KR20200046045A - 유전자 조작된 세포를 제조하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
세포 요법용 T 세포의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 조성물, 및 대상체에게 상기 세포를 투여하기 위한 방법이 제공된다. 특히, 본 발명은 유전자 조작된 수용체, 예컨대 유전자 조작된 항원 수용체, 조작된 (재조합) TCR 및 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 다른 재조합 키메라 수용체를 발현하는 조작된 T 세포의 제조에 관한 것이다. 상기 방법의 특징으로는 다른 방법과 비교하여 보다 일관되고 및/또는 예측 가능한 T 세포 생성물을 생성하고 및/또는 낮은 독성이 낮다는 것을 포함한다. 제공된 방법은 자극된 조성물에서 비-나이브 유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 팽창 또는 증식을 유도하는 자극 조건하에서 세포를 인큐베이션하여, 결과적으로 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포의 우선적인 형질전환을 초래할 수 있는 것을 포함한다. 상기 방법의 특징으로는 또한 다른 방법과 비교하여 비용, 단계 수, 및 자원 소비의 감소를 포함할 수 있다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 8월 9일자, 발명의 명칭이 “METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREPARING GENETICALLY ENGINEERED CELLS”인 미국 가특허 출원 제62/543,359호의 우선권을 주장하며, 상기 특허는 그 전체가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2018년 7월 11일에 생성된, 35,434 Kb 크기의 파일명 735042010540SEQLIST.txt으로 제공된다. 상기 서열 목록 전자적 형식 내의 정보는 그 전체가 참조로서 포함된다.
기술분야
본 발명은 세포 요법용 T 세포의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 조성물, 및 대상체에게 상기 세포를 투여하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 유전자 조작된 수용체, 예컨대 유전자 조작된 항원 수용체, 조작된 (재조합) TCR 및 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 다른 재조합 키메라 수용체를 발현하는 조작된 T 세포의 제조에 관한 것이다. 상기 방법의 특징으로는 다른 방법과 비교하여 보다 일관되고 및/또는 예측 가능한 T 세포 생성물을 생성하고 및/또는 낮은 독성이 낮다는 것을 포함한다. 제공된 방법은 자극된 조성물에서 비-나이브 유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 팽창 또는 증식을 유도하는 자극 조건하에서 세포를 인큐베이션하여, 결과적으로 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포의 우선적인 형질전환을 초래할 수 있는 것을 포함한다. 상기 방법의 특징으로는 또한 다른 방법과 비교하여 비용, 단계 수, 및 자원 소비의 감소를 포함할 수 있다.
치료적 용도를 위한 세포를 제조하고 세포를 투여하기 위한 다양한 방법이 이용 가능하다. 예를 들어, 상기 방법은 T 세포를 포함한 세포의 제조, 조작 및 세포 요법에 이용 가능하며, 상기 방법은 특정 서브-집단의 고갈 또는 농축을 포함하는 방법을 포함한다. 개선된 방법, 예를 들어, 특정 입양 세포 요법 투여와 관련된 독성을 감소하고, 제조 공정을 개선하고, 개선된 투여를 가능하게 하고, 및/또는 비용 또는 다른 자원을 감소하는 방법이 요구된다. 이러한 요구를 충족하는 방법, 세포, 조성물, 키트, 및 시스템이 제공된다.
T 세포를 유전적으로 조작하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 생성하는 단계로서, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하고, 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약을 포함하는 단계; 및 유전자 조작된 재조합 수용체를 T 세포의 자극된 조성물로 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 상기 도입 단계는 적어도 인큐베이션 단계의 일부 동안 수행되는 단계를 포함한다.
T 세포를 유전적으로 조작하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 생성하는 단계로서, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하고, 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약을 포함하는 단계; 및 자극 조건하에서 투입 조성물을 인큐베이션하는 단계는 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전, 동안 및 또는 이후 수행되는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 단계는 적어도 3 일 동안 수행된다. 일부 경우에, 인큐베이션 단계는 적어도 4 일 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 단계는 적어도 5 일 동안 수행된다. 일부 구현예에서,인큐베이션 단계는 적어도 6 일 동안 수행된다.
T 세포를 자극하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, (a) 자극 조건하에서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양-개시량을 포함하는 T 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 제조하는 단계; 및 (b) 자극된 세포 조성물 내로 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하며, 이에 따라 상기 방법은 유전자 조작된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, T 세포는 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하며, 이러한 자극 조건은 자극된 조성물 내 비-나이브 유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 팽창 또는 증식을 우선적으로 유도한다. 일부 구현예에서, 도입 단계는 인큐베이션 단계 중 적어도 일부 동안 수행되거나 또는 인큐베이션 단계 이후 수행된다.
일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 (약) 0.1 x 108 내지 5 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 4 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 2 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 1 x 108, (약) 1 x 108 내지 5 x 108 (약) 1 x 108 내지 4 x 108, (약) 1 x 108 내지 2 x 108, (약) 2 x 108 내지 5 x 108, (약) 2 x 108 내지 4 x 108 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트이다. 일부 경우에, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 적어도 (약) 0.5 x 108, 0.75 x 108, 1 x 108, 1.5 x 108, 2 x 108, 또는 4 x 108 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트이다. 일부 예시에서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 적어도 (약) 2 x 108 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트이다.
T 세포를 자극하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, 자극 조건하에서, (약) 1 x 108 내지 4 x 108 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양-개시량을 포함하는 T 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, T 세포는 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하며, 이러한 자극 조건은 자극된 조성물 내 비-나이브 유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 팽창 또는 증식을 우선적으로 유도한다.
일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 적어도 (약) 2 x 108 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트이다. 일부 양태에서, 배양 개시량은 나이브-유사 CD8+ T 세포의 양이다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 CD8+ T 세포는 CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는 CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는 CD95의 낮은 발현을 가지고; 및/또는 IL-2, IFN-γIL-4, IL-10으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 세포 또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는 CD45RO, CD56, KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는 CD95의 낮은 발현을 가진다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA+, CD27+, CCR7+, CD62-, 및/또는 CD45RO-이다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 비-나이브-유사 T 세포는 CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는 CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1, 및 퍼포린으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는 IL-2, IFN-γIL-4, IL-10으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현에 대해 양성이고; 및/또는 CD95의 높은 발현을 가진다. 일부 양태에서, 비-나이브-유사 T 세포는 CD45RA-, CD27-, CCR7-, CD62+, 및/또는 CD45RO+이다.
일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는, 인큐베이션 단계 이전에, 나이브-유사와 비-나이브-유사 T 세포 사이에서 분화하는 내인성 T 세포 표면 마커에 기초하는 선별 단계를 거치지 않았거나, 또는 거치지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 유전자 조작된 재조합 수용체를 자극된 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하며, 이에 따라 상기 방법은 유전자 조작된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성한다. 일부 경우에, 자극 조건하에서 조성물의 인큐베이션 단계는 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전, 동안 및 또는 이후 수행된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인, 및/또는 이에 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있다. 일부 예시에서, 질병, 장애 또는 병태는 감염성 질병 또는 장애, 자가면역 질병, 염증성 질병, 또는 종양 또는 암이다. 일부 예시에서, 표적 항원은 종양 항원이다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 αvβ인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), 탄산무수화효소 9 (CAIX), Her2/neu (수용체 타이로신 키나제 erbB2), L1-CAM, B7-H3, B7-H6, 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250로도 알려짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 알려짐), 암배아 항원 (CEA), ? B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), 표피 성장 인자 단백질 (EGFR), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이합체, III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 엽산 결합 단백질 (FBP), Fc 수용체 유사 5 (FCRL5; 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (fetal AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD3, 글리피칸-3 (GPC3), G 단백질 연결 수용체 5D (GPRC5D), Her2/neu (수용체 타이로신 키나제 erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원 (HMW-MAA), 간염 B 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 유착 분자 (L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린 (MSLN), c-Met, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 천연 세포 유착 분자 (NCAM), 종양태아성 항원, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA), 수용체 타이로신 키나제 유사 고아 수용체 1 (ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), 종양-관련 당단백 72 (TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1 (TRP1, 또한 TYRP1 또는 gp75로도 알려짐), 티로시나아제 관련 단백질 2 (TRP2, 또한 도파크롬 토토머라제, 도파크롬 델타-아이소머라제 또는 DCT로도 알려짐), 엽산 수용체-a, 8H9, 이중 항원, 당단백 100 (gp100), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGF-R2), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, Wilms 종양 1 (WT-1), 병원체-특이 또는 병원체-발현 항원, 및 보편적인 표지와 관련된 항원에 의해 발현되는 분자로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 기능적 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 항원-결합 도메인을 포함하는 세포 외 도메인을 포함하며, 선택적으로 이러한 항원-결합 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에, 항원-결합 도메인은 항체 또는 이의 항체 단편이거나, 또는 이를 포함하고, 상기 단편은 선택적으로 단일 사슬 단편이다. 일부 양태에서, 단편은 유연한 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 포함한다. 일부 예시에서, 단편은 scFv를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 수용체는 세포 내 신호전달 영역을 포함한다. 일부 예시에서, 세포 내 신호전달 영역은 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 내 신호전달 영역은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체 (TCR) 요소의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타 (CD3ζ사슬의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 이의 신호전달 부분이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체는 세포 외 도메인과 세포 내 신호전달 영역 사이에 배치된 막횡단 도메인을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 세포 내 신호전달 영역은 공동자극 신호전달 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 영역은 T 세포 공동자극 분자의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함한다. 일부 경우에, 공동자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항원에 특이적인 scFv, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB이거나 이를 포함), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인이거나 이를 포함)을 포함하며, 선택적으로 막횡단 도메인과scFv 사이에 스페이서를 추가로 포함하거나; CAR은, 순서대로, 항원에 특이적인 scFv, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB 신호전달 도메인이거나 이를 포함), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인)을 포함하거나; 또는 CAR은, 순서대로, 항원에 특이적인 scFv, 스페이서, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인이거나 이를 포함)을 포함한다.
일부 구현예에서, 공동자극 신호전달 영역은 막횡단 도메인과 세포 내 신호전달 영역 사이에 있다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 자극 조건은 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있고; TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있고; 및/또는 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 자극 시약과 함께 인큐베이션 하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약과 함께 인큐베이션을 포함한다. 일부 경우에, 자극 시약은 TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합하는, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 시제를 포함한다. 일부 구현예에서, 1차 시제는 항체 또는 항원-결합 단편이다.
일부 예시에서, 자극제는 T 세포 공동자극 분자에 대해 특이적으로 결합하는 2차 시제를 추가로 포함하며, 선택적으로 공동자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 1차 시제는 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 1차 및 2차 시제로는 항체를 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 자극제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와의 인큐베이션을 포함한다.
일부 구현예에서, 1차 및/또는 2차 시제는 고체 지지체의 표면 상에 존재한다. 일부 경우에, 고체 지지체는 비드이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드는 직경이 (약) 3.5 μm 이상이지만, 약 9 μm 이하, 또는 약 8 μm 이하, 또는 약 7 μm 이하, 또는 약 6 μm 이하, 또는 약 5 μm 이하이다. 일부 예시에서, 비드는 직경이 (약) 4.5 μm이다. 일부 양태에서, 비드는 직경이 림프구 또는 항원 제시 세포와 동일하거나 대략 동일한 크기이다.
일부 구현예에서, 비드는 불활성이다. 일부 경우에, 비드는 폴리스타이렌 표면이거나, 또는 이를 포함하며, 선택적으로 자성 또는 초상자성 코어를 포함한다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 비드 대 세포의 비율이 (약) 1:1 내지 10:1, (약) 1:1 내지 8:1, (약) 1:1 내지 6:1, (약) 1:1 내지 4:1, (약) 1:1 내지 3:1, (약) 2:1 내지 4:1, (약) 2:1 내지 3:1, (약) 1:1 내지 2:1, (약) 4:1 내지 10:1, (약) 4:1 내지 8:1, (약) 4:1 내지 6:1, (약) 6:1 내지 10:1, (약) 6:1 내지 8:1, (약) 8:1 내지 10:1, (약) 1:1 내지 1:10, (약) 1:1 내지 1:8, (약) 1:1 내지 1:6, (약) 1:1 내지 1:4, (약) 1:2 내지 1:3인 비율로 세포와의 인큐베이션을 포함한다. 일부 예시에서, 비드 대 세포의 비율은 (약) 3:1이다. 일부 구현예에서, 비드 대 세포의 비율은 (약) 1:1이다.
T 세포를 유전적으로 조작하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하는 단계로서, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하고, 자극 조건은 항-CD3 항체 및 비드에 부착된 항-CD28 항체인 2차 시제를 포함하는 자극 시약을 포함하며, 인큐베이션 동안 비드 대 세포의 비율은 (약) 1:1 내지 4:1인 단계; 및 유전자 조작된 재조합 수용체를 T 세포의 자극된 조성물로 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 상기 도입 단계는 적어도 인큐베이션 단계의 일부 동안 수행되는 단계를 포함한다.
T 세포를 유전적으로 조작하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하는 단계로서, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하고, 자극 조건은 항-CD3 항체 및 비드에 부착된 항-CD28 항체인 2차 시제를 포함하는 자극 시약을 포함하며, 인큐베이션 동안 비드 대 세포의 비율 (약) 1:1 내지 4:1인 단계를 포함하며; 이러한 자극 조건하에서 투입 조성물을 인큐베이션하는 단계는 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전, 동안 및 또는 이후 수행된다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, T 세포는 생물학적 샘플로부터 유래하며, 선택적으로 생물학적 샘플은 인간 대상체로부터 유래한다. 일부 경우에, 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 샘플, 분별되지 않은 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집 생성물, 또는 백혈구성분채집 생성물이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하며 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2:1 내지 (약) 1:5이다. 일부 경우에, CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 비율은 (약) 1:1, 1:2, 2:1, 1:3, 또는 3:1이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 나이브-유사 CD4+ T 세포 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포를 포함한다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 다클론성이다. 일부 경우에, 나이브-유사 T 세포의 클론성은 클론 시퀀싱, 선택적으로 차세대 시퀀싱, 또는 스펙트럼 유형 분석에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포의 존재, 양, 개수 또는 백분율은 유세포 분석에 의해 검출된다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 자극 조건은 N-아세틸시스테인 (NAC)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 IL-15 및/또는 IL-7을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 사멸 또는 비-나이브 유사 T 세포 또는 이의 서브집단을 야기하거나 또는 유도한다. 일부 양태에서, 자극 조건은 비-나이브 유사 T 세포 또는 이의 서브집단의 활성화-유도 세포 사멸 (AICD)을 야기한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 인큐베이션 동안 및/또는 자극된 조성물에 DNAase를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 일 이상 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포로부터 유래된, 자극된 조성물 내 세포 백분율은 투입 조성물 내 나이브-유사 세포의 백분율과 비교하여 (약) 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 50 배, 100 배 이상 증가된다. 일부 구현예에서, 자극된 조성물 내, 비-나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포로부터 유래한 세포의 비율은, 투입 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 비율과 비교하여 (약) 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배 , 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 50 배, 100 배 이상 증가한다.
일부 경우에, 자극된 조성물은 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포의 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극된 조성물은 비-나이브 유사 T 세포로부터 유래된 세포의 10% 미만을 포함한다. 일부 예시에서, 자극된 조성물은 비-나이브 T 세포로부터 유래된 세포의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 이하를 포함한다.
일부 구현예에서, 투입 조성물 내 세포 중에서, 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 더 큰 백분율의 나이브-유사 T 세포가 증식 및/또는 활성화되도록 유도된다. 일부 양태에서, 투입 조성물 내 나이브-유사형이었던 T 세포의 더 큰 백분율은 투입 조성물 내 비-나이브-유사형이었던 T 세포의 백분율과 비교하여, 상기 인큐베이션의 개시 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일에 분열한다. 일부 경우에, 자극 조건은, 이러한 조건하에서 인큐베이션의 개시 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일에, 인간 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 더 큰 백분율의 인간 나이브-유사 T 세포 집단의 세포의 증식을 유도할 수 있다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 비-나이브-유사 T 세포는 효과기 T (TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중추 기억 T 세포 (TCM), 효과기 기억 T (TEM) 세포, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되거나; 또는 비-나이브-유사 T 세포는 효과기 T (TEFF) 세포 및/또는 기억 T 세포를 포함하는 또는 이로 구성되며, 여기서 기억 T 세포는 선택적으로 중추 기억 T 세포 (TCM) 및/또는 효과기 기억 T (TEM) 세포를 포함하는, 복수의 T 세포이다.
일부 구현예에서, 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포의 백분율은 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 자극된 조성물 내 조작된 세포의 백분율보다 작다. 일부 구현예에서, 핵산과 함께 도입된 세포의 더 많은 백분율은, 투입 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포의 증식이거나, 또는 이로부터 유래된다.
임의의 이러한 일부 구현예에서, 도입은 형질전환에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 핵산은 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 도입은 핵산 분자를 포함하는 트랜스포존(transposon)의 전위에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 자극된 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 비율은 투입 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 비율과 비교하여 (약) 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 50 배, 100 배 이상 증가한다. 일부 구현예에서, 자극된 조성물운 투입 조성물과 비교하여 더욱 다클론성이거나 또는 다클론성이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행된다.
본 명세서에 제공된 임의의 방법에 의해 생성된 산출 조성물이 제공된다. 또한 기재된 산출 조성물을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 약제학적 담체를 추가로 포함한다.
기재된 임의의 방법에 의해 생성된 산출 조성물 또는 기재된 임의의 약제학적 조성물을 포유동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다 일부 구현예에서, 세포는 세포가 투여되는 대상체로부터 유래된다.
도 1A-1D는 기저 배지 (Bead-Basal Media), 또는 올리고머 자극 시약 (올리고머)에서 비드-기반의 자극 시약 (비드), 비드 기반의 자극 시약 및 인큐베이션을 수반하는 팽창 및 비-팽창 공정으로부터 생성된 CAR+ T 세포 조성물의 결과를 도시한다 . 도 1A는 CCR7 및 CD27 모두에 대해 양성인 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 백분율을 도시한다. 도 1B는 CD4+CAR+T 세포에 대한 CCR7+CD27+세포의 백분율을 도시한다. 도 1C는 CD8+CAR+T 세포에 대한 CCR7+CD27+세포의 백분율을 도시한다. 도 1D는 제1일의 활성화 (d1 AMAT), 제2일의 형질전환 (d2 XMAT), 및 배양 개시 이후 다양한 시점 (d4 INOC+2, d6 INOC+4, d7 INOC+5)을 포함하여, 제조 공정 동안의 다양한 날짜에 팽창 공정에서 대표 공여자로부터 생성된 CCR7+ CD27+ 세포의 백분율을 나타낸다.
도 2A-2D는 CAR+ T 세포 조성물이 투여된 대상체에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 도시하며, 대상체는 다음을 투여받은 그룹으로 나뉜다: CD4+ CAR+ T 세포 중 CCR7+CD27+ CAR+ T 세포의 백분율을 포함하는 조성물 (도 2A : 무진행 생존, 도 2C : 반응 기간) 및 CD8+ CAR+ T 세포 중에서 특정 역치 수준 이상 또는 이하인 이를 포함하는 조성물 (도 2B : 무진행 생존, 도 2D : 반응 기간).
도 3은 조작 (CMAT) 이전 단리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물의 T 세포 클론성 및 조작 이후 CD4+ 및 CD8+ 치료적 CAR+T 세포 조성물의 T 세포 클론성을 평가하였다 (섀넌 지수 적용).
도 2A-2D는 CAR+ T 세포 조성물이 투여된 대상체에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 도시하며, 대상체는 다음을 투여받은 그룹으로 나뉜다: CD4+ CAR+ T 세포 중 CCR7+CD27+ CAR+ T 세포의 백분율을 포함하는 조성물 (도 2A : 무진행 생존, 도 2C : 반응 기간) 및 CD8+ CAR+ T 세포 중에서 특정 역치 수준 이상 또는 이하인 이를 포함하는 조성물 (도 2B : 무진행 생존, 도 2D : 반응 기간).
도 3은 조작 (CMAT) 이전 단리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물의 T 세포 클론성 및 조작 이후 CD4+ 및 CD8+ 치료적 CAR+T 세포 조성물의 T 세포 클론성을 평가하였다 (섀넌 지수 적용).
본 명세서에 입양 세포 요법을 위한 세포 제조 공정에서 세포를 인큐베이션 하는 (예컨대, 자극하는) 방법, 상기 방법에 의해 제조된 조성물 및 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포를 포함하며, 일부 양태에서 이는 유전자 조작된 항원 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 유전자 조작된 또는 재조합 T 세포 수용체 (TCR) 및 기능적 비-TCR 항원 수용체 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다.
일부 구현예에서, T 세포를 인큐베이션하는 (예컨대, 자극하는) 방법이 제공된다. 상기 방법은 T 세포의 자극을 위해 항-CD3 및 항-CD28을 사용하였다. 그러나, 현재 이용 가능한 방법은 인큐베이션 과정을 통해 세포의 구체적인 표적 집단을 수득하고 더욱 바람직한 T 세포 집단 및 이의 유익한 결과를 생성하는데 초점을 맞추지 않는다. 이용 가능한 방법은 또한 인큐베이션 과정에서 투입된 T 세포 집단으로부터의 바람직하지 않은 특정 T 세포 집단의 제거나 이의 유익한 결과를 초래하지 않는다. 게다가, 이용 가능한 방법은, 인큐베이션 과정 동안 T 세포 집단으로부터, 유전자 조작된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성하기 위해 사용되는 서브집단을 제거하도록 설계되지 않는다. 이용 가능한 방법은 또한 유전자 조작, 투여, 및/또는 임상 반응에 유리한, 보다 일관된 및/또는 예측 가능한 T 세포 집단을 제조하는 것을 포함하는 이점을 설명하지 않는다.
일부 양태에서, 제공된 구현예는 다른 자극 방법과 비교하여 증가된 수의 보다 균일한 및/또는 예측 가능한 T 세포 조성물을 생성하는 방법을 제공하며, 일부 양태에서, 바람직하지 않은 T 세포 집단, 예컨대, 세포의 존재가 최종 생성물에 이질성을 제공하여 잠재력, 효능 및 안전성을 예측하기 어려울 수 있는 세포 집단을 감소 또는 제거를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 다수 또는 대부분의 유전자 조작된 세포가 비-나이브-유사 T 세포로부터 유래하는, 유전자 조작된 T 세포의 생성과 관련된 문제를 해결한다. 일부 양태에서, 지속성 부족, 고갈 및/또는 독성과 관련된 문제는 비-나이브-유사 T 세포로부터 유래된 유전자 조작된 세포를 포함하는 조성물을 포함하는 입양 T 세포 요법과 관련될 수 있고, 및/또는 비-나이브-유사 T 세포로부터 유래된 유전자 조작된 세포의 백분율 또는 개수가 특정 임계값 초과이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 세포로부터 튜래된 세포가 농축된 유전자 조작된 T 세포 조성물을 생성하는 방법은, 이러한 나이브-유사 세포가 농축되지 않은 다른 방법과 비교하여 건강한 세포 및/또는 증가된 지속성을 나타내는 조성물 내 세포의 백분율의 전반적인 증가와 관련된 특징을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 명세서에 제공된 입양 요법을 위한 조작된 T 세포의 제조 방법 중에는 비-나이브-유사 T 세포로부터 유래된 (또는 CD27-, CD45RA-, CCR7-, CD62L+ 또는 CD45RO+ T 세포로부터 유래된) 세포와 비교하여, 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 (또는 CD27+, CD45RA+, CCR7+, CD62L- 또는 CD45RO- T 세포로부터 유래된) 세포의 우선적인 팽창 또는 증식 또는 유전자 조작을 야기하는 조건을 사용하는 방법이 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포를 포함하는 자극된 조성물을 우선적으로 생산하는 조건하에서, 나이브-유사 T 세포를 포함하는 투입 조성물 내 T 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, T 세포 집단은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포 양자 모두의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 나이브-유사 T 세포와 비교하여 비-나이브-유사 T 세포에서 반응을 우선적으로 유도한다. 일부 경우에, 이러한 반응은 비-나이브-유사 T 세포의 우선적인 활성을 포함하며, 이는, 일부 구현예에서, 세포 사멸을 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화할 수 있는 자극제와의 인큐베이션을 포함하는 자극 조건하에서 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 1차 시제는 CD3에 특이적으로 결합하고 및/또는 공동자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 1차 시제는 항-CD3이거나, 또는 이를 포함하고 2차 시제는 항-CD28이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 경우에, 1차 및 2차 시제는 항체를 포함하고 및/또는 고체 지지체의 표면 상에 존재한다. 일부 예시에서, 고체 지지체는 비드이다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 투입 조성물의 세포를 자극 시약, 예컨대 항-CD3/항-CD28 비드와 함께 인큐베이션하는 것을 포함하며, 이러한 비드 대 세포의 비율은 (약) 1:1 내지 10:1, (약) 1:1 내지 8:1, (약) 1:1 내지 6:1, (약) 1:1 내지 4:1, (약) 1:1 내지 3:1, (약) 4:1 내지 10:1, (약) 4:1 내지 8:1, (약) 4:1 내지 6:1, (약) 6:1 내지 10:1, (약) 6:1 내지 8:1, (약) 8:1 내지 10:1, (약) 1:1 내지 1:10, (약) 1:1 내지 1:8, (약) 1:1 내지 1:6, (약) 1:1 내지 1:4, (약) 1:2 내지 1:3이다. 일부 구체적인 예시에서, 비드 대 세포의 비율은 (약) 3:1이다. 일부 경우에, 비드 대 세포의 비율은 (약) 1:3이다.
상기 방법은 일반적으로 T 세포의 자극된 조성물을 유전적으로 조작하는 단계를 추가로 포함한다. 유전적 조작 단계는 초기 인큐베이션의 개시 후 또는 개시 이후 임의의 시점에, 및/또는 동시에 인큐베이션과 동시에 자극된 조성물 상에서 수행되거나 또는 개시될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 이러한 유전자 조작된 분자를 인코딩하는 핵산과 인큐베이션되어, 핵산이 조성물 내 세포에서 발현된 유전자 조작된 분자 내로 도입되고, 이에 따라 산출 조성물을 생성한다. 유전자 조작된 분자 중에는 단백질, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 유전자 조작된 항원 수용체, 및 다른 재조합 수용체, 예컨대 리간드-결합 세포 외 부분 및 세포 내 신호전달 부분을 가지는 키메라 수용체가 있다.
또한 기재된 방법에 의해 사용 또는 생성된 배양-개시 조성물, 자극된 조성물, 및 산출 조성물이 제공된다. 또한 암 환자를 포함하여, 이러한 조성물 및 세포를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 제조된 조성물 및/또는 세포를 포함하는 키트가 추가로 제공된다.
상기 방법은 유리할 수 있으며, 더욱 바람직한 생성물을 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 제조 공정이 보다 일관되도록 한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포 조작의 후속 단계에서 더욱 균일한 형질전환 및/또는 팽창을 야기하는 세포를 제조한다. 일부 구현예에서, 더욱 균일한 형질전환 및/또는 팽창은 제조 공정을 통해 더욱 예측가능한 T 세포 생성물을 초래할 수 있다. 일부 경우에, T 세포 생성물은 대상체에게 투여하기 위해 더욱 일정하게 투여될 수 있다. 이러한 특징은 일부 맥락에서 입양 세포 요법 이후 대상체에서 잠재적인 독성 및/또는 관련된 결과 및 증상을 감소시키거나 예방할 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 예를 들어 특허 문서, 과학 논문 및 데이터베이스는 각각의 개별 간행물이 개별적으로 참조 문헌으로서 포함된 것과 마찬가지로, 동일하게 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로 포함된다. 본 명세서에 기재된 정의가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 출원에 기재된 정의와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 본 명세서에 기재된 정의는 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된 정의보다 우선한다.
본 출원에서 사용되는 구획 제목은 단지 구조화를 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
I.T 세포의 인큐베이션 (예를 들어, 자극) 방법
본 명세서에 입양 세포 요법을 위한 세포 제조 공정에서 세포를 인큐베이션 하는 (예컨대, 자극하는) 방법, 상기 방법에 의해 제조된 조성물 및 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 T 세포를 포함하며, 이는 일부 구현예에서 유전자 조작된 항원 수용체, 예컨대 유전자 조작된 또는 재조합 T 세포 수용체 (TCR) 및 기능적 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현한다.
일부 구현예에서, T 세포를 인큐베이션 (예컨대, 자극)하는 방법이 제공되며, 상기 방법은, 자극 조건하에서, 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션 하여, 자극된 조성물을 제조하는 단계로서, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양-개시량을 포함하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 자극 조건은 자극된 조성물 내 비-나이브 유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 팽창 또는 증식을 우선적으로 유도한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 자극된 세포 조성물 내로 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 방법은 이에 따라 유전자 조작된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성한다. 일부 양태에서, 도입 단계는 인큐베이션 단계 중 적어도 일부 동안 수행되거나 또는 인큐베이션 단계 이후 수행된다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 세포는, 인큐베이션 단계 이전에, 나이브-유사와 비-나이브-유사 T 세포 사이에서 분화하는 내인성 T 세포 표면 마커에 기초하는 선별 단계를 거치지 않았거나, 또는 거치지 않는다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산의 도입 단계는 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전, 동안 및 또는 이후 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산의 도입 단계 이전에 자극 조건하에서 상기 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산의 도입 단계 동안 자극 조건하에서 상기 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산의 도입 단계 이후에 자극 조건하에서 상기 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 자극 조건은 자성 비드, 세포 표면 모이어티에 결합하는 하나 이상의 시제가 부착된, 자성 비드와 같은 표면을 포함한다. 하나의 구체예에서, 표면은 적어도 항-CD3 항체에 부착되어 있다. 또 다른 구체예에서, 표면은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체에 부착되어 있다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 내 적어도 하나의 T 세포 집단의 적어도 상당 부분은 인큐베이션 단계 이후 제거된다. 하나의 구체예에서, 자극 조건 내 세포 대 비드의 비율은 약 50:1 내지 약 5:1이다. 특정 구체예에서, 비율은 약 100:1 내지 약 1:1이다. 일부 구현예에서, 비율은 약 1:1 내지 1:50이다. 특정 구체예에서, 비율은 적어도 약 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10이다. 하나의 구체적인 구현예에서, 비율은 약 3:1이다. 하나의 구체적인 구현예에서, 비율은 약 1:3이다.
본 명세서에 제공된 방법의 일부 구현예에서, 배양 조건은 나이브-유사 T 세포와 비교하여 비-나이브-유사 T 세포의 증식, 자극, 및/또는 활성화를 우선적으로 유도한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 (예컨대, 자극) 방법은 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포로부터 유래된, 원하는 개수로 세포로 구성된 원하는 산출 조성물을 생성한다. 본 명세서에 기재된 T 세포 자극 방법을 사용하는 일부 구현예에서, 투입 조성물 내 세포 중에서, 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 더 큰 백분율의 나이브-유사 T 세포가 증식하도록 유도되고 및/또는 팽창된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 자극 방법으로부터 생성된 자극된 조성물은 비-나이브 유사 T 세포로부터 유래된 세포의 10% 미만을 포함한다. 일부 예시에서, 자극된 조성물은 비-나이브 T 세포로부터 유래된 세포의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 이하를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 내 나이브-유사형이었던 T 세포의 더 큰 백분율은 투입 조성물 내 비-나이브-유사형이었던 T 세포의 백분율과 비교하여, 상기 인큐베이션의 개시 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일에 분열한다. 일부 경우에, T 세포 자극 방법의 자극 조건은 특히 세포의 서브집단의 세포 사멸을 유도한다. 구체적인 예시에서, 상기 방법의 자극 조건은 비-나이브-유사 T 세포의 활성화를 유도하여, 활성화-유도 세포 사멸 (AICD)을 유도한다.
하나의 양태에서, 상기 방법은 투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포를 우선적으로 활성화하여, 투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포의 세포 사멸을 유도하고, 자극된 조성물로부터 투입 조성물의 비-나이브-유사 세포로부터 유도된 T 세포를 제거한다. 동시에, 남아있는 원하는 세포, 예컨대, 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포는 팽창하기 위해 활성화, 생존 및 자극되어, 원하지않는 T 세포 서브집단 중 적어도 상당 부분이 제거된 활성화된 세포 집단을 생성한다. 게다가, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제공되는 인큐베이션 (예컨대, 자극) 조건은 스펙트럼 유형 분석 또는 클론성을 정량화하는 다른 방법에 의해 지시된, 발현된 TCR 유전자와 관련하여 T 세포 집단에 대한 다클론성을 회복시킨다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 산출 조성물 내 세포의 시그니처는 특이적인 마커의 발현에 의해 지시된다.
A. 투입 조성물
제공된 T 세포의 인큐베이션 (예컨대, 자극) 방법에서, 상기 방법은, 자극 조건하에서, T 세포의 집단을 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션 하는 단계를 포함한다. 투입 조성물은, 일부 양태에서, 예컨대 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 집단은 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 세포의 배양-개시량을 포함한다. 일부 경우에, 세포의 배양-개시량은 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 양에 기초한다. 일부 양태에서, T 세포, 예컨대 나이브-유사 T 세포 및/또는 비-나이브-유사 T 세포에 대한 특이적인 서브세트는 특이적 마커 또는 시그니처를 사용하여 식별될 수 있다. 일부 구체적인 예시에서, 세포 표면 마커의 발현은 T 세포의 서브세트를 평가 및/또는 식별하는데 사용된다. 일부 양태에서, 투입 조성물의 클론성이 특징분석될 수 있다.
일부 양태에서, 인큐베이션 및/또는 조작되는 세포의 조성물, 예컨대 투입 조성물은, 나이브-유사 T 세포의 이전 선별을 거친 바가 없으며, 거치지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 투입 조성물 중 나이브-유사 세포의 양성 또는 음성 선별 또는 농축을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 인큐베이션 및/또는 조작되는 세포의 조성물, 예컨대 투입 조성물 및/또는 자극된 조성물은, 인큐베이션 (예컨대, 자극) 단계 이전에 이러한 선별을 거친 바가 없으며, 거치지 않는다. 일부 구현예에서, 세포는, 인큐베이션 단계 이전에, 나이브-유사 및 비-나이브-유사 T 세포 사이를 분화하는 T 세포 표면 마커, 예컨대 CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD56, CD62L, CD95, KLRG1, 또는 CCR7의 수준 또는 존재에 기초하여 선별 단계를 거친 바가 없고 및/또는 거치지 않는다. 예를 들어, 일부 양태에서, 투입 조성물 내 세포는 자극 조건 하에서 인큐베이션 이전에, 이러한 마커의 발현 또는 표면 발현에 기초하는 선별을 거친 바가 없다. 일부 양태에서, 자극된 조성물 내 세포는 유전자 조작 단계 이전에, 예컨대, 핵산과의 인큐베이션 이전에 이러한 마커의 발현 또는 표면 발현에 기초한 선별을 거치지 않는다. 일부 양태에서, 투입 조성물의 인큐베이션 단계는 나이브-유사 T 세포를 농축시키기 위한 마커의 표면 발현에 기초한 선별 없이 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 다른 방법과 비교하여 더 적은 선별 단계를 포함하며, 예컨대, T 세포의 서브세트의 선별을 포함하지 않으므로 더욱 단순하며, 다중-단계 선별 방법과 비교하여 비용- 및/또는 자원-절약의 이점과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 기억 T 세포 또는 서브세트 이의 및/또는 나이브-유사 T 세포에 대해 특징적인 마커의 발현에 기초하는 농축을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 인큐베이션되는 (예컨대, 자극되는) 세포의 조성물, 예컨대 투입 조성물 및/또는 자극된 조성물은, 이러한 선별을 거친 바가 없으며, 거치지 않는다.
일부 예시에서, 상기 방법은 비-나이브-유사 T 세포에 특징적인 또는 T 세포의 특정 서브세트, 예컨대 CD62L, CCR7, CD27, CD28, CD56, CD3, CD122, CD95, CD25, IL7-Rα 및/또는 CD127를 구별하는 마커에 기초하는 양성 선별을 포함하지 않는다. 일부 예시에서, 상기 방법은 CD62L, CCR7, CD27, CD28, CD56, CD3, CD122, CD95, CD25, IL7-Rα 및/또는 CD127의 발현에 기초한 양성 선별 또는 농축을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 이러한 마커에 기초하여 또는 특이적인 서브-유형을 농축시키기 위해 농축된 또는 양성 선별된 샘플 또는 조성물을 사용하지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 나이브-유사와 비-나이브-유사 T 세포 사이를 분리 도는 구별하도록 설계된 친화도-기반의 선별 단계를 포함하지 않는다. 일부 예시에서, 상기 방법은 나이브-유사 또는 비-나이브-유사 세포에 특징적인 마커, 또는 서로 구별되는 마커, 예컨대 CD27, CD28, CD45RO, CD45RA, CD56, CCR7, CD95, KLRG1, 및/또는 CD62L에 기초하는 양성 선별을 포함하지 않는다. 일부 예시에서, 상기 방법은 이러한 마커의 발현에 기초하는 양성 선별 또는 농축을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 이러한 마커에 기초하여 또는 이러한 서브-유형을 농축시키기 위해 농축된 또는 양성 선별된 샘플 또는 조성물을 사용하지 않는다.
세포
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 예컨대 세포의 자극, 팽창, 증식 및/또는 유전자 조작, 예컨대 형질전환 중 하나 이상의 단계를 포함하는 방법과 관련하여, 나이브-유사 T 세포의 배양-개시량이 포함된 세포의 투입 조성물을 제공하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 세포는 일반적으로 진핵 세포, 예컨대 포유류 세포이며, 통상 인간 세포이다. 투입 조성물은 생물학적 샘플로부터 세포의 단리 또는 선별 단계를 포하마는 다양한 방법에 의해 제조 또는 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 생물학적 샘플로부터 유래된, 예컨대 하나 이상의 단리, 선별 또는 농축 단계로부터 수득 또는 획득된 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포를 포함한다. 일부 구체적인 예시에서, 투입 배양물 중 CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 비율은 (약) 1:1, 1:2, 2:1, 1:3, 또는 3:1이다. 일부 구현예에서, 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포의 혼합물을 포함하는 단리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 투입 조성의 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프성 기관으로부터 유래된 것으로, 면역계, 예컨대 선천성 면역 또는 입양 면역의 세포들이며, 림프구, 일반적으로 T 세포를 비롯한 골수 또는 림프성 세포를 포함하는 샘플로부터의 세포를 포함한다. 세포는 통상 대상체로부터 직접적으로 단리된 및/또는 대상체로부터 단리되고 동결된 것과 같은 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 예컨대 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 능력, 팽창, 재순환, 부위, 및/또는 지속 능력, 항원 특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 장기 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일 및/또는 분화 정도에 의해 정의된 것과 같은, T 세포 또는 전체 T 세포 집단, CD3+, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이러한의 서브 집단과 같은 기타 세포 유형의 하나 이상의 서브세트를 포함한다. 치료되는 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가일 수 있다. 상기 방법들 중에는 기성 방법이 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 대상체로부터 세포를 단리하고, 이를 제조, 가공, 배양 및/또는 조작하고, 이를 냉동 보존 전 또는 이후에 동일한 환자에게 다시 도입시키는 단계를 포함한다.
T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 서브 유형 및 서브 집단 중에는 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포 및 이러한의 서브 유형, 예컨대 줄기 세포 기억 T (TSCM), 중심 기억 T (TCM), 이펙터 기억 T (TEM) 또는 최종 분화된 이펙터 기억 T 세포, 종양-침윤성 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 점막 관련 불변 T (MAIT) 세포, 자연 발생 및 적응 조절 T (Treg) 세포, TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포 등의 T 보조 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포가 포함된다. 일부 구현예에서, 세포는 조절 T 세포 (Treg)이다. 일부 구현예에서, 세포는 재조합 FOXP3 또는 이의 변형체를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 세포의 제조는 하나 이상의 배양 단계 및/또는 제조 단계를 포함한다. 조작을 위한 세포는 샘플, 예컨대 대상체로부터 수득되거나 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 단리된 대상체는 세포 요법을 필요로 하는 질병 또는 질병 상태를 지니거나 또는 세포 요법이 가해질 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 특정 치료적 중재, 예컨대 세포가 단리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 인간이다.
따라서, 일부 구현예에서 세포는 1차 세포, 예컨대 1차 인간 세포이다. 샘플은 조직, 유체 및 상기 대상으로부터 직접 채취한 기타 샘플뿐만 아니라 하나 이상의 가공 단계, 예컨대 분리, 원심 분리, 유전자 조작 (예컨대, 바이러스 벡터를 이용한 형질 도입), 세척 및/또는 배양 단계에서 초래된 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원 또는 가공된 샘플에서 직접 수득한 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀 등의 체액, 이로부터 유래된 가공 샘플을 비롯한 조직 및 기관 샘플을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 세포가 유래되거나 단리되는 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나, 또는 성분채집술 (apheresis) 또는 백혈구성분채집술 (leukapheresis) 산물이거나 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 기타 기관 및/또는 이로부터 유래된 세포를 포함한다. 샘플은 세포 요법, 예컨대, 입양 세포 요법의 맥락에서, 자가 및 동종이계 공급원으로부터 유래된 샘플을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주 (예컨대, T 세포주)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 이종 공급원, 예컨대 마우스, 래트, 비인간 영장류 또는 돼지로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 세포의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화성에 기초한 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 예시에서, 세포는 세척되고, 원심 분리되며 및/또는 하나 이상의 시약 존재하에서, 예컨대 원치 않는 성분을 제거하고 원하는 성분을 풍부하게 하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거하기 위하여 인큐베이션된다. 일부 예시에서, 세포는 하나 이상의 성질, 예컨대 밀도, 부착 성질, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성에 기초하여 분리된다.
일부 예시에서, 환자의 순환 혈액의 세포는, 예컨대 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 수득된다. 일부 양태에서, 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 림프구를 포함하고, 일부 양태에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 대상체로부터 채취된 혈액 세포는, 예컨대 혈장 부분을 제거하고 세포를 후속 공정 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 위치시키기 위하여 세척된다. 일부 구현예에서, 세포는 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 상기 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 다수의 또는 모든 2가 양이온을 가지지 않는다. 일부 양태에서, 세척 단계는 반-자동 "플로우-스루" 원심 분리기 (예컨대, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)를 제조사의 지침에 따라 수행된다. 일부 양태에서, 세척 단계는 상기 제조사의 지침에 따른 접선 유동 여과 (tangential flow filtration; TFF)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충액, 예를 들어 Ca++/Mg++ 없는 PBS에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분은 제거되고 세포는 배양 배지에 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 적혈구를 용해시켜 퍼콜 (Percoll) 또는 피콜 (Ficoll) 구배를 통해 원심 분리하여 말초 혈액으로부터 백혈구를 제조하는 것과 같은 밀도-기반 세포 분리 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리 방법은 표면 마커, 예컨대 표면 단백질, 세포 내 마커 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 마커에 기초한 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 분리는 친화성- 또는 면역친화성- 기반 분리이다. 예를 들어, 일부 양태에서, 상기 단리는 세포의 발현 또는 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 발현 수준에 기초한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함하며, 예컨대 상기 분리는 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 배양에 의해 이루어지고, 뒤이어 일반적으로 세척 단계 및 상기 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포를 상기 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포로부터 분리하는 단계를 거친다.
