CN101421298A

CN101421298A - 用于治疗免疫相关疾病的新组合物和方法

Info

Publication number: CN101421298A
Application number: CNA2004800448277A
Authority: CN
Inventors: 希拉里·克拉克; 丹尼尔·L·伊顿; 伯恩德·兰尼克; 欧阳文军; 利诺·冈萨雷兹; 凯利·M·洛耶特
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2004-11-12
Filing date: 2004-11-12
Publication date: 2009-04-29
Also published as: JP4901747B2; KR20070086020A; MX2007005612A; KR101224659B1; AU2004325035B2; CA2586615A1; IL182643A; WO2006054961A2; IL228819A0; IL182643A0; AU2004325035A2; EP1812465B1; CA2586615C; ES2602731T3; EP1812465A1; JP2008519599A; BRPI0419117A; AU2004325035A1

Abstract

本发明涉及含有新的蛋白质的组合物及使用这些组合物来诊断和治疗免疫相关疾病的方法。

Description

用于治疗免疫相关疾病的新组合物和方法

发明领域

本发明涉及可用于诊断和治疗免疫相关疾病的组合物和方法。

发明背景

免疫相关和炎性疾病是相当复杂的、常常是多个互联的生物学途径的表现或结果，这些生物学途径在正常生理学中对于应答攻击或损伤、启动对攻击或损伤的修复、和发动针对外来生物体的先天性和获得性防御是至关重要的。在这些正常生理学途径引起另外的攻击或损伤时，或是与应答的强度直接相关，作为异常调节或过度刺激的后果，作为与自身的反应，或者作为上述的组合，发生疾病或病理学。

尽管这些疾病的起源常常牵涉多步骤途径，而且常常是多个不同的生物学系统/途径，一个或多个这些途径中临界点的干预可具有改善或治疗效果。治疗性干预可以通过有害过程/途径的拮抗作用或有益过程/途径的刺激作用而发生。

许多免疫相关疾病是已知的，而且已经广泛研究。此类疾病包括免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、传染病、免疫缺陷病、瘤形成等。

T淋巴细胞(T细胞)是哺乳动物免疫应答的一种重要成分。T细胞识别与由主要组织相容性复合物(MHC)内基因编码的自身分子关联的抗原。抗原可以与MHC分子一起展示在抗原呈递细胞、病毒感染细胞、癌细胞、移植物等的表面上。T细胞系统消除这些对宿主哺乳动物构成健康威胁的改变的细胞。T细胞包括辅助性T细胞和细胞毒性T细胞。辅助性T细胞在识别抗原呈递细胞上的抗原-MHC复合物后广泛增殖。辅助性T细胞还分泌在B细胞、细胞毒性T细胞和参与免疫应答的多种其它细胞的激活中扮演重要角色的多种细胞因子，即淋巴因子。

免疫相关疾病可通过遏制免疫应答来治疗。使用抑制具有免疫刺激活性的分子的中和性抗体在免疫介导的和炎性的疾病的治疗中将是有益的。抑制免疫应答的分子可用于抑制免疫应答及因此改善免疫相关疾病(蛋白质直接使用或经由抗体激动剂的使用)。

CD4+T细胞已知是炎症的重要调节物。在此，激活了CD4+T细胞，并分析了在激活时差异表达的基因谱。如此，激活特异基因可能是潜在的治疗靶。体内共刺激是生产性免疫增殖应答所必需的。共刺激分子表相当广泛，而且仍然不清楚是哪些共刺激分子在不同类型和阶段的炎症中扮演重要角色。

术语炎性肠紊乱(“IBD”)描述了起因未知的一组慢性炎性紊乱，其中肠变成发炎，常常引起反复的腹部绞痛或腹泻。IBD在美国的流行程度估计是约200例每100,000人。IBD患者可分成两大组，具有溃疡性结肠炎(“UC”)的和具有克罗恩氏(Crohn)病的(“CD”)。

在有UC的患者中，存在主要牵涉结肠粘膜的炎性反应。炎症通常是均匀且连续的，没有正常粘膜的居间区。表面粘膜细胞以及隐窝上皮和粘膜下层牵涉炎性反应且伴有嗜中性粒细胞浸润。最终，这种情形通常发展成上皮损伤，且上皮细胞的丧失导致结肠的多处溃疡、纤维化、发育异常和纵向退缩。

CD与UC的不同之处在于炎症延伸穿过肠壁的所有层，而且牵涉肠系膜以及淋巴结。CD可影响消化道的任何部分，从口至肛门。该病常常是不连续的，即严重患病肠段与表观无病区分开。在CD中，肠壁还增厚，这可导致闭塞。另外，瘘和裂隙不是罕见的。

临床上，IBD的特征为常常导致慢性、不可预测的进程的多种多样表现。血性腹泻和腹痛常常伴有发烧和体重减轻。贫血不是罕见的，正如严重的疲劳。范围从关节痛至急性关节炎的关节表现以及肝功能异常常常与IBD有关。与一般人群相比，IBD患者还具有升高的结肠癌风险。在IBD急性“发作”期间，工作和其它正常活动通常是不可能的，患者通常入院。

尽管IBD的起因仍然未知，已经牵连几种因素，诸如遗传、感染和免疫学易感性。IBD在高加索人(白种人)中常见得多，尤其是犹太人后裔。该状况的慢性炎性性质促使深入研究可能的感染原因。尽管已经找到了激发急性炎症的因素，尚未找到引起与IBD有关的慢性炎症的因素。IBD是自身免疫病的假说得到先前所述IBD的肠外表现有关节关节炎及通过诸如肾上腺糖皮质激素、环孢霉素和硫唑嘌呤等治疗剂的处理对IBD的已知积极响应已知遏制免疫应答的支持。另外，胃肠道比机体的任何其它器官更多的连续暴露于潜在抗原性物质诸如来自食物的蛋白质、细菌副产物(LPS)等。

另外，结肠癌的风险在具有严重溃疡性结肠炎的患者中高度升高，特别是如果该病已经存在了数年的话。由于大量出血、慢性虚弱性不适、结肠穿孔、或癌症风险，约20-25％的IBD患者最终需要手术切除结肠。在其它形式的医学处理失败时或者在类固醇或其它药物的副作用威胁患者健康时，有时也进行手术。因为手术是侵入性的且彻底改变生活，它不是非常想要的治疗方案，而且通常是最后求助的治疗方法。为了更好的理解这种疾病及(可能的话)治疗它，进行实验以确定在CD和UC二者中与正常组织相比都上调的基因。

尽管有上文鉴定的免疫紊乱研究中的进展，非常需要能够检测哺乳动物中是否存在免疫紊乱和有效降低这些紊乱的另外的诊断剂和治疗剂。因此，本发明的一个目的是鉴定和表征牵涉多种免疫紊乱、在多种免疫细胞中过表达的多肽，及使用该多肽和编码核酸来生成可用于哺乳动物中免疫紊乱的治疗性处理和诊断性检测的组合物。

发明概述

A.实施方案

本发明关注可用于在哺乳动物，包括人中诊断和治疗免疫相关疾病的组合物和方法。本发明基于蛋白质(包括激动性和拮抗性抗体)的鉴定，那是在哺乳动物中激发免疫应答的结果。免疫相关疾病可通过遏制或增强免疫应答来治疗。增强免疫应答的分子激发或加强对抗原的免疫应答。激发免疫应答的分子可用于其中增强免疫应答将是有益的治疗。或者，遏制免疫应答的分子削弱或降低对抗原的免疫应答(例如中和性抗体)。遏制免疫应答的分子可用于其中削弱免疫应答将是有益的治疗(例如炎症)。因此，PRO87299多肽、其激动剂和拮抗剂还可用于制备用于治疗免疫相关和炎性疾病的药物和药品。在一个具体的方面，此类药物和药品包含治疗有效量的PRO87299多肽、其激动剂或拮抗剂及药学可接受载体。优选的是，混合物是无菌的。

在又一个实施方案中，本发明关注鉴定PRO87299多肽的激动剂或拮抗剂的方法，包括使PRO87299多肽接触候选分子并监测由所述PRO87299多肽介导的生物学活性。优选的是，PRO87299多肽是天然序列PRO87299多肽。在一个具体的方面，PRO87299激动剂或拮抗剂是抗PRO87299抗体。

在另一个实施方案中，本发明关注包含PRO87299多肽或结合该多肽的激动性或拮抗性抗体且其与载体或赋形剂混合的组合物。在一个方面，组合物包含治疗有效量的多肽或抗体。在另一个方面，当组合物包含免疫激发分子时，该组合物可用于：(a)增加炎性细胞浸润进入有所需要的哺乳动物的组织，(b)激发或增强有所需要的哺乳动物中的免疫应答，(c)增加有所需要的哺乳动物中免疫细胞应答抗原的增殖，(d)激发免疫细胞的活性，或(e)增加血管通透性。在又一个方面，当组合物包含免疫抑制分子时，该组合物可用于：(a)降低炎性细胞浸润进入有所需要的哺乳动物的组织，(b)抑制或降低有所需要的哺乳动物中的免疫应答，(c)降低免疫细胞的活性，或(d)降低有所需要的哺乳动物中免疫细胞应答抗原的增殖。在另一个方面，组合物包含其它活性成分，它们可以是例如其它抗体或者细胞毒剂或化疗剂。优选的是，组合物是无菌的。

在另一个实施方案中，本发明关注在有所需要的哺乳动物中治疗免疫相关紊乱的方法，包括对哺乳动物施用有效量的PRO87299多肽、其激动剂、或其拮抗剂。在一个优选的方面，所述免疫相关紊乱选自：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼发型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏(

)综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病和惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主病。

在另一个实施方案中，本发明提供了特异性结合任何上述或下述多肽的抗体。任选的是，抗体是单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段或单链抗体。在一个方面，本发明关注结合PRO87299多肽的分离的抗体。在另一个方面，抗体模拟PRO87299多肽的活性(激动性抗体)，或者相反，抗体抑制或中和PRO87299多肽的活性(拮抗性抗体)。在另一个方面，抗体是单克隆抗体，优选具有非人互补决定区(CDR)残基和人框架区(FR)残基。抗体可以进行标记，而且可以固定在固相支持物上。在又一个方面，抗体是抗体片段、单克隆抗体、单链抗体、或抗独特型抗体。

在还有一个实施方案中，本发明提供了包含抗PRO87299抗体且其与药学可接受载体混合的组合物。在一个方面，组合物包含治疗有效量的抗体。优选的是，组合物是无菌的。组合物可以以液体药物剂型的形式施用，它可以保存以实现延长的贮藏稳定性。或者，抗体是单克隆抗体、抗体片段、人源化抗体、或单链抗体。

在又一个实施方案中，本发明关注制品，其包括：

(a)包含PRO87299多肽或其激动剂或拮抗剂的组合物；

(b)装有所述组合物的容器；和

(c)贴在所述容器上的标签或包括在所述容器中的包装插页，指出所述PRO87299多肽或其激动剂或拮抗剂在治疗免疫相关疾病中的用途。组合物可包含治疗有效量的PRO87299多肽或其激动剂或拮抗剂。

在还有一个实施方案中，本发明关注在哺乳动物中诊断免疫相关疾病的方法，包括检测(a)从哺乳动物获得的组织细胞的测试样品中和(b)相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品中编码PRO87299多肽的基因的表达水平，其中测试样品中与对照样品相比表达水平更高或更低指示获取测试组织细胞的哺乳动物中存在免疫相关疾病。

在另一个实施方案中，本发明关注在哺乳动物中诊断免疫病的方法，包括：(a)使抗PRO87299抗体接触从哺乳动物获得的组织细胞的测试样品，并(b)检测测试样品中是否形成抗体和PRO87299多肽之间的复合物，其中所述复合物的形成指示所述疾病的存在与否。检测可以是定性的或定量的，而且可以与监测相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品中复合物形成比较进行。测试样品中形成更大量的复合物指示获取测试组织细胞的哺乳动物中免疫病的存在与否。抗体优选携带可检测标记物。复合物形成可通过例如光学显微镜检术、流式细胞术、荧光测定法或本领域已知的其它技术来监测。测试样品通常从怀疑患有免疫系统缺陷或异常的个体获得的。

