 Fab는, 예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머에 대한 가역적 부착을 가능하게 하는 스트렙타비딘 결합 도메인을 함유한다. 일부 경우에, 항-CD3 및 항-CD28 Fab는 서로 밀접하게 배열되어, CD3 및/또는 CD28을 발현하는 T 세포가 가역적으로 부착된 Fab를 갖는 올리고머 자극 시약과 접촉하게 될 경우 결합 효과(avidity effect)가 발생할 수 있다. 일부 측면에서, Fab는 CD3 및 CD28에 대해 낮은 친화도를 가져서, Fab는 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 변이체 또는 유사체의 존재 하에 세포에서 해리된다. 따라서, 일부 구현예에서, Fab는 경쟁 시약, 예를 들어 D-비오틴의 존재 하에 세포에서 제거되거나 해리된다.
일부 구현예에서, 올리고머 자극 시약, 예를 들어 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약은 세포를 수확 또는 제형화하기 전에 세포 또는 세포 집단에서 제거되거나 분리된다. 일부 구현예에서, 올리고머 자극 시약, 예를 들어 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약은, 인큐베이션, 예를 들어 본원 예컨대 섹션 I-F 또는 섹션 I-E-3에 기재된 바와 같은 인큐베이션 중 또는 후에 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 D-비오틴에 노출 또는 접촉시킴으로써 세포 또는 세포 집단에서 제거되거나 분리된다. 특정 구현예에서, 세포 또는 세포 집단은 인큐베이션 후, 세포를 수집, 수확 또는 제형화하는 단계 전에 올리고머 자극 시약, 예를 들어 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 제거하기 위하여 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 D-비오틴에 노출 또는 접촉된다. 특정 구현예에서, 세포 또는 세포 집단은 인큐베이션 후 올리고머 자극 시약, 예를 들어 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 제거하기 위하여 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 D-비오틴에 노출 또는 접촉된다. 일부 측면에서, 올리고머 자극 시약, 예를 들어 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약이, 예를 들어 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 D-비오틴에 대한 노출 또는 접촉에 의해 인큐베이션(섹션 I-E-3 참조) 중 세포에서 제거 또는 분리된 경우, 세포는 나머지 인큐베이션 기간 동안 분리 또는 제거 전과 동일한 인큐베이션 조건으로 돌아간다.
일부 구현예에서, 세포는, 세포에서 올리고머 자극 시약을 제거 또는 분리하기 위하여 (약) 0.01 μM, 0.05 μM, 0. 1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM, 0.01 μM, 1 mM, 또는 10 mM 또는 적어도 0.01 μM, 0.05 μM, 0. 1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM, 0.01 μM, 1 mM, 또는 10 mM 의 경쟁 시약과 접촉된다. 다양한 구현예에서, 세포는, 세포로부터 가역적으로 접착된 항-CD3 및 항-CD28 Fab를 갖는 자극성 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머를 제거 또는 분리하기 위해 (약) 0.01 μM, 0.05 μM, 0. 1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM, 0.01 μM, 1 mM, 또는 10 mM 또는 적어도 0.01 μM, 0.05 μM, 0. 1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM, 0.01 μM, 1 mM, 또는 10 mM의 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 D-비오틴과 접촉된다. 다양한 구현예에서, 세포는 (약) 100 μM 내지 10 mM, 예를 들어, 1 mM의 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 D-비오틴과 접촉되어, 세포로부터 가역적으로 접착된 항-CD3 및 항-CD28 Fab를 갖는 올리고머 자극 시약, 예컨대 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머가 제거 또는 분리된다. 다양한 구현예에서, 세포는, D-비오틴과 접촉 또는 노출 후 (약) 2 시간, 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 42 시간 또는 48 시간 동안 (약) 100 μM 내지 10 mM, 예를 들어, 1 mM의 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 D-비오틴과 접촉된다
특정 구현예에서, 올리고머 자극 시약, 예를 들어 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약은 자극 개시의 (약) 120 시간, 108 시간, 96 시간, 84 시간, 72 시간, 60 시간, 48 시간, 36 시간, 24 시간 또는 12 시간(수치 포함) 이내에 세포에서 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 올리고머 자극 시약, 예를 들어, 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약은, 자극이 개시된 후 (약) 48 시간에 세포에서 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 올리고머 자극 시약, 예를 들어, 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약은, 자극이 개시된 후 (약) 72 시간에 세포에서 제거 또는 분리된다. 특정 구현예에서, 올리고머 자극 시약, 예를 들어, 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약은, 자극이 개시된 후 (약) 96 시간에 세포에서 제거 또는 분리된다.
특정 구현예에서, 세포 또는 세포 집단은 자극이 개시된 후, 예를 들어 본원 예컨대 섹션 I-E-3에 기재된 바와 같은 인큐베이션 중 또는 후 (약) 48 시간 또는 (약) 2일에 올리고머 자극 시약, 예를 들어 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 제거하기 위하여 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 D-비오틴에 노출 또는 접촉시킴으로써 세포 또는 세포 집단에서 제거되거나 분리된다. 일부 측면에서, 올리고머 자극 시약, 예를 들어 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약이, 예를 들어 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 D-비오틴에 대한 노출 또는 접촉에 의해 인큐베이션 중 세포에서 제거 또는 분리된 경우, 세포는 나머지 인큐베이션 기간 동안 분리 또는 제거 전과 동일한 인큐베이션 조건으로 돌아간다. 다른 측면에서, 올리고머 자극 시약, 예를 들어 올리고머 자극 스트렙타비딘 뮤테인 시약이 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예컨대 D-비오틴에 접촉 또는 노출되는 것에 의해서 인큐베이션 후에 세포로부터 분리 또는 제거될 때, 상기 세포는 경쟁 시약에 접촉 또는 노출된 후 (약) 2 시간, 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 30 시간, 36시간, 42 시간, 48 시간 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, D-비오틴 처리를 동반한 형질 도입된 세포는 D-비오틴 첨가 후 (약) 24 ± 6 시간 동안 더 인큐베이션 된다. 일부 구현예에서, D-비오틴 처리를 동반한 형질 도입된 세포는 D-비오틴 첨가 후 (약) 48 시간 동안 더 인큐베이션 된다.
I. 순차 선택, 병행 선택, 및 연마
본원에 제공된 방법은 표적 세포 집단(예를 들어, T 세포, CD3+, CD4+, CD8+ T 세포)의 단리 및/또는 농축시키기 위하여 예를 들어 컬럼 크로마토그래피에 의한 다중 선택 단계를 허용한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 선택 단계는 하나 이상의 시점 또는 조작된 세포의 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)을 생성시키기 위한 공정, 예를 들어 상기 섹션 IA-H에 기재된 바와 같은 공정의 특정 단계에 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 섹션 I-B 및 I-C에 기재된 바와 같은 초기 세포 선택 후에 발생하는 선택 단계는 연마(polishing) 단계로 지칭된다. 연마 단계는 다양한 목적을 위해 수행될 수 있고, 세포 조성물의 추가 정제, 특정 세포 서브타입(예를 들어, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포)의 선택, 죽은 세포의 제거(예를 들어, 생존 가능한 세포의 선택), 성공적으로 조작된 세포(예를 들어, 전이 유전자(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR) 등)를 발현하는 세포)의 선택, 또는 특정 세포 타입의 비율, 총 수 또는 농도(예를 들어, CD4+ 대 CD8+ 세포, CAR+ 또는 TCR+ 세포 대 CAR- 또는 TCR- 세포 또는 CD4+, CD8+, CAR+, TCR+ 및/또는 생존 가능한 세포의 총 수 또는 농도) 조정을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 연마 단계)는 생성물 제어를 증가시키고/거나 환자 간의 변이를 감소시키는 데 유용하다.
일부 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 단계 및/또는 연마 단계)는, 예를 들어 세포 조성물의 추가 정제, 특정 세포 서브 타입의 선택, 생존 가능한 세포의 선택, 조작된 세포의 선택 및/또는 세포의 비율, 총 수 또는 농도를 조정하기 위한 다중 선택 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 연마 단계)는 인큐베이션, 예를 들어 섹션 I-E-3 및/또는 I-F에 기재된 바와 같은 인큐베이션 전에 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 연마 단계)는 수확 및 수집, 예를 들어 섹션 I-H에 기재된 바와 같은 수확 및 수집 전에 수행된다.
일부 측면에서, 상기 방법(예를 들어, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 및/또는 연마 단계))은, 여기에 제공된 바와 같은 샘플(예를 들어, 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)에서 복수의 상이한 세포 집단이 농축 및/또는 단리되는 순차적 선택을 이용함으로써 폐쇄 시스템에서와 같은 단일 프로세스 흐름으로 달성된다. 일부 측면에서, 동일한 용기 또는 용기 세트, 예를 들어, 튜브 세트에서 선택 또는 단리의 수행은 순차적인 양성 및 음성 선택 단계, 이전 단계의 음성 및/또는 양성 분획을 추가 선택의 대상으로 하는 후속 단계를 수행함으로써 달성되고, 여기서 전체 프로세스는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어, 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나를 농축하도록 제1 선택이 수행되고, 제1 선택으로부터 비-선택된 세포가 제2 선택을 위한 세포 공급원으로써 사용되어 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 나머지 다른 하나를 농축하는 순차적 선택에 적용된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들을 수행하여 CD4+ 또는 CD8+ 집단 중 하나 또는 둘 다의 하위-집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포 또는 나이브 T 세포를 농축할 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포(예를 들어, CD3+, CD4+, CD8+ 세포)의 특정 하위 집단, 예컨대 양성이거나 하나 이상의 표면 마커를 높은 수준으로 발현하는 세포, 예를 들어, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포는, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 단계 및/또는 연마 단계) 중 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 선택된다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 세포 집단(예를 들어, 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은 생존 가능한 세포를 선택하기 위한 연마 단계인 후속 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 연마 단계는 세포 조성물에서 세포의 비율 또는 총 수를 제어 또는 조정하는 것을 허용한다.
일 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어, 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, CD3+ 집단을 농축하기 위해 수행되는 제1 선택인 후속 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 CD3+ 집단의 하위-집단, 예를 들어 CD4+ 세포를 농축시키는 결과를 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 CD3+ 집단의 하위-집단, 예를 들어 CD8+ 세포를 농축시키는 결과를 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 생존가능한 세포를 농축시키는 결과를 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 생존 가능한 CD3+ 세포의 하위집단, 예를 들어 CD3+CD4+ 및/또는 CD3+CD8+ 세포를 농축하는 결과를 가져올 수 있다. 일부 구현예에서, 생존 가능한 세포의 선택은 세포 집단(예를 들어, 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물 또는 이의 하위 집단)에서 죽은 세포를 제거하는 것을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본 섹션에 개시된 방법(예를 들어, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 단계 및/또는 연마 단계))은 순차적인 선택 기술을 사용하여 수행될 필요가 없다. 일부 구현예에서, 본 섹션에 개시된 방법(예를 들어, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 및/또는 연마 단계))은 병행 선택 기술과 조합하여 순차적인 선택 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 및/또는 연마 단계)는 순차적인 선택을 적용하지 않을 수 있거나 또는 폐쇄 시스템 또는 동일한 튜브를 사용하는 용기 세트에서 일어나지 않는 순차적인 선택을 적용할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 및/또는 연마 단계)는 예를 들어 단일 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 단일 단계에서 완료된다. 일부 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 및/또는 연마 단계)는 예를 들어 병행 선택 기술을 사용하여 완료된다. 예를 들어, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 및/또는 연마 단계)는 예를 들어 전체 공정이 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 수행되는 폐쇄 시스템에서, 양성 및/또는 음성 선택 단계를 동시에 수행함으로써 완료될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포를 함유하는 샘플(예를 들어, 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은 샘플(예를 들어, 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)이 각 컬럼이 세포 집단의 선택에 영향을 미치는, 2 개 이상의 크로마토그래피 컬럼에 로드되는 병행 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 개별적으로 CD3+, CD4+, 또는 CD8+ 집단의 선택에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 동일한 세포 집단의 선택에 영향을 미친다. 예를 들어, 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 CD3+ 세포의 선택에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 독립적으로 동일한 세포 집단의 선택에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 또는 겔 투과 크로마토그래피를 포함하는 2개 이상의 크로마토그래피 컬럼은 독립적으로 상이한 세포 집단들의 선택에 영향을 미친다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 병행 선택을 통해 선택된 하나 또는 모든 세포 집단의 하위 집단을 농축시키기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 선택된 세포는 중앙 기억 T(TCM) 세포, 나이브 T 세포에 대해 더 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어 CD3+ 세포)를 함유하는 샘플(예를 들어, 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, 병행 선택이 CD4+ 집단 및 CD8+ 집단을 농축시키기 위하여 수행되는 병행 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들을 수행하여 CD4+ 또는 CD8+ 집단 다의 하위-집단, 예를 들어 중앙 기억 T(TCM) 세포 또는 나이브 T 세포를 농축할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, T 세포(예를 들어, CD3+, CD4+, CD8+ T 세포)의 특정 하위 집단, 예컨대 하나 이상의 표면 마커를 높은 수준으로 발현하거나 양성인 세포, 예를 들어 CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 선택된다. 일부 구현예에서, 표적 세포(예를 들어 CD3+ 세포)를 함유하는 샘플(예를 들어, 자극 및/또는 조작된 세포의 산출 조성물)은, 병행 선택이 중앙 기억 T(TCM) 세포 또는 나이브 T 세포를 농축시키기 위하여 수행되는 병행 선택의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 추가 선택 또는 선택들은 중앙 기억 T(TCM) 세포 또는 나이브 T 세포의 하위 집단, 예를 들어 CD4+, CD3+ 또는 CD8+ 세포의 농축을 위해 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 병행 선택 후 수행되는 추가 선택들은 순차적인 선택 기술을 통해 완료된다.
일부 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 및/또는 연마 단계)는 본원에 기재된 바와 같은 선택 제제로 표지된 비드를 사용하여 수행될 수 있고, 제1 선택 단계로부터 양성 및 음성 분획은 유지될 수 있으며, 이어 예컨대 제2 선택 제제로 표지된 비드를 사용하거나 또는 상기 기재된 바와 같은 컬럼 크로마토그래피에 양성 분획을 적용시키는 것에 의해 제2 선택 마커를 농축하도록 양성 분획의 추가 양성 선택이 계속된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 연마 단계는 여기 기재된 바와 같은 컬럼 크로마토그래피, 예를 들어 섹션 I-B에 기재된 바와 같은 크로마토그래피 및/또는 섹션 I-B 또는 섹션 II에 기재된 바와 같은 제제 및 시약을 포함하는 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 및/또는 연마 단계)는 비드 분리 및 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 하나 이상의 방법을 사용하여 달성된다. 일부 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 및/또는 연마 단계)는 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 달성된다.
일부 측면에서, 단일 또는 동일한 단리 또는 분리 용기 또는 용기 세트, 예컨대 단일 컬럼 또는 컬럼 세트 및/또는 동일한 튜브 또는 튜브 세트에서 또는 동일한 분리 매트릭스 또는 배지 또는 시약, 예컨대 동일한 자성 매트릭스, 친화도 표지된 고체 지지체 또는 항체 또는 기타 결합 파트너를 사용하여 복수의 집단을 단리하는 것은, 예를 들어, 비용, 시간, 복잡성, 샘플 처리의 필요성, 자원, 시약 또는 장비 사용의 감소를 초래하는 단리를 간소화하는 특성을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 특징은 방법과 관련된 비용, 효율, 시간 및/또는 복잡성을 최소화하고/거나 감염, 오염 및/또는 온도 변화로 인한 피해와 같은 세포 생성물에 대한 잠재적인 피해를 피한다는 점에서 유리하다. 본원에 제공된 방법은 온-컬럼 자극과 조합된 세포 선택 전 또는 후 둘 다에 다중 선택 단계로 표적 집단의 농축을 가능하게 한다.
본원에 제공된 방법은 성공적으로 자극 및 조작된 세포의 선택 및 농축을 더 가능하게 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 기재된 순차 선택, 병행 선택 또는 단일 선택 절차가 사용되어 재조합 수용체(예를 들어, CARs, TCRs)를 발현하는 자극 세포를 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 성공적인 조작된 세포는 대용(surrogate) 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 선택 제제 사용에 의해 선?될 수 있다(섹션 IV-A-1 참조). 일부 구현예에서, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)를 발현하는 세포는, 하위 집단 세포, 예를 들어 CD4+ CAR+ T 세포, CD8+ CAR+ T 세포, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD45RA+, CD45RO+ T 세포 및/또는 생존 가능한 세포에 대해 추가 농축(예를 들어, 연마)될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 초기 선택 및/또는 연마 단계)는 재조합 수용체(예를 들어, CAR, TCR)를 발현하는 세포 및/또는 이의 하위 집단의 비율, 농도 또는 총 수의 제어 또는 조정을 허용한다. 일부 구현예에서, 농축(예를 들어, 연마)된 집단은 세포 요법을 위한 사용(예를 들어, 투여)을 위해 제형화될 수 있다.
J. 프로세스 및/또는 산출 집단의 예시적인 특성
특정 구현예에서, 제공된 방법은 하나 이상의 투입 집단, 예컨대 단일 생물학적 샘플에서 수득, 선택 또는 농축된 투입 집단에서 조작된 T 세포(예를 들어, 치료 세포 집단)의 산출 집단을 생산 또는 생성하는 프로세스와 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 산출 집단은 재조합 수용체, 예를 들어 TCR 또는 CAR을 발현하는 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 산출 집단의 세포는 요법, 예를 들어 자가 조직 세포 요법으로서 대상체에 투여하기에 적합하다.
특정 구현예에서, 제공된 방법은, 단일 단계로 컬럼 크로마토그래피를 사용해 세포를 선택 및 자극; 경쟁 시약의 사용 없이 자발적으로 분리된 세포의 수집; 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 CAR과 같은 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하거나 함유하는 자극된 세포의 조작, 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염; 세포의 인큐베이션, 세포에서 자극 시약(예를 들어, 올리고머 자극 시약)의 제거 또는 분리, 및 세포의 수확 및 수집, 일부 측면에서 이로써 조작된 T 세포 산출 집단의 생성; 단계 중 일부 또는 전부를 포함하는 프로세스와 같은 조작된 T 세포의 산출 집단 및/또는 산출 세포를 생성 또는 생산하기 위한 전체 프로세스와 관련하여 사용된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은, 생물학적 샘플의 수집 또는 수득; 생물학적 샘플에서 투입 세포의 단리, 선택 또는 농축; 투입 세포의 동결 및 보관 및 이어서 해동; 단일 단계에서 컬럼 크로마토그래피를 이용해 세포를 선택 및 자극; 경쟁 시약의 사용 없이 자발적으로 분리된 세포의 수집; 재조합 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 CAR과 같은 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하거나 함유하는 자극된 세포의 유전자 조작; 산출 조성물에서 배양된 세포의 제형화; 및 대상체에 주입 및/또는 투여를 위해 세포가 방출될 때까지 제형화된 산출 세포의 동결 및 보관; 단계 중 일부 또는 전부를 포함하는 프로세스와 같은 농축된 T 세포의 산출 조성물 및/또는 산출 세포를 생성 또는 생산하기 위한 전체 프로세스와 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 세포가 투입 집단에 비해, 예컨대 적어도 3, 4, 5 배 이상의 세포 양, 수준 또는 농도인 한계 양까지 세포가 증폭되는 조건 하에 생물 반응기에서 세포를 배양하는 것에 의한 것과 같이 프로세스 중 세포의 수를 증폭 또는 증가시키는 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 세포가 투입 집단에 비해, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5 배 이상의 세포 양, 수준 또는 농도인 한계 양까지 세포가 증폭되는 조건 하에 생물 반응기에서 세포를 인큐베이션 또는 배양하는 것에 의한 것과 같이 프로세스 중 세포의 수를 증폭 또는 증가시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 유전자 조작은, 예컨대 바이러스 입자의 존재 하에 세포의 회전 접종 및 이어서 바이러스 입자의 존재 하에 정적 조건 하에서 세포를 인큐베이션함으로써 바이러스 벡터로 세포를 형질 도입하는 단계이거나 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지 조작된 세포를 생성하기 위한 제공된 프로세스의 전체 지속 시간은 (약) 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 또는 36 시간, 42 시간, 48 시간, 54 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 96 시간, 108 시간 또는 120 시간 미만이다. 일부 구현예에서, 자극의 개시에서 세포의 수집, 수확 또는 제형화까지 조작된 세포를 생성하기 위한 제공된 프로세스의 전체 지속 기간은 (약) 36 시간 내지 120 시간, 48 시간 내지 96 시간 또는 48 시간 내지 72 시간(수치 포함)이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지 측정된 바와 같이 제공된 프로세스를 완료하기까지의 시간량은 (약) 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 또는 48 시간, 72 시간 또는 96 시간 미만이다. 특정 구현예에서, 인큐베이션의 개시에서 세포의 수확, 수집 또는 제형화까지 측정된 바와 같이 제공된 프로세스를 완료하기까지의 시간량은 48 시간 ± 6 시간, 72 시간 ± 6 시간 또는 96 시간 ± 6 시간이다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시 후 (약) 24 시간 내지 120 시간, 36 시간 내지 108 시간, 48 시간 내지 96 시간 또는 48 시간 내지 72 시간(수치 포함)에 완료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 자극의 개시로부터 (약) 120 시간, 108 시간, 96 시간, 72 시간, 48 시간 또는 36 시간 또는 120 시간, 108 시간, 96 시간, 72 시간, 48 시간 또는 36 시간 이내에 완료된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 24 시간 ± 6 시간, 48 시간 ± 6 시간, 또는 72 시간 ± 6 시간 후에 완료된다.
일부 구현예에서, 전체 프로세스는 농축된 T 세포, 예를 들어 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 단일 집단으로 수행된다. 특정 구현예에서, 프로세스는 농축된 T 세포의 단일 산출 집단을 생성 또는 생산하기 위한 프로세스 전 및/또는 중에 결합된 2개 이상의 농축된 T 세포의 투입 집단으로 수행된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포는, 조작된 T 세포, 예를 들어 재조합 수용체를 발현하도록 형질 도입된 T 세포이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 산출 집단, 예를 들어 조작된 T 세포 집단은, (i) 24시간 미만 동안 크로마토그래피 컬럼 상의 자극 조건 하(예를 들어, 온-컬럼 자극) T 세포의 샘플 또는 T 세포를 함유하는 샘플을 인큐베이션 하고, (ii) 자극된 집단의 T 세포로 재조합 수용체를 암호화하는 이종 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 도입시키고, (iii) 세포를 인큐베이션 하고, 이어서 (iv) 인큐베이션된 세포를 수집 또는 수확함으로써 생성된다.
특정 구현예에서, 산출 집단, 예를 들어 조작된 T 세포 집단은, (i) 단일 단계에서 (예를 들어, 온-컬럼 자극) 컬럼 크로마토그래피를 사용해 T 세포를 선택 및 자극하고, 24시간 미만에 경쟁 시약의 사용 없이 자발적으로 분리된 세포를 수집하며, (ii) 예컨대 바이러스 벡터의 존재 하에 자극된 T 세포를 회전 접종함으로써 재조합 수용체를 암호화하는 바이러스 벡터로 자극된 T 세포에 형질 도입시키고, (iii) 18 시간 내지 96 시간(수치 포함) 동안 정적 조건 하에서 형질 도입된 T 세포를 인큐베이션 하고, (iv) 자극 조건 하에서 인큐베이션이 개시된 후 (약) 36 시간 내지 108 시간 내에 형질 전환된 집단의 T 세포를 수확함으로써 생성된다.
특정 구현예에서, 산출 집단, 예를 들어 조작된 T 세포 집단은, (i) 단일 단계에서 (예를 들어, 온-컬럼 자극) 컬럼 크로마토그래피를 사용해 T 세포를 선택 및 자극하고, (약) 6시간 미만에 경쟁 시약의 사용 없이 자발적으로 분리된 세포를 수집하며, (ii) (약) 1시간 동안 재조합 수용체를 암호화 하는 바이러스 벡터로 자극된 T 세포에 형질 도입시키고 (iii) (약) 72 시간 동안 형질 도입된 T 세포를 인큐베이션 하고, (iv) 자극 조건 하에서 인큐베이션이 개시된 후 (약) 90 ± 10 시간 이내에 형질 전환된 집단의 T 세포를 수확함으로써 생성된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법과 관련된 프로세스는 대안적인 프로세스와 비교된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 여기 제공된 방법은 세포를 증폭하는 단계를 함유하는 대체 프로세스와 비교된다. 일부 구현예에서, 대체 프로세스는 세포 선택 및 자극을 위한 분리 단계를 포함하는 프로세스이다. 특정 구현예에서, 대안적인 프로세스는 하나 이상의 특정 측면에서 상이할 수 있으나, 그렇지 않으면 제공된 방법과 관련된 프로세스와 동일한 특징, 측면, 단계, 시기, 시약 또는 조건을 함유한다. 일부 구현예에서, 대안적인 프로세스는 제공된 방법과 관련된 프로세스와 유사, 예를 들어 증폭을 포함하지 않거나 결여되나, 방식 상 차이로서, 선택 및 자극을 위한 별도의 단계, 상이한 시약 및/또는 배지 제형; 인큐베이션, 형질 도입, 형질 감염 및/또는 배양 중 혈청의 존재; 투입 집단의 상이한 세포 조성, 예를 들어, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율; 상이한 자극 조건 및/또는 상이한 자극 시약; 자극 시약 대 세포의 상이한 비율; 상이한 벡터 및/또는 형질 도입 방법; 세포의 인큐베이션, 형질 도입 및/또는 형질 감염을 위한 상이한 시기 또는 순서; 형질 도입 또는 인큐베이션 중 존재하는 하나 이상의 재조합 사이토카인의 부재 또는 차이(예를 들어, 상이한 사이토카인 또는 상이한 농도) 또는 세포의 수확 또는 수집을 위한 상이한 시기; 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 투입 세포(예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포)의 단리, 농축 및/또는 선택에서 산출 세포가 수집, 제형화 및/또는 동결보호되는 시기까지 측정된 바와 같은 제공된 프로세스를 완료하기까지 필요한 시간의 양 또는 지속 기간은 (약) 48 시간, 72 시간, 96 시간, 120 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 7 일 또는 10 일 또는 48 시간, 72 시간, 96 시간, 120 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 7 일 또는 10 일 미만이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 투입 세포(예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포)의 단리, 농축 및/또는 선택에서 산출 세포가 수집, 제형화 및/또는 동결보호되는 시기까지 측정된 바와 같은 제공된 프로세스를 완료하기까지 필요한 시간의 양 또는 지속 기간은 (약) 4 내지 5일이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 투입 세포(예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포)의 단리, 농축 및/또는 선택에서 산출 세포가 수집, 제형화 및/또는 동결보호되는 시기까지 측정된 바와 같은 제공된 프로세스를 완료하기까지 필요한 시간의 양 또는 지속 기간은 (약) 5 일이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 투입 세포(예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포)의 단리, 농축 및/또는 선택에서 산출 세포가 수집, 제형화 및/또는 동결보호되는 시기까지 측정된 바와 같은 제공된 프로세스를 완료하기까지 필요한 시간의 양 또는 지속 기간은 5 일, 5일 미만이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 투입 세포(예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T 세포)의 단리, 농축 및/또는 선택에서 산출 세포가 수집, 제형화 및/또는 동결보호되는 시기까지 측정된 바와 같은 제공된 프로세스를 완료하기까지 필요한 시간의 양 또는 지속 기간은 (약) 4 일이다. 일부 구현예에서, 단리, 선택 또는 농축된 세포는 자극 전에 동결보호되지 않고, 투입 세포의 단리, 농축 및/또는 선택에서 (산출 세포가 수집, 제형화 및/또는 동결보호되는 시기까지 측정된 바와 같은 제공된 프로세스를 완료하기까지 필요한 시간의 양 또는 지속 기간은 (약) 48 시간, 72 시간, 96 시간 또는 120 시간 또는 48 시간, 72 시간, 96 시간 또는 120 시간 미만이다.
특정 구현예에서, 제공된 프로세스는 생물학적 샘플에서 단리, 농축 또는 선택된 세포, 예를 들어 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 CD3+ T 세포 집단에서 수행된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은, 생물학적 샘플이 다른 방법 또는 프로세스에 비해 짧은 시간량 내에 대상체에서 수집된 경우 조작된 T 세포 조성물을 생산하거나 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 생물학적 샘플 또는 농축, 단리 또는 선택된 세포가 형질 도입을 위한 단계 이전 동결 보존되고 보관되는 임의의 또는 모든 시간을 포함하여, 생물학적 샘플이 대상체에서 수집된 때로부터 조작된 T 세포가 수집, 수확 또는 (예를 들어, 동결 보존 또는 투여를 위해) 제형화된 때까지, (약) 10 일, 9 일, 8 일, 7 일, 6 일, 5 일 이내, 또는 (약) 120 시간, 96 시간, 72 시간 또는 48 시간 이내에 조작된 T 세포를 생산하거나 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은, 생물학적 샘플 또는 농축, 단리 또는 선택된 세포가 형질 도입을 위한 단계 이전 동결 보존되고 보관되는 임의의 또는 모든 시간을 포함하여, 생물학적 샘플이 대상체에서 수집된 때로부터 조작된 T 세포가 수집, 수확 또는 (예를 들어, 동결 보존 또는 투여를 위해) 제형화된 때까지, (약) 5 일 이내, 또는 (약) 4 일 이내에 조작된 T 세포를 생산하거나 생성할 수 있다.
특정 구현예에서, 제공된 방법은 산출 세포 및/또는 농축된 T 세포 산출 집단을 생산 또는 생성하기 위한 프로세스와 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 산출 세포 및/또는 농축된 T 세포 산출 집단은, 생물학적 샘플, 예컨대 혈액 샘플 또는 백혈구 성분 채집술 샘플에서 수집, 수득, 단리, 선택 및/또는 농축되고/거나; 자극 조건 하에서 인큐베이션 되고/거나; 재조합 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어 CAR과 같은 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하거나 함유하도록 조작, 예를 들어 형질 도입되고/거나; 임계량, 밀도까지 배양 또는 증폭되고/거나; 제형화된 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 산출 집단은 이전에 동결 보호되었고, 예를 들어 프로세스의 하나 이상의 단계 중, 전 및/또는 후에 해동된다. 일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)은 재조합 수용체, 예를 들어 CAR을 발현하는 T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 30% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상 또는 90% 이상, 95% 이상의 세포가 재조합 수용체를 발현한다. 특정 구현예에서, 산출 조성물 중 50% 이상의 세포가 재조합 수용체를 발현한다. 특정 구현예에서, 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 30% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 CD3+ T 세포가 재조합 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, 산출 조성물 중 50% 이상의 CD3+ T 세포가 재조합 수용체를 발현한다. 특정 구현예에서, 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 30% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 적어도 99% 또는 99% 초과의 CD4+ T 세포가 재조합 수용체를 발현한다. 특정 구현예에서, 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 50% 이상의 CD4+ T 세포가 재조합 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 30% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 적어도 99% 또는 99% 초과의 CD8+ T 세포가 재조합 수용체를 발현한다. 특정 구현예에서, 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 50% 이상의 CD8+ T 세포가 재조합 수용체를 발현한다.
특정 구현예에서, 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는, 대안적인 프로세스, 예를 들어 세포를 증폭시키는 하나 이상의 단계를 포함하는 프로세스에 의해 생성된 산출 세포에 비해, 재조합 수용체에 의해 인식되고/거나 결합되는 항원을 발현하는 세포(예를 들어, 표적 세포)에 대해 개선된 세포 용해 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포가 항원을 발현하는 세포, 예를 들어 표적 세포에 노출된 경우, 산출 조성물의 세포는 항원을 발현하는 세포 중 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%, 또는 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상을 사멸시킨다. 특정 구현예에서, 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는, 유사하거나 동일한 조건 하에서 대안적인 프로세스에 의해 생성된 산출 세포보다 적어도 25%, 50%, 75%, 100%, 150% 또는 1 배, 2 배, 3 배, 4 배 또는 5 배를 초과한 양의 항원 발현 세포, 예를 들어 표적 세포를 사멸시킨다.
특정 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는, 대안적인 프로세스, 예를 들어 세포를 증폭시키는 하나 이상의 단계를 포함하는 프로세스에 의해 생성된 산출 세포에 비해, 생체 내에서 개선된 항종양 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포가 대상체, 예를 들어 종양 또는 암이 있는 대상체에 투여된 경우, 산출 집단의 세포는 (약) 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%, 또는 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상의 대상체에 있는 종양 세포, 예를 들어 항원을 발현하는 암 또는 종양 세포를 사멸시킨다. 특정 구현예에서, 산출 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는, 유사하거나 동일한 조건 하에서 대체 프로세스에 의해 생성된 산출 세포보다 적어도 25%, 50%, 75%, 100%, 150% 또는 1 배, 2 배, 3 배, 4 배 또는 5 배를 초과한 양의 종양 세포를 생체 내에서 사멸시킨다.
특정 구현예에서, 대부분의 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는 나이브 유사, 중앙 기억 및/또는 이펙터 기억 세포이다. 특정 구현예에서, 대부분의 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는 나이브 유사 세포이다. 일부 구현예에서, 대부분의 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는 CCR7 또는 CD27 발현 중 하나 이상에 대해 양성이다. 특정 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는 증폭을 수반하는 프로세스와 같은 대체 프로세스에서 생성된 산출 집단보다 더 많은 부분의 나이브 유사 또는 중앙 기억 세포를 갖는다.
특정 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는 적은 부분 및/또는 빈도의 고갈 및/또는 노화된 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 산출 집단의 세포는 적은 부분 및/또는 빈도의 고갈 및/또는 노화된 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 세포가 고갈 및/또는 노화된다. 특정 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 25% 미만의 세포가 고갈 및/또는 노화된다. 특정 구현예에서, 산출 집단 중 10% 미만의 세포가 고갈 및/또는 노화된다. 특정 구현예에서, 세포는 낮은 부분을 갖는다.
일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는 적은 부분 및/또는 빈도의 CD27 및 CCR7 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 음성인 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는 적은 부분 및/또는 빈도의 CD27- CCR7- 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 세포가 CD27- CCR7- 세포이다. 특정 구현예에서, 산출 집단 중 25% 미만의 세포가 CD27- CCR7- 세포이다. 특정 구현예에서, 산출 집단 중 10% 미만의 세포가 CD27- CCR7- 세포이다. 구현예에서, 산출 집단 중 5% 미만의 세포가 CD27- CCR7- 세포이다.
일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는, 예를 들어 표면 발현인 CD27 및 CCR7 발현 중 하나 또는 둘 다에 대해 양성인, 많은 부분 및/또는 빈도의 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는, CD27 및 CCR7 발현 중 하나 또는 둘 다에 대해 양성인, 많은 부분 및/또는 빈도의 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, 산출 집단 중 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 95% 초과의 세포가 CD27 및 CCR7 중 하나 또는 둘 다에 대해 양성이다. 다양한 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 95% 초과의 CD4 + CAR+ 세포가 CD27 및 CCR7 중 하나 또는 둘 다에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 95% 초과의 CD8+ CAR+ 세포가 CD27 및 CCR7 중 하나 또는 둘 다에 대해 양성이다.
특정 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는, CD27 및 CCR7 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는 많은 부분 및/또는 빈도의 CD27+ CCR7+ 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 95% 초과의 세포는 CD27+ CCR7+ 세포이다. 다양한 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 95% 초과의 CD4 + CAR+ 세포는 CD27+ CCR7+ 세포이다. 일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 95% 초과의 CD8+ CAR+ 세포가 CD27+ CCR7+ 세포이다.
특정 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는 CCR7에 대해 음성이고 CD45RA 발현, 예를 들어 표면 발현에 대해 양성인, 적은 부분 및/또는 빈도의 세포를 갖는다. 일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 세포는 적은 부분 및/또는 빈도의 CCR7-CD45RA+ 세포를 갖는다. 특정 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 세포가 CCR7-CD45RA+ 세포이다. 일부 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 25% 미만의 세포가 CCR7-CD45RA+ 세포이다. 특정 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 10% 미만의 세포가 CCR7-CD45RA+ 세포이다. 세포이다. 특정 구현예에서, 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물) 중 5% 미만의 세포가 CCR7-CD45RA+ 세포이다.
상기 임의의 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 연마 단계, 섹션 I-I 참조)가 산출 집단(예를 들어, 치료 세포 조성물)에서 특정 표현형 또는 기능의 세포 부분, 빈도, 농도, 및/또는 비율을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 상기 임의의 구현예에서, 선택 단계(예를 들어, 연마 단계, 섹션 I-I 참조)가 소명하는 집단을 선택하기 위하여 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포는 세포 집단의 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 또는 그 초과의 세포 집단의 배가(예를 들어, 인큐베이션 중에 발생하는 배가) 전, 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 또는 그 초과의 세포 집단의 배가 전에 수확된다. 특정 구현예에서, 세포는 집단의 임의의 배가, 예를 들어, 인큐베이션 중에 발생하는 배가 전에 수확된다. 일부 측면에서, 조작 프로세스 중 발생할 수 있는 배가의 감소는 일부 구현예에서, 나이브-라인인 조작된 T 세포의 부분을 증가시킬 것이다. 일부 구현예에서, 조작 프로세스 중 배가의 증가는 조작 프로세스 중 발생할 수 있는 T 세포 분화를 증가시킨다.
일부 측면에서, 조작된 세포 조성물(예를 들어, 치료 세포 조성물)의 생성 또는 생산을 위한 프로세스에 있어, 프로세스 중, 예를 들어 인큐베이션 중 발생하는 세포 배가 또는 증폭의 감소는 생성된 조작된 세포 조성물 중 나이브 유사 T 세포의 양 또는 부분을 증가시키는 것으로 예상된다. 특정 측면에서, 프로세스 중 발생하는 세포 배가 또는 증폭의 증가는 생성된 조작된 세포 조성물 중 분화된 T 세포의 양 또는 부분을 증가시킨다. 일부 측면에서, 생성된 조작된 세포 조성물에서 나이브 유사 세포의 부분을 증가 또는 확대시키는 본원에서 제공된 프로세스와 같은 프로세스는, 조작된 세포 조성물의 투여 후 예를 들어, 생체 내에서 유효성, 효능 및 지속성을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다.
Ⅱ. 제제 및 시약 시스템
특정 측면에서, 상기 방법은 세포의 표면 상의 분자(세포 표면 분자)에 결합할 수 있는 하나 이상의 제제(예를 들어, 선택 제제 또는 자극제)가 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)과 가역적으로 연관된 가역적 시스템을 이용한다. 일부 경우에, 상기 시약은 제제(예를 들어, 선택 제제 또는 자극제)와 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 경우에 상기 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)은 다량체화 시약이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제제(예를 들어, 선택 제제 또는 자극제)는 분자의 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 부위 B를 함유하고, 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)의 하나 이상의 결합 부위 Z에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 C를 또한 함유한다. 일부 경우에, 결합 파트너 C와 하나 이상의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용은 비공유 상호작용이다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C와 하나 이상의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용, 예컨대 비공유 상호작용은 가역적이다.
일부 구현예에서, 가역적 연합은 예를 들어 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제와 같은, 적어도 하나의 결합 부위 Z에 결합할 수 있는 결합부위이거나 이를 함유하는 물질의 존재 하에서 중재될 수 있다. 일반적으로, 상기 물질(예를 들어, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제)는 자극 시약에서 결합 부위 Z에 대한 높은 결합 친화도에 기인하고/거나 결합 파트너 C 보다 고농도로 존재함에 기인해 경쟁자로써 작용할 수 있고, 이로써 시약으로부터 결합 파트너 C가 분리되고/거나 해리된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 결합 부위 Z에 대한 상기 물질(예를 들어, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제)의 친화도는 상기 적어도 하나 이상의 결합 부위 Z에 대한 제제(예를 들어, 선택 제제 또는 자극제)의 결합 부위 C의 친화도 보다 크다. 따라서 일부 경우에, 시약의 결합 부위 Z와 제제(예를 들어, 선택 제제 또는 자극제)의 결합 파트너 C 간의 결합은 물질(예를 들어, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제)의 추가에 의해서 파괴될 수 있고, 이로써 제제(예를 들어, 선택 제제 또는 자극제)와 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약) 간의 연합을 가역적으로 만든다.
상기 가역적 시스템에서 사용될 수 있는 시약은 기재 및 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[미국 특허번호 5,168,049; 5,506,121; 6,103,493; 7,776,562; 7,981,632; 8,298,782; 8,735,540; 9,023,604; 및 국제 공개된 PCT 출원번호 WO2013/124474 및 WO2014/076277]을 참조한다. 상기 결합을 반전시킬 수 있는 물질(예를 들어 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제)뿐만 아니라 가역적 상호 작용을 형성할 수 있는 시약 및 결합 파트너의 비제한적인 예가 하기에 설명된다.
A. 시약
본원에 고려된 시약은 선택 및 자극 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선택 및 자극 시약은 동일하다. 일부 구현예에서,, 상기 선택 및 자극 시약은 상이하다. 그러나, 선택 및 자극 시약 둘 다 동일한 물질로 제제화 될 수 있다. 일부 구현예에서, 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)은 제제(예를 들어, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C에 가역적으로 결합할 수 있는 하나 또는 복수의 결합 부위 Z를 함유한다. 일부 구현예에서, 시약은 제제(예를 들어, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C에 각각이 특이적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위 Z 를 함유하며, 시약이 복수의 제제(예를 들어, 선택 제제 또는 자극제), 예를 들어 다량체화 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)에 가역적으로 결합할 수 있도록 한다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 각각 하나 이상의 결합 부위 Z를 함유하는 개별 분자(예를 들어, 모노머)의 올리고머 또는 폴리머 또는 개별 분자로 구성된 복합체(예를 들어, 테트라머)이다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 2개 이상의 결합 부위 Z, 3개 이상의 결합 부위 Z, 4개 이상의 결합 부위 Z, 예컨대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72개 이상의 결합 부위 Z를 함유할 수 있다. 상기 결합 부위들은 모두가 동일하거나 또는 복수의 결합 부위는 하나 이상의 상이한 결합 부위 (예컨대, Z1, Z2, Z3 등)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 예컨대 시약 상에 존재하는 하나 또는 복수의 결합 부위 Z를 통해 시약과 연합, 예컨대 가역적으로 결합된다. 일부 경우에서, 이는 상기 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)가 서로 밀접하게 배열되도록 하여, (적어도 2개 카피의) 세포 표면 분자를 가지는 표적 세포가 특정 분자에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 부위 B를 갖는 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 접촉하게 되는 경우, 결합 효과를 발생할 수 있도록 한다.
일부 구현예에서, 동일한, 즉 동일한 결합 부위 B를 함유하는 2개 이상의 상이한 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 상기 시약에 가역적으로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 상이한 (종류의) 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)를 사용할 수 있고, 경우에 따라 3개 또는 4개의 상이한 (종류의) 제제, 예컨대 2개 이상의 상이한 선택 제제 및/또는 자극제를 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 시약은 결합 부위 B1, B2, B3 또는 B4 등을 함유하는 제1 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제) 및 또 다른 결합 부위, 예컨대 결합 부위 B1, B2, B3 또는 B4를 함유하는 제2 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 가역적으로 결합될 수 있다. 일부 경우에서, 상기 제1 제제 및 제2 제제의 결합 부위는 동일할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 2개 이상의 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제) 각각은 동일한 분자에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 제1 제제 및 제2 제제의 결합 부위는 상이할 수 있다. 일부 측면에서, 2개 이상의 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제) 각각은 제1 분자, 제2 분자 등과 같은 상이한 분자에 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 상기 상이한 분자, 예컨대 세포 표면 분자는 동일한 표적 세포상에 존재할 수 있다. 다른 경우에, 세포 표면 분자와 같은 상이한 분자는 동일한 세포 집단에 존재하는 상이한 표적 세포에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 제3, 제4 등의 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 각각 추가로 상이한 결합 부위를 함유하는 동일한 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)에 연합될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 상이한 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 동일한 결합 파트너 C를 함유한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 상이한 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 상이한 결합 파트너를 함유한다. 일부 측면에서, 제1 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)에 존재하는 결합 부위 Z1에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C1을 가질 수 있고, 제2 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 결합 부위 Z1 또는 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)에 존재하는 결합 부위 Z2에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C2를 가질 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 시약에 포함된 복수의 결합 부위 Z는 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C1 및 C2에 각각 가역적으로 결합할 수 있는 결합 부위 Z1 및 Z2를 포함한다. 일부 구현예에서, C1 및 C2는 동일하고/거나 Z1 및 Z2는 동일하다. 다른 측면에서, 하나 이상 복수의 결합 부위 Z는 상이할 수 있다. 다른 측면에서, 하나 이상 복수의 결합 파트너 C는 상이할 수 있다. 각각의 결합 파트너 C가 하나의 결합 부위 Z를 가지고 특이적으로 결합하는 것과 같은 상호 작용을 할 수 있는 한, 결합 부위 Z를 함유하는 시약과 호환되는 상이한 결합 파트너 C의 임의의 조합을 선택하는 것은 통상의 기술자 수준 내이다.
일부 구현예에서, 상기 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)은 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 유사체 (예컨대, 뉴트라비딘) 또는 이들의 혼합물이며, 상기 시약은 결합 파트너 C와의 가역적인 결합을 위한 결합 부위 Z를 1개 이상 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 결합 파트너 C는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체, 또는 스트렙타비딘 결합 펩타이드; 또는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 기타 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 비오틴, 비오틴 유사체 또는 그의 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는, 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 뮤테인, 또는 아비딘 유사체 또는 뮤테인이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)은 스트렙타비딘 결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘의 유사체 또는 뮤테인 또는 아비딘의 유사체 또는 뮤테인이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 물질(예를 들어, 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제)은 하나 이상의 결합 부위 Z에 대한 결합 파트너 C와의 결합에 경쟁할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C 및 물질(예를 들어 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제)은 상이하고, 상기 물질(예를 들어 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제)은 결합 파트너의 친화도에 대비해 하나 이상의 결합 부위 Z에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 야생형 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 예컨대 스트렙타비딘 유사 폴리펩타이드일 수 있다. 이와 유사하게, 일부 측면에서, 아비딘은 야생형 아비딘 또는 아비딘의 뮤테인 또는 유사체, 예를 들어 뉴트라비딘, 전형적으로 보다 중성인 pi를 나타내고 천연 아비딘의 대안으로서 이용 가능한 조작된 아르기닌을 가지는 데글리코실화된 아비딘을 포함한다. 일반적으로, 데글리코실화된 중성 형태의 아비딘은 Sigma Aldrich를 통해 상업적으로 이용 가능한 "Extravidin" 또는 Thermo Scientific 또는 Invitrogen에서 이용 가능한 "NeutrAvidin"과 같은 형태를 포함한다.
일부 구현예에서 상기 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약) 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체이다. 일부 구현예에서, 야생형 스트렙타비딘 (wt-스트렙타비딘)은 문헌 Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882에 개시된 아미노산 서열 (서열번호: 1)을 가진다. 일반적으로, 스트렙타비딘은 4개의 동일한 서브유닛의 테트라머로서 자연적으로 발생하고, 즉 각 서브유닛은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체를 위한 단일 결합 부위를 함유하는 호모-테트라머이다. 스트렙타비딘 서브유닛의 예시적인 서열은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열이지만, 상기 서열은 또한 기타 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종으로부터의 상동체에 존재하는 서열을 포함할 수 있다. 특히, 스트렙타비딘의 각 서브유닛은 약 10-14M 정도의 평형 해리 상수 (KD)를 가지는 비오틴에 대한 강한 결합 친화도를 나타낼 수 있다. 일부 경우에서, 스트렙타비딘은 1가 테트라머로 존재할 수 있으며, 4개의 결합 부위 중 오직 1개만이 기능적이고 (Howarth et al. (2006) Nat. Methods, 3:267-73; Zhang et al. (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun., 463:1059-63), 2가 테트라머는 4개의 결합 부위 중 2개가 기능적이며 (Fairhead et al. (2013) J. Mol. Biol., 426:199-214), 또는 스트렙타비딘은 모노머 또는 다이머 형태로 존재할 수 있다 (Wu et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:23225-31; Lim et al. (2010) Biochemistry, 50:8682-91).