이러한 분리 단계는 시약에 결합된 세포가 추가적인 사용을 위해 유지된 양성 선별, 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포가 유지된 음성 선별에 기초할 수 있다. 일부 예시에서, 두 분획은 모두 추가적인 사용을 위해 유지된다. 일부 양태에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 이용 가능한 항체가 없는 경우에 특히 유용하여, 분리는 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커에 기초하여 수행되는 것이 가장 바람직하다.
분리는 특정 마커를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선별 또는 농축은, 이러한 세포의 수 또는 퍼센트를 증가시키는 것을 의미하지만, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 초래할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포의 음성 선별, 제거 또는 고갈은, 이러한 세포의 수 또는 퍼센트를 감소시키는 것을 의미하지만, 이러한 모든 세포의 완전한 제거를 초래할 필요는 없다.
일부 예시에서, 하나의 단계로부터 양성 또는 음성으로 선택된 분획이 연속된 양성 선별 또는 음성선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거치는 분리 단계의 다중 라운드가 수행된다. 일부 예시에서, 단일 분리 단계는 예컨대 세포를 다수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 배양함으로써 다중 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있으며, 각각은 음성선택에 대해 표적화된 마커에 특이적이다. 마찬가지로, 여러 세포 유형은, 세포를 다양한 세포 유형에서 발현되는 다수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 배양함으로써 동시에 양성 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 양태에서, 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD56+, CD45RA+, CD95hi, 및/또는 CD45RO+ T 세포의 높은 수준을 발현하는 세포 또는 양성 세포와 같은 T 세포의 특정 서브 집단은 양성 선별 또는 음성선택 기술에 의해 단리된다.
예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 항-CD3/항-CD28 컨쥬게이션 자성 비드 (예를 들어, DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)를 사용하여 양성 선별될 수 있다.
일부 구현예에서, 단리는 양성 선별에 의한 특정 세포 집단의 농축, 또는 음성선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 선별 또는 음성선택은 세포를 각각 양성 또는 음성으로 선택된 세포상에 발현 (marker+) 또는 상대적으로 높은 수준으로 발현 (markerhigh)된 하나 이상의 표면 마커와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 기타 결합제와 함께 배양함으로써 수행된다.
일부 구현예에서, T 세포는 비-T 세포, 예컨대 B 세포, 단핵구 또는 CD14 등의 기타 백혈구에서 발현된 마커의 음성선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 양태에서, CD4+ 또는 CD8+ 선별 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리하도록 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 하나 이상의 나이브, 기억 및/또는 이펙터 T 세포 서브 집단에서 발현 또는 상대적으로 높은 정도로 발현된 마커에 대한 양성 선별 또는 음성선택에 의해 서브 집단으로 추가로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 예컨대 상기 각각의 서브 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 선별 또는 음성 선택에 의하여, 나이브, 중심 기억, 이펙터 기억 및/또는 중추 기억 줄기 세포가 더욱 풍부해지거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축은 예컨대 투여 이후의 장기 생존, 팽창 및/또는 생착을 개선시키 위한 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 이는 일부 양태에서 이러한 서브 집단에서 특히 강력하다. Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701를 참조한다. 일부 구현예에서, TCM-농축 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 결합은 효능을 더욱 증강시킨다.
구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하여, CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+가 풍부해지거나 고갈될 수 있다.
일부 구현예에서, 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축은 CD127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기초하고; 일부 양태에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현 또는 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선별에 기초한다. 일부 양태에서, TCM 세포가 풍부한 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈에 의해, 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선별 또는 농축에 의해 수행된다. 하나의 양태에서, CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선별 및 CD62L에 기초한 양성 선별을 받는, CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축이 수행된다. 이러한 선별은, 일부 양태에서는 동시에 수행되며, 또 다른 양태에서는 어떠한 순서로든 순차적으로 수행된다. 일부 양태에서, CD8+ 세포 집단 또는 부분 집단을 제조하는데 사용된 동일한 CD4 발현-기반의 선택 단계는 또한 CD4+ 세포 집단 또는 서브 집단을 생성하는데에도 사용되어, CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획은 모두 경우에 따라 하나 이상의 추가적인 양성 또는 음성 선별 단계에 이어서, 상기 방법의 후속 단계에서 유지되고 사용된다.
특정 예시에서, PBMC 샘플 또는 다른 백혈구 샘플에는 CD4+ 세포의 선택이 이루어지는데, 여기서는 음성 및 양성 분획 모두가 보유된다. 그 후, 음성 분획은 CD14 및 CD45RA 또는 ROR1의 발현에 기초한 음성 선택, 및 CD62L 또는 CCR7과 같은 중추 기억 T 세포의 마커 특징에 기초한 양성 선택을 받는데, 여기서 상기 양성 및 음성 선택은 어떤 순서로도 수행된다.
CD4+ 보조 T 세포는 세포 표면 항원을 가지는 세포 집단을 동정함으로써 나이브, 중심 기억 및 이펙터 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L-, CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
하나의 실시예에서, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포들을 농축시키기 위하여, 단일클론성 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선별을 위한 세포의 분리를 허용하기 위해, 자성 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 및 세포 집단은 면역 자기성 (또는 친화성 자기성) 분리 기법 (문헌 [Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒHumana Press Inc., Totowa, NJ]에서 검토됨)을 사용하여 분리 또는 단리된다.
일부 양태에서, 분리될 세포의 샘플 또는 조성물은 상자성 비드 (예컨대, Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 같은 자기적 반응 입자 또는 미세 입자 등의 작고 자화가능하거나 자기적 반응 물질과 함께 배양된다. 자기적 반응 물질, 예컨대 입자는 일반적으로 세포, 세포들 또는 세포 집단상에 존재하는 분자, 예컨대 표면 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너, 예컨대 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되고, 이는 분리, 예컨대 음성적으로 또는 양성적으로 선택하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 특이적 결합 구성원, 예컨대 항체 또는 기타 결합 파트너에 결합된 자기적 반응 물질을 포함한다. 일부 양태에서, 자성 분리 방법에 사용되는 자성 반응성 물질이 사용될 수 있다. 적합한 자성 입자는 Molday의 미국 특허 4,452,773, 및 유럽 특허 EP 452342B에 기술된 입자를 포함하며, 상기 특허는 본 명세서에 참조로 포함된다. Owen의 미국 특허 4,795,698 및 Liberti et al.의 미국 특허 5,200,084에 기술된 입자와 같은 콜로이드 크기의 입자가 기타 예시이다.
인큐베이션 단계는 일반적으로, 항체 또는 결합 파트너, 또는 자성 입자 또는 비드에 부착된 그러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 기타 시약 등의 분자가, 샘플 내 세포에 존재한다면 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건하에서 수행된다.
일부 양태에서, 샘플은 자기장 내에 배치되고, 자기적 반응 또는 자화 가능 입자들이 부착된 세포는 자석에 끌려서 표지되지 않은 세포들부터 분리될 것이다. 양성 선별의 경우, 자석에 끌리는 세포들이 유지되고; 음성 선별의 경우, 끌리지 않는 세포들 (표지되지 않은 세포)이 유지된다. 일부 양태에서, 양성 선별 및 음성 선별의 조합은 양성 및 음성 분획이 유지되고 추가로 가공되거나 추가적인 분리 단계에 종속되는 동일한 선택 단계 중에 수행된다.
특정 구현예에서, 자기적 반응 입자들은 1차 항체 또는 기타 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘에서 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자들은 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포들에 부착된다. 특정 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포-유형 특이적 2차 항체- 또는 기타 결합 파트너 (예컨대, 스트렙타비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘-코팅된 자성 입자는 비오틴화된 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 자기적 반응 입자들은 후속적으로 배양 및/또는 조작되는 세포들에 부착된 채로 남고; 일부 양태에서, 입자들은 환자에게 투여되기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 구현예에서, 자화 가능 또는 자기적 반응 입자들은 세포들로부터 제거된다. 세포로부터 자화 가능한 입자들을 제거하는 방법은, 예컨대 경쟁적 비표지된 항체, 자화 가능한 입자 또는 절단 가능한 링커에 접합된 항체 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 자화 가능한 입자들은 생분해성이다.
일부 구현예에서, 친화성-기반의 선별은 자성-활성화된 세포 분류 (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)를 통해 이루어진다. Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) 시스템은 자성 입자가 부착된 세포들을 고순도로 선별할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 비-표적 종 및 표적 종이 외부 자기장의 적용 이후 순차적으로 용출되는 모드로 작동한다. 즉, 자화된 입자들에 부착된 세포들은 부착되지 않은 종들이 용출되는 동안 제 위치에 유지된다. 이어서, 이 제1 용출 단계가 완료된 이후, 자기장에 포획되어 용출되는 것이 방지된 종은 용출 및 회수할 수 있는 어떤 방법으로 유리된다. 특정 양태에서, 비-표적 세포는 표지되고 세포의 이종 집단으로부터 고갈된다.
특정 구현예에서, 단리 또는 분리는 단리, 세포 제조, 분리, 가공, 인큐베이션, 배양 및/또는 제제화 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 기구 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일부 양태에서, 시스템은 밀폐되거나 멸균 환경에서 이러한 각 단계를 수행하기 위해, 예컨대 에러, 사용자 처리 및/또는 오염을 최소화하기 위해 사용된다. 한 예시에서, 한 예에서, 시스템은 국제 특허 출원 WO2009/072003 또는 US 20110003380 A1에 기술된 시스템이다.
일부 구현예에서, 시스템 또는 장치는 통합 또는 자체 내장 시스템에서, 및/또는 자동화되거나 프로그램 가능한 방식으로, 예컨대 모든 분리, 가공, 조작 및 제형 단계 중 하나 이상을 수행한다. 일부 양태에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 가공, 단리, 조작 및 제제화 단계의 결과를 프로그램, 제어, 평가하고, 및/또는 다양한 양상들을 조정할 수 있도록 하는 시스템 또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일부 양태에서, 분리 및/또는 기타 단계는 CliniMACS 시스템 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행되고, 예컨대 닫힌 무균 시스템에서 임상 규모 수준의 세포의 자동 분리를 위해 수행된다. 구성 요소들은 통합 마이크로컴퓨터, 자성 분리 유닛, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브을 포함할 수 있다. 통합 컴퓨터는 일부 양태에서 기구의 모든 구성 요소를 제어하고, 표준화된 순서로 반복적인 절차를 수행하도록 시스템에 지시한다. 자성 분리 유닛은 일부 양태에서 이동 가능한 영구 자석 및 선택 칼럼을 위한 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 튜빙 세트 전체의 유속을 제어하며, 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 제어된 흐름 및 세포의 지속적인 서스펜션을 보장한다.
CliniMACS 시스템은 일부 양태에서 멸균된 비-발열성 용액으로 공급되는 항체 결합 자화 가능 입자를 사용한다. 일부 구현예에서, 자성 입자로 세포를 표지한 이후 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 세포 제조 백은 이후 튜빙 세트에 연결되고, 완충액과 세포 채취 백에 차례로 연결된다. 튜빙 세트는 예비-칼럼과 분리 칼럼을 포함하여 미리 조립된 무균 튜빙으로 구성되어 있으며 일회용으로만 사용된다. 분리 프로그램의 개시 후, 시스템은 자동으로 세포 샘플을 분리 칼럼에 도포시킨다. 표지된 세포들은 칼럼 내에 유지되는 반면, 표지되지 않은 세포들은 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되지 않고 칼럼에 유지되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 칼럼에 유지된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장의 제거 이후 칼럼으로부터 용출되어 세포 채취 백 내에 수집된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 기타 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. CliniMACS Prodigy 시스템은 일부 양태에서 원심 분리에 의한 세포의 자동화된 세척 및 분류를 가능하게 하는 세포 처리 일체로 장착되어 있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 공급원 세포 생성물의 육안으로 보이는 층을 식별함으로써 최적의 세포 분획 종점을 결정하는 내장 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동 분리될 수 있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한, 예컨대 세포 분화 및 팽창, 항원 로딩 및 수명이 긴 세포 배양 등의 세포 배양 프로토콜을 수행하는 통합 세포 배양 챔버를 포함할 수 있다. 투입 포트는 멸균 제거 및 배지의 보충을 허용할 수 있으며 통합 현미경을 사용하여 세포를 모니터할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, 및 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701]를 참조한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 유동 세포 분석법을 통해 채취 및 농축 (또는 고갈)되고, 여기서 여러 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포는 유체 줄기로 운반된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 예비 크기 (FACS) 분리를 통해 채취 및 농축 (또는 고갈)된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 함께 마이크로 전기 기계 시스템 (MEMS) 칩의 사용에 의해 채취 및 농축 (또는 고갈)된다 (예컨대, 문헌 WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10: 1567-1573; 및 Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376 참조). 두 경우 모두 세포를 여러 마커로 표지할 수 있어 명확한 T 세포는 고순도로 단리된다.
일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출 가능한 마커로 표지되어, 양성 및/또는 음성 선별을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어, 분리는 형광 표지된 항체와의 결합에 기초할 수 있다. 일부 예시에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적인 항체 또는 기타 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 유체 줄기에서, 예컨대 예비 크기 (FACS) 및/또는 마이크로 전기 기계 시스템 (MEMS) 칩을 포함하는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를, 유동 세포 검출 시스템과 함께 조합하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 동시에 여러 마커에 기초한 양성 선별 및 음성 선별을 허용한다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 단리, 인큐베이션, 배양 및/또는 조작 전 또는 후에, 세포를 동결, 예컨대 동결 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 및 후속 해동 단계는 과립구 및 어느 정도는 세포 집단 내의 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 예컨대, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 세포는 동결 용액에서 현탁된다. 임의의 다양한 공지된 동결 용액 및 파라미터가 경우에 따라 사용될 수 있다. 한 예시로는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 기타 적합한 세포 동결 배지를 포함하는 PBS를 사용하는 것을 포함한다. 그런 다음 DMSO와 HSA의 최종 농도가 각각 10%와 4%가 되도록 배지와 1:1로 희석된다. 이어서, 세포는 분당 1°의 속도에서 -80 ℃로 동결되고 액체 질소 저장 탱크의 증기상에 저장된다.
a. 나이브-유사 T 세포(Na
ve-like T cell)
일부 구현예에서, 상기 방법은 나이브-유사 T 세포 또는 특청 역치량의 나이브-유사 T 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법의 하나의 양태는 인큐베이션 (예컨대, 자극) 단계 이전에, 다양한 마커의 발현에 기초한 세포의 서브집단에 대해 평가된 투입 조성물을 제공하며, 이러한 마커로는 CD27, CD28, CD56, CD62L, CD95, KLRG1, CD45RA 또는 CD45RO, 사이토카인 (예컨대, IL-2, IFN-γIL-4, IL-10), 사이토카인 수용체 (예컨대, CD25), 퍼포린, 유착 분자 (예컨대, VLA-1, VLA-2, VLA-4, LPAM-1, LFA-1), 및/또는 귀환(homing) 분자 (예컨대, L-Selectin)를 포함한다. 나이브-유사 T 세포를 식별하기 위해, 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포의 다양한 시그니처가 활용될 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포의 특정 마커의 발현이 평가될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 나이브-유사 T 세포는, CD27, CD28, CD45RA, CD62L, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택되는 T 세포 활성화 마커를 비롯한, 마커에 대해 표면 양성이다. 일부 양태에서, 나이브-유사 T 세포는 CD56 및/또는 CD45RO에 대해 표면 음성이다. 일부 양태에서, 나이브-유사 T 세포는 CD45RO에 에 대해 표면 음성이고, CD27, CD45RA, 및 CCR7에 대해 세포 표면 양성이다. 일부 경우에, 나이브-유사 T 세포는 사이토카인 예컨대 IL-2, IFN-γIL-4, 및/또는 IL-10의 세포 내 발현에 대해 음성이다. 일부 추가의 예시에서, 나이브-유사 T 세포는 마커 CD25 및/또는 퍼포린의 발현에 대해 음성이다. 일부 경우에, 나이브-유사 T 세포는 CD95lo이다.
나이브-유사 T 세포의 마커의 발현을 평가하기 위해, 일부 구현예에서 상기 방법은 시험관 내 분석을 수행함으로써 마커를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 예시에서, 시험관 내 분석은 면역분석, 앱타머-기반 분석, 조직학적 또는 세포학적 분석, 또는 mRNA 발현 수준 분석이다. 일부 구현예에서, 시험관 내 분석은 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA), 면역 블로팅, 면역표현형 검사법, 면역 침전법, 방사 면역 분석법 (RIA), 면역 염색법, 유동 세포 측정 분석법, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 화학발광 분석, 측면 흐름 면역분석, 억제 분석 또는 열성 분석일 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포의 마커 발현은 RNA-시퀀싱에 의해 결정된다.
투입 조성물의 나이브-유사 T 세포는 또한 T 세포의 클론성에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포 집단의 클론성 평가는 T 세포 집단의 클론 다양성의 평가이다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 다클론성 또는 다중클론성이다. 상기 T 세포의 투입 조성물의 다클론성은 주어진 항원에 대한 집단의 반응의 폭에 의해 측정된다. 일부 양태에서, 투입 조성물은 항원-특이적 세포에 의해 인식되는 상이한 에피토프의 수를 측정함으로써 평가될 수 있다. 이는 클로닝 항원-특이적 T 세포를 시험관 내 생성 및 클로닝하기 위한 표준 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 나이브-유사 T 세포 집단에서 우세한 단일 클론형(clonotypic) 집단을 가지지 않는 다클론성 (또는 다중클론성)이다.
일부 양태에서, 투입 조성물과 같은 T 세포의 집단의 관점에 있어서, 다클론성의 시그니처는 다수의 광범위한 항원 특이성을 가지는 T 세포의 집단을 지칭한다. 일부 구현예에서, 다클론성은 TCR 레퍼토리에서 높은 다양성을 나타내는 T 세포의 집단에 관한 것이다. 일부 경우에, TCR 레퍼토리의 다양성은, 일부 측면에서, 자기 및 외래 항원에 대한 선별 사건에 의해 유발되는 V(D)J 재조합 사건에 기인한다. 일부 구현예에서, 다양한 또는 다클론성인 T 세포의 집단은, 분석이 집단 내 존재하는 복수의 다양한 또는 상이한 TCR 전사체 또는 생성물의 존재를 나타내는 T 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, 높은 또는 상대적으로 높은 클론성을 나타내는 T 세포의 집단은 TCR 레퍼토리가 덜 다양한 T 세포의 집단이다. 일부 구현예에서, 분석이 T 세포의 집단에서 2 개 또는 3 개와 같은 여러 개의 TCR 전사체 또는 생성물의 존재를 나타내는 경우, T 세포는 올리고클론성이다. 일부 구현예에서, 분석이 T 세포의 집단에서 단일 TCR 전사체 또는 생성물의 존재를 나타내는 경우, T 세포는 단일클론성이다.
투입 조성물 내 세포, 예컨대 나이브-유사 T 세포의 클론성은, 일부 예시에서, 클론 시퀀싱, 선택적으로 차세대 시퀀싱, 또는 스펙트럼 유형 분석에 의해 결정된다. 일부 양태에서, 차세대 시퀀싱 방법은 상보성 결정 영역 3 (CDR3)을 인코딩하는 서열을 포함하여 TCR 레퍼토리를 분석하기 위해, T 세포로부터 게놈 DNA 또는 cDNA를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-시퀀싱에 의한 전체 전사체 시퀀싱이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일-세포 시퀀싱 방법이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다클론성은 스펙트럼 유형 분석 (TCR VβVα, Vγ또는 Vδ사슬 초가변 영역 레퍼토리의 측정)에 의해 평가 또는 결정될 수 있다. 주어진 TCR VβVα, Vγ또는 Vδ패밀리에 대한 Vβ스펙트럼 유형 프로파일이 다수의 피크, 일반적으로 5 개 이상의 우세한 피크를 가지며 대부분의 경우 가우시안 분포를 가지는 경우, T 세포의 집단은 다클론성으로 간주된다. 다클론성은 관심 항원에 대한 항원-특이적 클론의 생성 및 특징 분석에 의해 정의될 수 있다.
일부 구현예에서, 클론성 평가 방법으로는 국제 공개 번호 WO2012/048341, WO2014/144495, WO2017/053902, WO2016044227, WO2016176322 및 WO2012048340에 기재된 방법의 다양한 특징을 포함할 수 있으며, 상기 특허 각각은 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 TCR과 같은 세포 내에 관심 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 서열 정보를 수득하는데 사용될 수 있다. 표적 유전자는 샘플 또는 세포 집단으로부터 세포의 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 획득할 수 있다. 샘플 또는 세포 집단은 면역 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 TCR 분자에 대하여, TCR의 사슬을 인코딩하는 유전자는 면역 세포 또는 T 세포의 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 출발 물질은 TCR의 사슬에 대해 인코딩하는 유전자로 구성된 T 세포로부터의 RNA이다.
일부 구현예에서, 섀넌 지수(Shannon index)는 클론을 여과하기 위한 역치로서 클론성 (“Shannon-adjusted clonality”)에 적용되며, 문헌 [Chaara et al. (2018) Front Immunol 9:1038)]을 참고한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 투입 조성물로부터 T 세포 집단 또는 이의 서브세트의 다클론성의 증가를 촉진 또는 야기한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 투입 조성물로부터 T 세포 집단 또는 이의 서브세트의 다양성의 증가를 촉진 또는 야기한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션된 또는 자극된 조성물의 T 세포, 또는 이의 CD4 또는 CD8 서브세트는 T 세포, 또는 이의 CD4 또는 CD8 서브세트와 비교하여 상기 방법을 수행하기 전 감소된 클론성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 클론성의 정도는 (약) 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배 이상 감소된다.
제공된 방법의 하나의 양태에서, 투입 조성물 내 T 세포의 집단은 활성화 또는 자극되어, “세포 인큐베이션” 섹션에 기재된 바와 같이 세포 사멸을 유도하여, 세포 집단으로부터 서브집단을 제거한다. 동시에, 남아있는 원하는 세포, 예컨대, 나이브-유사 T 세포는 팽창하기 위해 활성화 및 자극되어, 원하지 않는 T 세포 서브집단 (예컨대, 비-나이브 유사 T 세포) 중 적어도 상당 부분이 제거된 활성화된 세포 집단을 생성한다. 전술한 바와 같이, 본 명세서에 기재된 자극/활성화는 세포 집단을 전-세포사멸 조성물에 직접적으로 노출시킨 후 남아있는 세포에서 수행될 수 있다. 게다가, 본 명세서에 의해 제공되는 후속 자극 및 활성화는 스펙트럼 유형 분석 또는 시퀀싱 방법에 의해 지시된, 발현된 TCR 유전자와 관련하여 T 세포 집단에 대한 다클론성을 회복시킨다.
배양-개시량
제공된 방법의 하나의 양태에서, 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포의 우선적인 활성화 또는 팽창을 위한 배양-개시량을 포함한다. 일부 경우에, 배양-개시량은 조성물 내 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 수를 포함하거나, 이로 결정되거나, 이에 기초한다. 이에 따라, 제공된 방법의 양태에서 인큐베이션 (예컨대 자극) 단계는 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포의 역치 또는 배양-개시량이 존재하기 때문에 비-나이브 T 세포의 전체 개수 또는 백분율과 상관 없이 수행된다.
세포를 인큐베이션 (예컨대 자극)하는 본 명세서에 제공되는 방법의 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 (약) 0.1 x 108 내지 5 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 4 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 2 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 1 x 108, (약) 1 x 108 내지 5 x 108 (약) 1 x 108 내지 4 x 108, (약) 1 x 108 내지 2 x 108, (약) 2 x 108 내지 5 x 108, (약) 2 x 108 내지 4 x 108개의 나이브-유사 T 세포이다. 일부 경우에, 배양 개시량 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트는 적어도 (약) 0.5 x 108, 0.75 x 108, 1 x 108, 1.5 x 108, 2 x 108, 또는 4 x 108 개의 나이브-유사 T 세포이다. 일부 예시에서, 배양 개시량 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트는 적어도 (약) 2 x 108 세포이다.
본 명세서에 기재된 자극 조건하에서 본 명세서에 제공된 인큐베이션 방법의 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포 집단을 포함하는 투입 조성물은 (약) 1 x 108 내지 4 x 108 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양-개시량을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 이에 따라 자극된 조성물을 제조하며, 여기서 자극 조건은 우선적으로 자극된 조성물 내 비-나이브 유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 팽창 또는 증식을 유도한다. 일부 양태에서, 배양 개시량 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트는 적어도 (약) 2 x 108 세포이다. 일부 구현예에서, 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브 유사 T 세포의 양은 대략 동일하다. 일부 경우에, 배양 개시량은 나이브 CD8+ T 세포의 양이다. 일부 경우에, 배양 개시량은 투입 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포의 양을 고려하지 않는다. 일부 양태에서, 배양-개시량은 자극된 조성물 내 표적 비-나이브-유사 T 세포의 수에 기초하여 결정된다.
b. 비-나이브-유사 T 세포
일부 구현예에서, 상기 방법은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-나이브-유사 T 세포로는 효과기 T (TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중추 기억 T 세포 (TCM), 효과기 기억 T (TEM) 세포, 및 이의 조합을 포함한다. 본 발명의 방법의 하나의 양태는 인큐베이션 (예컨대, 자극) 단계 이전에, 다양한 마커를 발현하는 세포의 집단에 대해 평가된 투입 조성물을 제공하며, 이러한 마커로는 CD27, CD28, CD56, CD62L, CD95, KLRG1, CD45RA 또는 CD45RO, 사이토카인 (예컨대, IL-2, IFN-γIL-4, IL-10), 사이토카인 수용체 (예컨대, CD25), 퍼포린, 유착 분자 (예컨대, VLA-1, VLA-2, VLA-4, LPAM-1, LFA-1), 및/또는 귀환(homing) 분자 (예컨대, L-Selectin)를 포함한다. 비-나이브-유사 T 세포를 식별하기 위해, 일부 구현예에서, 비-나이브-유사 T 세포의 다양한 시그니쳐가 활용될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-나이브-유사 T 세포의 특정 마커의 발현이 평가될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 비-나이브-유사 T 세포는 T 세포 활성화 마커, 예컨대 CD27, CD28, CD45RA, 및 CCR7를 비롯한 마커에 대해 표면 음성이며;일부 경우에, 비-나이브-유사 T 세포는 CD62L를 비롯한 마커에 대해 표면 양성이다. 일부 양태에서, 비-나이브-유사 T 세포는 CD56 및/또는 CD45RO에 대해 표면 양성이다. 일부 양태에서, 비-나이브-유사 T 세포는 CD45RO에 대해 표면 양성이고 CD27, CD45RA, 및 CCR7에 대해 세포 표면 음성이다. 일부 경우에, 비-나이브-유사 T 세포는 사이토카인 예컨대 IL-2, IFN-γIL-4, 및/또는 IL-10의 세포 내 발현에 대해 양성이다. 일부 추가의 예시에서, 비-나이브-유사 T 세포는 마커 CD25 및/또는 퍼포린의 발현에 대해 양성이다. 일부 경우에, 비-나이브-유사 T 세포는 CD95hi이다.
비-나이브-유사 T 세포의 마커의 발현을 평가하기 위해, 일부 구현예에서 상기 방법은 시험관 내 분석을 수행함으로써 마커를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 예시에서, 시험관 내 분석은 면역분석, 앱타머-기반 분석, 조직학적 또는 세포학적 분석, 또는 mRNA 발현 수준 분석이다. 일부 구현예에서, 시험관 내 분석은 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA), 면역 블로팅, 면역 침전법, 방사 면역 분석법 (RIA), 면역 염색법, 유동 세포 측정 분석법, 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 화학발광 분석, 측면 흐름 면역분석, 억제 분석 또는 열성 분석일 수 있다. 일부 구현예에서, 비-나이브-유사 T 세포의 마커 발현은 RNA-시퀀싱에 의해 결정된다.
투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포는 또한 T 세포의 클론성에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-나이브-유사 T 세포는 단클론성이다. 상기 T 세포의 투입 조성물의 클론성은 주어진 항원에 대한 집단의 반응의 폭에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 단클론성은 낮은 다양성의 T 세포의 집단을 지칭한다. 일부 양태에서, 투입 조성물은 항원-특이적 세포에 의해 인식되는 상이한 에피토프의 수를 측정함으로써 평가될 수 있다. 이는 클로닝 항원-특이적 T 세포를 시험관 내 생성 및 클로닝하기 위한 표준 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-나이브-유사 T 세포는 단일 TCR-유전자 재배열 패턴의 우세를 나타낸다. 투입 조성물 내 세포, 예컨대 비-나이브-유사 T 세포의 클론성은, 일부 예시에서, 클론 시퀀싱, 선택적으로 차세대 시퀀싱, 또는 스펙트럼 유형 분석에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, T 세포 집단의 클론성 평가는 T 세포 집단의 클론 다양성의 평가이다. 일부 구현예에서, 단클론성인 T 세포의 집단은 낮은 다양성을 나타내는 T 세포의 집단을 지칭한다.투입 조성물과 같은T 세포의 집단의 관점에서, 단클론성은 스펙트럼 유형 분석 (TCR VβVα, Vγ또는 Vδ사슬 초가변 영역 레퍼토리의 측정)에 의해 정의된 단일 특이성을 가지는 T 세포의 집단을 지칭한다. T 세포의 집단은 주어진 TCR VβVα, Vγ및/또는 Vδ패밀리에 대한 VβVα, Vγ및/또는 Vδ스펙트럼 유형 프로파일이 단일의 우세한 피크를 가지는 경우 단클론성 (또는 단일-특이적)으로 간주된다. 스펙트럼 유형 분석은 서열이 아닌, 특정 크기의 재배열된 가변 유전자를 구별한다. 이에 따라, 단일 피크는 접합 영역에서 4개의 잠재적 뉴클레오타이드 (아데닌 (a), 구아닌 (g), 사이토신 (c), 또는 타이민 (t)) 중 임의의 하나 또는 4개의 뉴클레오타이드의 조합을 포함하는 제한된 개수의 재배열된 TCR 가변 유전자 (VβVα, Vγ또는 Vδ중 임의의 하나를 발현하는 T 세포 집단을 나타낼 수 있는 것으로 이해된다. 특정 구체예에서, 특정 길이를 나타내는 밴드에 존재하는 재배열된 가변 유전자(들)의 서열(들)을 결정하기 위해 특정 밴드를 클로닝 및 서열분석하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 구현예에서, 클론성 평가 방법으로는 국제 공개 번호 WO2012/048341, WO2014/144495, WO2017/053902, WO2016044227, WO2016176322 및 WO2012048340에 기재된 방법의 다양한 특징을 포함할 수 있으며, 상기 특허 각각은 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 TCR과 같은 세포 내에 관심 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 서열 정보를 수득하는데 사용될 수 있다. 표적 유전자는 샘플 또는 세포 집단으로부터 세포의 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 획득할 수 있다. 샘플 또는 세포 집단은 면역 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 TCR 분자에 대하여, TCR의 사슬을 인코딩하는 유전자는 면역 세포 또는 T 세포의 게놈 DNA 또는 mRNA로부터 수득할 수 있다. 일부 구현예에서, 출발 물질은 TCR의 사슬에 대해 인코딩하는 유전자로 구성된 T 세포로부터의 RNA이다. 일부 구현예에서, 섀넌 지수(Shannon index)는 클론을 여과하기 위한 역치로서 클론성 (“Shannon-adjusted clonality”에 적용되며, 문헌 [Chaara et al. (2018) Front Immunol 9:1038)]을 참고한다.
따라서, 입양 요법을 위한 조작된 T 세포를 제조할 때 T 세포의 인큐베이션 (예컨대, 자극)하는 방법 중에는 비-나이브-유사 T 세포로부터 유도된 (또는 CD45RA- 또는 CD45RO+ T 세포로부터 유도된) 세포와 비교하여, 나이브-유사 T 세포로부터 유도된 (또는 CD45RA+ 또는 CD45RO- T 세포로부터 유도된) 세포의 팽창 및 증식을 우선적으로 유도하는 조건을 사용하는 방법이 있다. 일부 구현예에서, 나이브-유사 T 세포는 CD45RA+, CD45RO-, CD27+, 및 CCR7+이다. 일부 구현예에서, 비-나이브-유사 T 세포는 CD45RA-, CD45RO+, CD27-, 및 CCR7-. 일부 구현예에서, 상기 방법은 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 팽창 또는 증식을 우선적으로 유도하는 자극 조건하에서 배양-개시 조성물 내 T 세포를 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 생성하는 단계를 포함한다. 제공된 방법을 사용할 때, 상기 기재된 마커 및 시그니처를 사용하는 투입 조성물의 평가가 방법의 일부로서 사용될 수 있다.
B. 세포 인큐베이션
일부 구현예에서, 제공된 방법은 나이브-유사 T 세포의 배양-개시량을 함유하는 투입 조성물과 같은 투입 조성물 내 세포의 배양, 인큐베이션, 배양, 및/또는 유전자 조작 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 기재된 임계 개수의 나이브-유사 T 세포가 포함된 제공된 투입 조성물의 배양-개시량을 인큐베이션 및/또는 조작하는 방법이 제공된다. 배양 및/또는 조작은, 배양물 또는 배양 세포용의 배양 용기, 예컨대 유닛, 챔버, 웰, 컬럼, 튜브, 튜브 세트, 밸브, 바이알, 배양 디쉬, 백 또는 기타 컨테이너에서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작에 선행하여 또는 이와 관련하여 예컨대 섹션 II에 기재된 임의의 방법에 따라 인큐베이션 및/또는 배양된다. 인큐베이션 단계는 배양, 구축, 자극, 활성화 및/또는 증식을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재하에서 인큐베이션된다. 이러한 조건은 집단에서 세포의 증식, 팽창, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하며, 및/또는 재조합 수용체, 예컨대, CAR의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 준비하도록 고안된 것들을 포함한다.
조건은 하나 이상의 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 시제 (예컨대, 영양제, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자 (예컨대, 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화하도록 고안된 임의의 기타 시제))를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 시제는 TCR 복합체의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 시제, 예컨대 리간드를 포함한다. 일부 양태에서, 시제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 작동시키거나 개시한다. 이러한 시제는 항체, 예컨대 TCR에 대하여 특이적인 항체, 예컨대, 항-CD3를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 공동자극 수용체를 자극할 수 있는 하나 이상의 약제, 예를 들어 리간드를 포함하며, 예컨대 항-CD28이다. 일부 구현예에서, 이러한 제제 및/또는 리간드는 고체 지지체에 결합될 수 있는데, 예컨대 비드이고 및/또는 하나 이상의 사이토카인에 결합 될 수 있다. 선택적으로, 팽창 방법은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 배양 배지에 (예컨대, 적어도 약 0.5 ng/ml의 농도로) 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
제공된 방법은 일반적으로 비-나이브-유사 T 세포에 비해 나이브-유사의 팽창 또는 증식을 우선적으로 유도하고, 및/또는 나이브-유사 T 세포와 비교하여 비-나이브-유사의 팽창 또는 증식을 우선적으로 유도하지 않는 자극 조건의 존재, 설계, 및/또는 사용을 포함한다. 일부 양태에서, 이러한 조건은 오직 조성물 내 존재하는 비-나이브-유사 T 세포만 세포 사멸을 유도하는 방식으로 활성화 되도록, 활성화 신호를 유도하는 시제를 포함한다. 이러한 우선적 조건은 일반적으로 조작된 분자, 예컨대 조작된 항원 수용체를 인코딩하는 핵산의 도입 이전 단계에서 사용된다.
이러한 조건으로는 집단에서 세포의 증식, 팽창, 활성화, 및/또는 생존을 유도하도록 설계된 조건을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 조건은 비-나이브-유사 T 세포 또는 이의 서브세트에서 증식 또는 분열을 활성화 및/또는 유도하기 충분한 신호를 자극, 예컨대 활성화하는 단계를 포함한다. 나이브-유사 T 세포는 일반적으로 활성화 임계에 도달하기 위해, 예를 들어, 완전히 활성화되어 세포 주기로 유도되기 위해, TCR/CD3를 통한 최소 신호를 필요로 한다. 이러한 최소한의 신호는 일반적으로 비-나이브-유사 T 세포 및/또는 이의 특정 서브세트에서 활성화/세포 주기 진입을 유도하기 위해 요구되는 신호보다 더 높다. 비-나이브-유사 T 세포는 일반적으로 활성화되어 세포 주기에 진입하기 위해 훨씬 낮은 수준의 TCR/CD3 결합을 필요로 한다. 일부 양태에서, 강한 신호는 비-나이브-유사 세포 또는 이의 특정 집단에서 활성화-유도 세포 사멸 수준을 야기하거나 또는 증가시킬 수 있다.
이에 따라, 일부 구현예에서, 조성물이 나이브-유사 및 비-나이브-유사 T 세포의 집단을 포함하고, 나이브-유사 T 세포 활성화에 요구되는 활성화 임계보다 낮은 활성화 신호를 유도하는 조건이 사용되는 경우, 비-나이브-유사 T 세포는 주로 활성화되어 세포 사멸을 초래할 수 있는 자극 조건에 감응하게 될 것이다. 예를 들어, 특정 자극 조건에서, 세포 사멸은 활성화-유도 세포 사멸로부터 기인한 것일 수 있다.
일부 양태에서, 자극 조건은 다른 조건, 예컨대 표준 조건과 비교하여 비-나이브-유사 세포에서의 활성화-유도 세포 사멸이 유도되도록 하는 조건이다. 이에 따라, 본 발명은 임의의 원하지 않는 T 세포의 서브집단의 적어도 실질적인 부분, 예컨대, 투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포를 제거하는 방법을 제공한다. 제공된 방법의 목적을 위해, 실질적인 부분은 세포의 원하지 않는 서브집단, 예컨대, 투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포의 적어도 70%를 의미한다. 특정 구체예에서, 실질적인 부분은 세포 중 원하지 않는 서브집단, 예컨대, 투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포의 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 의미한다. 예컨대, 비-나이브-유사 T 세포의 세포 사멸로부터 세포의 제거는 임의의 다수의 기법을 사용하여 측정될 수 있으며, 이러한 기법으로는 다양한 항체 및/또는 펩타이드-MHC 사합체를 사용하는 유세포 분석, 및 증식 및 크로뮴 방출 분석과 같은 기능적 분석을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 효소가 투입 조성물에 첨가되어 세포의 제거로부터 잔여 세포 성분을 제거한다. 예를 들어, 일부 예시적인 구현예에서 데옥시뉴클레아제 (DNAse) 또는 재조합 인간 데옥시뉴클레아제 I (Pulmozyme®가 투입 조성물에 첨가된다. 일부 양태에서, 자극 조건은 데옥시뉴클레아제 (DNAse) 또는 재조합 인간 데옥시뉴클레아제 I (Pulmozyme®를 포함한다.
일부 경우에, 자극 조건은 T 세포의 특정 서브세트, 예를 들어 비-나이브-유사 T 세포를 보존하기 위해 보충되는 배양 성분을 포함하지 않는다. 그러므로, 일부 경우에, 자극 조건의 배양으로부터 성분의 제거는 비-나이브-유사 T 세포의 제거에 기여할 수 있다. 일부 양태에서, 자극 조건은 AICD를 감소키기는 것으로 공지되어있거나 또는 감소시킬 가능성이 있고 및/또는 비-나이브 세포와 같은 구형 세포의 생존을 촉진하는 배양 시약의 농도를 배제 또는 감소시킴으로써 수행되거나, 또는 추가적으로 수행된다. 일부 경우에, 자극 조건은 N-아세틸렌 시스테인을 포함하지 않거나, 또는 N-아세틸렌 시스테인을 감소된 양 또는 농도로 포함한다. 일부 경우에, 자극 조건은 하나의 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15를 포함하지 않거나, 또는 감소된 양 또는 농도의 재조합 IL-7 또는 IL-15를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-나이브 세포 (예컨대, CD45RO에 독소-부착된)의 제거를 추가로 보조 또는 촉진하는 배양 첨가제가 포함될 수 있다.
특정 구체예에서, 자극 및/또는 팽창 시간은 2 일 내지 15 일, 2 일 내지 12 일, 2 일 내지 10 일, 2 일 내지 8 일, 2 일 내지 6 일, 2일 내지 4 일, 4 일 내지 12 일, 4 일 내지 10 일, 4 일 내지 8 일, 4 일 내지 6 일, 6 일 내지 12 일, 6 일 내지 10 일, 6 일 내지 8 일, 8 일 내지 12 일, 8 일 내지 10 일, 또는 10 일 내지 12 일일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일 또는 14 일 이상 동안 인큐베이션된다. 제공된 방법의 하나의 구체예에서, 혼합물은 30 분 내지 수 시간 (약 3 시간) 내지 약 14 일 또는 그 사이의 임의의 시간 또는 분 정수 값 동안 배양될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 혼합물은 21 일간 배양될 수 있다. 하나의 구체예에서, 비드 및 T 세포는 약 8 일간 함께 배양된다. 또 다른 구체예에서, 비드 및 T 세포는 적어도 (약) 2-3 일간 배양된다. 또 다른 구체예에서, 비드 및 T 세포는 적어도 (약) 2 일 또는 적어도 (약) 48 시간 동안 함께 배양된다. 일부 양태에서, T 세포의 배양 시간이 60 일 이상일 수 있도록 여러 주기의 자극의 또한 바람직할 수 있다.
배양 및/또는 조작은, 배양물 또는 배양 세포용의 배양 용기, 예컨대 유닛, 챔버, 웰, 컬럼, 튜브, 튜브 세트, 밸브, 바이알, 배양 디쉬, 백 또는 기타 컨테이너에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재하에서 인큐베이션된다. 이러한 조건은 집단에서 세포의 증식, 팽창, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하며, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 준비하도록 고안된 것들을 포함한다.
제공된 방법은 일반적으로 자극 조건하에서 (예컨대, 투입 조성물을 포함하는 T 세포의) 인큐베이션을 포함한다. T 세포 자극의 맥락에서, 자극 조건은 일반적으로 TCR 복합체 또는 이의 구성원, 예컨대 CD3의 세포 내 신호전달 도메인에 결합, 연결, 가교, 및/또는 이를 통한 활성화 유도가 가능한 1차 시제를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합하는 1차 시제 및 T 세포 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 시제를 포함한다. 일부 구체적인 예시에서, 1차 시제는 CD3에 특이적으로 결합하고 및/또는 공동자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 고정화된 항-CD3 및 항-CD28 항체, 가용성 항-CD3 항체, 이러한 항체의 유도체, 및/또는 T 세포 상의 TCR/CD3 복합체와 결합하는 다른 리간드를 포함한다. 일부 양태에서, 1차 시제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 작동시키거나 개시한다. 이러한 시제는 항원-결합 항체 단편, 예컨대 CD3와 같이 TCR 성분에 특이적인 단편을 비롯한, 천연 리간드 및/또는 항체와 같은 결합 파트너를 포함할 수 있다. 예시적인 항-CD3 항체는 BC3, OKT3, 및 G19-4이다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 추가로 2차 시제, 예컨대 T 세포 공동자극 신호, 예컨대 1차 신호 (예컨대, TCR/CD3 연결)와 조합으로, T 세포 증식 및/또는 활성화를 야기하는 신호를 T 세포에 유도할 수 있는 시제와의 인큐베이션을 포함한다. 예시적인 2차 시제로는 세포 내 신호전달 사건을 T 세포 공동자극 또는 액세서리 분자, 예컨대 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, ICOS, CD40, LFA-1, DAP10, 및/또는 CD54에 특이적으로 결합, 연결, 가교, 및 또는 이를 통해 유도하는 시제를 포함한다. 시제는 항체를 비롯한, 이의 단편, 천연 리간드, 및 다른 결합 파트너를 포함한다. 일부 구현예에서, 2차 시제는 항-CD28 항체를 비롯한, 항원-결합 항체 단편과 같은 CD28에 결합한다. 일부 양태에서, 이러한 시제는 항-CD28 항체이다. 예시적인 항-CD28 항체는 B-T3 및 XR-CD28이다.