在另一个实施方案中，本发明提供了检测样品中是否存在PRO87299多肽的方法，包括使怀疑含有PRO87299多肽的细胞的测试样品暴露于抗PRO87299抗体并测定所述抗体与所述细胞样品的结合。在一个具体的方面，样品包含怀疑含有PRO87299多肽的细胞，而抗体结合该细胞。抗体优选进行可检测标记和/或结合于固相支持物。

在另一个实施方案中，本发明关注免疫相关疾病诊断试剂盒，包括合适包装的抗PRO87299抗体和载体。试剂盒优选包括使用抗体检测PRO87299多肽是否存在的说明书。优选的是，载体是药学可接受的。

在另一个实施方案中，本发明关注诊断试剂盒，包括合适包装的抗PRO87299抗体。试剂盒优选包括使用抗体检测PRO87299多肽的说明书。

在另一个实施方案中，本发明提供了在哺乳动物中诊断免疫相关疾病的方法，包括检测从所述哺乳动物获得的组织细胞的测试样品中是否存在PRO87299多肽，其中所述测试样品中PRO87299多肽的存在与否指示所述哺乳动物中存在免疫相关疾病。

在另一个实施方案中，本发明关注鉴定PRO87299多肽的激动剂的方法，包括：

(a)在适于诱导通常由PRO87299多肽诱导的细胞应答的条件下使细胞和待筛选测试化合物接触；并

(b)测定所述细胞应答的诱导以确定该测试化合物是否是有效的激动剂，其中所述细胞应答的诱导指示所述测试化合物是有效的激动剂。

在另一个实施方案中，本发明关注鉴定能够抑制PRO87299多肽活性的化合物的方法，包括使候选化合物与PRO87299多肽在足以容许这两种成分相互作用的条件和时间下接触，并测定PRO87299多肽活性是否受到抑制。在一个具体的方面，候选化合物或PRO87299多肽中任一固定在固相支持物上。在另一个方面，非固定化成分携带可检测标记物。在一个优选的方面，此方法包括如下步骤：

(a)在存在PRO87299多肽时在适于诱导通常由PRO87299多肽诱导的细胞应答的条件下使细胞和待筛选测试化合物接触；并

(b)测定所述细胞应答的诱导以确定该测试化合物是否是有效的拮抗剂。

在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定抑制PRO87299多肽在通常表达该多肽的细胞中表达的化合物的方法，其中所述方法包括使细胞与测试化合物接触并测定PRO87299多肽表达是否受到抑制。在一个优选的方面，此方法包括如下步骤：

(a)在适于容许PRO87299多肽表达的条件下使细胞和待筛选测试化合物接触；并

(b)测定对所述多肽表达的抑制。

在还有一个实施方案中，本发明关注用于在患有免疫相关紊乱的哺乳动物中治疗该免疫相关紊乱的方法，包括对哺乳动物施用编码(a)PRO87299多肽、(b)PRO87299多肽的激动剂、或(c)PRO87299多肽的拮抗剂中任一的核酸分子，其中所述激动剂或拮抗剂可以是抗PRO87299抗体。在一个优选的实施方案中，哺乳动物是人。在另一个优选的实施方案中，核酸经回体(ex vivo)基因疗法施用。在又一个优选的实施方案中，核酸包含在载体，更优选腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒或逆转录病毒载体内。

在又一个方面，本发明提供了重组病毒颗粒，其包含基本上由启动子，编码(a)PRO87299多肽、(b)PRO87299多肽的激动性多肽、或(c)PRO87299多肽的拮抗性多肽的核酸，和供多肽细胞分泌的信号序列组成的病毒载体，其中病毒载体与病毒结构蛋白关联。优选的是，信号序列来自哺乳动物，诸如来自天然PRO87299多肽。

在还有一个实施方案中，本发明关注回体生产者细胞，其包含表达逆转录病毒结构蛋白的核酸构建物且还包含基本上由启动子，编码(a)PRO87299多肽、(b)PRO87299多肽的激动性多肽、或(c)PRO87299多肽的拮抗性多肽的核酸，和供多肽细胞分泌的信号序列组成的逆转录病毒载体，其中所述生产者细胞包装逆转录病毒载体且其与结构蛋白关联以生成重组逆转录病毒颗粒。

在还有一个实施方案中，本发明提供了在哺乳动物中提高免疫细胞活性的方法，包括对所述哺乳动物施用(a)PRO87299多肽、(b)PRO87299多肽的激动剂、或(c)PRO87299多肽的拮抗剂，其中哺乳动物中免疫细胞的活性得到提高。

在还有一个实施方案中，本发明提供了在哺乳动物中提高免疫细胞增殖的方法，包括对所述哺乳动物施用(a)PRO87299多肽、(b)PRO87299多肽的激动剂、或(c)PRO87299多肽的拮抗剂，其中哺乳动物中免疫细胞的增殖得到提高。

在还有一个实施方案中，本发明提供了在哺乳动物中降低免疫细胞增殖的方法，包括对所述哺乳动物施用(a)PRO87299多肽、(b)PRO87299多肽的激动剂、或(c)PRO87299多肽的拮抗剂，其中哺乳动物中免疫细胞的增殖得到降低。

B.另外的实施方案

在本发明的其它实施方案中，本发明提供了包含编码任何本文所述多肽的DNA的载体。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。作为例子，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌或酵母。还提供了用于生成任何本文所述多肽的方法，包括在适于表达期望多肽的条件下培养宿主细胞并从细胞培养物回收期望多肽。

在其它实施方案中，本发明提供了包含任何本文所述多肽且其与异源多肽或氨基酸序列融合的嵌合分子。此类嵌合分子的例子包括与表位标签序列或免疫球蛋白Fc区融合的任何本文所述多肽。

在另一个实施方案中，本发明提供了特异性结合任何前述或后述多肽的抗体。任选的是，抗体是单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段或单链抗体。

在还有一个实施方案中，本发明提供了可用于分离基因组和cDNA核苷酸序列或用作反义探针的寡核苷酸探针，其中这些探针可衍生自任何前述或后述核苷酸序列。

在其它实施方案中，本发明提供了包含编码PRO87299多肽的核苷酸序列的分离的核酸分子。

在一个方面，分离的核酸分子包含与(a)编码具有如本文所披露的全长氨基酸序列、如本文所披露的缺少信号肽的氨基酸序列、如本文所披露的具有或没有信号肽的跨膜蛋白质胞外结构域的PRO87299多肽或如本文所披露的全长氨基酸序列的任何其它具体限定片段的DNA分子，或(b)(a)的DNA分子的互补物具有至少约80％核酸序列同一性，或者至少约81％核酸序列同一性，或者至少约82％核酸序列同一性，或者至少约83％核酸序列同一性，或者至少约84％核酸序列同一性，或者至少约85％核酸序列同一性，或者至少约86％核酸序列同一性，或者至少约87％核酸序列同一性，或者至少约88％核酸序列同一性，或者至少约89％核酸序列同一性，或者至少约90％核酸序列同一性，或者至少约91％核酸序列同一性，或者至少约92％核酸序列同一性，或者至少约93％核酸序列同一性，或者至少约94％核酸序列同一性，或者至少约95％核酸序列同一性，或者至少约96％核酸序列同一性，或者至少约97％核酸序列同一性，或者至少约98％核酸序列同一性和或者至少约99％核酸序列同一性的核苷酸序列。

在其它方面，分离的核酸分子包含与(a)包含本文所披露的全长PRO87299多肽cDNA的编码序列、本文所披露的缺少信号肽的PRO87299多肽的编码序列、本文所披露的具有或没有信号肽的跨膜PRO87299多肽胞外结构域的编码序列或本文所披露的全长氨基酸序列的任何其它具体限定片段的编码序列的DNA分子，或(b)(a)的DNA分子的互补物具有至少约80％核酸序列同一性，或者至少约81％核酸序列同一性，或者至少约82％核酸序列同一性，或者至少约83％核酸序列同一性，或者至少约84％核酸序列同一性，或者至少约85％核酸序列同一性，或者至少约86％核酸序列同一性，或者至少约87％核酸序列同一性，或者至少约88％核酸序列同一性，或者至少约89％核酸序列同一性，或者至少约90％核酸序列同一性，或者至少约91％核酸序列同一性，或者至少约92％核酸序列同一性，或者至少约93％核酸序列同一性，或者至少约94％核酸序列同一性，或者至少约95％核酸序列同一性，或者至少约96％核酸序列同一性，或者至少约97％核酸序列同一性，或者至少约98％核酸序列同一性和或者至少约99％核酸序列同一性的核苷酸序列。

在又一个方面，本发明关注包含与编码如图2(SEQ ID NO：2)所示相同成熟多肽的DNA分子具有至少约80％核酸序列同一性，或者至少约81％核酸序列同一性，或者至少约82％核酸序列同一性，或者至少约83％核酸序列同一性，或者至少约84％核酸序列同一性，或者至少约85％核酸序列同一性，或者至少约86％核酸序列同一性，或者至少约87％核酸序列同一性，或者至少约88％核酸序列同一性，或者至少约89％核酸序列同一性，或者至少约90％核酸序列同一性，或者至少约91％核酸序列同一性，或者至少约92％核酸序列同一性，或者至少约93％核酸序列同一性，或者至少约94％核酸序列同一性，或者至少约95％核酸序列同一性，或者至少约96％核酸序列同一性，或者至少约97％核酸序列同一性，或者至少约98％核酸序列同一性和或者至少约99％核酸序列同一性的核苷酸序列的分离的核酸分子。

在另一个方面，本发明提供了包含编码其跨膜结构域或是删除或是灭活的PRO87299多肽的核苷酸序列或与所述编码核苷酸序列互补的核苷酸序列的分离的核酸分子，其中所述多肽的跨膜结构域在本文中有披露。因此，设想了本文所述PRO87299多肽的可溶性胞外结构域。

另一个实施方案致力于PRO87299多肽编码序列或其互补物的片段，它们可用作例如PRO87299多肽编码片段(可任选编码包含供抗PRO87299抗体的结合位点的多肽)的杂交探针，或用作反义寡核苷酸探针。此类核酸片段通常至少长约20个核苷酸，或者至少长约30个核苷酸，或者至少长约40个核苷酸，或者至少长约50个核苷酸，或者至少长约60个核苷酸，或者至少长约70个核苷酸，或者至少长约80个核苷酸，或者至少长约90个核苷酸，或者至少长约100个核苷酸，或者至少长约110个核苷酸，或者至少长约120个核苷酸，或者至少长约130个核苷酸，或者至少长约140个核苷酸，或者至少长约150个核苷酸，或者至少长约160个核苷酸，或者至少长约170个核苷酸，或者至少长约180个核苷酸，或者至少长约190个核苷酸，或者至少长约200个核苷酸，或者至少长约250个核苷酸，或者至少长约300个核苷酸，或者至少长约350个核苷酸，或者至少长约400个核苷酸，或者至少长约450个核苷酸，或者至少长约500个核苷酸，或者至少长约600个核苷酸，或者至少长约700个核苷酸，或者至少长约800个核苷酸，或者至少长约900个核苷酸和或者至少长约1000个核苷酸，其中在此语境中，术语“约”意指所述核苷酸序列长度加上或减去所述长度的10％。注意到PRO87299多肽编码核苷酸序列的新片段可以常规方式确定，即使用多种众所周知的序列对比程序中的任一种将PRO87299多肽编码核苷酸序列与其它已知核苷酸序列对比，并确定哪个(些)PRO87299多肽编码核苷酸序列片段是新的。本文设想了所有此类PRO87299多肽编码核苷酸序列。还设想了由这些核苷酸分子片段编码的PRO87299多肽片段，优选那些包含供抗PRO87299抗体的结合位点的PRO87299多肽片段。