일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 임의의 형태, 예컨대 야생형 또는 조작되지 않은 스트렙타비딘, 예컨대 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종으로부터의 스트렙타비딘 또는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체에 대한 결합 부위를 함유하는 하나 이상의 기능적 서브유닛을 포함하는 그의 기능적 활성 단편, 예컨대 서열 번호: 1에 기재된 스트렙토마이세스 아비디니 (Streptomyces avidinii)로부터의 야생형 스트렙타비딘의 기능적 서브유닛 또는 그의 기능적 활성 단편을 하나 이상 함유하는 형태일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 N- 및/또는 C-말단이 짧아진 야생형 스트렙타비딘의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 미니멀 스트렙타비딘은 서열 번호: 1의 아미노산 위치 10 내지 16의 영역에서 N-말단으로 시작하고 서열 번호: 1의 아미노산 위치 133 내지 142의 영역에서 C-말단으로 종결되는 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘의 기능적 활성 단편은 서열 번호: 2에서 제시된 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘의 기능적 활성 단편은 서열 번호: 103에서 제시된 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 2에 제시된 바와 같은 스트렙타비딘은 서열 번호: 1에 제시된 넘버링으로 Ala13에 상응하는 위치에 N-말단 메티오닌을 추가로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 103에 제시된 바와 같은 스트렙타비딘의 기능적 활성 단편은 서열 번호: 1에 제시된 넘버링으로 Ala13에 상응하는 위치에 N-말단 메티오닌을 추가로 함유할 수 있다. 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 내의 잔기의 위치에 대한 기준은 서열 번호: 1에서 잔기 넘버링과 관련이 있다.
일부 측면에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입에 의하여, 야생형 또는 조작되지 않은 스트렙타비딘의 서열과 구별되지만, 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘 결합 펩타이드에 대한 결합 부위를 함유하는 하나 이상의 기능적 서브유닛을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 측면에서, 스트렙타비딘 유사 폴리펩타이드 및 스트렙타비딘 뮤테인은 본질적으로 야생형 스트렙타비딘과 면역학적으로 동등한 폴리펩타이드일 수 있으며, 특히 이들은 wt-스트렙타비딘과 동일하거나 상이한 친화도를 가지는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 비오틴 유사체와 결합할 수 있다. 일부 경우에서, 스트렙타비딘 유사 폴리펩타이드 또는 스트렙타비딘 뮤테인은 야생형 스트렙타비딘의 일부가 아닌 아미노산을 함유할 수 있거나, 또는 야생형 스트렙타비딘의 일부만을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 유사 폴리펩타이드는 숙주가 숙주-생성된 폴리펩타이드를 야생형 스트렙타비딘의 구조로 변형시키는데 필요한 효소를 가지지 않기 때문에, 야생형 스트렙타비딘과 동일하지 않은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 또한 스트렙타비딘 테트라머 및 스트렙타비딘 다이머, 특히 스트렙타비딘 호모테트라머, 스트렙타비딘 호모다이머, 스트렙타비딘 헤테로테트라머 및 스트렙타비딘 헤테로다이머로서 존재할 수 있다. 일반적으로, 각각의 서브유닛은 통상적으로 비오틴 또는 비오틴 유사체에 대한, 또는 스트렙타비딘 결합 펩타이드에 대한 결합 부위를 가진다. 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 예시로는, 예컨대 문헌[WO 86/02077, DE 19641876 Al, US 6,022,951, WO 98/40396 또는 WO 96/24606]에 언급되어 있다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 야생형 또는 변형되지 않은 스트렙타비딘의 일부가 아닌 아미노산을 함유할 수 있거나, 또는 야생형 또는 변형되지 않은 스트렙타비딘의 일부만을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 야생형 또는 변형되지 않은 스트렙타비딘의 서브유닛에 비하여, 예컨대 서열 번호: 1에 제시된 야생형 스트렙타비딘 서브유닛 또는 예컨대 서열 번호: 2 또는 서열번호: 103에 제시된 이의 기능적 활성 단편에 비하여, 하나 이상의 아미노산 치환 (대체)을 가질 수 있는 하나 이상의 서브유닛을 함유한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인의 하나 이상의 서브유닛은 야생형 또는 변형되지 않은 스트렙타비딘과 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개 아미노산이 상이하고, 및/또는 서열 번호: 1, 2 또는 103에 제시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과인 아미노산 서열이 포함된 하나 이상의 서브유닛을 함유하며, 여기서 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체와 결합하는 기능적 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 아미노산 치환(대체)는 보존적 또는 비보존적 돌연변이이다. 스트렙타비딘 뮤테인의 예시는 해당 기술 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, 문헌[미국 특허 제5,168,049호; 제5,506,121호; 제6,022,951호; 제6,156,493호; 제6,165,750호; 제6,103,493호; 또는 제6,368,813호; 또는 국제 공개된 PCT 출원 제WO2014/076277호]를 참조한다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘 결합 펩타이드에 대한 하나 이상의 결합 부위 Z를 함유하는 하나 이상의 기능적 서브유닛, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 및 경우에 따라, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 이상의 기능적 서브유닛을 함유하는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인은 모노머; 헤테로다이머 또는 호모다이머를 비롯한 다이머; 호모테트라머, 헤테로테트라머, 1가 테트라머 또는 2가 테트라머를 비롯한 테트라머를 포함할 수 있거나; 또는 고차 다량체 또는 이들의 올리고머를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 펩타이드 리간드 결합 파트너에 대한 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 결합 친화도는 1 x 10-4 M, 5 x 10-4 M, 1 x 10-5 M, 5x 10-5 M, 1 x 10-6 M, 5 x 10-6 M 또는 1 x 10-7 M 미만이지만 일반적으로 1 x 10-13 M, 1 x 10-12 M 또는 1 x 10-11 M. 을 초과한다.예를 들어, 예컨대 미국 특허 제5,506,121호에 기술된 펩타이드 서열 (Strep-태그)은 비오틴 모방체로서 작용할 수 있고, 스트렙타비딘에 대한 결합 친화도는, 예컨대 대략 10-4 M 내지 10-5 M 사이의 KD 로 나타낼 수 있다. 일부 경우에서, 상기 결합 친화도는 스트렙타비딘 분자 내 돌연변이를 만들어서 더 향상시킬 수 있으며, 예컨대 문헌[미국 특허 제6,103,493호 또는 국제 공개된 PCT 출원 제WO2014/076277호]을 참조한다. 일부 구현예에서, 결합 친화도는 해당 기술 분야에 공지된 방법, 예컨대 아래에 기술된 방법에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약), 예를 들어 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인은, 펩타이드 리간드 결합 파트너에 대한 결합 친화도를 나타내며, 상기 펩타이드 리간드 결합 파트너는 제제(예를 들어, 선택 제제 또는 자극제)에 존재하는 결합 파트너 C 일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 서열은 예컨대 서열번호: 10에 제시된 서열을 함유하는, 서열 번호: 9에 제시된 일반식을 가지는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 서열은 예컨대 서열 번호: 12에 제시된 서열과 같은 서열 번호: 11에 제시된 일반식(formula)을 가진다. 일 예에서, 펩타이드 서열은 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(Strep-tag®라고도 함, 서열 번호: 7에 제시)이다. 일 예에서, 펩타이드 서열은Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (Strep-tag®라고도 함, 서열 번호: 8에 제시)이다. 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 리간드는 적어도 2개의 스트렙타비딘 결합 모듈의 순차적 열을 포함하며, 상기 2개의 모듈 사이 거리는 적어도 0 내지 50개 이하의 아미노산이고, 상기 하나의 결합 모듈은 3 내지 8개의 아미노산을 가지며 적어도 His-Pro-Xaa (서열 번호: 9) 서열을 함유하고, 여기서 상기 Xaa는 글루타민, 아스파라긴 또는 메티오닌이며, 상기 기타 결합 모듈은 동일하거나 상이한 스트렙타비딘 펩타이드 리간드, 예컨대 서열 번호: 11에 제시된 서열을 가진다 (예컨대, 문헌[국제 공개된 PCT 출원 제WO02/077018호; 미국 특허 제7,981,632호] 참조). 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 리간드는 서열번호: 13 또는 14 중 어느 하나에 제시된 일반식을 가지는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 리간드는 서열 번호: 15 내지 19 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 가진다.
일부 구현예에서 상기 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)은 스트렙타비딘 뮤테인이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 야생형 스트렙타비딘 또는 이의 생물학적 활성 부분(예를 들어, 서열 번호: 2 또는 서열 번호: 103)과 비교하여, 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 아미노산 치환)를 함유한다. 예를 들어, 스트렙타비딘의 생물학적 활성 부분은 N- 및/또는 C-말단에서 짧아진 스트렙타비딘 변이체를 포함할 수 있으며, 이는 경우에 따라 미니멀 스트렙타비딘이라고 불린다. 일부 구현예에서, 임의의 돌연변이가 생성될 수 있는 N-말단 단축 미니멀 스트렙타비딘은, 서열 번호: 1에 제시된 서열과 비교하여 아미노산 위치 10 내지 16의 영역에서 N-말단으로 시작하고 아미노산 위치 133 내지 142의 영역에서 C-말단으로 종결된다. 일부 구현예에서, 임의의 돌연변이가 생성될 수 있는 N-말단 단축 스트렙타비딘은 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 미니멀 스트렙타비딘은 위치 Ala13 내지 Ser139의 아미노산 서열을 함유하고, 선택적으로 Ala13 대신 N-말단 메티오닌 잔기를 가진다. 본 명세서의 목적을 위하여, 아미노산 위치의 넘버링은 서열 번호: 1에 제시된 wt-스트렙타비딘의 넘버링을 기준으로 한다 (예컨대, 문헌[Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1871 -1882] 및 도 3 참조).
일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 문헌[미국 특허 제6,103,493호]에 기술된 바와 같은 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 야생형 스트렙타비딘의 아미노산 서열, 예컨대 서열 번호: 1에 제시된 서열에 기초한, 아미노산 위치 44 내지 53 의 영역 내에서 적어도 하나의 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 하나 이상의 잔기 44, 45, 46 및/또는 47에서 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 야생형 스트렙타비딘의 위치 44에서 Glu를 소수성 지방족 아미노산, 예컨대 Val, Ala, Ile 또는 Leu, 위치 45의 임의의 아미노산, 위치 46의 소수성 지방족 아미노산과 같은 지방족 아미노산으로의 치환 및/또는 위치 47에서 Val을 염기성 아미노산, 예컨대 Arg 또는 Lys, 일반적으로 Arg으로의 치환을 함유한다. 일부 구현예에서, Ala는 위치 46에 있고 및/또는 Arg은 위치 47에 있고 및/또는 Val 또는 Ile은 위치 44에 있다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 3 또는 서열 번호: 4(스트렙타비딘 뮤테인 1, SAM1로도 알려짐), 또는 서열 번호: 104에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 예시적 스트렙타비딘 뮤테인, Val44-Thr45-Ala46-Arg47 잔기를 함유한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 5 또는 서열 번호: 6, 또는 서열 번호: 105에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 예시적 스트렙타비딘 뮤테인(스트렙타비딘 뮤테인 2, SAM2로도 알려짐)으로 제시된 것과 같은, 잔기 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 예컨대 문헌[미국 특허 6,103,493]에 기술된 것 및 상표 Strep-Tactin®으로 상업적으로 이용 가능한 것이다.일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 문헌[국제 공개된 PCT 출원 제WO 2014/076277호]에 기술된 바와 같은 뮤테인이다.
일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 위치를 기준으로 아미노산 위치 44 내지 53의 영역에 2개 이상의 시스테인 잔기를 함유한다. 일부 구현예에서 상기 시스테인 잔기들은 위치 45 및 52에 존재하여 이들 아미노산을 연결하는 이황화 결합을 생성한다. 그러한 구현예에서, 아미노산 44는 전형적으로 글리신 또는 알라닌이고, 아미노산 46은 전형적으로 알라닌 또는 글리신이며, 아미노산 47은 전형적으로 아르기닌이다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 위치를 기준으로 아미노산 잔기 115 내지 121의 영역에서 적어도 하나의 돌연변이 또는 아미노산 차이를 가진다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 아미노산 위치 117, 120 및 121에서 적어도 하나의 돌연변이, 및/또는 118 및 119 아미노산의 결실 및 적어도 아미노산 위치 121에서의 치환을 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 위치 117에 상응하는 위치에서 Trp, Tyr 또는 Phe과 같은 큰 소수성 잔기 또는 Glu, Asp 또는 Arg과 같은 하전된 잔기 또는 Asn 또는 Gin과 같은 친수성 잔기, 또는 경우에 따라, Leu, Met 또는 Ala과 같은 소수성 잔기, 또는 Thr, Ser 또는 His과 같은 극성 잔기가 될 수 있는 돌연변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 위치 117에서의 돌연변이는, 위치 120에 상응하는 위치에서의 Ser 또는 Ala 또는 Gly과 같은 작은 잔기일 수 있는 돌연변이, 및 위치 121에 상응하는 위치에서의 Trp, Tyr 또는 Phe과 같은 부피가 큰 소수성 잔기 등의 소수성 잔기일 수 있는 돌연변이와 조합된다. 일부 구현예에서, 위치 117에서의 돌연변이는, 서열 번호: 1에 제시된 야생형 스트렙타비딘 또는 그의 생물학적 활성 단편의 위치 120에 상응하는 위치에서의 Leu, Ile, Met 또는 Val, 또는 일반적으로는 Tyr 또는 Phe과 같은 소수성 잔기일 수 있는 돌연변이, 및 서열 번호: 1에 제시된 야생형 스트렙타비딘 또는 그의 생물학적 활성 단편의 위치와 비교하여 위치 121에 상응하는 위치에서의 Gly, Ala 또는 Ser과 같은 작은 잔기, 또는 Gln, 또는 Leu, Val, Ile, Trp, Tyr, Phe 또는 Met과 같은 소수성 잔기일 수 있는 돌연변이와 조합된다. 일부 구현예에서, 이러한 뮤테인은 또한 Val44-Thr45-Ala46-Arg47 잔기 또는 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 잔기를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 Val44, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 및 Tyr121 잔기를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 뮤테인 스트렙타비딘은 서열 번호: 27 또는 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 27 또는 서열 번호: 28에 제시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과인 아미노산 서열을 함유하고, Val44, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 및 Tyr121 잔기를 함유하며 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘 결합 펩타이드에 결합하는 기능적 활성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 임의의 조합으로 임의의 상기 돌연변이를 함유할 수 있고, 생성된 스트렙타비딘 뮤테인은 펩타이드 리간드 (Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; Strep-tag®라고 도 함, 서열 번호: 7에 제시됨)에 대해2.7 x 10-4 M미만 및/또는 펩타이드 리간드 (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; Strep-tag®II라고도 함, 서열 번호: 8에 제시됨)에 대해 1.4 x 10-4 M 미만, 및/또는 임의의 서열 번호: 7 내지 19에 제시된 임의의 펩타이드 리간드에 대해 1 x 10-4 M, 5 x 10-4 M, 1 x 10-5 M, 5x 10-5 M, 1 x 10-6 M, 5 x 10-6 M or 1 x 10-7 M 미만, 그러나 일반적으로 1 x 10-13 M, 1 x 10-12 M or 1 x 10-11 M 초과인 결합 친화도를 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 3 내지 6, 27, 28, 104, 또는 105 중 임의의 것에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 3 내지 6, 27, 28, 104, 또는 105에 제시된 아미노산 서열과의 서열 동일성이 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상인 아미노산 서열을 나타내며, 펩타이드 리간드 (Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly; Strep-tag®라고도 함, 서열 번호: 7에 제시됨)에 대해 2.7 x 10-4 M 미만 및/또는 펩타이드 리간드 (Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys; Strep-tag®II라고도 함, 서열 번호: 8에 제시됨)에 대해 1.4 x 10-4 M 미만, 및/또는 임의의 서열 번호: 7 내지 19에 제시된 임의의 펩타이드 리간드에 대해 1 x 10-4 M, 5 x 10-4 M, 1 x 10-5 M, 5x 10-5 M, 1 x 10-6 M, 5 x 10-6 M or 1 x 10-7 M 미만, 그러나 일반적으로 1 x 10-13 M, 1 x 10-12 M or 1 x 10-11 M 초과인 결합 친화도를 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 또한 기타 스트렙타비딘 리간드, 예컨대 비오틴, 이미노비오틴, 리포산, 데스티오비오틴, 디아미노비오틴, HABA (hydroxyazobenzene-benzoic acid) 및/또는 디메틸-HABA 등에 대한 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘 뮤테인은 기타 스트렙타비딘 리간드, 예컨대 비오틴 또는 데스티오비오틴에 대한 결합 친화도를 나타내며, 이는 서열 번호: 7 내지 19에 기재된 바와 같은 비오틴 모방체 펩타이드 리간드에 대한 스트렙타비딘 뮤테인의 결합 친화도보다 크다. 따라서, 일부 구현예에서, 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 유도체 (예컨대, 데스티오비오틴)가 상기 제공된 방법에서 경쟁 제제로 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 예시로서, Strep-tactin®으로 명명된 뮤테인 스트렙타비딘(예컨대, 서열 번호: 4에 제시된 서열을 함유함)과 Strep-tag®II로 명명된 펩타이드 리간드 (예컨대, 서열 번호: 8에 제시됨)의 상호 작용은 비오틴-스트렙타비딘 상호 작용에 대한 대략 10-13 M과 비교하여 대략 10-6 M 의 KD의 결합 친화도를 특징으로 한다. 일부 경우에서, Strep-tactin®에 대해 (약) 10-10 내지 10-13 M 사이의 KD의 높은 친화도로 결합할 수 있는 비오틴은 결합 부위에 대해 Strep-tag®II 와 경쟁할 수 있다.
일부 경우에서, 상기 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)은 전이 금속 이온에 결합할 수 있는 킬레이트 그룹 K를 2개 이상 함유한다. 일부 구현예에서,시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)은 올리고히스티딘 친화도 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 칼모듈린 또는 이의 유사체, 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP), FLAG-펩타이드, HA-태그, 말토오스 결합 단백질(MBP), HSV 에피토프, myc 에피토프 및/또는 비오티닐화 수송 단백질(섹션 II-A를 참조)에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서 상기 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)은 올리고머 또는 폴리머이다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 또는 폴리머는 모노머의 개별 분자들 또는 개별 분자를 구성하는 서브유닛들의 복합체를 직접적으로 또는 간접적으로 연결함으로써, 자연적으로 존재하는 단백질의 개별 분자를 직접적으로 또는 간접적으로 연결함으로써 (예컨대, 자연적으로 존재하는 단백질의 다이머, 트라이머, 테트라머 등을 직접적으로 또는 간접적으로 연결함으로써) 생성될 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 아비딘의 테트라머 호모다이머 또는 헤테로다이머는 개별 올리고머 또는 폴리머의 분자 또는 가장 작은 구성 요소 각각으로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 또는 폴리머는 단백질의 2개 이상의 개별 분자 (예컨대, 2-mer)의 연결을 함유할 수 있거나, 또는 단백질의 개별 분자(예컨대, 모노머, 테트라머)의 적어도 3-mer, 4-mer, 5-mer, 6-mer, 7-mer, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer, 12-mer, 13-mer, 14-mer, 15-mer, 16-mer, 17-mer, 18-mer, 19-mer, 20-mer, 25-mer, 30-mer, 35-mer, 40-mer, 45-mer 또는 50-mer일 수 있다.
올리고머는 해당 기술 분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 문헌[공개된 미국 특허 출원 제US2004/0082012]에기재된 임의의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머 또는 폴리머는 다당류 또는 이작용성 링커 등에 의해 가교 결합될 수 있는 개별 분자를 2개 이상 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 또는 폴리머는 다당류의 존재 하에서 개별 분자 또는 개별 분자를 구성 하는 서브유닛의 복합체를 가교 결합함으로써 수득된다. 일부 구현예에서, 올리고머 또는 폴리머는 다당류 (예컨대, 덱스트란)에 카복실 잔기를 도입함으로써 제조될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 시약의 개별 분자 (예컨대, 모노머, 테트라머)는 통상적인 카르보디이미드 화학을 사용하여 내부 리신 잔기의 1차 아미노 그룹 및/또는 유리된 N-말단을 통해 덱스트란 백본의 카복실 그룹에 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 결합 반응은 덱스트란 1몰 당 약 60몰의 시약의 개별 분자 (예컨대, 모노머, 테트라머)의 몰비로 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 시약은 하나 이상의 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 임의의 유사체 또는 뮤테인 (예컨대, Strep-Tactin®또는 Strep-Tactin®XT) 또는 아비딘의 유사체 또는 뮤테인(예컨대, 뉴트라비딘)의 올리고머 또는 폴리머이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 부위 Z는 개별 분자 (예컨대, 4개의 결합 부위 Z를 함유하는 테트라머) 내에 4개 이하의 결합 부위가 존재할 수 있는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 천연 비오틴 결합 부위이고, 여기서 호모테트라머는 4개 이하의 동일한, 즉 Z1인 결합 부위를 함유할 수 있는 반면, 헤테로테트라머는 4개 이하의 상이한, 예컨대 Z1 및 Z2를 함유하는 결합 부위를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머는 동일한 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인의 다수의 개별 분자 (예컨대, 다수의 호모-테트라머)로부터 생성되거나 제조되며, 이 경우에서 올리고머의 각각의 결합 부위 Z (예컨대, Z1)은 동일하다. 예를 들어, 일부 경우에서, 올리고머는 다수의 결합 부위 Z1, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 결합 부위 Z1을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인의 헤테로테트라머일 수 있는 다수의 개별 분자 및/또는 결합 부위 Z (예컨대, Z1 및 Z2)가 상이한 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인의 다수의 상이한 개별 분자 (예컨대, 상이한 호모테트라머) 2개 이상으로부터 생성되거나 제조되며, 이 경우에서 다수의 상이한 결합 부위 Z (예컨대, Z1 및 Z2)는 올리고머에 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에서, 올리고머는 다수의 결합 부위 Z1 및 다수의 결합 부위 Z를 포함할 수 있으며, 이들은 조합하여, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 조합된 결합부위 Z1 및 Z2를 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 상기 개별 올리고머 또는 폴리머는 다당류에 의해 가교 결합될 수 있다. 일 구현예에서, 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 유사체 또는 아비딘의 유사체 (예컨대, 뉴트라비딘)의 올리고머 또는 폴리머는 다당류 (예컨대, 덱스트란)에 카복실 잔기를 도입함으로써 제조될 수 있으며, 이는 문헌[Noguchi, A, et al., Bioconjugate Chemistry (1992) 3,132-137]의 첫 단계에서 필수적으로 기술된 바와 같다. 그러한 일부 측면에서, 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 이들의 유사체는 이후 통상적인 카르보디이미드 화학을 사용하여 내부 리신 잔기의 1차 아미노 그룹 및/또는 유리 N-말단을 통해 덱스트란 백본의 카복실 그룹에 연결될 수 있다. 일부 경우에서, 가교 결합된 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 아비딘의 임의의 유사체의 올리고머 또는 폴리머는 또한 글루타르디알데하이드와 같은 링커로서 작용하는 이작용성 분자를 통해 가교 결합함으로써, 또는 해당 기술 분야에서 기술된 기타 방법에 의해 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 또는 폴리머는 글루타르디알데하이드와 같은 이작용성 링커 또는 기타 화학적 링커를 사용하여 개별 분자들 개별 분자를 구성하는 서브유닛들의 복합체를 가교 결합함으로써, 또는 해당 기술 분야에 공지된 기타 방법에 의해 수득될 수 있다. 일부 측면에서, 가교 결합된 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 아비딘의 임의의 뮤테인 또는 유사체의 올리고머 또는 폴리머는 글루타르디알데하이드와 같은 링커로 작용하는 이작용성 분자를 통해 개별 스트렙타비딘 또는 아비딘 분자들을 교차 결함함으로써, 또는 해당 기술 분야에 기술된 기타 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 스트렙타비딘 뮤테인에 티올 그룹을 도입함으로써 (이는, 예컨대 스트렙타비딘 뮤테인을 2-이미노티올란 (Trauts 시약)으로 반응시킴으로써 수행될 수 있음), 및 예를 들어 별개의 반응으로, 스트렙타비딘 뮤테인에서 아미노 그룹을 이용 가능하도록 활성화시킴으로써 스트렙타비딘 뮤테인의 올리고머를 생성하는 것이 가능하다. 일부 구현예에서, 아미노 그룹의 이러한 활성화는 스트렙타비딘 뮤테인와 상업적으로 이용 가능한 헤테로 이작용성 가교 결합 제제, 예컨대 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트 (술포 SMCC) 또는 석신이미딜-6-[(β말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트] (SMPH)와의 반응에 의해 달성될 수 있다. 일부 그러한 구현예에서, 이와 같이 수득된 두 반응의 산물은 함께 혼합되어, 조작된 스트렙타비딘 뮤테인의 한 배치에 함유된 티올 그룹과 조작된 스트렙타비딘 뮤테인의 또 다른 배치의 (예컨대, 말레이미드 기능에 의해) 활성화된 아미노산의 반응을 전형적으로 유도한다. 일부 경우에서, 상기 반응에 의해, 스트렙타비딘 뮤테인의 멀티머/올리고머가 형성된다. 이들 올리고머는 개별 분자의 임의의 적절한 수, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상을 가질 수 있고, 상기 올리고머화 정도는 반응 조건에 따라 바뀔 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 올리고머 또는 폴리머 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)은 크기 배제 크로마토그래피를 통해 단리될 수 있고, 임의의 원하는 분획은 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 조작된 스트렙타비딘 뮤테인을 2-이미노티올란 및 술포 SMCC와 같은 헤테로 이작용성 가교 결합 제제의 존재 하에서 반응시킨 이후, 상기 올리고머 또는 폴리머 시약은 크기 배제 크로마토그래피를 통해 단리될 수 있으며, 임의의 원하는 부분은 시약으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 올리고머는 단일 분자량을 가지지 않으나 (가질 필요도 없음), Gaussian 분포 등의 통계적 중량 분포를 관찰할 수 있다. 일부 경우에서, 3개 이상의 스트렙타비딘 또는 뮤테인 테트라머, 예컨대 호모테트라머 또는 헤테로테트라머를 가지는 임의의 올리고머는 일반적으로 3 내지 50 테트라머, 예컨대 호모테트라머 또는 헤테로테트라머, 10 내지 40 테트라머, 예컨대 호모테트라머 또는 헤테로테트라머, 또는 25 내지 35 테트라머, 예컨대 호모테트라머 또는 헤테로테트라머인 가용성 시약으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 올리고머는 3 내지 25 개의 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 예컨대 호모테트라머 또는 헤테로테트라머를 가질 수 있다. 일부 측면에서, 스트렙타비딘 뮤테인에 대해 약 50 kDa의 분자량을 가지는 가용성 올리고머는, 약 150 kDa 내지 약 2000 kDa, 약 150 kDa 내지 약 1500 kDa, 약 150 kDa 내지 약1250 kDa, 약 150 kDa 내지 1000 kDa, 약 150 kDa 내지 약 500 kDa 또는 약 150 kDa 내지 약 300 kDa, 약 300kDa 내지 약 2000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 1500 kDa, 약 300 kDa 내지 약 1250 kDa, 약 300 kDa 내지 1000kDa, 약 300 kDa 내지 약 500 kDa, 약 500 kDa 내지 약 2000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 1500 kDa, 약 500 kDa 내지 약 1250 kDa, 약 500 kDa 내지 1000 kDa, 약 1000 kDa 내지 약 2000 kDa, 약 1000 kDa 내지 약 1500 kDa, 약 1000 kDa 내지 약 1250 kDa, 약 1250 kDa 내지 약 2000 kDa 또는 약 1500 kDa 내지 약 2000 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 일반적으로, 각각의 스트렙타비딘 분자/뮤테인은 4개의 비오틴 결합 부위를 가지기 때문에, 이러한 시약은 12 내지 160개의 결합 부위 Z, 예컨대 12 내지 100개의 결합 부위 Z를 제공할 수 있다.
B. 제제
본원에 고려된 제제 선택 제제 및 자극제 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제 및 자극제는 동일하다. 일부 구현예에서, 상기 선택 제제 및 자극제는 상이하다. 그러나, 선택 및 자극 시약 둘 다 동일한 물질로 제제화 될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 세포 표면의 분자 (예컨대, 세포 표면 분자)에 결합하기 위하여 하나 이상의 결합 부위 B를 가진다. 따라서, 일부 경우에서, 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 결합 부위 B 또는 복수의 결합 부위 B를 함유하며, 여기서 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)와 표적 세포 표면의 분자 사이의 특이적 결합은 B와 상기 분자 사이의 상호 작용을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 제제는 단일 결합 부위만을 함유, 즉 1가이다. 일부 구현예에서, 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 상기 세포 표면의 분자에 결합할 수 있는 적어도 2개, 예를 들어 3, 4 또는 5개의 결합 부위 B를 포함하는 복수의 결합 부위 B를 갖는다. 일부 그러한 측면에서, 상기 적어도 2개 또는 다수의 결합 부위 B는 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개 또는 복수의 결합 부위 B 중 하나 이상은 상이할 수 있다(예컨대, B1 및 B2).
일부 구현예에서, 하나 이상의 상이한 제제(예를 들어, 하나 이상의 다른, 예컨대, 선택 제제 또는 자극제 또는 세포 상의 분자에 결합하는 기타 분자)는 시약(예를 들어, 선택 제제 또는 자극 시약)에 가역적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 적어도 2, 3, 4 또는 그 이상의 상이한 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)가 동일한 시약에 가역적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 상이한 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 상기 동일한 시약에 가역적으로 결합되며, 이에 의해 각 제제는 제제와 분자 사이의 특이적 결합을 위한 결합 부위 B 또는 복수의 결합 부위 B를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 예를 들어 동일 또는 실질적으로 동일한 분자에 결합하기 위한, 동일한 결합 부위 B를 함유한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 예를 들어 상이한 분자에 결합할 수 있는 상이한 결합 부위 B를 함유한다. 일부 구현예에서, 제1 제제 (예컨대, 제1 선택 제제 또는 제1 자극제)는 결합 부위 B1, B2, B3, B4 등을 함유하고, 제2 제제 (예컨대, 제2 선택 제제 또는 제2자극제)는 결합 부위 B1, B2, B3, B4 등 중 다른 것을 함유한다. 일부 구현예에서, 제1 제제 (예컨대, 제1 선택 제제)는 결합 부위 B1을 함유하고, 제2 제제 (예컨대, 제2 선택 제제)는 결합 부위 B3를 함유한다. 일부 구현예에서, 제1 제제 (예컨대, 제1 자극제)는 결합 부위 B2을 함유하고, 제2 제제 (예컨대, 제2 자극제)는 결합 부위 B4를 함유한다. 임의의 상기 구현예에서, 상기 제1 제제 및 제2 제제는 결합 파트너 C1 또는 C2를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, C1 및 C2는 동일한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, C1 및 C2는 상이하다. 일부 구현예에서, 상기 제1 제제 및 제2 제제는 동일한 결합 파트너 C1을 함유한다.
일부 경우에서, 상기 (예컨대, 결합 부위 B를 통하여) 제제와 시약의 결합 부위 Z 사이의 결합의 해리 상수 (KD)는 약 10-2　M 내지 약 10-13　M 또는 약 10-3　M 내지 약 10-12　M 또는 약 10-4　M 내지 약 10-11M, 또는 약 10-5M 내지 약 10-10M의 범위에 소정의 값을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 결합 제제와 분자 사이의 결합에 대한 해리 상수 (KD)3 내지 약 107 M의 KD 범위에서, 낮은 친화도이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 제제와 분자 사이의 결합에 대한 해리 상수 (KD)는, 예를 들어 약 107 내지 약 1×1010M의 KD 범위에서, 높은 친화도이다.
일부 구현예에서, 상기 결합 부위 B를 통한 상기 제제와 분자 사이의 결합의 해리는, 예컨대 상기 시약과 제제 사이의 가역적인 결합의 파괴 후 표적 세포가 오직 일시적으로 염색되거나 상기 제제와 연합되는 것을 허용하도록 충분히 빠르게 발생한다. 일부 경우에서, koff 속도 (상기 (결합 부위 B를 통한)제제와 분자 사이의 결합에 대한 해리 속도 상수라고도 함)의 용어로 표현될 때, koff 속도는 약 0.5×10-4 초-1 이상, 약 1×10-4 초-1 이상, 약 2×10-4 초-1 이상, 약 3×10-4　초-1 이상, 약 4×10-4　초-1 이상, 약 5×10-4　초-1 이상, 약 1×10-3　초-1 이상, 약 1.5×10-3　초-1　이상, 약 2×10-3　초-1　이상, 약 3×10-3　초-1　이상, 약 4×10-3　초-1, 약 5×10-3　초-1　이상, 약 1×10-2　초-1 이상, 또는 약 5×10-1　초-1　 이상이다. 특정 제제 및 세포 분자의 상호 작용에 적절한 koff 속도 범위를 경험적으로 결정하는 것은 통상의 기술자의 수준 내이다 (예컨대, 미국 공개된 특허 출원 제US2014/0295458호 참조). 예를 들어, 4.0×10-4　초-1　를 초과하는 높은 koff 속도를 가지는 제제는 상기 결합 복합체의 파괴 후, 대부분의 제제가 1시간 이내에 제거 또는 해리될 수 있도록 사용될 수 있다. 기타 경우에서, 예를 들어, 1.0×10-4　초-1,보다 작은 koff 속도를 가지는 제제는 상기 결합 복합체의 파괴 후 대부분의 제제가 세포로부터 약 3시간 반 이내에 제거 또는 해리될 수 있도록 사용될 수 있다.
　일부 구현예에서, 상기 제제 (예컨대, 예컨대, 선택 제제 또는 자극제)의 결합 부위 B와 세포 표면 분자 사이에 형성된 결합의 KD, koff 및 kon 속도뿐만 아니라 이 결합의 KD는 임의의 적절한 수단, 예컨대 형광 적정, 평형 투석 또는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정될 수 있다.
일부 측면에서, 상기 세포 표면 분자는 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)가 유도될 수 있는 분자이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 표면 분자는 펩타이드 또는 단백질, 예컨대 수용체 (예컨대, 막 수용체 단백질)이다. 일부 구현예에서, 상기 수용체는 지질, 다당류 또는 핵산이다. 일부 구현예에서, 단백질인 세포 표면 분자는 외재성 막 단백질 또는 내재성 막 단백질일 수 있다. 상기 세포 표면 분자는 일부 구현예에서, 상기 막에 걸쳐 있는 하나 이상의 도메인을 갖는다. 몇 가지 구체적인 예시로서, 막관통 도메인을 가지는 막 단백질은 후각 수용체 등의 G-단백질 결합 수용체, 로돕신 수용체, 로돕신 페로몬 수용체, 펩타이드 호르몬 수용체, 미각 수용체, GABA 수용체, 아편 수용체, 세로토닌 수용체, Ca2+ 수용체, 멜라놉신, 예컨대 리간드 개폐형, 전압 개폐형 또는 기계적 개폐형 수용체 등의 아세틸콜린, 니코틴산, 아드레날린, 노르에피네프린, 카테콜아민, L-DOPA-, 도파민 및 세로토닌 (생체 아민, 엔도르핀/엔케팔린) 뉴로펩타이드 수용체를 비롯한 신경전달물질 수용체, 세린/트레오닌 키나제 등의 수용체 키나제, 티로신 키나제, 염소 채널 등의 포린/채널, 칼륨 채널, 나트륨 채널, OMP 단백질, 아미노산 수송체 등의 ABC 수송체 (ATP-Binding Cassette-Transporter), Na-글루코오스 수송체, Na/요오드화물 수송체, 집광성복합체 (Light Harvesting Complex) 등의 이온 수송체, 사이토크롬 c 산화효소, ATPase Na/K, H/K, Ca, 메탈로프로테아제 등의 세포 부착 수용체, 인테그린 또는 카드헤린일 수 있다.
일부 구현예에서,상기 세포 표면 분자는 소망하는 세포 집단 또는 하위 집단, 예를 들어 혈액 세포, 예컨대 림프구 (예컨대, T 세포, 도움 T 세포, 예를 들어, CD4+ 도움 T 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포), 단핵세포, 또는 줄기 세포, 예컨대, CD34-양성 말초 줄기 세포 또는 Nanog 또는 Oct-4 발현 줄기 세포의 집단 또는 하위 집단을 한정하는 항원일 수 있다. T 세포의 예로는 CMV 특이적 CD8+ T 림프구, 세포 독성 T 세포, 기억 T 세포 및 조절 T 세포(Treg)와 같은 세포가 포함된다. Treg의 예시적인 예는 CD4 CD25 CD45RA Treg 세포이고, 기억 T 세포의 예시적인 예는 CD62L CD8+ 특이적 중앙 기억 T 세포이다. 상기 세포 표면 분자는 또한 종양 세포에 대한 마커일 수 있다.
전술한 바와 같이, 일부 구현예에서, 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 결합 부위 B 이외에, 결합 파트너 C를 가진다. 일부 측면에서, 이 결합 파트너 C는 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약(예컨대, 올리고머 자극 시약))의 결합 부위 Z에 결합할 수 있고, 여기서 상기 시약은 결합 파트너 C에 대한 하나 이상의 결합 부위를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C와 상기 시약(예컨대, 올리고머 자극 시약)의 결합 부위(들) Z 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합은 임의의 원하는 강도 및 친화도를 가질 수 있고, 상기 방법이 수행되는 조건하에서 파괴될 수 있거나 가역적이다. 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 2, 3개 또는 그 이상을 포함하는 하나 이상의 추가적인 결합 파트너 C를 포함하며, 상기 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약(예컨대, 올리고머 자극 시약))은 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C에 대한 적어도 2개, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 결합 부위 Z를 포함할 수 있다. 문헌[미국 특허 제7,776,562호, 미국 특허 제8,298,782호 또는 국제 출원 WO 2002/054065]에 기술된 바와 같이, 결합 파트너 C 및 하나 이상의 상응하는 결합 부위 Z를 가지는 시약의 임의의 조합은 예를 들어 복합체에서 결합 파트너 C와 결합 부위 B가 가역적으로 결합하여, 예컨대 결합 효과를 유발할 수 있다.
제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C는, 예를 들어 탄화수소 기반(중합체 포함)일 수 있고, 질소-, 인-, 황-, 카르벤-, 할로겐- 또는 슈도할로겐 기를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 상기는 알코올, 유기산, 무기산, 아민, 포스핀, 티올, 이황화물, 알칸, 아미노산, 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 당류, 올리고당류 또는 다당류일 수 있다. 추가 예로서, 상기는 또한 양이온, 음이온, 다중 양이온, 다중 음이온, 다중 양이온, 전해질, 고분자 전해질, 탄소 나노튜브 또는 탄소 나노폼(nanofoam)일 수 있다. 일반적으로, 상기 결합 파트너 C는 다른 물질 보다 시약의 결합 부위에 대해 높은 친화도를 갖는다. 각각의 결합 파트너 C의 예는 크라운 에테르, 면역글로불린, 이의 단편 및 항체 유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자를 C 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C는 비오틴을 포함하고, 시약은 비오틴에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C는 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체를 포함하고, 시약은 개별 비오틴 유사체에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C는 스트렙타비딘 또는 아비딘 결합 펩타이드를 포함하고, 시약은 개별 스트렙타비딘 또는 아비딘 결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 시약(예를 들어, 선택 시약 또는 자극 시약)은 스트렙타비딘, 예를 들어 임의의 전술된 (예를 들어 서열 번호: 3 내지 6, 104, 105에 제시된) 것을 포함하는 스트렙타비딘 뮤테인이며, 상기 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 상기 결합 파트너 C는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 예컨대 서열번호: 10에 제시된 서열을 함유하는, 서열 번호: 9에 제시된 일반식을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 서열은 예컨대 서열 번호: 12에 제시된 서열과 같은 서열 번호: 11에 제시된 일반식(formula)을 가진다. 일 예에서, 펩타이드 서열은 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(Strep-tag®라고도 함, 서열 번호: 7에 제시)이다. 일 예에서, 펩타이드 서열은Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (Strep-tag®라고도 함, 서열 번호: 8에 제시)이다. 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 리간드는 적어도 2개의 스트렙타비딘 결합 모듈의 순차적 열을 포함하며, 상기 2개의 모듈 사이 거리는 적어도 0 내지 50개 이하의 아미노산이고, 상기 하나의 결합 모듈은 3 내지 8개의 아미노산을 가지며 적어도 His-Pro-Xaa (서열 번호: 9) 서열을 함유하고, 여기서 상기 Xaa는 글루타민, 아스파라긴 또는 메티오닌이며, 상기 기타 결합 모듈은 동일하거나 상이한 스트렙타비딘 펩타이드 리간드, 예컨대 서열 번호: 11에 제시된 서열을 가진다 (예컨대, 문헌[국제 공개된 PCT 출원 제WO02/077018호; 미국 특허 제7,981,632호] 참조). 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 리간드는 서열번호: 13 또는 14 중 어느 하나에 제시된 일반식을 가지는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 펩타이드 리간드는 서열 번호: 15 내지 19 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 가진다. 대부분의 경우에, 상기 모든 스트렙타비딘 결합 펩타이드는 동일한 결합 부위, 즉 스트렙타비딘의 비오틴 결합 부위에 결합한다. 만일 하나 이상의 상기 스트렙타비딘 결합 펩타이드가 결합 파트너 C, 예를 들어 C1 및 C2로써 사용되면, 상기 다량체화 시약은 전형적으로 스트렙타비딘 뮤테인이다.
일부 구현예에서, 상기 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 추가로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 니켈로 충전된 trisNTA(His-STREPPER 또는 His/Strep-tag®Adapter라고도 함)와 컨쥬게이션된 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(Strep-tag® II라고도 함, 서열 번호: 8에 제시) 펩타이드 서열을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제(예컨대, 수용체-결합 제제 및 자극제)의 결합 파트너 C는 친화도 태그로써 통상의 기술자에게 공지된 모이어티를 포함한다. 상기 구현예에서, 시약은 상응하는 결합 파트너, 예를 들어 친화도 태그에 결합하는 것으로 공지된 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 공지된 친화성 태그의 몇 가지 구체적인 예시로서, 상기 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C는 디니트로페놀 또는 디곡시게닌, 올리고히스티딘, 폴리히스티딘, 면역 글로불린 도메인, 말토스 결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP) 또는 티오레독신, 칼모듈린 결합 펩타이드 (CBP)FLAG-펩타이드, HA-태그 (서열: Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala) (서열 번호: 20), VSV-G-태그 (서열: Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys) (서열 번호: 21), HSV-태그 (서열: Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp) (서열 번호: 22), T7 에피토프 (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly) (서열 번호: 22), 말토스 결합 단백질 (MBP), 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D의 서열 Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp의 HSV 에피토프 (서열 번호: 24), 서열 Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu의 전사 인자 c-myc의 “myc”에피토프 (서열 번호: 25), V5-태그 (서열: Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr) (서열 번호: 26) 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)를 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 항체 또는 항체 단편일 수 있는 상기 시약의 하나 이상의 결합 부위 Z와 상기 항원 사이에 형성된 복합체는 자유 항원, 즉 자유 펩타이드(에피토프 태그) 또는 자유 단백질(예컨대 MBP 또는 CBP)을 첨가함으로써 경쟁적으로 파괴될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 친화도 태그는 올리고뉴클레오타이드 태그일 수도 있다. 일부 경우에 상기 올리고뉴클레오타이드 태그는, 예를 들어, 시약에 연결되거나 포함된 상보적 서열을 가진 올리고뉴클레오타이드와 혼성화하는데 사용될 수 있다.
적절한 결합 파트너 C의 추가적인 예시로는 렉틴, 단백질 A, 단백질 G, 금속, 금속 이온, 니트릴로 트리아세트산 유도체 (NT A), RGD-모티프, 덱스트란, 폴리에틸렌이민 (PEI), 산화환원 폴리머, 당단백질, 압타머, 염료, 아밀로오스, 말토스, 셀룰로오스, 키틴, 글루타티온, 칼모듈린, 젤라틴, 폴리믹신, 헤파린, NAD, NADP, 리신, 아르기닌, 벤즈아미딘, 폴리 U 또는 올리고-dT가 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. Concavalin A 등의 렉틴은 다당류 및 글리코실화된 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있다. 염료의 구체적인 예시로는 Cibacron 블루 F3G-A (CB) 또는 Red HE-3B와 같은 트리아진 염료가 있으며, 이는 NADH-의존 효소에 특이적으로 결합한다. 전형적으로, Green A는 Co A 단백질, 인간 혈청 알부민 및 탈수소효소에 결합한다. 일부 경우에서, 상기 염료 7-아미노액노마이신 D 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌은 DNA에 결합한다. 일반적으로, Ni, Cd, Zn, Co 또는 Cu와 같은 금속의 양이온은 전형적으로 헥사히스티딘 또는 His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys 태그(MAT 태그) (서열 번호: 35)를 비롯한 올리고 히스티딘 함유 서열, 및 N-메타아크릴로일-(L)-시스테인 메틸 에스테르 등의 친화성 태그에 결합하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C와 상기 시약의 하나 이상의 결합 부위 Z 사이의 결합은 2가, 3가 또는 4가 양이온의 존재 하에서 일어난다. 이와 관련하여, 일부 구현예에서 상기 시약은 전형적으로 적절한 킬레이터에 의해 잡혀 있는, 예컨대 복합체화된 2가, 3가 또는 4가 양이온을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C는 2가, 3가 또는 4가 양이온을 포함하는, 예컨대 복합화하는 모이어티를 포함할 수 있다. 개별 금속 킬레이터의 예시로는, 에틸렌디아민, 에틸렌-디아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), 디에틸렌트리-아민펜타아세트산 (DTPA), N,N-비스(카복시메틸)글리신 (니트릴로트리아세트산, NTA라고도 함), 1,2-비스(o-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N'-테트라아세트산 (BAPTA), 2,3-다이머-캡토-1-프로판올 (다이머카프롤), 포르핀 및 헴이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 한 예시로서, EDTA는 대부분의 1가, 2가, 3가 및 4가 금속 이온, 예컨대 은 (Ag+), 칼슘 (Ca2+), 망간 (Mn2+), 구리 (Cu2+), 철 (Fe2+), 코발트 (Co　+) 및 지르코늄 (Zr4+)과 복합체를 형성하는 반면에, BAPTA는 Ca2+에 특이적이다. 구체적인 예시로서, 해당 기술 분야에서 사용되는 표준 방법은 올리고히스티딘 태그와 구리 (Cu2+), 니켈l (Ni2+), 코발트 (Co2+), 또는 아연 (Zn2+) 이온 사이의 복합체의 형성에 사용되며, 이들은 킬레이터인 니트릴로트리아세트산 (NTA)에 의해 나타난다.
일부 구현예에서, 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C는 칼모듈린 결합 펩타이드를 포함하고, 상기 시약은 예컨대 미국 특허 제5,985,658호에 기술된 바와 같은 다중결합의(multimeric) 칼모듈린을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C는 FLAG 펩타이드를 포함하고, 상기 시약은 예컨대 미국 특허 제4,851,341호에 기술된 바와 같은 단클론 항체 4E11에 결합하는 FLAG 펩타이드인, FLAG 펩타이드에 결합하는 항체를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C는 올리고히스티딘 태그를 포함하고, 상기 시약은 올리고히스티딘 태그에 결합하는 항체 또는 전이 금속 이온을 포함한다. 일부 경우에서, 이러한 모든 결합 복합체의 파괴는 예를 들어 EDTA 또는 EGTA를 첨가함으로써 금속 이온 킬레이트화, 예컨대, 칼슘 킬레이트화에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 칼모듈린, 4E11 등의 항체 또는 킬레이트화된 금속 이온 또는 유리 킬레이터는 통상적인 방법에 의해, 예컨대 비오티닐화 및 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 이들의 올리고머와의 복합체화에 의해, 또는 문헌[Noguchi, A, et al. Bioconjugate Chemistry (1992) 3, 132-137]에 기재된 바와 첫 단계에서 필수적으로 다당류, 예컨대, 덱스트란에 카르복실 잔기를 도입하고, 및 두 번째 단계에서 통상적인 카르보디이미드 화학을 사용하여 칼모듈린 또는 항체 또는 킬레이트화된 금속 이온 또는 유리 킬레이터를 1차 아미노 그룹을 통해 다당류, 예컨대, 덱스트란 백본의 카복실 그룹에 연결함으로써 다량체화 될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)에 포함된 결합 파트너 C와 상기 시약의 하나 이상의 결합 부위 Z 사이의 결합은 금속 이온 킬레이트화에 의해 파괴될 수 있다. 상기 금속 킬레이트화는, 예를 들어 EGTA 또는 EDTA의 첨가에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 상기 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 예컨대 항체, 이의 단편 또는 항체 유사 기능이 있는 단백질성 결합 분자에 의해 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제제의 결합 부위 B는 예컨대 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDRs)이거나 이를 포함하는 항체 결합 부위이다. (재조합) 항체 단편의 예시로는 Fab 단편, FV 단편, 단일 사슬 Fv 단편(scFv), 2가 항체 단편, 예컨대 (Fab)2'-단편, 다이어바디(diabodies), 트리어바디(triabodies)(Iliades, P., et al, FEB Lett (1997) 409, 437-441), 데카바디(Stone, E., et al, Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88- 8211;94) 및 기타 도메인 항체(Holt, L.J., et al, Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490)가 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 제제(예컨대., 수용체-결합 제제 또는 선택 제제)는 2가 단백질성의 인공 결합 분자, 예를 들어 "듀오칼린(duocalin)"으로도 공지된 이량체 리포칼린 뮤테인을 포함할 수 있다. 현예에서, 상기 제제(예컨대., 선택 제제 또는 자극제)는 단일 결합 부위 B를 가질 수 있으며, 즉 이는 1가일 수 있다. 1가 제제 (예컨대., 선택 제제 또는 자극제)의 예시로는 1가 항체 단편, 항체 유사 결합 특성이 있는 단백질성 결합 분자 또는 MHC 분자가 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 1가 항체 단편의 예시로는 Fab 단편, Fv 단편 및 2가 단일 사슬 Fv 단편을 포함하는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv)이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 상기 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 항체 또는 이의 항체 단편, 예를 들어 Fab 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편 (scFv), F(ab')2-단편과 같은 2가 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 제제(예컨대, 선택 제제 또는 자극제)는 세포 표면 분자에 결합하는 것으로 공지된 모체 항체이거나 이로 부터 유래한 것이다. 세포 표면 분자에 대한 다양한 항체 분자 또는 이의 단편은 해당 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 이들의 여러 가지 중 하나는 본 방법에서 제제로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제제(예컨대 선택 제제 또는 자극제)는 모체 항체 또는 기준 항체의 가변 중사슬에서 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 항체 또는 이의 단편이며, 예컨대 전술한 바와 같이 변형된 친화성을 가지면서 충분히 빠른 off 속도를 나타내는 항체를 생성한다. 예를 들어, 이러한 돌연변이의 예시는 항-CD4 항체 13B8.2의 돌연변이체의 맥락으로 알려져 있으며 (예컨대, 미국 특허 제7,482,000호, 미국 특허 출원 공보 제US2014/0295458 또는 국제 특허출원 제WO2013/124474로 참조), 이러한 돌연변이 중 하나는 또 다른 모체 항체 또는 기준 항체에서 생성될 수 있다.