일부 구현예에서, T 세포 자극 또는 공동자극 분자와 같은 특정 분자에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 또는 시제는 이러한 분자에 특이적인 항체를 비롯하여, 항원-결합 항체 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 항체, 예컨대, 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체는, 적어도 (약) 0.5 ng/mL의 농도로 포함된다. 일부 양태에서, 시제는 이러한 분자에 대한 하나 이상의 다른 결합 파트너, 예컨대 천연 결합 파트너를 포함한다. 시제는 또한 may include 천연 리간드 및 복합체를 비롯한, 항원 제시 세포 및/또는 초항원 (황색포도상구균 장독소 A (Staphylococcus enterotoxin A, SEA), 황색포도상구균 장독소 B (Staphylococcus enterotoxin B, SEB), 독성 쇼크 증후군 독성 1 (Toxic Shock Syndrome Toxin 1, TSST-1)), 내독소) 상의 분자 및/또는 복합체를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 시제로는 1차 또는 공동자극 T 세포 신호전달 분자, 예컨대 PKC 활성화제, 포볼 미리스테이트 아세테이트 (phorbol myristate acetate, PMA), 피토헤마글루티닌 (PHA), 및/또는 칼슘 이오노포어, 예컨대, 이오노마이신, 리포다당류 (LPS), T 세포 미토겐, 및 사이토카인을 포함하는 미토겐을 통한 신호전달을 모방하는 시제이다. 일부 양태에서, 이러한 조건은 하나 이상의 자극성 사이토카인 또는 다른 인자, 예컨대 IL-2 및/또는 IL-15과의 인큐베이션을 포함한다. 일부 양태에서, 사이토카인의 농도는 적어도 약 10 유닛/mL이다.
일부 구현예에서 1차 및 2차 (공동자극) 시제는 입자 예컨대, 비드와 같은 고체 표면 또는 지지체에 결합된다. 일부 구현예에서, 세포는 T 세포를 활성화 및/또는 팽창시킬 수 있는 자극제와 인큐베이션 및/또는 접촉될 수 있다. 일부 양태에서, 1차 및 2차 시제는 입자, 예컨대, 비드와 같은 고체 표면에 커플링된다. 특정 구체예에서, 자극제는 T 세포와 같은 세포를 활성화 및/또는 팽창시킬 수 있는 하나 이상의 시제, 예컨대 생체분자에 컨쥬게이션 또는 결합되는 입자, 예컨대, 비드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제는 비드에 결합된다. 일부 구현예에서, 비드는 생체적합성이며, 즉, 생물학적 용도에 적합한 물질로 구성된다. 일부 구현예에서, 비드는 배양된 세포, 예컨대, 배양된 T 세포에 대해 비독성이다. 일부 구현예에서, 비드는 시제와 세포 사이 상호 작용을 허용하는 방식으로 시제를 부착할 수 있는 임의의 입자일 수 있다.
일부 구현예에서, 자극제는 비드에, 예를 들어 비드의 표면에 결합되거나 그렇지 않으면 부착되어, 세포, 예컨대, T 세포를 활성화 및/또는 팽창시킬 수 있는 하나 이상의 시제를 포함한다. 특정 구체예에서, 비드는 비-세포 입자이다. 구체적인 구현예에서, 비드는 콜로이드 입자, 마이크로스피어, 나노입자, 자성 비드, 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 비드는 아가로스 비드이다. 특정 구체예에서, 비드는 세파로스 비드이다.
구체적인 구현예에서, 자극제는 단분산성(monodisperse)인 비드를 포함한다. 특정 구체예에서, 단분산성인 비드는 직경 표준 편차가 서로 5% 미만인 크기 분산도를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 하나 이상의 시제, 예컨대 비드의 표면에 커플링, 컨쥬게이션, 또는 (직접적으로 또는 간접적으로) 결합되는 시제를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 고려되는 시제로는 RNA, DNA, 단백질 (예컨대, 효소), 항원, 다클론성 항체, 단클론성 항체, 항체 단편, 탄수화물, 지질 렉틴, 또는 원하는 표적에 대해 친화력을 가지는 임의의 다른 생체분자를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 수용체 및/또는 T 세포 수용체의 성분이다. 특정 구체예에서, 원하는 표적은 CD3이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 공동자극 분자, 예컨대, CD28이다. 하나 이상의 시제는 다양한 방법에 의해 비드에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 부착은 공유, 비공유, 정전기, 또는 소수성일 수 있으며, 예를 들어, 화학적 수단, 기계적 수단, 또는 효소적 수단을 포함하는 다양한 부착 수단에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 생체분자 (예컨대, 비오틴화된 항-CD3 항체)는 비드에 직접적으로 부착된 또 다른 생체분자 (예컨대, 항-비오틴 항체)를 통해 비드에 간접적으로 부착될 수 있다.
일부 구현예에서, 비드에 부착된 하나 이상의 시제는 항체이다. 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체 (면역글로불린 Fc 영역을 가지는 전장 항체 포함), 다중에피토프(polyepitopic) 특이성을 가지는 항체 조성물, 다중특이성 항체 (예컨대, 이중특이성 항체, 다이아바디, 및 단일-사슬 분자, 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대, Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항체 단편 (항원-결합 단편 포함), 예컨대, Fab, Fab′Fv, scFv, 또는 (Fab′단편이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 비롯한 임의의 동형의 불변 영역은 본 명세서에 고려되는 항체에 사용될 수 있으며, 이러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종 (예컨대, 쥐과 종)으로부터 수득될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, 시제는 T 세포 수용체의 하나 이상의 성분에 결합 및/또는 이를 인식하는 항체이다. 구체적인 구현예에서, 시제는 항-CD3 항체이다. 특정 구체예에서, 시제는 공동-수용체에 결합 및/또는 이를 인식하는 항체이다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD28 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 직경이 약 0.001 μm 초과, 약 0.01 μm 초과, 약 0.1 μm 초과, 약 1.0 μm 초과, 약 10 μm 초과, 약 50 μm 초과, 약 100 μm 초과 또는 약 1000 μm 초과 및 약 1500 μm 이하이다. 일부 구현예에서, 비드는 직경이 약 1.0 μm 내지 약 500 μm, 약 1.0 μm 내지 약 150 μm, 약 1.0 μm 내지 약 30 μm, 약 1.0 μm 내지 약 10 μm, 약 1.0 μm 내지 약 5.0 μm, 약 2.0 μm 내지 약 5.0 μm, 또는 약 3.0 μm 내지 약 5.0 μm이다. 일부 구현예에서, 비드는 직경이 약 3 μm 내지 약 5 μm이다. 일부 구현예에서, 비드는 직경이 적어도 (약) 0.001 μm, 0.01 μm, 0.1 μm, 0.5 μm, 1.0 μm, 1.5 μm, 2.0 μm, 2.5 μm, 3.0 μm, 3.5 μm, 4.0 μm, 4.5 μm, 5.0 μm, 5.5 μm, 6.0 μm, 6.5 μm, 7.0 μm, 7.5 μm, 8.0 μm, 8.5 μm, 9.0 μm, 9.5 μm, 10 μm, 12 μm, 14 μm, 16 μm, 18 μm 또는 20 μm이다. 특정 구체예에서, 비드는 직경이 또는 약 4.5 μm이다. 특정 구체예에서, 비드는 직경이 또는 약 2.8 μm이다.
일부 구현예에서, 비드는 밀도가 0.001 g/cm3 초과, 0.01 g/cm3 초과, 0.05 g/cm3 초과, 0.1 g/cm3 초과, 0.5 g/cm3 초과, 0.6 g/cm3 초과, 0.7 g/cm3 초과, 0.8 g/cm3 초과, 0.9 g/cm3 초과, 1 g/cm3 초과, 1.1 g/cm3 초과, 1.2 g/cm3 초과, 1.3 g/cm3 초과, 1.4 g/cm3 초과, 1.5 g/cm3 초과, 2 g/cm3 초과, 3 g/cm3 초과, 4 g/cm3 초과, 또는 5g/cm3 초과이다. 일부 구현예에서, 비드는 밀도가 약 0.001 g/cm3 내지 약 100 g/cm3, 약 0.01 g/cm3 내지 약 50 g/cm3, 약 0.1 g/cm3 내지 약 10 g/cm3, 약 0.1 g/cm3 내지 약 0.5 g/cm3, 약 0.5 g/cm3 내지 약 1 g/cm3, 약 0.5 g/cm3 내지 약 1.5 g/cm3, 약 1 g/cm3 내지 약 1.5 g/cm3, 약 1 g/cm3 내지 약 2 g/cm3, 또는 약 1 g/cm3 내지 약 5 g/cm3이다. 일부 구현예에서, 비드는 밀도가 약 0.5 g/cm3, 약 0.6 g/cm3, 약 0.7 g/cm3, 약 0.8 g/cm3, 약 0.9 g/cm3, 약 1.0 g/cm3, 약 1.1 g/cm3, 약 1.2 g/cm3, 약 1.3 g/cm3, 약 1.4 g/cm3, 약 1.5 g/cm3, 약 1.6 g/cm3, 약 1.7 g/cm3, 약 1.8 g/cm3, 약 1.9 g/cm3, 또는 약 2.0 g/cm3이다. 특정 구체예에서, 비드는 밀도가 약 1.6 g/cm3이다. 구체적인 구현예에서, 비드 또는 입자는 밀도가 약 1.5 g/cm3이다. 특정 구체예에서, 입자는 밀도가 약 1.3 g/cm3이다.
특정 구체예에서, 복수의 비드는 균일한 밀도를 가진다. 특정 구체예에서, 균일한 밀도는 평균 비드 밀도의 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만의 밀도 표준 편차를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 표면적이 입자의 그램 당 약 0.001 m2 (m2/g) 내지 약 1,000 m2/g, 약 0.010 m2/g 내지 약 100 m2/g, 약 0.1 m2/g 내지 약 10 m2/g, 약 0.1 m2/g 내지 약 1 m2/g, 약 1 m2/g 내지 약 10 m2/g, 약 10 m2/g 내지 약 100 m2/g, 약 0.5 m2/g 내지 약 20 m2/g, 약 0.5 m2/g 내지 약 5 m2/g, 또는 약 1 m2/g 내지 약 4 m2/g이다. 일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 표면적이 약 1 m2/g 내지 약 4 m2/g이다.
일부 구현예에서, 비드는 시제에 커플링, 연결, 또는 컨쥬게이션될 수 있는 비드 표면에 또는 표면 근처에 적어도 하나의 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 비드는 표면 작용기화되며, 즉 결합 분자, 예컨대, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 공유 결합을 형성할 수 있는 작용기를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 비드는 표면-노출된 카복실 기, 아미노 기, 하이드록실 기, 토실 기, 에폭시 기, 및/또는 클로로메틸 기를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 비드는 표면 노출된 아가로스 및/또는 세파로스를 포함한다. 특정 구체예에서, 비드 표면은 결합 분자에 결합 또는 부착할 수 있는 부착된 자극 시약을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 생체분자는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 비드는 표면 노출된 단백질 A, 단백질 G, 또는 비오틴을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 자기장에서 반응한다. 일부 구현예에서, 비드는 자성 비드이다. 일부 구현예에서, 자성 비드는 상자성이다. 구체적인 구현예에서, 자성 비드는 초상자성이다. 특정 구체예에서, 비드는 자기장에 노출되지 않는 한 임의의 자성 성질을 나타내지 않는다.
구체적인 구현예에서, 비드는 자성 코어, 상자성 코어, 또는 초상자성 코어를 포함한다. 일부 구현예에서, 자성 코어는 금속을 포함한다. 일부 구현예에서, 금속은, 철, 니켈, 구리, 코발트, 가돌리늄, 망간, 탄탈륨, 아연, 지르코늄 또는 임의의 이의 조합일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예에서, 자성 코어는 금속 산화물 (예컨대, 산화 철), 페라이트 (예컨대, 망간 페라이트, 코발트 페라이트, 니켈 페라이트, 등.), 헤마타이트 및 금속 합금 (예컨대, CoTaZn)을 포함한다. 일부 구현예에서, 자성 코어는 페라이트, 금속, 금속 합금, 산화 철, 또는 이산화 크로뮴 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 자성 코어는 원소 철 또는 이의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 자성 코어는 마그네타이트 (Fe3O4), 마그헤마이트 (γFe2O3) 또는 그레자이트 (Fe3S4) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 코어는 산화 철 (예컨대, Fe3O4)을 포함한다.
특정 구체예에서, 비드는 표면 작용기화된 코트 또는 코팅에 의해 커버되는 자성, 상자성, 및/또는 초상자성 코어를 포함한다. 일부 구현예에서, 코팅은 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 단백질, 탄소, 아가로스, 세파로스, 또는 이의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는 물질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리글루타르알데하이드, 폴리우레탄, 폴리스타이렌, 또는 폴리비닐 알코올일 수 있다. 특정 구체예에서, 외부 코트 또는 코팅은 폴리스타이렌을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 외부 코팅은 표면 작용기화된다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어 (예컨대, 산화 철 코어) 및 코트를 포함하는 비드를 포함하며, 여기서 금속 산화물 코어는 적어도 하나의 다당류 (예컨대, 덱스트란)를 포함하며, 코트는 적어도 하나의 다당류 (예컨대, 아미노 덱스트란), 적어도 하나의 중합체 (예컨대, 폴리우레탄) 및 실리카를 포함한다. 일부 구현예에서 금속 산화물 코어는 콜로이드성 산화 철 코어이다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 시제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 항-비오틴 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-비오틴 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드는 직경이 약 3 μm 내지 약 10 μm이다. 일부 구현예에서, 비드는 직경이 약 3 μm 내지 약 5 μm이다. 특정 구체예에서, 비드는 직경이 약 3.5 μm이다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어 (예컨대, 산화 철 내부 코어) 및 코트 (예컨대, 보호성 코트)를 포함하는 비드에 부착된 하나 이상의 시제를 포함하고, 여기서 코트는 폴리스타이렌을 포함한다. 특정 구체예에서, 비드는 초상자성 철 코어, 예컨대, 마그네타이트 (Fe3O4) 및/또는 마그헤마이트(γ2O3) c 및 폴리스타이렌 코트 또는 코팅을 포함하는 단분산성의, 초상자성 비드이다. 일부 구현예에서, 비드는 비-다공성이다. 일부 구현예에서, 비드는 하나 이상의 시제가 부착된 작용기화된 표면을 포함한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 시제는 표면에서 비드에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제는항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 비드는 밀도가 약 1.5 g/cm3이고, 표면적이 약 1 m2/g 내지 약 4 m2/g이다. 구체적인 구현예에서; 비드는 직경이 약 4.5 μm이고 밀도가 약 1.5 g/cm3인 단분산성 초상자성 비드이다. 일부 구현예에서, 비드는 평균 직경이 약 2.8 μm이고 밀도가 약 1.3 g/cm3인 단분산성 초상자성 비드이다.
상이한 T 세포 집단의 단리를 유발하기 위해, 입자에 대한 노출 시간이 달라질 수 있다. 예를 들어, 하나의 바람직한 구현예에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선별에 충분한 기간 동안 3×28 비드, 예컨대 DYNABEADS®M-450, 또는 Dynabeads®CD3/CD28 CTS™와의 인큐베이션에 의해 단리된다. 하나의 구체예에서, 이러한 기간은 약 30 분이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 기간은 10 내지 24 시간 이상이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 인큐베이션 기간은 24 시간이다. 암 환자로부터 T 세포의 단리를 위해, 24 시간과 같은 더 긴 인큐베이션 시간을 사용하면, 세포 수율을 증가시킬 수 있다.
표면에 커플링될 때, 시제는 동일한 표면에 (즉, “시스” 형성) 또는 별도의 표면에 (즉, “트랜스” 형성) 커플링될 수 있다. 택일적으로, 하나의 시제는 표면에 커플링되고 다른 시제는 용액에 존재할 수 있다. 하나의 구체예에서, 공동자극 신호를 제공하는 시제는 세포 표면에 결합되고 1차 활성화 신호를 제공하는 시제는 용액 상태이거나 또는 표면에 결합된다. 바람직한 구현예에서, 두 시제는 비드에 고정화되며, 동일한 비드에, 즉, “시스”로, 또는 별도의 비드에, 즉, “트랜스”로 고정화된다. 예시로서, 1차 활성화 신호를 제공하는 시제는 항-CD3 항체이고 공동자극 신호를 제공하는 시제는 항-CD28 항체이고; 두 시제 모두는 동등한 분자량으로 동일한 비드에 공동-고정화된다. 하나의 구체예에서, CD4+ T 세포 팽창 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 각각의 항체의 1:1 비율이 사용된다. 본 발명의 특정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비율은 1:1 비율을 사용하여 관찰되는 팽창과 비교하여 T 세포 팽창의 증가가 관찰되도록 사용된다. 하나의 구체적인 구현예에서 1:1 비율을 사용하여 관찰되는 팽창과 비교하여 약 0.5 내지 약 3 배 증가가 관찰된다. 하나의 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율은 100:1 내지 1:100 및 그 사이 모든 정수 값의 범위이다. 본 발명의 하나의 양태에서, 항-CD3 항체보다 더 많은 항-CD28 항체가 입자에 결합되며, 즉, CD3:CD28의 비율이 1 미만이다. 본 발명의 특정 구체예에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비율은 2:1을 초과한다. 하나의 구체적인 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:200 비율이 사용된다. 하나의 구체적인 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:150 비율이 사용된다. 하나의 구체적인 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:100 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:75 비율이 사용된다. 추가의 구현예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:50 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:45 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:40 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:35 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:30 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:25 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:20 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:15 비율이 사용된다. 하나의 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:10 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:5 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:4 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 1:3 비율이 사용된다. 또 다른 구체예에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 3:1 비율이 사용된다.
일부 구현예에서, 항체와 같은 시제가 배양물 또는 조성물에 가용성 형태로 첨가된다. 일부 구현예에서, 하나의 시제는 가용성 형태로 포함되고 또 다른 시제는 고체 지지체에 커플링되어 포함된다. 일부 양태에서, 둘 이상의 시제가 고체 지지체(들)에 커플링되는 경우, 두 시제는 동일한 지지체 또는 입자에 결합되며, 예컨대, 항-CD3/항-CD28 비드, CD3 및 CD28을 인식하는 항체를 포함하는 비드와의 인큐베이션이다. 다른 양태에서, 둘 이상의 시제는 별도의 비드와 같은 별도의 지지체에 커플링된다. 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD28 비드는 일부 양태에서 배양물에 별도로 첨가된다.
일부 구현예에서, 배양 조건은 인공 항원 제시 세포를 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서 표면은 TCR 복합체를 통해 신호를 강화시킬 수 있는 시제 또는 시제들, 예컨대 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원 제시 세포이다. 예시적인 항원 제시 세포는 CD32 중간-친화성 또는 CD64 높은-친화성 Fc 수용체와 같은 Fc 수용체를 발현하도록 조작된 골수 세포 (예컨대, K562 또는 U937)와 같이 유전자 변형된 세포이다. 이러한 세포는 Fc 수용체에 의해 인식되는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체와 함께 로딩되고 T 세포와 인큐베이션되어 배양물에서 신호를 전달할 수 있다. 예시적인 인공 APC 및 배양 조건에서 이의 사용 비율 및 방법은 예를 들어, [Suhoski et al., Molecular Therapy (2007) 15 5, 981-988; Thomas et al., Clin Immunol (2002) 105(3): 259-72; Kim et al., Nature Biotechnology 22, 403 - 410 (2004)]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 배양 조건으로는 특정 종양 항원에 대해 특이적인 T 세포와 같이, 항원 예컨대 형질도입될 세포 상의 TCR 복합체 또는 다른 수용체에 의해 인식되는 항원이 로딩된 PBMC와 같은 항원 제시 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 나이브-유사 대 비-나이브-유사 T 세포의 우선적인 팽창 또는 증식은, 예를 들어, 비-나이브-유사 T 세포의 세포 사멸을 유도하기 위해 특정 강도의 신호, 예컨대 특정 수준보다 높은 자극 또는 활성화 신호의 강도를 유도하도록 설계된 자극 조건을 사용함으로써 달성된다. 일부 양태에서, 강한 신호는 투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포의 세포 사멸을 유도하는 반면에, 약한 신호는 강한 신호와 비교하여 투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포의 세포 사멸을 유도하지 않고 및/또는 비-나이브-유사 T 세포의 생존을 유지하지 않는다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 강한 신호는 비-나이브-유사 T 세포의 세포 사멸을 우선적으로 활성화 또는 야기한다.
일부 양태에서, 나이브-유사 대 비-나이브-유사 T 세포의 우선적인 팽창 또는 증식은 특정 비드 대 세포의 비율에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 비-나이브-유사 T 세포에 비해 팽창 또는 생존 또는 나이브-유사 T 세포를 편향시키는 임의의 자극조건이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 조건은, 예컨대 나이브-유사 세포의 증식 및/또는 생존을 유리한 및/또는 비-나이브 유사 세포의 활성화 유도된 세포 사멸 (AICD)을 우선적으로 유도하는 양으로 제공되는, T 세포 활성화 예컨대 항-CD3/항-CD28 비드 시약에 대해 1차 및/또는 2차 신호를 포함하는 비드 시약의 존재하에서의 인큐베이션을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 비드 시약은 1:1 이상의 비드 대 세포의 비율로 세포와 인큐베이션되며, 이는, 일부 양태에서, AICD를 더욱 유도하며 및 나이브-유사 세포의 생존 백분율을 증가시킬 수 있고, 예컨대 [Kalamasz et al., J Immunother. (2004) 27(5):405-418 및 미국 특허 7,977,095 및 9,528,088]를 참조한다. 하나의 구체예에서, 비율은 약 50:1 내지 약 5:1이다. 특정 구체예에서, 비율은 약 100:1 내지 약 1:1이다. 하나의 구체예에서, 비율은 적어도 약 45:1이다. 특정 구체예에서, 비율은 적어도 약 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 1:1이다. 일부 양태에서, 5:1 미만 또는 3:1 미만의 비드 대 세포 비율이 사용된다. 하나의 구체적인 구현예에서, 비율은 약 3:1이다.
제공된 방법의 하나의 구체예에서, 비드:세포 비율은 원하는 T 세포 표현형을 수득하기 위해 조정될 수 있다. 하나의 구체적인 구현예에서, 비드:세포 비율은 T 세포의 서브세트를 선택적으로 팽창 또는 제거하도록 달라질 수 있다. 하나의 구체예에서, 사용되는 특정 비드:세포 비율은 투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포 또는 비-나이브-유사 T 세포로부터 유도된 세포에서 세포 사멸을 선택적으로 유도한다. 추가의 구현예에서, 사용되는 특정 비드:세포 비율은 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 T 세포로부터 유도된 세포를 선택적으로 팽창시킨다. 일부 구현예에서, T 세포의 서브세트의 원하는 팽창 또는 제거가 일어나는 한, 특정 비율이 사용될 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 다양한 면역치료 설정을 위해 세포의 특정 집단을 팽창, 또는 T 세포의 특정 집단을 제거하도록 사용될 수 있다.
또한 T 세포의 인큐베이션 (예컨대, 자극) 방법에 적합한 자극 조건이 제공된다. T 세포 배양에 적절한 조건은 증식 및 생존에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지 (예컨대, OpTmizer™(Gibco), 또는 Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo 15, (BioWhittaker))를 포함하며, 이러한 인자로는 혈청 (예컨대, 태아 소 또는 인간 혈청), 혈청 대체 제품, 또는 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, 또는 세포 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함한다. 배지는 아미노산 및 비타민이 첨가되어있으며, 혈청이 없거나 또는 적절한 양의 혈청 (또는 혈장), 또는 혈청 대체물 또는 정의된 세트의 호르몬, 및/또는 T 세포의 성장 및 팽창에 충분한 양의 사이토카인으로 대체된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20을 포함할 수 있다. 항생제, 예컨대, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양물에만 포함될 수 있으며, 대상체에 주입될 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 뒷받침하기 위해 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도 (예컨대, 37 ℃) 및 분위기 (예컨대, 공기 + 5% CO2) 하에서 유지된다.
또 다른 구체예에서, 항-CD3/항-CD28 (즉, 3×28)-코팅된 비드와 같은 자극제에 대한 노출 시간은 원하는 T 세포 표현형을 수득하기 위한 방식으로 변형 또는 조정될 수 있다. CD8+ 세포독성 또는 조절 T 세포와 대조적으로, 보조 T 세포 (TH)의 팽창이 전반적인 면역 반응성을 개선 또는 회복시킬 수 있기 때문에 더 많은 집단의 TH 세포, 일반적으로 CD4+가 바람직할 수 있다. 표적 세포를 직접적으료 용해 또는 사멸시킬 수 있는 CD8+ 항원-특이적 T 세포에 의해 다수의 구체적인 면역 반응이 매개되는 반면, 대부분의 면역 반응은 CD4+ T 세포의 도움을 필요로 하며, 이는 예를 들어 GM-CSF, CD40L, 및 IL-2와 같은 중요한 면역-조절 분자를 발현한다. CD4-매개 도움이 바람직한 경우에, CD4:CD8 비율을 보존 또는 향상시키는 본 명세서에 기재된 방법이 상당히 유리할 수 있다. 증가된 수의 CD4+ T 세포는 환자에게 도입되는 세포-발현된 CD40L 의 양을 증가시켜, 잠재적으로 표적 세포의 가시성을 증가시킬 수 있다 (개선된 APC 기능). GM-CSF, 또는 IL-2를 발현하는 융합된 세포의 수를 증가시킴으로써 유사한 효과가 관찰될 수 있으며, 상기 모두는 CD4+ T 세포에 의해 주로 발현된다. 마찬가지로, 특정 적용에서 조절 T 세포 집단을 활용하는 것이 바람직할 수 있으며 (예컨대, 문헌 [Autoimmun Rev. 2002 August; 1(4):190-7; Curr Opin Immunol. 2002 December; 14(6):771-8] 참조) 이는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 생성 및 팽창될 수 있다. 택일적으로, CD4-도움이 덜 필요하고 증가된 수의 CD8+ T 세포가 바람직한 상황에서, 본 명세서에 기재된 XCELLERATE™접근법은, 예를 들어, 자극 및/또는 배양 전에 CD8+ 세포를 미리 선별함으로써 또한 활용될 수 있다. 이러한 상황은 증가된 수준의 IFN-γ또는 증가된 표적 세포의 세포 용해가 바람직한 경우에 존재할 수 있다. 또한, 원하는 TCR 레퍼토리를 사용하여, 예를 들어, 원하는 Vβ패밀리 유전자를 발현하여 T 세포를 팽창시키기 위한 자극제에 대한 노출 시간 및 유형을 변형시킬 수 있다.
일부 구현예에서 자극 조건의 다른 조건은 하나 이상의 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 시제 (예컨대, 영양제, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자 (예컨대, 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화하도록 고안된 임의의 기타 시제))를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 또는 조성물은 인큐베이션 단계 동안 평가 및/또는 조절된다. 예를 들어, 평가 및/또는 조정은 인큐베이션 또는 배양의 개시 이후 임의의 시간, 예컨대 인큐베이션 동안의 시간일 수 있다. 평가는 세포를 함유하는 조성물 또는 용기의 하나 이상을 측정하는 것을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 하나 이상의 표면 또는 세포 내 마커의 발현과 같은 증식 속도, 생존 정도, 표현형에 대해 세포를 평가하는 것, 및/또는 온도, 배지 성분(들), 산소 또는 이산화탄소 함량, 및/또는 하나 이상의 인자, 시제, 성분, 및/또는 서브유형을 비롯한 세포 유형의 존재 또는 부재 또는 양 또는 상대량에 대한 조성물 또는 용기를 평가하는 것이 있다. 평가는 또한 본 명세서에 기재된 시험관 내 또는 생체 외를 사용하는 독성 결과의 지표 또는 예측인자에 대한 평가를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 평가는 자동화된 방식으로, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 장치를 사용하여 수행되고, 및/또는 인큐베이션 동안 특정 시점에 수행되도록 미리 설정된다. 일부 양태에서, 평가 결과는 조정이 이루어져야 함을 나타낸다.
조정은 임의의 세포 배양 인자 또는 파라미터, 예컨대 인큐베이션 또는 이의 단계가 수행되는 (인큐베이션 동안의) 온도, 길이 (시간), 보충, 배지 또는 완충제 또는 이의 성분과 같은 인큐베이션되는 조성물 내 하나 이상의 성분의 첨가 및/또는 제거, 영양소, 아미노산, 항생제, 이온과 같은 시제, 및/또는 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 또는 세포 또는 세포 유형 또는 세포 집단과 같은 자극 인자를 조정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 다양한 성분의 제거 또는 첨가, 또는 기타 조정은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 장치 또는 시스템을 사용하여 자동화된 방식으로 수행된다. 일부 구현예에서, 시스템은 중간 평가로부터 특정 판독값에 기초하여 평가가 자동으로 개시되도록 프로그래밍된다. 예를 들어, 일부 경우에, 시스템 또는 장치는 특정 시간에 하나 이상의 평가를 수행하도록 프로그래밍되고; 이러한 경우에 시스템 또는 장치는 이러한 평가로부터의 특정 결과, 예컨대 또 다른 유형에 대한 하나의 세포 유형의 특정 비율이, 세포 유형의 첨가와 같은 특정 조정을 개시하도록, 추가적으로 프로그래밍될 수 있다.
일부 양태에서, 조정은 세포 및 조성물을 포함하는 밀폐된 환경을 방해하지 않는 방식으로 첨가 또는 제거에 의해, 예컨대 본 명세서에 기재된 하나 이상의 장치 또는 시스템에서와 같이 무균 상태를 유지하면서 성분을 첨가 또는 제거하도록 설계된 투입 및/또는 제거 밸브에 의해 수행된다. 구체적인 세포 유형에서의 반응 및/또는 결과에 유리한 자극 조건의 다양한 조정은, 예를 들어, 미국 특허 8,617,884, 및 미국 특허 출원 US 20030235908 A1에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 세포는 전체 또는 조작 이전에 (약) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14 일, 또는 (약) 1, 2, 3, 4 주 이상 동안 인큐베이션된다. 일부 예시에서, 인큐베이션은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 일 이상 동안 수행된다.
일부 양태에서, 인큐베이션 단계는 Riddell et al의 미국 특허 6,040,177, Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701에 기재된 기법에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은, 피더 세포, 예컨대 비-분할 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 첨가를 포함하고 (예컨대, 결과물인 세포 집단은 증식될 최초 집단에서의 각 T 림프구에 대하여 약 5, 10, 20, 또는 40 또는 그 이상의 PBMC 피더 세포를 함유하도록); 배양물을 배양함으로써 (예컨대, T t세포의 수가 증식하기에 충분한 시간 동안) 증식된다. 일부 양태에서, 비-분할 피더 세포는 감마-조사된 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있따. 일부 구현예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rads 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 양태에서, 피더 세포는 T 세포 집단의 첨가에 선행하여 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예컨대, 적어도 약 25 ℃, 일반적으로 약 30 ℃, 및 일반적으로 약 37 ℃를 포함한다. 선택적으로, 인큐베이션 단계는 피더 세포로서 비-분할 EBV-형질 전환 림프아구 세포 (LCL)를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rads 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. LCL 피더 세포는 일부 양태에서 임의의 적합한 양으로, 예컨대 초기 T 림프구에 대한 LCL 피더 세포의 비율이 적어도 약 10:1인 양으로 제공된다.
구현예에서, 항원 특이적 T 세포, 예컨대 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 나이브 또는 항원 특이적 T 림프구를 항원으로 자극함으로써 수득된다. 예를 들어, 항원 특이적 T 세포주 또는 클론은 T 세포를 감염된 대상체로부터 단리하고 시험관 내에서 동일한 항원으로 세포를 자극함으로써, 사이토메갈로바이러스 항원에 생성될 수 있다.
인큐베이션 및/또는 조작은, 배양물 또는 배양 세포용의 배양 용기, 예컨대 유닛, 챔버, 웰, 컬럼, 튜브, 튜브 세트, 밸브, 바이알, 배양 디쉬, 백 또는 기타 컨테이너에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 방법에 사용되는 배양-개시 조성물, 예컨대 T 세포, 예컨대, 인간 1차 T 세포와, 자극 조건, 예컨대, 다양한 비-나이브 T 세포의 우선적인 활성화 또는 팽창을 위해 설계된 농도/비율의 다양한 시제를 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 구현예에서, 세포가 예를 들어 유전자 조작된 항원 수용체를 도입하기 위해 조작되는 경우, 하나 이상의 자극제의 존재하에 조작 단계 동안 인큐베이션이 계속된다.
비드 대 세포가 1:500 내지 500:1 및 그 사이의 임의의 정수 값인 비율이 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극하도록 사용될 수 있다. 일부 경우에, 비드 대 세포의 비율은 표적 세포 대한 입자 크기에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 작은 크기의 비드는 소수의 세포에 결합할 수 있는 반면, 더 큰 비드는 다수의 세포에 결합할 수 있다. 특정 구체예에서 세포 대 입자의 비율은 1:100 내지 100:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 범위이며, 추가의 구현예에서 이러한 비율은 1:50 내지 50:1 및 그 사이의 임의의 정수 값을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 세포 대 입자의 비율은 1:9 내지 9:1 및 그 사이의 임의의 정수 값의 범위이며, 이는 또한 T 세포를 자극하도록 사용될 수 있다. T 세포 자극을 야기하는 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T 세포의 비율은 본 명세서에 기재된 바와 같이 달라질 수 있으나, 바람직한 특정 값으로는 적어도 1:150, 1:125, 1:100, 1:75, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2.5, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하며, 하나의 바람직한 비율은 T 세포 당 적어도 1:1의 비드이다. 하나의 구체적인 구현예에서, 바람직한 비드 대 세포의 비율은 3:1이다. 일부 경우에, 비드 대 세포의 비율은 1:3이다.
추가의 구현예에서, 입자 대 세포의 비율은 자극의 일 수에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 입자 대 세포의 비율은 제1일에 1:1 내지 10:1이고, 추가의 입자가 (첨가 당일의 세포 수 기준으로) 1:1 내지 1:10의 최종 비율로 이후 최대 10 일 동안 세포에 매일 또는 격일로 첨가된다. 또 다른 구체예에서, 입자 대 세포의 비율은 제1일에 적어도 약 1:2.5이고, 추가의 입자가 제5일에는 약 1:10, 1:25, 1:50 또는 1:100으로, 제7일에는 1:10, 1:25, 1:50으로, 또는 1:100 및 제9일에는 1:10, 1:25, 1:50, 또는 1:100으로 세포에 첨가된다. 하나의 구체적인 구현예에서, 입자 대 세포의 비율은 자극의 제1일에 1:1이며 자극의 제3일 및 제5일에 1:5로 조정된다. 또 다른 구체예에서, 입자는 제1일에 1:1의 최종 비율을 기준으로 매일 또는 격일 기준으로 첨가되고, 자극의 제3일 및 제5일에 1:5의 비율로 첨가된다. 또 다른 특정 구현예에서, 입자 대 세포의 비율은 자극의 제1일에 2:1이며 자극의 제3일 및 제5일에 1:10로 조정된다. 또 다른 구체예에서, 입자는 제1일에 1:1의 최종 비율을 기준으로 매일 또는 격일 기준으로 첨가되고, 자극의 제3일 및 제5일에 1:10의 비율로 첨가된다. 일부 양태에서, 다양한 다른 비율이 본 발명에 사용하기 적합할 수 있다. 특히, 비율은 입자 크기, 및 세포 크기와 유형에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 하나의 양태는 상이한 비드 (예컨대 항-CD3/항-CD28 비드 시약) 대 세포의 비율을 사용하면 항원-특이적 T 세포의 팽창과 관련하여 상이한 결과를 야기할 수 있다는 관찰에 관한 것이다. 특히, 비드 대 세포 비율은 나이브 또는 나이브 유사 T 세포와 같은 다른 세포 유형과는 달리, 항원-특이적 또는 항원을 경험한 (예컨대 기억 또는 효과기 또는 활성화된) T 세포를 선택적으로 팽창 또는 제거하도록 달라질 수 있다. 하나의 구체예에서, 사용되는 특정 비드 대 세포 비율은 항원-특이적 T 세포를 선택적으로 제거한다. 구체적으로, 비드 대 세포 비율, 예컨대 1:1 이상의 비드 대 세포 비율 및/또는 높은 비드 대 세포 비율, 예컨대 (적어도) 약 3:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 이상의 비율은 항원-특이적 T 세포의 제거를 유도할 수 있다. 항원-특이적 T 세포가 추가적인 자극에 감응성이 있는것으로 여겨지지만, 이러한 이론에 구속되는 것은 아니다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 시약 또는 조성물을 통해 T 세포에 전달되는 활성화 신호의 강도는 하나 이상의 특이적인 T 세포 서브세트의 팽창 및/또는 사멸에 영향을 줄 수 있다. 일부 양태에서, 기억 T 세포 (항원-특이적 T 세포)의 선택적 팽창은 다른 것과 비교하여 TCR 및/또는 공동수용체를 통한 약한 신호로 발생할 수 있고; 반면에, 일부 구현예에서, 나이브 세포를 보존하면서 기억 T 세포 및/또는 다른 항원을 경험한 T 세포의 선별적 제거는 상대적으로 강한 신호를 전달하는 시약으로 인큐베이션 이후 발생할 수 있다. 리간드에 의해 결합되는 CD3/TCR (및 CD28) 수용체의 양은, 다른 인자 중에서도, 일부 양태에서 신호 강도를 결정하거나 이를 결정하는데 기여할 수 있다. 이에 따라, 일부 상황에서 높은 비드 대 세포 비율로 자극하면 고농도의 자극 항체 (즉, “강한” 신호)를 제공하여, 항원-특이적 T 세포의 과도한 자극을 야기하여, 세포 사멸 또는 다른 기작에 의해 이들의 사멸을 유발할 수 있다. 따라서, 이와 관련하여, 본 명세서에 기재된 비드 조성물은 일부 상황에서 및/또는 특정 조성물과 관련하여 전-세포사멸(pro-apoptotic) 조성물로서 작용할 수 있다. 일부 양태에서, 신호는 예컨대 또한 활성화-유도 세포 사멸에 의한 것과 같이 나이브-유사 T 세포를 사멸시키기에 너무 강해서는 안된다. 일부 구현예에서, 자극성 비드 시약, 예컨대 항-CD3/항-CD28 비드 시약의 비율은 10:1 미만이다.
또한, 이와 관련하여, 특정 구체예에서, 예컨대, 전-세포사멸 조건으로서 사용되는 이러한 시약 또는 조성물은, 예를 들어 특정 세포 유형 (예컨대, 본 명세서에 기재된 비드 조성물과 같이, 세포 표면 모이어티를 자극하는 시제가 부착된 표면)과 관련하여, 본 명세서에 기재된 임의의 다양한 면역치료 설정에 사용하기 위해 남아있는 세포 집단을 팽창시키도록 사용된다. 추가의 구체예에서, 사용되는 특정 비드 대 세포 비율은 나이브-유사 T 세포를 선택적으로 팽창시킨다. 구체적인 비율은 원하는 특정 T 세포의 팽창 또는 특정 T 세포의 제거를 생성하도록 조정될 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 다양한 면역치료 설정을 위해 투입 조성물의 집단 중 T 세포의 특정 집단을 팽창, 또는 투입 조성물의 집단 중 T 세포의 특정 집단을 제거하도록 사용될 수 있다.
또한, 이와 관련하여, 특정 구체예에서, 예컨대, 전-세포사멸 조성물로서 사용되는 동일한 시약 또는 물질 또는 조성물, 예를 들어 특정 세포 유형 (예컨대, 본 명세서에 기재된 비드 조성물과 같이, 세포 표면 모이어티를 자극하는 시제가 부착된 표면)과 관련하여, 본 명세서에 기재된 임의의 다양한 면역치료 설정에 사용하기 위해 남아있는 세포 집단을 팽창시키도록 사용된다. 낮은 비드 대 세포의 비율을 사용하면, 항원-특이적 T 세포에 대해 과도하게 자극하지 않고 오히려 이러한 세포의 빠른 증식을 유도하는 자극 신호를 제공한다. 추가의 구체예에서, 사용되는 특정 비드 대 세포 비율은 항원-특이적 T 세포를 선택적으로 팽창시킨다. 일부 양태에서, 원하는 팽창 또는 제거가 일어나는 한 임의의 비율이 사용될 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 다양한 면역치료 설정을 위해 세포의 특정 집단을 팽창, 또는 T 세포의 특정 집단을 제거하도록 사용될 수 있다.
특정 방법론을 사용하여, 약 2 내지 14 일의 기간 이후 자극으로부터 T 세포를 분리함으로써 초기 활성화 및 자극 이후, T 세포의 집단의 장기적인 자극을 유리하는 것이 유리할 수 있다. T 세포의 증식 속도는 예를 들어, Coulter Counter와 같은 T 세포의 크기를 조사하거나 또는 부피를 측정함으로써 주기적으로 (예를 들어, 매일) 모니터링된다. 이와 관련하여, 휴지 T 세포는 평균 직경이 약 6.8 마이크론이고, 자극 리간드 존재하에 초기 활성화 및 자극 시, T 세포 평균 직경은 제4일까지 12 마이크론 이상으로 증가하고, 약 제6일에 감소하기 시작할 것이다. 평균 T 세포 직경이 대략 8 마이크론으로 감소될 때, T 세포는 T 세포의 추가적인 증식을 유도하도록 재활성화 및 재자극될 수 있다. 택일적으로, T 세포의 증식 속도 및 T 세포 재자극 시간은 세포 표면 분자의 존재에 대해 , 활성화된 T 세포 상에서 유도되는, CD154, CD54, CD25, CD137, CD134와 같은 세포 표면 분자의 존재에 대해 분석함으로써 모니터링될 수 있다.
CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 집단의 장기적인 자극을 유도하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 (예컨대, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besan
on, France))와 같은 자극제로 T 세포를 여러 번 재활성화 및 재자극하여, CD4+ 또는 CD8+ 세포 집단의 수를 원래 T 세포 집단의 약 10 내지 약 1,000 배로 증가시키는 것이 필요할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 하나의 구현예에서, T 세포는 기재된 바와 같이 2-3 회 자극된다. 추가의 구현예에서, T 세포는 기재된 바와 같이 4 또는 5 회 자극된다. 본 방법론을 사용하면, 자극 이전과 비교하여 다클론성이 증가된, 약 100 내지 약 100,000 배의 T 세포 수를 달성할 수 있다. 게다가, 본 발명의 방법에 의해 팽창된 T 세포는 실질적인 수준의 사이토카인 (예컨대, IL-2, IFN-γIL-4, GM-CSF 및 TNF-α)을 배양 상등액으로 분비한다. 예를 들어, IL-2로의 자극과 비교하여, 항-CD3 및 항-CD28 공동-자극의 사용에 의해 팽창된 CD4+ T 세포는 높은 수준의 GM-CSF 및 TNF-α를 배양 배지로 분비한다. 이러한 사이토카인은 배양 상등액으로부터 정제될 수 있거나, 또는 상등액은 배양물에서 세포를 유지하기 위해 직접적으로 사용될 수 있다. 이와 유사하게, 배양 상등액 및 사이토카인과 함께 본 발명의 방법에 의해 팽창된 T 세포는 생체 내 세포 성장을 뒷받침하도록 투여될 수 있다.