在另一个实施方案中，本发明提供了由上文鉴定的任何分离的核酸序列编码的分离的PRO87299多肽。

在某一个方面，本发明关注包含与具有本文所披露的全长氨基酸序列、本文所披露的缺少信号肽的氨基酸序列、本文所披露的具有或没有信号肽的跨膜蛋白质胞外结构域的PRO87299多肽或本文所披露的全长氨基酸序列的任何其它具体限定片段具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者至少约81％氨基酸序列同一性，或者至少约82％氨基酸序列同一性，或者至少约83％氨基酸序列同一性，或者至少约84％氨基酸序列同一性，或者至少约85％氨基酸序列同一性，或者至少约86％氨基酸序列同一性，或者至少约87％氨基酸序列同一性，或者至少约88％氨基酸序列同一性，或者至少约89％氨基酸序列同一性，或者至少约90％氨基酸序列同一性，或者至少约91％氨基酸序列同一性，或者至少约92％氨基酸序列同一性，或者至少约93％氨基酸序列同一性，或者至少约94％氨基酸序列同一性，或者至少约95％氨基酸序列同一性，或者至少约96％氨基酸序列同一性，或者至少约97％氨基酸序列同一性，或者至少约98％氨基酸序列同一性和或者至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的分离的PRO87299多肽。

在又一个方面，本发明关注包含与图2(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列具有至少约80％氨基酸序列同一性，或者至少约81％氨基酸序列同一性，或者至少约82％氨基酸序列同一性，或者至少约83％氨基酸序列同一性，或者至少约84％氨基酸序列同一性，或者至少约85％氨基酸序列同一性，或者至少约86％氨基酸序列同一性，或者至少约87％氨基酸序列同一性，或者至少约88％氨基酸序列同一性，或者至少约89％氨基酸序列同一性，或者至少约90％氨基酸序列同一性，或者至少约91％氨基酸序列同一性，或者至少约92％氨基酸序列同一性，或者至少约93％氨基酸序列同一性，或者至少约94％氨基酸序列同一性，或者至少约95％氨基酸序列同一性，或者至少约96％氨基酸序列同一性，或者至少约97％氨基酸序列同一性，或者至少约98％氨基酸序列同一性和或者至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的分离的PRO87299多肽。

在一个具体的方面，本发明提供了没有N-末端信号序列和/或起始甲硫氨酸且由编码上文所述氨基酸序列的核苷酸序列编码的分离的PRO87299多肽。本文还描述了用于生成它的方法，其中所述方法包括：在适于表达PRO87299多肽的条件下培养包含如下载体的宿主细胞，所述载体包含适宜的编码核酸分子，并从细胞培养物回收PRO87299多肽。

在另一个方面，本发明提供了其跨膜结构域或是删除或是灭活的分离的PRO87299多肽。本文还描述了用于生成它的方法，其中所述方法包括：在适于表达PRO87299多肽的条件下培养包含如下载体的宿主细胞，所述载体包含适宜的编码核酸分子，并从细胞培养物回收PRO87299多肽。

在还有一个实施方案中，本发明关注本文所定义的天然PRO87299多肽的激动剂和拮抗剂。在一个具体的实施方案中，激动剂或拮抗剂是抗PRO87299抗体或小分子。

在又一个实施方案中，本发明关注鉴定PRO87299多肽的激动剂或拮抗剂的方法，包括使PRO87299多肽与候选分子接触，并监测由所述PRO87299多肽介导的生物学活性。优选的是，PRO87299多肽是天然PRO87299多肽。

在还有一个实施方案中，本发明关注包含PRO87299多肽、或本文所述PRO87299多肽的激动剂或拮抗剂、或抗PRO87299抗体，连同载体的组合物。任选的是，载体是药学可接受载体。

本发明的另一个实施方案致力于PRO87299多肽、或本文所述其激动剂或拮抗剂、或抗PRO87299抗体用于制备可用于治疗对PRO87299多肽、其激动剂或拮抗剂、或抗PRO87299抗体有响应的状况的药物的用途。

附图简述

本专利的文件包含至少一幅彩色制成的附图。本专利及彩色附图的拷贝将由专利和商标局(the Patent and Trademark Office)在提出要求和支付必要费用后提供。

图1显示了天然序列PRO87299cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，其中SEQ ID NO：1是本文中称为“DNA332467”的克隆。

图2显示了由图1所示SEQ ID NO：1的编码序列衍生的氨基酸序列(SEQID NO：2)。

图3显示了天然序列HVEM cDNA(HVEM)的核苷酸序列(SEQ IDNO：3)，其中SEQ ID NO：3是本文中称为“HVEM”的克隆。

图4显示了由图3所示SEQ ID NO：3的编码序列衍生的氨基酸序列(SEQID NO：4)。

图5显示了天然序列LIGHT的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)，其中SEQ IDNO：5是本文中称为“LIGHT”的克隆。

图6显示了由图5所示SEQ ID NO：5的编码序列衍生的氨基酸序列(SEQID NO：6)。

图7显示了变异序列PRO87299的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)，其中SEQID NO：7是本文中称为“PRO87299.short”的克隆。

图8显示了由图7所示SEQ ID NO：7的编码序列衍生的氨基酸序列(SEQID NO：8)。

图9显示了变异序列PRO87299的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)，其中SEQID NO：9是本文中称为“PRO87299.AFTNIP”的克隆。

图10显示了由图9所示SEQ ID NO：9的编码序列衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。

图11显示了PRO87299 cDNA的核酸变体。

图12显示了PRO87299变体的多肽翻译。

图13显示了激动性抗体对CD4+T细胞增殖的抑制。

图14显示了PRO87299与HVEM的特异性结合。

图15显示了在与其它家族成员比较时PRO87299与HVEM的结合。

图16显示了PRO87299与HVEM的结合对pH敏感。

图17显示了PRO87299与用HVEM转染的细胞上HVEM的结合。

图18显示了PRO87299的抗体可阻断与HVEM的相互作用。

图19显示了PRO87299和LIGHT可同时结合HVEM。

图20显示了PRO87299不受LIGHT阻断与HVEM的相互作用。

图21显示了BP-2肽和gD阻断PRO87299/HVEM相互作用。

图22显示了PRO87299对CD4+T细胞的抑制效果。

图23显示了HVEM-Fc对PRO87299的活化在GVHR模型中促进存活。

优选实施方案的详述

I.定义

本文中描述的PRO87299多肽可从多种来源分离，诸如人组织类型或其它来源，或者通过重组或合成方法制备。本说明书中涉及“PRO87299多肽”的所有公开内容适用于个别的以及共同的每一种多肽。例如，关于多肽的制备、纯化、衍生、针对该多肽的抗体的形成、施用、含有该多肽的组合物、用该多肽治疗疾病、等等的描述适用于本发明的个别的每一种多肽。术语“PRO87299多肽”还包括本文中公开的PRO87299多肽的变体。

“天然序列PRO87299多肽”包括与衍生自自然界的相应PRO87299多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列PRO87299多肽可从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列PRO87299多肽”明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的特定PRO87299多肽(例如胞外结构域序列)、该多肽的天然存在变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在等位变体。在本发明的多个实施方案中，本文中公开的天然序列PRO87299多肽是包含附图中所示全长氨基酸序列的成熟或全长天然序列多肽。起始和终止密码子在图中以粗体和下划线显示。然而，尽管附图中公开的PRO87299多肽据显示以本文中指派为图中第1位氨基酸的甲硫氨酸残基开始，可以想到且有可能的是，可采用位于图中第1位氨基酸上游或下游的其它甲硫氨酸残基作为PRO87299多肽的起始氨基酸残基。

PRO87299多肽“胞外结构域”或“ECD”指基本上不含跨膜结构域和胞质结构域的PRO87299多肽形式。通常，PRO87299多肽ECD具有少于1％的所述跨膜结构域和/或胞质结构域，优选具有少于0.5％的所述结构域。可以理解，为本发明PRO87299多肽鉴定的任何跨膜结构域是依照本领域常规用于鉴定该种类型疏水性结构域的标准鉴定的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但最有可能是本文中最初鉴定的结构域任一末端不超过约5个氨基酸。因此，任选的是，PRO87299多肽的胞外结构域可含有实施例或说明书中鉴定的跨膜结构域/胞外结构域边界任一侧的约5个或更少氨基酸，而且本发明设想了具有或没有相关信号肽的此类多肽及编码它们的核酸。

“PRO87299多肽变体”意指与本文中所公开的全长天然序列PRO87299多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽的PRO87299多肽序列、本文中所公开的具有或没有信号肽的PRO87299多肽胞外结构域、或本文中所公开的全长PRO87299多肽序列的任何其它片段具有至少约80％的氨基酸序列同一性的上文或下文所定义的活性PRO87299多肽。此类PRO87299多肽变体包括例如其中全长天然氨基酸序列的N-或C-末端添加或删除一个或多个氨基酸残基的PRO87299多肽。通常，PRO87299多肽变体与本文中所公开的全长天然序列PRO87299多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽的PRO87299多肽序列、本文中所公开的具有或没有信号肽的PRO87299多肽胞外结构域、或本文中所公开的全长PRO87299多肽序列的任何其它特别限定片段具有至少约80％的氨基酸序列同一性，或者至少约81％的氨基酸序列同一性，或者至少约82％的氨基酸序列同一性，或者至少约83％的氨基酸序列同一性，或者至少约84％的氨基酸序列同一性，或者至少约85％的氨基酸序列同一性，或者至少约86％的氨基酸序列同一性，或者至少约87％的氨基酸序列同一性，或者至少约88％的氨基酸序列同一性，或者至少约89％的氨基酸序列同一性，或者至少约90％的氨基酸序列同一性，或者至少约91％的氨基酸序列同一性，或者至少约92％的氨基酸序列同一性，或者至少约93％的氨基酸序列同一性，或者至少约94％的氨基酸序列同一性，或者至少约95％的氨基酸序列同一性，或者至少约96％的氨基酸序列同一性，或者至少约97％的氨基酸序列同一性，或者至少约98％的氨基酸序列同一性和或者至少约99％的氨基酸序列同一性。通常，PRO87299变体多肽至少长约10个氨基酸，或者至少长约20个氨基酸，或者至少长约30个氨基酸，或者至少长约40个氨基酸，或者至少长约50个氨基酸，或者至少长约60个氨基酸，或者至少长约70个氨基酸，或者至少长约80个氨基酸，或者至少长约90个氨基酸，或者至少长约100个氨基酸，或者至少长约150个氨基酸，或者至少长约200个氨基酸，或者至少长约300个氨基酸或更多。

关于本文中所鉴定的PRO87299多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与特定PRO87299多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行测定百分比氨基酸序列同一性目的的序列对比，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表1中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，下文表1所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可从下文表1中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。

在采用ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y 乘 100

其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。作为使用这种方法的％氨基酸序列同一性计算的例子，表2和3演示了如何计算指派为“比较蛋白质”的氨基酸序列相对于指派为“PRO87299”的氨基酸序列的％氨基酸序列同一性，其中“PRO87299”代表目的假设PRO87299多肽的氨基酸序列，“比较蛋白质”代表目的“PRO87299”多肽针对其进行比较的多肽的氨基酸序列，而“X”、“Y”和“Z”各自代表不同假设氨基酸残基。

除非另有具体说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。然而，％氨基酸序列同一性值也可使用WU-BLAST-2计算机程序(Altschul et al.，Methods inEnzymology 266：460-480(1996))如下所述获得。大多数WU-BLAST-2检索参数设成缺省值。不设成缺省值的参数，即可调整参数设成如下值：交叠跨度＝1，交叠分数＝0.125，词阈值(T)＝11，和评分矩阵＝BLOSUM62。在采用WU-BLAST-2时，％氨基酸序列同一性值是通过将(a)通过WU-BLAST-2确定的具有衍生自天然PRO87299多肽的序列的目的PRO87299多肽氨基酸序列和目的比较氨基酸序列(即目的PRO87299多肽与之进行比较的序列，它可以是PRO87299变体多肽)之间的匹配相同氨基酸残基数除以(b)目的PRO87299多肽的氨基酸残基总数确定的。例如，在叙述“包含与氨基酸序列B具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列A的多肽”中，氨基酸序列A是目的比较氨基酸序列，而氨基酸序列B是目的PRO87299多肽的氨基酸序列。

百分比氨基酸序列同一性也可使用序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschul et al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))确定。NCBI-BLAST2序列比较程序可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov下载，或者以其它方式从National Institute of Health(Bethesda，MD)获得。NCBI-BLAST2使用几项检索参数，其中所有这些检索参数设成缺省值，包括例如未遮掩＝是，链＝全部，期望发生＝10，最小低复杂性长度＝15/5，多通过e值＝0.01，多通过常数＝25，最终缺口对比的降低(dropoff)＝25，评分矩阵＝BLOSUM62。