일부 측면에서, 1가일 수 있는 상기 제제(예컨대 선택 제제 또는 자극제)는 예를 들어 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드("Anticalin®"으로도 공지)에 기초한 뮤테인과 같은 1가 항체 단편 또는 1가 인공 결합 분자(단백질성 또는 기타)를 포함하거나, 또는 예컨대 F(ab')2 단편과 같이 양 결합 부위가 유지되는 항체 또는 단편과 같은 2가 분자를 포함한다.
항체 유사 기능을 가지는 단백질성 결합 분자의 예로는 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드에 기초한 뮤테인이 있다(예컨대, 문헌 WO 03/029462, Beste et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 1898-1903 참조). 일반적으로, 빌린 (bilin) 결합 단백질, 인간 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린, 인간 Apo 지질단백질 D 또는 인간 눈물 리포칼린 등의 리포칼린은, 주어진 표적을 결합하도록 변형될 수 있는 천연 리간드 결합 부위를 갖는다. 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 제제 (예컨대, 선택 제제 또는 자극제)로서 사용될 수 있는 항체 유사 결합 성질이 있는 단백질성 결합 분자의 추가적인 예시로는, 소위 글루바디 (예컨대, 국제 특허 출원 WO 96/23879 참조), 안키린 스캐폴드에 기초한 단백질 (Mosavi, L.K., et al., Protein Science(2004) 13, 6, 1435-1448) 또는 크리스탈린 스캐폴드 (예컨대, 국제 특허 출원 WO 01/04144 참조) 문헌[Skerra, J. Mol. Recognit. (2000) 13, 167-187]에 기술된 단백질, 아드넥틴 (AdNectins), 테트라넥틴 및 아비머가 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 인간 수용체 도메인 패밀리의 엑손 셔플링에 의해 진화된 다가 아비머 단백질을 비롯한 아비머는, 여러 세포 표면 수용체에서 다중 도메인 줄로 발생하는 소위 A도메인을 함유한다(Silverman, J., et al., Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561). 일반적으로 인간 피브로넥틴 도메인으로부터 유래된 아드넥틴은, 전형적으로 표적에 대한 면역글로불린-유사 결합을 위하여 조작될 수 있는 3개의 루프를 함유한다 (Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006)17, 653-658). 일반적으로 개별 인간 호모트라이머 단백질로부터 유래된 테트라넥틴은, 마찬가지로 전형적으로 원하는 결합을 위하여 조작될 수 있는 C-형 렉틴 도메인에 루프 영역을 함유한다. 일부 경우에서 단백질 리간드로 작용할 수 있는 펩토이드는, 전형적으로 측사슬이 탄소 원자보다는 아미드 질소에 연결된다는 점에서 펩타이드와 상이한 올리고(N-알킬) 글리신이다. 펩토이드는 전형적으로 프로테아제 및 기타 변형 효소(modifying enzymes)에 대하여 내성이며, 펩타이드보다 훨씬 높은 세포 투과성을 가질 수 있다 (예컨대, 문헌[won, Y.-U., and Kodadek, T., J. Am.Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509]참조)
적합한 단백질성 결합 분자의 추가 예는 EGF 유사 도메인, 크링글 도메인(Kringle-domain), 피브로넥틴 유형 I 도메인, 피브로넥틴 유형 Ⅱ 도메인, 피브로넥틴 유형 Ⅲ 도메인, PAN 도메인, Gla 도메인, SRCR 도메인, Kunitz/Bovine 췌장 트립신 억제제 도메인, 텐다미스타트(tendamistat), Kazal-유형 세린 프로테아제 억제제 도메인, Trefoil(P-유형) 도메인, von Willebrand 인자 유형 C 도메인, 아나필라톡신 유사 도메인, CUB 도메인, 다이로글로블린(thyroglobulin) 유형 I 반복, LDL-수용체 클래스 A 도메인, Sushi 도메인, 결합 도메인, 트롬보스폰딘(Thrombospondin) 유형 I 도메인, 면역 글로불린 도메인 또는 면역 글로불린 유사 도메인 (예를 들어, 도메인 항체 또는 낙타 중쇄 항체), C-유형 렉틴 도메인, MAM 도메인, von Willebrand 인자 유형 A 도메인, 소마토메딘(Somatomedin) B 도메인, WAP-유형 4개의 이황화물 코어 도메인, F5/8 유형 C 도메인, 헤모펙신(Hemopexin) 도메인, SH2 도메인, SH3 도메인, 라미닌-유형 EGF 유사 도메인, C2 도메인, "카파바디(Kappabodies)"(Ill. et al., Protein Eng (1997) 10, 949-57 참조, 소위 "미니바디(minibody)"(Martin et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309), 디아바디(Holliger et al., PNAS USA (1993)90, 6444-6448. 참조), 소위 “야누시스(Janusis)”(Traunecker et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659 또는 Traunecker et al., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52. 참조), 나노바디, 마이크로바디, 아필린(affilin), 아피바디(affibody), 크노틴(knottin), 유비퀴틴, 아연-핑거 단백질, 자가 형광 단백질 또는 류신-리치 반복 단백질이다. 일부 구현예에서, 항체 유사 기능을 갖는 핵산 분자는 압타머일 수 있다. 일반적으로, 압타머는 정의된 3 차원 모티프로 접히고, 주어진 표적 구조에 대해 높은 친화도를 나타낸다.
Ⅲ. 무혈청 배지 제형 및 관련 성분
제공된 방법의 하나 이상의 단계는 기본 배지에 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)을 함유하는 무혈청 배지의 존재 하에 수행될 수 있다. 하나 이상의 단백질, 예컨대 혈청 대체 단백질 또는 세포의 유지, 성장 및/또는 증폭을 지원하는 하나 이상의 기타 성분을 함유하는 하나 이상의 보충물을 포함하는 하나 이상의 추가 보충물을 첨가할 수 있다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 세포 배양에서 합성 아미노산(예컨대 디펩타이드 형태의 L-글루타민, 예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산(예컨대, 디펩타이드 형태의 L-글루타민의, 예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5 mM 내지 (약) 5 mM (예컨대 2mM)이다. 일부 구현예에서, L-글루타민의 농도는 (약) 0.5 mM 내지 (약) 5 mM(예컨대 2mM)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 인간 단백질 또는 재조합 단백질, 예컨대 혈청 대체 단백질, 예를 들어, 알부민이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2, IL-7 또는 IL-15)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 재조합 사이토카인(예컨대 IL-2, IL-7 또는 IL-15)을 추가로 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 페놀 레드를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 제공된 무혈청 배지는 액체 기본 배지 및 하나 이상의 보충물로부터 생산 또는 제조된다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 세포 배양에서 L-글루타민으로 전환될 수 있는 합성 아미노산, 예컨대 디펩타이드 형태의 L-글루타민, 예를 들어, L-알라닐-L-글루타민인 합성 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 경우에 합성 아미노산은 유리 L-글루타민 및 단백질을 함유한 기본 배지에 제공된다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산(예컨대, 디펩타이드 형태의 L-글루타민의, 예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5 mM 내지 (약) 5 mM (예컨대 2mM)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 인간 유래 단백질, 재조합 단백질 또는 둘 다이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 페놀 레드를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지를 제조하기 위한 보충물 중에는 하나 이상의 단백질 및 유리 형태의 글루타민, 예를 들어 L-글루타민을 포함하는 보충물이 있고, 여기서 상기 보충물은 L-글루타민이 이의 성분이 된 후에 동결되거나 동결되었다. 일부 구현예에서, 보충물에서 L-글루타민의 농도는 200 mM 미만, 예컨대 150 mM 미만, 100 mM 이하, 예컨대 20 mM 내지 120 mM 또는 40 mM 내지 100 mM, 예컨대 또는 약 80 mM이다. 일부 구현예에서, 보충물이 기본 배지와 조합된 후 L-글루타민의 농도는 약 0.5 mM 내지 약 5 mM(예컨대 2 mM)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 비포유류 기원이 아니다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 인간 단백질 또는 인간 유래 단백질이거나, 재조합 단백질이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 알부민, 예를 들어 인간 또는 재조합 인간 알부민을 포함한다.
A. 기본 배지
일부 구현예에서, 기본 배지는 포도당과 같은 탄소원, 물, 하나 이상의 염 및 아미노산 및 질소원을 포함한다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 세린, 글루타민, 히스티딘, 글리신, 트레오닌, 아르기닌, 알라닌, 티로신, 시스테인, 발린, 메티오닌, 노르발린, 트립토판, 페닐알라닌, 이솔루신, 루신, 리신, 하이드록시프롤린, 사르코신(sarcosine) 및/또는 프롤린을 포함한다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 하나 이상의 합성 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 세포를 포함하는 세포 배양물에서 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)으로 전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 인간 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작된 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작된 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작되어 재조합 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체)를 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 T 세포이다.
일부 구현예에서, 합성 아미노산은 글루타민(즉, L-글루타민)의 안정화된 형태이다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 수용액(예를 들어, 기본 배지)에서 글루타민(즉, L-글루타민)보다 더 안정적이다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 기본 배지에서 상당한 양의 글루타민을 생산하지 않는다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 기본 배지에서 상당한 양의 피롤리돈 카복실산 또는 암모니아를 생산하지 않는다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 약 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 14일 이상 동안 기본 배지에서 상당한 양의 글루타민(즉, L-글루타민)을 생산하지 않는다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주 이상 동안 기본 배지에서 상당한 양의 글루타민(즉, L-글루타민)을 생산하지 않는다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 이상 동안 기본 배지에서 상당한 양의 글루타민(즉, L-글루타민)을 생산하지 않는다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 1, 2, 3, 4 또는 5년 이상 동안 기본 배지에서 상당한 양의 글루타민(즉, L-글루타민)을 생산하지 않는다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 약 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 14일 이상 동안 기본 배지에서 상당한 양의 피롤리돈 카복실산 또는 암모니아를 생산하지 않는다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주 이상 동안 기본 배지에서 상당한 양의 피롤리돈 카복실산 또는 암모니아를 생산하지 않는다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 이상 동안 기본 배지에서 상당한 양의 피롤리돈 카복실산 또는 암모니아를 생산하지 않는다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 1, 2, 3, 4 또는 5년 이상 동안 기본 배지에서 상당한 양의 피롤리돈 카복실산 또는 암모니아를 생산하지 않는다.
일부 구현예에서, 합성 아미노산은 수용액(예를 들어, 기본 배지)에서 가용성이다. 일부 구현예에서, 수용액에서 합성 아미노산의 용해도는 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)보다 더 높다.
일부 구현예에서, 합성 아미노산은 세포로 전달될 수 있으며, 여기에서 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)으로 전환될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작된 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작된 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작되어 재조합 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체)를 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 키메라 항원 수용체(CAR) 발현 T 세포이다.
일부 구현예에서, 합성 아미노산은 디펩타이드이다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 트리펩타이드(tripeptide)이다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 기본 배지에서 자발적으로 분해되지 않는 디펩타이드 형태의 L-글루타민(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민), 예컨대 Glutamax™의 디펩타이드이다
일부 구현예에서, 기본 배지에서 L-글루타민의 디펩타이드 형태(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 약 0.5 mM 내지 5 mM이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 L-글루타민의 디펩타이드 형태(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 (약) 2 mM이다. 일부 구현예에서, L-글루타민의 디펩타이드 형태(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5mM-1mM, 0.5mM-1.5mM, 0.5mM-2mM, 0.5mM-2.5mM, 0.5mM-3mM, 0.5mM-3.5mM, 0.5mM-4mM, 0.5mM-4.5mM, 0.5mM-5mM, 1mM-1.5mM, 1mM-2mM, 1mM-2.5mM, 1mM-3mM, 1mM-3.5mM, 1mM-4mM, 1mM-4.5mM, 1mM-5mM, 1.5mM-2mM, 1.5mM-2.5mM, 1.5mM-3mM, 1.5mM-3.5mM, 1.5mM-4mM, 1.5mM-4.5mM, 1.5mM-5mM, 2mM-2.5mM, 2mM-3mM, 2mM-3.5mM, 2mM-4mM, 2mM-4.5mM, 2mM-5mM, 2.5mM-3mM, 2.5mM-3.5mM, 2.5mM-4mM, 2.5mM-4.5mM, 2.5mM-5mM, 3mM-3.5mM, 3mM-4mM, 3mM-4.5mM, 3mM-5mM, 3.5mM-4mM, 3.5mM-4.5mM, 3.5mM-5mM, 4mM-4.5mM, 4mM-5mM 또는 4.5mM-5mM(각각의 수치 포함)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 L-글루타민의 디펩타이드 형태(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 (약) 5mM-7.5mM, 5mM-10mM, 5mM-12.5mM, 5mM-15mM, 5mM-17.5mM, 5mM-20mM, 7.5mM-10mM, 7.5mM-12.5mM, 7.5mM-15mM, 7.5mM-17.5mM, 7.5mM-20mM, 10mM-12.5mM, 10mM-15mM, 10mM-17.5mM, 10mM-20mM, 12.5mM-15mM, 12.5mM-17.5mM, 12.5mM-20mM, 15mM-17.5mM, 15mM-20mM 또는 17.5mM-20mM(각각의 수치 포함)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 L-글루타민의 디펩타이드 형태(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM 또는 5mM 이상이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 L-글루타민의 디펩타이드 형태(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 (약) 2mM이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 L-글루타민의 디펩타이드 형태(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 최대 (약) 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM, 5mM, 5.5mM, 6mM, 6.5mM, 7mM, 7.5mM, 8mM, 8.5mM, 9mM, 9.5mM, 10mM, 12.5mM, 15mM, 17.5mM 또는 20mM이다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 L-글루타민을 포함하지 않거나 상당한 양의 L-글루타민을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 L-글루타민을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 L-글루타민의 농도는 0.1mM, 0.2mM, 0.3mM, 0.4mM 또는 0.5mM이거나 약 0.1mM, 0.2mM, 0.3mM, 0.4mM 또는 0.5mM이거나 0.1mM, 0.2mM, 0.3mM, 0.4mM 또는 0.5mM 미만이거나 약 0.1mM, 0.2mM, 0.3mM, 0.4mM 또는 0.5mM 미만이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 L-글루타민의 농도는 (약) 1mM, 2mM, 3mM, 4mM 또는 5mM이거나 또는 (약) 1mM, 2mM, 3mM, 4mM 또는 5mM 미만이다. 일부 구현예에서, 기본 배지 중 L-글루타민의 농도는 (약) 2mM이다.
일부 구현예에서, 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)으로 전환될 수 있는 하나 이상의 합성 아미노산, 예를 들어 디펩타이드 형태의 L-글루타민, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민을 포함하는 하나 이상의 아미노산이 기본 배지에 제공된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 인공 또는 합성 배지이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 균형 잡힌 염용액(예를 들어, PBS, DPBS, HBSS, EBSS)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 DMEM(둘베코’스 변형된 이글’스 배지), MEM(미니멀 필수적 배지), BME(기본 배지 이글), F-10, F-12, RPMI 1640, GMEM(글라스고우’스 미니멀 필수적 배지), 알파 MEM(알파 미니멀 필수적 배지), 일스코브’스 변형된 둘베코’스 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 및 M199로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 복합 배지(예를 들어, RPMI-1640, IMDM)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 OpTmizer™ CTS™ T 세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher)이다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 무기염, 설탕, 아미노산의 영양분 혼합물을 포함하며, 선택적으로 비타민, 유기산, 항산화제 및/또는 완충제를 또한 함유한다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 CO 3 2- 및 HCO 3 - 를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지의 CO3 2-/HCO3 -함량은 기체 CO2와 균형을 이루어(예를 들어, 5-10%), 배지에서 최적의 pH를 유지한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 양쪽성 이온(zwitterion), 예를 들어 HEPES를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 페놀 레드를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 페놀 레드를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 무기 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 무기 염은 삼투 균형을 촉진시킨다. 일부 구현예에서, 무기염은 나트륨, 칼륨 및 칼슘 이온을 제공하여 막 전위를 조절한다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 하나 이상의 탄수화물을 포함한다. 일부 구현예에서, 탄수화물은 포도당을 포함한다. 일부 구현예에서, 탄수화물은 갈락토오스를 포함한다. 일부 구현예에서, 탄수화물은 말토오스를 포함한다. 일부 구현예에서, 탄수화물은 과당을 포함한다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 비타민(예를 들어, 비타민 A, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 E)을 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 미량 원소를 포함한다. 일부 구현예에서, 미량 원소는 구리를 포함한다. 일부 구현예에서, 미량 원소는 아연을 포함한다. 일부 구현예에서, 미량 원소는 셀레늄을 포함한다. 일부 구현예에서, 미량 원소는 트리카르복실산 중간물을 포함한다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 무기염, 설탕, 아미노산 및 선택적으로 비타민, 유기산 및/또는 완충제 또는 기타 잘 알려진 세포 배양 영양소의 혼합물을 함유한다. 영양소 외에 배지는 또한 pH와 오스몰 농도 유지를 돕는다. 일부 측면에서, 기본 배지 시약은 세포 성장, 증식 및/또는 증폭을 지원한다. 다양한 기본 배지가 이용가능하고, DMEM(Dulbeccos' Modified Eagles Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), Iscove modified Dulbeccos' 배지 및 Hams 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 이스코브의 변형 둘벡코 배지(Iscove's Modified Dulbeccos' Medium), RPMI-1640 또는 α-MEM이다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 단백질이 없다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 인간 단백질(예를 들어, 인간 혈청 단백질)이 없다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 혈청이 없다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 인간으로부터 유래된 혈청이 없다. 일부 구현예에서, 기본 배지에는 재조합 단백질이 없다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 인간 단백질과 재조합 단백질이 없다.
일부 구현예에서, 기본 배지는 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 알부민 또는 알부민 대체재이다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간 유래 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 재조합 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 천연 인간 혈청 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간이 아닌 공급원으로부터의 재조합 알부민이다. 알부민 대체재는 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드 공급원일 수 있다. 상기 단백질 또는 폴리펩타이드 샘플의 예로는 소 뇌하수체 추출물, 식물 가수분해물(예를 들어, 쌀 가수분해물), 태아 송아지 알부민(페투인), 달걀 알부민, 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 또는 다른 동물 유래 알부민, 병아리 추출물, 소 배아 추출물, AlbuMAX® I 및 AlbuMAX® II를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드는 트랜스페린을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드는 피브로넥틴(fibronectin)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 펩타이드는 아프로티닌(aprotinin)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 페투인(fetuin)를 포함한다.
일부 구현예에서, 기본 배지(예를 들어 OpTmizer™ CTS™ T-세포 증폭 기본 배지)는 액체 제형이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 의도된 사용 전에 동결되지 않았거나 동결되지 않도록(예를 들어 프로토콜에 따라) 지시된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 (약) 2oC 내지 8 oC에 저장된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 실온에서 저장된다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 2oC 내지 8oC에 저장될 때 (약) 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주 이상 동안 안정적이다. 일부 구현예에서, 기본 배지는 2oC 내지 8oC에 저장될 때 (약) 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 이상 동안 안정적이다.
B. 추가 성분 및 보충물
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 기본 배지 및 하나 이상의 보충물에 의해 제공될 수 있는 하나 이상의 추가 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물은 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)을 포함하는, 적어도 제1 보충물을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 보충물은 사용 전 동결되고/거나 기본 배지로 혼입된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 것과 같은 보충물은 배지 보충물(예를 들어, 기본 배지용 배지 보충물)로서 사용되도록 의도된다. 일부 구현예에서, 제 1 보충물 및/또는 추가 보충물은 세포의 유지를 위해 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 CD3 T 세포, CD4 T 세포 또는 CD8 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간의 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간의 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간의 T 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간의 1차 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작된 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간으로부터 파생된 유전자 조작된 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 인간으로부터 유전자 조작된 T 세포(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포)이다.
일부 구현예에서, 제 1 보충물은 의도된 사용 전에 (약) -20oC 내지 (약) 0oC에서 저장되거나 저장될 것이 권장된다. 일부 구현예에서, 보충물은 약 0oC 미만에서 저장되거나 저장될 것이 권장된다. 일부 구현예에서, 보충물은 의도된 용도로 사용될 때까지 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)이 보충물의 성분이 된 직후 또는 그후에 빠르게 동결된다. 일부 구현예에서, 보충물은 의도된 용도로 사용될 때까지 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)이 보충물의 성분이 된 후 대부분의 시간 동안 동결된다. 일부 구현예에서, 보충물은 의도된 용도로 사용될 때까지 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)이 보충물의 성분이 된 후 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 이상 동안 액체로 유지되지 않는다. 일부 구현예에서, 보충물은 의도된 용도로 사용될 때까지 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)이 보충물의 성분이 된 후 (약) 4, 8, 12, 16, 20 또는 24시간 이상 동안 액체로 유지되지 않는다. 일부 구현예에서, 보충물은 의도된 용도로 사용될 때까지 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)이 보충물의 성분이 되기 전과 후 둘 다의 대부분의 시간 동안 동결된다. 일부 구현예에서, 보충물은 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)이 보충물의 성분이 될 때 실온 또는 실온 아래(예를 들어 보충물의 온도는 (약) 20 oC, 15 oC, 10 oC, 5 oC, 또는 0oC 미만)이다. 일 측면에서, 냉동 보충물에 L-글루타민의 존재는 L-글루타민의 불안정으로 인해 발생할 수 있는 무혈청 배지 제형에서 가변 글루타민 농도 및/또는 암모니아 농도 증가를 최소화하기 위해 기본 배지에 첨가하기 전에 안정성을 보장하였다.
일부 구현예에서, 보충물에서 유리 형태의 L-글루타민은 보충물이 해동될 때 침전되지 않는다. 일부 구현예에서, 보충물에서 유리 형태의 L-글루타민은 보충물이 액체일 때 침전되지 않는다. 일부 구현예에서, 보충물에서 유리 형태의 L-글루타민은 보충물이 실온 하에서 해동될 때 침전되지 않는다. 일부 구현예에서, 보충물에서 유리 형태의 L-글루타민 농도는 (약) 400mM, 300mM, 200mM, 180mM, 160mM, 140 mM, 120mM, 100mM 또는 80 mM이거나 (약) 400mM, 300mM, 200mM, 180mM, 160mM, 140 mM, 120mM, 100mM 또는 80 mM 미만이다. 일부 구현예에서, 보충물의 L-글루타민 농도는 (약) 200 mM이다.
일부 구현예에서, 보충물에서 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)의 농도는 보충물이 기본 배지(예컨대 본 명세서에 기재된 것)와 조합된 후, 배지에서 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민) 농도는 (약) 0.5 mM 내지 5 mM이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민) 농도는 (약) 2 mM이다. 일부 구현예에서, 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5mM-1mM, 0.5mM-1.5mM, 0.5mM-2mM, 0.5mM-2.5mM, 0.5mM-3mM, 0.5mM-3.5mM, 0.5mM-4mM, 0.5mM-4.5mM, 0.5mM-5mM, 1mM-1.5mM, 1mM-2mM, 1mM-2.5mM, 1mM-3mM, 1mM-3.5mM, 1mM-4mM, 1mM-4.5mM, 1mM-5mM, 1.5mM-2mM, 1.5mM-2.5mM, 1.5mM-3mM, 1.5mM-3.5mM, 1.5mM-4mM, 1.5mM-4.5mM, 1.5mM-5mM, 2mM-2.5mM, 2mM-3mM, 2mM-3.5mM, 2mM-4mM, 2mM-4.5mM, 2mM-5mM, 2.5mM-3mM, 2.5mM-3.5mM, 2.5mM-4mM, 2.5mM-4.5mM, 2.5mM-5mM, 3mM-3.5mM, 3mM-4mM, 3mM-4.5mM, 3mM-5mM, 3.5mM-4mM, 3.5mM-4.5mM, 3.5mM-5mM, 4mM-4.5mM, 4mM-5mM 또는 4.5mM-5mM(각각의 수치 포함)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)의 농도는 (약) 5mM-7.5mM, 5mM-10mM, 5mM-12.5mM, 5mM-15mM, 5mM-17.5mM, 5mM-20mM, 7.5mM-10mM, 7.5mM-12.5mM, 7.5mM-15mM, 7.5mM-17.5mM, 7.5mM-20mM, 10mM-12.5mM, 10mM-15mM, 10mM-17.5mM, 10mM-20mM, 12.5mM-15mM, 12.5mM-17.5mM, 12.5mM-20mM, 15mM-17.5mM, 15mM-20mM 또는 17.5mM-20mM(각각의 수치 포함)이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM 또는 5mM 이상이다. 일부 구현예에서, 기본 배지에서 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민) 농도는 최대 (약) 2 mM이다.
일부 구현예에서, 제 1 보충물은 하나 이상의 추가 성분을 함유한다. 일부 구현예에서, 제 2 보충물과 같은 추가 보충물은 하나 이상의 추가 성분을 제공하기 위해 제공된다. 일부 구현예에서, 보충물, 제 1 보충물 및 선택적으로 하나 이상의 추가 보충물, 예를 들어 제 2 보충물은 기본 배지와 결합되어 기본 배지에 하나 이상의 추가 성분을 제공한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 비포유류 기원이 아니다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 인간 또는 인간 유래 단백질이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 재조합이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 알부민, 트랜스페린, 인슐린, 피브로넥틴, 아프로티닌 또는 페투인을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 하나 이상의 알부민, 인슐린 또는 트랜스페린, 선택적으로 하나 이상의 인간 또는 재조합 알부민, 인슐린 또는 트랜스페린을 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질은 알부민 또는 알부민 대체재이다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간 유래 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 재조합 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 천연 인간 혈청 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간이 아닌 공급원으로부터의 재조합 알부민이다. 알부민 대체재는 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드 공급원일 수 있다. 상기 단백질 또는 폴리펩타이드 샘플의 예로는 소 뇌하수체 추출물, 식물 가수분해물(예를 들어, 쌀 가수분해물), 태아 송아지 알부민(페투인), 달걀 알부민, 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 또는 다른 동물 유래 알부민, 병아리 추출물, 소 배아 추출물, AlbuMAX® I 및 AlbuMAX® II를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간 알부민이거나 인간 알부민으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간 혈청 또는 인간 혈장으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 알부민은 재조합 알부민이다. 일부 구현예에서, 재조합 알부민은 인간으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 재조합 알부민은 인간으로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, 보충물은 천연 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 천연 알부민은 인간으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 천연 알부민은 인간으로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, 보충물의 알부민 농도는 보충물이 기본 배지(예컨대 본 명세서에 기재된 것)와 조합된 후, 배지에서 알부민의 농도가 (약) 0mg/mL 내지 (약) 2mg/mL, (약) 0mg/mL 내지 (약) 4mg/mL, (약) 0mg/mL 내지 (약) 6mg/mL, (약) 0mg/mL 내지 (약) 8mg/mL, (약) 0mg/mL 내지 (약) 10mg/mL, (약) 0 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL, (약) 2 mg/mL 내지 (약) 4mg/mL, (약) 2 mg/mL 내지 (약) 6mg/mL, (약) 2 mg/mL 내지 (약) 8mg/mL, (약) 2 mg/mL 내지 (약) 10mg/mL, (약) 2 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL, (약) 4mg/mL 내지 (약) 6mg/mL, (약) 4 mg/mL 내지 (약) 8mg/mL, (약) 4 mg/mL 내지 (약) 10mg/mL, (약) 4 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL, (약) 6mg/mL 내지 (약) 8mg/mL, (약) 6 mg/mL 내지 (약) 10mg/mL, (약) 6 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL, (약) 8mg/mL 내지 (약) 10mg/mL, (약) 8 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL, (약) 10 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL, 또는 (약) 10mg/mL 내지 (약) 15 mg/mL(각각의 수치 포함)인 농도이다. 일부 구현예에서, 배지 중 알부민은 (약) 5 mg/mL이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체재를 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스페린 대체재는 트랜스페린과 실질적으로 유사한 결과를 제공하기 위해 보충물에서 트랜스페린을 대체할 수 있는 화합물이다. 트랜스페린 대체재의 예에는 임의의 철 킬레이트 화합물이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 철 킬레이트 화합물은 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 데페록사민 메실레이트, 디머캅토프로판올, 디에틸렌트리아민-펜타아세트산(DPT A) 및 트랜스-1,2-디아미노시클로헥산-N,N,N',N'-테트라아세트산(CDTA)의 철 킬레이트제 뿐만 아니라, 시트르산 제2철 킬레이트 및 황산 제1철 킬레이트를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 트랜스페린은 철포화 트랜스페린이다. 일부 구현예에서, 트랜스페린은 철포화 인간 트랜스페린이다.
일부 구현예에서, 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체재는 인간 트랜스페린이거나 인간 트랜스페린으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체재는 인간 혈청 또는 혈장으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체재는 재조합 트랜스페린이다. 일부 구현예에서, 트랜스페린의 농도는, 보충물이 기본 배지(예컨대 여기에 기재된 것)와 조합된 후, 배지 중 트랜스페린의 농도가 (약) 10 mg/L 내지 (약) 50 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 100 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 150 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 200 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 250 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 300 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 350 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 400 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 450 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 500 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 550 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 600 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 650 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 750 mg/L인 농도이다. 일부 구현예에서, 트랜스페린의 농도는 보충물이 기본 배지(예컨대 본 명세서에 기재된 것)와 조합된 후, 배지 중 트랜스페린의 농도가 (약) 100 mg/L인 농도이다. 일부 구현예에서, 트랜스페린의 농도는 보충물이 기본 배지(예컨대 본 명세서에 기재된 것)와 조합된 후, 배지 중 트랜스페린의 농도가 (약) 50 mg/L 내지 (약) 150 mg/L인 농도이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 인슐린 또는 인슐린 대체재를 포함한다. 일부 구현예에서, 인슐린 대체재는 인슐린과 실질적으로 유사한 결과를 제공하기 위해 인슐린 대신에 사용될 수 있는 아연 함유 화합물이다. 인슐린 대체재의 예로는 염화 아연, 질산 아연, 브롬화 아연 및 황산 아연을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다수의 인슐린이 당업자에게 공지되어 있다. 문헌[Gilman, et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, 1990, pp. 1463-1495]을 참조한다. 일부 구현예에서, 인슐린 대체재보다 인슐린이 보충물과 배지에서 사용된다. 일부 구현예에서, 인슐린은 아연 인슐린이다. 일부 구현예에서, 인슐린은 인간 아연 인슐린이다.
일부 구현예에서, 인슐린은 인간 인슐린이거나 인간 인슐린으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 인슐린은 재조합 인슐린이다. 일부 구현예에서, 인슐린은 재조합 인간 인슐린이다. 일부 구현예에서, 인슐린(또는 인슐린 대체제)의 농도는, 보충물이 기본 배지(예컨대 여기에 기재된 것)와 조합된 후, 배지 중 인슐린(또는 인슐린 대체제)의 (대략적) 농도가 약 1 mg/L 내지 (약) 2.5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 7.5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 10 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 12.5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 15 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 17.5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 20 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 22.5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 25 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 27.5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 30 mg/L인 농도이다. 일부 구현예에서, 배지 중 인슐린 또는 인슐린 대체재의 농도는 (약) 10 mg/L이다. 일부 구현예에서, 배지 중 인슐린 또는 인슐린 대체재의 농도는 (약) 7.5 mg/L 내지 (약) 12.5 mg/L이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 성장 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF)를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF)를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF)를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장인자는 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF)를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor, PDGF)를 포함한다. 일부 구현예에서, 성장인자는 형질 전환 성장 인자(transforming growth factor, TGF)를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 호르몬(예를 들어, 성장 호르몬, 인슐린, 하이드로코르티손, 트리요오드타이로닌, 에스트로겐, 안드로겐, 프로게스테론, 프롤락틴, 여포 자극 호르몬, 가스트린 방출 펩타이드)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 알파 글로불린 또는 베타 글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 펩타이드 또는 펩타이드 분획물(예를 들어, 동물, 미생물 또는 식물에서 유래한 단백질 가수분해물)을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 콜레스테롤을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 스테로이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 지방산(예를 들어, 팔미테이트, 스테아레이트, 올레이트, 리놀레이트)을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 에탄올아민을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 콜린을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 이노시톨을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 전이 금속을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속은 철을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속은 아연을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속은 구리를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속은 크롬을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속은 요오드를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속은 코발트를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속은 셀레늄을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속은 마그네슘을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속은 몰리브덴을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 비타민을 포함한다. 일부 구현예에서, 비타민은 지용성 비타민(예를 들어, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K)을 포함한다. 일부 구현예에서, 비타민은 수용성 비타민(예를 들어, B1, B2, B6, B12, C, 엽산)을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 폴리아민을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 푸트레신(putrescine)을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 스페르미딘(spermidine)을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 스페르민(spermine)을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 환원제를 포함한다. 일부 구현예에서, 환원제는 2-메르캅토에탄올을 포함한다. 일부 구현예에서, 환원제는 알파-티오글리세롤(alpha-thioglycerol)을 포함한다. 일부 구현예에서, 환원제는 환원된 글루타티온을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 보호 첨가제를 포함한다. 일부 구현예에서, 보호 첨가제는 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함한다. 일부 구현예에서, 보호 첨가제는 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 일부 구현예에서, 보호 첨가제는 플루로닉(pluronic) F-68을 포함한다. 일부 구현예에서, 보호 첨가제는 트윈(Tween) 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 접착 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 접착 인자는 피브로넥틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 접착 인자는 라미닌(laminin)을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 하나 이상의 항산화제, 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체재, 하나 이상의 지질제제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체재, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체재, 하나 이상의 미량 원소 및 하나 이상의 글루코코르티코이드 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 항산화제는 N-아세틸-L-시스테인, 2-메르캅토에탄올 또는 D,L-토코페롤 아세테이트 또는 이의 유도체 또는 이의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간 혈청 알부민이다. 일부 구현예에서, 지질 제제는 인간 Ex-Cite®또는 에탄올아민 또는 이의 유도체 및 이의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 인슐린은 인간 아연 인슐린이다. 일부 구현예에서, 트랜스페린은 철포화 인간 트랜스페린이다. 일부 구현예에서, 미량 요소는 Se4+이다. 일부 구현예에서, 글루코코르티코이드는 하이드로코르티손이다. 일부 구현예에서, 보충물은 농축된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 하나 이상의 항산화제 및 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체재, 하나 이상의 지질제제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체재, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체재, 하나 이상의 미량 원소 및 하나 이상의 글루코코르티코로이드로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 N-아세틸-L 시스테인, 인간 혈청 알부민, 인간 Ex-Cyte®, 에탄올아민, 인간 아연 인슐린, 인간 철 포화 트랜스페린, Se4+, 하이드로코르티손, D,L-토코페롤 아세테이트 및/또는 2-메르캅토에탄올 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine, NAC)을 포함한다. 일부 구현예에서, NAC의 농도는, 보충물이 기본 배지(예컨대 여기에 기재된 것)와 조합된 후, 기본 배지 중 NAC의 농도가 (약) 10 mg/L 내지 (약) 50 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 100 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 150 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 200 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 250 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 300 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 350 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 400 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 450 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 500 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 550 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 600 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 650 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 700 mg/L인 농도이다.
일부 구현예에서, 기본 배지 중 NAC의 농도는 (약) 0 mM 내지 (약) 1 mM, (약) 0 mM 내지 (약) 2 mM, (약) 0mM 내지 (약) 3 mM, (약) 0 mM 내지 (약) 4 mM, (약) 0 mM 내지 (약) 5 mM, (약) 0 mM 내지 (약) 6 mM, (약) 0mM 내지 (약) 7 mM, (약) 0 mM 내지 (약) 8 mM, (약) 0mM 내지 (약) 9 mM, (약) 0 mM 내지 (약) 10 mM, (약) 0mM 내지 (약) 12 mM, (약) 0 mM 내지 (약) 14 mM, (약) 0 mM 내지 (약) 16 mM, (약) 0 mM 내지 (약) 18 mM, (약) 0 mM 내지 (약) 20 mM이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 에탄올아민을 포함한다. 일부 구현예에서, 에탄올아민의 농도는, 보충물이 기본 배지(예컨대 여기에 기재된 것)와 조합된 후, 기본 배지 중 에탄올아민의 농도가 (약) 0 mg/L 내지 (약) 2 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 4 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 6 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 8 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 10 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 12 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 14 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 16 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 18 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 20 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 22 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 24 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 26 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 28 mg/L, (약) 0 mg/L 내지 (약) 30 mg/L인 농도이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 하나 이상의 보충물, 예컨대 기본 배지에 대한 제1 보충물 및 하나 이상의 추가 또는 부가 보충물을 첨가함으로써 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 보충물은 L-글루타민을 하나 이상의 목적하는 성분을 함유하는 기존의 보충물에 첨가 또는 혼합함으로써 제조된다. 일부 구현예에서, L-글루타민은 혈청 대체 보충물, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체제, 예를 들어 ThermoFisher, #A2598101 또는 CTS™ 면역 세포 혈청 대체제에 첨가되거나 이와 혼합된다 일부 구현예에서, L-글루타민은 문헌[Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체제를 포함하는 보충물에 첨가되거나 이와 혼합된다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지 제형은 (약) 90 % 내지 98.75 %(v/v)의 기본 배지 및 (약) 1.25 % 내지 10 %(v/v)의 제1 보충물을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 제형은 (약) 90 % 내지 97.5 %(v/v)의 기본 배지 및 (약) 1.25 % 내지 5 %(v/v)의 제1 보충물을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 제형은 (약) 95 %(v/v)의 기본 배지 및 (약) 2.5 % ± 0.2 %(v/v)의 제1 보충물, 예컨대 (약) 2.5 %(v/v)를 포함한다. 일부 구현예에서, 1 리터의 기본 배지는 (약) 25 밀리리터의 제1 보충물로 보충된다.
일부 구현예에서, 추가 보충물, 예를 들어, 제 2 보충물이 기본 배지와 조합되어 하나 이상의 추가 성분을 제공한다. 일부 구현예에서, 제 2 보충물은 하나 이상의 항산화제, 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체재, 하나 이상의 지질 제제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체재, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체재, 하나 이상의 미량 원소 및 하나 이상의 글루코코르티코로이드를 포함한 상기 기재된 어느 하나와 같은 하나 이상의 추가 성분을 포함한다. 제2 보충물의 예시적인 성분은 상기에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 제2 보충물은 알부민, N-아세틸시스테인(NAC) 및 에탄올아민을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 보충물은 알부민, N-아세틸시스테인(NAC) 및 에탄올아민을 포함하고, 여기서 알부민, NAC 및/또는 에탄올아민의 농도는 제2 보충물이 기본 배지(예컨대 본 명세서에 기재된 것)와 조합된 후, 알부민, NAC 및/또는 에탄올아민의 농도가 본 명세서에 기재된 것과 실질적으로 동일한 농도이다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간 유래 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간 혈장 또는 혈청으로부터의 인간 유래 알부민이다. 일부 구현예에서, 제2 보충물은 액체이며 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)을 포함하지 않거나 상당한 양을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제2 보충물은 OpTmizer® 보충물(Thermofisher, A1048503의 일부)를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 보충물은 액체이다. 일부 구현예에서, 제2 보충물은 동결되지 않거나 저장을 위해 동결이 권장되지 않는다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 제형은 (약) 1.25 % 내지 (약) 5 %(v/v) 의 제2 보충물, 예컨대 (약) 2.5% ± 0.2%, 예컨대 (약) 2.5% 또는 (약) 2.6%를 포함한다. 일부 구현예에서, 1 리터의 기본 배지는 약 26 밀리리터의 제2 보충물로 보충된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 제형은 (약) 90 % 내지 97.5 %(v/v)의 기본 배지 및 (약) 1.25 % 내지 5 %(v/v)의 제2 보충물을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 제형은 (약) 95 %(v/v)의 기본 배지 및 (약) 2.5 % ± 0.2 %(v/v)의 제2 보충물, 예컨대 (약) 2.5 %(v/v) 또는 (약) 2.6 %(v/v)를 포함한다. 일부 구현예에서, 1 리터의 기본 배지는 (약) 25 밀리리터 또는 (약) 26 밀리리터의 제2 보충물로 보충된다.
일부 구현예에서, 제1 보충물(예를 들어 혈청 대체 보충물, 예를 들어 CTS™ 면역 세포 혈청 대체제) 및 추가 보충물(예를 들어 OpTmizer® 세포 보충물) 둘 다가 기본 배지에 첨가된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 제형은 약 90 % 내지 97.5 %(v/v)의 기본 배지, 약 1.25 % 내지 5 %(v/v)의 제1 보충물 및 약 1.25 % 내지 5%(v/v)의 제2 보충물을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 제형은 약 95 %(v/v)의 기본 배지, 약 2.5 % ± 0.2 %(v/v) 의 제1 보충물 및 약 2.5 % ± 0.2 %(v/v)의 제2 보충물을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물은 (약) 2 내지 (약) 100배 농축된다. 일부 구현예에서, 보충물은 (약) 40X 제형이다. 일부 구현예에서, 1 리터의 기본 배지는 제1 보충물 및 일부 경우에 하나 이상의 추가 보충물를 포함하는 하나 이상의 보충물를 (약) 20 내지 30 밀리리터, 예컨대 25 ± 2 밀리리터로 보충된다.
C. 무혈청 배지
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 기본 배지 및 합성 아미노산(예를 들어, L-글루타민의 디펩타이드 형태, 예를 들어, L-알라닐-L-글루타민), 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 기본 배지 및 합성 아미노산(예를 들어, L-글루타민의 디펩타이드 형태, 예를 들어, L-알라닐-L-글루타민), 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는, 예컨대 조작된 T 세포를 생성하기 위한 입증된 프로세스 중 T 세포의 유지를 지원하기 위한 하나 이상의 단백질 또는 추가 성분을 더 포함한다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 세포를 포함하는 세포 배양물에서 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)으로 전환될 수 있는 합성 아미노산(예를 들어, 디펩타이드 형태의 L-글루타민, 예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)을 함유하는 형태이고, 여기에서 상기 배지는 무혈청이다. 일부 구현예에서, 합성 아미노산은 수용액(예를 들어, 무혈청 배지)에서 가용성이다. 일부 구현예에서, 수용액에서 합성 아미노산의 용해도는 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)보다 더 높다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지에서 L-글루타민의 디펩타이드 형태(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5 mM 내지 5 mM이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지에서 L-글루타민의 디펩타이드 형태(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 (약) 2 mM이다. 일부 구현예에서, 디펩타이드 형태의 L-글루타민 (예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5mM-1mM, 0.5mM-1.5mM, 0.5mM-2mM, 0.5mM-2.5mM, 0.5mM-3mM, 0.5mM-3.5mM, 0.5mM-4mM, 0.5mM-4.5mM 또는 0.5mM-5mM(각 수치 포함)이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지에서 L-글루타민의 디펩타이드 형태(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM 또는 5mM 이상이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 중 디펩타이드 형태의 L-글루타민, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민의 농도는 (약) 2 mM이고, 무혈청 배지 중 유리 형태의 L-글루타민의 농도는 (약) 2 mM이다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지 중 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)의 농도는 약 0.5 mM-5mM이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 중 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)의 농도는 (약) 2 mM이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 중 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5mM-1mM, 0.5mM-1.5mM, 0.5mM-2mM, 0.5mM-2.5mM, 0.5mM-3mM, 0.5mM-3.5mM, 0.5mM-4mM, 0.5mM-4.5mM 또는 0.5mM-5mM(각 수치 포함)이다. 일부 구현예에서, 배지 중 유리 형태의 글루타민(즉, L-글루타민)의 농도는 (약) 0.5mM, 1mM, 1.5mM, 2mM, 2.5mM, 3mM, 3.5mM, 4mM, 4.5mM 또는 5mM 이상이다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 비포유류 기원이 아니다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 인간 또는 인간 유래 단백질이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 재조합이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 성분은 하나 이상의 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 비포유류 기원이 아니다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 인간 또는 인간 유래 단백질이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 재조합이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질은 알부민, 트랜스페린, 인슐린, 피브로넥틴, 아프로티닌 또는 페투인을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 하나 이상의 알부민, 인슐린 또는 트랜스페린, 선택적으로 하나 이상의 인간 또는 재조합 알부민, 인슐린 또는 트랜스페린을 포함한다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간 혈청 또는 인간 혈장으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 알부민은 재조합 알부민이다. 일부 구현예에서, 재조합 알부민은 인간으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 재조합 알부민은 인간으로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, 보충물은 천연 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 천연 알부민은 인간으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 천연 알부민은 인간으로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 중 알부민의 농도는 (약) 0mg/mL 내지 (약) 2mg/mL, (약) 0mg/mL 내지 (약) 4mg/mL, (약) 0mg/mL 내지 (약) 6mg/mL, (약) 0mg/mL 내지 (약) 8mg/mL, (약) 0mg/mL 내지 (약) 10mg/mL, (약) 0 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL, (약) 2 mg/mL 내지 (약) 4mg/mL, (약) 2 mg/mL 내지 (약) 6mg/mL, (약) 2 mg/mL 내지 (약) 8mg/mL, (약) 2 mg/mL 내지 (약) 10mg/mL, (약) 2 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL, (약) 4mg/mL 내지 (약) 6mg/mL, (약) 4 mg/mL 내지 (약) 8mg/mL, (약) 4 mg/mL 내지 (약) 10mg/mL, (약) 4 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL, (약) 6mg/mL 내지 (약) 8mg/mL, (약) 6 mg/mL 내지 (약) 10mg/mL, (약) 6 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL, (약) 8mg/mL 내지 (약) 10mg/mL, (약) 8 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL, (약) 10 mg/mL 내지 (약) 12mg/mL 또는 (약) 10mg/mL 내지 (약) 15 mg/mL(각각의 수치 포함)이다. 일부 구현예에서, 배지 중 알부민은 (약) 5 mg/mL이다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체재(예컨대 본 명세서에 기재된 것)를 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체재는 인간으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체재는 인간 혈청 또는 혈장으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 중 트랜스페린의 농도는 (약) 10 mg/L 내지 (약) 50 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 100 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 150 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 200 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 250 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 300 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 350 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 400 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 450 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 500 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 550 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 600 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 650 mg/L, (약) 10 mg/L 내지 (약) 750 mg/L이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 중 트랜스페린의 농도는 (약) 100 mg/L이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 중 트랜스페린의 농도는 (약) 50 mg/L 내지 150 mg/L이다.