하나의 구체예에서, T 세포 자극은, 예를 들어 비드 (3×28 비드) 상에 공동 고정화된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 사용하여, 정지 상태로 (낮은 증식 또는 증식 없음)으로 복귀하기에 충분한 일정 기간 동안 (초기 자극 이후 대략 8-14 일) 수행된다. 자극 신호는 이후 세포로부터 제거되고 세포는 세척되어 환자에게 다시 주입된다. 자극 단계의 말미에 있는 세포는, 예시에 의한 증거와 같이, 항원에 반응하는 이의 능력 및 기억-유사 표현형을 입증하는 이러한 세포의 능력에 의해 입증되는 바와 같이 본 발명의 방법에 의해 “초-유도성(super-inducible)”이 된다. 따라서, 외인성으로 또는 주입 이후 생체 내 항원에 의해 재자극될 때, 활성화된 T 세포는 지속적인 CD154 발현, 사이토카인 제조 증가, 등과 같은 독특한 표현형 성질을 특징으로 하는 강력한 반응을 나타낸다.
본 발명의 추가의 구현예에서, 세포, 예컨대 T 세포는 시제-코팅된 또는 컨쥬게이션된 비드와 조합되고, 이러한 비드 및 세포는 이후 분리된 후, 세포는 배양된다. 택일적인 구현예에서, 배양 이전에, 시제-코팅된 또는 컨쥬게이션된 비드 및 세포는 분리되지 않지만, 함께 배양된다. 추가의 구체예에서, 비드 및 세포는 먼저 물리력의 인가에 의해 농축되고, 세포 표면 모이어티를 결찰시켜, 세포 자극 및/또는 활성화 신호의 분극을 유도한다.
예시로서, T 세포가 세포 집단을 표적화할 때, 세포 표면 모이어티는 항-CD3 및 항-CD28 항체가 부착된 상자성 비드 (3×28 비드)를 제조된 T 세포에 접촉하게 함으로써 결찰될 수 있다. 하나의 구체예에서 세포 (예를 들어, 104 내지 109 T 세포) 및 비드 (예를 들어, 1:1의 비율의 DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)가 완충액, 바람직하게 PBS (칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온 불포함)에서 조합된다. 일부 양태에서, 임의의 세포 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플 내에서 매우 드물고, 샘플의 오직 0.01%를 포함할 수 있거나, 또는 전체 샘플 (즉, 100%)이 관심 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수는 본 발명의 맥락 내에 있다. 특정 구체예에서, 세포 및 입자의 최대 접촉을 보장하기 위해, 이러한 입자 및 세포가 함께 혼합되는 부피를 현저하게 감소 (즉, 세포의 농도를 증가)시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 약 20억 세포/mL의 농도가 사용된다. 또 다른 구체예에서, 1억 세포/mL 초과가 사용된다. 추가의 구체예에서, 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만, 또는 5000만 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 구현예에서, 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1 억 세포/mL의 세포 농도가 사용된다. 추가의 구현예에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만 세포/mL의 농도가 사용될 수 있다. 높은 농도를 사용하면 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 팽창이 증가될 수 있다. 또한, 높은 세포 농도를 사용하면 CD28-음성 T 세포와 같은 관심 표적 항원을 약하게 발현하는 세포를 더욱 효과적으로 포획하게 한다. 이러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있으며 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하면 일반적으로 약한 CD28 발현을 가지는 CD8+ T 세포를 보다 효과적으로 선별할 수 있다.
관련된 구현예에서, 더욱 낮은 세포 농도를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 입자의 혼합물을 상당히 희석시킴으로써, 입자와 세포 사이의 상호작용이 최소화된다. 이것은 입자가 결합되는 다량의 원하는 항원을 발현하는 세포를 선별한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 높은 수준의 CD28를 발현하고, 희석된 농도에서 CD8+ T 세포보다 더욱 효율적으로 포획되고 자극된다. 하나의 구체예에서, 사용되는 세포의 농도는 약 5×106/mL이다. 다른 구체예에서, 사용되는 농도는 약 1×105/mL 내지 약 1×106/mL, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.
세포가 현탁된 완충액은 특정 세포 유형에 적절한 임의의 완충액일 수 있다. 특정 세포 유형을 사용할 때 완충액은 과정 동안 세포 무결성을 유지하는데 필요한 다른 성분, 예컨대, 1-5% 혈청을 함유할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포 및 비드는 세포 배양 배지에서 조합될 수 있다. 세포 및 비드는, 예를 들어, 혼합을 위한 회전, 교반 또는 임의의 수단에 의해, 1 분 내지 수 시간 범위의 일정 기간 동안 혼합될 수 있다. 비드 및 세포의 용기는 이후 자기장에 배치하는 것과 같은 물리력에 의해 농축된다. 배지 및 결합되지 않은 세포는 제거되며, 비드 또는 다른 표면에 부착된 세포는 , 예를 들어, 연동 펌프를 통해 펌핑함으로써 세척된 후 세포 배양에 적절한 배지에 재현탁된다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 혼합물은 30 분 내지 수 시간 (약 3 시간) 내지 약 14 일 또는 그 사이의 임의의 시간 또는 분 정수 값 동안 배양될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 혼합물은 21 일간 배양될 수 있다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 비드 및 T 세포는 약 8 일간 함께 배양된다. 또 다른 구체예에서, 비드 및 T 세포는 2-3 일간 배양된다. 상기 기재된 바와 같이, T 세포의 배양 시간이 60 일 이상일 수 있도록 여러 주기의 자극의 또한 바람직할 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 증식 및 생존에 필요한 인자를 포함할 수 있는 적절한 배지 (예컨대, Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo 15, (BioWhittaker))를 포함하며, 이러한 인자로는 혈청 (예컨대, 태아 소 또는 인간 혈청), 또는 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, 또는 세포 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함한다. 배지는 아미노산 및 비타민이 첨가되어있으며, 혈청이 없거나 또는 적절한 양의 혈청 (또는 혈장), 또는 정의된 세트의 호르몬, 및/또는 T 세포의 성장 및 팽창에 충분한 양의 사이토카인으로 대체된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20을 포함할 수 있다. 항생제, 예컨대, 페니실린 및 스트렙토마이신은 실험 배양물에만 포함될 수 있으며, 대상체에 주입될 세포의 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 뒷받침하기 위해 필요한 조건, 예를 들어, 적절한 온도 (예컨대, 37 ℃) 및 분위기 (예컨대, 공기 + 5% CO2) 하에서 유지된다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 비드:세포 비율은 원하는 T 세포 표현형을 수득하기 위해 조정될 수 있다. 하나의 구체적인 구현예에서, 비드:세포 비율은 항원-특이적 (기억) T 세포를 선택적으로 팽창 또는 제거하도록 달라질 수 있다. 하나의 구체예에서, 사용되는 특정 비드:세포 비율은 항원-특이적 T 세포를 선택적으로 제거한다. 추가의 구체예에서, 사용되는 특정 비드:세포 비율은 항원-특이적 T 세포를 선택적으로 팽창시킨다. 일부 양태에서, 원하는 항원-특이적 T 세포의 팽창 또는 제거가 일어나는 한 임의의 비율이 사용될 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 다양한 면역치료 설정을 위해 세포의 특정 집단을 팽창, 또는 T 세포의 특정 집단을 제거하도록 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 항-CD3/항-CD28 (즉, 3×28)-코팅된 비드와 같은 자극제에 대한 노출 시간은 원하는 T 세포 표현형을 수득하기 위한 방식으로 변형 또는 조정될 수 있다. 택일적으로, 원하는 T 세포 집단은 자극 이전에 임의의 수의 선별 기법을 사용하여 선별될 수 있다. CD8+ 세포독성 또는 조절 T 세포와 대조적으로, 보조 T 세포 (TH)의 팽창이 전반적인 면역 반응성을 개선 또는 회복시킬 수 있기 때문에 더 많은 집단의 TH 세포, 일반적으로 CD4+가 바람직할 수 있다. 표적 세포를 직접적으료 용해 또는 사멸시킬 수 있는 CD8+ 항원-특이적 T 세포에 의해 다수의 구체적인 면역 반응이 매개되는 반면, 대부분의 면역 반응은 CD4+ T 세포의 도움을 필요로 하며, 이는 예를 들어 GM-CSF, CD40L, 및 IL-2와 같은 중요한 면역-조절 분자를 발현한다. CD4-매개 도움이 바람직한 경우에, CD4:CD8 비율을 보존 또는 향상시키는 본 명세서에 기재된 방법이 상당히 유리할 수 있다. 증가된 수의 CD4+ T 세포는 환자에게 도입되는 세포-발현된 CD40L 의 양을 증가시켜, 잠재적으로 표적 세포의 가시성을 증가시킬 수 있다 (개선된 APC 기능). GM-CSF, 또는 IL-2를 발현하는 융합된 세포의 수를 증가시킴으로써 유사한 효과가 관찰될 수 있으며, 상기 모두는 CD4+ T 세포에 의해 주로 발현된다. 마찬가지로, 특정 적용에서 조절 T 세포 집단을 활용하는 것이 바람직할 수 있으며 (예컨대, Autoimmun Rev. 2002 August; 1(4):190-7; Curr Opin Immunol. 2002 December; 14(6):771-8) 이는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 생성 및 팽창될 수 있다. 택일적으로, CD4-도움이 덜 필요하고 증가된 수의 CD8+ T 세포가 바람직한 상황에서, 본 명세서에 기재된 XCELLERATE™접근법은, 예를 들어, 자극 및/또는 배양 전에 CD8+ 세포를 미리 선별함으로써 또한 활용될 수 있다. 이러한 상황은 증가된 수준의 IFN-γ또는 증가된 표적 세포의 세포 용해가 바람직한 경우에 존재할 수 있다. 또한, 원하는 TCR 레퍼토리를 사용하여, 예를 들어, 원하는 Vβ패밀리 유전자를 발현하여 T 세포를 팽창시키기 위한 자극제에 대한 노출 시간 및 유형을 변형시킬 수 있다.
상이한 T 세포 집단의 단리를 유발하기 위해, 입자에 대한 노출 시간이 달라질 수 있다. 예를 들어, 하나의 바람직한 구현예에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선별에 충분한 기간 동안 3×28 비드, 예컨대 DYNABEADS®M-450와의 인큐베이션에 의해 단리된다. 하나의 구체예에서, 이러한 기간은 약 30 분이다. 또 다른 구현예에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 기간은 10 내지 24 시간 이상이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 인큐베이션 기간은 (약) 24 시간이다. 암 환자로부터 T 세포의 단리를 위해, 적어도 (약) 24 시간과 같은 더 긴 인큐베이션 시간을 사용하면, 세포 수율을 증가시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 전체 자극 및/또는 팽창 시간은 2 일 내지 15 일, 2 일 내지 12 일, 2 일 내지 12 일, 2 일 내지 8 일, 2 일 내지 6 일, 2일 내지 4 일, 4 일 내지 12 일, 4 일 내지 10 일, 4 일 내지 8 일, 4 일 내지 6 일, 6 일 내지 12 일, 6 일 내지 10 일, 6 일 내지 8 일, 8 일 내지 12 일, 8 일 내지 10 일, 또는 10 일 내지 12 일일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 (약) 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 또는 14 일 이상 동안 인큐베이션 및/또는 자극 시약 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 입자)과 함께 인큐베이션된다. T 세포의 자극이 짧은 기간 동안 수행될 때, T 세포 집단은 개체수가 증가할 수 없거나, 개체수가 급격히 증가할 수 없거나, 개체수가 감소할 수 있거나, 또는 동일한 개체수로 유지될 수 있지만, 이러한 집단은 생체 내에서 계속 증식할 수 있고 및/또는 천연 효과기 T 세포 풀과 더욱 근접하게 유사할 수 있는 더욱 강력하고 건강한 활성화된 T 세포를 제공할 것이다. 예를 들어, T 세포의 자극이 짧은 기간 동안 수행될 때, T 세포 집단은 T 세포 자극이 더 오랜 기간 동안 수행되는 유사한 과정과 비교하여, 나이브 또는 나이브-유사 T 세포, 또는 조작된 T 세포를 더 큰 백분율 및/또는 비율로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 짧은 기간은 전체 인큐베이션 시간을 특징으로 할 수 있으며, 일부 구현예에서 자극제와의 전체 인큐베이션 시간은, (약) 6 일 이하, (약) 5 일 이하, (약) 4 일 이하, (약) 3 일 이하, 또는 (약) 2 일 이하이다. T 세포 도움의 이용 가능성은 종종 단백질 항원에 대한 항체 반응의 제한 인자임에 따라, T 세포의 CD4+ 풍부 집단을 대상체로 선별적으로 팽창 또는 선별적으로 주입하는 능력은 매우 유리하다. B 림프구에 의해 제시된 항원을 인식하는 활성화된 보조 T 세포가 B 세포를 증식 및 분화시키는 2가지 유형의 자극, 물리적 접촉 및 사이토카인 제조를 야기하는 점에 있어서, 이러한 풍부 집단의 추가적인 이점이 명백하다.
일부 경우에, 자극 조건은 T 세포의 특정 서브세트, 예를 들어 비-나이브-유사 T 세포를 보존하기 위해 보충되는 배양 성분 또는 시제를 포함하지 않는다. 그러므로, 일부 경우에, 자극 조건의 배양으로부터 성분 또는 시제의 제거는 비-나이브-유사 T 세포의 제거에 기여할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 TCR/CD3 신호전달의 강도를 조절 및/또는 미세-조정하는데 사용될 수 있는 N-아세틸렌 시스테인과 같은 시제를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 이러한 시제는 활성화 신호의 강도를 증가시키기 위한 양/비율로 제거 또는 감소된다. 일부 양태에서, 자극 조건은 AICD를 감소키기는 것으로 공지되어있거나 또는 감소시킬 가능성이 있고 및/또는 비-나이브 세포와 같은 구형 세포의 생존을 촉진하는 배양 시약의 농도를 배제 또는 감소시킴으로써 수행되거나, 또는 추가적으로 수행된다. 일부 경우에, 자극 조건은 N-아세틸렌 시스테인을 포함하지 않거나, 또는 N-아세틸렌 시스테인을 감소된 양 또는 농도로 포함한다. 일부 경우에, 자극 조건은 하나의 재조합 IL-7 및/또는 재조합 IL-15를 포함하지 않거나, 또는 감소된 양 또는 농도의 재조합 IL-7 또는 IL-15를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-나이브 세포 (예컨대, CD45RO에 독소-부착된)의 제거를 추가로 보조 또는 촉진하는 배양 첨가제가 포함될 수 있다.
C.자극된 조성물
또한, 기재된 인큐베이션 (예컨대, 자극) 방법에 의해 생성된 자극된 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 자극된 조성물의 세포는 투입 조성물의 인큐베이션 이후, 예컨대 유전자 조작된 항원 수용체를 도입하기 위해 추가로 조작된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유전자 조작 단계 동안 하나 이상의 자극제의 존재하에 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 인큐베이션 (예컨대, 자극) 방법을 사용하여 세포 사멸을 겪지 않은 자극된 조성물의 세포는 주어진 항원에 대한 집단의 반응의 폭에 의해 측정되는 상기 남아있는 T 세포 집단의 다클론성을 증가시킬 수 있다. 다클론성의 복구 또는 증가는 특정 관심 항원에 대한 반응의 폭을 측정함으로써, 예를 들어 항원-특이적 세포에 의해 인식되는 상이한 에피토프의 수를 측정함으로써 결정될 수 있다. 이는 클로닝 항원-특이적 T 세포를 시험관 내 생성 및 클로닝하기 위한 표준 기법을 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에 제공된 방법의 일부 구현예에서, 배양 조건은 나이브-유사 T 세포와 비교하여 비-나이브-유사 T 세포의 팽창, 증식, 및/또는 생존을 우선적으로 유도한다. 제2 세포 유형 또는 집단과 비교하여, 제1 세포 유형 또는 집단의 우선적인 팽창, 증식, 및/또는 생존은 상대적인 팽창, 증식, 및/또는 생존이 제2 유형 또는 집단보다 제1 유형 또는 집단에 대해 더 크다는 것을 의미한다. 이것은, 팽창, 증식, 및/또는 생존된 제1 세포 유형 또는 집단의 백분율이 더 크고, 및/또는 세포가 팽창, 증식, 및/또는 생존된 정도 (예컨대, 집단 또는 유형의 세포 가운데 전체 또는 평균 정도)가 제2 집단 또는 유형보다 제1 집단 또는 유형에 대해 더 크다는 시나리오를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 우선적인 팽창, 증식, 및/또는 생존은 투입 조성물 내 나이브-유사 세포의 백분율과, 원래의 투입 조성물 내 나이브-유사 세포로부터 유래된 자극된 조성물 내 조작된 세포의 백분율을 비교함으로써 표현된다. 일부 예시에서, 원래의 투입 조성물 내 나이브-유사 세포로부터 유래된 자극된 조성물 내 조작된 세포의 백분율은 본 명세서에 기재된 자극 조건하에서 일반적으로 전자보다 더 크다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 원래의 투입 조성물 내 나이브-유사 세포로부터 유래된 자극된 조성물 내 조작된 세포의 백분율은 배양-개시 조성물 내 나이브 세포의 백분율보다 더 크다. 하나의 양태에서, 투입 조성물 (또는 그 안의 T 세포)는 (약) 70%의 나이브-유사 T 세포 및 30%의 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 반면에, 생성된 자극된 조성물 내 조작된 세포의 50 % 초과, 예컨대, 적어도 70%는 투입 조성물 내 나이브-유사 세포로부터 유래된다. 일부 경우에, TCR 복합체를 통해 강한 신호를 유도하는 시제(들)로의 자극과 같은 다른 조건을 사용하면, 자극된 조성물 내 세포의 50 % 이하, 예컨대, (약) 5-10 %가 비-나이브-유사 기원일 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 조건은 투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포에서 활성화-유도 세포 사멸을 유도하는 강한 신호를 유도한다.
일부 구현예에서, 자극된 조성물 내 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포로부터 유도된 나이브-유사 T 세포 또는 세포의 백분율은 투입 조성물과 비교하여 (약) 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 50 배, 100 배 이상 증가된다. 일부 경우에, 투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포로부터 유도된 세포와 비교하여 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포의 비율, 또는 자극된 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 비율은 투입 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 비율과 비교하여 (약) 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 50 배, 100 배 이상 증가한다. 일부 구현예에서, 자극된 조성물은 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포의 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 포함한다.
본 명세서에 기재된 T 세포 자극 방법을 사용하는 일부 구현예에서, 투입 조성물 내 세포 중에서, 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 더 큰 백분율의 나이브-유사 T 세포가 증식하도록 유도되고 및/또는 활성화된다. 일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 자극 방법으로부터 생성된 자극된 조성물은 비-나이브 유사 T 세포로부터 유래된 세포의 10% 미만을 포함한다. 일부 경우에, 자극된 조성물은 비-나이브 T 세포로부터 유래된 세포의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 이하를 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 조성물 내 나이브-유사형이었던 T 세포의 더 큰 백분율은 투입 조성물 내 비-나이브-유사형이었던 T 세포의 백분율과 비교하여, 상기 인큐베이션의 개시 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일에 분열한다. 일부 경우에, 자극 조건은 세포 사멸을 유도한다. 구체적인 예시에서, 상기 방법의 자극 조건은 비-나이브-유사 T 세포의 활성화를 유도하여, 활성화-유도 세포 사멸 (AICD)을 유도한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 인큐베이션의 개시 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일에, 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 더 큰 백분율의 나이브-유사 T 세포 집단의 세포의 증식을 유도할 수 있는 자극 조건을 포함한다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 자극된 조성물을 생성하고, 자극 조건은 나이브-유사 T 세포의 팽창을 우선적으로 유도하여 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 자극된 조성물의 T 세포의 표적 양이 생성되도록 한다. 일부 구현예에서, 자극된 조성물은 T 세포의 바람직한 CD4:CD8 비율을 달성하도록 추가로 조정된다. 일부 경우에, 특정 세포 집단은 바람직한 CD4:CD8 비율을 달성하도록 자극된 조성물로부터 제거될 수 있다.
일부 구현예에서, 예컨대, 투입 조성물이 인큐베이션되는 자극 조건은, 비-나이브-유사 T 세포 또는 이의 서브세트와 비교하여 나이브-유사 T 세포 또는 이의 서브세트의 팽창, 증식, 및/또는 생존을 우선적으로 유도한다. 일부 양태에서, 자극 조건은 투입 조성물의 비-나이브-유사 T 세포를 강하게 활성화하여, 특히 투입 조성물의 비-나이브-유사 세포에서 세포 사멸을 활성화한다. 일부 양태에서, 이는 나이브-유사 T 세포의 생존을 우선적으로 선호한다. 일부 양태에서, 이러한 자극 조건은 상기 방법에 의해 생성된 세포 및 조성물을 대상체에게 투여한 이후 독성 및/또는 독성-관련의 결과(들) 또는 증상(들)의 수준을 감소시킨다.
특정 반응이 또 다른 집단에 비해 하나의 집단에서 유도되었는지 또는 우선적으로 유도되었는지에 대한 여부는 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 세포 주기에 진입하도록 세포가 유도되는지 여부는 유세포 분석-기반의 방법에 의해 측정될 수 있으며, 이러한 방법으로는 세포 분할을 평가하기 위한 염료 및 다른 시제, 예컨대 CFSE 및 다른 킬레이트제의 사용에 이어서 이후 유세포 분석 평가, 삼중수소 (H3) 표지된 티미딘 및 유사한 시제의 혼입, 및/또는 세포 수의 평가 방법을 포함한다. 다양한 순수한 시험 집단을 평가함으로써, 예컨대 구체적인 조건하에서 개별적으로 나이브 및 비-나이브 T 세포 집단을 비교함으로써 비교할 수 있다. 활성화는, 예를 들어, 다양한 사이토카인의 분비 및/또는 CD25, CD69를 비롯한 다양한 활성화 마커의 상향 조절 또는 발현, 및/또는 세포 크기 (예컨대, 유세포 분석법에 의해 측정된 전방 산란)에 의해 측정될 수 있다. 생존 및/또는 세포 사멸은 유세포 분석법을 비롯한 다양한 방법, 프로피듐 아이오다이드를 비롯한 다양한 염료의 혼입, 및 시제를 사용한 염색, 예컨대 에넥신 V 및 유사한 시제로의 염색에 의해 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포의 백분율은 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 자극된 조성물 내 T 세포의 백분율보다 작다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 핵산과 함께 도입된 세포의 더 많은 백분율이, 투입 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포의 증식이거나, 또는 이로부터 유래되도록 생성한다. 구체적인 세포 유형에서의 반응 및/또는 결과에 유리한 자극 조건의 다양한 조정은, 예를 들어, 미국 특허 8,617,884, 및 미국 특허 출원 US 20030235908 A1에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 자극된 조성물은 나이브-유사 T 세포의 특정 마커를 발현하는 세포를 발현하는 세포, 또는 이로부터 유래된 세포를 포함한다. 예를 들어, 제공된 방법에 의해 생성된 자극된 조성물은 CD27, CD28, CD45RA, 및 CCR7로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인 세포 집단으로부터 유도된다. 일부 경우에, 제공된 방법에 의해 생성된 자극된 조성물은 CD62L와 같은 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 음성인 세포 집단으로부터 유래된다. 일부 양태에서, 자극된 조성물의 세포는 CD56 및/또는 CD45RO에 대해 표면 음성인 세포이거나, 또는 이로부터 유래된다. 일부 구체적인 구현예에서, 제공된 방법에 의해 생성된 자극된 조성물은 CD27+, CD45RA+, CD45RO-, 및 CCR7+인 세포 집단으로부터 유래된다. 일부 경우에, 자극된 조성물의 세포는 IL-2, IFN-γIL-4, 및/또는 IL-10와 같은 사이토카인의 세포 내 발현에 대해 음성인 세포이거나, 또는 이로부터 유래된 세포이다. 일부 추가의 예시에서, 자극된 조성물의 세포는 마커 CD25 및/또는 퍼포린의 발현에 음성인 세포이거나, 또는 이러한 세포로부터 유래된다. 일부 경우에, 자극된 조성물의 세포는 CD95lo인 세포이거나, 또는 이로부터 유래된 세포이다.
일부 경우에, 자극된 조성물은 CD27, CD28, CD45RA, 및 CCR7와 같은 T 세포 활성화 마커에 대해서는 표면 양성, 및 CD62L에 대해서는 표면 음성인 T 세포의 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 또는 적어도 90 %로부터 유래된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극된 조성물은 CD56 및/또는 CD45RO에 대해 표면 음성인 T 세포의 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 또는 적어도 90 %%로부터 유래된 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 자극된 조성물은 CD45RO에 대해 표면 음성 및 CD27, CD45RA, 및 CCR7에 대해 세포 표면 양성인 T 세포의 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 또는 적어도 90 %로부터 유래된 세포를 포함한다. 일부 예시에서, 자극된 조성물은 IL-2, IFN-γIL-4, IL-10과 같은 사이토카인의 세포 내 발현에 음성인 T 세포의 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 또는 적어도 90 %로부터 유래된 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 자극된 조성물은 마커 CD25 및/또는 퍼포린의 발현에 대해 음성인 T 세포의 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 또는 적어도 90 %로부터 유래된 세포를 포함한다. 일부 경우에, 자극된 조성물은 CD95lo인 T 세포의 적어도 40 %, 적어도 50 %, 적어도 60 %, 적어도 70 %, 적어도 80 %, 또는 적어도 90 %로부터 유래된 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 자극된 조성물운 투입 조성물과 비교하여 더욱 다클론성이거나 또는 다클론성이다. 일부 구현예에서, 자극된 조성물은 투입 조성물과 비교하여 더욱 다양하다. 일부 구현예에서, 이러한 다클론성의 증가는, 적어도 하나의 Vβ, Vα, Vγ또는 Vδ패밀리 유전자의 VβVα, Vγ또는 Vδ스펙트럼 유형 프로파일에의해 측정된 바와 같이, T 세포 집단의 단클론성에서 올리고클론성 다클론성으로의 이동을 포함한다. 제공된 방법을 사용하여 생존, 팽창, 증식된 남아있는 세포의 자극 및 활성화는, 주어진 항원에 대한 집단의 반응 폭에 의해 측정된 바와 같이 자극된 조성물의 상기 남아있는 T 세포의 다클론성을 증가시킬 수 있다. 자극된 조서물의 다클론성의 복구 또는 증가는 특정 관심 항원에 대한 반응의 폭을 측정함으로써, 예를 들어 항원-특이적 세포에 의해 인식되는 상이한 에피토프의 수를 측정함으로써 결정될 수 있다. 이는 클로닝 항원-특이적 T 세포를 시험관 내 생성 및 클로닝하기 위한 표준 기법을 사용하여 수행될 수 있다.
II.세포의 유전적 조작 방법
일부 구현예에서, 상기 방법은 유전자 조작된 재조합 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 키메라 수용체를 T 세포의 자극된 조성물로 도입하는 단계, 조작된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 자극 조건하에서 투입 조성물의 인큐베이션 단계는 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전, 동안 및 또는 이후 수행된다. 일부 예시에서, 도입은 형질전환에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 균일하게 형질전환될 수 있는 자극된 조성물을 생성한다. 일부 양태에서, 핵산은 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 예시에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 도입 단계를 포함하는 상기 방법은, 시험관 내 또는 생체 외에서 수행된다.
이에 따라, 본 명세서에 제공된 방법은 유전자 조작을 위한 세포를 제조하기 위한 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 단계로는, 생물학적 샘플로부터 세포를 단리하는 단계, 세포의 투입 조성물을 자극하는 단계, 및 유전자 조작될 세포의 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 또한 이러한 세포 집단, 이러한 세포를 포함 및/또는 이러한 세포가 풍부한 조성물이 제공되며, 재조합 수용체, 예컨대 키메라 수용체를 발현하는 세포가, 조성물 내 전체 세포 또는 특정 유형의 세포, 예컨대 T 세포 또는 CD8+ 또는 CD4+ 세포의 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 퍼센트 이상을 구성한다. 조성물 중에는 입양 세포 요법과 같은 투여용 약제학적 조성물 및 제제가 있다. 또한, 이러한 세포를 조작, 제조 또는 생성하는 방법, 환자와 같은 대상체에게 이러한 세포 및 조성물을 투여하는 방법, 및 이러한 세포를 감지, 선별, 단리 또는 분리하는 방법이 제공된다. 이에 따라, 재조합 수용체 예컨대, CAR를 발현하는 유전자 조작된 세포가 제공된다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작을 통해 도입되는 하나 이상의 핵산을 포함하고, 이에 의해 그러한 핵산의 재조합 또는 유전적으로 조작된 생성물을 발현한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종성이며, 즉 통상적으로 세포 또는 세포로부터 수득한 샘플, 예컨대 조작된 세포 및/또는 그러한 세포가 유래된 유기체에서 일반적으로 발견되지 않는 기타 유기체 또는 세포로부터 수득한 샘플에 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 자연적으로 발생하지 않으며, 예컨대 자연에서 발견되지 않는 핵산은 여러 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 인코딩하는 핵산의 키메라 조합물을 포함한다.
A.유전자 조작
1.재조합 항원 수용체
일부 구현예에서, 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드), 예컨대 특정 세포 유형의 표면에서 발현되는 항원에 대해 특이성을 가지는 CAR를 발현하는 조작된 세포, 예컨대 T 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은, 정상 세포 또는 비-표적화된 세포 또는 조직과 비교하여, 질병 또는 질병 상태의 세포, 예를 들어, 종양 또는 병원성 세포 상에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에 있어서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고 및/또는 조작된 세포 상에서 발현된다.
구체적인 구현예에서, 재조합 수용체, 예컨대 키메라 수용체는 세포 내 신호전달 영역을 포함하며, 이러한 신호전달 영역은 세포질 신호전달 도메인 (세포 내 신호전달 도메인로도 불림), 예컨대 T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 세포질 (세포 내) 영역, 예를 들어, T 세포 수용체 (TCR) 성분의 세포질 신호전달 도메인 (예컨대 CD3-제타 (CD3ζ사슬 또는 기능적 변형체의 세포질 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분)을 포함하고 및/또는 면역수용체 타이로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체는 리간드 (예컨대 항원) 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 리간드-결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 수용체는 항원에 특이적으로 결합하는 세포 외 항원-인식 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 구현예에서, 항원와 같은 리간드는 세포 표면에서 발현되는 단백질이다. 일부 구현예에서, CAR는 TCR-유사 CAR이고, 항원은 펩타이드 항원, 예컨대 세포 내 단백질의 펩타이드 항원으로 가공되며, 이는 TCR와 같이, 주조직 적합성 복합체 (MHC) 분자의 맥락에서 세포 표면에서 인식된다.
CAR을 포함하는 예시적인 항원 수용체 및 이러한 수용체를 조작하고 세포 내로 도입시키는 방법은, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 WO2000/14257, WO2013/126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 번호: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, , 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 및 8,479,118, 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416에 개시된 것들 및/또는 [Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398]; [Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338]; [Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39]; [Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75]에 개시된 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 항원 수용체로는 미국 특허 7,446,190에 개시된 CAR, 및 국제 특허 출원 공보 WO/2014055668 A1에 개시된 수용체를 포함한다. CAR의 예로는 전술한 공보, 예컨대 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 7,446,190, 미국 특허 8,389,282, 문헌 [Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)] 중 어느 하나에 개시된 CAR를 포함한다. 또한 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 7,446,190, 및 미국 특허 8,389,282를 참조한다.
일부 구현예에서, CAR은 특정 항원 (또는 마커 또는 리간드), 예컨대 입양 요법에 의해 표적화되는 특정 세포 유형에서 발현되는 항원, 예컨대, 암 마커, 및/또는 완충 반응을 유도하기 위한 항원, 예컨대 정상 또는 비-병증 세포 유형에서 발현된 항원에 대한 특이성으로 구성된다. 이에 따라, CAR은 일반적으로 세포 외 부분에, 하나 이상의 항원 결합 분자, 예컨대 하나 이상의 항원-결합 단편, 도메인, 또는 부분, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인, 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항원-결합 부분 또는 항체 분자의 부분, 예컨대 단클론성 항체 (mAb)의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)로부터 유도된 단일-사슬 항체 단편 (scFv)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체의 일부로서 세포에서 발현된다. 항원 수용체 가운데 기능적 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)가 존재한다. 일반적으로, 펩타이드-MHC 복합체에 대한 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 CAR이 또한 TCR-유사 CAR로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR-유사 CAR의 MHC-펩타이드 복합체에 대해 특이적인 세포 외 항원 결합 도메인은 하나 이상의 세포 내 신호전달 성분에 연결되며, 일부 양태에서 링커 및/또는 막횡단 도메인(들)을 통해 연결된다. 일부 구현예에서, 이러한 분자는 일반적으로 TCR와 같은 천연 항원 수용체를 통한 신호, 및, 선택적으로, 공동자극 수용체와의 조합된 이러한 수용체를 통한 신호를 모방하거나 유사하게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 수용체 (예컨대 CAR)와 같은 재조합 수용체는 항원 (또는 리간드)에 대해 결합, 예컨대 특이적으로 결합하는 리간드-결합 도메인을 포함한다. 키메라 수용체에 의해 표적화되는 항원 가운데 입양 세포 요법을 통해 표적화되는 질병, 조건, 또는 세포 유형의 맥락에서 발현되는 항원이 존재한다. 질병 및 병태 중에는 암과 종양을 비롯한 증식성, 신생물성, 및 악성 질병 및 장애가 있으며, 혈액암, 면역계 암, 예컨대 림프종, 백혈병, 및/또는 골수종, 예컨대 B, T, 및 골수성 백혈병, 림프종, 및 다발성 골수종을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 (또는 리간드)은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 이는 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원 (또는 리간드)는 정상 세포 또는 비-표적화된 세포 또는 조직과 비교하여, 질환 또는 증상 세포, 예컨대 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에 있어서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고 및/또는 조작된 세포 상에서 발현된다.
일부 구현예에서, CAR은 항원, 예컨대 세포 표면에서 발현된 온전한 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항원-결합 단편 (예컨대 scFv)을 포함한다.
특정 구현예에서, 항원은 αvβ인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250로도 알려짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 알려짐), 암배아 항원 (CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), 표피 성장 인바 단백질 (EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5 (FCRL5; 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (fetal AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100 (gp100), 글리피칸-3 (GPC3), G 단백질 연결 수용체 5D (GPCR5D), Her2/neu (수용체 타이로신 키나제 erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원 (HMW-MAA), 간염 B 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파 (IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 유착 분자 (L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린 (MSLN), c-Met, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 천연 세포 유착 분자 (NCAM), 종양태아성 항원, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA), 수용체 타이로신 키나제 유사 고아 수용체 1 (ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), 종양-관련 당단백 72 (TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1 (TRP1, 또한 TYRP1 또는 gp75로도 알려짐), 티로시나아제 관련 단백질 2 (TRP2, 또한 도파크롬 토토머라제, 도파크롬 델타-아이소머라제 또는 DCT로도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), Wilms 종양 1 (WT-1), 병원체-특이 또는 병원체-발현 항원, 또는 보편적인 표지와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 B 세포 악성종양과 관련된 항원을 포함하는데, 예컨대 다수의 공지된 B 세포 마커 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 바이러스 항원 (예컨대, HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스 항원), 박테리아 항원 및/또는 기생충 항원이다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 CD19이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD19에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유도된 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, CD19에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 마우스 유래 항체 예컨대 FMC63 및 SJ25C1이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 항체, 예컨대, US 2016/0152723에 기재된 항체이다.
일부 구현예에서, scFv는 FMC63으로부터 유래한다. FMC63은 일반적으로 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 만들어진 마우스 단일클론 IgG1 항체를 지칭한다 (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). FMC63 항체는 comprises 각각, 서열 번호 38, 39로 제시된 CDRH1 및 H2 및 서열 번호 40 또는 54로 제시된 CDRH3 및 서열 번호 35로 제시된 CDRL1 및 36 또는 55로 제시된 CDR L2 및 서열 37 또는 34로 제시된 CDR L3을 포함한다. FMC63 항체는 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, svFv는 서열 번호 35의 CDRL1 서열, 서열 번호 36의 CDRL2 서열, 및 서열 번호 37의 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호 38의 CDRH1 서열, 서열 번호 39의 CDRH2 서열 및 서열 번호 40의 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 41에 기재된 FMC63의 가변 중쇄 영역 및 서열 번호 42에 기재된 FMC63의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호 56에 기재된다. 일부 구현예에서, scFv는, 순서대로, VH, 링커, 및 VL를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는, 순서대로, VL, 링커, 및 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, svFc는 서열 번호 57에 기재된 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 57와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 43에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 43와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 SJ25C1로부터 유래한다. SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대하여 만들어진 마우스 단일클론 IgG1 항체이다 (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). SJ25C1 항체는 서열 번호 47-49로 각각 제시되는 CDRH1, H2 및 H3, 서열 번호 44-46으로 각각 제시되는 CDRL1, L2 및 L3를 포함한다. SJ25C1 항체는 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, svFv는 서열 번호 44의 CDRL1 서열, 서열 번호 45의 CDRL2 서열, 및 서열 번호 46의 CDRL3 서열을 포함하는 가변 경쇄 및/또는 서열 번호 47의 CDRH1 서열, 서열 번호 48의 CDRH2 서열 및 서열 번호 49의 CDRH3 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 50에 기재된 SJ25C1의 가변 중쇄 영역 및 서열 번호 51에 기재된 SJ25C1의 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열 번호 52에 기재된다. 일부 구현예에서, scFv는, 순서대로, VH, 링커, 및 VL를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는, 순서대로, VL, 링커, 및 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열 또는 서열 번호 53와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 BCMA이다. 일부 구현예에서, scFv는 BCMA에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유도된 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, BCMA에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 국제 출원 공개 번호 WO 2016/090327 및 WO 2016/090320에 기재된 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 및 VL이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 GPRC5D이다. 일부 구현예에서, scFv는 GPRC5D에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유도된 VH 및 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, GPRC5D에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 국제 출원 공개 번호 WO 2016/090329 및 WO 2016/090312에 기재된 항체 또는 항체 단편으로부터의 VH 및 VL이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 MHC-펩타이드 복합체로서 세포 표면에 제시되는 종양-관련 항원과 같은 세포 내 항원을 특이적으로 인식하는 TCR-유사 항체, 예컨대 항체 또는 항원-결합 단편 (예컨대 scFv)을 포함한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체를 인식하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 재조합 수용체, 예컨대 항원 수용체의 일부로서 세포에서 발현될 수 있다. 항원 수용체 가운데 기능적 비-TCR 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR)가 존재한다. 일반적으로, 펩타이드-MHC 복합체에 대한 TCR-유사 특이성을 나타내는 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하는 CAR이 또한 TCR-유사 CAR로 지칭될 수 있다.
“주조직 적합성 복합체” (MHC)는 다형성 펩타이드 결합 부위 또는 결합 고랑(groove)를 포함하는 단백질, 일반적으로 당단백질을 지칭하며, 이는 일부 경우에, 폴리펩타이드의 세포 기구에 의해 처리된 펩타이드 항원을 포함하여 폴리펩타이드의 펩타이드 항원과 복합체를 형성할 수 있다. 일부 경우에, MHC 분자는, TCR 또는 TCR-유사 항체와 같은 T 세포 상의 항원 수용체에 의해 인식될 수 있는 입체 구조로 항원을 제시하기 위해 펩타이드와의 복합체를 비롯하여, 즉 MHC-펩타이드 복합체로서, 세포 표면상에 표시 또는 발현될 수 있다. 일반적으로, MHC 클래스 I 분자는, 일부 경우에는 3개의 α 도메인과 함께, 막 관통 α 사슬, 및 비-공유 연결된 β마이크로글로불린을 가지는 이종이합체(heterodimer)이다. 일반적으로, MHC 클래스 II 분자는 2가지 막횡단 당단백질, α 및 β로 구성되며, 둘 모두는 일반적으로 막에 걸쳐있다. MHC 분자는 항원 결합 부위 또는 펩타이드에 결합하기 위한 부위를 포함하는 효과적인 MHC 부분 및 적절한 항원 수용체에 의한 인식에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 분자는 세포기질로부터 유래하는 펩타이드를 세포 표면으로 전달하며, MHC-펩타이드 복합체는 일반적으로 CD8+ T 세포이지만, 일부 경우에 CD4+ T 세포와 같은 T 세포에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템에서 유래하는 펩타이드를 세포 표면으로 전달하며, 일반적으로 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. 일반적으로, MHC 분자는 연결된 유전자좌의 그룹에 의해 인코딩되며, 이는 마우스에서 집합적으로 H-2로 지칭되고, 인간에서는 인간 백혈구 항원 (HLA)으로 지칭된다. 따라서, 일반적으로 인간 MHC는 또한 인간 백혈구 항원 (HLA)로서 지칭될 수 있다.
용어 “펩타이드 복합체” 또는 “펩타이드-MHC 복합체” 또는 이의 변이체는, 일반적으로, MHC 분자의 결합 고랑 또는 틈(cleft)에서 펩타이드의 비-공유 상호작용에 의한 펩타이드 항원 및 MHC 분자의 복합체 또는 결합을 지칭한다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 세포 표면에 존재하거나 표시된다. 일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체는 항원 수용체, 예컨대TCR, TCR-유사 CAR 또는 이의 항원-결합 부분에 의해 특이적으로 인식될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리펩타이드의 펩타이드, 예컨대 펩타이드 항원 또는 에피토프는 예컨대 항원 수용체에 의한 인식을 위해 MHC 분자와 결합할 수 있다. 일반적으로, 펩타이드는 긴 생물학적 분자의 단편, 예컨대 폴리펩타이드 또는 단백질으로부터 유래하거나, 또는 이를 기초로 한다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 일반적으로 약 8 내지 약 24 개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 II 복합체에서의 인식을 위해 길이가 (약) 9 내지 22 개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 MHC 클래스 I 복합체에서의 인식을 위해 길이가 (약) 8 내지 13 개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, MHC 분자, 예컨대 MHC-펩타이드 복합체의 맥락에서 펩타이드를 인식할 때, TCR 또는 TCR-유사 CAR와 같은 항원 수용체는 T 세포 증식, 사이토카인 제조, 세포독성 T 세포 반응 또는 다른 반응과 같은 T 세포 반응을 유도하는 T 세포에 대한 활성화 신호를 제조 또는 유발한다.
일부 구현예에서, a TCR-유사 항체 또는 항원-결합 부분이 제조될 수 있다 (예컨대, US 공개 특허 US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; 및 국제 PCT 출원 WO 03/068201을 참조한다).