在采用NCBI-BLAST2用于氨基酸序列比较的情况中，给定氨基酸序列A对、与、或相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(可另外表述为给定氨基酸序列A具有或包含对、与、或相对于给定氨基酸序列B的一定的％氨基酸序列同一性)计算如下：

X/Y分数×100

其中X是序列对比程序NCBI-BLAST2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，而Y是B中氨基酸残基总数。应理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性不等于B对A的％氨基酸序列同一性。

“PRO87299变体多核苷酸”或“PRO87299变体核酸序列”意指编码下文所定义的活性PRO87299多肽且与编码本文中所公开的全长天然序列PRO87299多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽的全长天然序列PRO87299多肽序列、本文中所公开的具有或没有信号肽的PRO87299多肽胞外结构域、或本文中所公开的全长PRO87299多肽序列的任何其它片段的核苷酸序列具有至少约80％核酸序列同一性的核酸分子。通常，PRO87299变体多核苷酸与编码本文中所公开的全长天然序列PRO87299多肽序列、本文中所公开的缺乏信号肽的全长天然序列PRO87299多肽序列、本文中所公开的具有或没有信号序列的PRO87299多肽胞外结构域、或本文中所公开的全长PRO87299多肽序列的任何其它片段的核酸序列具有至少约80％的核酸序列同一性，或者至少约81％的核酸序列同一性，或者至少约82％的核酸序列同一性，或者至少约83％的核酸序列同一性，或者至少约84％的核酸序列同一性，或者至少约85％的核酸序列同一性，或者至少约86％的核酸序列同一性，或者至少约87％的核酸序列同一性，或者至少约88％的核酸序列同一性，或者至少约89％的核酸序列同一性，或者至少约90％的核酸序列同一性，或者至少约91％的核酸序列同一性，或者至少约92％的核酸序列同一性，或者至少约93％的核酸序列同一性，或者至少约94％的核酸序列同一性，或者至少约95％的核酸序列同一性，或者至少约96％的核酸序列同一性，或者至少约97％的核酸序列同一性，或者至少约98％的核酸序列同一性和或者至少约99％的核酸序列同一性。变体不涵盖天然核苷酸序列。

通常，PRO87299变体多核苷酸至少长约30个核苷酸，或者至少长约60个核苷酸，或者至少长约90个核苷酸，或者至少长约120个核苷酸，或者至少长约150个核苷酸，或者至少长约180个核苷酸，或者至少长约210个核苷酸，或者至少长约240个核苷酸，或者至少长约270个核苷酸，或者至少长约300个核苷酸，或者至少长约450个核苷酸，或者至少长约600个核苷酸，或者至少长约900个核苷酸或更多。

关于本文中所鉴定的PRO87299编码核酸序列的“百分比(％)核酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，候选序列中与目的PRO87299核酸序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行测定百分比核酸序列同一性目的的序列对比，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。然而，为了本发明，％核酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2获得的，其中下文表1中提供了ALIGN-2程序的完整源代码。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，下文表1所示源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册。公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)得到ALIGN-2程序，或者可从下文表1中提供的源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。

在采用ALIGN-2来比较核酸序列的情况中，给定核酸序列C相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列D的％核酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定核酸序列D的某一％核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下计算：

分数W/Z乘100

其中W是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的C和D对比中评分为相同匹配的核苷酸数，且其中Z是D中的核苷酸总数。可以领会，若核酸序列C的长度与核酸序列D的长度不相等，则C相对于D的％核酸序列同一性将不等于D相对于C的％核酸序列同一性。作为％核酸序列同一性计算的例子，表4和5演示了如何计算指派为“比较DNA”的核酸序列相对于指派为“PRO87299-DNA”的核酸序列的％核酸序列同一性，其中“PRO87299-DNA”代表目的假设PRO87299编码核酸序列，“比较DNA”代表目的“PRO87299-DNA”核酸分子针对其进行比较的核酸分子的核苷酸序列，而“N”、“L”和“V”各自代表不同假设核苷酸。

除非另有具体说明，本文中所使用的所有％核酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。然而，％核酸序列同一性值也可使用WU-BLAST-2计算机程序(Altschul et al.，Methods in Enzymology266：460-480(1996))如下所述获得。大多数WU-BLAST-2检索参数设成缺省值。不设成缺省值的参数，即可调整参数设成如下值：交叠跨度＝1，交叠分数＝0.125，词阈值(T)＝11，和评分矩阵＝BLOSUM62。在采用WU-BLAST-2时，％核酸序列同一性值是通过将(a)通过WU-BLAST-2确定的具有衍生自天然序列PRO87299多肽编码核酸的序列的目的PRO87299多肽编码核酸分子的核酸序列和目的比较核酸分子(即目的PRO87299多肽编码核酸分子与之进行比较的序列，它可以是变体PRO87299多核苷酸)之间的匹配相同核苷酸数除以(b)目的PRO87299多肽编码核酸分子的核苷酸总数确定的。例如，在叙述“包含与核酸序列B具有至少80％核酸序列同一性的核酸序列A的分离的核酸分子”中，核酸序列A是目的比较核酸分子，而核酸序列B是目的PRO87299多肽编码核酸分子的核酸序列。

百分比核酸序列同一性也可使用序列比较程序NCBI-BLAST2(Altschulet al.，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997))确定。NCBI-BLAST2序列比较程序可从http://www.ncbi.nlm.nih.gov下载，或者以其它方式从NationalInstitute of Health(Bethesda，MD)获得。NCBI-BLAST2使用几项检索参数，其中所有检索参数设成缺省值，包括例如未遮掩＝是，链＝全部，期望发生＝10，最小低复杂性长度＝15/5，多通过e值＝0.01，多通过常数＝25，最终缺口对比的降低＝25，评分矩阵＝BLOSUM62。

在采用NCBI-BLAST2用于序列比较的情况中，给定核酸序列C对、与、或相对于给定核酸序列D的％核酸序列同一性(可另外表述为给定核酸序列C具有或包含对、与、或相对于给定核酸序列D的一定的％核酸序列同一性)计算如下：

W/Z分数×100

其中W是序列对比程序NCBI-BLAST2在该程序的C和D对比中评分为相同匹配的核苷酸数，而Z是D中核苷酸总数。应理解，当核酸序列C的长度不等于核酸序列D的长度时，C对D的％核酸序列同一性不等于D对C的％核酸序列同一性。

在其它实施方案中，PRO87299变体多核苷酸是编码活性PRO87299多肽且能够与编码本文中所公开的全长PRO87299多肽的核苷酸序列杂交，优选在严格杂交和洗涤条件下杂交的核酸分子。PRO87299变体多肽可以是那些由PRO87299变体多核苷酸编码的变体多肽。

“分离的”，在用于描述本文中所公开的各种多肽时，意指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的多肽。其天然环境的污染性成分指通常会干扰该多肽的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将多肽纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(2)根据使用考马斯蓝或优选银染色的非还原或还原条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然PRO87299多肽天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。

“分离的”PRO87299多肽编码核酸或其它多肽编码核酸指已经鉴定且与该多肽编码核酸的天然来源中通常与之相关的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的多肽编码核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的多肽编码核酸分子因此与存在于天然细胞中时的特定多肽编码核酸分子有区别。然而，分离的多肽编码核酸分子包括通常表达该多肽的细胞中所包含的多肽编码核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。

术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。

若一条核酸与另一条核酸序列处于功能性相互关系中，则它是“可操作连接”的。例如，若前序列(presequence)或分泌前导(secretory leader)的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白质(preprotein)，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与该序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接”意味着相连的DNA序列是相邻的，而且在分泌前导的情况中意味着相邻且处于阅读状态。然而，增强子不必相邻。连接可通过在方便的限制性位点处的连接反应来实现。如果没有此类位点，那么依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接头或接头。

术语“抗体”以最广义使用，明确覆盖例如单一抗PRO87299单克隆抗体(包括激动性、拮抗性、和中和性抗体)、具有多表位特异性的抗PRO87299抗体组合物、单链抗PRO87299抗体、和抗PRO87299抗体片段(见下文)。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。

杂交反应的“严格性”可以容易的由本领域普通技术人员确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度、和盐浓度凭经验计算。通常，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同源性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的另外细节和解释，参见Ausubel等人，《CurrentProtocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers，1995。

“严格条件”或“高严格性条件”，如本文中所定义的，可如下鉴别：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂，诸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，含750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)于42℃采用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt氏溶液，超声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸右旋糖苷，以及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中洗涤，接着在含EDTA的0.1x SSC中于55℃进行高严格性洗涤。

“中等严格条件”可以如Sambrook等人，《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》，New York，Cold Spring Harbor Press，1989所述鉴别，包括使用比上文所述较不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中等严格条件的一个例子是于37℃在含：20％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x Denhardt氏溶液，10％硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着在1x SSC中于约37-50℃洗涤滤膜。技术人员将认识到如何根据需要调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。

术语“表位标记的”在用于本文时指包含与“标签多肽”融合的PRO87299多肽的嵌合多肽。标签多肽具有足够残基以提供表位而可制备针对其的抗体，但又足够短使得其不干扰与其融合的多肽的活性。标签多肽优选还是相当独特的，使得所述抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。合适的标签多肽通常具有至少6个氨基酸残基且通常在约8个到约50个氨基酸残基之间(优选在约10个到约20个氨基酸残基之间)。

在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白质(“粘附素”)的结合特异性与免疫球蛋白恒定区的效应物功能联合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(即是“异源”的)、具有期望结合特异性的氨基酸序列和免疫球蛋白恒定区序列的融合物。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是至少包含受体或配体的结合位点的连续(contiguous)氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列可从任何免疫球蛋白获得，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。

“有活性的”或“活性”为了本发明指保留天然或天然存在PRO87299的生物学和/或免疫学活性的PRO87299多肽形式，其中“生物学”活性指由天然或天然存在PRO87299引起的，诱导针对天然或天然存在PRO87299所具有的抗原性表位的抗体生成的能力以外的生物学功能(或是抑制性的或是刺激性的)，而“免疫学”活性指诱导针对天然或天然存在PRO87299所具有的抗原性表位的抗体生成的能力。

术语“拮抗剂”以最广义使用，包括部分或完全阻断、抑制、或中和本文中所公开的天然PRO87299多肽的生物学活性的任何分子。类似的，术语

“激动剂”以最广义使用，包括模拟本文中所公开的天然PRO87299多肽的生物学活性的任何分子。合适的激动剂或拮抗剂分子明确包括激动性或拮抗性抗体或抗体片段、天然PRO87299多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、反义寡核苷酸、有机小分子等。用于鉴定PRO87299多肽的激动剂或拮抗剂的方法可包括使PRO87299多肽接触候选激动剂或拮抗剂分子并测量通常与PRO87299多肽有关的一种或多种生物学活性的可检测变化。

“处理”或“治疗”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)所针对的病理学状况或紊乱。需要治疗的受试者包括早就患有紊乱的受试者以及倾向于患上紊乱的受试者或要预防紊乱的受试者。

“长期”施用指以与短期模式相反的连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果(活性)维持较长的一段时间。“间歇”施用指并非连续不间断进行的处理，本质上是循环的。

对于治疗而言，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人、家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。优选的是，哺乳动物指人。

“联合”一种或多种其它治疗剂的施用包括同时(共同)施用和任意次序的连续施用。

“载体”在用于本文时包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata et al.，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。此片段由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是在这种构造中，各个可变区的三个CDR相互作用而在VH-VL二聚体表面确定了一个抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(C_H1)。Fab’片段因在重链C_H1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对其中恒定区半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)₂抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体片段的其它化学偶联。

根据其恒定区的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类别。免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。

“单链Fv”或“sFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。优选的是，Fv多肽在V_H和V_L结构域之间还包含多肽接头，使得sFv能够形成抗原结合期望的结构。关于sFv的综述参见Plückthun，《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315，1994。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(V_H-V_L)中包含相连的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。

“分离的”抗体指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry方法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或优选银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。