일부 구현예에서, 보충물은 인슐린 또는 인슐린 대체재(예컨대 본 명세서에 기재된 것)를 포함한다. 일부 구현예에서, 인슐린은 인간으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 인슐린은 재조합 인슐린이다. 일부 구현예에서, 인슐린은 재조합 인간 인슐린이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 중 인슐린(또는 인슐린 대체제)의 농도는 (약) 1 mg/L 내지 (약) 2.5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 7.5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 10 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 12.5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 15 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 17.5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 20 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 22.5 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 25 mg/L, (약) 1 mg/L 내지 (약) 27.5 mg/L (약) 또는 1 mg/L 내지 (약) 30 mg/L이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 중 인슐린 또는 인슐린 대체재의 농도는 (약) 10 mg/L이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 중 인슐린 또는 인슐린 대체재의 농도는 (약) 7.5 mg/L 내지 (약) 12.5 mg/L이다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 페놀 레드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 페놀 레드를 포함한다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 무기염, 설탕, 아미노산의 영양분 혼합물을 포함하며, 선택적으로 비타민, 유기산, 항산화제, 지질, 성장 인자, N-아세틸시스테인, 에탄올아민 및/또는 완충제를 또한 함유한다. 실례에는 무기염, 설탕, 아미노산, 비타민, 유기산, 항산화제, 지질, 성장 인자, N-아세틸시스테인, 에탄올아민 및/또는 완충제를 포함하는 상기 섹션에서와 같은 본 명세서에 기재된 것들이 포함된다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 항산화제, 하나 이상의 알부민 또는 알부민 대체재, 하나 이상의 지질제제, 하나 이상의 인슐린 또는 인슐린 대체재, 하나 이상의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체재, 하나 이상의 미량 원소, 하나 이상의 글루코코르티코로이드, 하나 이상의 무기염, 하나 이상의 에너지원, 하나 이상의 완충제, 하나 이상의 피루베이트 염, 하나 이상의 pH 지시약, 하나 이상의 아미노산 및 하나 이상의 비타민 중 하나 이상으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항산화제는 N-아세틸-L-시스테인, 2-메르캅토에탄올 및 D,L-토코페롤 아세테이트 또는 이의 유도체 또는 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 알부민은 인간 혈청 알부민이다. 일부 구현예에서, 지질 제제는 인간 Ex-Cyte® 및 에탄올아민이다. 일부 구현예에서, 인슐린은 인간 아연 인슐린이다. 일부 구현예에서, 트랜스페린은 인간 철 포화 인간 트랜스페린이다. 일부 구현예에서, 글루코코르티코이드는 하이드로코르티손이다. 일부 구현예에서, 무기염 성분은 하나 이상의 칼슘 염, 하나 이상의 칼륨 염, 하나 이상의 마그네슘 염, 하나 이상의 나트륨 염, 하나 이상의 탄산염, 하나 이상의 인산염으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 무기염을 포함한다. 일부 구현예에서, 에너지원은 D-포도당이다. 일부 구현예에서, 완충제는 HEPES이다. 일부 구현예에서, 피루베이트 염은 피루브산 나트륨이다. 일부 구현예에서, pH 지시약은 페놀 레드이다. 일부 구현예에서, 아미노산 성분은 글리신, L-알라닌, L-아스파라긴, L-시스테인, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-이소루신, L-리신, L-루신, L-글루타민, L-아르기닌 HCL, L-메티오닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린 및 이의 염 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 비타민 성분은 비오틴, D-칼슘 판토테네이트, 염화 콜린, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독살 HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl 및 비타민 B12 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 비타민을 포함한다. 일부 구현예에서, 성분은 N-아세틸-L-시스테인, 2-메르캅토에탄올, 인간 혈청 알부민, D,L-토코페롤 아세테이트, 인간 Ex-Cyte®, 에탄올아민, 인간 아연 인슐린, 철 포화 트랜스페린, Se4+, 하이드로코르티손, Ca2+, K+, Mg2+, Na+, CO32-, PO43-, D-포도당, HEPES, 피루브산 나트륨, 페놀레드, 글리신, L-알라닌 L-아스파라긴, L-시스테인, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-이소루신, L-리신, L-루신, L-글루타민, L-아르기닌 HCL, L-메티오닌, L-프롤린, L-하이드록시프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린, 비오틴, D-칼슘 판토테네이트, 염화 콜린, 엽산, i-이노시톨, 니아신아미드, 피리독살 HCl, 리보플라빈, 티아민 HCl 및 비타민 B12를 포함한다.
일부 구현예에서, 기본 배지 및 하나 이상의 보충물을 포함하는 무혈청 배지가 제공된다. 기본 배지 및 보충물의 다양한 예가 상기 섹션에서와 같이 본 명세서에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지 제형은 (약) 90 % 내지 (약) 97.5 %(v/v)의 기본 배지, (약) 2.5 % 내지 (약) 10 %(v/v)의 보충물, 예를 들어 제 1 보충물 및/또는 제 2 보충물을 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지 제형은 (약) 90 % 내지 (약) 97.5 %(v/v)의 기본 배지, (약) 1.25% % 내지 (약) 5 %(v/v)의 제 1 보충물 및 (약) 1.25% % 내지 (약) 5 %(v/v)의 제 2 보충물을 포함한다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 보충제가 보충된 기본 배지 예를 들어, OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지(ThermoFisher),를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충물은 무혈청이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는, 세포(예를 들어, T 세포)의 유지를 위해 보충물, 예컨대 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물(ThermoFisher)로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 L-글루타민과 같은 유리 형태의 아미노산을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 재조합 사이토카인, 예컨대 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15 중 하나 이상을 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 여기, 예컨대 섹션 Ⅰ에 기재된 하나 이상의 단계에 기재된 프로세스 중 임의의 하나 이상의 단계에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 예컨대 무혈청 배지는 세포의 인큐베이션 및/또는 수확, 수집 또는 제형화 중 사용된다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는, T 세포 보충물 및 유리 형태의 L-글루타민으로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물 및 L-글루타민으로 보충된 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 약 2.6%의 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물 및 약 1.0%의 L-글루타민(약 2mM의 최종 농도)으로 보충된 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 재조합 사이토카인, 예컨대 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15 중 하나 이상을 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 여기, 예컨대 섹션 Ⅰ에 기재된 하나 이상의 단계에 기재된 프로세스 중 임의의 하나 이상의 단계에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 예컨대 무혈청 배지는 세포의 인큐베이션 및/또는 수확, 수집 또는 제형화 중 사용된다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는, 세포(예를 들어, T 세포)의 유지를 위해 보충물, 예컨대 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물(ThermoFisher)로 보충된 기본 배지를 포함하고, 혈청 대체 보충제, 예를 들어 면역 세포 혈청 대체물, 예를 들어 ThermoFisher, #A2596101, CTS™ 면역 세포 혈청 대체물, 또는 문헌[Smith et al. Clin Transl Immunology. 2015 Jan; 4(1): e31]에 기재된 면역 세포 혈청 대체물을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 L-글루타민과 같은 유리 형태의 아미노산을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 디펩타이드 형태의 L-글루타민(예를 들어, L-알라닐-L-글루타민), 예컨대 Glutamax™(ThermoFisher)의 디펩타이드를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포 대해 내인성이고/거나 T 세포에 의해 발현되는 수용체에 결합하고/거나 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스 번들 패밀리의 멤버이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4-알파-헬릭스 번들 패밀리의 멤버는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9 (IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) 및 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)를 포함하되 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 여기, 예컨대 섹션 Ⅰ에 기재된 하나 이상의 단계에 기재된 프로세스 중 임의의 하나 이상의 단계에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 샘플 준비, 선택, 자극 및/또는 조작을 수반하는 임의의 하나 이상의 단계에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 무혈청 배지는 T 세포 보충물, 면역 세포 혈청 대체물, 유리 형태의 L-글루타민, 디펩타이드 형태의 L-글루타민, 재조합 IL-2, 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15로 보충된 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물, the CTS™ 면역 세포 보충물, L-글루타민, L-알라닐-L-글루타민, 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-7 및/또는 재조합 인간 IL-15으로 보충된 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 약 2.6% OpTmizer™ T-세포 증폭 보충물, 약 2.5% CTS™ 면역 세포 혈청 대체제, 약 1.0% L-글루타민(약 2mM 최종 농도), 약 1.0% L-알라닐-L-글루타민(약 2mM 최종 농도), 약 100 IU/mL 재조합 인간 IL-2, 약 600 IU/mL 재조합 인간 IL-7 및 약 100 IU/mL 재조합 인간 IL-15로 보충된 OpTmizer™ T-세포 증폭 기본 배지를 포함한다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 여기, 예컨대 섹션 Ⅰ에 기재된 하나 이상의 단계에 기재된 프로세스 중 임의의 하나 이상의 단계에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 무혈청 배지는 샘플 준비, 선택, 자극 및/또는 조작을 수반하는 임의의 하나 이상의 단계에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 농축된 배지 제형이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 농축된 배지 제형이 아니다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 (약) 2배 내지 (약) 100배 농축된다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 (약) 10배 제형이다. 일부 구현예에서, 무혈청 배지는 (약) 2oC 내지 8oC에서 저장될 수 있다.
Ⅳ. 재조합 단백질
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법에 의해 처리, 가공, 조작 및/또는 생성된 세포는 재조합 단백질, 예컨대 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)를 함유하거나 발현하거나 함유 또는 발현하도록 조작된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 재조합 단백질을 발현하거나 함유하도록 조작된 세포를 함유하고/거나 이로 농축된 세포, 집단 또는 조성물을 생산하고/거나 생산할 수 있다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 재조합 단백질(들)을 발현하는 조작, 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염된 세포, 예컨대 면역 세포, 예컨대 T 세포가 제공된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 재조합 단백질 중 하나 이상은 재조합 수용체, 예를 들어 항원 수용체 및 하나 이상의 이의 성분을 함유하는 수용체이다.
A. 재조합 수용체
일부 구현예에서, 하나 이상의 재조합 수용체를 발현하는 T 세포와 같은 면역 세포와 같은 조작된 세포가 제공된다. 수용체 중에는 항원 수용체 및 하나 이상의 이의 성분을 함유하는 수용체가 있다. 재조합 수용체는 키메라 수용체, 예컨대 리간드 결합 도메인 또는 이의 결합 단편 및 세포 내 신호 전달 도메인 또는 영역을 함유하는 것, 기능성 비-TCR 항원 수용체, 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR), 예컨대 재조합 또는 전이유전자 TCR, 키메라 자가 항체 수용체(chimeric autoantibody receptor, CAAR) 및 상기 중 어느 하나의 성분을 포함할 수 있다. CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에, 일부 측면에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 연결된 세포외 항원(또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포는 상이한 성분, 도메인 또는 영역을 함유하는 2개 이상의 수용체를 발현한다. 일부 측면에서, 2 이상의 수용체는 재조합 수용체의 특이성, 활성, 항원(또는 리간드) 결합, 기능 및/또는 발현의 공간적 또는 시간적 조절 또는 제어를 허용한다.
1. 키메라 항원 수용체(CAR)
제공된 방법의 일부 구현예에서, 키메라 수용체,예를 들어 키메라 항원 수용체는 세포내 신호 전달 도메인과 함께 소망하는 항원(예를 들어, 종양 항원)에 특이성을 제공하는 리간드-결합 도메인 (예를 들어, 항체 또는 항체 단편)과 결합하는 하나 이상의 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 1 차 활성화 신호를 제공하는, T 세포 활성화 도메인과 같은, 활성화 세포 내 도메인 부분이다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 이펙터 기능을 용이하게 하기 위해 공동자극 신호 전달 도메인을 함유하거나 추가로 함유한다. 일부 구현예에서,면역 세포로 유전적으로 조작될 때 키메라 수용체는 T 세포 활성을 조절할 수 있고, 어떤 경우에는 T 세포 분화 또는 항상성을 조절할 수 있으며, 이에 의해, 예를 들어 입양 세포 요법 방법에 사용하기 위한, 생체 내에서 개선된 수명(longevity), 생존 및/또는 지속성을 갖는 유전적으로 조작된 세포를 생성할 수 있다.
CAR을 포함하는 예시적 항원 수용체 및 상기 수용체를 조작하고 세포 내로 도입하는 방법은 예를 들어 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 번호 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353 및 8,479,118 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416]에 기재된 것들 및/또는 문헌[Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 기재된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 수용체는 문헌[미국 특허 번호 7,446,190]에 기재된 바와 같은 CAR 및 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO/2014055668 A1]에 기재된 것을 포함한다. CAR의 예로는 전술한 간행물 중 어느 하나, 예컨대 문헌[WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, U.S. Patent No.: 7,446,190, US Patent No.: 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)]에 개시된 바와 같은 CAR이 포함된다. 또한 문헌[WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 번호 7,446,190 및 미국 특허 번호 8,389,282]을 참조한다.
상기 키메라 수용체, 예를 들어 CAR은 일반적으로 세포외 항원 결합 도메인, 예컨대 항원 분자의 일부분, 일반적으로 항체의 가변 중쇄(VH) 영역 및/또는 가변 경쇄(VL) 영역, 예를 들어 scFv 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 병태의 세포 상에서, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/거나 조작된 세포 상에서 발현된다.
일부 구현예에서, 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 integrin), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 탈수 효소 9(CA9, CAIX 또는 G250으로도 공지), 암 고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 공지), 암배아 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 4(chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 타입 III 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백질 2(EPG-2), 상피 당단백질 40(EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5; Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 공지), 태아 아세틸콜린 수용체(태아 AchR), 엽산 결합 단백질(FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백질 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 커플링된 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, kdr), 카파 경쇄, L1 세포 부착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 8족 A 멤버를 함유하는 류신 풍부 반복(Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A, LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종 관련 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 시토메갈로 바이러스(CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 자연 살생 2 그룹 D 멤버(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 종양태아성 항원, 흑색종 우선 발현 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈(survivin), 영양막 당단백질(TPBG, 5T4로도 공지), 종양 관련 당단백질 72(TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1, TYRP1 또는 gp75로도 공지), 티로시나아제 관련 단백질 2(TRP2, 도파크롬 타우토메라제, 도파크롬 델타 이성화 효소 또는 DCT로도 공지), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2), 빌름스 종양 1(WT-1), 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원, 또는 보편적 꼬리표(universal tag) 관련 항원, 및/또는 비오틴화 분자 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현된 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스성 항원(예컨대 HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스 항원), 세균성 항원 및/또는 기생 항원이다.
일부 구현예에서, 항체는 중쇄 가변(VH) 영역 및 경쇄 가변(VL) 영역과 같은 두 개의 항체 도메인 또는 영역을 연결하는 하나 이상의 링커를 포함하는 scFv와 같은 항원 결합 단편이다. 링커는 전형적으로 펩타이드 링커, 예를 들어 가요성 및/또는 수용성 펩타이드 링커이다. 링커 중에는 글리신과 세린이 풍부하고/거나 일부 경우에는 트레오닌이 풍부한 것이 있다. 일부 구현예에서, 링커는 또한 용해도를 향상시킬 수 있는 리신 및/또는 글루타메이트와 같은 하전된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 또한 하나 이상의 프롤린을 포함한다. 일부 측면에서, 글리신 및 세린(및/또는 트레오닌)이 풍부한 링커는 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상기 아미노산(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들은 적어도 (약) 50%, 55%, 60%, 70% 또는 75%의 글리신, 세린 및/또는 트레오닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 실질적으로 전부 글리신, 세린 및/또는 트레오닌으로 구성된다. 링커는 일반적으로 약 5 내지 약 50개 아미노산 길이, 전형적으로 (약)10 내지 30, 예를 들어 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 아미노산 길이이고, 일부 예에서 10 내지 25개 아미노산 길이이다. 예시적인 링커는 서열 GGGGS(4GS; 서열 번호: 122) 또는 GGGS(3GS; 서열 번호: 123)의 다양한 반복 횟수, 예컨대 상기 서열의 2, 3, 4 및 5회 사이의 반복을 갖는 링커를 포함한다. 예시적인 링커는 서열 번호: 79(GGGGSGGGGSGGGGS), 서열 번호: 62(GSTSGSGKPGSGEGSTKG) 또는 서열 번호: 124(SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA)에 제시된 서열을 갖거나 이로 이루어진 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커 중 어느 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 CD19이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD19에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD19에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 FMC63 및 SJ25C1과 같은 마우스 유래 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 예를 들어, 문헌[미국 특허 공개 번호 US 2016/0152723]에 기재된 바와 같은 인간 항체이다.
본 명세서에서 용어 “항체(antibody)”는 가장 넓은 의미로 사용되며, 온전한 항체 및 기능성(항원-결합) 항체 단편을 포함하는 다클론 및 단클론 항체를 포함하며, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단편 항원 결합(Fab) 단편, F(ab’)2 단편, Fab’ 단편, Fv 단편, 재조합 IgG(rIgG) 단편, 가변 중쇄(VH) 영역, 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 포함한 단일 사슬 항체 단편 및 단일 도메인 항체(예를 들어,sdAb, sdFv, 나노바디(nanobody)) 단편을 포함한다. 상기 용어는 유전자 조작된 및/또는 달리 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디(intrabodies), 펩티바디(peptibodies), 키메라 항체, 완전한 인간 항체, 인간화된 항체 및 이종 접합 항체, 다중 특이적(예를 들어, 이중 특이적 또는 삼중 특이적) 항체, 디아바디(diabodies), 트리아바디(triabodies) 및 테트라바디(tetrabodies), 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv를 포괄한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 “항체”는 본 명세서에서 “항원 결합 단편(antigen-binding fragment)”으로도 지칭되는 이의 기능성 항체 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 하위 클래스, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 클래스 또는 하위 클래스의 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포괄한다.
용어 “초가변 영역(hypervariable region)” 또는 “HVR”과 동의어인 “상보성 결정 영역(complementarity determining region)” 및 “CDR”은 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 비인접 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)이 있고 각각의 경쇄 가변 영역에는 3개의 CDR(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 있다. “프레임워크 영역(framework region)” 및 “FR”은 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 비-CDR 부분을 지칭하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 전장 중쇄 가변 영역에는 4개의 FR(FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4)이 있고, 각각의 전장 경쇄 가변 영역에는 4개의 FR(FR-L1, FR-L2, FR-L3 및 FR-L4)이 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat” 넘버링 체계); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (“Chothia” 넘버링 체계); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745.” (“Contact” 넘버링 체계); Lefranc MP et al., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 (“IMGT” 넘버링 체계); Honegger A and Pl
Figure pct00004
ckthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (“Aho” 넘버링 체계); 및 Martin et al., “Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm,” PNAS, 1989, 86(23):9268-9272, (“AbM” 넘버링 체계)]에 기재된 것을 포함한 다수의 잘 알려진 체계 중 어느 하나를 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별에 사용된 체계에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, Kabat 체계는 구조적 정렬을 기반으로 하는 반면 Chothia 체계는 구조 정보를 기반으로 한다. Kabat 및 Chothia 체계 모두에 대한 넘버링은 삽입 문자, 예를 들어 “30a”에 의해 수용되는 삽입(insertion) 및 일부 항체에서 나타나는 결실(deletion)이 있는 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이에 기반한다. 이 두 체계는 상이한 위치에 특정 삽입 및 결실(“삽입-결실(indel)”)을 배치하여 차이가 있는 넘버링이 된다. Contact 체계는 복잡한 결정 구조의 분석에 기반하며 여러 측면에서 Chothia 넘버링 체계와 유사하다. AbM 체계는 Oxford Molecular’s AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된 것에 기반한 Kabat와 Chothia 정의 사이의 절충안이다.
하기 표 1은 Kabat, Chothia, AbM 및 Contact 체계에 의해 각각 확인된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 예시적인 위치 경계를 열거한다. CDR-H1의 경우, Kabat 및 Chothia 넘버링 체계 둘 다를 사용하여 잔기 넘버링이 나열된다. FR들은 예를 들어 CDR-L1 앞에 위치한 FR-L1, CDR-L1과 CDR-L2 사이에 위치한 FR-L2, CDR-L2와 CDR-L3 사이에 위치한 FR-L3과 같은 식으로 CDR들 사이에 위치한다. 도시된 Kabat 넘버링 체계는 H35A 및 H35B에 삽입을 배치하기 때문에, 도시된 Kabat 넘버링 관례를 사용하여 넘버링될 때 Chothia CDR-H1 루프의 끝은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 변한다.
[다양한 넘버링 체계에 따른 CDR의 경계]
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1 - Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948
따라서, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대 이의 가변 영역의 “CDR” 또는 “상보적 결정 영역(complementary determining region)” 또는 개별 지정 CDR(예를 들어,CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)은 전술한 체계 중 어느 하나 또는 다른 공지된 체계에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특정) 상보성 결정 영역을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 특정 CDR(예를 들어,CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 영역 아미노산 서열에 있는 해당 CDR의 아미노산 서열을 함유한다고 언급될 경우, 상기 CDR은 전술한 체계 중 어느 하나 또는 다른 공지된 체계에 의해 정의된 바와 같은 가변 영역 내의 해당 CDR(예를 들어,CDR-H3)의 서열을 갖는다고 이해된다. 일부 구현예에서, 특정 CDR 서열이 명시된다. 제공된 항체의 예시적인 CDR 서열은 다양한 넘버링 체계를 사용하여 기재되지만, 제공된 항체는 전술한 다른 넘버링 체계 중 어느 하나 또는 당업자에게 공지된 다른 넘버링 체계에 따라 기재된 바와 같은 CDR을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
마찬가지로, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역, 예컨대 이의 가변 영역의 FR 또는 개별 지정 FR(들)(예를 들어, FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4)은 공지된 체계 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특정) 프레임워크 영역을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 경우에, CDR과 같은 특정 CDR, FR 또는 FR들 또는 CDR들의 식별을 위한 체계는 Kabat, Chothia, AbM 또는 Contact 방법 또는 다른 공지된 체계에 의해 정의된 바와 같이 명시된다. 다른 경우에, CDR 또는 FR의 특정 아미노산 서열이 제공된다.
용어 “가변 영역(variable region)” 또는 “가변 도메인(variable domain)”은 항체가 항원에 결합하는 데 관여하는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL) 가변 영역은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(framework region, FR) 및 3개의 CDR을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보적 VL 또는 VH 도메인 라이브러리를 각각 선별하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어 문헌[Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
제공된 CAR에 포함된 항체 중에는 항체 단편이 있다. “항체 단편(antibody fragment)” 또는 “항원 결합 단편(antigen-binding fragment)”은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2; 디아바디; 선형 항체; 중쇄 가변(VH) 영역, scFv와 같은 단일 사슬 항체 분자 및 VH 영역만을 포함하는 단일 도메인 항체; 및 항체 단편들로 형성된 다중 특이적 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 제공된 CAR에 있는 항원 결합 도메인은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 항체 단편이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 scFv와 같은 중쇄 가변(VH) 영역 및/또는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 단일 사슬 항체 단편이다.
일부 구현예에서, scFv는FMC63으로부터 유래된다. FMC63은 일반적으로 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 발생된 마우스 단클론성 IgG1 항체를 지칭한다(Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). 일부 구현예에서, FMC63 항체는 각각 서열 번호 51 및 52에 제시된 CDRH1 및 H2, 및 서열 번호 53 또는 54에 제시된 CDRH3 및 서열 번호 55에 제시된 CDRL1 및 서열 번호 55 또는 57에 제시된 CDR L2 및 서열 번호 58 또는 59에 제시된 CDR L3을 포함한다. 일부 구현예에서, FMC63 항체는 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 55의 CDRL1 서열, 서열 번호: 56의 CDRL2 서열, 서열 번호: 58의 CDRL3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호: 51의 CDRH1 서열, 서열 번호: 52의 CDRH2 서열, 및 서열 번호: 53의 CDRH3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 scFv는 서열 번호: 60에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호: 61에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 서열 번호: 62에 제시된다. 일부 구현예에서, 상기 scFv는 VH, 링커 및 VL 순서로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 scFv는 VL, 링커 및 VH 순서로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 scFv는 서열 번호: 63에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호: 63에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 상기 scFv는 서열 번호: 64에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 64에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 scFv는 SJ25C1로부터 유래한다. SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 발생된 마우스 단클론성 IgG1 항체이다(Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). 일부 구현예에서, 상기 SJ25C1 항체는 서열 번호: 65-67에 각각 제시된 CDRH1, H2 및 H3 및 서열 번호: 68-70에 각각 제시된 CDRL1, L2 및 L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 73의 CDRL1 서열, 서열 번호: 74의 CDRL2 서열, 및 서열 번호: 75의 CDRL3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호: 76의 CDRH1 서열, 서열 번호: 77의 CDRH2 서열, 및 서열 번호: 78의 CDRH3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 71에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열 번호: 72에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호: 79에 제시된다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL 순서로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 scFv는 VL, 링커 및 VH 순서로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호: 80에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 80에 대해 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv 또는 VH 도메인)은 BCMA와 같은 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 BCMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로부터 유래하거나 이의 변이체이다.
일부 구현예에서, CAR은 BCMA, 예를 들어 인간 BCMA에 특이적인 항-BCMA CAR이다. 마우스 항-인간 BCMA 항체 및 인간 항-인간 항체를 포함하여 항-BCMA 항체를 함유하는 키메라 항원 수용체 및 상기 키메라 수용체를 발현하는 세포가 앞서 기재되었다. 문헌[Carpenter et al., Clin Cancer Res., 2013, 19(8):2048-2060, WO 2016/090320, WO2016090327, WO2010104949A2 및 WO2017173256]을 참조한다. 일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 BCMA이다. 일부 구현예에서, scFv는 BCMA에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, BCMA에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/090327 및 WO 2016/090320]에 제시된 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 및 VL이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 항-BCMA CAR은 문헌[WO 2016/090320 또는 WO2016090327]에 기재된 항체로부터 유래된 가변 중쇄(VH) 및/또는 가변 경쇄(VL) 영역을 함유하는 scFv와 같은 항원 결합 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 116에 제시된 VH 및 서열 번호: 117에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 118에 제시된 VH 및 서열 번호: 119에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 120에 제시된 VH 및 서열 번호: 121에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 113에 제시된 VH 및 서열 번호: 114에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서 scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 125에 제시된 VH 및 서열 번호: 126에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 127에 제시된 VH 및 서열 번호: 128에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, scFv와 같은 항원 결합 도메인은 서열 번호: 129에 제시된 VH 및 서열 번호: 130에 제시된 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, VH 또는 VL은 전술한 VH 또는 VL 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖고 BCMA에 대한 결합을 유지한다. 일부 구현예에서, VH 영역은 VL 영역에 대한 아미노 말단이다. 일부 구현예에서, VH 영역은 VL 영역에 대해 카르복시 말단이다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 GPRC5D이다. 일부 구현예에서, scFv는 GPRC5D에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, GPRC5D에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 문헌[국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/090329 및 WO 2016/090312]에 제시된 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 및 VL이거나 이를 함유한다.
일부 측면에서, CAR은 범용 태그 또는 범용 에피토프에 결합하거나 인식하는, 예를 들어 특이적으로 결합하는 리간드-(예를 들어, 항원-) 결합 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, 결합 도메인은, 질병 또는 장애와 관련된 항원을 인식하는 상이한 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편)에 연결될 수 있는 분자, 태그, 폴리펩타이드 및/또는 에피토프에 결합할 수 있다. 예시적인 태그 또는 에피토프는 염료(예를 들어, 플루오레신 이소티오시아네이트) 또는 비오틴을 포함한다. 일부 측면에서, 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편)은, 태그에 특이적인 CAR을 발현하는 조작된 세포와 관련되고, 질병 또는 장애, 예를 들어 종양 항원과 관련된 항원을 인식하는 태그에 연결되어 조작된 세포의 세포 독성 또는 다른 이펙터 기능을 초래한다. 일부 측면에서, 질병 또는 장애와 관련된 항원에 대한 CAR의 특이성은 태깅된 결합 분자(예를 들어, 항체)에 의해 제공되고, 상이한 태깅된 결합 분자는 상이한 항원을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 범용 태그 또는 범용 에피토프에 특이적인 예시적인 CAR은, 예를 들어 문헌[U.S. 9,233,125, WO 2016/030414, Urbanska et al., (2012) Cancer Res 72: 1844-1852 및 Tamada et al., (2012). Clin Cancer Res 18:6436-6445]에 기재된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 병원체 특이적 또는 병원체 발현 항원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스성 항원(예컨대 HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스 항원), 세균성 항원 및/또는 기생 항원이다. 일부 구현예에서, CAR은 주요 조직적합성 복합체 MHC-펩타이드 복합체로서 세포 표면 상에 제시된 종양 관련 항원과 같은 세포내 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원 결합 단편(예를 들어, scFv)과 같은 TCR 유사 항체를 함유한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체를 인식하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체의 일부로 세포 상에서 발현될 수 있다. 항원 수용체 중에는 키메라 항원 수용체(CAR)와 같은 기능성 비-T 세포 수용체(TCR) 항원 수용체가 있다. 일부 구현예에 있어서, 펩타이드-MHC 복합체에 대하여 지시된 TCR 유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원 결합 단편을 함유하는 CAR은 또한 TCR 유사 CAR로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR 유사 CAR이고 항원은 TCR과 마찬가지로 MHC 분자의 맥락에서 세포 표면 상에서 인식되는 세포내 단백질의 펩타이드 항원과 같은 가공된 펩타이드 항원이다. 일부 구현예에서, TCR 유사 CAR의 MHC-펩타이드 복합체에 특이적인 세포외 항원-결합 도메인은 일부 측면에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 분자는 통상적으로 TCR과 같은 천연 항원 수용체를 통한 신호 및 임의적으로 공자극 수용체와 조합하여 상기 수용체를 통한 신호를 모방하거나 이와 유사할 수 있다.
“주요 조직적합성 복합체(Major histocompatibility complex, MHC)”에 대한 언급은 일부 경우에, 세포 기작에 의해 가공된 펩타이드 항원을 포함하여 폴리펩타이드의 펩타이드 항원과 복합체를 형성할 수 있는 다형성 펩타이드 결합 부위 또는 결합 고랑(groove)을 함유하는 단백질, 일반적으로 당단백질을 지칭한다. 일부 경우에, MHC 분자는 TCR 또는 TCR 유사 항체와 같은 T 세포 상의 항원 수용체에 의해 인식 가능한 형태로 항원 제시를 위해 펩타이드와의 복합체로, 즉 MHC-펩타이드 복합체를 포함하여 세포 표면 상에 표시되거나 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는 일부 경우에, 3개의 α 도메인 및 비공유 결합된 β2 마이크로글로불린을 갖는, 막에 걸쳐있는 α 사슬을 갖는 이종이량체이다. 일반적으로 MHC 클래스 II 분자는 두 개의 막관통 당단백질, α 및 β로 구성되며, 둘 다 전형적으로 막에 걸쳐 있다. MHC 분자는 펩타이드에 결합하기 위한 항원 결합 부위 또는 부위들 및 적절한 항원 수용체에 의한 인식에 필요한 서열을 함유하는 MHC의 유효 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자는 시토솔에서 유래한 펩타이드를 세포 표면으로 전달하고, 여기서 MHC-펩타이드 복합체는 일반적으로 CD8+ T 세포와 같은, 일부 경우에는 CD4+ T 세포와 같은 T 세포에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 분자는 소포성 계(vesicular system)에서 유래한 펩타이드를 세포 표면으로 전달하며, 이는 전형적으로 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, MHC 분자는 인간에서 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA) 및 마우스에서 H-2라고 통칭되는 연관된 유전자 자리(loci) 그룹에 의해 암호화된다. 따라서, 전형적으로 인간 MHC는 인간 백혈구 항원(HLA)으로도 지칭될 수 있다.
용어 “MHC-펩타이드 복합체(MHC-peptide complex)” 또는 “펩타이드-MHC 복합체(peptide-MHC complex)” 또는 이의 변형은 예컨대 일반적으로 MHC 분자의 결합 고랑(groove) 또는 틈에서 펩타이드의 비공유 상호작용에 의한 펩타이드 항원 및 MHC 분자의 복합체 또는 회합을 지칭한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 세포의 표면 상에 존재하거나 표시된다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 TCR, TCR 유사 CAR 또는 이의 항원 결합 부분과 같은 항원 수용체에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 펩타이드 항원 또는 에피토프와 같은 펩타이드는 예컨대 항원 수용체에 의한 인식을 위해 MHC 분자와 회합할 수 있다. 일반적으로, 펩타이드는 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 보다 긴 생물학적 분자의 단편으로부터 유래되거나 이를 기초로 한다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 전형적으로 약 8 내지 약 24개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 II 복합체에서 인식을 위해 (약) 9 내지 22개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 I 복합체에서 인식을 위해 (약) 8 내지 13개의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체와 같은 MHC 분자의 맥락에서 펩타이드 인식 시, TCR 또는 TCR 유사 CAR과 같은 항원 수용체는 T 세포 반응, 예컨대 T 세포 증식, 사이토카인 생성, 세포 독성 T 세포 반응 또는 다른 반응을 유도하는 T 세포에 대한 활성화 신호를 생성하거나 유발시킨다.
일부 구현예에서, TCR 유사 항체 또는 항원 결합 부분은 공지되어 있거나, 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어 미국 공개 출원 번호 US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; 및 국제 출원 번호 WO 03/068201 참조).
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 특이적인 MHC-펩타이드 복합체를 함유하는 유효량의 면역원으로 숙주를 면역화함으로써 생산될 수 있다. 일부 경우에, MHC-펩타이드 복합체의 펩타이드는 종양 항원, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 범용 종양 항원, 골수종 항원 또는 기타 항원과 같이 MHC에 결합할 수 있는 항원의 에피토프이다. 일부 구현예에서, 이어서 유효량의 면역원이 면역 반응을 유발하기 위해 숙주에 투여되고, 여기서 면역원은 MHC 분자의 결합 고랑에서 펩타이드의 3차원 제시에 대하여 면역 반응을 유발하기에 충분한 기간 동안 이의 3차원 형태를 유지한다. 이어서 숙주로부터 수집된 혈청을 분석하여 MHC 분자의 결합 고랑에서 펩타이드의 3차원 제시를 인식하는 원하는 항체가 생성되고 있는지 여부를 결정한다. 일부 구현예에서, 생성된 항체를 분석하여 상기 항체가 MHC-펩타이드 복합체와 MHC 분자 단독, 관심 펩타이드 단독 및 MHC 및 무관한 펩타이드의 복합체를 구별할 수 있는지 확인할 수 있다. 이어서 원하는 항체를 단리할 수 있다.
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 파지 항체 라이브러리와 같은 항체 라이브러리 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 라이브러리의 멤버가 CDR 또는 CDR들의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이되는 뮤테인 Fab, scFv 또는 기타 항체 형태의 파지 디스플레이 라이브러리가 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 US20020150914, US20140294841; 및 Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332]을 참조한다.
일부 구현예에서, 항원은 CD20이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD20에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD20에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 리툭시맙 scFv와 같은 리툭시맙이거나 이로부터 유래된 항체이다.
일부 구현예에서, 항원은 CD22이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD22에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD22에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 m971 scFv와 같은 m971이거나 이로부터 유래된 항체이다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 항체 부분은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일 부분, 예를 들어 힌지 영역, 예컨대, IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 부분은 항원-인식 성분, 예를 들어, scFv와 막관통 도메인 사이에서 스페이서 영역으로 기능한다. 스페이서는 스페이서의 부재와 비교하여 항원 결합 후에 세포의 반응성 증가를 제공하는 길이일 수 있다. 예시적인 스페이서는 문헌[Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153 또는 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014031687, 미국 특허 번호 8,822,647 또는 공개된 출원 번호 US2014/0271635]에 기재된 것을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 (서열 번호 81에 제시된) 서열 ESKYGPPCPPCP를 가지며, 서열 번호 82에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 83에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 84에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 85에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 81, 83, 84, 또는 85 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 86-94에 제시된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호: 86-94 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 항원 수용체는 세포외 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인과 세포내 신호 전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 ITAM을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 항원 인식 도메인(예를 들어, 세포외 도메인)은 일반적으로 CAR의 경우에 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체를 통한 활성화 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 모방하는 신호 전달 성분과 같은 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분에 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 세포외 도메인(예컨대, scFv)과 세포내 신호 전달 도메인을 연결 또는 융합되는 막관통 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 항원 결합 성분(예를 들어, 항체)은 하나 이상의 막관통 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인에 연결된다.
일 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR에 있는 도메인 중 하나와 자연적으로 회합하는 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 상기 도메인의 결합을 피하도록 아미노산 치환에 의해 변형되거나 선택되어 수용체 복합체의 다른 멤버와의 상호 작용이 최소화된다.
일부 구현예에서, 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 일부 측면에서, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래된다. 막 관통 영역은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154로부터 유래된 것을 포함한다(즉 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함한다). 대안적으로 일부 구현예에서 막관통 도메인은 합성이다. 일부 측면에서, 합성 막관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플릿(triplet)이 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 연결은 링커, 스페이서 및/또는 막관통 도메인에 의한 것이다. 일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다.
세포외 도메인과 막관통 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인과 막관통은 본원에 기술된 임의 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 수용체는 막관통 도메인이 유래된 분자의 세포 외 부분, 예컨대 CD28 세포 외 부분을 포함한다.
세포내 신호 전달 도메인 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공자극 수용체와 조합으로 상기 수용체를 통한 신호 및/또는 공자극수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 이와 유사한 것이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예를 들어 글리신 및 세린, 예를 들어 글리신-세린 더블릿(doublet)을 함유하는 것과 같은 2 내지 10개 아미노산 길이의 링커가 CAR의 막관통 도메인과 세포질 신호 전달 도메인 사이에 존재하고 연결을 형성한다.
일부 측면에서, T 세포 활성화는 두 종류의 세포질 신호 전달 서열, 즉 TCR을 통한 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 서열(1차 세포질 신호 전달 서열) 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공자극 신호를 제공하는 서열(2차 세포질 신호 전달 서열)에 의해 매개되는 것으로 설명된다. 일부 측면에서, CAR은 상기 신호 전달 성분 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
수용체, 예를 들어 CAR은 일반적으로 하나 이상의 세포내 신호 전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호 전달 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호 전달 모티프를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호 전달 서열을 함유하는 ITAM의 예에는 CD3 제타 사슬, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타 및 CD3 엡실론으로부터 유래된 것이 포함된다. 일부 구현예에서, CAR의 세포질 신호 전달 분자(들)은 CD3 제타로부터 유래된 세포질 신호 전달 도메인, 이의 부분 또는 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 수용체는 T-세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예를 들어 CD3 제타 사슬과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 항원-결합 부분는 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 신호 전달 도메인 및/또는 기타 CD3 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어 CAR은 또한 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부를 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체는 CD3-제타(CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이에 키메라 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체의 결찰시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포내 신호 전달 도메인은 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 주효인자 기능 또는 반응 중 하나 이상을 활성화시킨다. 예를 들어, 일부 맥락에서, CAR은 T 세포의 기능, 예컨대 세포 용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 예컨대 사이토카인 또는 기타 인자의 분비를 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공동자극분자의 세포내 신호 전달 도메인의 절단 부분은 예를 들어 그것이 효과기 기능 신호를 형질도입하는 경우 온전한 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인 또는 도메인들은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열 및 일부 측면에서 자연적인 상황에서 항원 수용체 결합 후에 신호 전달을 개시하기 위해 상기 수용체와 협력하여 작용하는 공-수용체의 서열을 포함한다.
천연 TCR의 맥락에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호 전달뿐만 아니라 공자극 신호를 요구한다. 따라서, 일부 구현예에서, 완전한 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분이 또한 CAR에 포함된다. 다른 구현예에서, CAR은 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가의 CAR이 동일한 세포에서 발현되고 2차 또는 공자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공동자극분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS와 같은 공자극 수용체의 신호 전달 도메인 및/또는 막관통 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR은 활성화 및 공자극 성분 둘 다를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공동자극분자 또는 이의 기능적 변이체로부터 유래된 세포내 도메인을, 예컨대 막관통 도메인과 세포내 신호 전달 도메인 사이에 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공동자극분자는 CD28 또는 41BB이다.
일부 구현예에서, 활성화 도메인은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 공자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 활성화 또는 자극성 CAR, 공자극 CAR을 포함하며, 둘 다 동일한 세포 상에서 발현된다(WO2014/055668 참조). 일부 측면에서, 세포는 하나 이상의 자극성 또는 활성화 CAR 및/또는 공자극 CAR를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 억제성 CAR (iCARs, Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013) 참조), 예컨대 질병 또는 병태에 특이적이고/거나 이와 관련된 것 이외의 항원을 인식하는 CAR을 더 포함하고, 이에 의해 질병 표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 신호는 억제성 CAR의 그의 리간드에 결합함으로써, 예를 들어 오프 타겟 효과를 감소시킴으로써 감소되거나 억제된다.
일부 구현예에서, 2개의 수용체는 각각 세포에 활성화 및 억제 신호를 세포에 유도하여, 항원에 수용체 중 하나의 결찰은 세포를 활성화하거나 반응을 유도하지만, 항원에 제2 억제성 수용체의 결찰은 반응을 억제하거나 약화시키는 신호를 유도한다. 활성화 CAR 및 억제성 CAR(iCAR)을 조합하는 예가 있다. 예를 들어, 활성화 CAR이 질병 또는 병태에서 발현되나 정상 세포에서도 발현되는 항원에 결합하고 억제 수용체는 정상 세포에서 발현되나 질병 또는 병태의 세포에서는 발현되지 않는 별개의 항원에 결합하는 맥락에서 오프 타겟(off-target) 효과의 가능성을 감소시키는 것과 같은 전략이 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 키메라 수용체는 억제 CAR(예를 들어 iCAR)이거나 이를 포함하고 면역 반응, 예컨대 세포에서 ITAM 및/또는 공자극 촉진 반응을 약화 또는 억제하는 세포내 성분을 포함한다. 상기 세포 내 신호 전달 성분의 예는 PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2 수용체, A2AR을 포함한 EP2/4 아데노신 수용체를 포함한 면역 체크포인트 분자에서 발견되는 것이다. 일부 측면에서, 조작된 세포는 상기 억제 분자의 또는 이로부터 유래된 신호 전달 도메인을 포함하는 억제성 CAR를 포함하여, 이것이 예를 들어, 활성화 및/또는 공자극 CAR에 의해 유도되는 세포의 반응을 약화시키는 역할을 한다.
특정 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 CD3(예를 들어, CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 CD28 막관통 및 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 세포질 부분에서 하나 이상의, 예를 들어 2개 이상의 공자극 도메인 및 활성화 도메인, 예를 들어 1차 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 CAR에는 CD3-제타, CD28 및 4-1BB의 세포내 성분이 포함된다.
일부 구현예에서, 항원 수용체는 마커를 추가로 포함하고/거나 CAR 또는 다른 항원 수용체를 발현하는 세포는 세포 표면 마커와 같은 대리 마커를 추가로 포함하며, 이는 수용체를 발현하기 위해 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 마커는 CD34, NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체의 전부 또는 일부 (예를 들어, 절단된 형태), 예를 들어 그러한 세포 표면 수용체의 절단된 버전 (예를 들어, tEGFR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 마커를 암호화하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열과 같은 링커 서열에 대해 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, T2A)에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 마커 및 선택적으로 링커 서열은 문헌[특허 출원 번호 WO2014031687]에 개시된 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 마커는 링커 서열, 예컨대 T2A 절단 가능한 링커 서열에 선택적으로 연결된 절단형 EGFR(tEGFR)일 수 있다.
절단형 EGFR(예를 들어, tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩타이드는 서열 번호 43 또는 16에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호 43 또는 44에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 T2A 링커 서열은 서열 번호 47 또는 48에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호 47 또는 48에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 T 세포에서 자연적으로 발견되지 않거나 또는 T 세포 표면에서 자연적으로 발견되지 않는 분자(예를 들어, 세포 표면 단백질) 또는 이의 부분이다. 일부 구현예에서, 분자는 비자기 분자, 예를 들어 비자기 단백질, 즉 세포가 입양으로 전달될 숙주의 면역 시스템에 의해 “자기(self)”로 인식되지 않는 분자이다.
일부 구현예에서, 마커는 치료 기능을 제공하지 않고/거나 유전자 조작, 예를 들어 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 마커로서 사용되는 것 외에 다른 효과를 생성하지 않는다. 기타 구현예에서, 마커는 치료적 분자 또는 달리 일부 원하는 효과를 나타내는 분자, 예컨대 생체 내에서 세포가 조우하게 될 리간드, 예컨대 입양 전달 및 리간드와의 조우 시 세포의 반응을 강화하고/거나 약화시키는 공자극 또는 면역 관문 분자일 수 있다.
일부 경우에, CAR은 제1, 제2 및/또는 제3 세대 CAR로 지칭된다. 일부 측면에서, 제1 세대 CAR은 항원 결합 시 단독으로 CD3 사슬 유도 신호를 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 제2 세대 CAR은 CD28 또는 CD137 등의 공자극 수용체로부터의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 것과 같은, 신호 및 공자극 신호를 제공하는 것이며; 일부 측면에서, 제3 세대 CAR은 일부 측면에서 상이한 공자극 수용체의 다중 공자극 도메인을 포함하는 것이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, CAR는 기재된 임의의 것을 포함하는 항원에 특이적인 항체, 예를 들어, scFv와 같은 항체 단편, CD28의 막관통 부분 또는 이의 기능적 변이체이거나 이를 함유하는 막관통 도메인, 및 CD28의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체 및 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포 내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR는 기재된 임의의 것을 포함하는 항원에 특이적인 항체, 예를 들어, scFv와 같은 항체 단편, CD28의 막관통 부분 또는 이의 기능적 변이체이거나 이를 함유하는 막관통 도메인, 및 4-1BB의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체와 CD3 제타의 신호 전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포내 신호 전달 도메인을 함유한다. 일부 상기 구현예에서, 수용체는 Ig 분자, 예컨대 인간 Ig 분자의 일부, 예컨대 Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지, 예컨대 힌지 전용 스페이서를 함유하는 스페이서를 더 포함한다.
일부 구현예에서,재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 막관통 도메인은 인간 CD28(예를 들어, 수탁 번호 P01747.1) 또는 이의 변이체, 예컨대 서열 번호: 95에 제지된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 95에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 막관통 도메인이거나 이를 포함하며; 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 일부를 함유하는 막관통 도메인은 서열 번호: 96에 제시된 아미노산 서열 또는 이에 대해 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어 CAR의 세포내 신호 전달 성분(들)은 인간 CD28의 세포내 공동자극 신호 전달 도메인 또는 이의 기능적 변이체 또는 이의 부분, 예컨대 천연 CD28 단백질의 위치 186-187에 LL이 GG로 치환된 도메인을 함유한다. 예를 들어, 세포내 신호 전달 도메인은 서열 번호 97 또는 98에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호 97 또는 98에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서,세포내 도메인은 4-1BB 세포내 공동자극 신호 전달 도메인재조합 수용체(예를 들어, 수탁 번호 Q07011.1) 또는 기능적 변이체 또는 이의 부분, 예를 들어 서열 번호: 99에 제지된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 99에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 세포내 신호 전달 도메인은 인간 CD3 제타 자극성 신호 전달 도메인 또는 이의 기능성 변이체, 예컨대 인간 CD3ζ(수탁 번호: P20963.2)의 동형 단백질 3의 112 AA 세포질 도메인 또는 문헌[미국 특허 번호 7,446,190 또는 미국 특허 번호 8,911,993]에 기재된 바와 같은 CD3 제타 신호 전달 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 서열 번호 100, 101 또는 102에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호 100, 101 또는 102에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서는 IgG의 힌지 영역 단독, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 힌지 단독, 예컨대 서열 번호 81에 제시된 힌지 단독 스페이서를 함유한다. 다른 구현예에서, 스페이서는 CH2 및/또는 CH3 도메인에 임의적으로 연결된 Ig 힌지, 예를 들어, IgG4-유래 힌지이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 84에 제시된 바와 같이 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 83에 제시된 바와 같이 CH3 도메인에만 연결된 Ig 힌지, 예를 들어 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 공지된 가요성 링커(flexible linker)와 같은 다른 가요성 링커이거나 이를 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, CAR는 scFv를 포함하는 항체 단편과 같은 항체, 힌지 영역과 같은 면역 글로불린 분자의 일부를 함유하는 스페이서 및/또는 중쇄 분자의 하나 이상의 불변 영역, 예를 들어 Ig-힌지 함유 스페이서, CD28-유래 막관통 도메인, CD28-유래 세포내 신호 전달 도메인, 및 CD3 제타 신호 전달 도메인의 전부 또는 일부를 함유하는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 scFv와 같은 항체 또는 단편, 임의의 Ig-힌지 함유 스페이서와 같은 스페이서, CD28-유래 막관통 도메인, 4-1BB-유래 세포내 신호 전달 도메인 및 CD3 제타 신호 전달 도메인을 포함한다.　