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 MHC-펩타이드 복합체를 함유하는 유효량의 면역원으로 숙주를 면역화시킴으로서 제조될 수 있다. 일부 경우에, MHC-펩타이드 복합체의 펩타이드는 MHC에 결합할 수 있는 항원의 에피토프, 예컨대 종양 항원, 예를 들어 범용 종양 항원, 골수종 항원 또는 하기 기재되는 다른 항원이다. 일부 구현예에서, 유효량의 면역원은 이후 면역 반응을 유발하기 위해 숙주에 투여되며, 면역원은 MHC 분자의 결합 고랑에서 펩타이드의 3차원 존재에 대한 면역 반응을 유발하기에 충분한 일정 기간 동안 이의 3차원 형태를 유지한다. 숙주로부터 수집된 혈청이 이후 MHC 분자의 결합 고랑 내 펩타이드의 3차원 존재를 인식하는 원하는 항체가 생성되었는지 결정하기 위해 분석된다. 일부 구현예에서, 생성된 항체는 이러한 항체가 MHC-펩타이드 복합체를 MHC 분자 단독, 관심의 펩타이드 단독, 및 MHC및 무관한 펩타이드의 복합체로부터 구별할 수 있는지 확인하기 위해 평가될 수 있다. 원하는 항체는 이후 단리될 수 있다.
일부 구현예에서, MHC-펩타이드 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 항체 라이브러리 디스플레이 방법, 예컨대 파지 항체 라이브러리를 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이 Fab, scFv 또는 다른 항체 형태의 파지 디스플레이 라이브러리가 생성될 수 있으며, 예를 들어, 라이브러리 구성원이 CDR 또는 CDRs의 하나 이상의 잔기에서 돌연변이화된다. 예컨대 US 공개 특허 US20020150914, US2014/0294841; 및 [Cohen CJ. et al. (2003) J Mol. 16:324-332]를 참조한다.
본 명세서에서, 용어 “항체”는 넓은 의미로 사용되고, 다클론성 및 단클론성 항체를 포함하며, 예를 들어 온전한 항체 및 기능적 (항원-결합) 항체 단편, 예를 들어 단편 항원 결합 (Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 중쇄 (VH) 영역, 단일 사슬 항체 단편, 예를 들어 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 및 단일 도메인 항체 (예컨대, sdAb, sdFv, nanobody) 단편을 포함한다. 상기 용어는 유전자 조작된 및/또는 개질된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 및 이종컨쥬게이트 항체, 다중특이성, 예를 들어, 이중특이성, 항체, 다이아바디, 트라이아바디, 및 테트라아바디, 탠덤 다이-scFv, 탠덤 tri-scFv를 포함한다. 달리 언급하지 않는 한, 용어 “항체”는 이의 기능적 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한 상기 용어는 임의의 클래스 또는 하위 클래스의 항체를 비롯하여 온전한 또는 전장 항체를 포함하며, 예를 들어 IgG 및 이의 하위 클래스, IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원-결합 단백질, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 전장 항체의 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 구현예에서, 항체의 중쇄 및 경쇄는 can be 전장 또는 항원-결합 부분 (a Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv))일 수 있다. 다른 구체예에서, 항체 중쇄 불변 영역은, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE으로부터 선택되며, 구체적으로, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 더욱 구체적으로, IgG1 (예컨대, 인간 IgG1)으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 항체 경쇄 불변 영역은, 예를 들어, 카파 또는 람다, 특히 카파로부터 선택된다.
제공된 항체 중에는 항체 단편이 있다. "항체 단편(antibody fragment)"은 온전한(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 부분을 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 가변 중쇄 (VH) 영역, 단일-사슬 항체 분자 예컨대 scFvs 및 단일-도메인 VH 단일 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 항체는 가변 중쇄 영역 및/또는 가변 경쇄 영역, 예컨대 scFvs를 포함하는 단일-사슬 항체 단편이다.
용어 “가변적 영역(variable region)”또는 “가변적 도메인(variable domain)”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 말한다. 고유 항체의 중쇄와 경쇄 (차례로 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR)과 3개의 CDR을 포함한다. (예를 들어, 문헌[ Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]를 참조한다). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크린하기 위하여 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예로써, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)를 참조한다.
단일-도메인 항체는 이 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부분이 포함된 항체 단편이다. 특정 구체예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다. 일부 구현예에서, CAR은 항원에 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 도메인, 예컨대 암 마커, 또는 표적화되는 세포 또는 질병, 예컨대 종양 세포 또는 암 세포의 세포 표면 항원, 예컨대 본 명세서에 기재된 또는 기술 분야 내 공지된 임의의 표적 항원을 포함한다.
항체 단편은 다양한 기법에 의해 제조될 수 있으며, 이러한 기법으로 온전한 항체의 단백질 분해효소 검사법, 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포에 의한 제조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체는 재조합-제조된 단편, 예컨대 자연적으로 발생하지 않는 재배열을 포함하는 단편, 예컨대 합성 링커, 예컨대, 펩타이드 링커에 의해 연결된 둘 이상의 항체 영역 또는 사슬을 가지는 단편, 및/또는 천연 존재의 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생성될 수 없는 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 scFv이다.
“인간화” 항체는, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 아미노산 잔기가 비-인간 CDR으로부터 유도되고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 아미노산 잔기가 인간 FR으로부터 유도된 항체이다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 비-인간 항체의 “인간화 형태”는 일반적으로 인간에 대한 면역원성을 감소시키면서, 모체 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하기 위한 인간화를 거친 비-인간 항체의 변형체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 인간화 항체 내 일부 FR 잔기는 비-인간 항체 (예를 들어, CDR 잔기가 유도되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환되어, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선한다.
이에 따라, 일부 구현예에서, TCR-유사 CAR를 비롯한 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다. 일부 양태에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편 및 세포 내 신호 전달 영역을 포함하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체 (TCR) 요소의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR와 같은 재조합 수용체, 예컨대 이의 항체 일부는 스페이서를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 스페이서는 면역글로불린 불변 영역 또는 변형체 또는 이의 개질된 버전의 적어도 일부, 예컨대 힌지 영역, 예컨대, IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역일 수 있거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 일부분은 인간 IgG의 것, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 것이다. 일부 양태에서, 불변 영역의 일부는 항원-인식 성분, 예컨대 scFv와 막횡단 도메인 사이의 스페이서 영역으로서 작용한다. 스페이서는 스페이서가 없는 경우와 비교하여, 항원 결합 후 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이의 것일 수 있다. 일부 예시에서, 스페이서는 길이가 약 12개의 아미노산이거나 그 이하이다. 예시적 스페이서는 적어도 약 10 내지 229개의 아미노산, 약 10 내지 200개의 아미노산, 약 10 내지 175개의 아미노산, 약 10내지 150개의 아미노산, 약 10 내지 125개의 아미노산, 약 10 내지 100개의 아미노산, 약 10 내지 75개의 아미노산, 약 10 내지 50개의 아미노산, 약 10 내지 40개의 아미노산, 약 10 내지 30개의 아미노산, 약 10 내지 20개의 아미노산 또는 약 10 내지 15개의 아미노산을 가지는 것들, 및 나열된 범위 중 임의의 종점들 사이의 임의의 정수를 포함하는 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 약 12 개 또는 그 이하의 아미노산, 약 119개 또는 그 이하의 아미노산, 또는 약 229개 또는 그 이하의 아미노산을 가진다. 예시적 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다. 예시적인 스페이서로는, 문헌 Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, 또는 국제 특허 출원 공보 WO2014031687에 기재된 스페이서를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 1에 기재된 서열을 가지며, 서열 번호 2에 기재된 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 3에 기재된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 4에 기재된 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 불변 영역 또는 일부분은 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 5에 기재된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 1, 3, 4 및 5 중 임의의 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 26-31에 기재된 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 번호 27-31, 58, 59 중 임의의 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가진다.
항원 인식 도메인은 일반적으로 하나 이상의 세포 내 신호 전달 성분, 예컨대 CAR의 경우 TCR 복합체 등의 항원 수용체 복합체 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 통한 활성화를 모방하는 신호 전달 성분에 연결된다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 항원-결합 성분 (예컨대, 항체)은 하나 이상의 멤브레인통과 도메인 및 세포 내 신호 전달 영역에 연결된다. 일부 구현예에서, 멤브레인통과 도메인은 세포 외 도메인에 융합된다. 한 구현예에서, 수용체 (예컨대, CAR)의 도메인 중 하나에 자연적으로 결합된 멤브레인통과 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막횡단 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해, 동일하거나 또는 상이하다 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 이러한 도메인이 결합하는 것을 회피하도록 선택되거나, 아미노산 치환에 의하여 변형된다.
일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 천연원 또는 합성원으로부터 유도된다. 상기 유도원이 천연인 경우, 일부 측면에 있어서 상기 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유도된다. 멤브레인통과 영역은 (즉, 적어도 멤브레인통과 영역(들)을 포함하는) T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유도된 영역을 포함한다. 택일적으로, 일부 구현예에서 막횡단 도메인은 합성인 것이다. 일부 측면에서, 합성 막횡단 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 합성 막횐단 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 결합은 링커, 스페이서 및/또는 막횡단 도메인(들)에 의한다.
세포 내 신호 전달 영역 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공동 자극 수용체와 조합하여 그러한 수용체를 통한 신호 및/또는 공동 자극 수용체만을 통한 신호를 모방하거나 이와 비슷한 것들이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예컨대 글리신 및 세린 (예컨대, 이중 글리신-세린)을 포함하는 것과 같은 길이가 2 내지 10개 사이의 아미노산인 링커가 존재하며, 이는 막횡단 도메인과 CAR의 세포질 신호 전달 도메인 사이의 결합을 형성한다.
수용체, 예를 들어, CAR는 일반적으로 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체는 T-세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬와 같은 TCR 복합체의 세포 내 요소, 예컨대 CD3 제타 사슬를 포함한다. 이에 따라, 일부 양태에서, ROR1-결합 항체는 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 멤브레인통과 도메인, CD3 세포 내 신호 전달 도메인 및/또는 기타 CD 멤브레인통과 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어, CAR은 Fc 수용체 γ CD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부분을 더 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, CAR은 CD3-제타 (CD3-ζ또는 Fc 수용체 γ및 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메라 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR의 연결 시에, CAR의 세포질 도메인 또는 세포 내 신호 전달 영역은 정상 이펙터 기능 또는 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 반응 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예를 들어, 일부 관점에서는, CAR은 T 세포의 기능, 예컨대 세포 용해 활성 또는 T-헬퍼 활성, 예컨대 사이토카인 또는 다른 인자의 분비를 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공동 자극 분자의 세포 내 신호 전달 영역의 절두된 부분은, 예컨대 이펙터 기능 신호를 전달하는 경우에 온전한 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 세포 내 도메인 또는 도메인을 포함하는 세포 내 신호전달 영역은, T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열, 일부 양태에서 또한 자연적인 상황에서 항원 수용체 결합 후 신호 형질전환을 개시하기 위해 이러한 수용체와 협력하여 작용하는 공동-수용체의 서열, 및/또는 이러한 분자의 임의의 유도체 또는 변형체, 및/또는 동일한 기능적 능력을 가지는 임의의 합성 서열을 을 포함한다.
천연 TCR의 관점에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호 전달뿐만 아니라 공동자극 신호를 요구한다. 따라서, 일부 구현예에서, 완전한 활성화를 촉진시키기 위해, 2차 또는 공-자극 신호를 발생시키는 위한 요소가 또한 CAR에 포함된다. 다른 구현예에 있어서, CAR은 공동자극 신호를 생성하기 위한 요소를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 추가적인 CAR은 동일한 세포에서 발현되며, 2차 또는 공동 자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
T 세포 활성화는 일부 양태에서 다음의 두 종류의 세포질 신호 전달 서열에 의해 매개되는 것으로 설명된다: TCR을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 서열 (1차 세포질 신호 전달 서열), 및 2차 또는 공동 자극 신호를 제공하기 위해 항원-독립적인 방식으로 작용하는 서열 (2차 세포질 신호 전달 서열). 일부 양태에서, CAR은 이러한 신호 전달 성분들 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 자극하는 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 전달 서열은 면역 수용체 타이로신-기반 활성 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호 전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호 전달 서열을 포함하는 ITAM의 예시로는 TCR 또는 CD3 제타, FcR 감마 또는 FcR beta로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포질 신호 전달 분자(들)은 세포질 신호 전달 도메인, 이의 일부분, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS와 같은 공동자극 수용체의 신호 전달 영역 및/또는 멤브레인통과 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 동일한 CAR은 신호전달 영역 및 공동자극 성분을 모두 포함한다.
일부 구현예에서, 신호전달 영역은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 공동자극 성분은 또 다른 항원을 인식하는 또 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 활성화 또는 자극 CAR, 및 공동자극 CAR을 포함하며, 모두 동일한 세포상에 발현된다 (WO2014/055668 참조).
특정 구현예에서, 세포 내 신호 전달 영역은 CD3 (예컨대, CD3- 제타) 세포 내 도메인에 연결된 CD28 멤브레인통과 도메인 및 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 영역은 CD3 제타 세포 내 도메인에 연결된, 키메라 CD28 및 CD137 (4-1BB, TNFRSF9) 공동자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의, 예컨대 2개 이상의 공동자극 도메인 및 활성화 도메인, 예컨대 1차 활성화 도메인을 세포질 부분에 포함한다. 예시적인 CAR은 CD3-제타, CD28 및 4-1BB의 세포 내 성분을 포함한다.
일부 경우, CAR은 제1, 제2 및/또는 제3 세대 CAR로 지칭된다. 일부 양태에서, 제1 세대 CAR은 항원 결합시 단독으로 CD3-사슬 유도 신호를 제공하는 것이고; 일부 양태에서, 제2 세대 CAR은 CD28 또는 CD137 등의 공동자극 수용체로부터의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 것과 같은, 신호 및 공동자극 신호를 제공하는 것이며; 일부 양태에서, 제3 세대 CAR은 일부 양태에서 상이한 공동자극 수용체의 여러 공동자극 도메인을 포함하는 것이다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 본 명세서에 기재된 항체 또는 단편을 포함하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 키메라 항원 수용체는 명세서에 기재된 항체 또는 단편 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv 또는 단일-도메인 VH 항체를 포함하고, 세포 내 도메인은 ITAM을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ사슬의 제타 사슬의 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 도메인과 세포 내 신호전달 영역 사이에 배치된 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 양태에서, 막횡단 도메인은 CD28의 막횡단 부분을 포함한다. 세포 외 도메인 및 막횡단 도메인은 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 외 도메인과 막횡단 도메인은 스페이서, 예컨대 본 명세서에 기재된 임의의 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는, 예컨대 막횡단 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인 사이에, T 세포 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 함유한다. 일부 양태에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어, 항체 단편, CD28 또는 이의 기능적 변이체의 막횡단 부분이거나 이를 함유하는 막횡단 도메인, 및 CD28의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체 및 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포 내 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 항체, 예를 들어, 항체 단편, CD28 또는 이의 기능적 변이체의 막횡단 부분이거나 이를 함유하는 막횡단 도메인, 및 4-1BB의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체 및 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유하는 세포 내 신호전달 도메인을 함유한다. 이러한 일부 구현예에서, 수용체는 인간 Ig 분자와 같은 Ig 분자의 일부분, 예를 들어 Ig 힌지, 예컨대 IgG4 힌지를 함유하는 스페이서를 더 포함하고, 예컨대 힌지-온리 (힌지-only) 스페이서이다.
일부 구현예에서, CAR과 같은 수용체의 막횡단 도메인 는 인간 CD28 또는 이의 변형체의 막횡단 도메인이고, 예컨대, 인간 CD28의 27-아미노산 막횡단 도메인 (기탁 번호: P10747.1)이거나, 또는 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 8에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 나타내는 막횡단 도메인이고; 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 일부를 포함하는 막횡단-도메인은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 (약) 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 4-1BB이다.
일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 인간 CD28 또는 이의 기능적 변형체 또는 일부의 세포 내 공동자극 신호전달 도메인, 예컨대 이의 41개의 아미노산 도메인 및/또는 천연 CD28 단백질의 186-187 위치에서 LL이 GG으로 치환된 이러한 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 서열 번호 10 또는 11에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 10 또는 11과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 영역은 4-1BB의 세포 내 공동자극 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변형체 또는 일부, 예컨대 인간 4-1BB (기탁 번호 Q07011.1)의 42-아미노산 세포질 도메인 또는 이의 기능적 변형체 또는 일부, 예컨대 서열 번호 12에 기재된 서열 또는 서열 번호 12와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 외 신호전달 영역은, 인간 CD3 사슬, 선택적으로 CD3 제타 자극 신호전달 도메인 또는 이의 기능적 변형체, 예컨대 인간 CD3ζ의 동형 3의 112 AA 세포질 도메인 (기탁 번호: P20963.2) 또는 미국 특허 7,446,190 또는 미국 특허 8,911,993에 기재된 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영여은 서열 번호 13, 14, 또는 15에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 13, 14, 또는 15와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서는 오로지 IgG의 힌지 영역만을 함유하는데, 예컨대 IgG4 또는 IgG1의 힌지 영역만, 예컨대 서열 번호 1에 기재된 힌지 온리 스페이서이다. 다른 구체예에서, 스페이서는 Ig 힌지, 예컨대, CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 상기 스페이서는 Ig 힌지인데, 예컨대, 서열 번호 3에 기재된 것과 같은 CH2 및 CH3 도메인과 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 상기 스페이서는 Ig 힌지인데, 예컨대 서열 번호 4에 기재된 것과 같은 CH3 도메인과만 연결된 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 상기 스페이서는 글리신-세린 풍부 서열 또는 유연 링커로 알려진 것과 같은 기타 유연 링커이거나 이를 포함한다.
2.키메라 자가-항체 수용체 (CAAR)
일부 구현예에서, 조작된 세포에 의해 발현된 재조합 수용체 가운데 제공된 방법, 용도, 제조 물품 및 조성물와 관련하여 사용되는 수용체는 키메라 자가항체 수용체 (CAAR)이다. 일부 구현예에서, CAAR은 자가항체에 특이적이다. 일부 구현예에서, CAAR를 발현하는 세포, 예컨대 CARR을 발현하도록 조작된 T 세포는 자가항체-발현 세포에 특이적으로 결합하고 이를 죽이는데 사용될 수 있지만, 정상 항체 발현 세포에는 사용될 수 없다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 자가면역 질병과 같은 자기-항원의 발현과 관련된 자가면역 질병을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 궁극적으로 자가항체를 생산하고 그의 세포 표면 상에 자가항체를 표시하는 B 세포를 표적화 할 수 있고, 이들 B 세포를 치료적 중재를 위한 질병-특이적 표적으로 표시할 수 있다. 일부 구현예에서, CAAR-발현 세포는 항원-특이적 키메라 자가항체 수용체를 사용하여 질병-유발 B 세포를 표적화함으로써 자가면역 질병에서 병원성 B 세포를 효율적으로 표적화하고 사멸시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 CAAR, 예컨대 미국 특허 출원 공보 2017/0051035에 개시된 임의의 수용체이다.
일부 구현예에서, CAAR은 자가항체 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포 내 신호전달 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체 (TCR) 요소의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호전달 영역은 2차 또는 공동자극 신호전달 영역 (2차 세포 내 신호전달 영역)을 포함한다.
일부 구현예에서, 자가항체 결합 도메인은 자가항원 또는 그의 단편을 포함한다. 자가항원의 선택은 표적화 될 자가항체의 유형에 달려 있다. 예를 들어, 자가항원은, 그것이 특정 질병 상태, 예컨대 자기면역 질병, 예컨대 자가항체-매개 자가면역 질병과 관련된, B 세포와 같은 표적 세포상의 자가항체를 인식하기 때문에 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 자가면역 질병은 심상성 천포창 (pemphigus vulgaris, PV)을 포함한다. 예시적인 자가항원은 데스모글레인 1 (Dsg1) 및 Dsg3을 포함한다.
3.다중-표적화
일부 구현예에서, 제공된 방법, 용도, 제조 물품 및 조성물과 관련하여 사용되는 세포는 다중 표적화 전략을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 세포는 세포 상에 다중-사슬 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하거나 또는 2가지 이상의 유전자 조작된 수용체의 발현하며, 각각은 상이한 항원의 동일한 것을 인식하고 전형적으로 각각은 상이한 세포 내 신호 전달 성분을 포함한다. 이러한 다중 표적화 전략은 예컨대, 국제 특허 출원 공보 WO 2014055668 A1 (예컨대, 오프-표적 (예컨대, 정상 세포)상에 개별적으로 존재하지만 치료하고자 하는 질환 또는 증상 세포에서만 함께 존재하는, 2개의 상이한 항원을 표적으로 하는 활성화 및 공동자극 CAR의 조합을 기술함) 및 문헌 Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013) (활성화 및 억제 CAR을 발현하는 세포들, 예컨대 활성화 CAR은 정상 또는 비-질환성 세포 및 치료될 질환 또는 증상 세포 모두에서 발현되는 하나의 항원에 결합하고, 억제 CAR은 정상 세포 또는 치료를 원하지 않는 세포상에서만 발현되는 또 다른 항원에 결합하는 것인 세포들을 기술함)에 기술되어 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 제1 수용체에 의해 인식되는 항원 (예컨대, 제1 항원)에 특이적으로 결합시, 세포에 활성화 또는 자극 신호를 유도할 수 있는 제1 유전자 조작된 항원 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR)를 발현하는 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 제2 수용체에 의하여 인식되는 제2 항원에 특이적 결합시, 면역 세포에 대한 공동자극 신호를 유도할 수 있는, 유전적으로 조작된 제2 항원 수용체 (예컨대 CAR 또는 TCR), 예컨대 키메라 공동자극 수용체를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다. 일부 구현예에서, 상기 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다.
일부 구현예에서, 상기 제1 및/또는 제2의 유전적으로 조작된 항원 수용체 (예를 들어, CAR 또는 TCR)은 세포에 활성화 신호를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포 내 신호전달 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체에 의해 유도된 활성화는 신호 전달 또는 세포에서 단백질 발현의 변화를 수반하는데, 그 결과 면역 반응의 개시, 예컨대 ITAM 인산화 및/또는 ITAM-매개 신호 전달 캐스케이드의 개시, 면역학적 시냅스의 형성 및/또는 결합된 수용체 근처에서 분자들의 클러스터링 (예컨대, CD4 또는 CD8 등), 하나 이상의 전사 인자의 활성화, 예컨대 NF-κ및/또는 AP-1, 및/또는 예컨대 사이토카인과 같은 인자들의 유전자 발현, 증식, 및/또는 생존의 유도가 일어난다.
일부 구현예에서, 상기 제1 및/또는 제2 수용체는 CD28, CD137 (4-1BB), OX40 및/또는 ICOS와 같은 공동자극 수용체의 세포 내 신호전달 도메인 또는 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 수용체는 상이한 공동자극 수용체의 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에 있어서, 상기 제1 수용체는 CD28 공동자극 신호전달 영역을 함유하고, 제2 수용체는 4-1BB 공-자극 신호전달 영역을 함유하며, 또는 그 역도 마찬가지이다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 함유하는 세포 내 신호전달 도메인 및 공동자극 수용체의 세포 내 신호전달 도메인 양자를 모두 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하고, 제2 수용체는 공동자극 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 동일한 세포에서 유도된 활성화 신호와 조합된 공동자극 신호는 면역 반응을 결과하는 것이고, 예컨대 견고하고 지속적인 면역 반응, 예컨대 유전자 발현 증가, 사이토카인 및 다른 인자의 분비, 및 T 세포 매개 된 효과자 기능, 예컨대 세포 살상이다.
일부 구현예에서, 제1 수용체만의 결합 또는 제2 수용체만의 결합은 강력한 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 측면에서, 단지 하나의 수용체가 결합된다면, 세포는 내성이 되거나 항원에 반응하지 않거나, 억제되거나, 및/또는 인자들을 증식하거나 분비하도록 유도되지 않거나 효과자 기능을 수행하지 않는다. 그러나, 일부 이러한 구현예에서, 제1 및 제2 항원을 발현하는 세포와 맞닥뜨리는 것과 같이 복수 개의 수용체가 결합될 때, 원하는 반응은 달성되는데, 예를 들어, 하나 이상의 사이토카인의 분비에 의하여 표시되는 바와 같은 완전한 면역 활성화 또는 자극, 표적 세포의 세포독성 살해와 같은 면역 효과자 기능의 증식, 지속 및/또는 수행이다.
일부 구현예에서, 두 수용체는 각각 세포에 활성화 및 억제성 신호를 유도하고, 그로써 상기 수용체 중 하나에 의한 그의 항원에 대한 결합은 상기 세포를 활성화시키거나 반응을 유도하지만, 상기 제2 억제성 수용체의 그의 항원에 대한 결합은 그 반응을 억제하거나 완충하는 신호를 유도한다. 예시로는 활성화 CAR 및 억제 CAR나 iCAR의 조합이 있다. 예를 들어, 활성화 CAR이 질병 또는 질병 상태에서 발현되지만 정상 세포 상에서도 발현되는 항원에 결합하고, 억제성 수용체가 정상 세포에서 발현되지만 질병이나 질병 상태의 세포에서는 발현되지 않는 별개의 항원에 결합하는, 그러한 전략이 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-표적화 전략은 특정 질병 또는 질병 상태와 관련된 항원이 일시적으로 (예를 들어, 유전자 조작 관련 자극시) 또는 영구적으로 비-질병 세포 상에서 발현 및/또는 조작된 세포 자체 상에서 발현되는 경우에 이용된다. 이러한 경우에, 2 개의 독립적이고 각각 특이적인 항원 수용체의 결합을 요구함으로써, 특이성, 선택성 및/또는 효능이 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 복수 개의 항원, 예를 들어, 제1 및 제2 항원은 표적화될 세포, 조직 또는 질병 또는 질병 상태에서 발현되는데, 예컨대 암 세포 상에서이다. 일부 측면에서, 상기 세포, 조직, 질병 또는 질병 상태는 다발성 골수종 또는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에서, 복수 개의 항원 중 하나 이상은 또한 일반적으로 세포 요법으로 표적화되기를 원치 않는 세포, 예컨대 정상 또는 비-질병 세포나 조직, 및/또는 조작된 세포 그 자체 상에서 발현된다. 이러한 구현예에 있어서, 세포의 반응을 달성하기 위하여 다수의 수용체의 결합을 요구함으로써, 특이성 및/또는 효능이 달성된다.
4.T 세포 수용체
일부 구현예에서, 조작된 세포, 예컨대 T 세포는 표적 폴리펩타이드, 예컨대 종양, 바이러스 또는 자가면역 단백질의 항원의 펩타이드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 이의 항원-결합 일부를 발현하는 세포가 제공된다.
일부 구현예에 있어서, "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β쇄 (각각, TCRα 및 TCRβ로도 알려짐) 또는 가변 γ및 δ쇄 (또한, 각각 TCRα 및 TCRβ로도 알려짐), 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하고, MHC 분자에 결합된 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자이다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ형태이다. 통상, αβ와 γδ형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면상에서 또는 가용성 형태로 발견된다. 일반적으로, TCR은, 일반적으로 주조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 하는 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면에서 발견된다.
달리 언급하지 않는 한, 용어 "TCR"은 완전 TCR 뿐만 아니라 그의 항원-결합 부분 또는 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, TCR은 온전한 또는 전장 TCR이고, 예컨대 αβ형태 또는 γδ형태의 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR 보다 짧지만 MHC 분자에서 결합된 특정 펩타이드에 결합하는 항원-결합 부분이고, 예컨대 MHC-펩타이드 복합체에 결합한다. 일부 경우, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부분만을 함유하지만, 여전히 상기 전장 TCR이 결합하는 MHC-펩타이드 복합체와 같은 펩타이드 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우, 항원-결합 부분은 특정 MHC-펩타이드 복합체에 결합하기 위한 결합 위치를 형성하기에 충분한, TCR의 가변 도메인, 예컨대 가변 α 사슬 및 가변 β사슬를 포함한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬들은 펩타이드, MHC 및/또는 MHC-펩타이드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR의 가변 도메인은 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하는데, 이것이 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 주로 기여한다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 또는 그들의 조합은 주어진 TCR 분자의 항원-결합 위치의 전부 또는 실질적으로 전부를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내 다양한 CDR은 일반적으로 구조 영역 (FR)에 의해 분리되는데, 이는 CDR과 비교하여 TCR 분자 중에서 일반적으로 가변성이 덜 나타난다 (예를 들어, [Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990]; [Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988] 참조; 또한 [Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003] 참조). 일부 구현예에서, CDR3이 항원 결합 또는 특이성을 책임지는 주 CDR이거나, 또는 항원 인식을 위해 및/또는 펩타이드-MHC 복합체의 가공된 펩타이드 부분과 상호 작용하기 위하여 주어진 TCR 가변 영역상의 3 개의 CDR 중에서 가장 중요하다. 일부 상황에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원 펩타이드의 N-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, 베타 사슬의 CDR1은 펩타이드의 C-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, CDR2는 MHC-펩타이드 복합체의 MHC 부분과의 상호 작용 또는 그의 인식을 책임지는 주 CDR에 가장 크게 기여하거나 그러한 CDR이다. 일부 구현예에서, β사슬의 가변 영역은 추가적인 초변이 영역을 함유할 수 있는데 (CDR4 또는 HVR4), 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초항원 (superantigen) 결합과 관련된다 (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구현예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막횡단 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 함유 할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997]를 참조한다). 일부 측면에서, TCR의 각 사슬은 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막횡단 영역 및 C-말단에서 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달을 매개하는 것과 관련된 CD3 복합체의 불변 단백질들과 관련된다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 주어진 TCR 사슬 (예컨대, α-사슬 또는 b-사슬)의 세포 외 부분은 세포 막에 인접하여 2 개의 면역글로불린-유사 도메인을 함유할 수 있는데, 예컨대 가변 도메인 (예컨대, Vα 또는 Vb; 통상 카밧 (Kabat) 번호매김에 기초하여 아미노산 1 내지 116, 문헌 [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.]) 및 불변 도메인 (예컨대, α-사슬 불변 도메인 또는 Cα, 통상 카밧 번호매김에 기초하여 사슬 중 117 내지 259 위치 또는 b 사슬 불변 도메인 또는 Cb, 통상 카밧에 기초하여 사슬 중 117 내지 295 위치)이다. 예를 들어, 일부 경우, 2 개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포 외 부분은 2 개의 막-근위 불변 도메인 및 2 개의 막-말단 가변 도메인을 포함하는데, 가변 도메인 각각은 CDR을 포함한다. TCR의 불변 도메인은, 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하여 이에 의해 TCR의 두 사슬를 연결하는 짧은 연결 서열을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 α 및 β사슬 각각에 추가의 시스테인 잔기를 가질 수 있어서, TCR은 불변 도메인에서 2 개의 이황화 결합을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서 막횡단 도메인은 양전하를 띤다. 일부 경우에는, TCR 사슬은 세포질 꼬리를 포함한다. 일부 경우, 상기 구조는 TCR이 CD3 및 그의 서브 유닛과 같은 다른 분자와 결합하는 것을 허용한다. 예를 들어, 막횡단 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포막 내의 단백질을 고정시키고 CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 불변 서브 유닛과 결합 할 수 있다. CD3 신호전달 서브 유닛 (예를 들어, CD3γ, CD3δ, CDε 및 CD3ζ사슬)의 세포 내 꼬리는 TCR 복합체의 신호전달 능력에 관계된 하나 이상의 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프 또는 ITAM을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR은 2 개의 사슬 α 및 β(또는 선택적으로, γ및 δ의 이종이합체이거나 단일 사슬 TCR 작제물일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해 연결된 2 개의 분리 된 사슬 (α 및 β사슬 또는 γ및 δ사슬)를 함유하는 이종이합체이다.
일부 구현예에서, TCR은 Vα, β사슬의 서열과 같은 공지된 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있는데, 이들에 대하여 실질적으로 전장 코딩 서열이 용이하게 이용 가능하다. 세포 공급원으로부터 V 사슬 서열을 포함하는 전장 TCR 서열을 얻는 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR을 인코딩하는 핵산은 다양한 원으로부터 얻어질 수 있는데, 예컨대 주어진 세포 또는 세포들 내에서 또는 그로부터 분리된 TCR-인코딩 핵산의 중합 효소 연사슬 반응 (PCR) 증폭에 의하여 또는 공개적으로 입수 가능한 TCR DAN 서열을 합성함에 의하여 얻어질 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 생물학적 원으로부터 얻어지는데, 예컨대 세포로부터, 예컨대 T 세포 (예를 들어, 세포 독성 T 세포), T 세포 하이브리도마 또는 다른 공개적으로 입수 가능한 원으로부터 얻어진다. 일부 구현예에서, T 세포는 생체 내 분리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 흉선학적으로 (thymically) 선택된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 신에피토프-제한 (neoepitope-restricted) TCR이다. 일부 구현예에서, T-세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원-결합 부분 또는 이의 항원-결합 단편은 TCR의 서열의 지식으로부터 합성으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 표적 폴리펩타이드 항원 또는 그의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR 라이브러리의 스크리닝하는 것으로부터 선택되거나 또는 동정된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 다른 림프 기관에 존재하는 세포를 포함하여 대상체로부터 분리된 T 세포로부터 Vα 및 Vβ레파토리를 증폭함으로써 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양-침윤 림프구 (TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 건강한 대상체의 정상 T 세포원, 즉 정상 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 질병이 있는 대상체의 T 세포원, 즉 질병이 있는 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 축퇴 (degenerate) 프라이머는 인간으로부터 수득된 T 세포와 같은 샘플에서 예컨대 RT-PCR에 의하여 Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, scTv 라이브러리는 증폭된 산물이 클로닝되거나 어셈블리 되어 링커에 의해 분리되는 나이브 Vα 및 Vβ라이브러리로부터 어셈블리 될 수 있다. 대상체 및 세포의 공급원에 따라 라이브러리는 HLA 대립형질-특이적일 수 있다. 택일적으로, 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 모체 또는 스캐폴드 TCR 분자의 돌연변이화 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 양태에서, TCR은 예를 들어 α 또는 β사슬의 돌연변이화에 의하여 설명서된 진화 (directed evolution)의 대상이 된다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 내의 특정 잔기가 변경된다. 일부 구현예에서, 선택된 TCR은 친화적 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는, 예컨대 펩타이드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위한 스크리닝에 의하여 선택될 수 있다. 일부 측면에서, TCR, 예를 들어 항원-특이적 T 세포 상에서 존재하는 TCR은, 예컨대 결합 활성에 의하여, 예컨대 상기 항원에 대한 특정 친화도 또는 결합력 (avidity)에 의하여 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분은 변형되거나 조작된 것이다. 일부 구현예에서, 설명서된 진화 방법이 이용되어, 특정 MHC-펩타이드 복합체에 대한 보다 높은 친화성을 갖는 것과 같은 변화된 특성을 갖는 TCR을 생성시킨다. 일부 구현예에서, 설명서된 진화는 디스플레이 방법, 예컨대 비한정적인 예로서 효모 디스플레이 (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이 (Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) 또는 T 세포 디스플레이 (Chervin et al. (2008) J Immunol 방법, 339, 175-84)에 의하여 달성된다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근법은 공지된, 모체 또는 레퍼런스 TCR을 조작하는것 또는 변형하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에, 야생형 TCR은, 그 TCR에서 CDR의 하나 이상의 잔기가 돌연변이되는 돌연변이화된 TCR을 생성하기 위한 주형으로서 사용될 수 있고, 원하는 변경된 성질을 갖는 돌연변이체, 예를 들어 원하는 표적 항원에 대한 더 높은 친화도의 돌연변이체가 선택된다.
일부 구현예에서, 대상 TCR을 생산하거나 생성시키는 데 사용하기 위한 표적 폴리펩타이드의 펩타이드는 공지되어 있거나 당업자에 의하여 쉽게 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 항원-결합 부분을 생성시키는 데 사용하기에 적합한 펩타이드는 대상 표적 폴리펩타이드, 예를 들어 하기 기술되는 표적 폴리펩타이드에서 HLA-제한 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 이용가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 식별된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 결합 위치를 예측하기 위한 모델로서, ProPred1 (Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237), 및 SYFPEITHI (문헌 [Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007] 참조)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, MHC-제한된 에피토프는 HLA-A0201인데, 이는 전체 코카시언의 대략 39-46%에서 발현되며, 따라서 TCR 또는 기타 MHC-펩타이드 결합 분자를 제조하는데 사용하기 위한 MHC 항원의 적절한 선택을 대표한다.
컴퓨터 예측 모델을 이용하여 HLA-A0201-결합 모티프 및 프로테아좀 및 면역-프로테아좀의 절단 위치가 사용될 수 있다. MHC 클래스 I 결합 위치를 예측하기 위한 그러한 모델은 ProPred1 (문헌 [Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001]에 보다 자세히 기술됨), 및 SYFPEITHI (문헌 [Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics 방법 in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007] 참조)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은 하나 이상의 특성이 변경된, 재조합적으로 생산된 천연 단백질 또는 그들의 돌연변이된 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유 동물과 같은 다양한 동물 종 중 하나로부터 유래될 수 있다. TCR은 세포-결합된 것 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공되는 방법의 목적상, TCR은 세포 표면 상에 발현된 세포-결합된 형태이다.
일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 항원-결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 이합체 TCR (dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일-사슬 TCR (sc-TCR)이다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR은 WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186에 기재된 바와 같은 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, TCR은 막횡단 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3과 함께 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는 임의의 TCR은 T 세포의 표면 상에 활성 TCR을 생성하는 신호전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포 표면에서 발현된다.
일부 구현예에서, dTCR은, TCR α 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포 외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제1 폴리펩타이드, 및 TCR β사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR β사슬 분변 영역 세포 외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제2 폴리펩타이드를 함유하는데, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 이황화 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 결합은 본래의 이합체 αβTCR에 존재하는 본래의 내부-사슬 이황화 결합에 해당할 수 있다. 일부 구현예에서, 사슬간 이황화 결합은 천연 TCR에는 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, dTCR 폴리펩타이드 쌍의 불변 영역 세포 외 서열에 하나 이상의 시스테인이 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합이 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 결착하기 위해 막횡단 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은, 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 상기 불변 α 도메인의 C-말단에 부착된 제1 이합체화 모티프를 함유하는 TCR α 사슬, 및 가변 β도메인, 불변 β도메인 및 상기 불변 β도메인의 C-말단에 부착된 제2 이합체화 모티프를 포함하는 TCR β사슬를 함유하고, 상기 제1 및 제2 이합체화 모티프는 쉽게 상호 작용하여 상기 제1 이합체화 모티프의 아미노산과 상기 제2 이합체화 모티프의 아미노산 간 공유 결합을 형성하여, TCR α 사슬와 TCR β사슬를 함께 연결한다.
일부 구현예에서, TCR은 scTCR이다. 통상, scTCR은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992)]; [Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994)]; [Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993)]; 국제 공개 PCT Nos. WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; 및 [Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996)] 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 도입된 비-천연 (non-naive) 이황화 사슬간 결합을 함유하여 TCR 사슬들의 결합을 촉진시킨다 (예를 들어, 국제 공개 PCT WO 03/020763 참조). 일부 구현예에서, scTCR은, 그의 C-말단에 융합된 이종의 류신 지퍼가 사슬 결합을 용이하게 하는 비-이황화 결합된 절단된 TCR이다 (예를 들어, 국제 공개 PCT WO 99/60120 참조). 일부 구현예에서, scTCR은 펩타이드 링커를 통해 TCRβ가변 도메인에 공유 결합된 TCRα 가변 도메인을 함유한다 (국제 공개 PCT No. WO99/18129 참조).
일부 구현예에서, scTCR은, TCR α 사슬 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열로 구성되는 제1 분절, TCR β사슬 불변 도메인 세포 외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β사슬 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열로 구성되는 제2 분절, 및 상기 제1 분절의 C 말단을 상기 제2 분절의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scTCR은, α 사슬 세포 외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성되는 제1 분절, 및 β사슬 세포 외 불변 서열의 N 말단에 융합된 β사슬 가변 영역 서열 및 막횡단 서열로 구성되는 제2 분절, 및, 필요에 따라 상기 제1 분절의 C 말단을 상기 제2 분절의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scTCR은, β사슬 세포 외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCR β사슬 가변 영역 서열로 구성되는 제1 분절, 및 α 사슬 세포 외 불변 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열 및 막횡단 서열로 구성되는 제2 분절, 및, 필요에 따라 상기 제1 분절의 C 말단을 상기 제2 분절의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 분절을 연결시키는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩타이드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커 서열은 예를 들어 식 -P-AA-P-를 가질 수 있는데, 여기서 P는 프롤린이고 AA는 그 아미노산이 글리신 및 세린 인 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 분절은 그들의 가변 영역 서열이 그러한 결합을 위해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서 일부 경우에, 상기 링커는 상기 제1 분절의 C 말단과 상기 제2 분절의 N 말단 간의 거리를 아우르는 충분한 길이를 가지거나 그 역도 마찬가지이지만, scTCR의 그 표적 리간드로의 결합을 차단하거나 감소시킬 만큼 너무 길지는 않다. 일부 구현예에서,상기 링커는 10 내지 45 개 아미노산, 예컨대 10 내지 30 개 아미노산, 또는 26 내지 41 개 아미노산 잔기, 예컨대 29, 30, 31 또는 32 개의 아미노산, 또는 약 그 정도의 아미노산을 함유 할 수있다. 일부 구현예에서, 상기 링커는 식 -PGGG-(SGGGG)5-P-를 갖는데, 여기서 P는 프롤린, G는 글리신 및 S는 세린이다 (서열 번호 23). 일부 구현예에서, 상기 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS (서열 번호 24)을 갖는다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를, β사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 연결하는 공유 이황화 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR에서 사슬간 (interchain) 이황화 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, scTCR 폴리펩타이드의 제1 및 제2 분절의 불변 영역 세포 외 서열 내로 하나 이상의 시스테인이 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합 양자 모두가 바람직할 수 있다.
도입된 사슬간 이황화 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 구현예에서, 천연의 이황화 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 천연의 사슬간 이황화 결합을 형성하는 하나 이상의 천연 시스테인은 세린 또는 알라닌과 같은 다른 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 도입된 이황화 결합은 상기 제1 및 제2 분절 상의 비-시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이 시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비-천연 이황화 결합은 국제 공개 PCT 번호 WO2006/000830에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 이의 항원-결합 단편은, 10-5 내지 10-12 M과 그 안의 모든 개별 값 및 범위 또는 약 그 정도의 표적 항원에 대한 평형 결합 상수를 갖는 친화도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 MHC-펩타이드 복합체 또는 리간드이다.
일부 구현예에서, α 사슬 및 β사슬와 같은 TCR을 인코딩하는 핵산 또는 핵산들은 PCR, 클로닝 또는 다른 적절한 수단에 의해 증폭될 수 있고, 적합한 발현 벡터 또는 벡터들 내에 클로닝 될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적합한 숙주를 형질 전환 또는 형질 감염 시키는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 전파 및 증식을 위해 또는 발현을 위해, 또는 양자 모두를 위해 설계된 것들을 포함하며, 예컨대 플라스미드 및 바이러스이다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC 시리즈 (Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라호야 소재), pET 시리즈 (Novagen, 미국 위스콘신주 매디슨 소재), pGEX 시리즈 (Pharmacia Biotech, 스웨덴 웁살라 소재), 또는 pEX 시리즈 (Clontech, 미국 캘리포니아주 팔로앨토 소재)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에서, 박테리오파지 벡터, 예컨대 λλλ(Stratagene), λ및 λ가 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 이는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19 (Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo (Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터가 사용된다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는, 벡터가 DNA- 또는 RNA-기반인지를 고려하여, 적절한 경우, 벡터가 도입될 숙주의 유형 (예를 들어, 박테리아, 균류, 식물 또는 동물)에 특이적인 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 TCR 또는 항원-결합 부분 (또는 기타 MHC-펩타이드 결합 분자)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴 말단 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 다른 공지된 프로모터도 또한 고려된다.