“特异性结合”特定多肽或特定多肽上的表位或者对其“特异”的抗体指结合该特定多肽或特定多肽上的表位且基本上不结合任何其它多肽或多肽表位的抗体。

词“标记物”在用于本文时指与抗体直接或间接偶联从而产生“经标记”抗体的可检测化合物或组合物。标记物可以是自身就可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

“固相”意指本发明的抗体可粘附其上的非水性基质。本文中所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些实施方案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它指纯化柱(例如亲和层析柱)。此术语还包括离散颗粒的不连续固相，诸如美国专利4,275,149中所述。

“脂质体”指由各种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物(诸如PRO87299多肽或其抗体)的小囊泡。与生物膜的脂质排列相似，脂质体的成分通常排列成双层形式。

“小分子”在本文中定义为分子量小于约500道尔顿。

术语“免疫相关疾病”指哺乳动物中由哺乳动物免疫系统成分引起、介导、或以其它方式促成发病的疾病。还包括刺激或干预免疫应答对疾病发展具有改善作用的疾病。此术语包括免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、传染病、免疫缺陷病、瘤形成等。

术语“T细胞介导的疾病”指其中T细胞直接或间接介导或以其它方式促成哺乳动物发病的疾病。T细胞介导的疾病可能与细胞介导的效应、淋巴因子介导的效应等有关，甚至与B细胞有关的效应，如果B细胞受到刺激的话，例如受到由T细胞分泌的淋巴因子的刺激。

可依照本发明治疗的免疫相关和炎性疾病的例子，其中有些是免疫或T细胞介导的，包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏(

)综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、和硬化性胆管炎、炎性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn)病)、麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫性或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主疾病。传染病包括病毒性疾病诸如AIDS(HIV感染)、甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎等，细菌感染，真菌感染，原生动物感染和寄生虫感染。

术语“有效量”指导致具体所述目的得以实现的PRO87299多肽和/或激动剂/拮抗剂的浓度或量。PRO87299多肽或其激动剂或拮抗剂的“有效量”可凭经验确定。另外，“治疗有效量”指有效实现所述治疗效果的PRO87299多肽和/或激动剂/拮抗剂的浓度或量。该量也可凭经验确定。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶(nucleolytic enzyme)；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。细胞毒素可共价附着于将该毒素靶向表达某种抗原的特定目的细胞的抗体。可用的细胞毒素及其接头包括但不限于下列：

接头：

MC＝马来酰亚胺己酰基

Val Cit＝缬氨酸-瓜氨酸，蛋白酶可切割接头中的二肽位点

瓜氨酸＝2-氨基-5-脲基戊酸

PAB＝对氨基苄基氨基甲酰基(接头的“自我牺牲”(self immolative)部分)

Me＝N-甲基-缬氨酸瓜氨酸，其中接头肽键经过修饰而防止其受到组织蛋白酶B的切割

MC(PEG)6-OH＝马来酰亚胺己酰基-聚乙二醇，附着于抗体半胱氨酸

SPP＝N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯

SMCC＝N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯

细胞毒性药物：

MMAE＝monomethylauristatin E(MW 718)

MMAF＝auristatin E(MMAE)在药物的C-末端具有苯丙氨酸的变体(MW731.5)

MMAF-DMAEA＝C-末端苯丙氨酸以酰胺键连有DMAEA(二甲氨基乙胺)的MMAF(MW 801.5)

MMAF-TEG＝苯丙氨酸以三缩四乙二醇酯化的MMAF

MMAF-NtBu＝C-末端以酰胺附有N-叔丁基的MMAF

AEVB＝auristatin E戊酰基苄腙，酸不稳定接头经AE的C-末端(MW732)

AFP＝Auristatin F苯二胺；(以苯二胺间隔物经C-末端与抗体相连的苯丙氨酸变体)(MW 732)

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见《The Molecular Basis ofCancer》，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”，Murakami等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))都是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(TAXOTERE

，Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(TAXOL

，Bristol-Myers Squibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞有丝分裂的抑制。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括阿霉素(adriamycin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)(“Ara-C”)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、塞替派(thiotepa)、白消安(busulfan)、环磷酰胺(cytoxan)、类紫杉醇(taxoids)例如紫杉醇(paclitaxel)(Taxol，Bristol-Myers SquibbOncology，Princeton，NJ)和多西他塞(doxetaxel)(Taxotere，

-PoulencRorer，Antony，France)、泰索帝(taxotere)、甲氨蝶呤(methotrexate)、顺铂(cisplatin)、美法仑(melphalan)、长春碱(vinblastine)、博来霉素(bleomycin)、依托泊苷(etoposide)、异磷酰胺(ifosfamide)、丝裂霉素(mitomycin)C、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、卡铂(carboplatin)、替尼泊苷(teniposide)、道诺霉素(daunomycin)、洋红霉素(carminomycin)、氨基喋呤(aminopterin)、放线菌素D(dactinomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、埃斯波霉素类(esperamicins)(参见美国专利4,675,187)、美法仑(melphalan)和其它相关氮芥类。该定义还包括作用为调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如他莫昔芬(tamoxifen)和奥那司酮(onapristone)。

术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。

在用于本文时，术语“炎性细胞”指增强炎性应答的细胞，诸如单核细胞、嗜曙红细胞、巨噬细胞和多形核嗜中性细胞(PMN)。

表1

/*

*

*C-C increased from 12 to 15

*Z is average of EQ

*B is average of ND

*match with stop is_M；stop-stop＝0；J(joker)match＝0

*/

#define_M-8 /*value ofa match with a stop*/

int _day[26][26]＝{

/* A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z*/

/*A*/ {2，0，-2，0，0，-4，1，-1，-1，0，-1，-2，-1，0，_M，1，0，-2，1，1，0，0，-6，0，-3，0}，

/*B*/ {0，3，-4，3，2，-5，0，1，-2，0，0，-3，-2，2，_M，-1，1，0，0，0，0，-2，-5，0，-3，1}，

/*C*/ {-2，-4，15，-5，-5，-4，-3，-3，-2，0，-5，-6，-5，-4，_M，-3，-5，-4，0，-2，0，-2，-8，0，0，-5}，

/*D*/ {0，3，-5，4，3，-6，1，1，-2，0，0，-4，-3，2，_M，-1，2，-1，0，0，0，-2，-7，0，-4，2}，

/*E*/ {0，2，-5，3，4，-5，0，1，-2，0，0，-3，-2，1，_M，-1，2，-1，0，0，0，-2，-7，0，-4，3}，

/*F*/ {-4，-5，-4，-6，-5，9，-5，-2，1，0，-5，2，0，-4，_M，-5，-5，-4，-3，-3，0，-1，0，0，7，-5}，

/*G*/ {1，0，-3，1，0，-5，5，-2，-3，0，-2，-4，-3，0，_M，-1，-1，-3，1，0，0，-1，-7，0，-5，0}，

/*H*/ {-1，1，-3，1，1，-2，-2，6，-2，0，0，-2，-2，2，_M，0，3，2，-1，-1，0，-2，-3，0，0，2}，

/*I*/ {-1，-2，-2，-2，-2，1，-3，-2，5，0，-2，2，2，-2，_M，-2，-2，-2，-1，0，0，4，-5，0，-1，-2}，

/*J*/ {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，

/*K*/ {-1，0，-5，0，0，-5，-2，0，-2，0，5，-3，0，1，_M，-1，1，3，0，0，0，-2，-3，0，-4，0}，

/*L*/ {-2，-3，-6，-4，-3，2，-4，-2，2，0，-3，6，4，-3，_M，-3，-2，-3，-3，-1，0，2，-2，0，-1，-2}，

/*M*/ {-1，-2，-5，-3，-2，0，-3，-2，2，0，0，4，6，-2，_M，-2，-1，0，-2，-1，0，2，-4，0，-2，-1}，

/*N*/ {0，2，-4，2，1，-4，0，2，-2，0，1，-3，-2，2，_M，-1，1，0，1，0，0，-2，-4，0，-2，1}，

/*O*/ {_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，0，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M，_M}，

/*P*/ {1，-1，-3，-1，-1，-5，-1，0，-2，0，-1，-3，-2，-1，_M，6，0，0，1，0，0，-1，-6，0，-5，0}，

/*Q*/ {0，1，-5，2，2，-5，-1，3，-2，0，1，-2，-1，1，_M，0，4，1，-1，-1，0，-2，-5，0，-4，3}，

/*R*/ {-2，0，-4，-1，-1，-4，-3，2，-2，0，3，-3，0，0，_M，0，1，6，0，-1，0，-2，2，0，-4，0}，

/*S*/ {1，0，0，0，0，-3，1，-1，-1，0，0，-3，-2，1，_M，1，-1，0，2，1，0，-1，-2，0，-3，0}，

/*T*/ {1，0，-2，0，0，-3，0，-1，0，0，0，-1，-1，0，_M，0，-1，-1，1，3，0，0，-5，0，-3，0}，

/*U*/ {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，

/*V*/ {0，-2，-2，-2，-2，-1，-1，-2，4，0，-2，2，2，-2，_M，-1，-2，-2，-1，0，0，4，-6，0，-2，-2}，

/*W*/ {-6，-5，-8，-7，-7，0，-7，-3，-5，0，-3，-2，-4，-4，_M，-6，-5，2，-2，-5，0，-6，17，0，0，-6}，

/*X*/ {0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，_M，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0，0}，

/*Y*/ {-3，-3，0，-4，-4，7，-5，0，-1，0，-4，-1，-2，-2，_M，-5，-4，-4，-3，-3，0，-2，0，0，10，-4}，

/*Z*/ {0，1，-5，2，3，-5，0，2，-2，0，0，-2，-1，1，_M，0，3，0，0，0，0，-2，-6，0，-4，4}

}；

/*

*/

#include<stdio.h>

#include<ctype.h>

#define MAXJMP 16 /*maxjumps in a diag*/

#define MAXGAP 24 /*don′t continue to penalize gaps larger than this*/

#define JMPS 1024 /*max jmps in an path*/

#define MX 4 /*save ifthere′s at least MX-1 bases since lastjmp*/

#define DMAT 3 /*value of matching bases*/

#define DMIS 0 /*penalty for mismatched bases*/

#define DINSO 8 /*penalty for a gap*/

#define DINSl 1 /*penalty per base*/

#define PINSO 8 /*penalty for a gap*/

#define PINS1 4 /*penalty per residue*/

structjmp{

short n[MAXJMP]； /*size ofjmp(neg for dely)*/

unsigned short x[MAXJMP]； /*base no.ofjmp in seq x*/

}； /*limits seq to2^16-1*/

struct diag{

int score； /*score at last jmp*/

long offset； /*offset of prev block*/

short ijmp； /*current jmp index*/

struct jmp jp； /*list ofjmps*/

}；

struct path{

int spc； /*number of leading spaces*/

short n[JMPS]； /*size ofjmp(gap)*/

int x[JMPS]； /*loc ofjmp(last elem before gap)*/

}；

char *ofile； /*output file name*/

char *namex[2]； /*seq names:getseqs()*/

char *prog； /*prog name for err msgs*/

char *seqx[2]； /*seqs:getseqs()*/

int dmax； /*best diag:nw()*/

int dmax0； /*final diag*/

int dna； /*set if dna:main()*/

int endgaps； /*set if penalizing end gaps*/

int gapx，gapy； /*total gaps in seqs*/

int len0，lenl； /*seq lens*/

int ngapx，ngapy； /*total size of gaps*/

int smax； /*max score:nw()*/

int *xbm； /*bitmap for matching*/

long offset； /*current offset in jmp file*/

struct diag *dx； /*holds diagonals*/

struct path pp[2]； /*holds path for seqs*/

char *calloc()，*malloc()，*index()，*strcpy()；

char *getseq()，*g_calloc()；

/*Needleman-Wunsch alignment program

*

*usage:progs file1 file2

* where file1 and file2 are two dna or two protein sequences.

* The sequences can be in upper-orlower-case an may contain ambiguity

* Any lines beginning with′；′，′>′or′<′are ignored

* Max file length is65535(limited by unsigned short x in the jmp struct)

* A sequence with1/3or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA

* Output is in the file＂align.out＂

*

*The program may create a tmp file in/tmp to hold info about traceback.