예시적인 대리 마커는 비기능적이며 신호 또는 일반적으로 전장 형태의 세포 표면 폴리펩타이드에 의해 전달되는 신호를 전달할 수 없거나 전달하지 않고/거나 내재화될 수 없거나 내재화되지 않는 절단 형태와 같은 세포 표면 폴리펩타이드의 절단 형태를 포함할 수 있다. 예시적 절단된 세포 표면 폴리펩타이드는 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (tHER2), 절단된 표피 성장 인자 수용체 (tEGFR, 43 또는 44에 제시된 예시적인 tEGFR 서열) 또는 전립선-특이적 막 항원 (PSMA) 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. tEGFR은 항체 세툭시맙 (cetuximab, Erbitux®) 또는 다른 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유할 수 있으며, 이는 tEGFR 컨스트럭 및 코딩된(암호화된) 외인성 단백질을 발현하도록 조작된 세포를 확인 또는 선택하는데 사용될 수 있고, 및/또는 코딩된 외인성 단백질을 발현하는 세포를 제거 또는 분리하는데 사용될 수 있다. 문헌 미국 특허 번호 8,802,374 및 Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434를 참조한다. 일부 측면에서, 마커(예를 들어, 대리 마커)에는 CD34의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단 형태), NGFR, CD19 또는 절단된 CD19 예를 들어, 절단된 비-인간 CD19, 또는 표피 성장 인자 수용체(예를 들어, tEGFR)가 포함된다. 일부 구현예에서, 마커는 형광 단백질, 예컨대 그린 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 강화된 그린 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 예컨대 슈퍼-폴드 GFP(super-fold GFP, sfGFP), 레드 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 블루 그린 형광 단백질(blue green fluorescent protein, BFP), 강화된 블루 형광 단백질(enhanced blue fluorescent protein, EBFP) 및 옐로우 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP) 및 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체 및 코돈-최적화된 및/또는 강화된 변이체를 포함한 이의 변이체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 루시퍼라아제, 대장균(E. Coli)의 lacZ 유전자, 분비 배아 알칼리 포스파타아제(SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT)와 같은 효소이거나 이를 포함할 수 있다. 예시적인 발광 리포터 유전자에는 루시퍼라아제(luc), β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-글루쿠로니다아제(GUS) 또는 이들의 변이체가 포함된다.
일부 구현예에서, 마커는 내성 마커 또는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 내성 마커 또는 선택 마커는 외인성 제제 또는 약물에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 포유류 세포에 대해 항생제 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 내성 마커 또는 선택 마커는 퓨로마이신 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자, 블라스티사이딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 게네티신 내성 유전자 또는 제오신 내성 유전자 또는 이들의 변형된 형태이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커를 암호화하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열과 같은 링커 서열에 대해 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, T2A에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 마커 및 선택적으로 링커 서열은 국제 출원 공개 번호 WO2014031687에 개시된 바와 같은 임의의 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 CAR 작제물을 암호화하는 핵산 분자는 T2A 라이보솜 스킵 요소를 암호화 하는 서열 및/또는 tEGFR 서열, 예를 들어, CAR을 암호화하는 서열의 다운스트림을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 서열은 서열 번호 47 또는 48에 제시된 T2A 라이보솜 스킵 요소, 또는 서열 번호 47 또는 48에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 암호화한다.
일부 구현예에서, 항원 수용체 (예를 들어 CAR)를 발현하는 T 세포는 또한 비 면역원성 선택 에피토프로써 절단된 EGFR (EGFRt)을 발현하도록 생성될 수 있고 (예를 들어, 동일한 작제물로부터 2 개의 단백질을 발현시키기 위해 T2A 리보솜 스위치에 의해 분리된 CAR 및 EGFRt를 암호화하는 작제물의 도입에 의해), 이후 이러한 세포를 검출하기 위한 마커로써 사용될 수 있다 (예를 들어, U.S. 특허번호 8,802,374 참조). 일부 구현예에서, 상기 서열은 서열 번호 43 또는 44에 제시된 tEGFR 서열, 또는 서열 번호 43 또는 44에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 경우에, T2A와 같은 펩타이드는 라이보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩타이드 결합의 합성을 건너뛰도록(라이보솜 스키핑) 유발할 수 있으며, 이는 2A 서열의 말단과 다음 펩타이드 다운스트림 사이의 분리로 이어진다(예를 들어, de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) 및 de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004) 참조).많은 2A 요소가 공지되어 있다. 본원에 개시된 방법 및 핵산이 사용될 수 있는 2A 서열의 예에는 문헌[미국 특허 공개 번호 20070116690]에 기술된 바와 같은 구제역 바이러스(F2A, 예를 들어, 서열번호: 45), 말 비염 A 바이러스(E2A, 예를 들어, 서열번호: 46), 토세아 아시그나 바이러스(T2A, 예를 들어, 서열번호: 47 또는 48) 및 돼지 테스코 바이러스-1(P2A, 예를 들어, 서열번호: 49 또는 50)이 있으며, 하지만 이에 한정되지 않는다.
대상체에게 투여된 세포에 의해 발현되는 CAR와 같은 재조합 수용체는 일반적으로 치료되는 질병 또는 병태 또는 세포에서 발현, 연합되는 및/또는 특이적인 분자를 인식하거나 특이적으로 결합한다. 분자, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합할 때, 수용체는 일반적으로, ITAM- 형질 도입된 신호와 같은, 면역 자극 신호를 세포 내로 전달하여 질병 또는 병태에 대한 면역 반응을 촉진시킨다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 세포는 질병 또는 병태의 세포 또는 조직에 의해 발현되거나 질병 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 CAR를 발현한다.
2. 키메라 자가항체 수용체(CAAR)
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 키메라 자가항체 수용체(CAAR)이다. 일부 구현예에서, CAAR은 자가항체에 결합, 예를 들어 특이적으로 결합하거나 인식한다. 일부 구현예에서, CAAR을 발현하도록 조작된 T 세포와 같은 CAAR을 발현하는 세포는 정상적인 항체 발현 세포가 아닌 자가항체 발현 세포에 결합하여 이를 사멸하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 자가면역 질환과 같은 자가항원 발현과 관련된 자가면역 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 궁극적으로 자가항체를 생산하고 세포 표면에 자가항체를 나타내는 B 세포를 표적화할 수 있고, 치료적 개입을 위한 질병 특이적 표적으로 상기 B 세포를 표시할 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR 발현 세포는 항원 특이적 키메라 자가항체 수용체를 이용하여 질병을 유발하는 B 세포를 표적화함으로써 자가면역 질환에서 병원성 B 세포를 효율적으로 표적화하고 사멸시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 US 2017/0051035]에 기술된 어느 하나와 같은 CAAR이다.
일부 구현예에서, CAAR은 자가항체 결합 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호 전달 영역 또는 도메인(세포질 신호 전달 도메인 또는 영역이라고도 함)을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 영역은 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 전달 도메인은 1차 신호 전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 자극 및/또는 유도할 수 있는 신호 전달 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 전달 도메인(예를 들어, CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포내 신호 전달 도메인 또는 영역 또는 기능적 변이체 또는 이의 신호 전달 부분) 및/또는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 포함하는 신호 전달 도메인이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 자가항체 결합 도메인은 자가항원 또는 이의 단편을 포함한다. 자가항원의 선택은 표적화되는 자가항체의 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 자가 항원은 특정 질병 상태, 예를 들어 자가면역 질환, 예컨대 자가항체 매개 자가면역 질환과 관련된 B 세포와 같은 표적 세포 상의 자가항체를 인식하기 때문에 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 자가면역 질환은 심상성 천포창(pemphigus vulgaris, PV)을 포함한다. 예시적인 자가항원은 데스모글레인 1(desmoglein 1, Dsg1) 및 Dsg3을 포함한다.
3. T 세포 수용체(TCR)
일부 구현예에서, 종양, 바이러스 또는 자가 면역 단백질의 항원과 같은 표적 폴리펩타이드의 펩타이드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 부분을 발현하는 T 세포와 같은 조작된 세포가 제공된다.
일부 구현예에서, “T 세포 수용체(T cell receptor)”또는 “TCR”은 가변 α 및 β 사슬(각각 TCRα 및 TCRβ로도 공지) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각 TCRγ 및 TCRδ로도 공지) 또는 이의 항원 결합 부분을 함유하는 분자이고 이는 MHC 분자에 결합된 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태이다. 통상적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로 TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면 상에서 발견되며, 이는 일반적으로 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원의 인식을 담당한다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 “TCR”은 완전한(full) TCR뿐만 아니라 이의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태 또는 γδ 형태의 TCR을 포함하는 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 전장 미만의 TCR이지만 MHC-펩타이드 복합체에 결합하는 것과 같이 MHC 분자에서 결합된 특정 펩타이드에 결합하는 항원 결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원 결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있으나, 그럼에도 완전한 TCR이 결합하는 MHC-펩타이드 복합체와 같은 펩타이드 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 부분은 특정 MHC-펩타이드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬과 같은 TCR의 가변 도메인을 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩타이드, MHC 및/또는 MHC-펩타이드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR의 가변 도메인은 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 함유하며, 이는 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 대한 1차 기여자이다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 또는 이의 조합은 주어진 TCR 분자의 항원 결합 부위의 전부 또는 실질적으로 전부를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내의 다양한 CDR은 일반적으로 CDR에 비해 TCR 분자 중에서 일반적으로 가변성을 덜 나타내는 프레임워크 영역(FR)으로 분리된다(예를 들어, Jores et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988 참조; 또한 Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 참조). 일부 구현예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 항원 인식을 위한 및/또는 펩타이드-MHC 복합체의 가공된 펩타이드 부분과의 상호작용을 위한 주어진 TCR 가변 영역상에서 3개의 CDR 중 가장 중요한 CDR이다. 일부 맥락에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원 펩타이드의 N-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, 베타 사슬의 CDR1은 상기 펩타이드의 C-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, CDR2는 MHC-펩타이드 복합체의 MHC 부분과의 상호작용 또는 이의 인식을 담당하는 1차 CDR이거나 이에 가장 강력하게 기여한다. 일부 구현예에서, β 사슬의 가변 영역은 초가변 영역(CDR4 또는 HVR4)을 더 함유할 수 있으며, 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초항원 결합에 관여한다(Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구현예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유할 수 있다(예를 들어, 문헌[Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997] 참조). 일부 측면에서, TCR의 각 사슬은 1개의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 1개의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C-말단 끝에 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 회합한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 함유한다. 예를 들어, 주어진 TCR 사슬(예를 들어, α-사슬 또는 b-사슬)의 세포외 부분은 세포막에 인접한 2개의 면역글로불린 유사 도메인, 예컨대 가변 도메인(예를 들어, Vα 또는 Vb; 전형적으로 Kabat 넘버링 Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.에 기초한 1 내지 116 아미노산) 및 불변 도메인(예를 들어 α 사슬 불변 도메인 즉 Cα, 전형적으로 Kabat 넘버링에 기초한 사슬의 117 내지 259 위치 또는 b 사슬 불변 도메인 또는 Cb, 전형적으로 Kabat에 기초한 사슬의 117 내지 295 위치)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막 근위 불변 도메인과 2개의 막 원위 가변 도메인을 함유하고, 상기 가변 도메인 각각은 CDR을 함유한다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화물 결합을 형성하여 이로써 2개의 TCR 사슬을 연결하는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 각각의 α 및 β 사슬에 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있어서, TCR은 불변 도메인에서 2개의 이황화물 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막관통 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양으로 하전된다. 일부 경우에, TCR 사슬은 세포질 꼬리를 함유한다. 일부 경우에, 이 구조는 TCR이 CD3 및 이의 서브유닛과 같은 다른 분자와 회합하도록 허용한다. 예를 들어, 막관통 영역을 가진 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정하고 CD3 신호 전달 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 회합할 수 있다. CD3 신호 전달 서브유닛(예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포내 꼬리는 TCR 복합체의 신호 전달 용량에 관여하는 하나 이상의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 즉 ITAM을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR은 2개의 사슬 α 및 β(또는 임의적으로 γ 및 δ)의 이종이량체이거나 단일 사슬 TCR 작제물일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 예컨대 이황화물 결합 또는 이황화물 결합들에 의해 연결되는 2개의 별개의 사슬(α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 함유하는 이종이량체이다.
일부 구현예에서, TCR은 Vα, β 사슬의 서열과 같은 공지된 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있으며, 이에 대해 실질적으로 전장 코딩 서열이 용이하게 이용가능하다. V 사슬 서열을 포함한 전장 TCR 서열을 세포 공급원으로부터 수득하는 방법은 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 예컨대 주어진 세포 또는 세포들 내의 또는 이로부터 단리된 TCR 암호화 핵산의 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭에 의해 또는 공개적으로 이용 가능한 TCR DNA 서열의 합성에 의해 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 생물학적 공급원, 예컨대 세포, 예컨대 T 세포(예를 들어, 세포 독성 T 세포), T 세포 혼성세포 또는 기타 공개적으로 이용 가능한 공급원으로부터 수득된다. 일부 구현예에서, T 세포는 생체 내 단리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 흉선에서 선택된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 네오에피토프 제한(neoepitope-restricted) TCR이다. 일부 구현예에서, T 세포는 배양된 T 세포 혼성세포(hybridoma) 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분 또는 이의 항원 결합 단편은 TCR 서열에 대한 지식을 이용해 합성하여 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 표적 폴리펩타이드 항원 또는 이의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR의 라이브러리를 스크리닝하여 확인되거나 선택된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 기타 림프구 기관에 존재하는 세포를 포함하여 대상체로부터 단리된 T 세포로부터의 Vα 및 Vβ 레퍼토리를 증폭하여 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양 침윤성 림프구(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR는 정상적인 건강한 대상체의 T 세포 공급원, 즉 정상 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR는 유병 대상체의 T 세포 공급원, 즉 유병 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간으로부터 수득된 T 세포와 같은 샘플에서 예컨대 RT-PCR에 의해 Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키기 위해 퇴화(degenerate) 프라이머가 사용된다. 일부 구현예에서, scTv 라이브러리는 증폭된 산물이 클로닝되거나 조립되어 링커에 의해 분리되는 나이브(naive) Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 조립될 수 있다. 대상체와 세포의 공급원에 따라, 라이브러리는 HLA 대립유전자 특이적일 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 모(parent) 또는 지지체(scaffold) TCR 분자의 돌연변이 유발 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 측면에서, TCR은 예를 들어 α 또는 β 사슬의 예컨대 돌연변이 유발에 의해 유도 진화를 거친다. 일부 측면에서, TCR의 CDR 내 특정 잔기가 변경된다. 일부 구현예에서, 선택된 TCR은 친화도 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 예컨대, 펩타이드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위해 스크리닝에 의해 선택될 수 있다. 일부 측면에서, 예를 들어 항원 특이적 T 세포에 존재하는 TCR은 예컨대 결합 활성, 예를 들어 항원에 대한 특정 친화도 또는 친화력에 의해 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 변형되었거나 조작된 것이다. 일부 구현예에서, 특정 MHC-펩타이드 복합체에 대한 더 높은 친화도를 갖는 것과 같은 변경된 특성을 가진 TCR을 생성하기 위해 유도 진화 방법이 사용된다. 일부 구현예에서, 유도 진화는 효모 디스플레이(Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이(Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) 또는 T 세포 디스플레이(Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)를 포함하되 이에 국한되지 않는 디스플레이 방법에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근 방식은 공지된 모(parent) 또는 기준 TCR 조작 또는 변형하는 것을 수반한다. 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 CDR 잔기에서 돌연변이를 일으킨 돌연변이된 TCR을 생성하기 위한 주형(template)으로 야생형 TCR이 사용될 수 있고, 원하는 변경된 특성, 예컨대 원하는 표적 항원에 대한 보다 높은 친화도를 갖는 돌연변이가 선택된다.
일부 구현예에서, 관심 TCR의 제조 또는 생성에 사용하기 위한 표적 폴리펩타이드의 펩타이드는 공지되어 있거나 용이하게 식별될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 항원 결합 부분을 생성하는데 사용하기에 적합한 펩타이드는 하기 기재된 표적 폴리펩타이드와 같은 관심 표적 폴리펩타이드에서 HLA 제한 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 이용 가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 식별된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 상기 모델은 ProPred1(Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237) 및 SYFPEITHI(Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007 참조)를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, MHC 제한 에피토프는 HLA-A0201이며, 이는 모든 백인의 약 39-46%에서 발현되고 따라서, TCR 또는 다른 MHC-펩타이드 결합 분자를 제조하는데 사용하기 위한 MHC 항원의 적합한 선택을 의미한다.
컴퓨터 예측 모델을 사용한 프로테아솜 및 면역 프로테아솜에 대한 HLA-A0201 결합 모티프 및 절단 부위는 공지되어 있다. MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 상기 모델은 ProPred1(Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001에 보다 상세하게 기재됨) 및 SYFPEITHI(Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007 참조)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은 하나 이상의 특질이 변경된 재조합으로 생산된 천연 단백질 또는 이의 돌연변이 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 인간, 마우스, 래트 또는 기타 포유동물과 같은 다양한 동물 종 중 하나에서 유래될 수 있다. TCR은 세포 결합 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법의 목적을 위해, TCR은 세포의 표면 상에 발현된 세포 결합 형태이다.
일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 이량체 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일 사슬 TCR(sc-TCR)이다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR은 문헌[WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186]에 기술된 바와 같은 구조를 가지고 있다.
일부 구현예에서, TCR은 막관통 서열에 해당하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 해당하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3과 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는 임의의 TCR은 T 세포 표면 상에 활성 TCR을 생성하는 신호 전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포의 표면 상에 발현된다.
일부 구현예에서 dTCR은 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포외 서열에 해당하는 서열의 N 말단에 융합된 제1 폴리펩타이드 및 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 서열이 TCR β 사슬 불변 영역 세포외 서열에 해당하는 N 말단 서열에 융합된 제2 폴리펩타이드를 함유하고, 제1 및 제2 폴리펩타이드는 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 이 결합은 천연 이량체 αβ TCR에 존재하는 천연 사슬 간 이황화물 결합에 해당할 수 있다. 일부 구현예에서, 사슬 간 이황화물 결합은 천연 TCR에 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인이 dTCR 폴리펩타이드 쌍의 불변 영역 세포외 서열에 편입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화물 결합이 모두 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 고정하는 막관통 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 이 불변 α 도메인의 C-말단에 부착된 제1 이량체화(dimerization) 모티프를 함유하는 TCR α 사슬, 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 이 불변 β 도메인의 C-말단에 부착된 제2 이량체화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬을 함유하고, 여기에서 제1 및 제2 이량체화 모티프는 용이하게 상호작용하여 TCR α 사슬과 TCR β 사슬을 서로 연결하는 제1 이량체화 모티프에 있는 아미노산과 제2 이량체화 모티프에 있는 아미노산 사이에서 공유결합을 형성한다.
일부 구현예에서, TCR은 scTCR이다. 전형적으로, scTCR은 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wulfing, C. and Pl
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ckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); 국제 출원 공개 번호 WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; 및 Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996) 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 도입된 비천연 사슬 간 이황화물 결합을 함유하여 TCR 사슬의 회합을 용이하게 한다(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO 03/020763 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 비이황화물 연결 절단형 TCR이며 여기에서 이종 루신 지퍼(heterologous leucine zipper)가 이의 C-말단에 융합하여 사슬 결합을 촉진한다(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO99/60120 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 펩타이드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유적으로 연결된 TCRα 가변 도메인을 함유하고 있다(예를 들어, 국제 출원 공개 번호 WO99/18129 참조).
일부 구현예에서, scTCR은 TCR α 사슬 가변 영역에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제1 분절, TCR β 사슬 불변 도메인 세포외 서열에 해당하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제2 분절, 및 제2 분절의 N 말단에 제1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제1 분절 및 β 사슬 세포외 불변 서열의 N 말단에 융합된 β 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 분절 및 막관통 서열 및 임의적으로 제2 분절의 N 말단에 제1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제1 분절 및 α 사슬 세포외 불변 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 분절 및 막관통 서열 및 임의적으로 제2 분절의 N 말단에 제1 분절의 C 말단을 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 분절을 연결하는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩타이드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 예를 들어, 화학식 -P-AA-P-를 가질 수 있고, 여기서 P는 프롤린이고 AA는 아미노산 서열을 나타내며 여기서 아미노산은 글리신과 세린이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 분절은 이의 가변 영역 서열이 상기 결합을 향해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서, 일부 경우에, 링커는 제1 분절의 C 말단과 제2 분절의 N 말단 사이(또는 그 반대)의 거리를 포괄할 수 있는 충분한 길이를 가지나 표적 리간드와 scTCR의 결합을 차단하거나 감소시킬 정도로 너무 길지 않다. 일부 구현예에서, 링커는 10 내지 45개 아미노산 또는 약 10 내지 약 45개 아미노산, 예컨대 10 내지 30개의 아미노산 또는 26 내지 41개의 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 화학식 -PGGG-(SGGGG) 5-P-을 갖고 여기서 P는 프롤린이고, G는 글리신이고 S는 세린이다(서열 번호: 38). 일부 구현예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS(서열 번호: 39)를 갖는다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를 연결하는 공유 이황화물 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR에서 사슬 간 이황화물 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인이 scTCR 폴리펩타이드의 제1 및 제2 분절의 불변 영역 세포외 서열로 편입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비천연 이황화물 결합이 모두 바람직할 수 있다.
도입된 사슬 간 이황화물 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 구현예에서, 천연 이황화물 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 천연 사슬 간 이황화물 결합을 형성하는 천연 시스테인 중 하나 이상이 다른 잔기, 예컨대 세린 또는 알라닌으로 치환된다. 일부 구현예에서, 도입된 이황화물 결합은 제1 및 제2 분절에 있는 비시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비천연 이황화물 결합은 문헌[국제 출원 공개 번호 WO2006/000830]에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 표적 항원에 대해 (약) 10-5 내지 10-12 M 및 그 안의 모든 개별 수치 및 범위의 평형 결합 상수를 갖는 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 MHC-펩타이드 복합체 또는 리간드이다.
일부 구현예에서, α 및 β 사슬과 같은 TCR을 암호화하는 핵산 또는 핵산들은 PCR, 클로닝 또는 기타 적합한 수단에 의해 증폭되어 적합한 발현 벡터 또는 벡터들로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 숙주를 형질전환하거나 형질주입시키는 데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 및 바이러스와 같이 증식 및 증폭 또는 발현 또는 둘 모두를 위해 설계된 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈(Stratagene, LaJolla, Calif.), pET 시리즈(Novagen, Madison, Wis.), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 또는 pEX 시리즈(Clontech, Palo Alto, Calif.)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에, λG10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4 및 λNM1149와 같은 박테리오파지 벡터도 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있고 식물 발현 벡터에는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터에는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)가 포함된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 사용된다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 벡터가 도입되어야 하는 숙주 유형(예를 들어, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물)에 특이적인 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은 조절 서열을, 벡터가 DNA 기반인지 또는 RNA 기반인지 고려하여 적절한 것으로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 TCR 또는 항원 결합 부분(또는 다른 MHC-펩타이드 결합 분자)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 시토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터 및 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴 말단 반복에서 발견되는 프로모터와 같은 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터일 수 있다. 기타 공지된 프로모터도 고려된다.
일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 벡터를 생성하기 위해, α 및 β 사슬은 관심 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 단리된 총 cDNA로부터 PCR 증폭되고 발현 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 동일한 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 상이한 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, 생성된 α 및 β 사슬은 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스, 벡터로 편입된다.
B. 유전자 조작을 위한 핵산, 벡터 및 방법
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포는 재조합 수용체를 발현하도록 유전자 조작된다. 일부 구현예에서, 조작은 재조합 단백질 또는 그 일부나 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것에 의해 수행된다. 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 핵산 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터 또는 작제물이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 수용체의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 함유한다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 재조합 수용체의 발현을 제어하도록 작동 가능하게 연결된 2개, 3개 이상의 프로모터를 함유한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드가 도입되어야 하는 숙주 유형(예를 들어, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물)에 특이적인 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은 조절 서열을, 폴리뉴클레오타이드가 DNA 기반인지 또는 RNA 기반인지 고려하여 적절한 것으로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 프로모터, 증진인자, 인트론, 폴리아데닐화 신호, Kozak 공통서열, 내부 리보솜 유입점(IRES), 2A 서열 및 스플라이스 수용체 또는 도너와 같은 조절/제어 요소를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 재조합 수용체 및/또는 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA pol I, pol II 또는 pol III 프로모터 중에서 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II(예를 들어, CMV, SV40 초기 영역 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터)에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 III(예를 들어, U6 또는 H1 프로모터)에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 시토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터 및 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴 말단 반복에서 발견되는 프로모터와 같은 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터일 수 있다. 기타 공지된 프로모터도 고려된다.
일부 구현예에서, 프로모터는 구성 프로모터(constitutive promoter)이거나 이를 포함한다. 예시적인 구성 프로모터에는 예를 들어 시미안 바이러스 40 초기 프로모터(SV40), 시토메갈로 바이러스 즉석 초기 프로모터(CMV), 인간 유비퀴틴 C 프로모터(UBC), 인간 신장 인자 1α 프로모터(EF1α), 마우스 포스포글리세린산 키나아제 1 프로모터(PGK) 및 CMV 초기 증진인자와 결합한 치킨 β-액틴 프로모터(CAGG)가 포함된다. 일부 구현예에서, 구성 프로모터는 합성 또는 변형 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 골수증식 육종바이러스 증진인자가 있는 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터인 MND 프로모터이거나 이를 포함한다(Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755 참조). 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터이다. 일부 구현예에서, 예시적인 프로모터에는 인간 신장 인자 1 알파(EF1α) 프로모터 또는 이의 변형된 형태 또는 MND 프로모터가 포함될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 프로모터는 조절된 프로모터(예를 들어, 유도성 프로모터)이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터 또는 억제성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 Lac 작동유전자 서열, 테트라사이클린 작동유전자 서열, 갈락토스 작동유전자 서열 또는 독시사이클린 작동유전자 서열을 포함하거나 또는 이의 유사체이거나 Lac 억제인자 또는 테트라사이클린 억제인자 또는 이의 유사체에 의해 결합되거나 인식될 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 조절 요소, 예를 들어, 프로모터를 포함하지 않는다.
일부 경우에, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 일부 측면에서, 신호 서열은 천연 폴리펩타이드로부터 유래된 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 다른 측면에서, 신호 서열은 서열 번호: 41에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되고 서열 번호: 40에 제시된 GMCSFR 알파 사슬의 예시적인 신호 펩타이드와 같은 이종 또는 비천연 신호 펩타이드를 암호화할 수 있다. 일부 경우에, 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 비제한적인 예시적 신호 펩타이드에는 예를 들어, 서열 번호: 40에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되고 서열 번호: 40에 제시된 GMCSFR 알파 사슬 신호 펩타이드 또는 서열 번호: 42에 제시된 CD8 알파 신호 펩타이드가 포함된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 추가 폴리펩타이드, 예를 들어, 하나 이상의 마커(들) 및/또는 하나 이상의 작동체(effector) 분자를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 마커(들)는 형질도입 마커, 대리 마커 및/또는 선택 마커를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 도입된 추가 핵산 서열 중에는 예컨대 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선할 수 있는 핵산 서열; 예컨대 생체 내 생존 또는 국소화를 평가하기 위한 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 마커를 제공하기 위한 핵산 서열; 문헌[Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); and Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기술된 바와 같이 예를 들어 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 핵산 서열이 포함되고; 또한 우성의 양성 선택 가능한 마커를 음성 선택 가능한 마커와 융합시켜 유래된 2작용성 선택 가능한 융합 유전자의 용도를 기술하는 문헌[WO 1992008796 및 WO 1994028143와 미국 특허 번호 6,040,177]을 참조한다.
일부 구현예에서, 마커는 형질도입 마커 또는 대리 마커이다. 형질 도입 마커 또는 대리 마커는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입 마커는 세포의 변형을 나타내거나 확인할 수 있다. 일부 구현예에서, 대리 마커는 재조합 수용체, 예를 들어 CAR과 함께 세포 표면 상에 공-발현(co-expressed)되도록 제조된 단백질이다. 특정 구현예에서, 상기 대리 마커는 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않도록 변형된 표면 단백질이다. 특정 구현예에서, 대리 마커는 재조합 수용체를 암호화하는 동일한 폴리뉴클레오타이드 상에 암호화된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열은, 임의적으로 내부 리보솜 유입점(IRES)에 의해 분리되는, 마커를 암호화하는 핵산 서열에 또는 자가 절단 펩타이드 또는 2A 서열과 같은 리보솜 스키핑을 일으키는 펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 외인성 마커 유전자는 일부 경우에 세포의 검출 또는 선택을 허용하도록 조작된 세포와 관련하여 사용될 수 있고, 일부 경우에 세포 제거 및/또는 세포 자살을 촉진하도록 조작된 세포와 관련하여 또한 사용될 수 있다.　
예시적인 대리 마커는 비기능적이며 신호 또는 일반적으로 전장 형태의 세포 표면 폴리펩타이드에 의해 전달되는 신호를 전달할 수 없거나 전달하지 않고/거나 내재화될 수 없거나 내재화되지 않는 절단 형태와 같은 세포 표면 폴리펩타이드의 절단 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 절단된 세포 표면 폴리펩타이드는 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 2(tHER2), 절단된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR, 서열 번호: 43 또는 44에 제시된 예시적인 tEGFR 서열) 또는 전립선-특이적 막 항원(PSMA) 또는 절단된 PSMA(tPSMA)와 같은 이의 변형 형태와 같은 성장 인자 또는 다른 수용체의 절단 형태를 포함한다. 일부 측면에서, tEGFR은 항체 세툭시맙(Erbitux®) 또는 다른 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유할 수 있으며, 이는 tEGFR 작제물 및 암호화된 외인성 단백질로 조작된 세포를 확인 또는 선택하기 위해 및/또는 암호화된 외인성 단백질을 발현하는 세포를 제거 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다. 문헌 미국 특허 번호 8,802,374 및 Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434를 참조한다. 일부 측면에서, 마커(예를 들어, 대리 마커)에는 CD34의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단 형태), NGFR, CD19 또는 절단된 CD19(예를 들어, 절단된 비-인간 CD19)가 포함된다. 절단된 EGFR(예를 들어, tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩타이드는 서열 번호: 43 또는 44에 제시된 아미노산 서열 또는 서열 번호: 43 또는 44에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체, 코돈-최적화된, 안정화된 및/또는 강화된 변이체를 포함하여, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 예컨대 슈퍼-폴드 GFP(super-fold GFP, sfGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청록 형광 단백질(blue green fluorescent protein, BFP), 강화된 청색 형광 단백질(EBFP) 및 노랑 형광 단백질(YFP) 및 이들의 변이체와 같은 형광 단백질과 같은 검출 가능한 단백질이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 루시퍼라아제, 대장균(E. Coli)의 lacZ 유전자, 분비 배아 알칼리 포스파타아제(SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT)와 같은 효소이거나 이를 포함할 수 있다. 예시적인 발광 리포터 유전자에는 루시퍼라아제(luc), β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-글루쿠로니다아제(GUS) 또는 이들의 변이체가 포함된다. 일부 측면에서, 효소의 발현은 효소의 발현 및 기능적 활성 시 검출될 수 있는 기질의 첨가에 의해 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 마커는 내성 마커 또는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 외인성 제제 또는 약물에 대한 내성을 부여하는 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 포유류 세포에 대해 항생제 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 내성 마커 또는 선택 마커는 퓨로마이신 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자, 블라스티사이딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 게네티신 내성 유전자 또는 제오신 내성 유전자 또는 이들의 변형된 형태이거나 이를 포함한다.
본원에 기술된 임의의 재조합 수용체 및/또는 추가 폴리펩타이드(들)는 임의의 조합, 방향 또는 배열에서 재조합 수용체를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 함유하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들어, 하나, 둘 또는 셋 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나, 둘 또는 셋 이상의 상이한 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합 수용체, 또는 이의 부분 또는 성분, 및/또는 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들), 예를 들어, 마커 및/또는 이펙터 분자를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR, 또는 이의 부분 또는 성분 암호화하는 핵산 서열, 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나의 벡터 또는 작제물은 재조합 수용체, 예를 들어 CAR, 또는 이의 부분 또는 성분을 암호화하는 핵산 서열을 함유하고, 그리고 개별 벡터 또는 작제물은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 핵산 서열은 두 개의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 핵산의 업스트림에 존재한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산은 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 핵산의 다운스트림에 존재한다.
특정 경우에, 하나의 폴리뉴클레오타이드는 둘 이상의 상이한 폴리펩타이드 사슬, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열, 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)(예를 들어, 마커 및/또는 작동체 분자)를 함유한다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 상이한 폴리펩타이드 사슬, 예를 들어 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열, 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)가 두 개의 개별 전이 유전자 서열에 존재한다. 예를 들어, 두 개의 개별 폴리뉴클레오타이드가 제공되고, 각각은 세포내 발현을 위해 세포로 개별적으로 전달되거나 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 및 마커를 암호화하는 핵산 서열은 세포의 게놈 내의 상이한 위치에 존재하거나 이에 삽입된다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 및 마커를 암호화하는 핵산 서열은 2개의 상이한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드가 제1 및 제2 핵산 서열을 함유하는 것과 같이 각각의 상이한 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 코딩 서열은 동일하거나 상이할 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 둘 이상의 상이한 폴리펩타이드 사슬의 발현을 구동하는 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 핵산 분자는 다중 시스트론(이중 시스트론 또는 삼중 시스트론, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,060,273 참조)일 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 서열 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 임의적으로 내부 리보솜 유입점(IRES) 또는 자가 절단 펩타이드 또는 2A 요소와 같은 리보솜 스키핑을 일으키는 펩타이드를 암호화하는 핵산에 의해 분리된다. 예를 들어, 예시적인 마커 및 임의적으로 리보솜 스키핑 서열 서열은 문헌[국제 출원 공개 번호 WO2014031687]에 개시된 바와 같은 어느 하나일 수 있다.
일부 구현예에서, 전사 단위는 단일 프로모터로부터의 메시지에 의해 (예를 들어, 재조합 수용체 및 추가 폴리펩타이드를 암호화하는) 유전자 산물의 동시 발현을 허용하는 IRES를 함유하는 이중 시스트론 단위로 조작될 수 있다. 대안적으로, 일부 경우에, 단일 프로모터는 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)에 자가-절단 펩타이드(예를 들어, 2A 서열) 또는 프로테아제 인식 부위(예를 들어, 푸린)를 암호화하는 서열에 의해 서로 분리된, 2 개 또는 3 개의 유전자(예를 들어, 마커 암호화 및 재조합 수용체 암호화)를 함유하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다. 따라서, ORF는 번역 동안(2A의 경우) 또는 번역 후에 개별 단백질로 가공되는 단일 폴리펩타이드를 암호화한다. 일부 경우에, T2A와 같은 펩타이드는 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩타이드 결합의 합성을 건너뛰도록(리보솜 스키핑) 유발할 수 있으며, 이는 2A 서열의 말단과 다음 펩타이드 하부 사이의 분리로 이어진다(예를 들어, 문헌[de Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) and de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)] 참조). 다양한 2A 요소가 공지되어 있다. 본원에 개시된 방법 및 시스템에 사용될 수 있는 2A 서열의 예에는 문헌[미국 특허 공개 번호 20070116690]에 기술된 바와 같은 구제역 바이러스(F2A, 예를 들어, 서열번호: 45), 말 비염 A 바이러스(E2A, 예를 들어, 서열번호: 46), 토세아 아시그나 바이러스(T2A, 예를 들어, 서열번호: 47 또는 48) 및 돼지 테스코 바이러스-1(P2A, 예를 들어, 서열번호: 49 또는 50)이 있으며, 하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 및/또는 폴리펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내에 함유되거나 하나 이상의 벡터(들)에 클로닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터(들)가 숙주 세포, 예를 들어, 조작을 위한 세포를 형질변환하거나 형질주입할 수 있다. 예시적인 벡터로는 플라스미드 및 바이러스 벡터와 같이 도입, 증식 및 증폭 또는 발현 또는 둘 모두를 위해 설계된 벡터가 포함된다. 일부 측면에서, 벡터는 발현 벡터, 예를 들어 재조합 발현 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈(Stratagene, LaJolla, Calif.), pET 시리즈(Novagen, Madison, Wis.), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 또는 pEX 시리즈(Clontech, Palo Alto, Calif.)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에, λG10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4 및 λNM1149와 같은 박테리오파지 벡터도 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있고 식물 발현 벡터에는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터에는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)가 포함된다.
일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 및/또는 추가 폴리펩타이드(들)을 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터, 또는 트랜스포손을 통해 세포에 도입된다(예를 들어, 문헌[Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy 18:1748-1757; and Hackett et al. (2010) Molecular Therapy 18:674-683] 참조).
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(들)는, 예를 들어, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV)로부터 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(들)는 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 도입된다(예를 들어 문헌[Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557] 참조).
일부 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 측면에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(long terminal repeat sequence, LTR), 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수증식 육종바이러스(myeloproliferative sarcoma virus, MPSV), 뮤린 배아줄기세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus, MESV), 뮤린 줄기세포 바이러스(murine stem cell virus, MSCV), 비장 병소 형성 바이러스(spleen focus forming virus, SFFV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(AAV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터를 갖는다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유래된 것을 포함한다. 레트로바이러스는 통상적으로 인간을 포함하여 몇몇 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미하는, 암포트로픽(amphotropic)이다. 일 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스의 gag(객), pol(폴) 및/또는 env(엔브) 서열을 대체한다. 수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 문헌[예를 들어, 미국 특허 번호 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109]에 기재되어 있다.
렌티바이러스 형질도입 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌[Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; 및 Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체 및 하나 이상의 추가 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 예컨대 레트로바이러스 형질 도입, 형질 감염 또는 형질 전환에 의해 배양된 세포를 함유하는 조성물로 도입된다.
일부 구현예에서, 하나 이상 폴리뉴클레오타이드(들)는 전기 천공법을 사용하여 T 세포 내로 도입된다(예를 들어, 문헌[Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo et al (2000] Gene Therapy 7(16):1431-1437] 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위(transposition)를 통해 T 세포로 전달된다(예를 들어, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126. 참조). 면역 세포에서 유전 물질, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 및/또는 벡터를 면역 세포에 도입하고 발현시키는 다른 방법에는 인산칼슘 형질감염(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y]에 기재된 바와 같음); 원형질체 융합, 양이온성 리포솜-매개 형질감염; 텅스텐 입자 촉진 미세 입자 충격(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 인산스트론튬 DNA 공동 침전(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)) 및 다른 접근, 예컨대 문헌[국제특허 출원번호 WO2014055668, 및 미국 특허 번호 7,446,190]에 기재된 바와 같은 것이 포함된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 및/또는 추가 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(들) 또는 벡터(들)은 증폭 도중 또는 후에 세포, 예를 들어, T 세포에 도입될 수 있다. 상기 전이 폴리뉴클레오타이드(들) 또는 벡터(들)의 도입은 예를 들어 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 이어서 그 결과로 생성된 유전자 조작된 세포는 초기 자극(예를 들어, 항-CD3/항-CD28 자극)으로부터 유리될 수 있으며, 후속적으로 제2 유형의 자극(예를 들어, 새로이 도입된 재조합 수용체를 통해)의 존재 하에서 자극될 수 있다. 상기 제2 유형의 자극은 새로운 수용체의 프레임워크 내에서 직접 결합하는(예를 들어, 수용체 내의 불변 영역을 인식함으로써) 유전자 도입된 수용체의 펩타이드/MHC 분자, 즉 동종(가교 결합) 리간드(예를 들어, CAR의 천연 항원 및/또는 리간드) 또는 임의의 리간드(예컨대 항체) 형태의 항원 자극을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cheadle et al, “Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy” Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 또는 Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)]을 참조한다.
일부 경우에, 세포, 예를 들어, T 세포가 활성화되는 것이 필요하지 않은 벡터를 사용할 수 있다. 일부 상기의 경우에, 세포는 활성화되기 전에 선택 및/또는 형질도입될 수 있다. 따라서, 세포는 세포 배양 이전에 또는 이후에 조작될 수 있고, 일부 경우에는 배양의 적어도 일부와 동시에 또는 그 동안에 조작될 수 있다.
Ⅴ. 조성물, 제형 및 투여 방법
자극 및 선택된 세포, 선택적으로 유전자 조작된(예를 들어, 조작된 항원 수용체), 예컨대 CAR 또는 TCR, 및 약학 조성물 및 제형을 포함하는 상기 세포를 함유하는 조성물이 또한 제공된다. 또한, 예컨대 질병, 병태, 및 항원이 발현되는 장애의 치료, 검출, 진단 및 예후 방법과 같이 상기 조성물을 사용하는 방법 및 용도가 제공된다.
A. 조성물/제형
용어 “약학적 제형(pharmaceutical formulation)”은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적일 수 있도록 하는 형태이고, 상기 제형이 투여되는 대상체에 허용 가능하지 않을 정도로 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제(preparation)를 지칭한다.
“약학적으로 허용 가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)”는 활성 성분 외의 약학적 제형 안에 있는 성분을 지칭하고, 이는 대상체에 무독성이다. 약학적으로 허용 가능한 운반체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서, 담체의 선택은 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 적합한 제형이 다양하게 존재한다. 예를 들어, 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산 나트륨 및 염화 벤잘코늄을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 2개 이상의 보존제가 혼합되어 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 통상적으로 전체 조성물의 약 0.0001% 내지 약 2 중량%의 양으로 존재한다. 운반체는 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다. 약학적으로 허용 가능한 운반체는 일반적으로 사용된 용량 및 농도에서 수용체에게 무독성이며, 인산염, 구연산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로 헥사놀; 3- 펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 설탕; 나트륨과 같은 염 형성 카운터 이온; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온 계면활성제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 측면에서 완충제는 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는 예를 들어, 구연산, 구연산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2개 이상의 완충제 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 통상적으로 전체 조성물의 약 0.001% 내지 약 4 중량%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법이 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 보다 상세하게 기술되어 있다.
제형 또는 조성물은 또한 세포, 바람직하게는 세포에 상보적인 활성을 가진 것으로 치료될 특정 징후, 질병 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 함유할 수 있으며, 여기서 각각의 활성이 서로 악영향을 미치지 않는다. 상기 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은 화학 요법제, 예를 들어 아스파라기나제, 부술판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 젬시타빈, 히드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등과 같은 다른 약학적 활성제 또는 약물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 항체는 염의 형태, 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 투여된다. 적합한 약학적으로 허용 가능한 산 부가 염은 염산, 브롬화 수소산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산과 같은 무기산 및 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 숙신산 및 아릴술폰산, 예를 들어 p-톨루엔술폰산과 같은 유기산으로부터 유도된 것을 포함한다.
활성 성분은 마이크로캡슐, 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노 입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에 포획될 수 있다. 특정 구현예에서, 약학 조성물은 사이클로덱스트린 포접 복합체와 같은 포접 복합체 또는 리포솜으로서 제형화된다. 리포솜은 특정 조직에 대해 숙주 세포(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 표적화하는 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980) 및 미국 특허 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 및 5,019,369]에 기재된 것과 같은 리포솜 제조에 이용 가능한 방법이 많이 있다.
일부 측면에서 약학 조성물은 치료될 부위의 감작을 유발하기 전에 그리고 충분한 시간을 가지고 조성물의 전달이 발생하도록 시간 방출, 지연 방출 및 서방형 전달 시스템을 채용할 수 있다. 많은 유형의 방출 전달 시스템이 이용 가능하고 공지되어 있다. 상기 시스템은 조성물의 반복 투여를 피할 수 있어서, 대상체와 의사의 편의성을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서 약학 조성물은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량과 같이 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 세포를 함유한다. 일부 구현예에서 치료적 또는 예방적 효능은 치료된 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 병태에 따라 며칠 또는 그 이상에 걸쳐 반복 투여되는 경우, 질병 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 치료가 반복된다. 그러나, 다른 투여량 요법이 유용할 수 있고 결정될 수 있다. 원하는 투여량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다중 볼루스 투여 또는 조성물의 지속적인 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
세포는 표준 투여 기술, 제형 및/또는 디바이스를 사용하여 투여될 수 있다. 조성물의 저장 및 투여를 위해 주사기 및 바이알과 같은 제형 및 디바이스가 제공된다. 세포의 투여는 자가 또는 이종 기원일 수 있다. 예를 들어, 면역 반응성 세포 또는 전구체(progenitor)는 하나의 대상체로부터 수득될 수 있고, 동일한 대상체 또는 상이하고, 양립 가능한 대상체에 투여될 수 있다. 말초 혈액 유래 면역 반응성 세포 또는 이의 자손(예를 들어, 생체 내, 생체 외 시험 또는 시험관 내 유래)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 주사 또는 비경구 투여를 포함하는 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료 조성물(예를 들어, 유전자 변형 면역 반응성 세포를 함유하는 약학 조성물)을 투여할 때, 일반적으로 이는 주사 가능한 단위 투여량 형태(용액, 현탁액, 에멀션)로 제형화될 것이다.
제형에는 경구, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비강내, 볼, 설하 또는 좌약 투여를 위한 것이 포함된다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 비경구적으로 투여된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "비경구(parenteral)"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질 및 복강내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 정맥내, 복강내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서 조성물은 멸균 액체 제제로서, 예를 들어, 등장성 수용액, 현탁액, 에멀션, 분산액 또는 점성 조성물로 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 제제는 일반적으로 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조가 보다 용이하다. 또한, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기가 다소 더 편리하다. 반면에, 점성 조성물은 적절한 점도 범위 내에서 제형화되어 특정 조직과의 보다 긴 접촉 기간을 제공할 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예를 들어, 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 배지일 수 있는 운반체를 포함할 수 있다.
멸균 주사용 용액은 적합한 담체, 희석제 또는 멸균수, 생리 식염수, 포도당, 덱스트로스 등과 같은 부형제와의 혼화물과 같은 용매에 세포를 통합시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물은 또한 냉동 건조될 수 있다. 조성물은 원하는 투여 경로 및 제제에 따라, 습윤제, 분산제 또는 유화제(예를 들어, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향미제, 색소 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 제조를 위하여 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이팅제 및 완충제를 포함한, 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제를 첨가할 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 보장될 수 있다. 주사용 약학적 형태의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 초래될 수 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형품(shaped article), 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체 내 투여에 사용될 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
B. 투여 방법
세포, 집단, 및 조성물 투여의 방법, 및 암을 포함하는 질병, 병태, 및 장애의 치료 또는 예방을 위한 상기 세포, 집단, 및 조성물의 용도가 제공된다. 또한, 세포, 집단 및 조성물의 사용 방법 및 용도, 그리고 암을 포함하는 질병, 병태 및 장애를 치료 또는 예방하기 위한 이러한 세포, 집단 및 조성물의 용도가 제공된다. 특정한 구현예에서, 상기 세포, 집단 및 조성물은 임의의 제공된 방법에 따라서 생산되고 조작된 것들이다. 일부 구현예에서, 세포, 집단 및 조성물은 치료될 특정 질병 또는 질환이 있는 대상체 또는 환자에 예를 들어 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 예컨대 조작된 조성물 및 인큐베이션 및/또는 다른 프로세싱 단계 후 최종 생산 조성물과 같이 제공된 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물은 예를 들어 질병 또는 병태를 가지거나 이에 대한 위험한 처한 대상체에 투여된다. 일부 측면에서, 본 방법은 예컨대 조작된 T 세포에 의해 인식된 항원을 발현하는 암에서 종양 부담을 감소시킴으로써 이에 의해 질병 또는 병태의 하나 이상의 증상을 치료, 예를 들어, 개선한다.
상기 방법 및 용도는 예를 들어, 제공된 방법에 의해서 제조된 세포 및 조성물, 예컨대 인큐베이션 및/또는 다른 프로세싱 단계 후에 조작된 조성물 또는 최종 생산 조성물을 예컨대 암을 포함하는 질병, 병태 또는 장애를 갖는 대상체에게 질병 또는 장애의 치료를 수행하기 위하여 투여하는 것을 포함하는, 치료 방법 및 용도를 포함한다. 용도는 상기 방법 및 치료에서 조성물의 용도, 및 상기 치료 방법을 수행하기 위한 약제의 제조에서 조성물의 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 이를 통해 대상체에서 종양 또는 암과 같은 질병 또는 병태 또는 장애를 치료한다.
입양 세포 요법을 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며 제공된 방법 및 조성물과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법 방법은 예를 들어 문헌[미국 특허 출원 공개 번호 2003/0170238(Gruenberg et al); 미국 특허 번호 4,690,915(Rosenberg); Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)]에 기재되어 있다. 문헌[Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338]을 참조한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “대상체(subject)”는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유동물이며, 통상적으로 인간이다. 일부 구현예에서, 세포, 세포 집단 또는 조성물이 투여되는 대상체, 예를 들어 환자는 포유류, 인간과 같은 전형적인 영장류이다. 일부 구현예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있으며, 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함한 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 설치류와 같은 비영장류 포유 동물이다.
본원에서 사용된 바와 같은 “치료(treatment, treat, treating)”는 질병 또는 병태 또는 장애 또는 이와 관련된 증상, 역효과 또는 결과 또는 표현형의 완전한 또는 부분적인 개선 또는 감소를 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질병의 직접적 또는 간접적인 병리적 결과 중 어느 하나의 감소, 전이 방지, 질병 진행의 속도 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화 및 차도 또는 향상된 예후를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 용어는 질병의 완전한 치료 또는 모든 증상이나 결과에 있어 임의의 증상이나 영향(들)의 완전한 제거를 의미하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 “질병의 발달 지연(delaying development of a disease)”은 질병(예컨대 암)의 발달을 미룸, 방해, 늦춤, 지연, 안정화, 억제 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 상기 지연은 치료 중인 개인 및/또는 질병의 이력에 따라 다양한 시간의 길이일 수 있다. 해당 개인이 질병을 발달시키지 않는다는 점에서 충분하거나 유의미한 지연이 사실상 예방을 포함할 수 있다는 것은 당업자에게는 자명하다. 예를 들면, 전이의 발병과 같이 말기 암이 지연될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 “예방(preventing)”은 질병에 걸릴 성향을 가질 수 있으나 아직 질병으로 진단되지 않은 대상체에서 질병의 발생 또는 재발과 관련하여 예방을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 세포 및 조성물은 질병의 발병을 지연시키거나 질병의 진행을 늦추는 데 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 기능 또는 활성을 “억제(suppress)”한다는 것은 다른 조건과 비교하여 또는 대안적으로 관심 조건 또는 매개변수를 제외하고 달리 동일한 조건과 비교할 때 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는 세포의 부재 시에 종양의 성장 속도에 비해 종양의 성장 속도를 감소시킨다.