일부 구현예에서, TCR을 인코딩하는 벡터를 생성하기 위해, 대상 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 단리된 전체 cDNA로부터 α 및 β사슬를 PCR 증폭하고 발현 벡터에 클로닝한다. 일부 구현예에서, α 및 β사슬은 동일한 벡터 내로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β사슬은 상이한 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, 생성된 α 및 β사슬은 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터 내로 혼입된다.
B.핵산 및 벡터
또한 재조합 수용체를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, 핵산 분자), 이러한 수용체를 발현하는 유전적 조작 세포를 위한 벡터 및 조작된 세포의 제조 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 양태에서, 재조합 수용체는 T 세포 수용체 (TCR), 예컨대, 형질전환 TCR이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 경우에, 재조합 수용체, 예컨대, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 핵산 서열은 신호 펩타이드를 인코딩하는 신호 서열을 포함한다. 신호 펩타이드의 비-제한적 예시적인 예로는, 예를 들어, 서열 번호 26에 기재되며 서열 번호 25에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 GMCSFR 알파 사슬 신호 펩타이드, 또는 서열 번호 18에 기재된 CD8 알파 신호 펩타이드를 포함한다.
핵산 분자가 둘 이상의 상이한 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 특정한 경우에는, 폴리펩타이드 사슬 각각이 별개의 핵산 분자에 의해 인코딩될 수 있다. 예를 들어, 두 가지의 별개의 핵산이 제공되며, 각각은 세포 내 발현을 위해 세포로 개별적으로 전달 또는 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드가 제1 및 제2 핵산 서열을 포함하는 것과 같이, 상이한 폴리펩타이드 사슬 각각을 인코딩하는 코딩 서열은 프로모터에 의해 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 이러한 프로모터는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 둘 이상의 상이한 폴리펩타이드 사슬의 발현을 유도하는 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 핵산 분자는 다중시스트론 (이중 시스트론 또는 삼중시스트론, 예컨대, 미국 특허 6,060,273 참조)일 수 있다. 일부 구현예에서, 전사 단위는 단일 프로모터로부터의 메세지에 의해 유전자 산물이 공동발현하게 하는 IRES (내부 리보솜 진입 부위)를 포함하는 이중시스트론 단위로서 조작될 수 있다. 택일적으로, 일부 경우에, 단일 프로모터는, 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)에서, 자가-절단 펩타이드 (예컨대, 2A 서열) 또는 프로테아제 인식 부위 (예컨대, 퓨린)을 코딩하는 서열에 의해 서로 분리된 2개 또는 3개의 유전자를 포함하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다. 이에 따라 ORF는 단일 폴리펩타이드를 인코딩하는데, 이는 번역 중에 (2A의 경우) 또는 번역 이후, 개별 단백질 내로 처리된다. 일부 경우에, T2A와 같은 펩타이드는 리보좀으로 하여금 2A 요소의 C-말단에서 펩타이드 결합의 건너뛰기 (리보좀 스킵핑)를 일으켜, 2A 서열의 말단과 다음 펩타이드 하류 사이의 분리를 유도할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004)] 및 [de Felipe et al.Traffic 5:616-626 (2004)] 참조). 다양한 2A 요소가 알려져 있다. 본 발명에 개시되는 방법 및 시스템에 사용될 수 있는 2A 서열의 예시는, 제한없이, 미국 특허 공개 번호 20070116690에 기재된 것과 같은 구제역 바이러스 (F2A, 예를 들어, 서열 번호 22), 마(馬) 비염 A 바이러스 (equine rhinitis A virus)(E2A, 예컨대 서열 번호 21), 토시아 어시그나 바이러스 (Thosea asigna virus)(T2A, 예컨대 서열 번호 6 또는 17) 및 돼지 테스코 바이러스-1 (P2A, 예를 들어 서열 번호 19 또는 20) 이다.
일부 구현예에서, 외인성 마커 유전자가 조작된 세포 요법과 관련하여 이용되어 세포의 검출 또는 선택을 가능케 하고, 일부 경우에 또한 세포의 자살을 촉진할 수 있다. 예시적인 대리 마커는 세포 표면 폴리펩타이드의 절두된 형태, 예컨대 비-기능적이며, 신호 또는 세포 표면 폴리펩타이드의 전장 형태에 의해 통상적으로 형질도입되는 신호를 형질전환하지 않거나 또는 형질전환할 수 없고, 및/또는 내재화하지 않거나 내재화가 불가능한 절두된 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 절두된 세포 표면 폴리펩타이드로는 성장 인자 또는 다른 수용체의 절두된 형태, 예컨대 절두된 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (tHER2), 절두된 상피 성장 인자 수용체 (tEGFR, 서열 번호 7 또는 16에 기재된 예시적인 tEGFR 서열) 또는 전립선-특이적 막항원 (PSMA) 또는 이의 개질된 형태를 포함한다. tEGFR은 항체 세툭시맙 (Erbitux®또는 다른 치료용 항-EGFL 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 포함할 수 있는데, 이는 tEGFR 작제물 및 인코딩된 외인성 단백질, 예를 들어 키메라 항원 수용체 (CAR)로 조작된 세포를 동정하거나 선택, 및/또는 인코딩된 외인성 단백질을 발현하는 세포를 제거하거나 분리시키는데 사용될 수 있다. 미국 특허 8,802,374 및 [Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434]를 참조한다. 일부 양태에서, 마커, 예컨대 대리 마커로는, 전체 또는 일부 (예컨대, 절두된 형태)의 CD34, NGFR, CD19 또는 절두된 CD19, 예컨대, 절두된 비-인간 CD19, 또는 상피 성장 인자 수용체 (예컨대, tEGFR)를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP), 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP), 예컨대 슈퍼-폴드 GFP (sfGFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질 (CFP), 청록색 형광 단백질 (BFP), 강화된 청색 형광 단백질 (EBFP), 및 황색 형광 단백질 (YFP), 및 이의 변형체, 예를 들어 종 변형체, 단량체 변형체, 및 이러한 형광 단백질의 코돈-최적화 및/또는 향상된 변형체이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 효소, 예컨대 루시퍼라제, E. coli의 lacZ 유전자, 알칼리성 포스파타제, 분비된 배아 알칼리성 포스파타제 (SEAP), 클로람페니콜 아세틸렌 트랜스퍼라제 (CAT)이거나, 또는 이를 포함한다. 예시적인 발광 리포터 유전자로는 루시퍼라제 (luc), β갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT), β글루쿠로니다제 (GUS) 또는 이의 변형체를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 선별 마커이다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 외인성 시제 또는 약물에 내성을 부여하는 폴리펩타이드이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 포유동물 세포에 항생제 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 퓨로마이신(Puromycin) 내성 유전자, 하이그로마이신(Hygromycin) 내성 유전자, 블라스티딘(Blasticidin) 내성 유전자, 네오마이신(Neomycin) 내성 유전자, 제네티신(Geneticin) 내성 유전자 또는 제오신(Zeocin) 내성 유전자 또는 이의 개질된 형태이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커를 인코딩하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열, 예컨대 T2A와 같은 링커 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된다. 예를 들어, 마커, 및 선택적으로 링커 서열은, 국제 공개 특허 WO2014031687에 기재된 임의의 마커일 수 있다. 예를 들어, 상기 마커는 필요에 따라 T2A 절단 가능 링커 서열과 같은 링커 서열에 연결된, 절단된 EGFR (tEGFR)일 수 있다. 절단형 EGFR (예를 들어 tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩타이드는 서열 번호 7 또는 16에 기재된 tEGFR 서열, 또는 서열 번호 7 또는 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예시에서, 절단된 표피 성장 인자 수용체 (EGFRt), 예컨대 서열 번호 7 또는 16에 기재된 수용체, 일부 경우에 형질도입된 세포에서 대상 전이유전자 (CAR 또는 TCR)와 함께 공동-발현될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 8,802,374 참조). EGFRt는 항체 세툭시맙 (Erbitux®또는 다른 치료용 항-EGFL 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 포함할 수 있는데, 이는 EGFRt 작제물 및 다른 재조합 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체 (CAR)로 조작된 세포를 동정하거나 선택, 및/또는 상기 수용체를 발현하는 세포를 제거하거나 분리시키는데 사용될 수 있다. 미국 특허 8,802,374 및 [Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434]를 참조한다.
또한 이러한 핵산 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 작제물이 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터 또는 작제물은 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 프로모터를 포함하여, 이의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 하나 또는 하나 이상의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된다. 이에 따라, 또한 본 명세서에 제공되는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것과 같은 벡터가 제공된다.
일부 경우에, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다. 또한 이러한 벡터 또는 벡터의 조합을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터의 세트 또는 조합이 세포 조작을 위해 함께 사용된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 벡터의 세트는 조작을 위한 세포내로 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로 도입된다.
일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 비-바이러스 벡터 또는 트랜스포존, 예컨대 슬리핑 뷰티 트랜스포존 시스템, 유인원 바이러스 40 (SV40)로부터 유래된 벡터, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 derived from the 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (MoMLV), 골수증식 육종 바이러스 (MPSV), 쥐과 배아 줄기 세포 바이러스 (MESV), 쥐가 줄기 세포 바이러스 (MSCV), 비장 병소 형성 바이러스 (SFFV) 또는 아데노-연관 바이러스 (AAV)를 포함한다.
C.유전적 조작을 위한 벡터 및 방법
유전자 조작된 성분, 예컨대, 재조합 수용체, 예컨대, CAR 또는 TCR의 도입을 위한 다양한 방법이 공지되어 있다. 예시적인 방법은 상기 수용체를 인코딩하는 핵산을 전달하기 위한 것들을 포함하는데, 예컨대 바이러스를 통하여, 예컨대 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 통하여, 형질 도입, 트랜스포존 및 전기천공을 통하여 등이다. 일부 구현예에서, 표면 글리칸 발현은 유전자 조작 공정 이전, 동안 또는 직후에 수집된 세포의 조성물에서 평가된다. 일부 구현예에서, 표면 글리칸 발현은 유전자 조작된 성분을 도입하기 위해 공정의 상응하는 단계에서 세포의 조성물 사이에서 평가 및 비교된다. 일부 구현예에서, 조성물은 동일한 재조합 수용체를 발현하지만, 유전 물질을 도입하는 상이한 방법에 의해 조작되거나, 또는 조작된 바가 있다.
일부 구현예에서, 유전자 전달은 우선 세포를 자극시킴으로써, 예컨대, 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정되는 바 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 세포를 조합시킨 후, 활성화된 세포를 형질도입시키고, 임상 적용에 충분한 수로 배양 증식시킴으로써 달성된다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은, 예를 들어 유인원 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV)로부터 유래한 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여, 세포 내로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포로 전달된다 (예를 들어, Koste et al. Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25 (2014); Carlens et al. Exp Hematol 28(10): 1137-46 (2000); Alonso-Camino et al. Mol Ther Nucl Acids 2, e93 (2013); Park et al., Trends Biotechnol., November 29(11): 550-557 2011 참조). 일부 구현예에서, 바이러스는 아데노-연관 바이러스 (AAV)이다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (MoMLV), 골수 증식 육종 바이러스 (MPSV), 쥐과 배아 줄기 세포 바이러스 (MESV), 쥐과 줄기 세포 바이러스 (MSCV), 비장 병소 형성 바이러스 (SFFV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터와 같은 긴 말단 반복 서열 (LTR)을 가진다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 뮤린 레트로바이러스로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유래한 것을 포함한다. 레트로바이러스는 전형적으로 양친매성이며, 이는 인간을 비롯한 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 한 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 구체적인 레트로바이러스 시스템은 기술되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; 문헌 [Miller and Rosman, BioTechniques, 7:980-990 (1989); Miller, A. D. Human Gene Therapy 1:5-14 (1990); Scarpa et al. Virology 180:849-852 (1991); Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:8033-8037 (1993); 및 Boris-Lawrie and Temin Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 (1993)] 참조).
렌티바이러스 형질 도입 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은, 예를 들어, 문헌 [Wang et al. J. Immunother. 35(9): 689-701 (2012); Cooper et al. Blood. 101:1637-1644 (2003); Verhoeyen et al. Methods Mol Biol. 506: 97-114 (2009); and Cavalieri et al. Blood. 102(2): 497-505 (2003)]에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 일렉트로포레이션을 통해 T 세포에 전달된다 (예를 들어, 문헌 [Chicaybam et al, PLoS ONE 8(3): e60298 (2013) 및 Van Tedeloo et al. Gene Therapy 7(16): 1431-1437 (2000)] 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위를 통해 T 세포에 전달된다 (예를 들어, 문헌 [Manuri et al. Hum Gene Ther 21(4): 427-437 (2010); Sharma et al. Molec Ther Nucl Acids 2, e74 (2013); 및 Huang et al. Methods Mol Biol 506: 115-126 (2009)] 참조). 면역 세포에서 유전 물질을 도입하고 발현시키는 기타 방법들은 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 (예컨대, 문헌 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 기재된 트렌스펙션), 원형질 융합, 양이온성 리포좀 매개 트랜스펙션; 텅스텐 입자-촉진 미세 입자 충격 (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공동 침전 (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다.
재조합 산물을 인코딩하는 핵산의 전달을 위한 기타 접근법 및 벡터는, 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO2014055668, 및 미국 특허 7,446,190에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예컨대 T 세포는 팽창 도중 또는 팽창 후에 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)로 트랜스펙션될 수 있다. 원하는 수용체 유전자의 도입을 위한 이러한 트랜스펙션은, 예컨대 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 유전자 조작된 세포 집단은 초기 자극 (예컨대, CD3/CD28 자극)으로부터 유리된 후, 이어서 제2 유형의 자극, 예컨대 새로 (de novo) 도입된 수용체를 통한 자극으로 자극될 수 있다. 이러한 제2 유형의 자극은 펩타이드/MHC 분자, 유전적으로 도입된 수용체의 동족 (교차 결합) 리간드 (예컨대, CAR의 천연 리간드) 또는 새로운 수용체의 골격 내에서 (예컨대, 수용체 내의 불변 영역을 인식함으로써) 직접 결합하는 임의의 리간드 (예컨대, 항체) 형태의 항원 자극을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cheadle et al, Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66; 또는 Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)]를 참조한다.
일부 경우에서, 세포, 예컨대 T 세포가 활성화될 것을 필요로 하지 않는 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 일부 경우에서, 세포는 활성화 전에 선택 및/또는 형질 도입될 수 있다. 이에 따라, 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포의 배양 단계에 선행하여, 또는 배양 단계 후에, 경우에 따라 배양 단계와 동시에 또는 배양 단계의 적어도 일부 기간 동안에 조작될 수 있다.
일부 양태에서, 세포는 사이토카인 또는 기타 인자의 발현을 촉진하도록 추가로 조작된다. 추가적인 핵산, 예컨대 도입 유전자 중에는 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진시킴으로써 치료의 효능을 개선시키는 것; 생체 내 생존 또는 국소화를 평가하는 것과 같은 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 마커를 제공하는 유전자; 문헌 [Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기재된 바와 같이 세포가 생체 내 음성 선별에 민감성을 갖도록 함으로써 안정성을 개선시키는 유전자가 있으며, 예컨대 우성 양성 선택 마커와 음성 선별 마커를 융합시킴으로써 유래된 이작용성 선택 융합 유전자의 용도를 기술하고 있는 Lupton 등의 공보 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601도 참조한다. 예를 들어, Riddell et al의 미국 특허 6,040,177 중 14-17 열을 참조한다.
D.산출 조성물의 특징
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 방법은 유전자 조작된 세포를 포함하는 세포의 조성물, 예컨대, 산출 조성물을 제조 또는 생성한다. 특정 구체예에서, 산출 조성물은 유전적 조작 세포를 위한 일부 또는 전체 단계로부터 생성된 세포 조성물이다. 특정 구체예에서, 산출 조성물은 투입 세포 조성물의 유전적 조작 세포의 공정으로부터 생성된다. 특정 구체예에서, 공정은 세포, 예컨대 투입 세포 조성물로부터 획득된 세포를 활성화, 형질도입 또는 형질감염, 팽창, 및/또는 수확하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 산출 세포 조성물은 유전자 조작된 세포를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 산출 조성물의 세포는 유전자 조작 공정의 모든 단계를 거친다.
일부 구현예에서, 산출 조성물은 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하여, 이러한 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 생성물을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종성이며, 즉 통상적으로 세포 또는 세포로부터 수득한 샘플, 예컨대 조작된 세포 및/또는 그러한 세포가 유래된 유기체에서 일반적으로 발견되지 않는 기타 유기체 또는 세포로부터 수득한 샘플에 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 자연적으로 발생하지 않으며, 예컨대 자연에서 발견되지 않는 핵산은 여러 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 인코딩하는 핵산의 키메라 조합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 산출 조성물은 유전자 조작된 세포를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 산출 세포 조성물은 조작된 T 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 조작된 T 세포는 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 산출 조성물은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% , 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100% 조작된 T 세포를 함유 또는 포함한다. 특정 구체예에서, 조작된 세포는 재조합 수용체를 발현한다. 구체적인 구현예에서, 산출 조성물은 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% , 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 함유 또는 포함한다 일부 구현예에서, 재조합 수용체는 TCR 또는 CAR이다. 구체적인 구현예에서, 재조합 수용체는 CAR이다.
III.조성물 및 제제
본 명세서에 기재된 인큐베이션 (예컨대, 자극) 방법에 따라 제조된 세포를 포함하는 조성물 또는 제제가 본 명세서에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 세포 집단의 적어도 일부, 예컨대 세포 집단으로부터의 비-나이브-유사 T 세포를 제거하도록 사용될 수 있다. 또한, 원하지 않는 세포를 더 이상 포함하지 않거나, 또는 자극된 조성물 내에 원하지 않는 세포, 예컨대 비-나이브 유사 T 세포로부터 유도된 세포의 수가 현저하게 감소된 세포 집단을 포함하는 조성물 및 이의 용도가 제공된다. 본 명세서에 제공된 조성물 및 방법은 또한 치료에 사용하기 위해 원하지 않는 서브집단에 대해 제거된 세포 집단을 선별적으로 팽창하도록 사용된다. 또한 본 명세서에 기재된 임의의 T 세포 자극 방법에 의해 제조된 산출 또는 농축된, 자극된 조성물이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 인큐베이션 (예컨대, 자극) 방법을 사용하여 제조된 세포, 예컨대 재조합 수용체 (예컨대, CAR-T 세포)로 유전자 조작된 세포가 약제학적 조성물 및 제제를 포함하는 조성물, 예컨대 주어진 복용량 또는 이의 분획을 투여하기 위한 다수의 세포를 포함하는 단위 용량 형태 조성물로서 제공된다. 약제학적 조성물 및 제제는 일반적으로 하나 이상의 선택적인 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 조성물은 세포 요법의 목적을 위해 생성 또는 제조된다. 일부 구현예에서, 세포 조성물은 약제학적 조성물 또는 제제이다. 이러한 조성물은 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 질병, 병태, 및 장애의 예방 또는 치료에서, 또는 검출, 진단, 및 예후 방법에서 사용하기 위한 방출을 평가하도록 사용될 수 있다.
용어 “약제학적 제제(pharmaceutical formulation)”이란 이러한 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 조제물을 지칭하며, 제제가 투여되는 대상에게 수용 불가능한 독성을 주는 추가 성분은 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 방법은 동일한 조작된 세포로 구성되지만, 상이한 약제학적 제제를 가지는 세포 조성물의 표면 글리칸 발현을 비교하도록 사용될 수 있다.
“약제학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)”란, 대상에게 비독성이며, 활성 성분 이외의 약학 제제에 포함된 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 방법은 동일한 조작된 세포로 구성되지만, 상이한 약제학적으로 허용되는 담체를 가지는 세포 조성물의 표면 글리칸 발현을 비교하도록 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포 요법, 예컨대 조작된 T 세포 (예컨대, CAR T 세포)는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화된다. 일부 양태에서, 담체의 선택은 부분적으로 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제로는, 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 총 조성물 중량의 약 0.0001% 내지 약 2%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용된 복용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 포스페이트, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량의 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린 등의 단백질; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨 등의 슈가; 나트륨 등의 염-형성 반대 이온; 금속 복합체 (예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등의 비이온성 계면 활성제.
일부 양태에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제로는 예를 들어, 시트르산, 시트르산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 기타 산 및 염을 포함한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 전체 조성물 중량의 약 0.001% 내지 약 4%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약제학적 조성물의 제조 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은 예컨대, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 더욱 상세히 기재되어 있다.
이러한 제제는 수용액을 포함할 수 있다. 제제 또는 조성물은 또한 세포로 예방 또는 치료되는 특정 징후, 질병, 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 여기서 활성은 세포에 상보적이고 및/또는 각각의 활성은 서로 악영향을 미치지 않는 하나 이상의 활성 성분을 포함한다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합하여 적절하게 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 기타 약제학적으로 활성인 시제 또는 약물, 예컨대 화학요법 시제, 예컨대 아스파라기나제, 부술판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시유레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맵, 빈블라스틴 등을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 질환 또는 증상을 치료 또는 예방하기에 효과적인 양, 예컨대 치료적 유효량 또는 예방적 유효량의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 치료된 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 조건에 따른 며칠 또는 며칠 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 치료는 질병 증상이 바람직하게 억제될 때까지 반복된다. 그러나, 기타 복용량 요법이 유용할 수 있으며 결정될 수 있다. 원하는 복용량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다중 볼루스 투여 또는 조성물의 지속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
세포는 투여를 위해 표준 투여 기법, 제형 및/또는 장치를 사용하여 제제화될 수 있다. 조성물의 저장 및 투여를 위한 주사기 및 바이알과 같은 제제 및 장치가 제공된다. 세포와 관련하여, 투여는 자가조직 또는 이종조직일 수 있다. 예를 들어, 면역 반응 세포 또는 전구 세포는 한 대상체로부터 수득될 수 있으며, 동일한 대상체 또는 상이한, 호환이 되는 대상체에 투여될 수 있다. 말초 혈액 유래의 면역 반응 세포 또는 그 후대 (예컨대, 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 유래됨)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 내 주사 또는 비경구 투여를 비롯한 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료적 조성물 (예컨대, 유전자 조작된 면역 반응 세포를 포함하는 약제학적 조성물)을 투여하는 경우, 이는 일반적으로 단위 복용량 주사 가능한 형태 (용액, 현탁액, 에멀젼)로 제형화될 것이다.
제제는 경구, 정맥 내, 복강 내, 피하, 폐, 경피, 근육 내, 비강 내, 협측, 설하 또는 좌약 투여를 위한 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 시제 또는 세포 집단은 비경구적으로 투여된다. 용어 “비경구”는, 본 명세서에서 사용 시, 정맥 내, 근육 내, 피하, 직장, 질 및 복강 내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 시제 또는 세포 집단은 정맥 내, 복강 내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서 조성물은, 일부 양태에서 선택된 pH로 완충될 수 있는 멸균 액체 제조물, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공된다. 액체 제조물은 일반적으로 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기 용이하다. 또한, 액체 제조물은 특히 주사에 의해 투여하기에 더욱 편리하다. 한편, 점성 조성물은 특정 조직과의 연장된 접촉 시간을 제공하기 위해 적합한 점도 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예컨대 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사 가능한 용액은 세포를 적합한 담체, 희석제, 또는 멸균수, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 같은 부형제와 혼합한 것과 같은 용매에 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물은 또한 동결 건조될 수 있다. 조성물은 원하는 투여 및 제조 경로에 따라 습윤제, 분산제 또는 에멀젼화제 (예컨대, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 증강 첨가제, 보존제, 향료제, 착색제 등과 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적합한 제조물을 제조하기 위하여 표준 텍스트를 참고할 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이트화제 및 완충제를 비롯하여, 조성물의 안정성 및 무균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 보장될 수 있다. 주사 가능한 제약 형태의 흡수는, 흡수를 지연시키는 시제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 연장될 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 무균이다. 무균성은, 예컨대 무균성 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
질병의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 시제의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 세포가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지 여부, 이전의 치료, 대상체의 임상 기록 및 시제 또는 세포에 대한 반응, 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 한 번에 또는 일련의 치료를 통해 적절하게 대상체에게 투여된다.
또한 재조합 수용체 (예컨대 CAR)에 의해 인식되는 항원이 발현되는 질병, 조건, 및 장애의 치료에 본 명세서에 기재된 산출 조성물에 존재하는 것과 같은 세포 및 조성물의 사용 방법 및 용도가 제공된다. 또한 기재된 임의의 인큐베이션 (예컨대, 자극) 방법에 의해 제조된 산출 또는 농축된 산출 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 유전자 조작된 T 세포를 생성하는 단계 및 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 유전자 조작된 T 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
조작된 세포 및 조성물을 투여하는 방법, 및 암을 비롯한 질환, 병태 및 장애를 치료 또는 예방하기 위한 조작된 세포 및 조성물의 용도가 제공된다. 일부 구현예에서, 세포 기반의 요법은 종양 또는 암과 같은 병변이 표면에 발현되는 분자를 표적화하는 면역 세포와 같은 세포, 예를 들어 T 세포를 투여하는 것이거나, 이를 포함한다. 제공된 방법 및 용도는 입양 세포 요법을 위한 방법 및 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 질환, 병태 또는 장애를 가지거나 가질 위험이 있거나, 또는 가지는 것으로 의심을 받는 대상체, 조직 또는 세포에, 조작된 세포, 또는 세포를 포함하는 조성물, 예컨대 기재된 바와 같이 산출 조성물로부터의 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 집단 및 조성물은 치료될 특정 질병 또는 병태를 가지는 대상체에게, 예컨대 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 또는 조성물은 대상체, 예컨대 질환 또는 병태를 가지거나 가질 위험이 있는 대상체에게 투여되어, 예컨대 조작된 T 세포에 의해 인식되는 항원을 발현하는 암에서 종양 부담을 감소시킴으로써, 질환 또는 병태 중 하나 이상의 징후를 개선시킨다.
치료되는 질환 또는 병태는, 일부 양태에서, 항원의 발현이 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직에 특이적인, 및/또는 발현되고, 및/또는 질병의 병인에 관여하는, 예컨대 그러한 질환, 병태 또는 장애를 유발하거나, 악화시키거나 또는 그렇지 않으면 이에 관여하는 임의의 것일 수 있다. 예시적인 질병 및 질병 상태는, 세포의 악성 또는 형질 전환 (예를 들어, 암), 자가면역 또는 염증성 질병, 또는 예컨대 박테리아, 바이러스 또는 기타 병원체에 의하여 야기되는 감염성 질병과 관련되는 질병 또는 질병 상태를 포함할 수 있다. 치료될 수 있는 다양한 질병 및 질병 상태와 관련된 항원을 포함하는, 예시적인 항원은 상기 기재되어 있다. 구체적인 구현예에서, 면역조절성 폴리펩타이드 및/또는 재조합 수용체, 예컨대, 키메라 항원 수용체 또는 TCR은 질병 또는 병태와 연관된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 대상체는 질병, 장애 또는 병태, 선택적으로 암, 종양, 자가면역 질병, 장애 또는 병태, 또는 감염성 질병을 가진다.
일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 다양한 암과 연관된 종양을 포함할 수 있다. 암은 일부 구현예에서 대상체의 신체에 위치하는 임의의 암, 예컨대, 두경부, 유방, 간, 결장, 난소, 전립선, 췌장, 뇌, 자궁경부, 뼈, 피부, 눈, 방광, 위, 식도, 복막, 또는 폐에 위치하는 암일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 항암제는 결장암, 자궁경부암, 중추신경계 암, 유방암, 방광암, 항문 암종, 두경부암, 난소암, 자궁내막암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암종, 신경내분비암, 연부조직 암종, 음경암, 전립선암, 췌장암, 위암, 담낭암 또는 식도암의 치료에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 암은 혈액암일 수 있다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 종양, 예컨대 고체 종양, 림프종, 백혈병, 혈액 종양, 전이성 종양, 또는 다른 암 또는 종양 유형이다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 결장, 폐, 간, 유방, 전립선, 난소, 피부, 흑색종, 뼈의 암, 뇌암, 난소암, 상피암, 신장 세포 암종, 췌장 선암종, 자궁경부 암종, 대장암, 교모세포종, 신경아세포종, 유잉(Ewing) 육종, 수모세포종, 골육종, 활막 육종, 및/또는 악성중피종으로부터 선택된다.
질병, 병태, 및 장애 중에는, 고형 종양, 혈액 악성 종양, 및 흑색종을 비롯한 종양, 및 국소적 및 전이성 종양을 비롯한 종양, 감염성 질병, 예컨대 바이러스 또는 다른 병원체에 의한 감염, 예를 들어, HIV, HCV, HBV, CMV, HPV, 및 기생충 질병, 및 자가면역 및 염증성 질병이 있다. 일부 구현예에서, 질병, 장애 또는 병태는 종양, 암, 악성종양, 신생종(neoplasm), 또는 다른 증식성 질병 또는 장애이다. 이러한 질병으로는 백혈병, 림프종, 예를 들어, 급성 골수 (또는 골수성) 백혈병 (AML), 만성 골수 (또는 골수성) 백혈병 (CML), 급성 림프구성 (또는 림프아구성) 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모세포 백혈병 (HCL), 소림프구성 림프종 (SLL), 외투 세포 림프종 (MCL), 변연부 림프종, 버킷 림프종, 호지킨 림프종 (HL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 역형성 거대 세포 림프종 (ALCL), 여포성 림프종, 불응성 여포성 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL) 및 다중 골수종 (MM)을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, B 세포 악성 종양은 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 성인 ALL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 및 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 질병 또는 질병 상태는 감염성 질병 또는 질병 상태, 예컨대, 바이러스, 레트로바이러스, 박테리아, 및 원충 감염, 면역결핍, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡스타인-바르 바이러스 (Epstein-Barr virus)(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스 (polyomavirus)이나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 질병 또는 질병 상태는 자가면역 또는 염증성 질병 또는 질병 상태, 예컨대 관절염, 예를 들어 류머티즘성 관절염 (RA), I형 당뇨병, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 염증성 장 질병, 건선, 경피증, 자가면역 갑상선 질병, 그레이브스병 (Grave's disease), 크론병 (Crohn's disease) 다발성 경화증, 천식, 및/또는 이식 관련 질병 또는 질병 상태이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 장애와 관련된 항원은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: 고아 타이로신 키네이스 수용체 ROR1, B 세포 성?과 항원 (BCMA), 탄산 무수화효소 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (수용체 타이로신 키네이스 erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린 수용체 A2 (EPHa2), Her2/neu (수용체 타이로신 키네이스 erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, 유형 III 상피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 엽산 결합 단백질 (FBP), FCRL5, Fc 수용체 유사 5 (FCRL5; 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체, 강글리오사이드 GD2, 강글리오사이드 GD3, G 단백질 연결 수용체 5D (GPCR5D), HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, 키네이스 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, L1-cell 유착 분자, (L1-CAM), 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 서바이빈, TAG72, B7-H6, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), MAGE A1, HLA-A2, NY-ESO-1, PSCA, 엽산 수용체-a, CD44v6, CD44v7/8, αvβ인테그린 (avb6 인테그린), 8H9, NCAM, VEGF 수용체, 5T4, 태아 AchR, 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, CD44v6, 이중 항원, 암-정소 항원, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), NKG2D, 암-고환 항원 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2으로도 알려짐), MART-1, 당단백 100 (gp100), 태아 종양 항원, ROR1, 영양막 당단백 (TPBG, 또한 5T4로도 알려짐), TAG72, VEGF-R2, 암 배아 항원 (CEA), Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린 B2, CD123, c-Met, GD-2, O-아세틸화된 GD2 (OGD2), CE7, Wilms 종양 1 (WT-1), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD138, 병원체-특이적 항원 및 보편적인 표지와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자.
일부 구현예에서, 항원 또는 리간드는 종양 항원 또는 암 마커이다. 일부 구현예에서, 항원 또는 리간드는 αvβ인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250로도 알려짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 알려짐), 암배아 항원 (CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), 표피 성장 인바 단백질 (EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5 (FCRL5; 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (fetal AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100 (gp100), 글리피칸-3 (GPC3), G 단백질 연결 수용체 5D (GPCR5D), Her2/neu (수용체 타이로신 키나제 erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원 (HMW-MAA), 간염 B 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 유착 분자 (L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린 (MSLN), c-Met, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 천연 세포 유착 분자 (NCAM), 종양태아성 항원, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA), 수용체 타이로신 키나제 유사 고아 수용체 1 (ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), 종양-관련 당단백 72 (TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1 (TRP1, 또한 TYRP1 또는 gp75로도 알려짐), 티로시나아제 관련 단백질 2 (TRP2, 또한 도파크롬 토토머라제, 도파크롬 델타-아이소머라제 또는 DCT로도 알려짐), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), Wilms 종양 1 (WT-1), 병원체-특이 또는 병원체-발현 항원, 또는 보편적인 표지와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 B 세포 악성종양이다. 일부 구현예에서, B 세포 악성종양은 백혈병 또는 림프종이다. 일부 양태에서, 질병 또는 병태는 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 성인 ALL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 비-호지킨 림프종 (NHL), 또는 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL)이다. 일부 경우에, 질병 또는 병태는 NHL, 예컨대 공격형 NHL인 NHL, 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), NOS (신생 또는 무통성 림프종으로부터 형질전환), 원발 종격동성 거대 B 세포 림프종 (PMBCL), T 세포/조직구-풍부형 거대 B 세포 림프종 (TCHRBCL), 버킷 림프종, 외투 세포 림프종 (MCL), 및/또는 여포성 림프종 (FL), 선택적으로 여포성 림프종 등급 3B (FL3B)를 포함한다. 일부 양태에서, CAR와 같은 재조합 수용체는 질병 또는 병태와 연관된, 또는 B 세포 악성종양과 연관된 병변의 환경의 세포에서 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 B 세포 악성종양과 관련된 항원을 포함하는데, 예컨대 다수의 공지된 B 세포 마커 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화되는 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Ig카파, Ig람다, CD79a, CD79b 또는 CD30이다.
일부 구현예에서, 질병 또는 병태는 골수종, 예컨대 다발성 골수종이다. 일부 양태에서, CAR와 같은 재조합 수용체는 질병 또는 병태와 연관된, 또는 다발성 골수종과 연관된 병변의 환경의 세포에서 발현된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 다발성 골수종과 연관된 항원, 예컨대 GPRC5d 또는 BCMA를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 병원체-특이적 또는 병원체-발현된 항원이다. 일부 구현예에서, 상기 항원은 바이러스 항원 (예컨대, HIV, HCV, HBV 등으로부터의 바이러스 항원), 박테리아 항원 및/또는 기생충 항원이다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 다른 항원-결합 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 형질전환 TCR 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 재조합 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에 대해 자가조직이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에 대해 동종이계이다.
입양 세포 요법를 위한 조작된 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며, 제공된 방법 및 조성물과 관련되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 예컨대, Gruenberg 등의 미국 특허 출원 공보 2003/0170238; Rosenberg의 미국 특허 4,690,915; 문헌 Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338를 참조한다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예컨대 입양 T 세포 요법은 자가 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 그러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리되고 및/또는 그렇지 않으면 이로부터 제조된다. 이에 따라, 일부 양태에서, 세포는 치료가 필요한 대상체, 예컨대 환자로부터 유래되고, 단리 및 가공 후의 세포는 동일한 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예컨대 입양 T 세포 요법은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받거나 또는 궁극적으로 받는 대상체 이외의 대상체, 예컨대 제1 대상체로부터 단리되고 및/또는 그렇지 않으면 이로부터 제조된다. 이러한 구현예에서, 이후 세포는 동일한 종의 상이한 대상체, 예컨대 제2 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스 또는 수퍼타입을 발현한다.
특정 구현예에서, 세포, 또는 세포 서브 유형의 개별 집단은 대상체에게, 약 100만 내지 약 1000억개의 세포 범위 및/또는 체중 kg당 세포의 양으로, 예컨대 약 100만 내지 약 500억개의 세포 (예컨대, 약 500만개의 세포, 약 2500만 개의 세포, 약 5억 개의 세포, 약 10억 개의 세포, 약 50억 개의 세포, 약 200억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 400억 개의 세포 또는 값 중 임의의 두 값으로 한정된 범위), 예컨대 약 1000만 내지 약 1000억개의 세포 (예컨대, 약 2000만 개의 세포, 약 3000만 개의 세포, 약 4000만 개의 세포, 약 6000만 개의 세포, 약 7000만 개의 세포, 약 8000만 개의 세포, 약 9000만 개의 세포, 약 100억 개의 세포, 약 250억 개의 세포, 약 500억 개의 세포, 약 750억 개의 세포, 약 900억 개의 세포 또는 값 중 임의의 두 값으로 한정된 범위), 및 경우에 따라 약 1억 내지 약 500억 개의 세포 (예컨대, 약 1억 2000만 개의 세포, 약 2억 5000만 개의 세포, 약 3억 5000만 개의 세포, 약 4억 5000만 개의 세포, 약 6억 5000만 개의 세포, 약 8억개의 세포, 약 9억개의 세포, 약 30억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 450억 개의 세포) 또는 이러한 범위 사이의 임의의 값 및/또는 체중 kg당 값으로 투여된다. 투여량은 질병 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 대한 특정 속성에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 예를 들어,대상체가 인간인 경우, 복용량은 약 5 x 108 미만의 전체 재조합 수용체 (예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포, 또는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어,대상체가 인간인 경우, 복용량은 약 1 x 108 미만의 전체 재조합 수용체 (예를 들어, CAR)-발현 세포, T 세포, 또는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC), 예를 들어, 약 1 x 106 내지 1 x 108개 범위의 이러한 세포, 예컨대 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108개의 전체 이러한 세포, 또는 전술한 값 중 임의의 둘 사이의 범위를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 세포의 복용량은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 2.5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 1 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 5 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 2.5 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 105 내지 1 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 2.5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 1 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 5 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 106 내지 2.5 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 2.5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 1 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 106 내지 5 x 106 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 2.5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 106 내지 1 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 107 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 107 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 107 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 107 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 107 내지 2.5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 107 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 107 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 107 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 2.5 x 107 내지 5 x 107 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 107 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 107 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 5 x 107 내지 1 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 108 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 1 x 108 내지 2.5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포, 또는 2.5 x 108 내지 5 x 108 개의 전체 CAR-발현 T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 세포의 복용량은 적어도 (약) 1 x 105 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 105 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 105 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 106 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 5 x 107 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 1 x 108 개의 CAR-발현 세포, 적어도 (약) 2.5 x 108 개의 CAR-발현 세포, 또는 적어도 (약) 5 x 108 개의 CAR-발현 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 수, (약) 5 x 105 내지 1 x 107 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 수, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107 개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 수를 포함하는 복용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 적어도 (약) 1 x 105개의 전체 재조합 수용체-발현 세포, 전체 T 세포, 또는 전체 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 수를 포함하는 세포 복용량의 투여를 포함하는데, 예컨대 적어도 (약) 1 x 106 개, 적어도 (약) 1 x 107 개, 적어도 (약) 1 x 108 개의 그러한 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 수는 CD3+ 또는 CD8+의 전체 수에 관한 것이며, 일부 경우, 재조합 수용체-발현 (예컨대, CAR+) 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은 (약) 1 x 105 내지 5 x 108 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107 개의 CD3+ 또는 CD8+ 전체 T 세포 또는 CD3+ 또는 CD8+ 재조합 수용체-발현 세포 수를 포함하는 복용량의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 요법은, (약) 1 x 105 내지 5 x 108 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, (약) 5 x 105 내지 1 x 107 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포, 또는 (약) 1 x 106 내지 1 x 107 개의 전체 CD3+/CAR+ 또는 CD8+/CAR+ 세포 수를 포함하는 복용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, T 세포의 복용량은 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어, 대상체가 인간인 경우, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 복용량을 포함하는, 복용량의 CD8+ T 세포는, 약 1 x 106 내지 5 x 108 개의 전체 재조합 수용체 (예를 들어, CAR)-발현 CD8+세포, 예를 들어, 약 5 x 106 내지 1 x 108 개의 이러한 세포의 범위를 포함하고, 이러한 세포는 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, 또는 5 x 108 개의 전체 이러한 세포, 또는 전술한 값 중 임의의 둘 사이의 범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다회 복용량을 투여받고, 복용량 각각 또는 전체 복용량은 전술한 수치들 중 어느 하나 이내일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포 복용량은 (약) 1 x 107 내지 0.75 x 108 개의 전체 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, 1 x 107 내지 2.5 x 107 개의 전체 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, (약) 1 x 107 내지 0.75 x 108 개의 전체 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 복용량은 약 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107 7.5 x 107, 1 x 108, 또는 5 x 108 개의 전체 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, 재조합 수용체-발현 T 세포의 복용량은, 단일 용량으로서 대상체에게 투여되거나, 또는 2 주, 1 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년 이상의 기간 내에 한 번만 투여된다.
일부 양태에서, 약제학적 조성물 및 제제는 주어진 복용량 또는 이의 분획으로 투여하기 위해 다수의 세포를 포함하는 단위 용량 형태 조성물로서 제공된다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포를 인큐베이션 (예컨대, 자극) 하는 다른 방법과 비교하여 투여에 대한 예측 가능한 타임라인으로 세포를 제조한다. 일부 경우에, 투여를 위한 세포의 복용량은 투입 조성물 내 나이브-유사 세포의 수에 기초하여 결정된다. 일부 구현예에서, 더 짧은 자극 기간 (예를 들어, 일부 구현예에서, 자극제와 함께 세포의 인큐베이션 시간이 (약) 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 또는 6 일)을 포함하는 공정을 사용하여 제조된 세포를 포함하는 복용량은 더 긴 자극 기간을 포함하는 공정에서 제조된 세포를 포함하는 복용량보다 더 낮을 수 있다. 일부 구현예에서, 더 짧은 자극 기간을 포함하는 공정을 사용하여 제조된 세포를 포함하는 복용량은, 더 긴 자극 기간을 포함하는 공정에서 제조된 세포를 포함하는 복용량과 비교하여, 더 큰 백분율의 또는 비율의 나이브-유사 세포를 포함할 수 있으며, 더 적은 전체 세포를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 복용량은 각각 복용량 중 일부의 세포를 함유하는 복수 개수의 조성물 또는 용액의 투여에 의하여 투여될 수 있는데, 예컨대 제1 및 제2 조성물 또는 용액, 필요에 따라 더 다수의 조성물 또는 용액의 투여에 의하는 것이다. 일부 측면에서, 각각 상이한 세포 집단 및/또는 서브-유형을 함유하는 복수 개의 조성물은, 필요에 따라 특정 기간 내에 개별적이거나 독립적으로 투여된다. 예를 들어, 세포의 집단 또는 서브-유형은, 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포 및/또는 각각 CD8+-농축된 및 CD4+-농축된 집단, 예를 들어 각각 재조합 수용체를 발현하도록 유전자 조작 세포들을 각기 포함하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 복용량의 투여는 CD8+ T 세포의 복용량 또는 CD4+ T 세포의 복용량을 포함하는 제1 조성물의 투여, 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 다른 복용량을 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물 또는 복용량의 투여, 예를 들어, 복수 개의 세포 조성물의 투여는 세포 조성물을 개별적으로 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 개별적인 투여는 동시에 또는 어느 순서로든 순차적으로, 수행된다. 일부 구현예에서, 복용량은 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하고, 제1 조성물 및 제2 조성물은 0 내지 12 시간 간격으로, 0 내지 6 시간 간격으로 또는 0 내지 2 시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 조성물의 투여 개시 및 제2 조성물의 투여 개시는 2 시간 이하의 간격으로, 1 시간 이하의 또는 30 분 이하의, 15 분 이하의, 10 분 이하의 또는 5 분 이하의 간격으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 조성물의 투여 개시 및/또는 완료 및 제2 조성물의 투여의 완료 및/또는 개시는 2 시간 이하, 1 시간 이하, 또는 30 분 이하, 15 분 이하, 10 분 이하 또는 5 분 이하의 간격으로 수행된다.