*Original version developed under BSD 4.3on a vax 8650

*/

#include＂nw.h＂

#include＂day.h＂

static_dbval[26]＝{

1，14，2，13，0，0，4，11，0，0，12，0，3，15，0，0，0，5，6，8，8，7，9，0，10，0}；

static_pbval[26]＝{

1，2|(1<<(′D′-′A′))|(1<<(′N′-′A′))，4，8，16，32，64，

128,256，0xFFFFFFF，1<<10，1<<11，1<<12，1<<13，1<<14，

1<<15，1<<16，1<<17，1<<18，1<<19，1<<20，1<<21，1<<22，

1<<23，1<<24，1<<25|(1<<(′E′-′A′))|(1<<(′Q′-′A′))

}；

main(ac，av)main

int ac；

char *av[]；

{

prog＝av[0]；

if(ac!＝3){

fprintf(stderr，＂usage:％s file1 file2\n＂，prog)；

fprintf(stderr，＂where file1and file2 are two dna or two protein sequences.\n＂)；

fprintf(stderr，＂The sequences can be in upper-or lower-case\n＂)；

fprintf(stderr，＂Any lines beginning with′；′or′<′are ignored\n＂)；

fprintf(stderr，＂Output is in the file\＂align.out\＂\n＂)；

exit(1)；

}

namex[0]＝av[1]；

namex[1]＝av[2]；

seqx[0]＝getseq(namex[0]，&len0)；

seqx[1]＝getseq(namex[1]，&len1)；

xbm＝(dna)？_dbval:_pbval；

endgaps＝0； /*1 to penalize endgaps*/

ofile＝＂align.out＂；/*output file*/

nw()； /*fill in the matrix，get the possible jmps*/

readjmps()； /*get the actual jmps*/

print()； /*print stats，alignment*/

cleanup(0)； /*unlink any tmp files*/

}

/*do the alignment，return best score:main()

*dna:values in Fitch and Smith，PNAS，80，1382-1386，1983

*pro:PAM 250 values

*When scores are equal，we prefer mismatches to any gap，prefer

*a new gap to extending an ongoing gap，and prefer a gap in seqx

*to a gap in seq y.

*/

nw() nw

{

char *px，*py； /*seqs and ptrs*/

int *ndely，*dely； /*keep track of dely*/

int ndelx，delx； /*keep track of delx*/

int *tmp； /*for swapping row0，row1*/

int mis； /*score for each type*/

int ins0，ins1； /*insertion penalties*/

register id； /*diagonal index*/

register ij； /*jmp index*/

register *col0，*col1；/*score for curr，last row*/

register xx，yy； /*index into seqs*/

dx＝(struct diag*)g_calloc(＂to get diags＂，len0+len1+1，sizeof(struct diag))；

ndely＝(int*)g_calloc(＂to get ndely＂，len1+1，sizeof(int))；

dely＝(int*)g_calloc(＂to get dely＂，len1+1，sizeof(int))；

col0＝(int*)g_calloc(＂to get col0＂，len1+1，sizeof(int))；

col1＝(int*)g_calloc(＂to get col1＂，len1+1，sizeof(int))；

ins0＝(dna)？DINS0:PINS0；

ins1＝(dna)？DINS1:PINS1；

smax＝-10000；

if(endgaps){

for(col0[0]＝dely[0]＝-ins0，yy＝1；yy<＝len1；yy++){

col0[yy]＝dely[yy]＝col0[yy-1]-ins1；

ndely[yy]＝yy；

}

col0[0]＝0；/*Waterman BullMath Biol 84*/

}

else

for(yy＝1；yy<＝len1；yy++)

dely[yy]＝-ins0；

/*fill in match matrix

*/

for(px＝seqx[0]，xx＝1；xx<＝len0；px++，xx++){

/*initialize first entry in col

*/

if(endgaps){

if(xx＝＝1)

col1[0]＝delx＝-(ins0+ins1)；

else

col1[0]＝delx＝col0[0]-ins1；

ndelx＝xx；

}

else{

col1[0]＝0；

delx＝-ins0；

ndelx＝0；

}

...nw

for(py＝seqx[1]，yy＝1；yy<＝len1；py++，yy++){

mis＝col0[yy-1]；

if(dna)

mis+＝(xbm[*px-′A′]&xbm[*py-′A′])？DMAT:DMIS；

else

mis+＝_day[*px-′A′][*py-′A′]；

/*update penalty for del in x seq；

*favor new del over ongong del

*ignore MAXGAP if weighting endgaps

*/

if(endgaps‖ndely[yy]<MAXGAP){

if(col0[yy]-ins0>＝dely[yy]){

dely[yy]＝col0[yy]-(ins0+ins1)；

ndely[yy]＝1；

}else{

dely[yy]-＝ins1；

ndely[yy]++；

}

}else{

if(col0[yy]-(ins0+ins1)>＝dely[yy]){

dely[yy]＝col0[yy]-(ins0+ins1)；

ndely[yy]＝1；

}else

ndely[yy]++；

}

/*update penalty for del in y seq；

*favor new del over ongong del

*/

if(endgaps‖ndelx<MAXGAP){

if(col1[yy-1]-ins0>＝delx){

delx＝col1[yy-1]-(ins0+ins1)；

ndelx＝1；

}else{

delx-＝ins1；

ndelx++；

}

}else{

if(col1[yy-1]-(ins0+ins1)>＝delx){

delx＝col1[yy-1]-(ins0+ins1)；

ndelx＝1；

}else

ndelx++；

}

/*pick the maximum score；we′re favoring

*mis over any del and delx over dely

*/

...nw

id＝xx-yy+len1-1；

if(mis>＝delx&&mis>＝dely[yy])

col1[yy]＝mis；

else if(delx>＝dely[yy]){

col1[yy]＝delx；

ij＝dx[id].ijmp；

if(dx[id].jp.n[0]&&(!dna‖(ndelx>＝MAXJMP

&&xx>dx[id].jp.x[ij]+MX)‖mis>dx[id].score+DINS0)){

dx[id].ijmp++；

if(++ij>＝MAXJMP){

writejmps(id)；

ij＝dx[id].ijmp＝0；

dx[id].offset＝offset；

offset+＝sizeof(struct jmp)+sizeof(offset)；

}

dx[id].jp.n[ij]＝ndelx；

dx[id].jp.x[ij]＝xx；

dx[id].score＝delx；

}

else{

col1[yy]＝dely[yy]；

ij＝dx[id].ijmp；

if(dx[id].jp.n[0]&&(!dna‖(ndely[yy]>＝MAXJMP

&&xx>dx[id].jp.x[ij]+MX)‖mis>dx[id].score+DINS0)){

dx[id].ijmp++；

if(++ij>＝MAXJMP){

writejmps(id)；

ij＝dx[id].ijmp＝0；

dx[id].offset＝offset；

offset+＝sizeof(struct jmp)+sizeof(offset)；

}

dx[id].jp.n[ij]＝-ndely[yy]；

dx[id].jp.x[ij]＝xx；

dx[id].score＝dely[yy]；

}

if(xx＝＝len0&&yy<len1){

/*last col

*/

if(endgaps)

col1[yy]-＝ins0+ins1*(len1-yy)；

if(col1[yy]>smax){

smax＝col1[yy]；

dmax＝id；

}

if(endgaps&&xx<len0)

col1[yy-1]-＝ins0+ins1*(len0-xx)；

if(col1[yy-1]>smax){

smax＝col1[yy-1]；

dmax＝id；

}

tmp＝col0；col0＝col1；col1＝tmp；

}

(void)free((char*)ndely)；

(void)free((char*)dely)；

(void)free((char*)col0)；

(void)free((char*)col1)；}

/*

*

*print()--only routine visible outside this module

*

*static:

*getmat()--trace back best path，count matches:print()

*pr_align()--print alignment of described in array p[]:print()

*dumpblock()--dump a block of lines with numbers，stars:pr_align()

*nums()--put out a number line:dumpblock()

*putline()--put out a line(name，[num]，seq，[num]):dumpblock()

*stars()--put aline of stars:dumpblock()

*stripname()--strip any path and prefix from a seqname

*/

#include＂nw.h＂

#define SPC3

#define P_LINE 256 /*maximum output line*/

#define P_SPC 3 /*space between name or num and seq*/

extern _day[26][26]；

int olen； /*set output line length*/

FILE *fx； /*output file*/

print() print

{

int lx，ly，firstgap，lastgap； /*overlap*/

if((fx＝fopen(ofile，＂w＂))＝＝0){

fprintf(stderr，＂％s:can′t write％s\n＂，prog，ofile)；

cleanup(1)；

}

fprintf(fx，＂<first sequence:％s(length＝％d)\n＂，namex[0]，len0)；

fprintf(fx，＂<second sequence:％s(length＝％d)\n＂，namex[1]，len1)；

olen＝60；

lx＝len0；

ly＝len1；

firstgap＝lastgap＝0；

if(dmax<len1-1){/*leading gap in x*/

pp[0].spc＝firstgap＝lenl-dmax-1；

ly-＝pp[0].spc；

}

else if(dmax>len1-1){/*leading gap in y*/

pp[1].spc＝firstgap＝dmax-(len1-1)；

lx-＝pp[1].spc；

}

if(dmax0<len0-1){/*trailing gap in x*/

lastgap＝len0-dmax0-1；

lx-＝lastgap；

}

else if(dmax0>len0-1){ /*trailing gap in y*/

lastgap＝dmax0-(len0-1)；

ly-＝lastgap；

}

getmat(lx，ly，firstgap，lastgap)；

pr_align()；

}

/*

*trace back the best path，count matches

*/

static

getmat(lx，ly，firstgap，lastgap) getmat

int lx，ly； /*＂core＂(minus endgaps)*/

int firstgap，lastgap；/*leading trailing overlap*/

{

int nm，i0，i1，siz0，siz1；

char outx[32]；

double pct；

register n0，n1；

register char *p0，*p1；

/*get to tal matches，score

*/

i0＝i1＝siz0＝siz1＝0；

p0＝seqx[0]+pp[1].spc；

p1＝seqx[1]+pp[0].spc；

n0＝pp[1].spc+1；

n1＝pp[0].spc+1；

nm＝0；

while(*p0&&*p1){

if(siz0){

p1++；

n1++；

siz0--；

}

else if(siz1){

p0++；

n0++；

siz1--；

}

else{

if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′])

nm++；

if(n0++＝＝pp[0].x[i0])

siz0＝pp[0].n[i0++]；

if(n1++＝＝pp[1].x[i1])

siz1＝pp[1].n[i1++]；

p0++；

p1++；

}

/*pct homology:

*if penalizing endgaps，base is the shorter seq

*else，knock off overhangs and take shorter core

*/

if(endgaps)

lx＝(len0<len1)？len0:len1；

else

lx＝(lx<ly)？lx:ly；

pct＝100.*(double)nm/(double)lx；

fprintf(fx，＂\n＂)；

fprintf(fx，＂<％d match％s in an overlapof％d:％.2f percent similarity\n＂，

nm，(nm＝＝1)？＂＂:＂es＂，lx，pct)；

fprintf(fx，＂<gaps in first sequence:％d＂，gapx)；...getmat

if(gapx){

(void)sprintf(outx，＂(％d％s％s)＂，

ngapx，(dna)？＂base＂:＂residue＂，(ngapx＝＝1)？＂＂:＂s)；

fprintf(fx，＂％s＂，outx)；

fprintf(fx，＂，gaps in second sequence:％d＂，gapy)；

if(gapy){

(void)sprintf(outx，＂(％d％s％s)＂，

ngapy，(dna)？＂base＂:＂residue＂，(ngapy＝＝1)？＂＂:＂s＂)；

fprintf(fx，＂％s＂，outx)；

}

if(dna)

fprintf(fx，

＂\n<score:％d(match＝％d，mismatch＝％d，gappenalty＝％d+％d per base)\n＂，

smax，DMAT，DMIS，DINS0，DINS1)；

else

fprintf(fx，

″\n<score:％d(Dayhoff PAM 250 matrix，gap penalty＝％d+％d per residue)\n＂，

smax，PINS0，PINS1)；

if(endgaps)

fprintf(fx，

＂<endgaps penalized.left endgap:％d％s％s，right endgap:％d％s％s\n＂，

firstgap，(dna)？＂base＂:＂residue＂，(firstgap＝＝1)？＂＂:＂s＂，

lastgap，(dna)？＂base＂:＂residue＂，(lastgap＝＝1)？＂＂:＂s＂)；

else

fprintf(fx，＂<endgaps not penalized\n＂)；

}

static nm； /*matches in core--for checking*/

static 1max； /*lengths of stripped file names*/

static ij[2]； /*jmp index for a path*/

static nc[2]； /*number at start of currentline*/

static ni[2]； /*current elem number--for gapping*/

static siz[2]；

static char *ps[2]； /*ptr to current element*/

static char *po[2]； /*ptr to next output char slot*/

static char out[2][P_LINE]； /*output line*/

static char star[P_LINE]； /*set by stars()*/

/*

*print alignment of described in struct path pp[]