제제, 예를 들어 약학적 제형, 세포, 또는 조성물의 “유효량(effective amount)”은 투여의 맥락에서, 치료적 또는 예방적 결과와 같은 원하는 결과를 달성하기 위해 투여량/양에서 및 필요한 기간 동안의 효과적인 양을 지칭한다.
제제, 예를 들어 약학적 제형, 세포의 “치료적 유효량(therapeutically effective amount)”은 예컨대 질병, 질환 또는 장애의 치료 및/또는 치료의 약동학적 또는 약력학적 효과를 위해 원하는 치료적 결과를 달성하기 위한 투여량에서와 필요한 기간 동안의 효과적인 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 대상체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중 및 투여된 세포의 집단과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포 및/또는 조성물을 유효량, 예를 들어 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
“예방적 유효량(prophylactically effective amount)”은 원하는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서와 시간 동안의 효과적인 양을 지칭한다. 반드시는 아니나 통상적으로, 예방 단위 용량이 질병 이전 또는 초기 단계의 대상체에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
치료되는 질병 또는 병태는 항원의 발현이 예를 들어 질병, 병태 또는 장애의 원인, 악화 또는 그렇지 않으면 이에 수반되며, 상기 질병, 병태 또는 장애의 병인과 관련되고/거나 병인에 수반되는 임의의 것일 수 있다. 예시적인 질병 및 병태는 악성 종양 또는 세포의 형질전환(예를 들어, 암), 자가면역 또는 염증성 질환 또는 예를 들어 세균, 바이러스 또는 기타 병원체로 인한 감염성 질환과 관련된 질병 또는 병태를 포함할 수 있다. 치료할 수 있는 다양한 질병 및 병태와 관련된 항원을 포함하는 예시적인 항원들이 상기에 기술되어 있다. 특정 구현예에서, 키메라 항원 수용체 또는 전이 유전자 TCR은 질병 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
따라서, 제공된 방법 및 용도는 입양 세포 요법에 대한 방법 및 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 대상체, 조직 또는 세포, 예컨대, 질병, 병태 또는 장애가 있거나, 이를 가질 위험이 있거나 또는 가질 것으로 의심되는 것에 세포 또는 세포를 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 집단 및 조성물은 치료될 특정 질병 또는 질환이 있는 대상체에 예를 들어 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 또는 조성물은 대상체, 예컨대 질병 또는 병태가 있거나 이를 가질 위험이 있는 대상체에 투여되고, 질병 또는 병태의 하나 이상의 징후를 완화시킨다.
일부 구현예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 자가 전달에 의해 수행되며, 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 상기 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리 및/또는 달리 제조된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 대상체, 예를 들어 치료가 필요한 환자로부터 유래되고, 세포는 단리 및 가공 후에 동일한 대상체에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 요법(예를 들어, 입양 T 세포 요법)은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 세포는 세포 요법을 받을 예정이거나 최종적으로 받은 대상체, 예를 들어 제1 대상체 외의 대상체로부터 단리 및/또는 달리 제조된다. 상기 구현예에서, 이어서 세포는 상이한 대상체, 예를 들어, 같은 종의 제2 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스(HLA class) 또는 수퍼타입(supertype)을 발현한다. 세포는 임의의 적합한 수단에 의해서 투여될 수 있다. 투약 및 투여는 투여가 단기 인지 장기 인지에 따라 부분적으로 좌우될 수 있다. 다양한 투약 스케쥴은 다양한 시점에 걸쳐 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 세포, 또는 세포의 하위-유형의 개별 집단은, 약 1백만 내지 약 1000억 세포의 범위로, 예컨대, 예를 들어, 1백만 내지 약 500억 세포(예를 들어, 약 5백만 세포, 약 2천 5백만 세포, 약 5억 세포, 약 10억 세포, 약 50억 세포, 약 200억 세포, 약 300억 세포, 약 400억 세포 또는 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위), 예컨대 약 1천만 내지 약 1000억 세포(예를 들어, 약 2천만 세포, 약 3천만 세포, 약 4천만 세포, 약 6천만 세포, 약 7천만 세포, 약 8천만 세포, 약 9천만 세포, 약 100억 세포, 약 250억 세포, 약 500억 세포, 약 750억 세포, 약 900억 세포 또는 전술한 수치 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위) 및 일부 경우에 약 1억 세포 내지 약 500억 세포(예를 들어, 약 1억 2천만 세포, 약 2억 5천만 세포, 약 3억 5천만 세포, 약 4억 5천만 세포, 약 6억 5천만 세포, 약 8억 세포, 약 9억 세포, 약 30억 세포, 약 300억 세포, 약 450억 세포) 또는 상기 범위 사이에 있는 임의의 수치 및/또는 대상체의 체중 1킬로그램당 대상체에 투여된다. 또한, 투여량은 질병 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 특수한 속성에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 다른 치료적 개입, 예컨대 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 제제, 예컨대 세포 독성제 또는 치료제와 예컨대 동시에 또는 순차적으로, 임의 순서로 병용 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시이든 순차적이든 임의의 순서로 공동-투여된다. 일부 맥락에서, 세포는 세포의 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 강화하도록(또는 그 역으로 강화하도록) 충분히 가까운 시점에 다른 요법과 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제보다 앞서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 제제는 예를 들어, 지속성을 향상시키기 위해 IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 화학적 치료제의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서 세포의 투여 후에, 조작된 세포의 집단의 생물학적 활성이 예를 들어, 공지된 다수의 방법 중 하나에 의해 측정된다. 평가 매개변수는 생체 내에서, 예를 들어 영상화에 의해 또는 생체 외 시험에서, 예를 들어 ELISA 또는 유세포 분석에 의해 항원에 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포를 특이적으로 결합하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 예를 들어 문헌[Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)]에 기재된 세포 독성 분석과 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 CD 107a, IFNγ, IL-2 및 TNF의 발현 및/또는 분비를 분석하여 측정된다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하 감소와 같은 임상 결과를 산정하여 측정한다.
특정 구현예에서, 조작된 세포는 이들의 치료적 또는 예방적 효능이 증가하도록 임의의 다수의 방법으로 추가 변형된다. 예를 들어, 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 표적화 모이어티에 링커를 통해 직접적으로든 간접적으로든 접합될 수 있다. 화합물, 예를 들어 CAR 또는 TCR을 표적화 모이어티에 접합시키는 실시는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) 및 미국 특허 5,087,616]을 참조한다.
Ⅵ. 키트 및 제조 물품
일부 구현예에서, 장치 또는 제조 물품이 또한 제공된다. 임의의 제공된 방법의 수행을 위한 친화도 크로마토그래피 매트릭스인 정지 상을 포함하는 장치가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상은 크로마토그래피 컬럼에 포함된다. 상기 배열은 제1 정지 상과 유체적으로 연결된 제2 정지 상을 더 포함한다. 상기 제2 정지 상은 겔 여과 매트릭스 및/또는 친화도 크로마토그래피 매트릭스일 수 있고, 상기 겔 여과 매트릭스 및/또는 친화도 크로마토그래피 매트릭스는 선택 시약을 포함하며, 이로써 정지 상에 다량체화 시약을 고정시키는데 적합하다. 이러한 유형의 배열은 표적 세포(예를 들어, T 세포, CD4, CD3, CD8 T 세포) 순차적 선택을 용이하게 할 수 있으며, 여기서 컬럼 중 하나는 본원에 기술한 바와 같은 온-컬럼 자극에 또한 적합할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 장치는 크로마토그래피(예컨대, 컬럼 크로마토그래피)를 위한 친화도 크로마토그래피인 정지 상을 포함한 배열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상은 이의 상에 고정된, 본원에 기술된 바와 같은 선택 시약을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 배열은 본원에 기술된 바와 같이 병행으로 선택 및 온-컬럼 자극을 위한 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 컬럼 크로마토그래피)를 위해 2개의 정지 상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 배열은 본원에 기술된 바와 같이 순차적 선택 및 온-컬럼 자극을 위한 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 컬럼 크로마토그래피)를 위해 2개의 정지 상을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 배열은 병행 및 순차적 선택, 온-컬럼 자극 , 또는 연마를 수행하기 위해 배열될 수 있는 2개 초과의 컬럼을 포함한다. 예를 들어, 병행으로 2개 컬럼은 컬럼의 산출이 순차 선택을 위한 컬럼에 공급되도록 배열될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 장치는 (예컨대, 상술한 것과 같은) 정지 상 및 세탁과 정지 상으로부터 수집된 선택 및 자극된 세포를 세척 및 형질도입하기 위한 디바이스(예컨대, 원심분리 챔버)의 배열을 포함한다.
본 발명은 또한 정제(예를 들어, 선택 및 온-컬럼 자극) 및 조성물의 세포를 배양, 예를 들어 자극 또는 증폭하기 위한 장치에 관한 것이며 , 상기 장치는 적어도 하나의 바이오리액터 및 상기 정의된 바와 같은 크로마토그래피를 위한 제1 정지 상 또는 제2 정지 상을 포함한다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피를 위한 정지 상과 바이오리액터의 배열이 제공된다. 상기 바이오리액터는 세포의 증폭에 적합하고, 상기 정지 상은 세포의 분리 및 온-컬럼 자극에 적합하다. 에를 들어, 상기 정지 상으로부터 선택 및 자극된 세포는 세척, 형질도입될 수 있고, 증폭을 위해 바이오리액터에 배치될 수 있다. 구현예에서, 상기 정지 상은 겔 여과 매트릭스 및/또는 친화도 크로마토그래피 매트릭스일 수 있고, 상기 겔 여과 매트릭스 및/또는 친화도 크로마토그래피 매트릭스는 선택 시약을 포함하며, 상기 선택 시약은 선택 제제에 포함된 결합 파트너 C1에 특이적으로 결합하는 결합 부위 Z1을 포함하고/거나 상기 선택 시약은 제2 자극제에 포함된 결합 파트너 C2에 특이적으로 결합하는 결합 부위 Z2를 포함한다. 상기 정지 상은 이로써 이의 상에 제1 자극제 및/또는 제2 자극제, 제1 결합 파트너 C1 및/또는 제2 결합 파트너 C2를 고정시키기에 적합하며, 제1 추가적으로 상기 바이오리액터 및 상기 정지 상은 유체적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상은 세척 및 형질도입 단계를 위한 디바이스를 통해서 바이오리액터에 연결될 수 있다. 상기 배열은 연속 증폭에 사용될 수 있고 예를 들어 Quantum® 세포 증폭 시스템 or the Xuri Cell 증폭 시스템 W25와 같은 증폭 시스템으로 공지된 것에 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 바이오리액터는 세포 건강 및 표현형을 모니터하기 위하여(섹션 I-E-3a 참조) 예를 들어 Ovizio iLine F (Ovizio 이미징 시스템 NV/SA, 브뤼셀, 벨기에)과 같은 디바이스에 연결될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 상기 배열은 연마(섹션 I-I 참조)를 위한 정지 상을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 정지 상은 크로마토그래피(예컨대, 컬럼 크로마토그래피)를 위한 친화도 크로마토그래피이다. 일부 구현예에서, 연마를 위한 상기 o 정지 상은 세포 선택을 용이하게 하기 위해서 이의 상에 고정된, 본원에 기술된 바와 같은 선택 시약을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 배열은 연마, 제형화, 및 본원에 기술된 바와 같이 치료 조성물을 적합한 컨테이너에 충진시키기 위한 디바이스(예를 들어, 원심분리 챔버)를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 배열을 위한 구성요소들은 튜브에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 배열을 위한 구성요소들은 용접에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 배열의 구성요소 간 연결(예를 들어, 튜브 및/또는 용접)은 무균이다.
일부 구현예에서, 상기 배열은 장치에서 구현된다. 상기 장치는 직렬로 유체 연결되는 생물 반응기 및 정지 상의 복수의 배열을 추가로 포함할 수 있다.
상기 장치는 크로마토그래피(예를 들어, 선택 및 온-컬럼 자극)를 위한 정지 상에 유체적으로 연결된 샘플 유입구를 포함한다. 상기 장치는 정제(예를 들어, 선택된) 및 자극된 표적 세포를 위한 샘플 배출구를 또한 포함할 수 있고, 상기 샘플 배출구는 크로마토그래피를 위한 하나 이상의 바이오리액터와 정지 상의 배열의 마지막 정지 상에 유체적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 장치는 조작된 T 세포(예를 들어, 치료 세포 조성물)가 적합한 컨테이너에 충진될 수 있게 하는 출구를 더 포함한다. 마지막으로, 상기 장치는 기능적으로 폐쇄 시스템으로서 설계될 수 있다.
Ⅶ. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는 청구된 주제가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원에 상기 정의를 포함하는 것이 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태(“a”, “an” 및 “the”)는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, 단수 형태(“a” 또는 “an”)는 “적어도 하나(at least one)” 또는 “하나 이상(one or more)”을 의미한다. 본 명세서에 기재된 측면 및 변형은 측면 및 변형으로 “구성되는(consisting)” 및/또는 “필수적으로 구성되는(consisting essentially of)”을 포함하는 것으로 이해된다.
본 개시 전체에서, 청구된 주제의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위 범위 및 상기 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우, 상기 범위의 상한 내지 하한 사이 각각의 사이에 오는 값과 상기 언급된 범위에서 임의의 다르게 언급되거나 사이에 오는 값은 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 상기 더 작은 범위의 상한 내지 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계를 조건으로 청구된 주제 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 상기 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 청구된 주제에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본원에 사용된 용어 “약(about)”은 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 “약(about)”의 값 또는 매개변수에 대한 언급은 상기 값 또는 매개변수 자체에 관한 구현예를 포함(기술)한다. 예를 들어, “약 X”를 지칭하는 기재는 “X”의 기재를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치가 서열 목록에 제시된 것과 같은 개시 된 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치에 "해당(correspond to)"한다는 기재는 GAP 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘을 사용하여 동일성을 극대화하기 위해 개시된 서열과 정렬시 확인된 뉴클레오티드 또는 아미노산 위치를 지칭한다. 서열을 정렬함으로써, 예를 들어 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 가이드로 사용하여 해당하는 잔기를 확인할 수 있다. 일반적으로, 해당 위치를 확인하기 위해, 아미노산 서열은 가장 높은 순서의 일치가 수득되도록 정렬된다(예를 들어 Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073 참조).
본원에 사용된 바와 같은 용어 “벡터(vector)”는 이에 연결된 다른 핵산을 번식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 및 이것이 도입된 숙주 세포의 유전체에 편입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이것이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 본원에서 “발현 벡터(expression vector)”로 지칭된다. 벡터 중에는 레트로바이러스, 예를 들어 감마레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 있다.
용어 “숙주 세포(host cell)”, “숙주 세포주(host cell line)” 및 “숙주 세포 배양물(host cell culture)”은 상호 교환적으로 사용되며, 상기 세포의 자손을 포함하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 “형질 전환체(transformants)” 및 “형질 전환된 세포(transformed cells)”를 포함하고, 이는 1차 형질 전환 세포 및 계대 수(number of passages)에 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질 전환된 세포에서 선별되거나 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 뮤테인 자손이 본원에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포의 집단이 특정 마커에 대해 “양성(positive)”이라는 진술은 특정 마커, 통상적으로 표면 마커가 세포 상에 또는 세포 내에 검출 가능하게 존재함을 지칭한다. 표면 마커를 언급할 때, 상기 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 이 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 존재를 지칭하며, 이 염색은 달리 동일한 조건 하에서 동종형-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유세포 분석에 의해 검출 가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포의 집단이 특정 마커에 대해 “음성(negative)”이라는 진술은 특정 마커, 통상적으로 표면 마커가 세포 상에 또는 세포 내에 실질적으로 검출 가능하게 존재하지 않음을 지칭한다. 표면 마커를 언급할 때, 상기 용어는 유세포 분석에 의해, 예를 들어, 이 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써 검출된 바와 같은 표면 발현의 부재를 지칭하며, 이 염색은 달리 동일한 조건 하에서 동종형-매칭된 대조군으로 같은 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 상위 수준에서 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 낮은 수준에서 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 비교하여 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 분석에 의해 검출되지 않는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “아미노산 서열 동일성 백분율(percent (%) amino acid sequence identity)” 및 “동일성 백분율(percent identity)”이 아미노산 서열(기준 폴리펩타이드 서열)에 대하여 사용될 때, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고 최대 백분율의 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하다면 갭을 도입한 후 기준 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열(예를 들어, 대상체 항체 또는 단편) 내 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 다양한 공지된 방법으로 달성될 수 있다. 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수는 비교되는 서열의 전장에 대한 최대 정렬 달성을 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 결정될 수 있다.
아미노산 치환은 폴리펩타이드에서 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환일 수 있다. 아미노산 치환은 관심 결합 분자(예를 들어, 항체)에 도입될 수 있고, 그 산물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별된다.
아미노산은 일반적으로 하기와 같은 공통적인 측쇄(side-chain) 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르루신(Norleucine), Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
일부 구현예에서, 보존적 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤버를 동일한 클래스의 다른 멤버로 교환하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비보존적 아미노산 치환은 상기 클래스 중 하나의 멤버를 다른 클래스로 교환하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 조성물은 세포를 포함하여 둘 이상의 산물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “대상체(subject)”는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유동물이며, 통상적으로 인간이다.
Ⅷ. 예시적인 구현예
제공된 구현예 중에는 하기가 있다:
1. T 세포의 온-컬럼 자극 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 복복수의 T 세포 중 하나 이상의 T 세포에 자극신호를 전달하기 위한 하나 이상의 자극제와 함께 정지 상에 고정된 복수의 T세포를 인큐베이션 하는 단계-상기 정지 상은 상기 하나 이상의 T 세포의 표면상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 선택 제제를 포함하며, 여기서 하나 이상의 T 세포에 의해 발현되는 상기 선택 마커에 대한 상기 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 상기 하나 이상의 T 세포의 고정에 영향을 미침-; 및
(b) 상기 인큐베이션 개시 24시간 내에, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가 없이 중력 흐름에 의하여 상기 정지 상으로부터 상기 하나 이상의 T 세포를 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 함유한 조성물을 생성시키는 단계를 포함한다.
2. 구현예 1의 방법에서, 상기 정지 상은 하나 이상의 T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제 중 적어도 하나를 포함한다.
3. 구현예 2의 방법에서, 상기 적어도 하나의 자극제는 제1자극제이고, 상기 정지 상은 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형 시킬 수 있는 하나 이상의 제2 자극제를 더 포함한다.
4. 구현예 2의 방법에서, 상기 자극제는 제1자극제이고, 여기서 상기 인큐베이션 전에 상기 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형시킬 수 있는 하나 이상의 제2 자극제를 포함하는 자극 시약을 상기 정지 상에 첨가한다.
5. 구현예 1의 방법에서, 상기 인큐베이션 전에 상기 정지 상에 자극 시약을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 자극 시약은 상기 하나 이상의 자극제 중 적어도 하나를 포함한다.
6. 구현예 5의 방법에서, 상기 하나 이상의 자극제는 제1자극제이고, 상기 하나 이상의 자극제는 상기 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형시킬 수 있는 제2 자극제를 더 포함한다.
7. 구현예 1-6 중 어느 한 방법에서, 상기 하나 이상의 자극제 중 적어도 하나인, 선택적으로 상기 제1 자극제는 자극 신호를 전달할 수 있고, 상기 자극 신호는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체, T 세포에서 CD3-함유 복합체, 및/또는 T 세포에서 ITAM-함유 분자를 통한 것이다.
8. 구현예 3,4,6 및 7 중 어느 한 방법에서, 상기 제2 자극제는 상기 하나 이상의 T 세포 상에 공동자극분자에 특이적으로 결합할 수 있다.
9. T 세포의 온-컬럼 자극 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 정지 상에 복수의 T 세포를 포함하는 샘플을 첨가하여, 이로써 상기 정지 상에 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 고정시키는 단계-상기 정지 상은 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 표면 상의 선택 마커에 결합하는 선택 제제를 포함함-;
(b) 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상에서 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제를 포함하는 자극 시약을 상기 정지 상에 첨가하여, 이로써 하나 이상 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계; 및
(c) 상기 인큐베이션 개시 24시간 내에, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가 없이 중력 흐름에 의하여 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성시키는 단계를 포함한다.
10. T 세포의 온-컬럼 자극 방법으로서, 상기 방법은:
(1) (a) 복수의 T 세포를 포함하는 샘플 및 (b) 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 표면 상에 발현된 선택 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 선택 제제를 포함하는 정지 상을 조합하는 단계-여기서 상기 선택 마커에 대한 상기 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 상기 복수의 T 세포의 고정에 영향을 미침-;
(2) T 세포에서 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제를 포함하는 자극 시약을 상기 정지 상에 첨가하여, 이로써 상기 하나 이상 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계; 및
(3) 상기 인큐베이션 개시 24시간 내에, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가 없이 중력 흐름에 의하여 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성시키는 단계를 포함한다.
11. T 세포의 온-컬럼 자극의 방법으로서, 상기 방법은 복수의 고정된 T 세포를 포함하는 정지 상에 올리고머 자극 시약을 첨가하여, 이로써 상기 복수의 고정된 T 세포 중 하나 이상의 T 세포와 함께 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계를 포함하며, 여기서:
상기 정지 상은 하나 이상의 T 세포의 표면상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 선택 제제를 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 T 세포에 의해 발현되는 상기 선택 마커에 대한 상기 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 상기 하나 이상의 T 세포의 고정에 영향을 미치고; 및
상기 올리고머 자극 시약은 (i) 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 (ii) 하나 이상의 T 세포에서 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 선택 제제를 포함하고, 여기서 상기 올리고머 자극 시약의 크기는 i) 50 nm 초과 반경, ii) 적어도 5 x 106 g/mol의 분자량; 및/또는 (iii) 올리고머 자극 시약 당 적어도 100 개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함한다.
12. 구현예 11의 방법에서, 상기 인큐베이션 개시 24시간 내에, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가 없이 중력 흐름에 의하여 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성시키는 단계를 더 포함한다.
13. 구현예 1-10 또는 12 중 어느 한 방법에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시의 약 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 시간 이내에 일어난다.
14. 구현예 1-10,12, 또는 13의 방법에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시의 약 2 내지 24, 3 내지 24, 4 내지 24, 5, 내지 24, 6 내지 24, 7 내지 24, 8 내지 24, 9 내지 24, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 13 내지 24, 14 내지 24, 15 내지 24, 16 내지 24, 17 내지 24, 18 내지 24, 19 내지 24, 20 내지 24, 21 내지 24, 22 내지 24, 23 내지 24, 2 내지23, 2 내지 22, 2 내지 21, 2 내지 20, 2 내지 19, 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 2 내지 15, 2 내지 14, 2 내지 13, 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 2 내지 3 시간 이내에 일어난다.
15. 구현예 1-10 또는 12-14 중 어느 한 방법에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시의 약 12, 10, 8, 6, 4, 또는 2 시간 이내에 일어난다.
16. 구현예 1-10 또는 12-15 중 어느 한 방법에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시의 5시간 이내에 일어난다.
17. 구현예 1-10 또는 12-16 중 어느 한 방법에서, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시의 4시간 이내에 일어난다.
18. 구현예 9, 10, 및 13-17 중 어느 한 방법에서, 상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 포함하는 샘플을 정지 상에 첨가하거나 또는 정지 상과 함께 조합시킨 후 (약) 10분 이내, (약) 20분 이내, (약) 30분 이내, (약) 45분 이내, (약) 60분 이내, (약) 90분 이내 또는 (약) 120분 이내에 수행된다.
19. 구현예 9-18 중 어느 한 방법에서, 하나 이상의 자극제 중 적어도 하나는 자극 신호를 전달할 수 있고, 상기 자극 신호는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체, T 세포에서 CD3-함유 복합체, 및/또는 T 세포에서 ITAM-함유 분자를 통한 것이다.
20. 구현예 19의 방법에서, 상기 적어도 하나의 자극제는 제1자극제이고, 상기 자극 시약은 상기 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형 시킬 수 있는 하나 이상의 제2 자극제를 더 포함한다.
21. 구현예 3, 4, 6 및 20 중 어느 한 방법에서, 상기 제2 자극제는 하나 이상의 T 세포 상에 공동자극분자에 특이적으로 결합할 수 있다.
22. 구현예 21의 방법에서, 상기 공동자극분자는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 또는 HVEM 중으로부터 선택된 것이다.
23. 구현예 21 또는 22의 방법에서, 상기 제2 자극제는 CD28에 특이적으로 결합할 수 있다.
24. 구현예 3, 4, 6, 7, 및 20-23 중 어느 한 방법에서, 상기 제1 자극제는 CD3에 특이적으로 결합하고, 상기 제2 자극제는 CD28에 특이적으로 결합한다.
25. 구현예 1-24 중 어느 한 방법에서,
상기 자극제는 항체 단편, 1가 항체 단편, 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자, Ig 도메인을 함유하는 분자, 사이토카인, 케모카인, 압타머, MHC 분자, MHC-펩타이드 복합체; 수용체 리간드; 및 이의 결합 단편;으로 이루어진 군에서 선택된 것이거나 이를 포함하고; 및/또는
상기 자극제는 항체 단편을 포함하고;
상기 자극제는 Fab 단편이거나 이를 포함하며;
상기 자극제는 (Fab)2’-단편 및 2가 단일-사슬 Fv (scFv) 단편의 군으로부터 선택된 2가 항체 단편이고;
상기 자극제는 Fab 단편, Fv 단편, 및 scFvs로 이루어진 군에서 선택된 1가 항체 단편이며; 및/또는
상기 자극제는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩타이드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)로 이루어진 군으로부터 선택된, 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 결합 분자이다.
26. 구현예 3, 4, 6, 7 또는 20-24 중 어느 한 방법에서, 여기서:
상기 제1 및 제2 자극제는 독립적으로 항체 단편, 1가 항체 단편, 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자, Ig 도메인을 함유하는 분자, 사이토카인, 케모카인, 압타머, MHC 분자, MHC-펩타이드 복합체; 수용체 리간드; 및 이의 결합 단편;으로 이루어진 군에서 선택된 제제이거나 이를 포함하고; 및/또는
상기 제1 및 제2 자극제는, 독립적으로, 항체 단편을 포함하며;
상기 제1 및 제2 자극제는, 독립적으로, Fab 단편이거나 이를 포함하고;
상기 제1 및 제2 자극제는, 독립적으로, (Fab)2’-단편 및 2가 단일-사슬 Fv (scFv) 단편의 군으로부터 선택된 2가 항체 단편이며;
상기 제1 및 제2 자극제는, 독립적으로, Fab 단편, Fv 단편, 및 scFvs로 이루어진 군에서 선택된 1가 항체 단편이고; 및/또는
상기 제1 및 제2 자극제는, 독립적으로, 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩타이드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)로 이루어진 군으로부터 선택된, 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 결합 분자이다.
27. 구현예 3, 4, 6, 7, 20-24, 및 26 중 어느 한 방법에서, 상기 제1 자극제는 항-CD3 Fab이고, 상기 제2 자극제는 항-CD28 Fab이다.
28 . T 세포의 온-컬럼 자극 방법으로서, 상기 방법은 복수의 고정된 T 세포를 포함하는 정지 상에 T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 올리고머 자극 시약을 첨가하여, 이로써 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계-여기서:
상기 정지 상은 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브세트의 표면 상에 선택 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 선택 제제를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브세트에 의해 발현된 선택 마커에 대한 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 상기 적어도 복수의 T 세포의 고정에 영향을 미치며, 여기서 상기 선택 제제는 CD3, CD4, 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택된 선택 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이며;
상기 올리고머 자극 시약은 (i) 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자, (ii) 하나 이상의 T 세포에서 자극 신호를 전달할 수 있고, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편인 제1 자극제, 및 (iii) 상기 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형시킬 수 있고, CD28에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편인 제2 자극제를 포함하며, 상기 올리고머 자극 시약의 크기는 i) 50 nm 초과의 반경, ii) 적어도 5 x 106 g/mol의 분자량; 및/또는 (iii) 올리고머 자극 시약 당 적어도 100 개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함함-; 및
상기 인큐베이션 개시 24시간 내에, 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제의 첨가 없이 중력 흐름에 의하여 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성시키는 단계를 포함한다.
29. 구현예 25의 방법에서,
상기 자극제는 비오틴, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체, Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드, 칼모듈린에 가역적으로 결합하는 칼모듈린 결합 펩타이드, 항체 결합 FLAG 펩타이드에 가역적으로 결합하는 FLAG 펩타이드, 및 항체 결합 올리고히스티딘 태그(tag)에 가역적으로 결합하는 올리고히스티딘 태그를 더 포함한다.
30. 구현예 26의 방법에서, 여기서:
상기 제1 자극제 및 상기 제2 자극제는, 독립적으로, 비오틴, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체, Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드, 칼모듈린에 가역적으로 결합하는 칼모듈린 결합 펩타이드, 항체 결합 FLAG 펩타이드에 가역적으로 결합하는 FLAG 펩타이드, 및 항체 결합 올리고히스티딘 태그에 가역적으로 결합하는 올리고히스티딘 태그를 더 포함한다.
31. 구현예 1-30 중 어느 한 방법에서, 상기 선택 제제는 항체 단편, 1가 항체 단편, 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자, Ig 도메인을 함유하는 분자, 사이토카인, 케모카인, 압타머, MHC 분자, MHC-펩타이드 복합체, 수용체 리간드, 및 이의 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 제제이거나 이를 포함하며; 및/또는
상기 선택 제제는 항체 단편을 포함하고;
상기 선택 제제는 Fab 단편이거나 이를 포함하며;
상기 선택 제제는 (Fab)2’-단편 및 2가 단일-사슬 Fv (scFv) 단편으로 이루어진 2가 항체 단편의 군으로부터 선택된 것이고;
상기 선택 제제는 Fab 단편, Fv 단편, 및 scFvs로 이루어진 군에서 선택된 1가 항체 단편이며; 및/또는
상기 선택 제제는 압타머(aptamer), 리포칼린(lipocalin) 패밀리의 폴리펩타이드에 기초한 뮤테인(mutein), 글루바디(glubody), 안키린(ankyrin) 스캐폴드에 단백질, 결정성 스캐폴드에 기초한 단백질, 아드넥틴(adnectin) 및 아비머(avimer)로 이루어진 군으로부터 선택된, 항체 유사 결합 특성을 가진 단백질성 결합 분자이다.
32. 구현예 31의 방법에서, 상기 선택 제제는 비오틴, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체, Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드, 칼모듈린에 가역적으로 결합하는 칼모듈린 결합 펩타이드, 항체 결합 FLAG 펩타이드에 가역적으로 결합하는 FLAG 펩타이드, 및 항체 결합 올리고히스티딘 태그(tag)에 가역적으로 결합하는 올리고히스티딘 태그를 더 포함한다.
33. 구현예 1-32 중 어느 한 방법에서,
상기 선택 마커는 T 세포 공수용체(coreceptor)이며;
상기 선택 마커는 T 세포 항원 수용체 복합체의 멤버이거나 이를 포함하고;
상기 선택 마커는 CD3 사슬이거나 이를 포함하며;
상기 선택 마커는 CD3 제타 사슬이거나 이를 포함하고;
상기 선택 마커는 CD8이거나 이를 포함하며;
상기 선택 마커는 CD4이거나 이를 포함하고;
상기 선택 마커는 CD45RA이거나 이를 포함하며;
상기 선택 마커는 CD27이거나 이를 포함하고;
상기 선택 마커는 CD28이거나 이를 포함하며; 및/또는
상기 선택 마커는 CCR7이거나 이를 포함한다.
34. 구현예 1-33 중 어느 한 방법에서,상기 선택 제제 및 선택 마커 간 특이적 결합은 T 세포에 대한 신호를 유도하지 않거나, 또는 자극 또는 활성화 또는 증식 신호를 유도하지 않는다.
35. 구현예 1-34 중 어느 한 방법에서, 상기 선택 제제는 항-CD3 Fab, 항-CD8 Fab 또는 항-CD4 Fab이다.
36. 구현예 2 및 5-35 중 어느 한 방법에서, 상기 제2 자극 시약은 가용성이다.
37. 구현예 2 및 5-36 중 어느 한 방법에서, 여기서:
상기 자극 시약은 고체 지지체, 정지 상, 비드, 마이크로입자, 자성입자, 및/또는 매트릭스가 아니고, 이에 결합되거나 이와 연합되지 않으며; 및/또는
상기 시약은 가요성이고, 금속 또는 자성 코어를 함유하지 않으며, 전체적으로 또는 주로 유기 다량체를 포함하고/거나 단단하지 않다.
38. 구현예 2 및 5-10 및 12-37 중 어느 한 방법에서, 상기 자극 시약은 비오틴, 비오틴 유사체 또는 이의 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 뮤테인; 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 뮤테인; 적어도 2개의 킬레이팅 작용기 K를 함유하는 시약, 여기서 상기 적어도 2개의 킬레이트 작용기는 전이금속 이온에 결합할 수 있음; 올리고히스티딘 친화성 태그(affinity tag)에 결합할 수 있는 제제; 글루타치온-S-전이효소에 결합할 수 있는 제제; 칼모듈린 또는 이의 유사체; 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP)에 결합할 수 있는 제제; FLAG-펩타이드에 결합할 수 있는 제제; HA-태그에 결합할 수 있는 제제; 말토오스 결합 단백질(MBP)에 결합할 수 있는 제제; HSV 에피토프에 결합할 수 있는 제제; myc 에피토프에 결합할 수 있는 제제; 또는 비오티닐화된 수송 단백질에 결합할 수 있는 제제이거나 또는 이를 포함한다.
39. 구현예 2, 5-10, 및 12-38 중 어느 한 방법에서, 여기서:
상기 자극 시약은 비오틴 또는 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비단 뮤테인이거나 이를 포함하고;
상기 자극 시약은 비오틴 유사체 또는 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비단 뮤테인이거나 이를 포함하며; 및/또는
상기 자극 시약은 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비단 뮤테인이거나 이를 포함한다.
40. 구현예 2, 5-10, 및 12-39 중 어느 한 방법에서, 상기 자극 시약은 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 자극 시약이며, 여기서 상기 올리고머 자극 시약의 크기는 i) 50 nm 초과의 반경, ii) 적어도 5 x 106 g/mol의 분자량; 및/또는 (iii) 올리고머 입자로 시약 당 적어도 100 개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함한다.
41. 구현예 11 또는 40 인 방법에서, 상기 올리고머 자극 시약은 가용성이다.
42. 구현예 11, 40 또는 41인 방법에서, 여기서:
상기 올리고머 자극 시약은 고체 지지체, 정지 상, 비드, 마이크로입자, 자성입자, 및/또는 매트릭스가 아니고, 이에 결합되거나 이와 연관되지 않으며; 및/또는
상기 시약은 가요성이 있고, 금속 또는 자성 코어를 함유하지 않으며, 전체적으로 또는 주로 유기 다량체를 포함하고/거나 단단하지 않다.
43. 구현예 11 또는 40-42 중 어느 한 방법에서, 상기 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하거나 또는 가역적으로 결합할 수 있다.
44. 구현예 38-43 중 어느 한 방법에서,
상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47 인 아미노산 서열을 포함;하거나
상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 Va144-Thr45-Ala46-Arg47인 아미노산 서열을 포함한다.
45. 구현예 38, 39, 43, 또는 44 중 어느 한 방법에서, 상기 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(서열 번호: 17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호:16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
46. 구현예 11 또는 40-45 중 어느 한 방법에서, 상기 올리고머 입자의 시약은:
60nm 초과, 70nm 초과, 80nm 초과, 또는 90nm 초과의 반경을 포함한다.
47. 구현예 11 또는 40-46 중 어느 한 방법에서, 상기 올리고머 입자의 시약은:
50 nm 및 150 nm 사이, 75 nm 및 125 nm 사이, 80 nm 및 115 nm 사이, 또는 90 nm 및 110 nm 사이의 반경(수치 포함); 또는
90 nm ±15 nm, 또는 95 nm ±20-25nm의 반경을 포함한다.
48. 구현예 11 또는 40-47 중 어느 한 방법에서, 상기 반경은 유체역학적 반경이다.
49. 구현예 11 또는 40-48 중 어느 한 방법에서, 올리고머 입자 시약은 적어도 5 x 107 g/mol, 또는 적어도 1 x 108 g/mol; 및/또는 5 x 107 g/mol 및 5 x 108 g/mol 사이, 1 x 108 g/mol 및 5 x 108 g/mol 사이, 또는 1 x 108 g/mol 및 2 x 108 g/mol 사이의 분자량을 포함한다.
50. 구현예 11 또는 40-49 중 어느 한 방법에서, 상기 올리고머 입자 시약은 적어도 500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 적어도 1,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 적어도 1,500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 또는 적어도 2,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머; 및/또는
1,000 내지 20,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 1,000 내지 10,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 또는 2,000 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함한다.
51. 구현예 1-50 중 어느 한 방법에서, 상기 선택 제제는 상기 정지 상에 직접 또는 간접적으로 결합된다.
52. 구현예 1-51 중 어느 한 방법에서, 상기 선택 제제는 상기 선택 제제가 가역적으로 결합하는 선택 시약을 통해서 상기 정지 상에 간접적으로 결합된다.
53. 구현예 51 또는 52인 방법에서, 상기 선택 시약은 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 뮤테인으로서 비오틴, 비오틴 유사체 또는 이의 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 것; 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 뮤테인; 적어도 2개의 킬레이팅 작용기 K를 함유하는 시약, 여기서 상기 적어도 2개의 킬레이트 작용기는 전이금속 이온에 결합할 수 있음; 올리고히스티딘 친화성 태그(affinity tag)에 결합할 수 있는 제제; 글루타치온-S-전이효소에 결합할 수 있는 제제; 칼모듈린 또는 이의 유사체; 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP)에 결합할 수 있는 제제; FLAG-펩타이드에 결합할 수 있는 제제; HA-태그에 결합할 수 있는 제제; 말토오스 결합 단백질(MBP)에 결합할 수 있는 제제; HSV 에피토프에 결합할 수 있는 제제; myc 에피토프에 결합할 수 있는 제제; 또는 비오티닐화된 수송 단백질에 결합할 수 있는 제제이거나 또는 이를 포함한다.
54. 구현예 51-53 중 어느 한 방법에서,
상기 선택 시약은 비오틴 또는 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비단 뮤테인이거나 이를 포함하고;
상기 자극 시약은 비오틴 유사체 또는 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비단 뮤테인이거나 이를 포함하며; 및/또는
상기 자극 시약은 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비단 뮤테인이거나 이를 포함한다.
55. 구현예 53 또는 54인 방법에서, 상기 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하거나 또는 가역적으로 결합할 수 있는 것이다.
56. 구현예 53-55 중 어느 한 방법에서,
상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47 인 아미노산 서열을 포함;하거나
상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 Va144-Thr45-Ala46-Arg47인 아미노산 서열을 포함한다.
57. 구현예 53-54 중 어느 한 방법에서, 상기 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호:16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
58. 구현예 1-10 또는 12-57 중 어느 한 방법에서, 상기 수집은 상기 정지 상을 배지로 세척하는 것을 포함하고, 상기 배지는 상기 정지 상으로부터 T 세포를 용리시키기 위한 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제(free binding agent)를 함유하지 않는다.
59. 구현예 1-10 또는 12-58 중 어느 한 방법에서, 상기 수집은 상기 자극된 T 세포를 포함하는 조성물을 인큐베이션 하는 것을 더 포함한다.
60. 구현예 59의 방법에서,
상기 추가 인큐베이션은 (약) 37 ºC ± 2 ºC에서 수행되며; 및/또는 상기 추가 인큐베이션은 T 세포에 신호를 전달할 수 있는 추가 제제의 존재 하에서 수행된다.
61. 구현예 60의 방법에서, 상기 추가 제제는 상기 정지 상을 세척하기 위해 사용되는 상기 배지에 포함된다.
62. 구현예 60 또는 61인 방법에서, 상기 추가 제제는 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 강화 또는 유도할 수 있다.
63. 구현예 60-62 중 어느 한 방법에서, 상기 추가 제제는 IL-2, IL-15 및 IL-7 중에서 선택된 사이토카인이다.
64. 구현예 59-63 중 어느 한 방법에서, 상기 추가 인큐베이션은 72시간, 48시간 이하, 24시간 이하, 또는 12시간 이하의 시간 동안 수행된다.
65. 구현예 1-64 중 어느 한 방법에서, 재조합 핵산 분자-여기서 핵산 분자는 재조합 단백질을 암호화함-를 상기 조성물의 상기 자극된 T 세포에 도입시키고, 이로써 형질 도입된 T 세포를 포함하는 조성물을 생산하는 단계를 더 포함한다.
66. 구현예 65의 방법에서, 상기 재조합 단백질은 항원 수용체이다.
67. 구현예 65의 방법에서, 상기 재조합 단백질은 키메라 항원 수용체이다.
68. 구현예 67의 방법에서, 상기 키메라 항원 수용체(CAR)는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
69. 구현예 68의 방법에서, 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포 내 도메인을 포함한다.
70. 구현예 68 또는 69항인 방법에서, 상기 세포외 도메인 및 상기 세포내 신호 전달 도메인을 연결시키는 막관통 도메인을 더 포함한다.
71. 구현예 70의 방법에서, 상기 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 포함한다.
72. 구현예 68-71 중 어느 한 방법에서, 상기 세포내 신호 전달 도메인은 T 세포 공동자극분자의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다.
73. 구현예 72의 방법에서, 상기 T 세포 공동자극분자는 CD28 및 41BB로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
74. 구현예 65-73 중 어느 한 방법에서, 상기 핵산은 재조합 항원 수용체를 암호화 하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 더 포함한다.
75. 구현예 65-74 중 어느 한 방법에서, 상기 재조합 핵산의 도입은 바이러스 입자로 형질도입에 의해 달성된다.
76. 구현예 75인 방법에서, 상기 바이러스 입자는 레트로바이러스 벡터 입자이다.
77. 구현예 75인 방법에서, 상기 바이러스 입자는 렌티바이러스 벡터 입자이다.
78. 구현예 65-73 중 어느 한 방법에서, 바이러스 통합을 위한 조건 하에서 형질도입된 세포를 포함하는 상기 조성물을 배양하고, 이로써 배양된 T 세포를 포함하는 조성물을 생산하는 것을 더 포함한다.
79. 구현예 75-78 중 어느 한 방법에서, T 세포를 증폭시키기 위한 조건 하에서 형질도입된 세포를 포함하는 상기 조성물을 배양하는 단계를 더 포함한다.
80. 구현예 79의 방법에서, 상기 배양은 14일 이하, 12일 이하, 10일 이하, 8일 이하 또는 6일 이하의 시간 동안 수행된다.
81. 구현예 59-64 중 어느 한 방법에서, 상기 자극된 T 세포를 함유하는 상기 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하여, 이로써 가역적 결합(들)을 파괴하는 단계를 더 포함한다.
82. 구현예 65-77 중 어느 한 방법에서, 상기 형질도입된 T 세포를 함유하는 상기 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하여, 이로써 가역적 결합(들)을 파괴하는 단계를 더 포함한다.
83. 구현예 78-80 중 어느 한 방법에서, 상기 배양된 T 세포를 함유하는 상기 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하여, 이로써 가역적 결합(들)을 파괴하는 단계를 더 포함한다.
84. 구현예 81-83 중 어느 한 방법에서, 상기 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제는 T 세포에 대해 해롭지 않고/거나 여기서 상기 물질의 첨가는 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제 없이 비교가능하거나 또는 동일한 조건 하에서 상기 T 세포의 인큐베이션에 대비해 생존 T 세포의 백분율을 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 또는 50% 미만으로 감소시키지 않는다.
85. 구현예 81-84 중 어느 한 방법에서, 상기 파괴는 상기 T 세포에서 상기 자극 신호를 종결시키거나 감소시킨다.
86. 구현예 81-85 중 어느 한 방법에서, 상기 경쟁 시약 및 자유 결합 제제는 독립적으로 스트렙타비딘-결합 분자; 비오틴; D-비오틴; 비오틴 유사체; 야생형 스트렙타비딘의 44 내지 47 위치에 상응하는 서열 위치에 아미노산 서열 Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47을 가지는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 유사체에 특이적으로 결합하는 비오틴 유사체; 또는 서열 번호: 1, 4, 5, 및 7에 제시된 서열을 포함하거나 이의 서열로 이루어진 펩타이드; 또는
상기 경쟁 시약 및 자유 결합 제제는 독립적으로 선택적으로 EDTA 또는 EGTA인, 금속 킬레이트제를 포함한다.
87. 구현예 1-77 중 어느 한 방법에서, 상기 T 세포는 항원-특이적 T 세포 또는 이의 집단, 도움 T 세포 또는 이의 집단, 세포독성 T 세포 또는 이의 집단, 기억 T 세포 또는 이의 집단, 또는 조절 T 세포 또는 이의 집단을 포함한다.
88. 구현예 1-87 중 어느 한 방법에서, 상기 T 세포는 CD3+ T 세포를 포함하거나 CD4+ T 세포 및/또는 CD8 T 세포를 포함한다.
89. 구현예 1-88 중 어느 한 방법에서, 상기 정지 상은 크로마토그래피 매트릭스이거나 이를 포함한다.
90. T 세포 온-컬럼 자극을 위한 제조 물품으로서, 상기 제조 물품은:
(a) T 세포 표면 상의 제1 분자 및 제2분자에 각각 특이적으로 결합하여 이로써 T 세포를 자극할 수 있는 제1 자극제 및 제2자극제; 및
(b) T 세포 상의 선택 마커에 특이적으로 결합하여 이로써 상기 정지 상에 상기 T 세포를 고정시킬 수 있는 선택 제제를 포함하는 정지 상;을 포함한다.
91.구현예 90의 제조 물품에서, 상기 정지 상은 제1 자극제 및 제2자극제를 더 포함한다.
92. 구현예 90 또는 91인 제조 물품에서, 상기 제1 자극제, 상기 제2 자극제, 및 상기 선택 제제는 선택 시약을 통해서 정지 상에 간접적으로 결합된다.
93. 구현예 90인 제조 물품에서, 자극 시약을 더 포함하며, 상기 제1 자극제 및 제2 자극제는 가역적으로 결합하거나 결합할 수 있다.
94. 구현예 90인 방법에서, 상기 선택 제제는 선택 시약을 통해서 상기 정지 상에 간접적으로 결합된다.
95. 구현예 90-94 중 어느 한 제조 물품에서, 상기 정지 상은 크로마토그래피 매트릭스이거나 이를 포함하며, 여기서 상기 제조 물품은 크로마토그래피 매트릭스가 전부 또는 일부 함유된 컨테이너를 더 포함한다.
96. 장치는 구현예 90 내지 95 중 어느 하나의 상기 제조 물품을 포함한다.
97. 구현예 96의 장치에서, 상기 장치의 하나 이상의 구성요소에 유체적으로 연결되는 유체 입구 및/또는 상기 장치의 하나 이상의 구성요소에 유체적으로 연결되는 유체 출구를 더 포함한다.
98. 구현예 96 또는 97인 상기 장치는, 폐쇄된 또는 멸균 시스템에 있다.
99. 구현예 96-98 중 어느 한 장치 또는 구현예 90-95 중 어느 한 제조 물품에서, 구현예 1-89 중 어느 한 방법에 사용되기 위한 것이며, 상기 방법은 선택적으로 자동화된 방식으로 수행된다.
Ⅸ. 실시예들
하기 실시예들은 예시적인 목적으로만 포함되며 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다.