일부 조성물에서, 제1 조성물, 예를 들어 복용량 중 제1 조성물은 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 조성물에서, 제1 조성물, 예를 들어 복용량 중 제1 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 조성물은 제2 조성물 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포의 복용량 또는 조성물은 정의된 비율 또는 표적 비율의 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ 세포에 대한 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ 세포, 및/또는 CD8+ 세포에 대한 CD4+ 세포를 포함하는데, 여기의 비율은 선택적으로 대략 1:1 또는 대략 1:3 내지 대략 3:1 사이로, 예컨대 대략 1:1이다. 일부 측면에서, 표적 비율 또는 원하는 비율의 상이한 세포 집단 (예컨대 CD4+:CD8+ 비율 또는 CAR+CD4+:CAR+CD8+ 비율, 예컨대 1:1)을 갖는 조성물 또는 투여량의 투여는 상기 집단 중 하나를 함유하는 세포 조성물을 투여한 후 상기 집단 중 다른 것을 포함하는 개별적인 세포 조성물을 투여하는 것을 포함하는데, 여기서 투여는 상기 표적 비율 또는 원하는 비율로 또는 대략 그러한 비로 이루어진다. 일부 양태에서, 세포의 복용량 또는 조성물을 정해진 비율로 투여하면 T 세포 요법의 팽창, 지속성 및/또는 항종양 활성을 개선시킨다.
일부 구현예에서, 대상체 세포의 다중 복용량, 예를 들어, 2회 이상 복용량 또는 다중 연속 복용량을 받는다. 일부 구현예에서, 2회 복용량이 대상체에 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 연속 복용량을 받으며, 예를 들어, 제2 복용량은 제1 복용량 이후 대략 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 일에 투여된다. 일부 구현예에서, 다중 연속 복용량은, 추가의 복용량 또는 복용량들이 연속 복용량 투여 이후 투여되도록, 제1 복용량 이후 투여된다. 일부 양태에서, 추가적인 복용량으로 대상체에 투여되는 세포의 수는 제1 복용량 및/또는 연속 복용량과 동일하거나 이와 유사하다. 일부 구현예에서, 추가적인 복용량 또는 복용량은 이전의 복용량보다 더 크다.
일부 측면에서, 제1 및/또는 연속 복용량의 크기는 하나 이상의 기준에 기초하여 결정되는데, 예컨대 화학요법과 같은 선행 치료에 대한 환자의 반응, 대상체의 질병 부담, 예컨대 종양 부하, 벌크, 크기 또는 정도, 세기, 또는 전이 유형, 단계 및/또는 독성 결과, 예컨대 CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성, 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응를 발생할 가능성 또는 이환률에 기초한다.
일부 양태에서, 제1 복용량의 투여와 연속 복용량의 투여 사이의 시간은 약 9 내지 약 35 일, 약 14 내지 약 28 일, 또는 15 내지 27 일이다. 일부 구현예에서, 연속 복용량의 투여는 제1 복용량의 투여 이후 약 14 일 초과 및 약 28 일 미만의 시점이다. 일부 양태에서, 제1 및 연속 복용량 사이의 시간은 약 21 일이다. 일부 구현예에서, 추가의 복용량 또는 복용량들, 예를 들어 연속 복용량은 연속 복용량 투여 이후 투여된다. 일부 양태에서, 추가적인 연속 복용량 또는 복용량은 이전 복용량의 투여 이후 적어도 약 14 일 및 약 28 일 미만에 투여된다. 일부 구현예에서, 추가적인 복용량은 이전 복용량 이후 약 14일 미만에, 예를 들어, 이전 복용량의 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 일에 투여된다. 일부 구현예에서, 복용량은 이전 복용량 이후 약 14 일 미만으로 투여되지 않고 및/또는 복용량은 이전 복용량 이후 약 28 일 초과로 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포의 복용량, 예를 들어, 재조합 수용체-발현 세포는 T세포의 제1 복용량 및 T세포의 연속 복용량을 포함하는 2 가지 복용량 (예를 들어, 이중 복용량)을 포함하고, 이러한 제1 복용량 및 제2 복용량 중 하나 또는 둘 모두는 T세포의 분할 복용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 시제 (예컨대, 세포 독성제 또는 치료제) 등의 또 다른 치료적 개입과 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로, 추가의 조합 치료의 일부로서 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항암제 또는 면역조절제는 CAR와 같은 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포를 가지는 입양 세포 요법과 병용 요법으로 사용될 수 있다. 일부 상황에서, 세포 집단이 하나 이상의 추가적인 치료제의 효과를 증강시키도록 또는 그 반대의 경우를 위하여, 세포는 또 다른 요법과 시간적으로 충분히 가까이 병용 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 치료제는 예컨대 지속성을 증강시키기 위한, IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 화학요법 제제의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 치료제는 예컨대 조작된 세포의 투여 개시 이전에 또는 동시에 하나 이상의 림프구 고갈 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 림프구 고갈 요법은 포스파미드(phosphamide), 예컨대 사이클로포스파미드의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 림프구 고갈 요법은 플루라다빈의 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 플루라다빈은 림프구 고갈 요법에서 배제된다. 일부 구현예에서, 림프구 고갈 요법은 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 요법의 개시 전에 대상체에게 전처치 시제, 예컨대 림프고갈 또는 화학치료 시제, 예컨대 사이클로포스파미드, 플루다라빈 또는 이의 조합을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 대상체는 세포 요법의 개시보다 적어도 2 일 전에, 예를 들어 적어도 3, 4, 5, 6, 또는 7 일 이전에 전처치 시제를 투여받는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 세포 요법의 개시보다 최대 7 일 전에, 예를 들어 최대 6, 5, 4, 3 또는 2 일 이전에 전처치 시제를 투여받는다.
일부 구현예에서, 대상체는 20 mg/kg 내지 100mg/kg 사이, 또는 40 mg/kg 내지 80 mg/kg 사이 또는 약 그 정도의 복용량으로 사이클로포스파미드를 이용하여 전처치된다. 일부 측면에서, 상기 대상체는 60 mg/kg의 또는 약 그 정도의 사이클로포스파미드로 전처치된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 단일 투여로 투여되거나 또는 복수 회 투여로, 예컨대 매일, 격일로 또는 매 3일에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 하루 또는 이틀간 1 일 1 회 투여된다. 일부 구현예에서, 림프구고갈 시제가 사이클로포스파미드를 포함하는 경우, 대상체는 사이클로포스파미드가 복용량 (약) 100 mg/m2 내지 500 mg/m2, 예컨대 (약) 200 mg/m2 내지 400 mg/m2, 또는 250 mg/m2 내지 350 mg/m2의 복용량으로 투여된다. 일부 예시에서, 대상체는 약 300 mg/m2의 사이클로포스파미드가 투여된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 단일 투여로 투여되거나 또는 복수 회 투여로, 예컨대 매일, 격일로 또는 매 3일에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 예컨대 1-5 일간, 예컨대 3 내지 5 일간 매일 투여된다. 일부 예시에서, 대상체는 세포 요법의 개시 이전에, 3 일 간 매일, 약 300 mg/m2의 사이클로포스파미드기 투여된다.
일부 구현예에서, 림프구고갈 시제가 플루다라빈을 포함하는 경우, 대상체는 플루다라빈이 (약) 1 mg/m2 내지 100 mg/m2, 예컨대 (약) 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 35 mg/m2의 복용량으로 투여된다. 일부 예시에서, 대상체는 약 30 mg/m2의 플루다라빈이 투여된다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 단일 투여로 투여되거나 또는 복수 회 투여로, 예컨대 매일, 격일로 또는 매 3일에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 예컨대 1-5 일간, 예컨대 3 내지 5 일간 매일 투여된다. 일부 예시에서, 대상체는 세포 요법의 개시 이전에, 3 일 간 매일, 약 30 mg/m2의 플루다라빈이 투여된다.
일부 구현예에있서, 림프구 고갈 시제는 시제들의 조합, 예컨대 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 조합을 포함한다. 따라서, 상기 제제의 조합물은 임의의 복용량 또는 투여 스케쥴로 사이클로포스파미드를 포함할 수 있는데, 예컨대 전술한 바와 같고, 상기 조합물은 임의의 복용량 또는 투여 스케쥴로 플루다라빈을 포함할 수 있는데, 예컨대 전술한 바와 같다. 예를 들어, 일부 측면에서, 제1 투여 또는 후속 투여 전에 60 mg/kg (~ 2 g/m2)의 사이클로포스파미드 및 3 내지 5 복용량의 25 mg/m2 플루다라빈을 투여받는다.
세포는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 세포는 투약 요법으로 투여되어, 종양 부담의 감소와 같은 치료적 효과를 달성한다. 투약 및 투여는 면역조절성 화합물의 투여 스케줄에 부분적으로 의존할 수 있고, 이는 T 세포 요법의 투여 개시 이전에, 이후에, 및/또는 동시에 투여될 수 있다. T 세포 요법의 다양한 투약 스케쥴은 다양한 시점, 볼루스 투여 및 맥박 주입에 대한 단일 또는 다중 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
IV.키트 및 제조 물품
또한 입양 세포 요법에 대해 제공된 방법에 따라 대상체에게 세포를 투여하기 위한, 및 기재된 바와 같은 투입 조성물 또는 산출 조성물과 같은 세포 및 조성물의 저장 및 투여를 위한 키트 및 장치와 같은 제조 물품이 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 조성물을 포함하는 키트 및 사용 설명서가 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 방벙베 따라 자극된 임의의 조작된 세포의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 조작된 세포의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물, 및 질병 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 양태에서, 설명서는 세포 집단으로부터, 자극 시약에 의해 특이적으로 인식되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 수용체를 발현하는 세포를 선별 또는 농축하기 위한 것이다. 일부 경우에, 설명서는 세포 집단으로부터 자극 시약에 의해 특이적으로 인식되는 항원-결합 도메인을 포함하는 항원 수용체를 발현하는 세포를 팽창시키기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 키트는 질병 또는 병태를 치료하기 위한 병용 요법에서 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 자극된 조작된 세포를 질병 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여하기 위한 설명서를 추가적으로 포함한다. 일부 예시에서, 키트는 치료제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 면역조절제, 세포독성제, 항암제 또는 방사선치료제이다.
또한 본 명세서에는 제조 물품이 제공된다. 일부 구현예에서, 제조 물품은 본 명세서에 제공된 임의의 조작된 세포, 조성물, 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 세트, 폴리뉴클레오타이드 세트를 포함하는 조성물, 벡터, 벡터 세트, 벡터 세트를 포함하는 조성물, 또는 키트를 포함한다.
제조 물품 또는 키트는 하나 이상의 용기, 일반적으로 복수의 용기, 패키징 재료, 및 용기 또는 용기 및/또는 패키징 상에 또는 이와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함하며, 일반적으로 대상체에게 세포를 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 제조 물품 및 키트는 용기 및 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 용기는 투여될 세포, 예컨대, 이의 하나 이상의 단위 복용량을 포함한다. 제조 물품은 일반적으로 복수의 용기를 포함하며, 각각은 세포의 단일 단위 복용량을 포함한다. 단위 복용량은 제1 복용량으로 대상체에게 투여될 세포의 양 또는 수, 또는 제1 또는 임의의 하나 이상의 연속 복용량(들)로 투여될 세포 수의 두 배 (이상)일 수 있다. 이는 투여 방법과 관련하여 대상체에게 투여될 세포의 최저 용량 또는 가능한 최저 용량일 수 있다. 일부 구현예에서, 단위 용량은 본 명세서의 방법에 따라 특정 질병 또는 병태를 가지는 임의의 대상체, 또는 임의의 대상체에게 단일 용량으로 투여될 표적 범위 내에서 최소 세포 수 또는 세포 수, 또는 기준 단위의 최소 수 또는 표적 기준 단위 또는 기준 단위이다.
적합한 용기로는, 예를 들어, 병, 바이알, 실린지, IV 수액 백, 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서 용기는 그 자체로, 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 용기는 멸균 접근 포트를 가진다. 예시적인 용기는 주사용 바늘이 뚫을 수 있는 스탑퍼를 가지는 백을 포함하는 정맥 내 수액 백, 바이알, 또는 경구 투여되는 제제를 위한 병 또는 바이알을 포함한다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 질병 또는 병태를 치료하기 위하여 사용된다는 것을 명시할 수 있다. 제조 물품은 조성물이 특정 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 택일적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은은 약제학적으로-허용되는 완충액을 포함하는 또 다른 또는 동일한 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 물질, 예컨대 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및/또는 실린지를 추가로 포함할 수 있다.
구체적인 구현예에서, 용기는 유연한 백(bag)과 같은 백, 예컨대 대상체에게 세포를 주입하기에 적합한 백, 예컨대, 유연한 플라스틱 또는 PVC 백, 및/또는 IV 솔루션 백이다. 일부 구현예에서 백은 멸균 용액을 제공하고 세포 및 조성물의 전달하도록 밀봉 가능하고 및/또는 멸균될 수 있다. 일부 구현예에서, 용기, 예컨대, 백은 적어도 (약) 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 1000 mL의 용량, 예컨대 (약) 10 내지 (약) 100, 또는 (약) 10 내지 (약) 500 mL의 용량을 가진다. 일부 구현예에서, 용기, 예컨대, 백은, 하나 이상의 다양한 온도, 예컨대 차가운 온도, 예컨대 (약) -20 ℃, -80 ℃, -120 ℃, 135 ℃에서 및/또는 냉동보존에 적합한 온도, 및/또는 다른 온도, 예컨대 세포를 해동하기에 적합한 온도 및, 예를 들어, 치료 직전에 대상체의 위치 또는 치료 위치, 예컨대, 침대 옆에서, 해동을 허용하는 (약) 37 ℃과 같은 체온에서, 안정한 및/또는 안정한 저장 및/또는 세포 유지를 제공하는 물질이고 및/또는 이러한 물질로 이루어져있다.
용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 예를 들어, 하나 이상의 튜브에 튜빙 또는 캐뉼레이션하기 위한, 예를 들어, 정맥내 또는 다른 주입을 위해 및/또는 다른 용기, 예컨대 세포 배양물, 및/또는 저장 백 또는 다른 용기로 전달하기 위한 하나 이상의 포트, 예컨대, 멸균 접근 포트를 가진다. 예시적인 용기로는 주사용 바늘이 뚫을 수 있고 스탑퍼를 가지는 백을 포함하여, 주입 백, 정맥 내 수액 백, 바이알을 포함한다.
제조 물품은 하나 이상의 식별 정보 및/또는 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물 또는 라벨을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 정보 또는 설명서는 구체적인 병태 또는 질병을 치료하기 위해, 및/또는 이를 위한 설명서를 제공하는데 사용될 수 있거나 사용되어야 하는 것을 명시한다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 제조 물품의 내용물이 질병 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다는 것을 명시할 수 있다. 일부 구현예에서, 라벨 또는 패키지 삽입물은 예컨대, 제공된 방법 중 임의의 구현예에 따라, 제1 및 하나 이상의 연속 용량의 세포 투여를 포함하는 방법을 통해, 세포가 유래된 대상체와 같은 대상체를 치료하기 위한 설명서를 제공한다. 일부 구현예에서, 설명서는, 제1 용량으로, 하나의 단위 용량, 예컨대, 제조 물품 내의 단일 개별 용기의 내용물의 투여에 이어서, 지정된 시점에 또는 지정된 시간 윈도우 이내에 및/또는 대상체에서 하나 이상의 인자 또는 결과의 존재 또는 부재 또는 양 또는 정도의 검출 이후, 하나 이상의 연속 용량을 투여하는 것을 명시한다.
일부 구현예에서, 설명서는 대상체에게 하나 이상의 단위 용량을 투여하는 것을 명시한다.
일부 구현예에서, 라벨 또는 패키지 삽입물 또는 패키징은 세포가 유래된 및/또는 세포가 투여될 대상체의 특정 신원을 나타내는 식별자를 포함한다. 자가 전이의 경우, 세포가 유래된 대상체의 신원은 세포가 투여되는 대상체의 신원과 동일하다. 이에 따라, 식별 정보는 세포가 특정 환자, 예컨대 세포가 원래 유래된 환자에게 투여되도록 특정할 수 있다. 이러한 정보는 바코드 또는 다른 암호화된 식별자의 형태의 패키징 재료 및/또는 라벨로 존재할 수 있거나, 또는 대상체의 이름 및/또는 다른 식별 특성을 식별할 수 있다.
일부 구현예에서 제조 물품은 세포를 포함하는 조성물을 함유하는 하나 이상의, 일반적으로 복수의 용기, 예컨대, 이의 개별 단위 용량을 포함하며, 예를 들어, 임의의 순서로 동시에 또는 순차적으로, 세포와 조합되어 투여될 세포독성제, 그렇지 않으면 치료제와 같은 추가적인 시제를 포함하는 조성물이 함유된 하나 이상의 추가적인 용기를 추가로 포함한다. 택일적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은은 약제학적으로-허용되는 완충액을 포함하는 또 다른 또는 동일한 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 물질, 예컨대 다른 완충액, 희석제, 필터, 튜빙, 바늘, 및/또는 실린지를 추가로 포함할 수 있다.
용어 “패키지 삽입물(package insert)”은 이러한 치료요법적 산물의 사용과 관련된 지시, 용도, 복용량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보가 포함된 치료요법적 산물의 시판 포장에 관례적으로 포함되는 지침을 칭할 때 이용된다.
V.정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는, 청구되는 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 가지는 용어는 명확성 및/또는 즉답형 참조를 위해 본 발명에 정의되며, 본 명세서에 이러한 정의를 포함한다고 해서 해당 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 바와 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명에서 사용되는 바, "대상체"는 인간 또는 다른 동물과 같은 포유류이고, 통상 인간이다. 일부 구현예에서, 면역조절성 폴리펩타이드, 조작된 세포, 또는 조성물이 투여되는 대상체, 예컨대 환자는 포유류, 전형적으로는 인간과 같은 영장류이다. 일부 구현예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있으며, 유아, 어린이, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하여 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 설치류와 같은 영장류가 아닌 포유류이다.
본 명세서에서 사용 시, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료의"와 같은 문법적인 변형)는 질병 또는 병태 또는 장애, 또는 징후, 부작용 또는 결과, 또는 이러한과 관련된 표현형의 완전한 또는 부분적인 개선 또는 감소를 의미한다. 치료의 바람직한 효과에는 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행 속도 감소, 상기 질병 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 용어는 질환의 완치, 또는 모든 징후나 결과에 대한 임의의 징후나 효과(들)의 완전한 제거를 의미하지는 않는다.
본 명세서에서 사용 시, "질환 발달 지연"은 질환 (예컨대, 암)의 발달을 연기, 저해, 둔화, 지체, 안정화, 억제 및/또는 미루는 것을 의미한다. 지연은 치료될 질병 및/또는 개인의 병력에 좌우하여 다양한 길이의 시간이 될 수 있다. 사실상 충분한 또는 현저한 지연이 개인이 질환을 발달시키지 않는다는 점에서 예방을 포함할 수 있는 것은 명백하다. 예를 들어, 말기 암, 예컨대 전이의 발달은 지연될 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "예방"은 질병에 걸리기 쉽지만 아직 질병을 진단받지 않은 대상체에서, 질병의 발병 또는 재발과 관련된 예방을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 세포 및 조성물은 질병의 발달을 지연시키거나 질병의 진행을 둔화시키는데 사용된다.
본 명세서에서 사용 시, 기능 또는 활성을 "억제"하는 것은 관심있는 조건 또는 파라미터를 제외한 다른 동일한 조건과 비교하였을 때, 또는 또 다른 조건과 비교하여, 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는, 세포가 없는 경우에서의 종양의 성장 속도와 비교하여 종양의 성장 속도를 감소시킨다.
투여의 맥락에서, 약학 제형, 세포 또는 조성물의 "유효량"은, 필요한 시간 동안 복용량/투여량으로 치료적 또는 예방적 결과 등의 원하는 결과를 효과적으로 달성하기 위한 양을 의미한다.
시제, 예컨대 약제학적 제형 또는 조작된 세포의 "치료적 유효량"은, 필요한 시간 동안 복용량으로 원하는 치료적 결과, 예컨대 질환, 병태 또는 장애의 치료, 및/또는 치료의 약동학 또는 약역학 효과를 효과적으로 달성하기 위한 양을 의미한다. 치료적 유효량은 대상체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 투여되는 면역조절성 폴리펩타이드 또는 조작된 세포 등의 인자에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 면역조절성 폴리펩타이드 또는 조작된 세포, 또는 조성물을 유효량으로, 예컨대 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
"예방적 유효량"은, 필요한 시간 동안 복용량으로 원하는 예방적 결과를 효과적으로 달성하기 위한 양을 의미한다. 예방적 복용량(dose)은 질병 이전 또는 초기 단계에서 사용됨에 따라, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이지만, 전형적으로 반드시 그런 것은 아니다.
용어 “약제학적 제제(pharmaceutical formulation)”이란 이러한 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 조제물을 지칭하며, 제제가 투여되는 대상에게 수용 불가능한 독성을 주는 추가 성분은 포함하지 않는다.
“약제학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)”란, 대상에게 비독성이며, 활성 성분 이외의 약학 제제에 포함된 성분을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용 시, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치가 서열 목록에 기재된 것과 같은 개시된 서열에서 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치에 "상응한다"는 설명은, 표준 정렬 알고리즘, 예컨대 GAP 알고리즘을 사용하여 동일성을 최대화하기 위해 개시된 서열과의 정렬 시에 식별되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 위치를 지칭한다. 서열을 정렬시킴으로써, 예를 들어, 보존된 동일한 아미노산 잔기를 가이드로서 사용하여 상응하는 잔기를 식별할 수 있다. 일반적으로, 상응하는 위치를 식별하기 위해, 아미노산 서열은 가장 높은 순서로 일치하게 되도록 정렬된다 (예컨대, 다음의 문헌을 참조한다: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
본 명세서에서 사용 시, 단수 용어(“a”“an,”및 “the”는 문맥이 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, 단수 용어(“a”또는 “an”는 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본 명세서에 기술된 양태 및 변형은, 양태 및 변형으로 "구성하는" 및/또는 "본질적으로 구성된"을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 청구되는 발명의 다양한 양태가 범위 포맷으로 제공될 수 있다. 범위 포맷의 설명은 단지 편의 및 간결화를 위한 것이며, 청구되는 발명의 범위에 대한 변경할 수 없는 제한으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 그러한 범위에 속하는 개별적인 수치, 뿐만 아니라 모든 가능한 하위범위가 명시적으로 개시된 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재된 값 및 언급된 범위 내의 임의의 기타 언급되거나 개재된 값이 청구된 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위 내에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 임의의 특별히 배제된 한계값에 따라 청구된 발명 범위에 포함될 수도 있다. 언급된 범위가 한계값의 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 하나 또는 두 한계값을 제외한 범위 또한 청구된 발명 범위에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 발명에서 사용되는 "약"이라는 용어는 이 기술 분야의 숙련자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본 명세서의 값 또는 매개변수에 대한 "약(about)"의 언급은 그 값 또는 매개변수 그 자체(per se)를 나타내는 구현예를 포함 (및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"에 대한 기술은 "X"에 대한 기술을 포함한다. 특정 구체예에서, 언급된 값의 “약”은 언급된 값의 ±25%, ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.1%, 또는 ±0.01% 인애ㅢ 갑을 지칭한다.
본 명세서에서 사용 시, 조성물은 세포를 포함하는 둘 이상의 산물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이러한의 임의의 조합일 수 있다.
본 명세서에 사용 시, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라는 설명은, 특정 마커, 전형적으로 표면 마커가 세포 상의 또는 세포 내의 검출 가능하도록 존재하는 것을 의미한다. 표면 마커를 지칭할 때, 용어는 예컨대, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 항체를 검출함으로써, 유동 세포 측정 분석에 의해 검출된 표면 발현의 존재를 지칭하며, 여기서 염색은 동일한 조건하에서 이소타입-매치된 대조군을 사용한 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포보다 실질적으로 높은 수준에서 유동 세포 측정 분석에 의해 검출 가능하다.
본 명세서에 사용 시, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라는 설명은, 특정 마커, 전형적으로 표면 마커의 세포 상의 또는 세포 내의 실질적으로 검출 가능한 존재가 없다는 것을 의미한다. 표면 마커를 지칭할 때, 용어는 예컨대, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 항체를 검출함으로써, 유동 세포 측정 분석에 의해 검출되는 표면 발현이 없음을 의미하며, 여기서 염색은 동일한 조건하에서 이소타입-매치된 대조군을 사용한 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포보다 현저히 낮은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 유동 세포 측정 분석에 의해 검출되지 않는다.
본 발명에 사용되는바, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 말한다. 상기 용어는 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 혼입된 벡터뿐만 아니라 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터를 본 명세서에서 “발현 벡터(expression vectors)”라고 한다.
용어 "숙주 세포(host cell)", "숙주 세포 계통(cell line)", 및 "숙주 세포 배양물(culture)"은 호환 이용되며, 외생 핵산이 도입된, 세포 및 이러한 세포들의 후대가 포함된 세포들을 지칭한다. 숙주 세포들은 "형질변환체(transformants)"와 "형질변환된(transformed) 세포들"이 포함되는데, 이들은 계대의 수와 무관하게, 1차 형질변환된 세포와 이로부터 유도된 후대를 포함한다. 후대는 핵산 함량에 있어서 부모계 세포와 완벽하게 동일하지는 않고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 원래 형질변환된 세포에 대하여 선별된 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보유한 돌연변이 후대가 본 명세서에 포함된다.
VI.예시적인 구현예
제공되는 구현예는 다음과 같다:
1. 다음의 단계를 포함하는, T 세포를 유전적으로 조작하는 방법:
(a) 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 생성하는 단계로서, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하고, 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약을 포함하는 단계; 및
(b) 유전자 조작된 재조합 수용체를 T 세포의 자극된 조성물로 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 상기 도입 단계는 적어도 인큐베이션 단계의 일부 동안 수행되는 단계.
2. 다음의 단계를 포함하는, T 세포를 유전적으로 조작하는 방법:
(a) 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 생성하는 단계로서, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하는 단계; 및
(b) 유전자 조작된 재조합 수용체를 T 세포의 자극된 조성물로 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 상기 도입 단계는 적어도 인큐베이션 단계의 일부 동안 수행되는 단계.
3. 구현예 2에 있어서, 자극 조건은 투입 조성물과 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약과의 인큐베이션을 포함하는 것인 방법.
4. T 세포를 유전적으로 조작하는 방법으로서,
상기 방법은 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 생성하는 단계로서, 상기 투입 세포의 집단은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하며, 여기서:
자극 조건이 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약의 존재를 포함하고; 및
자극 조건하에서 투입 조성물의 인큐베이션 단계는 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전, 동안 및 또는 이후 수행되는 것인 방법.
5. 구현예 1-4 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 적어도 3 일 동안 수행되는 것인 방법.
6. 구현예 1-4 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 적어도 4 일 동안 수행되는 것인 방법.
7. 구현예 1-4 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 적어도 5 일 동안 수행되는 것인 방법.
8. 구현예 1-4 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 단계는 적어도 6 일 동안 수행되는 것인 방법.
9.다음의 단계를 포함하는, T 세포를 자극하는 방법:
(a) 자극 조건하에서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양-개시량을 포함하는 T 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 제조하는 단계; 및
(b) 자극된 세포 조성물 내로 유전자 조작된 재조합 수용체를 코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 상기 방법은 이에 따라 유전자 조작된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성하는 것인 방법.
10. 구현예 9에 있어서, T 세포는 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하며, 이러한 자극 조건은 자극된 조성물 내 비-나이브 유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 팽창 또는 증식을 우선적으로 유도하는 것인 방법.
11. 구현예 9 또는 구현예 10에 있어서, 상기 도입 단계는 적어도 인큐베이션의 일부 동안 수행되거나, 또는 인큐베이션 이후 수행되는 것인 방법.
12. 구현예 9-11 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 (약) 0.1 x 108 내지 5 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 4 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 2 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 1 x 108, (약) 1 x 108 내지 5 x 108 (약) 1 x 108 내지 4 x 108, (약) 1 x 108 내지 2 x 108, (약) 2 x 108 내지 5 x 108, (약) 2 x 108 내지 4 x 108개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트인 것인 방법.
13. 구현예 9-12 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 적어도 (약) 0.5 x 108, 0.75 x 108, 1 x 108, 1.5 x 108, 2 x 108, 또는 4 x 108 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트인 것인 방법.
14. 구현예 9-13 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 적어도 (약) 2 x 108 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트인 것인 방법.
15.T 세포를 자극하는 방법으로서, 상기 방법은, 자극 조건하에서, (약) 1 x 108 내지 4 x 108 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양-개시량을 포함하는 T 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것인 방법.
16. 구현예 15에 있어서, T 세포는 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하며, 이러한 자극 조건은 자극된 조성물 내 비-나이브 유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 팽창 또는 증식을 우선적으로 유도하는 것인 방법.
17. 구현예 15 또는 구현예 16에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 적어도 (약) 2 x 108 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트인 것인 방법.
18. 구현예 17-17 중 어느 하나에 있어서, 배양 개시량은 나이브-유사 CD8+ T 세포의 양인 것인 방법.
19. 구현예 1-18 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 CD8+ T 세포는:
CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는
CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는
CD95의 발현이 낮고; 및/또는
IL-2, IFN-γIL-4, IL-10으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현에 대해 음성인 것인 방법.
20. 구현예 1-19 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 세포 또는 나이브-유사 CD8+ 세포는:
CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는
CD45RO, CD56, KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는
CD95의 발현이 낮은 것인 방법.
21. 구현예 1-20 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA+, CD27+, CCR7+, 및/또는 CD45RO-인 것인 방법.
22. 구현예 1-17 및 16-21 중 어느 하나에 있어서, 비-나이브-유사 T 세포는:
CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는
CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1, 및 퍼포린으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는
IL-2, IFN-γIL-4, IL-10으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현에 대해 양성이고; 및/또는
CD95의 발현이 높은 것인 방법.
23. 구현예 1-14 및 16-22 중 어느 하나에 있어서, 비-나이브-유사 T 세포는 CD45RA-, CD27-, CCR7-, 및/또는 CD45RO+인 것인 방법.
24. 구현예 1-23 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물의 세포는 인큐베이션 단계 이전에, 나이브-유사와 비-나이브-유사 T 세포 사이에서 분화하는 내인성 T 세포 표면 마커에 기초하는 선별 단계를 거치지 않았거나, 또는 거치지 않는 것인 방법.
25. 구현예15-24 중 어느 하나에 있어서, 유전자 조작된 재조합 수용체를 자극된 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하며,
상기 방법은 이에 따라 유전자 조작된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성하는 것인 방법.
26. 구현예 26에 있어서, 자극 조건하에서 조성물의 인큐베이션 단계는 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전, 동안 및 또는 이후 수행되는 것인 방법.
27. 구현예 1-14 및 25-26 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인, 및/또는 이에 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것인 방법.
28. 구현예 27에 있어서, 질병, 장애 또는 병태는 감염성 질병 또는 장애, 자가면역 질병, 염증성 질병, 또는 종양 또는 암인 것인 방법.
29. 구현예 27 또는 구현예 28에 있어서, 표적 항원은 종양 항원인 것인 방법.
30. 구현예 27-29 중 어느 하나에 있어서, 표적 항원은 αvβ인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), 탄산무수화효소 9 (CAIX), Her2/neu (수용체 타이로신 키나제 erbB2), L1-CAM, B7-H3, B7-H6, 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250로도 알려짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 알려짐), 암배아 항원 (CEA), ? B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), 표피 성장 인자 단백질 (EGFR), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이합체, III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 엽산 결합 단백질 (FBP), Fc 수용체 유사 5 (FCRL5; 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (fetal AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD3, 글리피칸-3 (GPC3), G 단백질 연결 수용체 5D (GPRC5D), Her2/neu (수용체 타이로신 키나제 erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원 (HMW-MAA), 간염 B 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 유착 분자 (L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린 (MSLN), c-Met, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 천연 세포 유착 분자 (NCAM), 종양태아성 항원, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA), 수용체 타이로신 키나제 유사 고아 수용체 1 (ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), 종양-관련 당단백 72 (TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1 (TRP1, 또한 TYRP1 또는 gp75로도 알려짐), 티로시나아제 관련 단백질 2 (TRP2, 또한 도파크롬 토토머라제, 도파크롬 델타-아이소머라제 또는 DCT로도 알려짐), 엽산 수용체-a, 8H9, 이중 항원, 당단백 100 (gp100), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGF-R2), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, Wilms 종양 1 (WT-1), 병원체-특이 또는 병원체-발현 항원, 및 보편적인 표지와 관련된 항원에 의해 발현되는 분자로부터 선택되는 것인 방법.
31. 구현예 1-14 및 25-30 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 기능적 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
32. 구현예 1-14 및 25-30 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 방법.
33. 구현예 1-14 및 25-32 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 항원-결합 도메인을 포함하는 세포 외 도메인을 포함하고, 선택적으로 항원-결합 도메인은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
34. 구현예 33에 있어서, 항원-결합 도메인은 항체 또는 이의 항체 단편이거나, 또는 이를 포함하며, 선택적으로 단일 사슬 단편인 것인 방법.
35. 구현예 33에 있어서, 단편은 유연한 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
36. 구현예 34 또는 구현예 35에 있어서, 단편은 scFv를 포함하는 것인 방법.
37. 구현예 1-14 및 25-36 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함하는 것인 방법.
38. 구현예 1-14 및 25-37 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 세포 내 신호전달 영역을 포함하는 것인 방법.
39. 구현예 38에 있어서, 세포 내 신호전달 영역은 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
40. 구현예 39에 있어서, 세포 내 신호전달 영역은 1차 신호전달 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호전달 도메인, T 세포 수용체 (TCR) 요소의 신호전달 도메인 및/또는 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 신호전달 도메인이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
41. 구현예 40에 있어서, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타 (CD3ζ사슬의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 이의 신호전달 부분이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
42. 구현예 38-41 중 어느 하나에 있어서, 재조합 수용체는 세포 외 도메인과 세포 내 신호전달 영역 사이에 배치된 막횡단 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
43. 구현예 38-42 중 어느 하나에 있어서, 세포 내 신호전달 영역은 공동자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는 것인 방법.
44. 구현예 43에 있어서, 공동자극 신호전달 영역은 T 세포 공동자극 분자의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함하는 것인 방법.
45. 구현예 43 또는 구현예 44에 있어서, 공동자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함하는 것인 방법.
46. 구현예 43-45 중 어느 하나에 있어서, 공동자극 신호전달 영역은 막횡단 도메인과 세포 내 신호전달 영역 사이에 있는 것인 방법.
47. 구현예 1-46 중 어느 하나에 있어서, 자극 조건은 T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 활성화시킬 수 있고; TCR 복합체를 통해 신호를 유도할 수 있고; 및/또는 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 증식을 유도할 수 있는 자극 시약과 함께 인큐베이션 하는 것을 포함하는 것인 방법.
48. 구현예 1-47 중 어느 하나에 있어서, 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약과의 인큐베이션을 포함하는 것인 방법.
49. 구현예 47 또는 구현예 48에 있어서, 자극 시약은 TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합하며, 선택적으로 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 시제를 포함하는 것인 방법.
50. 구현예 49에 있어서, 자극제는 T 세포 공동자극 분자에 대해 특이적으로 결합하는 2차 시제를 추가로 포함하며, 선택적으로 공동자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
51. 구현예 47-50 중 어느 하나에 있어서, 1차 및 2차 시제로는 항체를 포함하며, 선택적으로 하나 이상의 자극제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와의 인큐베이션을 포함하는 것인 방법.
52. 구현예 50 또는 구현예 51에 있어서, 1차 및/또는 2차 시제는 고체 지지체의 표면 상에 존재하는 것인 방법.
53. 구현예 52에 있어서, 고체 지지체는 비드이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
54. 구현예 53에 있어서, 비드는 직경이 (약) 3.5 μm 이상이지만, 약 9 μm 이하, 또는 약 8 μm 이하, 또는 약 7 μm 이하, 또는 약 6 μm 이하, 또는 약 5 μm 이하인 것인 방법.
55. 구현예 53 또는 구현예 54에 있어서, 비드는 직경이 (약) 4.5 μm인 것인 방법.
56. 구현예 53-55 중 어느 하나에 있어서, 비드는 직경이 림프구 또는 항원 제시 세포와 동일하거나 또는 대략 동일한 것인 방법.
57. 구현예 53-56 중 어느 하나에 있어서, 비드는 불활성인 것인 방법.
58. 구현예 53-57 중 어느 하나에 있어서, 비드는 폴리스타이렌 표면이거나, 또는 이를 포함하며, 선택적으로 자성 또는 초상자성 코어를 포함하는 것인 방법.
59. 구현예 53-58 중 어느 하나에 있어서, 자극 조건은 비드 대 세포의 비율이 (약) 1:1 내지 10:1, (약) 1:1 내지 8:1, (약) 1:1 내지 6:1, (약) 1:1 내지 4:1, (약) 1:1 내지 3:1, (약) 2:1 내지 4:1, (약) 2:1 내지 3:1, (약) 1:1 내지 2:1, (약) 4:1 내지 10:1, (약) 4:1 내지 8:1, (약) 4:1 내지 6:1, (약) 6:1 내지 10:1, (약) 6:1 내지 8:1, (약) 8:1 내지 10:1, (약) 1:1 내지 1:10, (약) 1:1 내지 1:8, (약) 1:1 내지 1:6, (약) 1:1 내지 1:4, (약) 1:2 내지 1:3인 비율로 세포와의 인큐베이션을 포함하는 것인 방법.
60. 다음의 단계를 포함하는, T 세포를 유전적으로 조작하는 방법:
(a) 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하는 단계로서, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하고, 자극 조건은 항-CD3 항체 및 비드에 부착된 항-CD28 항체인 2차 시제를 포함하는 자극 시약을 포함하며, 인큐베이션 동안 비드 대 세포의 비율 (약) 1:1 내지 4:1인 단계; 및
(b) 유전자 조작된 재조합 수용체를 T 세포의 자극된 조성물로 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 상기 도입 단계는 적어도 인큐베이션 단계의 일부 동안 수행되는 단계.
61. T 세포를 유전적으로 조작하는 방법으로서, 상기 방법은 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하고, 여기서:
자극 조건은 항-CD3 항체 및 비드에 부착된 항-CD28 항체인 2차 시제를 포함하는 자극 시약을 포함하며, 인큐베이션 동안 비드 대 세포의 비율 (약) 1:1 내지 4:1인 것인 단계; 및
자극 조건하에서 투입 조성물의 인큐베이션 단계는 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전, 동안 및 또는 이후 수행되는 것인 방법.
62. 구현예 59에 있어서, 비드 대 세포의 비율은 (약) 3:1인 것인 방법.
63. 구현예 59 중 어느 하나에 있어서, 비드 대 세포의 비율은 (약) 1:1인 것인 방법.
64. 구현예 1-63 중 어느 하나에 있어서, T 세포는 생물학적 샘플로부터 유래하며, 선택적으로 생물학적 샘플은 인간 대상체로부터 유래하는 것인 방법.
65. 구현예 64에 있어서, 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 샘플, 분별되지 않은 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집 생성물, 또는 백혈구성분채집 생성물이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
66. 구현예 1-65 중 어느 하나에 있어서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포를 포함하는 것인 방법.
67. 구현예 1-66 중 어느 하나에 있어서, T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2:1 내지 (약) 1:5인 것인 방법.
68. 구현예 55에 있어서, CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 비율은 (약) 1:1, 1:2, 2:1, 1:3, 또는 3:1인 것인 방법.
69. 구현예 1-68 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 T 세포는 나이브-유사 CD4+ T 세포 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포를 포함하는 것인 방법.
70. 구현예 1-69 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 T 세포는 다클론성인 것인 방법.
71. 구현예 70에 있어서, 나이브-유사 T 세포의 클론성은 클론 시퀀싱, 선택적으로 차세대 시퀀싱, 또는 스펙트럼 유형 분석에 의해 결정되는 것인 방법.
72. 구현예 1-71 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 T 세포의 존재, 양, 개수 또는 백분율은 유세포 분석에 의해 검출되는 것인 방법.
73. 구현예 1-72 중 어느 하나에 있어서, 자극 조건은 N-아세틸시스테인 (NAC)을 포함하지 않는 것인 방법.
74. 구현예 1-72 중 어느 하나에 있어서, 자극 조건은 IL-15 및/또는 IL-7을 포함하지 않는 것인 방법.
75. 구현예 1-72 중 어느 하나에 있어서, 자극 조건은 사멸 또는 비-나이브 유사 T 세포 또는 이의 서브집단을 야기하거나 또는 유도하는 것인 방법.
76. 구현예 1-75 중 어느 하나에 있어서, 자극 조건은 비-나이브 유사 T 세포 또는 이의 서브집단의 활성화-유도 세포 사멸 (AICD)을 야기하는 것인 방법.
77. 구현예 1-76 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션 동안 및/또는 자극된 조성물에 DNAase를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
78. 구현예 1-77 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 일 이상 동안 수행되는 것인 방법.
79. 구현예 1-78 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 T 세포로부터 유래된, 자극된 조성물 내 세포 백분율은 투입 조성물 내 나이브-유사 세포의 백분율과 비교하여 (약) 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 50 배, 100 배 이상 증가되는 것인 방법.
80. 구현예 1-79 중 어느 하나에 있어서, 자극된 조성물 내, 비-나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포로부터 유래한 세포의 비율은, 투입 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 비율과 비교하여 (약) 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배 , 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 50 배, 100 배 이상 증가하는 것인 방법.
81. 구현예 1-80 중 어느 하나에 있어서, 자극된 조성물은 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포의 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 포함하는 것인 방법.
82. 구현예 1-81 중 어느 하나에 있어서, 자극된 조성물은 비-나이브 유사 T 세포로부터 유래된 세포의 10 % 미만을 포함하는 것인 방법.
83. 구현예 1-82 중 어느 하나에 있어서, 자극된 조성물은 비-나이브 T 세포로부터 유래된 세포의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 이하를 포함하는 것인 방법.
84. 구현예 1-83 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물 내 세포 중에서, 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 더 큰 백분율의 나이브-유사 T 세포가 증식 및/또는 활성화되도록 유도되는 것인 방법.