*/

static

pr_align() pr_align

{

int nn； /*char count*/

int more；

registeri；

for(i＝0，1max＝0；i<2；i++){

nn＝stripname(namex[i])；

if(nn>1max)

1max＝nn；

nc[i]＝1；

ni[i]＝1；

siz[i]＝ij[i]＝0；

ps[i]＝seqx[i]；

po[i]＝out[i]；}

for(nn＝nm＝0，more＝1；more；){...pr_align

for(i＝more＝0；i<2；i++){

/*

*do we have more of this sequence？

*/

if(!*ps[i])

continue；

more++；

if(pp[i].spc){ /*leading space*/

*po[i]++＝＂；

pp[i].spc--；

}

else if(siz[i]){ /*in agap*/

*po[i]++＝′-′；

siz[i]--；

}

else{ /* we′re putting a seq element

*/

*po[i]＝*ps[i]；

if(islower(*ps[i]))

*ps[i]＝toupper(*ps[i])；

po[i]++；

ps[i]++；

/*

*are we at next gap for this seq？

*/

if(ni[i]＝＝pp[i].x[ij[i]]){

/*

*we need to merge all gaps

*at this location

*/

siz[i]＝pp[i].n[ij[i]++]；

while(ni[i]＝＝pp[i].x[ij[i]])

siz[i]+＝pp[i].n[ij[i]++]；

}

ni[i]++；

}

if(++nn＝＝olen‖!more&&nn){

dumpblock()；

for(i＝0；i<2；i++)

po[i]＝out[i]；

nn＝0；

}

/*

*dump a block of lines，including numbers，stars:pr_align()

*/

static

dumpblock()dumpblock

{

registeri；

for(i＝0；i<2；i++)

*po[i]--＝′\0′；

...dumpblock

(void)putc(′\n′，fx)；

for(i＝0；i<2；i++){

if(*out[i]&&(*out[i]!＝＂‖*(po[i])!＝＂)){

if(i＝＝0)

nums(i)；

if(i＝＝0&&*out[1])

stars()；

putline(i)；

if(i＝＝0&&*out[1])

fprintf(fx，star)；

if(i＝＝1)

nums(i)；

}

/*

*put out a number line:dumpblock()

*/

static

nums(ix)nums

int ix； /*index in out[]holding seq line*/

{

char nline[P_LINE]；

register i，j；

register char *pn，*px，*py；

for(pn＝nline，i＝0；i<1max+P_SPC；i++，pn++)

*pn＝＂；

for(i＝nc[ix]，py＝out[ix]；*py；py++，pn++){

if(*py＝＝＂‖*py＝＝′-′)

*pn＝＂；

else{

if(i％10＝＝0‖(i＝＝1&&nc[ix]!＝1)){

j＝(i<0)？-i:i；

for(px＝pn；j；j/＝10，px--)

*px＝j％10+′0′；

if(i<0)

*px＝′-′；

}

else

*pn＝＂；

i++；

}

*pn＝′\0′；

nc[ix]＝i；

for(pn＝nline；*pn；pn++)

(void)putc(*pn，fx)；

(void)putc(′\n′，fx)；

}

/*

*put out a line(name，[num]，seq，[num]):dumpblock()

*/

static

putline(ix)putline

int ix； {

...putline

int i；

register char *px；

for(px＝namex[ix]，i＝0；*px&&*px!＝′:′；px++，i++)

(void)putc(*px，fx)；

for(；i<lmax+P_SPC；i++)

(void)putc(＂，fx)；

/*these count from 1:

*ni[]is current element(from1)

*nc[]is number at start of current line

*/

for(px＝out[ix]；*px；px++)

(void)putc(*px&0x7F，fx)；

(void)putc(′\n′，fx)；

}

/*

*put a line of stars(seqs alwaysin out[0]，out[1]):dumpblock()

*/

static

stars()stars

{

int i；

register char *p0，*p1，cx，*px；

if(!*out[0]‖(*out[0]＝＝＂&&*(po[0])＝＝＂)‖

!*out[1]‖(*out[1]＝＝＂&&*(po[1])＝＝＂))

return；

px＝star；

for(i＝1max+P_SPC；i；i--)

*px++＝＂；

for(p0＝out[0]，p1＝out[1]；*p0&&*p1；p0++，p1++){

if(isalpha(*p0)&&isalpha(*p1)){

if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′]){

cx＝′*′；

nm++；

}

else if(!dna&&_day[*p0-′A′][*p1-′A′]>0)

cx＝′.′；

else

cx＝′′；

}

else

cx＝＂；

*px++＝cx；

}

*px++＝′\n′；

*px＝′\0′；

}

/*

*strip path or prefix from pn，return len:pr_align()

*/

static

stripname(pn) stripname

char*pn；/*file name(may be path)*/

{

register char *px，*py；

py＝0；

for(px＝pn；*px；px++)

if(*px＝＝′/′)

py＝px+1；

if(py)

(void)strcpy(pn，py)；

return(strlen(pn))；

}

/*

*cleanup()--cleanup any tmp file

*getseq()--read in seq，set dna，len，maxlen

*g_calloc()--calloc()with error checkin

*readjmps()--get the good jmps，from tmp file if necessary

*writejmps()--write a filled array ofjmps to a tmp file:nw()

*/

#include＂nw.h＂

#include<sys/file.h>

char *jname＝＂/tmp/homgXXXXXX＂； /*tmp file for jmps*/

FILE *fj；

int cleanup()； /*cleanup tmp file*/

long lseek()；

/*

*remove any tmp file if we blow

*/

cleanup(i) cleanup

int i；

{

if(fj)

(void)unlink(jname)；

exit(i)；

}

/*

*read，return ptr to seq，set dna，len，maxlen

*skip lines starting with′；′，′<′，or′>′

*seq in upper or lower case

*/

char*

getseq(file，len) getseq

char *file；/*file name*/

int *len；/*seqlen*/

{

char line[1024]，*pseq；

register char *px，*py；

int natgc，tlen；

FILE *fp；

if((fp＝fopen(file，＂r＂))＝＝0){

fprintf(stderr，＂％s：can′t read％s\n＂，prog，file)；

exit(1)；

}

tlen＝natgc＝0；

while(fgets(line，1024，fp)){

if(*line＝＝′；′‖*line＝＝′<′‖*line＝＝′>′)

continue；

for(px＝line；*px!＝′\n′；px++)

if(isupper(*px)‖islower(*px))

tlen++；

}

if((pseq＝malloc((unsigned)(tlen+6)))＝0){

fprintf(stderr，″％s:malloc()failed to get ％d bytes for ％s\n＂，prog，tlen+6，file)；

exit(1)；

}

pseq[0]＝pseq[1]＝pseq[2]＝pseq[3]＝′\0′；

...getseq

py＝pseq+4；

*len＝tlen；

rewind(fp)；

while(fgets(line，1024，fp)){

if(*line＝＝′；′‖*line＝＝′<′‖*line＝＝′>′)

continue；

for(px＝line；*px!＝′\n′；px++){

if(isupper(*px))

*py++＝*px；

else if(islower(*px))

*py++＝toupper(*px)；

if(index(＂ATGCU＂，*(py-1)))

natgc++；

}

*py++＝′\0′；

*py＝′\0′；

(void)fclose(fp)；

dna＝natgc>(tlen/3)；

return(pseq+4)；

}

char*

g_calloc(msg，nx，sz) g_calloc

char *msg； /*program，calling routine*/

int nx，sz； /*number and size of elements*/

{

char *px，*calloc()；

if((px＝calloc((unsigned)nx，(unsigned)sz))＝＝0){

if(*msg){

fprintf(stderr，＂％s:g_calloc()failed％s(n＝％d，sz＝％d)\n＂，prog，msg，nx，sz)；

exit(1)；

}

return(px)；

}

/*

*get final jmps from dx[]or tmp file，set pp[]，reset dmax:main()

*/

readjmps() readjmps

{

int fd＝-1；

int siz，i0，i1；

register i，j，xx；

if(fj){

(void)fclose(fj)；

if((fd＝open(jname,O_RDONLY,0))<0){

fprintf(stderr,”％s:can′t open()％s\n”，prog。jname)；

cleanup(1)；

}

for(i＝i0＝i1＝0，dmax0＝dmax，xx＝len0；；i++){

while(1){

for(j＝dx[dmax].ijmp；j>＝0&&dx[dmax].jp.x[j]>＝xx；j--)

；

...readjmps

if(j<0&&dx[dmax].offset && fj){

(void)lseek(fd，dx[dmax].offset，0)；

(void)read(fd，(char*)&dx[dmax].jp，sizeof(struct jmp))；

(void)read(fd，(char*)&dx[dmax].offset，sizeof(dx[dmax].offset))；

dx[dmax].ijmp＝MAXJMP-1；

}

else

break；

}

if(i>＝JMPS){

fprintf(stderr，＂％s:too many gaps in alignment\n＂，prog)；

cleanup(1)；

}

if(j>＝0){

siz＝dx[dmax].jp.n[j]；

xx＝dx[dmax].jp.x[j]；

dmax+＝siz；

if(siz<0){/*gap in second seq*/

pp[1].n[i1]＝-siz；

xx+＝siz；

/*id＝xx-yy+len1-1

*/

pp[1].x[i1]＝xx-dmax+len1-1；

gapy++；

ngapy-＝siz；

/*ignore MAXGAP when doing endgaps*/

siz＝(-siz<MAXGAP‖endgaps)？-siz:MAXGAP；

i1++；

}

else if(siz>0){/*gap in first seq*/

pp[0].n[i0]＝siz；

pp[0].x[i0]＝xx；

gapx++；

ngapx+＝siz；

/*ignore MAXGAP when doing endgaps*/

siz＝(siz<MAXGAP‖endgaps)？siz:MAXGAP；

i0++；

}

else

break；

}

/*reverse the order ofjmps

*/

for(j＝0，i0--；j<i0；j++，i0--){

i＝pp[0].n[j]；pp[0].n[j]＝pp[0].n[i0]；pp[0].n[i0]＝i；

i＝pp[0].x[j]；pp[0].x[j]＝pp[0].x[i0]；pp[0].x[i0]＝i；

}

for(j＝0，i1--；j<i1；j++，i1--){

i＝pp[1].n[j]；pp[1].n[j]＝pp[1].n[i1]；pp[1].n[i1]＝i；

i＝pp[1].x[j]；pp[1].x[j]＝pp[1].x[i1]；pp[1].x[i1]＝i；

}

if(fd>＝0)

(void)close(fd)；

if(fj){

(void)unlink(jname)；

fj＝0；

offset＝0；

} }

/*

*write a filled jmp struct offset of the prev one(if any):nw()

*/

writejmps(ix)writejmps

int ix；

{

char*mktemp()；

if(!fj){

if(mktemp(jname)<0){

fprintf(stderr，＂％s:can′t mktemp()％s\n＂，prog，jname)；

cleanup(1)；

}

if((fj＝fopen(jname，＂w＂))＝＝0){

fprintf(stderr，＂％s:can′t write％s\n＂，prog，jname)；

exit(1)；

}

(void)fwrite((char*)&dx[ix].jp，sizeof(structjmp)，1，fj)；

(void)fwrite((char*)&dx[ix].offset，sizeof(dx[ix].offset)，1，fj)；

}

表2

PRO87299 XXXXXXXXXXXXXXX (长度＝15个氨基酸)

比较蛋白质 XXXXXYYYYYYY (长度＝12个氨基酸)