실시예1: 스트렙타비딘 뮤테인을 포함하는 항-CD3/항-CD28 Fab 컨쥬게이션된 올리고머 시약 제조방법
올리고머 시약은, 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인 지정 STREP-TACTIN® M2(서열 번호: 6에 제시된 아미노산의 뮤테인 서열을 함유하는 스트렙타비딘 동질-테트라머, 예를 들어, 문헌[미국 특허 번호 6,103,493 및 Voss and Skerra (1997) Protein Eng., 1:975-982 및 Argarana et al. (1986) Nucleic Acids Research, 1871-1882] 참조)를 중합하여 제조되었다. 올리고머화를 위한 스트렙타비딘 뮤테인을 제조하기 위해, 하나 이상의 반응성 티올기를 함유하는 스트렙타비딘 뮤테인을 말레이미드 활성화 스트렙타비딘 뮤테인과 인큐베이션했다. 티올화 스트렙타비딘 뮤테인을 제조하기 위해, 약 100 mg의 스트렙타비딘 뮤테인이, 2-이미노티올란 히드로클로라이드와 1:100의 몰비로, 약 8.5의 pH에서, 24 ℃에서 1 시간 동안, 100 mM 보레이트 완충제에서 2.6 mL의 총 부피로 인큐베이션에 의해 티올화되었다. 활성화 반응을 위해, 약 400 mg의 스트렙타비딘 뮤테인이, 숙신이미딜-6-[(β-말레이미도프로피온아미도) 헥사노에이트(SMPH)와 1:2의 몰비로 약 7.2의 pH에서, 24 ℃에서 1 시간 동안, 약 10.4 mL의 총 부피로 인산 나트륨 완충제에서 인큐베이션 되었다. 티올화 및 활성화 반응이 대략 동시에 시작되도록 조정했고 반응의 지속 기간을 제어하였다.
반응 후, 2-이미노티올란 염산염 및 SMPH는, PD-10 탈염 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 샘플의 겔 여과를 개별적으로 수행함으로써 샘플에서 제거되었다. 각각의 2.5 mL 부피 샘플에 대해, 1 mL의 PD-10 컬럼을 평형화시켰고, 티올화 뮤테인 스트렙타비딘 또는 말레이미드(maelimdie) 뮤테인 스트렙타비딘을 로딩하고, 3.5 mL의 결합 완충제(100 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.2)를 첨가하여 용출을 수행했다. 말레이미드 뮤테인 스트렙타비딘의 겔 여과를 10mL 부피를 고려하여 4개의 컬럼에서 수행했고, 용출액을 풀링했다. 활성화 및 티올화 반응의 시기 및 활성화 및 티올화 반응의 끝과 올리고머화 반응의 시작 사이의 시기를 신중하게 제어했다. 일반적으로, 겔 여과의 시작부터, 즉 활성화 및 티올화 반응의 끝에서 올리고머화 반응이 개시될 때까지 10분 이내가 허용되었다.
이어서 올리고머화를 위해, 말레이미드 스트렙타비딘 뮤테인 및 티올화 스트렙타비딘 뮤테인 샘플이 약 17.5 mL의 전체 부피로 결합되었고, 약 600 rpm의 교반 조건 하에서 7.2의 pH, 24 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션 되었다. 4배 더 많은 스트렙타비딘 뮤테인이 2-이미노티올란 염산염보다 SMPH과 인큐베이션 되었기 때문에, 티올화 스트렙타비딘 뮤테인과 말레이미드 스트렙타비딘 뮤테인의 몰 비는 올리고머화 반응 중 1:4였다. 반응 후, 올리고머화된 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 나머지 SH기는, N-에틸말레이미드(N-Ethylmaleimide, NEM)와 24 ℃에서 15분 동안 교반(약 600rpm)으로 인큐베이션한 후 4 ℃에서 16-20 시간 동안 더 인큐베이션함으로써 포화되었다.
NEM과 인큐베이션 후, 올리고머화된 스트렙타비딘 뮤테인을 함유한 샘플을 원심분리하였고, 상청액을 0.45 ㎛ 멤브레인(Merck Millopore의 Millex-HP 0.45 ㎛)을 통해 여과하였다. 이어서 여과된 용액을 AKTA Explorer 크로마토그래피 시스템(GE Healthcare)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 위한 컬럼(Sephacryl S-300 HR HiPrep 26/60, GE Healthcare)에 로딩했다. 1500 mAU 이상의 밀리 흡광도 단위(milli absorbance unit(mAU)의 분획이 풀링되었다.
올리고머 스트렙타비딘 뮤테인을 함유한 풀링된 샘플을 실온에서 15 분 동안 6.35의 pH에서 100 mM 히드록실아민으로 처리했다. 처리 후 히드록실아민을 제거하기 위해, 샘플을 PD10 컬럼(컬럼당 2.5mL)에 로딩하고, 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.2를 함유하는 3.5mL의 완충제로 용출하였다. PD10 용출액을 풀링하고, 0.45 ㎛ 필터 후 0.22 ㎛ 필터로 멸균 여과한 뒤 샘플을 동결하고 -80 ℃로 보관하였다. 동결 전에, 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 최종 농도를 측정하고, 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 크기를 동적 광 산란(dynamic light scattering, DLS)에 의해 결정하였다.
올리고머화 프로세스의 일관성을 평가하기 위해, 10개의 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 5개의 상이한 로트의 스트렙타비딘 뮤테인(SAM)으로부터 상기 기재된 방법을 사용하여 제조하였다. 올리고머의 평균 크기, 수율 백분율(기준 보정 없이 280 nm에서 흡광도 측정에 의해 결정됨) 및 활성(비오틴 결합)을 평가하였고, 결과가 표 2에 도시된다. 결과는, 생성된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약이 97 nm ± 10 nm의 평균 반경 및 40 nmol/mg ± 3 nmol/mg의 비오틴 결합으로 상기 파라미터에서 일관됨을 나타냈다.
[상이한 배치(batche)에서 올리고머화된 STREP-TACTIN의 비교]
Figure pct00007
상기 기재된 바와 같이 생성된 3개의 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 평균 분자량(MW)은, UV 검출(MALLS DAWN HELEOS(Wyatt)와 결합된 Agilent UV 검출기)하는 HPLC 시스템(AGILENT 1100 및 Wyatt ECLIPSE DUALTEC)으로 수행된 비대칭 장흐름 분획법(AF4)에 의해 측정되었다. AF4에 의한 측정은 52,500 g/mol(52.5 kDa)의 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머의 평균 분자량을 가정하는 각각의 올리고머 시약에서 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머의 평균수를 계산할 수 있었다(표 3)
반경(nm) MW (g/mol) 테트라머의 수
102 1.65x108 3150
82 1.08 x108 2050
92 1.26 x108 2280
자극제(항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편)는 상기 기재된 바와 같이 생성된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약에 가역적인 결합에 의해 다량체화되었다. 항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편은 각 Fab 단편에 융합된 스트렙타비딘 펩타이드 결합 파트너를 통해 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머에 가역적으로 결합되었다. 항-CD3 Fab 단편은 하이브리도마 세포주 OKT3(ATCC® CRL-8001™; 또한 문헌[미국 특허 번호 4,361,549] 참조)에 의해 생성된 CD3 결합 단클론 항체에서 유래되었고, 문헌[Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996)]에 기재된 항-CD3 항체 OKT3의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 함유했다. 상기 서열은 서열 번호: 31 및 32에 각각 제시된다. 항-CD28 Fab 단편은 항체 CD28.3(GenBank 수탁 번호 AF451974.1 하에 합성 단일 사슬 Fv 작제물로 기탁됨; 또한 문헌[Vanhove et al., BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, 564-570 페이지] 참조)에서 유래되었고, 서열 번호: 33 및 34에 각각 제시된 항-CD28 항체 CD28.3의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유했다. Fab 단편은 중쇄의 카르복시-말단에 아미노산 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16)을 갖는 2개의 스트렙타비딘 결합모듈의 순차적 배열을 함유하는 스트렙타비딘 펩타이드 결합 서열이 개별적으로 융합되었다. 펩타이드 태그 Fab 단편은 재조합으로 생성되었다(국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/011011 및 WO 2013/124474 참조). 가역적 결합을 달성하기 위해, 펩타이드 태그된 항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편은 대략 실온에서 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약과 혼합되었고, 이로써 시약 상의 결합 부위에 가역적으로 결합할 수 있는 결합 파트너인 Fab 단편 상의 쌍-strep-태그 사이 상호 작용을 통해 시약에 상기를 가역적으로 결합시켰다. 일부 경우에, 펩타이드-태그 Fab 단편은 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약 상에 고정되기 전에 미리 혼합되었고, 이는 일부 경우에 상이한 Fab 분자의 보다 균일한 분포를 초래할 수 있다. 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약에 펩타이드-태그 항-CD3 및 항-CD28의 결합은 D-비오틴을 첨가함으로써 파괴되거나 반전될 수 있다. D-비오틴은 스트렙타비딘 뮤테인 상의 결합 파트너에 결합하기 위해 제제 상의 strep-태그와 경쟁하여 결합을 파괴한다.
실시예 2: 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머에 가역적으로 결합된 올리고머화 항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편의 활성 평가
실시예 1에 기재된 프로세스에 의해 표 2에 기재된 각 배치로부터 다양한 올리고머 스트렙타비딘 시약에 가역적으로 결합된 항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편을 T 세포를 자극하는 능력에 대해 평가하였다. 상기 올리고머 스트렙타비딘 시약은 약 95 nm의 평균 반경을 가졌다. 세포 증식의 지표로서 세포의 대사 활성을 안정적인 테트라졸륨염 WST-1의 가용성 포르마잔 염료 복합체로의 절단에 대해 착색 모니터링함으로써 평가하였다.
3개의 상이한 공여자 유래 T 세포를 올리고머 스트렙타비딘 시약에 가역적으로 결합된 항-CD3/항-CD28 다량체화 Fab 단편과 인큐베이션 하였다. 세포를 또한 항-CD3/항-CD28 Fab 단편에 가역적으로 결합되었고, 101(내부 기준) 또는 36 nm의 평균 반경을 가진 대조군 올리고머 시약과 또한 인큐베이션 하였다.
인큐베이션 후, WST-1 시약이 세포에 적용되었고, 대사 활성의 수준이 450 nm에서 판독으로 흡광도를 측정하여 평가되었다. 결과는 평가될 배양 중의 세포 수로 정규화되었고, 세포 수 당 WST-1의 비율로 도시되었다.
도 2b에 도시된 바와 같이, 테스트된 각각의 시약으로 자극된 T 세포의 평균 WST-1 활성을 비교하였다. 또한, 자극의 정도는 모든 테스트된 시약에서 유사했고, 유사한 크기의 내부 기준 시약과 비교되었다(일반적으로 ± 2 표준 편차 내에서 다양함). 도 2a는 각 시약에 대해 별개의 데이터 포인트로 도시된 WST-1 활성을 나타낸다. 도 2a 및 도 2b는, WST-1 활성에 의해 관찰된 바와 같이 T 세포의 자극이 보다 작은 36 nm 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약 백본 상에서 다량체화된 항-CD3/항-CD28 Fab를 사용하여 더 낮았음을 나타낸다.
실시예 3: 컬럼 크로마토그래피를 통한 T 세포의 선택 및 자극
항-CD3/항-CD28 올리고머 자극제의 존재 하에서 온-컬럼 자극으로 컬럼-기반 친화도 크로마토그래피에 의해 T 세포를 농축시키기 위한 연구가 수행되었다.
이 연구에서, Sephadex G50 (Sigma)가 정지 상으로 사용되었고 사이아노젠 브로마이드(CNBr) 활성화 레진을 사용해 STREP-TACTIN® M2 (서열 번호: 6)가 공유결합되었다. Sephadex G50의 50% 현탁액은 대략 70 μg의 공유결합된 7 Strep-tactin®/mL 의 비드 현탁액을 함유했다. STREP-TACTIN®을 정지 상에 고정시킨 후, 고정화된 Strep-tactin® 시약에 Fab 단편의 결합을 허용하기 위하여 Strep-tactin®이 포함된 Sephadex G50 현탁액 2mL를 T 세포 표면 선택 마커에 특이적인 10μg의 선택 제제와 함께 4°C에서 20 분 동안 배양했다. 이후, 바닥에 90 마이크로미터 프릿이있는 플라스틱 미니 컬럼에 현탁액을 채웠다. 컬럼을 0.5 % 소 혈청 알부민(PBSA 완충액)을 함유하는 PBS (인산 완충 식염수)로 평형화하여 1 mL의 충진부피를 제공했다.
이들 연구에서, 항-CD3 결합 Fab 단편, 항 -CD4 결합 Fab 단편, 또는 항 -CD8 결합 Fab 단편을 선택 제제로써 사용하여 실험을 수행하였다. CD3 결합 Fab 단편은 하이브리도마 세포주 OKT3 (ATCC® CRL-8001 ™; 또한 미국 특허 번호 4,361,549 참조)에 의해 생산된 CD3 결합 단클론 항체에서 유래되었으며, 문헌[Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996).]에 기재된 항-CD3 항체 OKT3의 중쇄 가변 도메인 (서열 번호: 31) 및 경쇄 가변 도메인(서열 번호: 32)을 함유했다. 상기 CD4 결합 Fab 단편은 m13B8.2 (예를 들어, 미국 특허 7,482,000)에서 얻었으며, 항-CD4 항체 m13B8.2의 중쇄 가변 도메인 (서열 번호 : 29) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 번호 : 30)을 함유했다. 상기 CD8 결합 Fab 단편은 OKT8 (예를 들어, ATCC CRL-8014)에서 얻었으며, 항 -CD8 항체 OKT8의 중쇄 가변 도메인 (서열 번호: 9) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 번호: 10)을 포함했다. 각각의 Fab 단편의 중쇄는 2 개의 스트렙타비딘 결합 모듈의 순차적 배열을 포함하는 Twin Strep-Tag® (서열 번호: 16)와 카르복시-말단 융합되었다.
인간 공여자의 성분채집술 샘플을 친화도 컬럼에 로드하고 2번 세척 단계를 수행했다. 샘플을 로드한 후 30분 초과 경과한 후, 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약(항-CD3/항-CD28 올리고머 시약)에 가역적으로 결합 된 다량체화된 항-CD3 항-CD28 Fab 단편 40 μg를 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 글루타민 및 재조합 IL-2, IL-15 및 IL-7을 함유하는 3mL의 무혈청 기본 배지에서 컬럼 상에 로딩하고, 37 oC에서 인큐베이션했다. 약 24 시간 후, 결합을 파괴하기 위한 추가 경쟁 물질을 추가하지 않고, 글루타민 및 재조합 IL-2, IL-15 및 IL-7을 포함하는 무혈청 기본 배지 약 80 mL를 컬럼을 통해 통과시키는 단일 단계로 컬럼으로부터 세포를 수집했다. 대조군으로서, 성분채집술 샘플을 항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약의 존재 하에서 인큐베이션 없이 항-CD3 친화도 컬럼에 로딩했다. 대조 조건의 경우, 24 시간 경과 후 항-CD3 Fab의 Twin Strep-Tag®와 STREP-TACTIN® 사이의 결합을 파괴하기 위해서 D- 비오틴을 첨가했고, 방출된 세포를 중력 흐름에 의해 수집했다.
항-CD3/항-CD28 올리고머 시약을 사용한 자극 개시 후 약 24 시간 경과되었을 때, 수집된 세포에 대한 선택 마커의 표면 발현에 대해 평가 하였다. 도 3에 도시 된 바와 같이. CD3, CD4 및 CD8의 하향 조절은 선택 마커에 특이적인 각각의 선택 제제를 사용하여 온-컬럼 선택 및 자극 시약과 함께 인큐베이션 한 후 24 시간에 관찰되었다. 대조적으로, 올리고머 자극 시약과 함께 세포를 인큐베이션 하지 않은 대조군 조건에서는 선택 마커의 수용체 하향 조절이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 항-CD3/항-CD8 자극 시약을 사용하여 T 세포를 자극하면 수용체의 표면 발현이 하향 조절되어, 경쟁 시약을 추가할 필요없이 컬럼에서 세포가 자발적으로 분리된다는 관찰과 일치한다.
T 세포가 항-CD3 STREP-TACTIN® 친화도 컬럼에서 선택되고 위에서 설명한 바와 같은 항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약으로 온-컬럼 자극을 받는 유사한 연구가 수행되었다. 세포는 올리고머 자극 시약을 첨가 한 후 다양한 시간에 중력 흐름에 의해 수집되었다. 수집 된 세포를 알파-베타 TCR 사슬에 대한 항체로 즉시 염색하고 CD3의 표면 발현을 검출하기 위해 유세포 분석으로 모니터링했다. 도 4는 항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약의 존재 하에 자극 개시 후 CD3/TCR 복합체 하향 조절 및 재-발현의 예시적인 동역학을 예시한다. 나타난 바와 같이, CD3/TCR 복합체 표면 발현의 급속한 하향 조절은 자극의 첫 24 시간 동안 관찰되었으며, CD3/TCR 복합체 표면 발현의 최대 감소는 단지 12 시간 후에 관찰되었다. 올리고머 자극 시약의 존재 하에서 36 시간 이상 배양한 결과 자극 시약으로 자극을 개시한 후 약 72 시간 이내에 달성된 최대 CD3/TCR 복합체 표면 재-발현으로 표면 CD3/TCR 복합체가 재발현 되었다. 이러한 결과는 실질적인 온-컬럼 자극-매개된 자발적 T 세포 분리는 4 ~ 6 시간 내에 발생할 수 있으며, 자극 시약으로 온-컬럼 인큐베이션을 시작한 후 약 12 시간에 최대 방출이 발생할 수 있음을 뒷받침한다.
항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약을 첨가 한 후 약24 시간에 자발적으로 분리된 세포를 글루타민과 재조합 IL-2, IL-15 및 IL-7을 포함하는 무혈청 기본 배지에서 37ºC로 최대 9일 동안 인큐베이션 했다. 인큐베이션 동안, 상기 올리고머 자극 시약은 제거되지 않다; 그러나, 그것은 인큐베이션 동안 세포가 계속 증폭함에 따라서 희석되었다. 세포는 CD3 및 활성화 마커 CD69 및 CD25의 크기 및 발현에 대해 후속 인큐베이션 동안 24 시간 및 5 일째에 모니터링 되었다. 도 5a에 도시된 바와 같이. 최대 5 일 동안의 추가 인큐베이션은 24 시간 시점에 관찰된 CD3 조기 하향 조절 후 CD3의 재발현을 초래했다. 또한, 활성화 마커 CD25 및 CD69의 세포 크기 및 표면 발현의 증가도 24 시간 시점과 비교하여 5 일째에 관찰되었다. 최대 9 일 동안의 후속 인큐베이션 후 세포 수 및 증폭 배수에 대한 평가는 자발적으로 분리된 세포가 높은 증식 능력을 나타냄을 보여 주었다(도 5b). 이러한 결과는 온-컬럼 선택 및 단기 자극을 받은 T 세포가 원하는 자극, 활성화 및/또는 증폭을 달성하기 위해 추가로 인큐베이션 될 수 있다는 관찰과 일치한다.
이러한 결과는 조작된 T 세포 조성물을 생산하기 위한 다운스트림 프로세스(예를 들어, 형질 도입) 이전에 또는 이와 관련하여 표적 세포를 단리 및 자극하는 빠른 수단(예를 들어, 24 시간 미만)으로써 온-컬럼 선택 및 자극의 사용을 뒷받침 한다.
실시예 4: 소분자 mTOR 키나아제 억제제의 존재 하에서 생산된 조작된 T 세포의 T 세포 표현형 및 기능 평가
CD4+ 및 CD8+ T 세포는 인간 공여 대상체로부터의 백혈구 성분채집술 샘플로부터 면역 친화도 기반 농축에 의해 단리되었다. 1일째, 단리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 1:1로 혼합하고, 재조합 IL-2 (100 IU/mL), 재조합 IL-7 (600 IU/mL), 및 재조합 IL-15 (100 IU/mL) 로 보충되되, 1μM 의 2-(3-하이드록시페닐)-9-(2-이소프로필페닐)-8-옥소-8,9-디하이드로-7H-퓨린-6-카르복사미드(화합물 63)이 존재하거나 또는 부존재 하는 무혈청 배지에서 실시예 1에 기술된 바와 같이 생성된 항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약으로 자극시켰다. 화합물 63의 존재 또는 부존재로 배양된 T 세포를 37 °C에서 밤새(약 24 시간) 배양한 다음, 항 -CD19 CAR을 암호화 하는 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 화합물 63 (1mM)의 존재 또는 부존재로 무혈청 배양 배지에서 형질 도입했다. 상기 CAR은 CD19(FMC63으로부터 유래)에 특이적인 scFv 항원-결합 도메인, CD28 막관통 영역, 4-1BB 공동자극 신호 전달 영역 및 CD3-제타 유래 세포 내 신호 전달 도메인을 함유했다. 형질 도입 후, 세포를 재조합 사이토카인(기본 배지) 및 화합물 63 (1mM) 유무에 관계없이 무혈청 배지에서 인큐베이션 하고, 다음으로 항-CD3/항-CD28 올리고머 자극 시약으로 자극을 개시한 후(프로세스의 5일까지) 최대 96 시간 동안 인큐베이터에서 약 37.0 ºC에서 인큐베이션했다. 배양 시작 후 약 24 시간(프로세스의 3 일)시점에 1mM 비오틴을 첨가했다. 각 공여자로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 인큐베이션 한 후 수확, 제형화 및 동결하였다.
동결된 조작된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 해동하고, T 세포를 세포 내 S6 인산화, 리보솜 단백질 및 mTOR 억제 마커에 대해 평가했으며, CD4 또는 CD8의 표면 발현과 기억 서브세트의 마커로서 CCR7 및 CD45RA에 대해 공동 염색했다. 도 6a에서 도시된 바와 같이, 기억 서브 세트에 의한 살아 있는 CD8+ T 세포에서의 pS6 발현은 CCR7 및 CD45RA의 발현에 의해 나타났다 도시된 바와 같이, 화합물 63과의 인큐베이션은 자극된 기억 T 세포 서브 세트, Temra, Tem 및 Tcm 세포의 평균 형광 강도를 감소시켰고, 이는 mTOR의 억제를 나타내는 반면, 시간이 지남에 따라 생존가능한 세포의 백분율 또는 총 수에 유의한 영향을 미치지 않았다. CD8+ T 세포에서 PS6의 평균 형광 강도(MFI)를 도 6b에 나타내었다. 도 6c 및 도 6d에 도시된 바와 같이, 화합물 63의 존재는 생성된 조성물에서 각각 생존 가능한 세포 백분율 또는 총 살아있는 세포에 영향을 미치지 않았다.
설명된 프로세스에 의해 생성된 해동된 세포를 세포 사멸 마커(예를 들어, 카스파제 양성 CAR-T 세포의 백분율), 표현형 프로파일 및 PMA/이오노마이신 및 골지 억제제로 자극한 후 세포 내 사이토카인을 생산하는 능력에 대해 평가했다. 도 7a에 도시된 바와 같이, 화합물 63과 함께 인큐베이션된 샘플로부터의 T 세포는 화합물 63과 함께 인큐베이션 되지 않은 것보다 세포 내 카스파제 발현이 더 적었으며, 이는 조작된 세포를 생성하는 프로세스 동안 화합물 63의 존재가 T 세포 조성물의 전체 세포 건강을 개선했음을 나타낸다. 해동된 세포는 또한 유세포 분석에 의해 CD27 및 CCR7의 표면 발현에 대해 염색되었다. 도 7b(CD8+ T 세포) 및 도 7d(CD4+ T 세포)에 도시된 바와 같이, 화합물 63과의 인큐베이션은 CD27 및 / 또는 CCR7의 발현에 의해 평가된 바와 같이 세포의 표현형 서브세트 프로파일을 실질적으로 변경하지 않았다. 세포 내 사이토카인 IL2, IFNg 또는 TNF의 수준에 의해 입증된 바와 같이, 화합물 63의 존재 하에 생산된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 기능적 활성은 조작된 CD8+ T 세포(도 7c) 및 CD4+ T 세포(도. 7e) 모두에서 실질적으로 개선되었다.
세포의 기능적 활성을 추가로 평가하기 위해, 생성된 T 세포 조성물을 항-CD19 CAR에 대한 항-이디오타입(ID) 항체와 컨쥬게이션된 비드로 12 일에 걸쳐 장기간 자극하고, 세포의 증폭 및 생존을 모니터링 했고(도 7f, 왼쪽 패널) 총 증폭 메트릭을 곡선 아래 부분에 의해 계산했다(도 7f, 오른쪽 패널). 도시된 것과 같이, 화합물 63의 부재 하에 세포의 자극은 CAR의 만성적 자극 및 장기간의 자극에 따른 지속적인 기능 상실과 일치하는 시간 경과에 따른 세포의 감소된 증폭을 초래했다. 결과는 화합물 63의 존재 하에 생산된 조작된 세포에서 장기 CAR-특이적 자극 후에 T 세포의 개선된 기능이 관찰되었음을 보여준다.
실시예 5: 결합된 선택 및 온-컬럼 자극 프로세스를 이용한 조작된 T 세포의 표현형 및 기능적 특성 평가
크로마토그래피 컬럼(온-컬럼 선택 및 자극)에서 선택 및 자극 단계를 결합하는 프로세스는 실질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행되었지만 더 큰 규모로 수행되었다. 온-컬럼 선택 및 자극 프로세스는 실질적으로 유사하지만 자극 단계가 선택과 별도로 용액에서 수행되는 대체 프로세스와 비교되었다.
A. 온-컬럼 선택 및 자극
0일차, 인간 공여자로부터 성분채집술 샘플이 사이아노젠 브로마이드(CNBr) 활성화 수지를 사용해 StrepTactin® (서열 번호: 6)이 공유결합된 Sephadex G50 (Sigma) 정지 상을 함유하는 친화도 컬럼 상에 로딩되었다. 상기 20 mL 정지 상은 최대 20 억 ± 5 억 개의 세포를 수용 할 수 있었다. 실시예 3에 기재된 바와 같은 항-CD3 결합 Fab 단편인 선택 제제를 StrepTactin에.결합할 수 있는 중쇄 카르복시-말단 융합된 스트렙타비딘 결합 펩타이드(Twin Strep-Tag®; 서열 번호: 16)를 통해 정지 상에 고정시켰다.
샘플을 로딩한 시간으로부터 약 60분 후, 실시예1에 기술한 바와 같이 생성된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약(항-CD3/항-CD28 올리고머 시약)에 가역적으로 결합된 다량체화된 항-CD3 항-CD28 Fab 단편을 재조합 IL-2(예를 들어: 100 IU/mL), IL-15(예를 들어: 100IU/mL) 및 IL-7(예를 들어: 600 IU/mL)를 함유하는 무혈청 배지에 0.2-0.3x(1-2 μg/1 백만 세포)의 고정된 용량으로 컬럼에 로딩시켰고, 약 4.5 시간 동안 컬럼에서 37°C로 배양하였다. 인큐베이션 동안, 항-CD3/항-CD28 올리고머 시약을 사용한 자극은 컬럼 상의 선택 제제로부터 고정화된 세포의 분리 또는 방출을 초래했다. 방출된 세포는 동일한 무혈청 배지를 사용하여 중력 흐름에 의해 컬럼에서 용리되었다. 상기 배지에는 정지 상에 있는 StrepTactin®과 컬럼의 정지 상에 세포를 고정시키는데 사용되되는 항-CD3 항체에 융합된 스트렙타비딘 결합 펩타이드 사이의 결합을 파괴하는 비오틴 또는 임의의 경쟁 물질이 포함되지 않았다.
방출되고 수집된 세포는 이후 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시키기 위해 예시적인 항-CD19 CAR을 암호화 하는 렌티 바이러스 벡터와 함께 동일한 무혈청 배지에서 1 시간 동안 인큐베이션 함에 의해 형질도입 되었다. 예시적인 CAR은 뮤린 항체 FMC63로부터 유래된 항 -CD19 scFv, 면역글로불린 스페이서, CD28로부터 유래된 막관통 도메인, 4-1BB로부터 유래된 공동자극 영역 및 CD3- 제타 세포내 신호 전달 도메인을 함유했다. 형질 도입을 위해 배양 부피는 1x106 세포 / mL로 조정되었습니다.
형질 도입된 세포를 세척한 다음 37oC에서 추가로 인큐베이션 하였다. 항-CD3/항-CD28 올리고머 시약으로 온-컬럼 자극을 시작한 지 약 48 시간 후, 가용성 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약으로부터 항-CD3 및 항-CD28 Fab를 해리시키기 위해1.0mM D- 비오틴을 첨가하고 세포와 혼합했다.
비오틴을 첨가 한 후, 세포를 추가로 약 24 시간 동안 37 oC 에서 추가로 인큐베이션 하였다. 이후 세포를 두 개의 서브세트로 나누었다. 제1 서브세트에서 세포는 동결보호제로 직접 제형화되었다. 제2 서브세트에서 세포의 부피는 배양 및 형질 도입 단계 동안 사용된 바와 같은 IL-2, IL-7 및 IL-15의 농도 두 배를 함유하는 무혈청 배지에서 0.5 x 106 세포 / mL로 조정되었습니다. 상기 제2 서브세트의 세포는 배지 교환과 함께 정적 배양으로 37 oC에서 추가로 5 일 동안 배양에 의해 증폭을 위해 추가로 인큐베이션 된 다음, 동결 보호제와 함께 제형화 되었다.
B. 대체 프로세스: 별도의 선택 및 (용액 내) 자극
대체 프로세스는 일반적으로 위에서 설명한 바와 같이 진행하되, 선택 및 자극 단계는 컬럼에서 결합되지 않았다. 동일한 인간 공여자로부터 성분채집술 샘플을 CD3+ T 세포의 선택을 위해 전술한 바와 같이 항-CD3 선택 시약을 포함하는 친화도 컬럼 상에 로딩했다. 선택된 세포를 용리시키기 위해, 1.0 mM D-비오틴을 컬럼에 첨가하고 용리된 세포를 수집 하였다. D- 비오틴은 컬럼 및 항-CD3 Fab로부터 상기 세포를 방출시키기 위하여 항-CD3 Fab에 융합된 스트렙타비딘 결합 펩타이드와 정지 상에 StrepTactin® 간의 결합을 파괴시키기 위한 경쟁 물질로써 작용했다.
대체 프로세스 0일 차에, 선택된 세포는 세척되고, 1 x 106/mL로 희석되었으며, 항-CD3/항-CD28 Fab 컨쥬게이트된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약과 함께 인큐베이션에 의해 자극되었고, 고정된 용량(0.3x, 약 2 μg/1 백만 세포)에서 실시예1에 기재된 바와 같이 생성되었다. 자극은 재조합 IL-2 (예를 들어, 100 IU/mL), 재조합 IL-7 (예를 들어, 600 IU/mL) 및 재조합 IL-15 (예를 들어, 100 IU/mL)을 포함하는 무혈청 배지에서 약 18-30 시간(24 ± 6 시간) 동안 수행되었다.
자극 후, 세포는 전술된 바와 같은 동일한 예시적인 항-CD19 CAR을 암호화 하는 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 동일한 무혈청 배지에서 30 분 동안 회전 접종에 의해 형질 도입되었다.
회전 접종 후, 세포는 세척되었고, 이후 37oC에서 추가로 인큐베이션 하였다. 항-CD3/항-CD28 올리고머 시약으로 자극을 시작한 지 약 48± 6 시간 후, 올리고머 스트렙타비딘 시약으로부터 항-CD3 및 항-CD28 Fab를 분리시키기 위해1.0mM D- 비오틴을 첨가하고 세포와 혼합했다.
비오틴을 첨가 한 후, 세포를 추가로 약 24 시간 동안 37 oC 에서 추가로 인큐베이션 하였다. 이후 세포를 상기와 유사한 두 개의 서브세트로 나누었다. 제1 서브세트에서 세포는 동결보호제로 직접 제형화되었다. 제2 서브세트의 상기 세포는 배지 교환과 함께 정적 배양으로 37 oC에서 추가로 5 일 동안 배양에 의해 증폭을 위해 추가로 인큐베이션 된 다음, 동결 보호제와 함께 제형화 되었다.
C. 세포 회수 및 표현형 평가
온-컬럼 선택 및 자극 후 컬럼에서 방출된 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수율을 세포를 방출하기 위해 비오틴을 첨가한 컬럼 상에서 선택만 수행한 대체 프로세스에서 컬럼에서 방출 된 세포와 비교했다. 도 8a에 도시된 바와 같이, CD3+ T 세포 수율뿐만 아니라 CD4+ 및 CD8+ T 세포 수율은 두 프로세스에서 유사했다. 온-컬럼 선택 및 자극 후 컬럼으로부터 방출된 세포 중 자극 후 살아있는 세포의 총 세포수 및 백분율을 대체 프로세스에서 선택된 세포의 개별 자극 후 세포를 비교하였고, 도 8b 및 8c는 각각 두 프로세스에 대한 자극 후 총 세포수 및 살아있는 세포의 백분율을 보여준다. 이 실험에서 온-컬럼 자극을 사용하는 프로세스에서 세포 회수가 더 컸다.
추가 5 일 배양을 포함하는 프로세스의 경우, 각 프로세스에 의해 조작된 세포 집단의 정성 및 표현형을 배양 5 일차(프로세스 시작 후 8 일)에 평가했다. 도 9a 및 9b는 각각의 프로세스에 대해 회수된 살아있는 T 세포의 백분율 및 각각 예시적인 CAR (CAR+)을 발현하는 살아있는 세포의 백분율을 보여준다. CD4, CD8, CD27 및 CCR7을 포함하는 마커의 표면 발현에 대하여 5일 동안(프로세스 시작으로부터 8 일차) 추가 배양 후 두 프로세스로부터 생성된 조성물의 샘플을 유세포 분석에 의해 평가했다. 도 9c는 추가 배양(5일차) 후 마지막 날에 세포 조성물에 존재하는 살아 있는 CD4+ T 세포의 백분율에 대한 선택 단계(대체 프로세스) 또는 결합된 선택 및 자극 단계(온-컬럼 자극)으로부터 수득된 CD4+ T 세포의 백분율 비교를 제공한다.
도 9d는 온-컬럼 자극 공정에 의해 생성된 조성물에서 CD27-CCR7-, CD27+CCR7-, CD27+CCR7+ 및 CD27-CCR7+ T 세포의 백분율이 대체 프로세스에 의해 생성된 세포 조성물에 존재하는 백분율과 유사함을 보여준다.
D. 온-컬럼 자극을 사용하여 제조된 조작된 T 세포의 기능 평가
온-컬럼 자극을 포함하는 프로세스를 사용하여 제조된 조작된 T 세포의 기능적 능력은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 평가되었다. 결과는 대체 프로세스를 사용하여 제조된 조작된 T 세포와 비교되었다.
1. 시험관 내 기능적 분석
세포 용해 활성은 조작된 항-CD19 CAR T 세포를 CD19 (HEK CD19)를 발현하는 HEK 세포와 함께 이펙터 대 표적 비율 5: 1로 공동 배양함으로써 평가되었다. 세포 용해는 배양 동안 여러 시점에서 수행한 임피던스 측정에 의해 결정되었다. 대조 조건에는 다른 표적(BCMA) (HEK CD19+ BCMA CAR), 표적 세포만(HEK CD19+만) 또는 항 -CD19 CAR T 세포(HEK CD19- 및 CD19 CAR)와 함께 배양된 비표적 세포에 대한 대체 CAR을 발현하는 T 세포의 배양을 포함한다. 도 10에 도시된 바와 같이, 세포 용해 활성은 표적 세포에 특이적이었고, 온-컬럼 자극 프로세스에 의해 제조된 CAR T 세포는 대체 프로세스에 의해 조작된 세포와 유사한 강력한 세포 용해 활성을 나타냈다. 이러한 데이터는 온-컬럼 자극을 사용하여 제조된 조작된 T 세포가 대체 프로세스를 사용하여 제조된 조작된 T 세포와 비슷한 효능을 가지고 있음을 입증한다.
조작된 T 세포의 사이토카인 활성은 골지 억제제의 존재 하에 표적 세포주 (CD19+ HEK 세포)로 항원-특이적 자극 후 사이토카인 축적을 모니터링함으로써 평가되었다. 사이토카인 생산은 표면 CD4, CD8 또는 항-CD19 CAR에 대해서도 공동 염색된 세포에서 IFNg, IL-2 및 TNF-알파에 대한 세포 내 사이토카인 염색 후 유세포 분석법에 의해 평가되었다. 도 11a-11c는 각각 IFNg, IL-2 및 TNF-알파를 발현하는 각 제조 프로세스로부터 유래된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브세트의 백분율을 보여준다. 두 가지 방법으로 제조되나 CAR 발현이 결여된 T 세포를 대조군으로 사용하였다. 이러한 데이터는 CAR T 세포 항원-특이적 사이토카인 생산이 제조 프로세스 간에 생산된 세포에서 비슷하다는 것을 입증한다.
2. 생체 내 기능적 분석
온-컬럼 자극 및 대체 조작 프로세스로부터 생성된 항-CD19 CAR T 세포를 함유하는 T 세포 조성물의 항-종양 활성을 생체 내에서 비교하였다.
면역력이 약화된 NSG 마우스는 0 일에 5 x 105 B 세포 림프종 세포주 (Raji)를 주사 (i.v.)했다. 7 일차에 마우스에 온-컬럼 자극 또는 대체 프로세스에 의해 생산된 CAR+ 조작된 조성물로부터의 0.75 x 106 CAR+ T 세포를 주사 하였다. 세명의 다른 공여자로부터 각 공정에 대해 세 번의 제조 실행을 완료하고 각각 생산된 조작된 CAR+ T 치료 세포 조성물을 테스트했다. 도 12a-12c는 주사 전 각각의 조작된 치료 조성물의 CD4: CD8 비율, 형질 도입 효율 및 생존 가능한 세포의 백분율을 각각 보여준다. 나타난 바와 같이, 두 프로세스로부터 세포는 각 공여자에 대해 비슷한 조작된 세포를 생산했지만 일부 공여자 가변성이 관찰되었다.
종양 부담은 CAR-T 세포 투여 후 최대 41 일까지 상이한 시점에서 인-라이프 발광 영상화(in-life luminescence imaging)에 의해 생체 내에서 측정되었다. 종양 주입 후 6 일차, 모든 치료 그룹의 동물은 유사한 종양 부담을 나타냈다(도 13). 도 14에 도시된 바와 같이, 종양 부담은 모든 치료 그룹에서 시간이 지남에 따라 상당하게 감소했다. 이러한 결과는 제조 프로세스에 의해 생산된 CAR+ 조작된 치료 T 세포 간에 비스한 항-종양 효능을 입증한다.
E. 결론
종합적으로 상기 데이터는 온-컬럼 선택 및 자극이 형질 도입을 포함하는 프로세스의 후속 단계에 사용하기 위하여 항-CD3/항-CD28 올리고머 시약으로 자극의 개시 후 4.5 시간 이내에 컬럼으로부터 선택된 T 세포를 수집하는 프로세스를 포함한, 조작된 T 세포(예를 들어: CAR+ T 세포)를 생산하는 프로세스에서 사용될 수 있음을 나타낸다. 상기 결과는 온-컬럼 선택 및 자극 프로세스가 대체 프로세스에 비길만한 표현형 및 기능적 특징을 나타내는 조작된(예를 들어, CAR+ 세포) 세포 조성물을 생성하지만, 선택과 자극을 한 단계로 조합하는 능력에 기인해.더 효율적이고 더 짧은 시간에 수행될 수 있음을 입증한다.
본 발명은 본 발명의 다양한 측면을 설명하기 위해, 예를 들어 제공되는 특정 개시된 구현예로 범위를 제한하려는 것이 아니다. 기술된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본 명세서의 기재 및 가르침에서 명백해질 것이다. 상기 변형은 본 개시의 진정한 범위와 정신에서 벗어나지 않고 실시될 수 있으며, 본 개시의 범위에 속하도록 의도된다.