85. 구현예 1-84 중 어느 하나에 있어서, 투입 조성물 내 나이브-유사형이었던 T 세포의 더 큰 백분율은 투입 조성물 내 비-나이브-유사형이었던 T 세포의 백분율과 비교하여, 상기 인큐베이션의 개시 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일에 분열하는 것인 방법.
86. 구현예 1-85 중 어느 하나에 있어서, 자극 조건은, 이러한 조건하에서 인큐베이션의 개시 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일에, 인간 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 더 큰 백분율의 인간 나이브-유사 T 세포 집단의 세포의 증식을 유도할 수 있는 것인 방법.
87. 구현예 1-86 중 어느 하나에 있어서, (i) 비-나이브-유사 T 세포는 효과기 T (TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중추 기억 T 세포 (TCM), 효과기 기억 T (TEM) 세포, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 (ii) 비-나이브-유사 T 세포는 효과기 T (TEFF) 세포 및/또는 기억 T 세포를 포함하는 또는 이로 구성되며, 여기서 기억 T 세포는 선택적으로 중추 기억 T 세포 (TCM) 및/또는 효과기 기억 T (TEM) 세포를 포함하는, 복수의 T 세포인 것인 방법.
88. 구현예 1-87 중 어느 하나에 있어서,
투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포의 백분율은 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 자극된 조성물 내 조작된 세포의 백분율보다 작은 것인 방법.
89. 구현예 1-14 및 25-88에 있어서, 핵산과 함께 도입된 세포의 더 많은 백분율은, 투입 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포의 증식이거나, 또는 이로부터 유래되는 것인 방법.
90. 구현예 1-14 및 25-89 중 어느 하나에 있어서, 도입은 형질전환에 의한 것인 방법.
91. 구현예 1-14 및 25-90 중 어느 하나에 있어서, 핵산은 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
92. 구현예 91에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
93. 구현예 91 또는 구현예 92에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
94. 구현예 1-14 및 25-89 중 어느 하나에 있어서, 도입은 핵산 분자를 포함하는 트랜스포존의 전위에 의한 것인 방법.
95. 구현예 1-94 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행되는 것인 방법.
96. 구현예 1-83 중 어느 하나에 의해 제조된 산출 조성물.
97. 구현예의 산출 조성물을 포함하는 것인 약제학적 조성물. 98. 구현예 97에 있어서, 약제학적 담체를 추가로 포함하는 것인 약제학적 조성물.
99.치료 방법으로서, 포유동물 대상체에게, 구현예 1-95에 의해 제조된 산출 조성물 또는 구현예 97 또는 구현예 98의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
100. 구현예 99에 있어서, 세포는 세포가 투여되는 대상체로부터 유래하는 것인 방법.
VII.
실시예
다음의 실시예는 오직 설명의 목적으로 제공되는 것이며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1 : CAR+ T 세포를 포함하는 조작된 T 세포 조성물에서 나이브-유사 마커의 평가
바이러스 벡터로 형질전환 하기 전 T 세포를 활성화시키기 위해, 항-CD3 및 항-CD28 가 부착된 상자성 폴리스타이렌-코팅 비드로 구성된 자극 시약을 사용하는 2 개의 유사한 공정에 의해, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 T 세포를 포함하는 1차 T 세포의 조작된 조성물을 제조하였다. 두 공정에서, 동일한 항-BCMA CAR를 발현하기 위해 렌티바이러스 형질전환에 의해 세포를 조작하였다. CAR는 BCMA에 대해 특이적인 scFv 항원-결합 도메인, CD28 막횡단 영역, 4-1BB 공동자극 신호전달 영역, 및 세포 내 신호전달 도메인으로부터 유래된 CD3-제타를 포함하였다. 공정은 세포의 팽창 기간 및 조건에서 상이하였다. 제조된 T 세포 조성물을 세포 표면 마커에 대해 평가하였다.
두 공정에서, CD4+ 및 CD8+ 세포의 개별조성물은 인간 공여자로부터의 백혈구성분채집 샘플로부터 단리된 PBMC으로부터 선별하였고, 선별된 세포 조성물을 즉시 냉동시켰다. CD4+ 및 CD8+ T 세포의 개별 조성물을 이후 해동시키고, 1:1의 생존 CD4+ T 세포 대 생존 CD8+ T 세포 비율로 혼합하였다. 무혈청 배지에서 항-CD3/항-CD28 항체 콘쥬게이션 비드의 존재하에 1:1의 비드 대 세포 비율로 대략 300 x 106 T 세포 (150 x 106 CD4+ 및 150 x 106 CD8+ T 세포)의 혼합된 투입 세포 조성물을 18-30 시간 동안 세포를 인큐베이션 함으로써 자극하였다. 배지는 또한 재조합 IL-2, IL-7, 및 IL-15를 함유하였다. 자극 이후, 세포를 세척하고 첨가제 뿐만 아니라 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 무혈청 배지에 재현탁시켰다.
하나의 공정 (이하, “비-팽창”)에서, 자극된 세포 조성물로부터의 회전접종(spinoculation)에 의해 항-BCMA CAR를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다 회전접종 이후, 세포를 세척하고 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 무혈청 배지에 재현탁시켰다. 재현탁된 조성물의 세포를 약 37.0 ℃의 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 자극의 개시 후 약 96 시간에, 자기장의 존재하에 세포를 2회 세정하여, 항 CD3/항-CD28 항체 컨주게이션 상자성 비드를 제거하고 10% DMSO를 함유하는 용액에서 제제화하였다. 제제화된 세포 조성물을 백 또는 바이알로 옮기고 대략 -80 ℃에서 저장하였다.
또 다른 공정 (이하, “팽창”)에서, 인큐베이션 이후, 자극된 세포 조성물로부터 대략 100 x106의 생존 세포를 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 무혈청 배지에서 농축하였다. 세포를 60 분간 대략 1600 g으로 회전접종에 의해 상기 기재된 바와 동일한 항-BCMA CAR를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. 회전접종 이후, 세포를 세척하고 재조합 IL-2, IL-7 및 IL-15를 함유하는 무혈청 배지에 재현탁시키기고, 약 37 ℃에서 약 18 내지 30 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 인큐베이션 및 형질전환 단계 동안 사용된 IL-2, IL-7, 및 IL-15의 농도의 2배를 함유하는 약 500 mL의 예시적인 무혈청 배지의 바이오리엑터 (예컨대 록킹 모션(rocking motion) 바이오리엑터)로 세포를 옮김으로써 팽창을 위해 배양하였다. 설정된 생존 세포 밀도가 달성될 때, 관류가 개시되었고, 배지는 연속 혼합하는 반-연속 관류로 대체되었다. 다음 날, 약 3 x106 세포/ml의 역치 세포 밀도가 달성될 때까지 바이오리액터에서 세포를 배양하였고, 이는 일반적으로 6-7 일의 팽창을 수반하는 공정에서 발생하였다. 항-CD3 및 항-CD28 항체 컨쥬게이션 상자성 비드를 자기장에 노출시켜 세포 조성물로부터 제거하였다. 이후 세포를 수집하고, 상기 기재된 바와 같이 제제화 및 즉시 냉동하였다.
팽창 및 비-팽창 조작 공정으로부터 제조된 T 세포 조성물을 CD4, CD8, CCR7 및 CD27를 포함하는 표면 마커를 인식하는 항체로 염색하고 세포 분석에 의해 정량화하였다. CCR7 및 CD27 염색 모두에 양성인 CD4+CAR+ 및 CD8+CAR+ T 세포의 백분율은 도 1A, 도 1B 에 도시되어 있으며 및 도 1C는 항-CD3/항-CD28 항체 컨쥬게이션 비드 자극 시약 (CMAT)으로의 인큐베이션 이전에 투입 조성물 내 CCR7+CD27+ 세포의 백분율과 비교하여, 제조된 T 세포 조성물 내, 각각, CD4+CAR+ T 세포 또는 CD8+CAR+에 대한 CCR7+CD27+ 세포의 백분율을 도시한다. 도시된 바와 같이, 팽창 조작 공정과 비교하여, 비-팽창 조작 공정으로부터 제조된 T 세포 조성물에서 더 큰 백분율의 CCR7+CD27+이 관찰되었다.
활성화 (AMAT), 형질전환 (XMAT) 또는 배양 개시 이후 다양한 시간 (inoc +2, inoc +4 또는 inoc +5)을 포함하여, 제조 공정 동안 다양한 날에 대표 공여자로부터의 팽창 공정에 의해 생성된 세포를 추가적으로 분석한 결과, 감소된 CCR7+ CD27+ 세포의 백분율에 의해 결정된 바와 같이 세포의 팽창이 더욱 분화된 표현형과 관련이 있음을 입증한다 (도 1D).
실시예 2 :CAR-발현 T 세포에 대한 공여자 반응에서의 나이브-유사 표현형의 관계
CD19에 특이적인 키메라 항원-수용체 (CAR)를 발현하는 자가조직이식 T 세포를 함유하는 예시적인 치료적 CAR+ T 세포 조성물을 생성하였다. 항-CD19 CAR은 쥐과 항체로부터 유래된 항-CD19 scFv (FMC63으로부터 유래한 가변 영역), 면역글로불린-유래 스페이서, CD28 유래 막횡단 도메인, 4-1BB 유래 공동자극 영역, 및 CD3-제타 세포 내 신호전달 도메인을 포함하였다.
투여용 세포 조성물의 생성을 위해, 백혈구성분채집술을 통해 자가 세포를 대상체로부터 단리하였다. 백혈구성분채집술 샘플을 CAR-발현 세포의 생성 공정에 적용하였다. 상기 공정은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 정제를 위한 자동 세척 및 면역친화성 기반 선택을 이용하는 세포 세척을 포함하며, 2 가지 조성물, 즉 CD8+가 농축강화된 조성물(99% 중앙값, 세포의 Inter Quartile Range (IQR) 98-100%가 CD8+) 및 CD4 +가 농축강화된 조성물 (99% 중앙값, 세포의 Inter Quartile Range (IQR) 98-100%가 CD4+)이 각각 얻어졌다.
농축된 CD4+ 및 CD8+ 조성물의 세포를 항-CD3/항-CD28 상자성 비드로 활성화하고, 4-1BB 공동자극 도메인을 갖는 항-CD19 CAR을 인코딩하는 벡터를 사용하여 렌티바이러스 형질도입에 개별적으로 적용 하였다. 이어서, 형질도입된 집단을 세포 확장을 위한 자극 시약의 존재하에 별도로 인큐베이션하였다. 확장된 CD8+ 및 CD4+ 세포는 별도로 제제화 및 동결 보존되고 투여 전에 저장되었다. 세포 건강을 나타내는 파라미터에서, 상이한 환자 특성을 갖는 것과 같은 상이한 환자로부터 유래된 세포 조성물 및/또는 세포 조성물 사이의 변화를 최소화하기 위해, 세포를 로트에 걸쳐 일정한 부피로 유지시켰다. 세포 생성물은 좁은 범위의 생존 세포 농도를 나타냈다 (대상체 중 하나의 그룹에 대한 세포 조성물의 평가에 근거, CD8+: 중앙값 31 x 106 세포/mL, IQR 28-40 x 106 세포/mL, N=38; CD4+: 중앙값 35 x 106 세포/mL, IQR 31-40 x 106, N=36).
상기 기재된 치료적 CAR+ T 세포 조성물을 임상 연구에서 재발성 또는 불응성 (R/R) 공격형 비-호지킨성 림프종 (NHL)을 가지는 대상체에게 투여하였다. 구체적으로, 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 신생 또는 무통성 림프종으로부터 형질전환 (NOS), 고급 B-세포 림프종 (이중/삼중 유전자이상 포함), 만성 림프구성 백혈병 (CLL)로부터 형질전환된 DLBCL 또는 변연부 림프종 (MZL), 원발 종격동성 거대 b-세포 림프종 (PMBCL), 및 여포성 림프종 등급 3b (FL3B)을 포함하는 R/R NHL을 가지는 성인 인간 대상체에, 코호트는 항-CD19 CAR-발현 T 세포 조성물을 투여하였다. 전체 코호트 내의 대상체의 코어 서브세트에 대한 결과를 개별적으로 평가하였다 (열악한 전신 상태 (ECOG 2), 변연부 림프종 (MZL)으로부터 형질전환된 DLBCL 및/또는 만성 림프구성 백혈병 (CLL, Richter's)를 가지는 대상체 제외, 및 원발 종격동성 거대 b-세포 림프종 (PMBCL), 및 여포성 림프종 등급 3b (FLG3B)을 가지는 대상체 (코어 코호트)를 제외한 대상체). 코어 코호트는DLBCL, NOS 및 형질전환된 여포성 림프종 (tFL) 또는 고급 B-세포 림프종 (이중/삼중 유전자이상) 또는 DLBCL 조직학으로 MYC 및 BCL2 및/또는 BCL6 재배열을 가지는 (이중/삼중 유전자이상) 고급 B-세포 림프종을 가지는 대상체, 및 Eastern Cooperative Oncology Group 전신 상태 (ECOG PS)가 0 또는 1인 대상체를 포함하였다. 본 실시예에 제시된 시점에서의 분석은 반응에 대해 평가된 전체 코호트 (88 (코어 코호트로부터 65) 중 전체 91명의 대상체 및 항-CD19 CAR-발현 세포가 투여된 안전성에 대해 평가된 91 (코어 코호트로부터 67 )의 평가를 기초한다.
동결 보존된 항-CD19 CAR-발현 세포를 포함하는 세포 조성물을 정맥 내 투여하기 전에 해동시켰다. 치료적 T 세포 복용량은 대략 1:1의 표적 비율로, 개별적으로 투여된 제제화된 CD4+ CAR+ 세포 집단 및 제제화된 CD8+ CAR+ 집단을 투여함으로써 특정된 세포 조성물로서 투여되었다. 대상체는 다음과 같은 단일 복용량 또는 2회 복용량의 CAR-발현 T 세포를 투여받았다 (각각의 단일 복용량은 CD4+ CAR-발현 T 세포 및 CD8+ CAR-발현 T 세포를 분리 주입함에 의함): 5 x 107 전체 CAR-발현 T 세포를 함유하는 단일 복용량의 복용량 수준 1 (DL1), 또는 1 x 108 총 CAR-발현 T 세포를 함유하는 단일 복용량의 복용량 수준 2 (DL2). 일부 경우에, 대상체는 2회 복용량의 DL1을 투여받았으며, 각각의 복용량은, 대략 14 일 간격으로, 제1일 및 제14일에 투여되었으며, 이는 복용량 오류로 인하여 부주의하게 2회 복용량 일정을 통해 2번의 DL2 복용량을 받은 1 명의 대상체를 포함한다. 복용량 수준 및 DL1 및 DL2에서 투여된 조성물에 대한 T 세포 서브세트의 표적 개수가 표 E1에 제시되어 있다. 코어 코호트에서, 34명의 대상체에는 DL1을 투여하고, 27 대상체는 DL2를 투여하였다.
표 E2는 두 가지 복용량 수준의 전체 코호트 및 코어 코호트에 대한 전체 반응 및 안전성 결과를 나타낸다. 객관적 반응률 (ORR)은 완전 반응 (CR)을 나타내는 52 % 대상체를 포함하여 74 %이었다. 임의의 등급의 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 발생은 35%이었고, 1%는 중증 CRS이었고; 임의의 등급의 신경독성 (NT) 발생은 19%이었고, 1%는 중증 NT이었다.
a DL1D (복용량 수준 1, 2-복용량 일정)로 치료된 4명의 환자가 유사한 결과를 나타냄. b PD, 사망, 또는 28-일 리스테이징 스캔 사건의 환자들을 포함. 1명의 환자는 사용 가능한 리스테이징 스캔이 없었음.
c 데이터 스넵샷 28일 전에 순응 CAR-발현 세포 생성물을 적어도 1복용량을 투여 받았거나 또는 사망한 모든 대상체들을 포함.
A.
항-CD19 CAR-발현 T 세포의 세포 속성과 반응 사이의 연관성
치료적 조성물 내 CAR+ T 세포의 특정 표현형 속성과 임상 반응 결과와 연관된 파라미터 사이의 관계를 평가하였다. 조성 및 기능에서 기억 표현형 사이의 상관관계는 중추 기억 서브세트 조성 및 CAR+ 세포의 피크 생체 내 팽창 (ρ=0.42, P=0.002)과 관찰된 무진행 생존 (PFS) (카플란-마이어 생존 추정치, P=0.0164) 사이의 양의 상관관계로 번역되었다. 도 2A-2D는 CAR+ T 세포 조성물이 투여된 대상체에 대한 카플란-마이어 생존 곡선을 도시하며, 대상체는 다음을 투여받은 그룹으로 나뉜다: CD4+ CAR+ T 세포 중 CCR7+CD27+ CAR+ T 세포의 빈도를 포함하는 조성물 (도 2A : 무진행 생존, 도 2C : 반응 기간) 및 CD8+ CAR+ T 세포 중에서 특정 역치 수준 이상 또는 이하인 이를 포함하는 조성물 (도 2B : 무진행 생존, 도 2D : 반응 기간). 조성물 내 더 높은 CCR7+CD27+ 기억 세포가 더 긴 무진행 생존과 상관관계가 있는 것으로 관찰되었다.
실시예 3: 시퀀싱 및 분석 방법을 사용한 T 세포 클론성 평가
세포의 조성물은, T 세포 수용체 (TCR) 쌍의 단일 세포 시퀀싱을 사용하여 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시키기 위한 유전자 조작 이전 및 이후에 T 세포 클론성 풍부에 대해 평가하였다.
자가조직 T 세포를 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 정제를 위한 면역친화성 기반의 선별에 의한 백혈구분리를 통해 대상체로부터 단리하여, 각각, CD8+ 및 CD4+ T 세포가 풍부한, 두 개의 조성물로 수득하였다. 농축된 CD4+ 및 CD8+ 조성물의 세포를 항-CD3/항-CD28 상자성 비드로 활성화하고, 항-CD19 CAR을 인코딩하는 벡터를 사용하여 렌티바이러스 형질도입에 개별적으로 적용하였다. 항-CD19 CAR은 쥐과 항체로부터 유래된 항-CD19 scFv (FMC63으로부터 유래한 가변 영역), 면역글로불린-유래 스페이서, CD28 유래 막횡단 도메인, 4-1BB 유래 공동자극 영역, 및 CD3-제타 세포 내 신호전달 도메인을 포함하였다. 이어서, 형질도입된 집단을 세포 확장을 위한 자극 시약의 존재하에 별도로 인큐베이션하였다. CAR-발현 T 세포를 포함하는 팽창된 CD8+ 및 CD4+ 세포는 별도로 제제화 및 동결 보존하여, 저장하였다.
조작 (CMAT) 이전 단리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물의 T 세포 클론성 및 상기 기재된 공정에 의한 조작 이후 CD4+ 및 CD8+ 치료적 CAR+T 세포 조성물의 T 세포 클론성을 평가하였다. T 세포 클론성을 평가하기 위하여, 일반적으로 WO2016044227, WO2016176322 및 WO2012048340에 기재된, 단일-세포 αβ쌍 TCR 시퀀싱을 세포에 적용하였다. TCR 유전자의 바코딩된 단일-세포 시퀀싱에 기초하여, 세포 집단 내 T 세포 클론성 및 식별된 클론의 다양성을 결정하였다. 일부 경우에, 섀넌 지수(Shannon index)는 클론을 필터링하기 위한 역치로서 사용되며 (“Shannon-adjusted clonality”에, 이는 샘플 노이즈를 제거하면서 샘플 간 관계를 유지한다. 문헌 [Chaara et al. (2018) Front Immunol 9:1038]을 참조한다.
도 3은 섀넌 지수를 적용한 후 각 샘플의 클론성을 도시한다. 도 3에 도시된 바와 같이, CD4 및 CD8 세포의 클론성은 유전자 조작 이전 및 이후의 T 세포 조성물 사이에서 상이하였으며, 조작된 CAR+ T 세포 조성물은 세포 조작 공정의 개시 이전 조성물 내 T 세포와 비교하여 클론성이 감소됨을 나타냈다.
유전자 조작 이후의 CD4+ 및 CD8+ 치료적 CAR+T 세포 조성물은 세포 사멸을 나타내는 인자, 예컨대 아넥신 V (아넥신 V-) 또는 카스파제 3 절단에 의한 표면 염색 (비-세포사멸 세포을 나타냄)의 유세포 분석 발현, 및 CD45RA, CCR7, CD27, CD4 및 CD8을 비롯한 다양한 표면 마커의 발현에 의해 분류하였다. 세포 표현형은 세포 클론성의 정도돠 상관 관계가 있었다. CD4+ 및 CD8+ 치료적 CAR+T 세포 조성물 모두에서, CCR7-/CD27-인 세포사멸 마커-음성 세포의 존재는 조성물 내 세포 클론성과 높은 양의 상관 관계가 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, CCR7+ 또는 CCR7+/CD27+인 세포사멸 마커-음성 세포의 존재는 CD4+ 및 CD8+ 치료적 CAR+T 세포 조성물 각각에서 세포의 클론성과 음의 상관관계가 있었다. 이러한 결과는, 세포의 클론성이 CCR7 및/또는 CD27 양성에 의해 측정된 바와 같이 덜 분화된 나이브-유사 세포와 역의 상관관계가 있을 수 있다는 관찰과 일치한다.
본 발명은, 예를 들어 본 발명의 다양한 측면을 예시하기 위해 제공되는 특정의 개시된 구현예에 대한 범위 내로 제한하려는 의도는 아니다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본 명세서의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본 개시의 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않고 실시될 수 있으며 본 개시의 범위 내에 속하도록 의도된 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> JUNO THERAPEUTICS, INC.
BONYHADI, Mark L.
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREPARING
GENETICALLY ENGINEERED CELLS
<130> 735042010540
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> 62/543,359
<151> 2017-08-09
<160> 59
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Spacer (IgG4hinge)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Spacer (IgG4hinge)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Hinge-CH3 spacer
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Hinge-CH2-CH3 spacer
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
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<211> 282
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IgD-hinge-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
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145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
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195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 6
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Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
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1 5 10 15
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35 40 45
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Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
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100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
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275 280 285
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Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
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340 345 350
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355
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
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<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 8
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20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 9
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28
<300>
<308> UniProt P10747
<309> 1989-07-01
<400> 10
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35 40
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<211> 41
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD28
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Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
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Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
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<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> 4-1BB
<300>
<308> UniProt Q07011.1
<309> 1995-02-01
<400> 12
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20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
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65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> CD3 zeta
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
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180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
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260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
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<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8 alpha signal peptide
<400> 18
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1 5 10 15
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<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 19
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P2A
<400> 20
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 21
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2A
<400> 21
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2A
<400> 22
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<220>
<221> REPEAT
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG is repeated 5 times
<400> 23
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 24
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 25
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFR alpha chain signal sequence
<400> 25
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atccca 66
<210> 26
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFR alpha chain signal sequence
<400> 26
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 27
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 27
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 28
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Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
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Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 29
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
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<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 31
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 32
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
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<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 33
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<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 LC-CDR3
<400> 34
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 35
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 36
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
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<220>
<223> FMC63 CDR L3
<400> 37
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1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 CDR H1
<400> 38
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1 5
<210> 39
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 CDR H2
<400> 39
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 CDR H3
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1 5
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<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 VH
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100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 VL
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
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35 40 45
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 scFv
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR L1
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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR L2
<400> 45
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR L3
<400> 46
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR H1
<400> 47
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR H2
<400> 48
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 CDR H3
<400> 49
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 122
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 VH
<400> 50
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 VL
<400> 51
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 52
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 53
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SJ25C1 scFv
<400> 53
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 HC-CDR3
<400> 54
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FMC63 LC-CDR2
<400> 55
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 56
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 57
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence encoding scFv
<400> 57
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)...(1)
<223> Xaa1 is glycine, cysteine or arginine
<220>
<221> VARIANT
<222> (4)...(4)
<223> Xaa4 is cysteine or threonine
<400> 58
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hinge
<400> 59
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Claims (91)
- 다음의 단계를 포함하는, T 세포를 유전적으로 조작하는 방법:
(a) 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 생성하는 단계로서, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하고, 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약을 포함하는 단계; 및
(b) 유전자 조작된 재조합 수용체를 T 세포의 자극된 조성물로 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 상기 도입 단계는 적어도 인큐베이션 단계의 일부 동안 수행되는 단계. - T 세포를 유전적으로 조작하는 방법으로서,
상기 방법은 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 생성하는 단계로서, 상기 투입 세포의 집단은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 단계를 포함하며, 여기서:
자극 조건이 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약의 존재를 포함하고; 및
자극 조건하에서 투입 조성물의 인큐베이션 단계는 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전, 동안 및 또는 이후 수행되는 것인 방법. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 인큐베이션 단계는 적어도 3 일 동안 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 인큐베이션 단계는 적어도 4 일 동안 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 인큐베이션 단계는 적어도 5 일 동안 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 인큐베이션 단계는 적어도 6 일 동안 수행되는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, T 세포를 자극하는 방법:
(a) 자극 조건하에서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양-개시량을 포함하는 T 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 제조하는 단계로서, 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약의 존재를 포함하여, 자극된 조성물을 생성하는 단계; 및
(b) 자극된 세포 조성물 내로 유전자 조작된 재조합 수용체를 코딩하는 핵산을 도입하는 단계,
여기서 상기 방법은 이에 따라 유전자 조작된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성하는 것인 방법. - 청구항 7에 있어서, T 세포는 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하며, 이러한 자극 조건은 자극된 조성물 내 비-나이브 유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 팽창 또는 증식을 우선적으로 유도하는 것인 방법.
- 청구항 7 또는 청구항 8에 있어서, 상기 도입 단계는 적어도 인큐베이션의 일부 동안 수행되거나, 또는 인큐베이션 이후 수행되는 것인 방법.
- 청구항 7-9 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 (약) 0.1 x 108 내지 5 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 4 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 2 x 108, (약) 0.1 x 108 내지 1 x 108, (약) 1 x 108 내지 5 x 108 (약) 1 x 108 내지 4 x 108, (약) 1 x 108 내지 2 x 108, (약) 2 x 108 내지 5 x 108, (약) 2 x 108 내지 4 x 108개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트인 것인 방법.
- 청구항 7-10 중 어느 하나에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 적어도 (약) 0.5 x 108, 0.75 x 108, 1 x 108, 1.5 x 108, 2 x 108, 또는 4 x 108 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트인 것인 방법.
- 청구항 7-11 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 적어도 (약) 2 x 108 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트인 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, T 세포를 자극하는 방법:
나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양-개시량으로 (약) 1 x 108 내지 4 x 108 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트를 포함하는 T 세포를 포함하는 투입 조성물을 인큐베이션하여, 자극된 조성물을 제조하는 단계로서, 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분 중 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극 시약의 존재를 포함하여, 자극된 조성물을 생성하는 단계. - 청구항 13에 있어서, T 세포는 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하며, 상기 자극 조건은 자극된 조성물 내 비-나이브 유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 팽창 또는 증식을 우선적으로 유도하는 것인 방법.
- 청구항 13 또는 청구항 14에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트의 배양 개시량은 적어도 (약) 2 x 108 개의 나이브-유사 T 세포 또는 이의 CD8+ T 세포 서브세트인 것인 방법.
- 청구항 7-15 중 어느 한 항에 있어서, 배양 개시량은 나이브-유사 CD8+ T 세포의 양인 것인 방법.
- 청구항 1-16 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 CD8+ T 세포는:
CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는
CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는
CD95의 발현이 낮고; 및/또는
IL-2, IFN-γIL-4, IL-10으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현에 대해 음성인 것인 방법. - 청구항 1-16 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 세포 또는 나이브-유사 CD8+ 세포는:
CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는
CD45RO, CD56, KLRG1으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는
CD95의 발현이 낮은 것인 방법. - 청구항 1-18 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 T 세포 또는 나이브-유사 CD8+ 세포는 CD45RA+, CD27+, CCR7+, 및/또는 CD45RO-인 것인 방법.
- 청구항 1-7, 8-12 및 14-19 중 어느 한 항에 있어서, 비-나이브-유사 T 세포는:
CD45RA, CD27, CD28, 및 CCR7으로 구성된 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 음성이고; 및/또는
CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1, 및 퍼포린으로 구성된 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 양성이고; 및/또는
IL-2, IFN-γIL-4, IL-10으로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현에 대해 양성이고; 및/또는
CD95의 발현이 높은 것인 방법. - 청구항 1-7, 8-12 및 14-20 중 어느 한 항에 있어서, 비-나이브-유사 T 세포는 CD45RA-, CD27-, CCR7-, 및/또는 CD45RO+인 것인 방법.
- 청구항 1-21 중 어느 한 항에 있어서, 투입 조성물의 세포는 인큐베이션 단계 이전에, 나이브-유사와 비-나이브-유사 T 세포 사이에서 분화하는 내인성 T 세포 표면 마커에 기초하는 선별 단계를 거치지 않았거나, 또는 거치지 않는 것인 방법.
- 청구항13-22 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 조작된 재조합 수용체를 자극된 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하며,
상기 방법은 이에 따라 유전자 조작된 재조합 수용체를 발현하는 T 세포를 포함하는 산출 조성물을 생성하는 것인 방법. - 청구항23에 있어서, 자극 조건하에서 조성물의 인큐베이션 단계는 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전, 동안 및 또는 이후 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-12 및 23-24 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 질병, 장애 또는 병태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인, 및/또는 이에 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것인 방법.
- 청구항 25에 있어서, 질병, 장애 또는 병태는 감염성 질병 또는 장애, 자가면역 질병, 염증성 질병, 또는 종양 또는 암인 것인 방법.
- 청구항 25 또는 청구항 26에 있어서, 표적 항원은 종양 항원인 것인 방법.
- 청구항 25-27 중 어느 한 항에 있어서, 표적 항원은 αvβ인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), 탄산무수화효소 9 (CAIX), Her2/neu (수용체 타이로신 키나제 erbB2), L1-CAM, B7-H3, B7-H6, 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250로도 알려짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로도 알려짐), 암배아 항원 (CEA), ? B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), 표피 성장 인자 단백질 (EGFR), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 이합체, III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 엽산 결합 단백질 (FBP), Fc 수용체 유사 5 (FCRL5; 또한 Fc 수용체 동족체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (fetal AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD3, 글리피칸-3 (GPC3), G 단백질 연결 수용체 5D (GPRC5D), Her2/neu (수용체 타이로신 키나제 erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원 (HMW-MAA), 간염 B 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Rα2), 키나제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 유착 분자 (L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 풍부 반복 함유 8 패밀리 구성원 A (LRRC8A), Lewis Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린 (MSLN), c-Met, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 천연 세포 유착 분자 (NCAM), 종양태아성 항원, 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 멤브레인 항원 (PSMA), 수용체 타이로신 키나제 유사 고아 수용체 1 (ROR1), 서바이빈, 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), 종양-관련 당단백 72 (TAG72), 티로시나아제 관련 단백질 1 (TRP1, 또한 TYRP1 또는 gp75로도 알려짐), 티로시나아제 관련 단백질 2 (TRP2, 또한 도파크롬 토토머라제, 도파크롬 델타-아이소머라제 또는 DCT로도 알려짐), 엽산 수용체-a, 8H9, 이중 항원, 당단백 100 (gp100), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGF-R2), 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, Wilms 종양 1 (WT-1), 병원체-특이 또는 병원체-발현 항원, 및 보편적인 표지와 관련된 항원에 의해 발현되는 분자로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 1-12 및 23-28 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 기능적 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 이의 항원-결합 단편이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-12 및 23-29 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체 (CAR)인 것인 방법.
- 청구항 1-12 및 23-30 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 수용체는 표적 항원에 특이절으로 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는 세포 외 도메인 및 ITAM을 포함하는 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 31에 있어서, 항원-결합 도메인은 항체 또는 이의 항체 단편이거나, 또는 이를 포함하며, 선택적으로 단일 사슬 단편인 것인 방법.
- 청구항 31 또는 청구항 32에 있어서, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로 CD3-제타 (CD3ζ) 사슬의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 이의 신호전달 부분이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 31-33 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 신호전달 영역은 공동자극 신호전달 영역을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 34에 있어서, 공동자극 신호전달 영역은 T 세포 공동자극 분자의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 34 또는 청구항 35에 있어서, 공동자극 신호전달 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포 내 신호전달 도메인 또는 이의 신호전달 부분을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 30-36 중 어느 한 항에 있어서,
CAR은, 순서대로, 항원에 특이적인 scFv, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB이거나 이를 포함), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인이거나, 이를 포함)을 포함하며, 선택적으로 막횡단 도메인과 scFv 사이의 스페이서를 추가로 포함하거나;
CAR은, 순서대로, 항원에 특이적인 scFv, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB 신호전달 도메인이거나 이를 포함), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인)을 포함하거나; 또는
CAR은, 순서대로, 항원에 특이적인 scFv, 스페이서, 막횡단 도메인, 공동자극 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 4-1BB 신호전달 도메인이거나 이를 포함), 및 1차 신호전달 ITAM-함유 분자로부터 유도된 세포질 신호전달 도메인 (선택적으로 CD3제타 신호전달 도메인이거나, 이를 포함)을 포함하는 것인 방법. - 청구항 1-37 중 어느 한 항에 있어서, 자극 시약은 TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합하는 1차 시제를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-38 중 어느 한 항에 있어서, 자극 시약은 CD3에 특이적으로 결합하는 1차 시약을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 38 또는 청구항 39에 있어서, 1차 시제는 항체 또는 항원-결합 단편인 것인 방법.
- 청구항 38 또는 청구항 39에 있어서, 자극제는 T 세포 공동자극 분자에 대해 특이적으로 결합하는 2차 시제를 추가로 포함하며, 선택적으로 공동자극 분자는 CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, 또는 ICOS으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 41에 있어서, 1차 시제는 항체 또는 항원-결합 단편인 것인 방법.
- 청구항 1-40 중 어느 한 항에 있어서, 자극 시약은 항-CD3 항체인 1차 시제 및 항-CD28 항체인 2차 시제를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 38-43 중 어느 한 항에 있어서, 1차 및/또는 2차 시제는 고체 지지체의 표면에 존재하는 것인 방법.
- 청구항 44에 있어서, 고체 지지체는 비드이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 45에 있어서, 비드는 직경이 (약) 3.5 μm 이상이지만, 약 9 μm 이하, 또는 약 8 μm 이하, 또는 약 7 μm 이하, 또는 약 6 μm 이하, 또는 약 5 μm 이하인 것인 방법.
- 청구항 45 또는 청구항 46에 있어서, 비드는 직경이 (약) 4.5 μm인 것인 방법.
- 청구항 45-47 중 어느 한 항에 있어서, 비드는 직경이 림프구 또는 항원 제시 세포와 동일하거나 또는 대략 동일한 것인 방법.
- 청구항 45-48 중 어느 한 항에 있어서, 비드는 불활성인 것인 방법.
- 청구항 45-49 중 어느 한 항에 있어서, 비드는 폴리스타이렌 표면이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 45-50 중 어느 한 항에 있어서, 비드는 자성 또는 초상자성 코어를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 45-51 중 어느 한 항에 있어서, 자극 조건은 비드 대 세포의 비율이 (약) 1:1 내지 10:1, (약) 1:1 내지 8:1, (약) 1:1 내지 6:1, (약) 1:1 내지 4:1, (약) 1:1 내지 3:1, (약) 2:1 내지 4:1, (약) 2:1 내지 3:1, (약) 1:1 내지 2:1, (약) 4:1 내지 10:1, (약) 4:1 내지 8:1, (약) 4:1 내지 6:1, (약) 6:1 내지 10:1, (약) 6:1 내지 8:1, (약) 8:1 내지 10:1, (약) 1:1 내지 1:10, (약) 1:1 내지 1:8, (약) 1:1 내지 1:6, (약) 1:1 내지 1:4, (약) 1:2 내지 1:3인 비율로 세포와의 인큐베이션을 포함하는 것인 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, T 세포를 유전적으로 조작하는 방법:
(a) 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하는 단계로서, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하고, 자극 조건은 항-CD3 항체 및 비드에 부착된 항-CD28 항체인 2차 시제를 포함하는 자극 시약을 포함하며, 인큐베이션 동안 비드 대 세포의 비율이 (약) 1:1 내지 4:1인 단계; 및
(b) 유전자 조작된 재조합 수용체를 T 세포의 자극된 조성물로 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계로서, 상기 도입 단계는 적어도 인큐베이션 단계의 일부 동안 수행되는 단계. - T 세포를 유전적으로 조작하는 방법으로서,
상기 방법은 자극 조건하에서, 2 내지 6 일 동안, 투입 조성물을 인큐베이션하는 단계로서, 상기 투입 조성물은 나이브-유사 T 세포 및 비-나이브-유사 T 세포를 포함하는 T 세포의 집단을 포함하는 단계를 포함하며, 여기서:
자극 조건은 항-CD3 항체 및 비드에 부착된 항-CD28 항체인 2차 시제를 포함하는 자극 시약을 포함하며, 인큐베이션 동안 비드 대 세포의 비율은 (약) 1:1 내지 4:1이며; 및
자극 조건하에서 투입 조성물의 인큐베이션 단계는 유전자 조작된 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 도입하기 이전, 동안 및 또는 이후 수행되는 것인 방법. - 청구항 52-54 중 어느 한 항에 있어서, 비드 대 세포의 비율은 (약) 3:1인 것인 방법.
- 청구항52-54 중 어느 한 항에 있어서, 비드 대 세포의 비율은 (약) 1:1인 것인 방법.
- 청구항 1-56 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 생물학적 샘플로부터 유래하며, 선택적으로 생물학적 샘플은 인간 대상체로부터 유래하는 것인 방법.
- 청구항 57에 있어서, 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 샘플, 분별되지 않은 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 성분채집 생성물, 또는 백혈구성분채집 생성물이거나, 또는 이를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-58 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-59 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하고, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 (약) 2:1 내지 (약) 1:5인 것인 방법.
- 청구항 1-60 중 어느 한 항에 있어서, T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하며, CD4+ 세포 대 CD8+ 세포의 비율은 (약) 1:1, 1:2, 2:1, 1:3, 또는 3:1인 것인 방법.
- 청구항 1-61 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 T 세포는 나이브-유사 CD4+ T 세포 및/또는 나이브-유사 CD8+ T 세포인 것인 방법.
- 청구항 1-62 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 T 세포는 다클론성인 것인 방법.
- 청구항1-63 중 어느 한 항에 있어서, 자극 조건은 N-아세틸시스테인 (NAC)을 포함하지 않는 것인 방법.
- 청구항 1-63 중 어느 한 항에 있어서, 자극 조건은 IL-15 및/또는 IL-7을 포함하지 않는 것인 방법.
- 청구항 1-65 중 어느 한 항에 있어서, 자극 조건은 사멸 또는 비-나이브 유사 T 세포 또는 이의 서브집단을 야기하거나 또는 유도하는 것인 방법.
- 청구항 1-66 중 어느 한 항에 있어서, 자극 조건은 비-나이브 유사 T 세포 또는 이의 서브집단의 활성화-유도 세포 사멸 (AICD)을 야기하는 것인 방법.
- 청구항 1-67 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 동안 및/또는 자극된 조성물에 DNAase를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
- 청구항 7-65 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16 일 이상 동안 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-69 중 어느 한 항에 있어서, 나이브-유사 T 세포로부터 유래된, 자극된 조성물 내 세포 백분율은 투입 조성물 내 나이브-유사 세포의 백분율과 비교하여 (약) 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 50 배, 100 배 이상 증가되는 것인 방법.
- 청구항 1-70 중 어느 한 항에 있어서, 자극된 조성물 내, 비-나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포로부터 유래한 세포의 비율은, 투입 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 비율과 비교하여 (약) 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배 , 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 50 배, 100 배 이상 증가하는 것인 방법.
- 청구항 1-71 중 어느 한 항에 있어서, 자극된 조성물은 투입 조성물의 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 세포의 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-72 중 어느 한 항에 있어서, 자극된 조성물은 비-나이브 유사 T 세포로부터 유래된 세포의 10 % 미만을 포함하는 것인 방법.
- 청구항1-73 중 어느 한 항에 있어서, 자극된 조성물은 비-나이브 T 세포로부터 유래된 세포의 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 이하를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1-74 중 어느 한 항에 있어서, 투입 조성물 내 세포 중에서, 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 더 큰 백분율의 나이브-유사 T 세포가 증식 및/또는 활성화되도록 유도되는 것인 방법.
- 청구항 1-75 중 어느 한 항에 있어서, 투입 조성물 내 나이브-유사형이었던 T 세포의 더 큰 백분율은 투입 조성물 내 비-나이브-유사형이었던 T 세포의 백분율과 비교하여, 상기 인큐베이션의 개시 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일에 분열하는 것인 방법.
- 청구항 1-76 중 어느 한 항에 있어서, 자극 조건은, 이러한 조건하에서 인큐베이션의 개시 이후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일에, 인간 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 더 큰 백분율의 인간 나이브-유사 T 세포 집단의 세포의 증식을 유도할 수 있는 것인 방법.
- 청구항 1-77 중 어느 한 항에 있어서, (i) 비-나이브-유사 T 세포는 효과기 T (TEFF) 세포, 기억 T 세포, 중추 기억 T 세포 (TCM), 효과기 기억 T (TEM) 세포, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 (ii) 비-나이브-유사 T 세포는 효과기 T (TEFF) 세포 및/또는 기억 T 세포를 포함하는 또는 이로 구성되며, 여기서 기억 T 세포는 선택적으로 중추 기억 T 세포 (TCM) 및/또는 효과기 기억 T (TEM) 세포를 포함하는, 복수의 T 세포인 것인 방법.
- 청구항 1-78 중 어느 한 항에 있어서,
투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포의 백분율은 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포로부터 유래된 자극된 조성물 내 조작된 세포의 백분율보다 작은 것인 방법. - 청구항 1-12 및 23-79에 있어서, 핵산과 함께 도입된 세포의 더 많은 백분율은, 투입 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 투입 조성물 내 나이브-유사 T 세포의 증식이거나, 또는 이로부터 유래되는 것인 방법.
- 청구항 1-12 및 23-80 중 어느 한 항에 있어서, 도입은 재조합 수용체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터로 형질전환에 의한 것인 방법.
- 청구항 81에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
- 청구항 81 또는 청구항 82에 있어서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
- 청구항 1-83 중 어느 한 항에 있어서, 자극된 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여, 나이브-유사 T 세포의 비율은 투입 조성물 내 비-나이브-유사 T 세포와 비교하여 나이브-유사 T 세포의 비율과 비교하여 (약) 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 50 배, 100 배 이상 증가하는 것인 방법.
- 청구항 1-84 중 어느 한 항에 있어서, 자극된 조성물운 투입 조성물과 비교하여 더욱 다클론성이거나 또는 다클론성인 것인 방법.
- 청구항 1-85 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외에서 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1-86 중 어느 한 항에 의해 제조된 산출 조성물.
- 청구항 87의 산출 조성물을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
- 청구항 88에 있어서, 약제학적 담체를 추가로 포함하는 것인 약제학적 조성물.
- 포유동물 대상체에게, 청구항 1-6에 의해 제조된 산출 조성물 또는 청구항 88 또는 청구항 89의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
- 청구항 90에 있어서, 세포는 세포가 투여되는 대상체로부터 유래하는 것인 방법.
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