서 열
# 서열 주석
1 DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ 스트렙타비딘종: 스트렙토마이세스 아비디니
UniProt 번호. P22629
2 MetGluAlaGlyIleThrGlyThrTrpTyrAsnGlnLeuGlySerThrPheIleValThrAlaGlyAlaAspGlyAlaLeuThrGlyThrTyrGluSerAlaValGlyAsnAlaGluSerArgTyrValLeuThrGlyArgTyrAspSerAlaProAlaThrAspGlySerGlyThrAlaLeuGlyTrpThrValAlaTrpLysAsnAsnTyrArgAsnAlaHisSerAlaThrThrTrpSerGlyGlnTyrValGlyGlyAlaGluAlaArgIleAsnThrGlnTrpLeuLeuThrSerGlyThrThrGluAlaAsnAlaTrpLysSerThrLeuValGlyHisAspThrPheThrLysValLysProSerAlaAlaSer 미니멀 스트렙타비딘종: 스트렙토마이세스 아비디니
3 DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ 뮤테인 스트렙타비딘 Val44-Thr45-Ala46-Arg47
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4 MetGluAlaGlyIleThrGlyThrTrpTyrAsnGlnLeuGlySerThrPheIleValThrAlaGlyAlaAspGlyAlaLeuThrGlyThrTyrValThrAlaArgGlyAsnAlaGluSerArgTyrValLeuThrGlyArgTyrAspSerAlaProAlaThrAspGlySerGlyThrAlaLeuGlyTrpThrValAlaTrpLysAsnAsnTyrArgAsnAlaHisSerAlaThrThrTrpSerGlyGlnTyrValGlyGlyAlaGluAlaArgIleAsnThrGlnTrpLeuLeuThrSerGlyThrThrGluAlaAsnAlaTrpLysSerThrLeuValGlyHisAspThrPheThrLysValLysProSerAlaAlaSer 뮤테인 스트렙타비딘 Val44-Thr45-Ala46-Arg47
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5 DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYIGARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ 뮤테인 스트렙타비딘 Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47
종: 스트렙토마이세스 아비디니
6 MetGluAlaGlyIleThrGlyThrTrpTyrAsnGlnLeuGlySerThrPheIleValThrAlaGlyAlaAspGlyAlaLeuThrGlyThrTyrIleGlyAlaArgGlyAsnAlaGluSerArgTyrValLeuThrGlyArgTyrAspSerAlaProAlaThrAspGlySerGlyThrAlaLeuGlyTrpThrValAlaTrpLysAsnAsnTyrArgAsnAlaHisSerAlaThrThrTrpSerGlyGlnTyrValGlyGlyAlaGluAlaArgIleAsnThrGlnTrpLeuLeuThrSerGlyThrThrGluAlaAsnAlaTrpLysSerThrLeuValGlyHisAspThrPheThrLysValLysProSerAlaAlaSer 뮤테인 스트렙타비딘 Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47

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7 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly 스트렙타비딘 결합 펩타이드, Strep-tag®
8 WSHPQFEK Strep-tag® II
9 His-Pro-Xaa 스트렙타비딘 결합 펩타이드
Xaa 는 Gln, Asp, 및 Met로부터 선택됨
10 His-Pro-Gln-Phe 스트렙타비딘-결합 펩타이드
11 Xaa1-Xaa2-His-Pro-Gln-Phe-Xaa3-Xaa4 스트렙타비딘-결합 펩타이드
Xaa1 는 Trp, Lys 또는 Arg;
Xaa2 는 임의의 아미노산;
Xaa3는 Gly 또는 Glu
Xaa4 는 Gly, Lys 또는 Arg
12 -Trp-Xaa1-His-Pro-Gln-Phe-Xaa2-Xaa3-　 스트렙타비딘-결합 펩타이드
Xaa1 는 임의의 아미노산;
Xaa2는 Gly 또는 Glu
Xaa3 는 Gly, Lys 또는 Arg
13 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Xaa)n-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-　 스트렙타비딘-결합 펩타이드의 순차적 모듈
Xaa는 임의의 아미노산;
n은 8 또는 12
14 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)n-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys 스트렙타비딘-결합 펩타이드의 순차적 모듈
n은 2 또는 3
15 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK 쌍-스트렙-태그
16 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK 쌍-스트렙-태그
17 WSHPQFEKGGGSGGGSGGGSWSHPQFEK 쌍-스트렙-태그
18 WSHPQFEKGGGSGGGSWSHPQFEK 쌍-스트렙-태그
19 WSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK 쌍-스트렙-태그
20 Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala HA-태그
21 Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys VSV-G-태그
22 Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp HSV-태그
23 Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly T7 에피토프
24 Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp HSV 에피토프
25 Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu Myc 에피토프
26 Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr V5-태그
27 EAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEENAGYSTLVGHDTFTKVKPSAAS 뮤테인 스트렙타비딘 Val44-Thr45-Ala46-Arg47 및 Glu117, Gly120, Tyr121 (뮤테인 m1-9)
종: 스트렙토마이세스 아비디니
28 DPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYVTARGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEENAGYSTLVGHDTFTKVKPSAAS 뮤테인 스트렙타비딘 Val44-Thr45-Ala46-Arg47 및 Glu117, Gly120, Tyy121 (뮤테인 m1-9)
종: 스트렙토마이세스 아비디니
29 AMQVQLKQSG PGLVQPSQSL SITCTVSGFS LTTFGVHWVR QSPGKGLEWL GVIWASGITD YNVPFMSRLS ITKDNSKSQV FFKLNSLQPD DTAIYYCAKN DPGTGFAYWG QGTLVTVSAG STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SCGSAWSHPQ FEKGGGSGGG SGGSAWSHPQ FEK Fab 단편 m13B8.2의 가변 중쇄
30 AMDIQMTQSP ASLSASVGET VTFTCRASEM IYSYLAWYQQ KQGKSPQLLV HDAKTLAEGV PSRFSGGGSG TQFSLKINTL QPEDFGTYYC QAHYGNPPTF GGGTKLEIKR GIAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGECGS Fab 단편 m13B8.2의 가변 경쇄
31 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 항-CD3 항체 OKT3의 가변 중쇄
32 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 항-CD3 항체 OKT3의 가변 경쇄
33 Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 항-CD28 항체 CD28.3의 가변 중쇄
34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 항-CD28 항체 CD28.3의 가변 경쇄
35 His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys MAT-태그
36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser huOKT8의 가변 중쇄
37 Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys huOKT8의 가변 경쇄
38 -PGGG-(SGGGG)5-P- 링커P는 프롤린, G는 글리신 및 S는 세린
39 GSADDAKKDAAKKDGKS 링커
40 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP GMCSFR 알파 사슬 (아미노산)
41 atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca GMCSFR 알파 사슬(핵산)
42 MALPVTALLLPLALLLHA CD8 알파 신호 펩타이드
43 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM 절단된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR)
44 RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM 절단된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR)
45 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A
46 QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A
47 LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR T2A
48 EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A
49 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A
50 ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A
51 DYGVS CDR H1
52 VIWGSETTYYNSALKS CDR H2
53 YAMDYWG CDR H3
54 HYYYGGSYAMDY CDR H3
55 RASQDISKYLN CDR L1
56 SRLHSGV CDR L2
57 HTSRLHS CDR L2
58 GNTLPYTFG CDR L3
59 QQGNTLPYT CDR L3
60 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS VH
61 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT VL
62 GSTSGSGKPGSGEGSTKG 링커
63 gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagc scFv를 암호화하는 서열
64 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS scFv
65 SYWMN CDR H1
66 QIYPGDGDTNYNGKFKG CDR H2
67 KTISSVVDFYFDY CDR H3
68 QQYNRYPYT CDR L3
69 SYWMN CDR H1
70 QIYPGDGDTNYNGKFKG CDR H2
71 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSS VH
72 DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR VL
73 KASQNVGTNVA CDR L1
74 SATYRNS CDR L2
75 QQYNRYPYT CDR L3
76 SYWMN CDR H1
77 QIYPGDGDTNYNGKFKG CDR H2
78 KTISSVVDFYFDY CDR H3
79 GGGGSGGGGSGGGGS 링커
80 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR scFv
81 ESKYGPPCPPCP 스페이서 (IgG4힌지) (aa)
호모 사피엔스
82 GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT 스페이서 (IgG4힌지) (nt)
호모 사피엔스
83 ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 힌지-CH3 스페이서
호모 사피엔스
84 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 힌지-CH2-CH3 스페이서
호모 사피엔스
85 RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH IgD-힌지-Fc
호모 사피엔스
86 Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 예시적 IgG 힌지
87 X1PPX2PX1은 글리신, 시스테인 또는 아르기닌
X2는 시스테인 또는 트레오닌		 예시적 IgG 힌지
88 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 예시적 IgG 힌지
89 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 예시적 IgG 힌지
90 ELKTPLGDTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP 예시적 IgG 힌지
91 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 예시적 IgG 힌지
92 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 예시적 IgG 힌지
93 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 예시적 IgG 힌지
94 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 예시적 IgG 힌지
95 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 (수탁 번호 P10747의 아미노산 153-179)

호모 사피엔스
96 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 (수탁 번호 P10747의 아미노산 114-179)

호모 사피엔스
97 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28 (P10747의 아미노산 180-220)
호모 사피엔스
98 RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28(LL이 GG로)
호모 사피엔스
99 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 4-1BB (Q07011.1의 아미노산 214-255)
호모 사피엔스
100 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3 제타
호모 사피엔스
101 RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3 제타
호모 사피엔스
102 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3 제타
호모 사피엔스
103 GluAlaGlyIleThrGlyThrTrpTyrAsnGlnLeuGlySerThrPheIleValThrAlaGlyAlaAspGlyAlaLeuThrGlyThrTyrGluSerAlaValGlyAsnAlaGluSerArgTyrValLeuThrGlyArgTyrAspSerAlaProAlaThrAspGlySerGlyThrAlaLeuGlyTrpThrValAlaTrpLysAsnAsnTyrArgAsnAlaHisSerAlaThrThrTrpSerGlyGlnTyrValGlyGlyAlaGluAlaArgIleAsnThrGlnTrpLeuLeuThrSerGlyThrThrGluAlaAsnAlaTrpLysSerThrLeuValGlyHisAspThrPheThrLysValLysProSerAlaAlaSer 미니멀 스트렙타비딘 종: 스트렙토마이세스 아비디니
104 GluAlaGlyIleThrGlyThrTrpTyrAsnGlnLeuGlySerThrPheIleValThrAlaGlyAlaAspGlyAlaLeuThrGlyThrTyrValThrAlaArgGlyAsnAlaGluSerArgTyrValLeuThrGlyArgTyrAspSerAlaProAlaThrAspGlySerGlyThrAlaLeuGlyTrpThrValAlaTrpLysAsnAsnTyrArgAsnAlaHisSerAlaThrThrTrpSerGlyGlnTyrValGlyGlyAlaGluAlaArgIleAsnThrGlnTrpLeuLeuThrSerGlyThrThrGluAlaAsnAlaTrpLysSerThrLeuValGlyHisAspThrPheThrLysValLysProSerAlaAlaSer 뮤테인 스트렙타비딘 Val44-Thr45-Ala46-Arg47
종: 스트렙토마이세스 아비디니
105 GluAlaGlyIleThrGlyThrTrpTyrAsnGlnLeuGlySerThrPheIleValThrAlaGlyAlaAspGlyAlaLeuThrGlyThrTyrIleGlyAlaArgGlyAsnAlaGluSerArgTyrValLeuThrGlyArgTyrAspSerAlaProAlaThrAspGlySerGlyThrAlaLeuGlyTrpThrValAlaTrpLysAsnAsnTyrArgAsnAlaHisSerAlaThrThrTrpSerGlyGlnTyrValGlyGlyAlaGluAlaArgIleAsnThrGlnTrpLeuLeuThrSerGlyThrThrGluAlaAsnAlaTrpLysSerThrLeuValGlyHisAspThrPheThrLysValLysProSerAlaAlaSer 뮤테인 스트렙타비딘 Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47

종: 스트렙토마이세스 아비디니
106 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 인간 IgG2 Fc (Uniprot P01859)
107 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 인간 IgG4 Fc (Uniprot P01861)
108 GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKMDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE FKBP
109 GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE FKBP12v36
110 MGSNKSKPKDASQRRR 변형된 아실화 모티프
111 Met-Gly-Cys-Xaa-Cys 이중 아실화 모티프
112 Cys-Ala-Ala-Xaa 이실화 영역
113 EVQLVQSGAEMKKPGASLKLSCKASGYTFIDYYVYWMRQAPGQGLESMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAMYYCARSQRDGYMDYWGQGTLVTVSS 가변 중 (VH) 항-BCMA
114 QSALTQPASVSASPGQSIAISCTGTSSDVGWYQQHPGKAPKLMIYEDSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSNTRSSTLVFGGGTKLTVLG 가변 경 (VL) 항-BCMA
115 ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 힌지-CH2-CH3 스페이서호모 사피엔스
116 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS V가변 중쇄(VH) 항-BCMA
117 DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIHWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK V가변 경쇄(VL) 항-BCMA
118 QIQLVQSGPDLKKPGETVKLSCKASGYTFTNFGMNWVKQAPGKGFKWMAWINTYTGESYFADDFKGRFAFSVETSATTAYLQINNLKTEDTATYFCARGEIYYGYDGGFAYWGQGTLVTVSA V가변 중쇄(VH) 항-BCMA
119 DVVMTQSHRFMSTSVGDRVSITCRASQDVNTAVSWYQQKPGQSPKLLIFSASYRYTGVPDRFTGSGSGADFTLTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKLDIK V가변 경쇄(VL) 항-BCMA
120 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARYSGSFDNWGQGTLVTVSS V가변 중쇄(VH) 항-BCMA
121 SYELTQPPSASGTPGQRVTMSCSGTSSNIGSHSVNWYQQLPGTAPKLLIYTNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDGSLNGLVFGGGTKLTVLG V가변 경쇄(VL) 항-BCMA
122 GGGGS L링커
123 GGGS L링커
124 SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA L링커
125 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYSKSIVSYMDYWGQGTLVTVSS V가변 중쇄(VH) 항-BCMA
126 LPVLTQPPSTSGTPGQRVTVSCSGSSSNIGSNVVFWYQQLPGTAPKLVIYRNNQRPSGVPDRFSVSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGYVFGTGTKVTVLG V가변 경쇄(VL) 항-BCMA
127 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYGSYRWEDSWGQGTLVTVSS V가변 중쇄(VH) 항-BCMA
128 QAVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVFWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSASYVFGTGTKVTVLG V가변 경쇄(VL) 항-BCMA
129 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQRLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQDRITVTRDTSSNTGYMELTRLRSDDTAVYYCARSPYSGVLDKWGQGTLVTVSS V가변 중쇄(VH) 항-BCMA
130 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGFDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGYVFGTGTKVTVLG V가변 경쇄(VL) 항-BCMA
131 KYGPPCPPCP H힌지
SEQUENCE LISTING <110> Juno Therapeutics GmbH Germeroth, Lothar Stemberger, Christian Poltorak, Mateusz Pawel Schmidt, Thomas <120> Methods for selection and stimulation of cells and kits and apparatus for same <130> 73504-20192.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/753,911 <151> 2018-10-31 <150> US 62/842,511 <151> 2019-05-02 <150> US 62/861,314 <151> 2019-06-13 <160> 131 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <223> UniProt No. P22629 <400> 1 Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr 20 25 30 Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly 35 40 45 Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro 50 55 60 Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr 85 90 95 Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser 100 105 110 Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp 115 120 125 Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys 130 135 140 Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln 145 150 155 <210> 2 <211> 127 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <223> Minimal streptavidin <400> 2 Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu 20 25 30 Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 35 40 45 Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr 50 55 60 Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 159 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <223> Mutein Streptavidin Val44-Thr45-Ala46-Arg47 <400> 3 Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr 20 25 30 Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly 35 40 45 Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro 50 55 60 Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr 85 90 95 Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser 100 105 110 Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp 115 120 125 Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys 130 135 140 Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln 145 150 155 <210> 4 <211> 127 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <223> Mutein Streptavidin Val44-Thr45-Ala46-Arg47 <400> 4 Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val 20 25 30 Thr Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 35 40 45 Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr 50 55 60 Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 159 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <223> Mutein Streptavidin Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47 <400> 5 Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr 20 25 30 Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ala Arg Gly 35 40 45 Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro 50 55 60 Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr 85 90 95 Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser 100 105 110 Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp 115 120 125 Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys 130 135 140 Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln 145 150 155 <210> 6 <211> 127 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <223> Mutein Streptavidin Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47 <400> 6 Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile 20 25 30 Gly Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 35 40 45 Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr 50 55 60 Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptavidin binding peptide, Strep-tag (R) <400> 7 Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Strep-tag(R) II <400> 8 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptavidin Binding peptide <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa is selected from Gln, Asp, and Met <400> 9 His Pro Xaa 1 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptavidin-binding peptide <400> 10 His Pro Gln Phe 1 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptavidin-binding peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa is Trp, Lys, or Arg <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa is Gly or Glu <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa is Gly, Lys, or Arg <400> 11 Xaa Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptavidin-binding peptide <220> <221> VARIANT <222> 2 <223> Xaa is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 7 <223> Xaa is Gly or Glu <220> <221> VARIANT <222> 8 <223> Xaa Gly, Lys, or Arg <400> 12 Trp Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa 1 5 <210> 13 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequential modules of streptavidin-binding peptide <220> <221> VARIANT <222> 9 <223> Xaa is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 10 <223> Xaa is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 12 <223> Xaa is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> 13 <223> Xaa is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (14)...(14) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (15)...(15) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (16)...(16) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (17)...(17) <223> Xaa is any amino acid or null <220> <221> VARIANT <222> (18)...(18) <223> Xaa is any amino acid if Xaa at position 17 is any amino acid, otherwise Xaa is null <220> <221> VARIANT <222> (19)...(19) <223> Xaa is any amino acid if Xaa at position 17 is any amino acid, otherwise Xaa is null <220> <221> VARIANT <222> (20)...(20) <223> Xaa is any amino acid if Xaa at position 17 is any amino acid, otherwise Xaa is null <400> 13 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 20 25 <210> 14 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequential modules of streptavidin-binding peptide <220> <221> VARIANT <222> 17 <223> Xaa is Gly or null <220> <221> VARIANT <222> 18 <223> Xaa is Gly if Xaa at position 17 is Gly, otherwise Xaa is null <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa is Gly if Xaa at position 17 is Gly, otherwise Xaa is null <220> <221> VARIANT <222> 20 <223> Xaa is Ser if Xaa at position 17 is Gly, otherwise Xaa is null <400> 14 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 20 25 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Twin-Strep-tag <400> 15 Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 20 25 30 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Twin-Strep-tag <400> 16 Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 20 25 30 <210> 17 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Twin-Strep-tag <400> 17 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 20 25 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Twin-Strep-tag <400> 18 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 20 <210> 19 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Twin-Strep-tag <400> 19 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 20 25 <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-tag <400> 20 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VSV-G-tag <400> 21 Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV-tag <400> 22 Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 epitope <400> 23 Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSV epitope <400> 24 Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Myc epitope <400> 25 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 1 5 10 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V5-tag <400> 26 Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr 1 5 10 <210> 27 <211> 126 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <223> Mutein Streptavidin Val44-Thr45-Ala46-Arg47 and Glu117, Gly120, Tyr121 (mutein m1-9) <400> 27 Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe 1 5 10 15 Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr 20 25 30 Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp 35 40 45 Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val 50 55 60 Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser 65 70 75 80 Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu 85 90 95 Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val 100 105 110 Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125 <210> 28 <211> 139 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <223> Mutein Streptavidin Val44-Thr45-Ala46-Arg47 and Glu117, Gly120, Tyr121 (mutein m1-9) <400> 28 Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr 20 25 30 Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly 35 40 45 Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro 50 55 60 Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr 85 90 95 Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser 100 105 110 Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val Gly His Asp 115 120 125 Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 130 135 <210> 29 <211> 253 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy chain of Fab fragment m13B8.2 <400> 29 Ala Met Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr 20 25 30 Thr Phe Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Val Pro 50 55 60 Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Phe Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Lys Asn Asp Pro Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser 210 215 220 Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 245 250 <210> 30 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Light chain of Fab Fragment m13B8.2 <400> 30 Ala Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Glu Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Glu Met Ile Tyr 20 25 30 Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu 35 40 45 Leu Val His Asp Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Thr Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala His Tyr Gly Asn 85 90 95 Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ile 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser 210 215 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy chain of anti-CD3 antibody OKT3 <400> 31 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Light chain of anti-CD3 antibody OKT3 <400> 32 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105 <210> 33 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy chain of anti-CD28 antibody CD28.3 <400> 33 Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg 1 5 10 15 Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His 20 25 30 Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe 35 40 45 Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys 50 55 60 Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu 65 70 75 80 Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg 85 90 95 Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val 115 <210> 34 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Light chain of anti-CD28 antibody CD28.3 <400> 34 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAT tag <400> 35 His Asn His Arg His Lys His Gly Gly Gly Cys 1 5 10 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy chain of huOKT8 <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Light chain of huOKT8 <400> 37 Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 38 Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro 20 25 30 <210> 39 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 39 Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15 Ser <210> 40 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GMCSFR alpha chain <400> 40 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro 20 <210> 41 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GMCSFR alpha chain <400> 41 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atccca 66 <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 alpha signal peptide <400> 42 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala <210> 43 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> truncated epidermal growth factor receptor (tEGFR) <400> 43 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly 20 25 30 Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe 35 40 45 Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala 50 55 60 Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu 65 70 75 80 Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile 85 90 95 Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu 100 105 110 Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala 115 120 125 Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 130 135 140 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr 145 150 155 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96 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (amino acids 114-179 of Accession No. P10747) <400> 96 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 35 40 45 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 50 55 60 Trp Val 65 <210> 97 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (amino acids 180-220 Accession No. P10747) <400> 97 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 98 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (LL to GG) <400> 98 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 99 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapien <220> <223> 4-1BB (amino acids 214-255 of Q07011.1) <400> 99 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 100 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD3 zeta <400> 100 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 101 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD3 zeta <400> 101 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser 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Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 103 <211> 126 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <223> Minimal streptavidin <400> 103 Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe 1 5 10 15 Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser 20 25 30 Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp 35 40 45 Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val 50 55 60 Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser 65 70 75 80 Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu 85 90 95 Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val 100 105 110 Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125 <210> 104 <211> 126 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <223> Mutein Streptavidin Val44-Thr45-Ala46-Arg47 <400> 104 Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe 1 5 10 15 Ile Val Thr Ala Gly Ala 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Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 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Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His 20 25 30 Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Thr Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Gly Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 122 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 122 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 123 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 123 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 124 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 124 Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Glu Met Ala 20 <210> 125 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA <400> 125 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Ser Lys Ser Ile Val Ser Tyr Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 126 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light (VL) Anti-BCMA <400> 126 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Thr Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Val Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Val Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Val 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Val Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 127 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA <400> 127 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Ser Tyr Arg Trp Glu Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 128 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light (VL) Anti-BCMA <400> 128 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Ser Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 129 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable heavy (VH) Anti-BCMA <400> 129 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Ile Thr Val Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Gly Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Tyr Ser Gly Val Leu Asp Lys Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 130 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable light (VL) Anti-BCMA <400> 130 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Phe Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 131 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge <400> 131 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10

Claims (157)

  1. T 세포의 온-컬럼 자극 방법으로서, 상기 방법은:
    복수의 고정된 T 세포를 포함하는 정지 상에, T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 올리고머 자극 시약을 첨가하고, 이로써 하나 이상의 T 세포와 함께 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계-여기서:
    상기 정지 상은 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브 세트의 표면 상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 선택 제제를 포함하며;
    상기 올리고머 자극 시약은 (i) 항-CD3 항체인 제1 자극제, 및 (ii) 항-CD28 항체인 제2 자극제를 포함하는 하나 이상의 자극제를 포함함-; 및
    상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계;를 포함하는, 방법.
  2. T 세포의 온-컬럼 자극 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 복수의 T 세포 중 하나 이상의 T 세포에 자극신호를 전달하기 위하여 하나 이상의 자극제와 함께 정지 상에 고정된 복수의 T세포를 인큐베이션 하는 단계-상기 정지 상은 상기 하나 이상의 T 세포의 표면상의 상기 선택 마커에 특이적으로 결합하는 상기 선택 제제를 포함하며, 여기서 하나 이상의 T 세포에 의해 발현되는 상기 선택 마커에 대한 상기 선택 제제의 특이적 결합은 사익 정지 상에 상기 하나 이상의 T 세포를 고정시킴-; 및
    (b) 상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 하나 이상의 T 세포를 수집하여 이로써 자극된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계;를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 정지 상은 상기 하나 이상의 T 세포에서 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 고정되는, 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 하나 이상의 자극제는 제1자극제 및 제2 자극제이며, 상기 인큐베이션 전에 상기 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형 시킬 수 있는 상기 제2 자극제를 포함하는 자극 시약을 정지 상에 첨가하는, 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 방법은, 상기 인큐베이션 전에 상기 정지 상에 자극 시약을 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 자극 시약은 상기 하나 이상의 자극제 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 하나 이상의 자극제는 상기 제1자극제이고, 상기 하나 이상의 자극제는 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형(modifying) 시킬 수 있는 제2 자극제를 더 포함하는, 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 자극제 중 적어도 하나인, 선택적으로 상기 제1 자극제는 자극 신호를 전달할 수 있고, 상기 자극 신호는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체, T 세포에서 CD3-함유 복합체, 및/또는 T 세포에서 ITAM-함유 분자를 통한 것인, 방법.
  8. 제4항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 자극제는 상기 하나 이상의 T 세포 상에 공동자극분자에 특이적으로 결합할 수 있는 것인, 방법.
  9. T 세포의 온-컬럼 자극 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 정지 상에 복수의 T 세포를 포함하는 샘플을 첨가하여 상기 정지 상에 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 고정시키는 단계-상기 정지 상은 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 표면 상의 선택 마커에 결합하는 선택 제제를 포함함-;
    (b) 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상에서 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제를 포함하는 자극 시약을 정지 상에 첨가하여, 이로써 상기 하나 이상 T 세포와 함께 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계; 및
    (c) 상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계;를 포함하는, 방법.
  10. T 세포의 온-컬럼 자극 방법으로서, 상기 방법은:
    (1) (a) 복수의 T 세포를 포함하는 샘플 및 (b) 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 표면 상에 발현된 선택 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 선택 제제를 포함하는 정지 상을 조합시키는 단계-여기서 선택 마커에 대한 선택 제제의 특이적 결합은 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 정지 상에 고정시킴-;
    (2) T 세포에서 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제를 포함하는 자극 시약을 상기 정지 상에 첨가하여, 이로써 상기 하나 이상 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계; 및
    (3) 상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계;를 포함하는, 방법.
  11. T 세포의 온-컬럼 자극 방법으로서, 상기 방법은 복수의 고정된 T 세포를 포함하는 정지 상에 올리고머 자극 시약을 첨가하여, 이로써 상기 복수의 고정된 T 세포 중 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계를 포함하며, 여기서:
    상기 정지 상은 하나 이상의 T 세포의 표면상의 선택 마커에 특이적으로 결합하는 선택 제제를 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 T 세포에 의해 발현되는 상기 선택 마커에 대한 상기 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 상기 하나 이상의 T 세포를 고정시키고;
    상기 올리고머 자극 시약은 (i) 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자, 및 (ii) 하나 이상의 T 세포에서 자극 신호를 전달할 수 있는 하나 이상의 자극제를 포함하고,
    여기서 상기 올리고머 자극 시약의 크기는 i) 50 nm 초과의 반경, ii) 적어도 5 x 106 g/mol의 분자량; 및/또는 (iii) 올리고머 자극 시약 당 적어도 100 개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정지 상으로부터의 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시의 약 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 시간 이내에 일어나는, 방법.
  14. 제1항 내지 제10항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정지 상으로부터의 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시의 약 2 내지 24, 3 내지 24, 4 내지 24, 5, 내지 24, 6 내지 24, 7 내지 24, 8 내지 24, 9 내지 24, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 13 내지 24, 14 내지 24, 15 내지 24, 16 내지 24, 17 내지 24, 18 내지 24, 19 내지 24, 20 내지 24, 21 내지 24, 22 내지 24, 23 내지 24, 2 내지23, 2 내지 22, 2 내지 21, 2 내지 20, 2 내지 19, 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 2 내지 15, 2 내지 14, 2 내지 13, 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 2 내지 3 시간 이내에 일어나는, 방법.
  15. 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정지 상으로부터의 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시의 약 12, 10, 8, 6, 4, 또는 2 시간 이내에 일어나는, 방법.
  16. 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정지 상으로부터의 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시 5시간 이내에 일어나는, 방법.
  17. 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정지 상으로부터의 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시의 (약) 4.5 시간 이내에 일어나는, 방법.
  18. 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정지 상으로부터의 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상의 수집은 상기 인큐베이션 개시 4시간 이내에 일어나는, 방법.
  19. 제1항, 제9항, 제10항 및 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는, 상기 복수의 T 세포를 포함하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 상기 정지 상과 조합시킨 후 (약) 10분 이내, (약) 20분 이내, (약) 30분 이내, (약) 45분 이내, (약) 60분 이내, (약) 90분 이내 또는 (약) 120분 이내에 수행되는, 방법.
  20. 제1항, 제9항, 제10항 및 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자극 시약과의 상기 인큐베이션 개시는 상기 복수의 T 세포를 포함하는 상기 샘플을 상기 정지 상에 첨가 또는 상기 정지 상과 조합시킨 후 (약) 60분 이내에 수행되는, 방법.
  21. 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 자극제 중 적어도 하나는 자극 신호를 전달할 수 있고, 상기 자극 신호는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체, T 세포에서 CD3-함유 복합체, 및/또는 T 세포에서 ITAM-함유 분자를 통한 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 자극제는 제1자극제이고, 상기 자극 시약은 상기 제1 자극제의 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형 시킬 수 있는 하나 이상의 제2 자극제를 더 포함하는, 방법.
  23. 제4항, 제6항, 제7항, 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 자극제는 상기 하나 이상의 T 세포 상에 공동자극분자에 특이적으로 결합할 수 있는 것인, 방법.
  24. 제8항 또는 제23항에 있어서,
    상기 공동자극분자는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 또는 HVEM 중으로부터 선택된 것인, 방법.
  25. 제8항, 제23항, 또는 제24항에 있어서,
    상기 제2 자극제는 CD28에 특이적으로 결합할 수 있고/거나 상기 공동자극분자는 CD28인, 방법.
  26. 제1항 내지 제4항, 제6항, 제7항 및 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 자극제는 CD3에 특이적으로 결합하고, 상기 제2 자극제는 CD28에 특이적으로 결합하는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서:
    상기 하나 이상의 자극제는 독립적으로 항체 단편, 1가 항체 단편, 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자, Ig 도메인을 함유하는 분자, 사이토카인, 케모카인, 압타머, MHC 분자, MHC-펩타이드 복합체; 수용체 리간드; 및 이의 결합 단편;으로 이루어진 군에서 선택된 제제이거나 이를 포함하는, 방법.
  28. 제4항, 제6항, 제7항, 제8항, 제13항 내지 제20항 및 제22항 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서:
    상기 제1 및 제2 자극제는 독립적으로 항체 단편, 1가 항체 단편, 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자, Ig 도메인을 함유하는 분자, 사이토카인, 케모카인, 압타머, MHC 분자, MHC-펩타이드 복합체; 수용체 리간드; 및 이의 결합 단편;으로 이루어진 군에서 선택된 제제이거나 이를 포함하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 자극제는 1가 항체 단편을 포함하는, 방법.
  30. 제1항, 제4항, 제6항, 제7항, 제8항, 제13항 내지 제20항, 제22항 내지 제26항 및 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2자극제는 독립적으로 1가 항체 단편을 포함하는, 방법.
  31. 제1항, 제4항, 제6항, 제7항, 제8항, 제13항 내지 제20항, 제22항 내지 제26항, 제28항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 자극제는 CD3에 결합하는 1가 항체 단편을 포함하고, 상기 제2자극제는 CD28에 결합하는 1가 항체 단편을 포함하는, 방법.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 1가 항체 단편은 Fab 단편, Fv 단편 및 단일 사슬 Fv 단편(scFv)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  33. 제1항, 제4항, 제6항, 제7항, 제8항, 제13항 내지 제20항, 제22항 내지 제26항, 제28항 및 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 자극제는 항-CD3 Fab이고, 상기 제2 자극제는 항-CD28 Fab인, 방법.
  34. T 세포의 온-컬럼 자극의 방법으로서, 상기 방법은 복수의 고정된 T 세포를 포함하는 정지 상에 T 세포에 자극 신호를 전달할 수 있는 올리고머 자극 시약을 첨가하여, 이로써 하나 이상의 T 세포와 함께 상기 자극 시약의 인큐베이션을 개시하는 단계-여기서:
    상기 정지 상은 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브세트의 표면 상의 선택 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 선택 제제를 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 T 세포 또는 이의 서브세트에 의해 발현된 선택 마커에 대한 상기 선택 제제의 특이적 결합은 상기 정지 상에 적어도 복수의 T 세포를 고정시키며, 여기서 상기 선택 제제는 CD3, CD4, 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택된 선택 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편이며;
    상기 올리고머 자극 시약은 (i) 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자, (ii) 하나 이상의 T 세포에서 자극 신호를 전달할 수 있고, CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편인 제1 자극제, 및 (iii) 상기 자극 신호를 강화, 완화, 또는 변형시킬 수 있고, CD28에 특이적으로 결합할 수 있는 Fab 단편인 제2 자극제를 포함하며, 상기 올리고머 자극 시약의 크기는 i) 50 nm 초과의 반경, ii) 적어도 5 x 106 g/mol의 분자량; 및/또는 (iii) 올리고머 자극 시약 당 적어도 100 개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함함-; 및
    상기 인큐베이션 개시 24 시간 이내에, 중력 흐름에 의해 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 T 세포 중 하나 이상을 수집하여, 이로써 자극된 T 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 단계;를 포함하는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 전혈 샘플, 연막(buffy coat) 샘플, 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 샘플, 비분획화 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분 채집술(apheresis) 생성물 또는 백혈구 성분 채집술(leukapheresis) 생성물이거나 이를 포함하는 샘플 유래인, 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 샘플은 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 산물인, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술 산물은 이전에 동결된 적이 있는 것인, 방법.
  38. 제2항 내지 제27항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 자극제와의 인큐베이션은 상기 정지 상으로부터 복수의 고정된 T 세포 중 하나 이상을 방출하는, 방법.
  39. 제1항, 제4항, 제6항, 제7항, 제8항, 제13항 내지 제20항, 제22항 내지 제26항, 제28항 및 제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 자극제와의 인큐베이션은 상기 정지 상으로부터 상기 복수의 고정된 T 세포 중 하나 이상을 방출하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제27항, 제29항 및 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서:
    상기 하나 이상의 자극제는 비오틴, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체, Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드, 칼모듈린에 가역적으로 결합하는 칼모듈린 결합 펩타이드, 항체 결합 FLAG 펩타이드에 가역적으로 결합하는 FLAG 펩타이드, 및 항체 결합 올리고히스티딘 태그(tag)에 가역적으로 결합하는 올리고히스티딘 태그를 더 포함하는, 방법.
  41. 제1항 내지 제27항, 제29항 및 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 자극제는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) and Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함하는, 방법.
  42. 제1항 내지 제27항, 제29항 및 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 자극제는 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16)를 갖는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함하는, 방법.
  43. 제1항, 제4항, 제6항, 제7항, 제8항, 제13항 내지 제20항, 제22항 내지 제26항, 제28항 및 제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서:
    상기 제1 자극제 및 제2 자극제는, 독립적으로, 비오틴, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체, Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드, 칼모듈린에 가역적으로 결합하는 칼모듈린 결합 펩타이드, 항체 결합 FLAG 펩타이드에 가역적으로 결합하는 FLAG 펩타이드, 및 항체 결합 올리고히스티딘 태그에 가역적으로 결합하는 올리고히스티딘 태그를 더 포함하는, 방법.
  44. 제1항, 제4항, 제6항, 제7항, 제8항, 제13항 내지 제20항, 제22항 내지 제26항, 제28항, 제30항 내지 제39항 및 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 상기 제1 자극제 및 제2 자극제는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) and Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함하는, 방법.
  45. 제1항, 제4항, 제6항, 제7항, 제8항, 제13항 내지 제20항, 제22항 내지 제26항, 제28항, 제30항 내지 제39항, 제43항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 상기 제1 자극제 및 제2 자극제는 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16)를 갖는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함하는, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 제제는 항체 단편, 1가 항체 단편, 면역글로불린-유사 기능을 갖는 단백질성 결합 분자, Ig 도메인을 함유하는 분자, 사이토카인, 케모카인, 압타머, MHC 분자, MHC-펩타이드 복합체, 수용체 리간드, 및 이의 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 제제이거나 이를 포함하는, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서:
    상기 선택 마커는 T 세포 공수용체(coreceptor)이며;
    상기 선택 마커는 T 세포 항원 수용체 복합체의 멤버이거나 이를 포함하고;
    상기 선택 마커는 CD3 사슬이거나 이를 포함하며;
    상기 선택 마커는 CD3 제타 사슬이거나 이를 포함하고;
    상기 선택 마커는 CD8이거나 이를 포함하며;
    상기 선택마커는 CD4이거나 이를 포함하고;
    상기 선택 마커는 CD45RA이거나 이를 포함하며;
    상기 선택마커는 CD27이거나 이를 포함하고;
    상기 선택 마커는 CD28이거나 이를 포함하며; 및/또는
    상기 선택 마커는 CCR7이거나 이를 포함하는, 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 마커는 CD3, CD4, 및 CD8로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 마커는 CD3인, 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 제제는 비오틴, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체, Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드, 칼모듈린에 가역적으로 결합하는 칼모듈린 결합 펩타이드, 항체 결합 FLAG 펩타이드에 가역적으로 결합하는 FLAG 펩타이드, 및 항체 결합 올리고히스티딘 태그(tag)에 가역적으로 결합하는 올리고히스티딘 태그를 더 포함하는, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 제제는 비오틴, 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체, Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함하는, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 제제는 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16)를 갖는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 더 포함하는, 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 제제 및 상기 선택 마커 간 특이적 결합은 T 세포에 대한 신호를 유도하지 않거나, 또는 자극 또는 활성화 또는 증식 신호를 유도하지 않는 것인, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 제제는 CD3, CD8 또는 CD4 에 결합하는 1가 항체 단편을 포함하는, 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 제제는 항-CD3 Fab, 항-CD8 Fab 또는 항-CD4 Fab인, 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 제제는 항-CD3 Fab인, 방법.
  57. 제4항 내지 제10항, 제13항 내지 제33항, 및 제35항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자극 시약은 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 함유하는 올리고머 자극 시약이고,
    여기서 상기 올리고머 자극 시약의 크기는 i) 50 nm 초과의 반경, ii) 적어도 5 x 106 g/mol의 분자량; 및/또는 (iii) 올리고머 자극 시약 당 적어도 100 개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함하는, 방법.
  58. 제1항에 있어서,
    상기 올리고머 자극 시약은 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하고,
    여기서 올리고머 자극 시약의 크기는 i) 50 nm 초과 반경, ii) 적어도 5 x 106 g/mol의 분자량; 및/또는 (iii) 올리고머 자극 시약 당 적어도 100 개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함하는, 방법.
  59. 제1항, 제11항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고머 자극 시약은 가용성인, 방법.
  60. 제1항 및 제11항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서:
    상기 올리고머 자극 시약은 고체 지지체, 정지 상, 비드, 마이크로입자, 자성입자, 및/또는 매트릭스가 아니고, 이에 결합되거나 이와 연관되지 않으며; 및/또는 상기 시약은 가요성이 있고, 금속 또는 자성 코어를 함유하지 않으며, 전체적으로 또는 주로 유기 다량체를 포함하고/하거나 단단하지 않은 것인, 방법.
  61. 제11항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하거나 또는 가역적으로 결합할 수 있는 것인, 방법.
  62. 제11항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서:
    상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 lle44-Gly45-Ala46-Arg47 인 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 Va144-Thr45-Ala46-Arg47인 아미노산 서열을 포함; 하는, 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서,
    상기 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) and Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  64. 제1항 및 제11항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머 자극 시약은:
    60nm 초과, 70nm 초과, 80nm 초과, 또는 90nm 초과의 반경을 포함하는 것인, 방법.
  65. 제1항 및 제11항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머 자극 시약은:
    50 nm 및 150 nm 사이, 75 nm 및 125 nm 사이, 80 nm 및 115 nm 사이, 또는 90 nm 및 110 nm 사이의 반경(수치 포함); 또는
    90 nm ±15 nm, 또는 95 nm ±20-25nm의 반경을 포함하는, 방법.
  66. 제11항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반경은 유체역학적 반경인, 방법.
  67. 제1항 및 제11항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머 자극 시약은 분자량:
    적어도 5 x 107 g/mol, 또는 적어도 1 x 108 g/mol; 및/또는
    5 x 107 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 1 x 108 g/mol 내지 5 x 108 g/mol , 또는 1 x 108 g/mol 내지 2 x 108 g/mol을 포함하는 것인, 방법.
  68. 제1항 및 제11항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고머 자극 시약은 적어도 500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 적어도 1,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 적어도 1,500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 또는 적어도 2,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머; 및/또는
    1,000 내지 20,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 1,000 내지 10,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머, 또는 2,000 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 테트라머를 포함하는, 방법.
  69. 제1항 및 제11항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고머 자극 시약은 약 1 내지 약 2μg/1백만개 세포의 농도로 상기 정지 상에 첨가되는, 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 제제는 상기 정지 상에 직접 또는 간접적으로 결합되는, 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 선택 제제는 상기 선택 제제가 가역적으로 결합하는 선택 시약을 통해서 상기 정지 상에 간접적으로 결합되는, 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서,
    상기 선택 시약은 비오틴, 비오틴 유사체 또는 이의 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘의 뮤테인; 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 뮤테인; 적어도 2개의 킬레이팅 작용기 K를 함유하는 시약, 여기서 상기 적어도 2개의 킬레이트 작용기는 전이금속 이온에 결합할 수 있음; 올리고히스티딘 친화성 태그(affinity tag)에 결합할 수 있는 제제; 글루타치온-S-전이효소에 결합할 수 있는 제제; 칼모듈린 또는 이의 유사체; 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP)에 결합할 수 있는 제제; FLAG-펩타이드에 결합할 수 있는 제제; HA-태그에 결합할 수 있는 제제; 말토오스 결합 단백질(MBP)에 결합할 수 있는 제제; HSV 에피토프에 결합할 수 있는 제제; myc 에피토프에 결합할 수 있는 제제; 또는 비오티닐화된 수송 단백질에 결합할 수 있는 제제이거나 또는 이를 포함하는, 방법.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서:
    상기 선택 시약은 비오틴 또는 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비단 뮤테인이거나 이를 포함하고;
    상기 자극 시약은 비오틴 유사체 또는 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비단 뮤테인이거나 이를 포함하며; 및/또는
    상기 자극 시약은 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 아비단 뮤테인이거나 이를 포함하는, 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서,
    상기 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하거나 또는 가역적으로 결합할 수 있는 것인, 방법.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서:
    상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 lle44-Gly45-Ala46-Arg47 인 아미노산 서열을 포함하거나;
    상기 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치와 관련하여 위치 44 내지 47에 상응하는 서열 위치에 Va144-Thr45-Ala46-Arg47인 아미노산 서열을 포함; 하는, 방법.
  76. 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 8), Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:15), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호: 17), SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　18) and Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호:　19)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  77. 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 서열 SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEK (서열 번호: 16)를 갖는 것인, 방법.
  78. 제1항 내지 제10항 또는 제12항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 중력 흐름에 의한 수집은 상기 정지 상에 배지를 첨가하는 것을 포함하고, 상기 배지는 상기 정지 상으로부터 T 세포를 용리시키기 위해 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제(free binding agent)를 함유하지 않는 것인, 방법.
  79. 제1항 내지 제10항 및 제12항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자극된 T 세포를 포함하는 상기 조성물은 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 포함하지 않는 것인, 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서,
    상기 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제는 비오틴 또는 비오틴 유사체이거나 이를 포함하며, 선택적으로 여기서 상기 비오틴 유사체는 D-비오틴인, 방법.
  81. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 핵산 분자-여기서 핵산 분자는 재조합 단백질을 암호화함-를 조성물의 자극된 T 세포에 도입시키고, 이로써 조작된 T 세포-선택적으로 형질 도입된 T 세포-를 포함하는 조성물을 생산하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 항원 수용체인, 방법.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서,
    상기 재조합 단백질은 키메라 항원 수용체인, 방법.
  84. 제83항에 있어서,
    상기 키메라 항원 수용체(CAR)는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원-인식 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포내 신호 전달 도메인을 포함하는, 방법.
  85. 제84항에 있어서,
    상기 세포내 신호 전달 도메인은 CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
  86. 제84항 또는 제85항에 있어서,
    상기 세포외 도메인 및 상기 세포내 신호 전달 도메인을 연결시키는 막관통 도메인을 더 포함하는, 방법.
  87. 제86항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 포함하는, 방법.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포내 신호 전달 도메인은 T 세포 공동자극분자의 세포내 신호 전달 도메인을 더 포함하는, 방법.
  89. 제88항에 있어서,
    상기 T 세포 공동자극분자는 CD28 및 41BB로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
  90. 제81항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵산은 상기 재조합 항원 수용체를 암호화 하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 더 포함하는, 방법.
  91. 제81항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 핵산의 도입은 바이러스 입자로 형질도입하여 달성되는 것인, 방법.
  92. 제91항에 있어서,
    상기 바이러스 입자는 레트로바이러스 벡터 입자인, 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서,
    상기 바이러스 입자는 렌티바이러스 벡터 입자인, 방법.
  94. 제81항 내지 제93항에 있어서,
    바이러스 통합(viral integration)을 위한 조건 하에서, 선택적으로 (약) 37ºC± 2ºC의 온도에서, 형질도입된 세포를 포함하는 상기 조성물을 인큐베이션 하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  95. 제94항에 있어서,
    형질 도입된 세포를 포함하는 상기 조성물을 인큐베이션 하는 단계는 상기 도입 후 최대 96시간 동안 수행되는, 방법.
  96. 제94항에 있어서,
    형질 도입된 세포를 포함하는 상기 조성물을 인큐베이션 하는 단계는 상기 도입 후 최대 72시간 동안 수행되는, 방법.
  97. 제94항에 있어서,
    형질 도입된 세포를 포함하는 상기 조성물을 인큐베이션 하는 단계는 상기 도입 후 최대 48시간 동안 수행되는, 방법.
  98. 제94항에 있어서,
    형질 도입된 세포를 포함하는 상기 조성물을 인큐베이션 하는 단계는 상기 도입 후 최대 24시간 동안 수행되는, 방법.
  99. 제94항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서,
    형질 도입된 세포를 포함하는 상기 조성물을 인큐베이션 하는 단계는 상기 도입 후 최대 18시간 동안 수행되는, 방법.
  100. 제81항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포 증폭을 위한 조건 하에서, 조작된 세포, 선택적으로 형질도입된 세포를 포함하는 상기 조성물을 배양하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서,
    상기 배양하는 단계는 14일 이하, 12일 이하, 10일 이하, 8일 이하, 6일 이하, 또는 5일 이하의 시간 동안 수행되는, 방법.
  102. 제81항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조작된 T 세포를 수확하여 조작된 T 세포의 산출 집단을 생산하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  103. 제81항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자극 시약에 노출이 개시된 후, 48 시간 내지 120 시간 사이(수치 포함)의 시간에 상기 조작된 T 세포를 수확하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  104. 제81항 내지 제99항 및 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수확하는 단계는 상기 자극제에 대한 노출이 개시된 후 120 시간 내에 수행되는, 방법.
  105. 제81항 내지 제99항 및 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수확하는 단계는 상기 자극제에 대한 노출이 개시된 후 96 시간 내에 수행되는, 방법.
  106. 제81항 내지 제99항 및 제105항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수확하는 단계는 상기 자극제에 대한 노출이 개시된 후 72 시간 내에 수행되는, 방법.
  107. 제81항 내지 제99항 및 제106항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수확하는 단계는 상기 자극제에 대한 노출이 개시된 후 48 시간 내에 수행되는, 방법.
  108. 제102항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
    수확 시점에 나이브-유사 세포의 백분율은 집단 내 전체 T 세포, 집단 내 CD4+ T 세포, 집단 내 CD8+ T 세포, 또는 집단 내 이의 재조합 단백질-발현 세포 중 (약) 60% 초과인, 방법.
  109. 제108항에 있어서,
    상기 나이브-유사 T 세포는 CD27+CCR7+ 세포를 포함하는, 방법.
  110. 제81항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 도입하는 것은 무혈청 배지에서 수행되는, 방법.
  111. 제94항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인큐베이션 하는 단계는 무혈청 배지에서 수행되는, 방법.
  112. 제100항 또는 제101항에 있어서,
    상기 배양하는 단계는 무혈청 배지에서 수행되는, 방법.
  113. 제110항 내지 제112 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무혈청 배지는:
    기본 배지에 0.5mM 내지 5mM의 디펩타이드 형태의 L-글루타민;
    0.5mM 내지 5mM L-글루타민; 및
    선택적으로 적어도 하나의 단백질;을 포함하고,
    여기서 상기 배지는 무혈청인, 방법.
  114. 제110항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 무혈청 배지는 IL-2, IL-15 및 IL-7, 선택적으로 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-15, 및/또는 재조합 인간 IL-7 중에 선택된 재조합 사이토카인을 포함하는, 방법.
  115. 제110항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 무혈청 배지는 IL-2, IL-15 및 IL-7, 선택적으로 재조합 인간 IL-2, 재조합 인간 IL-15, 및/또는 재조합 인간 IL-7 중에 선택된 재조합 사이토카인을 포함하는 않는, 방법.
  116. 제81항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서,
    기 조작된 세포, 선택적으로 형질도입된 T 세포를 함유하는 상기 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하는 단계를 더 포함하며, 선택적으로 여기서 상기 제제는 상기 조성물에서 상기 올리고머 자극 시약으로부터 상기 하나 이상의 자극제를 해리시키는 조건 하에서 첨가되는, 방법.
  117. 제94항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택적으로 상기 조성물에서 상기 올리고머 자극 시약으로부터 상기 하나 이상의 자극제를 해리시키는 조건 하에서, 상기 인큐베이션된 T 세포를 함유하는 상기 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  118. 제100항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택적으로 상기 조성물에서 상기 올리고머 자극 시약으로부터 상기 하나 이상의 자극제를 해리시키는 조건 하에서, 상기 배양된 T 세포를 함유하는 조성물에 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  119. 제116항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제를 첨가하는 단계는 상기 수확 전에 수행되는, 방법.
  120. 제116항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제는 상기 T 세포에 대해 해롭지 않고/거나, 여기서 상기 물질의 첨가는, 상기 경쟁 제제 또는 자유 결합 제제 없이 비교가능하거나 또는 동일한 조건 하에서 상기 T 세포의 인큐베이션에 대비해 생존 T 세포의 백분율을 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 또는 50% 미만으로 감소시키지 않는, 방법.
  121. 제116항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 해리는 상기 T 세포에서 상기 자극 신호를 종결시키거나 감소시키는, 방법.
  122. 제116항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서:
    상기 경쟁 시약 및 자유 결합 제제는 독립적으로 스트렙타비딘-결합 분자; 비오틴; D-비오틴; 비오틴 유사체; 야생형 스트렙타비딘의 44 내지 47 위치에 상응하는 서열 위치에 아미노산 서열 Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47을 가지는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 유사체에 특이적으로 결합하는 비오틴 유사체;로 이루어진 군에서 선택된 분자를 포함하거나; 또는
    상기 경쟁 시약 및 자유 결합 제제는 독립적으로 선택적으로 EDTA 또는 EGTA인, 금속 킬레이트제를 포함하는, 방법.
  123. 제116항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경쟁 시약 및 자유 결합 제제는 독립적으로 D-비오틴, 선택적으로 1mM의 D-비오틴을 포함하는, 방법.
  124. 제81항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포를 세척하는 단계를 더 포함하며, 선택적으로 상기 세척하는 단계는 상기 조성물 내 상기 자극 시약 및/또는 상기 하나 이상의 자극제를 감소시키거나 제거하는 것인, 방법.
  125. 제124항에 있어서,
    상기 세척하는 단계는 상기 수확하는 단계 이전에 수행되는, 방법.
  126. 제1항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포는 항원-특이적 T 세포 또는 이의 집단, 도움 T 세포 또는 이의 집단, 세포독성 T 세포 또는 이의 집단, 기억 T 세포 또는 이의 집단, 또는 조절 T 세포 또는 이의 집단을 포함하는, 방법.
  127. 제1항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포는 CD3+ T 세포를 포함하거나 CD4+ T 세포 및/또는 CD8 T 세포를 포함하는, 방법.
  128. 제1항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 제81항 내지 제93항 중 어느 한 항에 따른 도입하는 단계 전에 상기 조성물의 상기 자극된 세포로부터 T 세포 서브세트를 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 핵산 분자는 상기 선택된 T 세포 서브세트에 도입되는 것인, 방법.
  129. 제1항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 제94항 내지 제99항 중 어느 한 항에 따른 인큐베이션 전에 형질 도입된 세포를 포함하는 상기 조성물로부터 T 세포의 서브세트를 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 선택된 T 세포의 서브세트는 바이러스 통합을 위한 조건 하에서 인큐베이션 되는, 방법.
  130. 제1항 내지 제129 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 제100항 또는 제101항에 따른 배양하는 단계 전에 조작된 세포를 포함하는 상기 조성물로부터 T 세포의 서브세트를 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 선택된 T 세포의 서브세트는 상기 T 세포를 증폭시키기 위한 조건 하에서 배양되는, 방법.
  131. 제1항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 제102항 내지 제109항 중 어느 한 항에 따른 수확하는 단계 전에 조작된 세포를 포함하는 상기 조성물로부터 T 세포의 서브세트를 선택하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 선택된 T 세포의 서브세트는 수확되어 조작된 T 세포의 산출 집단을 생산하는, 방법.
  132. 제129항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포의 서브세트는 나이브-유사 T 세포이거나 나이브-유사 T 세포 상에 발현된 마커에 대한 표면 양성인 T 세포로서 CCR7+CD45RA+, CD27+CCR7+ 또는 CD62L-CCR7+인, 방법.
  133. 제129항 또는 제132항에 있어서,
    상기 나이브-유사 T 세포는 CD27+CCR7+ T 세포를 포함하는, 방법.
  134. 제129항 또는 제132항에 있어서,
    상기 나이브-유사 T 세포는 CCR7+CD45RA+ T 세포를 포함하는, 방법.
  135. 제129항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포의 서브세트는 선택적으로 키메라 항원 수용체인 재조합 단백질을 발현하는 것인, 방법.
  136. 제129항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포의 서브세트를 선택하는 단계는 친화도 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행되는, 방법.
  137. 제102항 내지 제108항, 제125항 및 제129항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서,
    선택적으로 제약 상 허용되는 부형제(excipient)의 존재 하에서, 동결보존 및/또는 대상체에게 투여를 위해 상기 수확된 세포를 제제화 하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  138. 제102항 내지 제108항, 제125항 및 제129항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수확된 세포는 동결보호제의 존재 하에서 제제화 되는, 방법.
  139. 제1항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정지 상은 크로마토그래피 매트릭스이거나 이를 포함하는 것인, 방법.
  140. 제1항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정지 상은 정지 상의 mL 당 약 7천5백만 내지 약 1억 2천5백만개의 T 세포의 결합능력(binding capacity), 선택적으로 정적 결합능력 또는 동적 결합능력을 가지는 것인, 방법.
  141. 제1항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서:
    (a) 상기 정지 상은 약 20mL; 이며/이거나
    (b) 상기 정지 상은 20억 ± 5억개 세포의 결합 능력을 갖는 것인, 방법.
  142. 제1항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서,
    2개의 정지 상을 포함하는, 방법.
  143. 제142항에 있어서,
    상기 2개의 정지 상은 병행 배열되는, 방법.
  144. 제142항에 있어서,
    상기 2개의 정지 상은 순차적으로 배열되는, 방법.
  145. T 세포 온-컬럼 자극을 위한 제조 물품으로서, 상기 제조 물품은:
    (a) T 세포 표면 상의 제1 분자 및 제2분자에 각각 특이적으로 결합하여 이로써 T 세포를 자극할 수 있는 제1 자극제 및 제2자극제; 및
    (b) T 세포 상의 선택 마커에 특이적으로 결합하여 이로써 상기 정지 상에 상기 T 세포를 고정시킬 수 있는 선택 제제를 포함하는 정지 상;을 포함하는, 제조 물품.
  146. 제145항에 있어서,
    상기 정지 상은 상기 제1 자극제 및 상기 제2자극제를 더 포함하는, 제조 물품.
  147. 제145항 또는 제146항에 있어서,
    상기 제1 자극제, 상기 제2 자극제, 및 상기 선택 제제는 선택 시약을 통해서 상기 정지 상에 간접적으로 결합되는, 제조 물품.
  148. 제145항에 있어서,
    자극 시약을 더 포함하며, 상기 제1 자극제 및 상기 제2 자극제는 가역적으로 결합하거나 결합할 수 있는 것인, 제조 물품.
  149. 제145항에 있어서,
    상기 선택 제제는 선택 시약을 통해서 상기 정지 상에 간접적으로 결합되는, 제조 물품.
  150. 제145항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 정지 상은 크로마토그래피 매트릭스이거나 이를 포함하며, 여기서 상기 제조 물품은 상기 크로마토그래피 매트릭스가 전부 또는 일부 함유된 컨테이너를 더 포함하는, 제조 물품.
  151. 제145항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서,
    2개의 정지 상을 포함하는, 제조 물품.
  152. 제151항에 있어서,
    상기 2개의 정지 상은 병행 배열되는, 제조 물품.
  153. 제151항에 있어서,
    상기 2개의 정지 상은 순차적으로 배열되는, 제조 물품.
  154. 제145항 내지 제153항 중 어느 한 항에 따른 제조 물품을 포함하는, 장치.
  155. 제154항에 있어서,
    상기 장치의 하나 이상의 구성요소에 유체적으로 연결되는 유체 입구 및/또는 상기 장치의 하나 이상의 구성요소에 유체적으로 연결되는 유체 출구를 더 포함하는, 장치.
  156. 154항 또는 제155항에 있어서,
    폐쇄(closed) 또는 멸균 시스템에 있는, 장치.
  157. 제154항 내지 제156항 또는 제145항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1항 내지 제144항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용하기 위한 것이며, 상기 방법은 선택적으로 자동화된 방식으로 수행되는 것인, 장치 또는 제조 물품.
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