％氨基酸序列同一性＝

(ALIGN-2测定为两种多肽序列之间相同匹配的氨基酸残基数)÷(PRO87299多肽的氨基酸残基总数)＝5÷15＝33.3％

表3

PRO87299 XXXXXXXXXX (长度＝10个氨基酸)

比较蛋白质 XXXXXYYYYYYZZYZ (长度＝15个氨基酸)

％氨基酸序列同一性＝

(ALIGN-2测定为两种多肽序列之间相同匹配的氨基酸残基数)÷(PRO87299多肽的氨基酸残基总数)＝5÷10＝50％

表4

PRO87299-DNA NNNNNNNNNNNNNN (长度＝14个核苷酸)

比较DNA NNNNNNLLLLLLLLLL (长度＝16个核苷酸)

％核酸序列同一性＝

(ALIGN-2测定为两种核酸序列间相同匹配的核苷酸数)÷(PRO87299-DNA核酸序列的核苷酸总数)＝6÷14＝42.9％

表5

PRO87299-DNA NNNNNNNNNNNN (长度＝12个核苷酸)

比较DNA NNNNLLLVV (长度＝9个核苷酸)

％核酸序列同一性＝

(ALIGN-2测定为两种核酸序列间相同匹配的核苷酸数)÷(PRO87299-DNA核酸序列的核苷酸总数)＝

4÷12＝33.3％

II.本发明的组合物和方法

A.全长PRO87299多肽

本发明提供了新鉴定并分离的核苷酸序列，其编码本申请中称为PRO87299多肽的多肽。具体的说，已经鉴定并分离了编码多种PRO87299多肽的cDNA，正如下文实施例进一步详细公开的。

那些克隆的实际核苷酸序列可以由熟练技术人员使用本领域常规方法通过对所保藏克隆测序来容易的测定。预测的氨基酸序列可使用常规技术从核苷酸序列确定。对于本文所述PRO87299多肽及编码核酸，申请人已经鉴定了认为是根据那时可获得的序列信息最好的可鉴定读码框。

B.PRO87299多肽变体

除了本文所述全长天然序列PRO87299多肽，设想了可制备PRO87299变体。PRO87299变体可通过将适宜的核苷酸改变引入PRO87299DNA和/或通过合成期望PRO87299多肽来制备。本领域技术人员将领会，氨基酸改变可改变PRO87299的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或位置或者改变膜锚定特征。

可在本文所述天然全长序列PRO87299中或在PRO87299的各个结构域中进行变异，例如使用例如美国专利5,364,934所述的保守和非保守突变的任何技术和指导方针。变异可以是编码PRO87299的一个或多个密码子的替代、删除或插入，其导致PRO87299的氨基酸序列相对于天然序列PRO87299的改变。任选的是，变异是通过PRO87299的一个或多个结构域中至少一个氨基酸为任何其它氨基酸所替代。通过比较PRO87299的序列与同源已知蛋白质分子的序列，并将高同源区中进行的氨基酸序列改变的数目最少化，可发现确定哪些氨基酸残基可插入、替代或删除而不会对期望活性有不利影响的方针。氨基酸替代可以是将一种氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸替代的结果，诸如用丝氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。插入或删除可任选在约1个至5个氨基酸的范围内。可通过在序列中系统进行氨基酸插入、删除或替代，并对所得变体测试由全长或成熟天然序列展示的活性来确定可容许的变异。

本文提供了PRO87299多肽的片段。例如，在与全长天然蛋白质比较时，此类片段可在N-末端或C-末端截短，或者可缺少内部残基。某些片段缺少对于PRO87299多肽的期望生物学活性不是至关重要的氨基酸残基。

PRO87299片段可通过多种常规技术中的任一种来制备。期望肽片段可化学合成。一种备选方法牵涉通过酶促消化产生PRO87299片段，例如通过用已知在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理蛋白质，或者通过用合适的限制酶消化DNA，并分离期望片段。还有一种合适的技术牵涉分离并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码期望多肽片段的DNA片段。限定DNA片段期望末端的寡核苷酸在PCR中用作5′和3′引物。优选的是，PRO87299多肽片段与本文所公开的天然PRO87299多肽共享至少一种生物学和/或免疫学活性。

在具体实施方案中，感兴趣的保守替代见表6标题“优选替代”下所示。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可引入表6中称为“例示替代”的更实质性改变，或者如下文关于氨基酸类别进一步所述的，并筛选产物。

表6

原始残基	例示替代	优选替代
原始残基	例示替代	优选替代	Ala(A)	val；leu；ile	val
Arg(R)	lys；gln；asn	lys	Ala(A)	val；leu；ile	val
Arg(R)	lys；gln；asn	lys	Asn(N)	gln；his；lys；arg	gln
Asp(D)	glu	glu	Asn(N)	gln；his；lys；arg	gln
Asp(D)	glu	glu	Cys(C)	ser	ser
Gln(Q)	asn	asn	Cys(C)	ser	ser
Gln(Q)	asn	asn	Glu(E)	asp	asp
Gly(G)	pro；ala	ala	Glu(E)	asp	asp
Gly(G)	pro；ala	ala	His(H)	asn；gln；lys；arg	arg

Ile(I)	leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸	leu
Ile(I)	leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸	leu	Leu(L)	正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe	ile
Lys(K)	arg；gln；asn	arg	Leu(L)	正亮氨酸；ile；val；met；ala；phe	ile
Lys(K)	arg；gln；asn	arg	Met(M)	leu；phe；ile	leu
Phe(F)	leu；val；ile；ala；tyr	leu	Met(M)	leu；phe；ile	leu
Phe(F)	leu；val；ile；ala；tyr	leu	Pro(P)	ala	ala
Ser(S)	thr	thr	Pro(P)	ala	ala
Ser(S)	thr	thr	Thr(T)	ser	ser
Trp(W)	tyr；phe	tyr	Thr(T)	ser	ser
Trp(W)	tyr；phe	tyr	Tyr(Y)	trp；phe；thr；ser	phe
Val(V)	ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸	leu	Tyr(Y)	trp；phe；thr；ser	phe

对PRO87299多肽的功能或免疫学身份的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：Asn、Gln、His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守替代将需要用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。还可以将此类替代残基引入保守替代位点，或者更优选的是，引入剩余的(非保守)位点。

变异可使用本领域知道的方法来进行，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描、及PCR诱变。可对克隆的DNA进行定点诱变(Carter et al.，Nucl.Acids Res.13：4331(1986)；Zoller et al.，Nucl.Acids Res.10：6487(1987))、盒式诱变(Wells et al.，Gene 34：315(1985))、限制性选择诱变(restriction selection mutagenesis)(Wells et al.，Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA 317：415(1986))或其它已知技术以产生PRO87299变体DNA。

还可采用扫描氨基酸分析来鉴定沿着邻近序列的一个或多个氨基酸。在优选的扫描用氨基酸中有相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通常是这组中的优选扫描用氨基酸，因为它消除了β-碳上的侧链，而且不大可能改变变体的主链构象(Cunninghamand Wells，Science 244：1081-1085(1989))。丙氨酸通常也是优选的，因为它是最常见的氨基酸。另外，常常在隐蔽位置和暴露位置都能发现它(Creighton，The Proteins，W.H.Freeman & Co.，N.Y.；Chothia，J.Mol.Biol.150：1(1976))。如果丙氨酸替代不产生足够量的变体，那么可使用等排(isoteric)氨基酸。

C.PRO87299的修饰

对PRO87299的共价修饰包括在本发明的范围内。一种类型的共价修饰包括使PRO87299多肽的靶氨基酸残基与有机衍生化试剂反应，该有机衍生化试剂能够与PRO87299的选定侧链或者N-或C-末端残基起反应。用双功能试剂进行的衍生化可用于例如使PRO87299与不溶于水的支持基质或表面交联，以用于抗PRO87299抗体的纯化方法，反之亦然。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮-乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同双功能亚氨酸酯包括二琥珀酰亚胺酯诸如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺诸如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷和诸如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚胺酯等试剂。

其它修饰包括谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基分别脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，SanFrancisco，pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。

本发明范围内所包括的对PRO87299多肽的另一类共价修饰包括改变多肽的天然糖基化样式。“改变天然糖基化样式”在本文中意图指删除一个或多个在天然序列PRO87299中发现的碳水化合物模块(moiety)(或是通过消除潜在糖基化位点，或是通过以化学和/或酶促手段删除糖基化)，和/或添加一个或多个在天然序列PRO87299中不存在的糖基化位点。另外，此短语包括天然蛋白质糖基化中的定性改变，牵涉所存在的多种碳水化合物模块的本质和比例的改变。

向PRO87299多肽中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列而实现。改变可通过例如向天然序列PRO87299中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。可任选通过DNA水平的变化来改变PRO87299氨基酸序列，特别是通过在预先选择的碱基处突变编码PRO87299多肽的DNA，从而产生将翻译成期望氨基酸的密码子。

增加PRO87299多肽上碳水化合物模块的数目的另一种方法是通过使糖苷与多肽化学或酶促偶联。本领域对此类方法有描述，例如1987年9月11日公开的WO87/05330，和Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)。

去除PRO87299多肽上存在的碳水化合物模块可通过化学或酶促方法来实现，或者通过编码充当糖基化靶物的氨基酸残基的密码子的突变替代。化学脱糖基化技术是本领域已知的，而且描述于例如Hakimuddin et al.，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge et al.，Anal.Biochem.118：131(1981)。酶促切割多肽上的碳水化合物模块可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura et al.，Meth.Enzymol.138：350(1987)所述。

对PRO87299的另一类共价修饰包括，以美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述方式，将PRO87299多肽与多种非蛋白质性质的聚合物之一连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化亚烷基(polyoxyalkylene)。

还可以形成嵌合分子的方式修饰本发明的PRO87299，所述嵌合分子包含与另一种异源多肽或氨基酸序列融合的PRO87299。

在一个实施方案中，此类嵌合分子包括带有标签多肽的PRO87299的融合物，所述标签多肽提供了抗标签抗体可选择性结合的表位。表位标签通常位于PRO87299的氨基或羧基末端。此类表位标记形式的PRO87299的存在可使用针对所述标签多肽的抗体来检测。而且，表位标签的提供使PRO87299易于使用抗标签抗体或另一类结合所述表位标签的亲和基质通过亲和纯化来纯化。多种标签多肽及其各自抗体是本领域公知的。例子包括多组氨酸(poly-his)或多-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签；流感HA标签多肽及其抗体12CA5(Field et al.，Mol.Cell.Biol.8：2159-2165(1988))；c-myc标签及其抗体8F9，3C7，6E10，G4，B7和9E10(Evan et al.，Molecular and Cellular Biology5：3610-3616(1985))；及单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)标签及其抗体(Paborsky etal.，Protein Engineering 3(6)：547-553(1990))。其它标签多肽包括Flag肽(Hoppet al.，BioTechnology 6：1204-1210(1988))；KT3表位肽(Martin et al.，Science255：192-194(1992))；α-微管蛋白表位肽(Skinner et al.，J.Biol.Chem.266：15163-15166(1991))；及T7基因10蛋白肽标签(Lutz-Freyermuth et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6393-6397(1990))。

在一个备选实施方案中，嵌合分子可包括PRO87299与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合物。对于二价形式的嵌合分子(也称为“免疫粘附素”)，此类融合物可以是与IgG分子Fc区的融合。Ig融合物优选包含用可溶形式(跨膜结构域删除或失活)的PRO87299多肽置换Ig分子内至少一个可变区的替代。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白融合物包含IgG1分子的铰链区、CH₂区和CH₃区，或者铰链区、CH₁区、CH₂区和CH₃区。关于免疫球蛋白融合物的制备还可参见1995年6月27日授权的美国专利5,428,130。

D.PRO87299的制备

下面的描述主要涉及通过培养用包含PRO87299核酸的载体转化或转染的细胞来生成PRO87299。当然设想了可采用本领域公知的备选方法来制备PRO87299。例如，可使用固相技术通过直接肽合成来生成PRO87299序列或其部分(参见例如Stewart et al.，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.FreemanCo.，San Francisco，CA，1969；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154(1963))。体外蛋白质合成可使用手工技术或通过自动化来进行。自动化合成可例如使用Applied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City，CA)依照制造商的说明书来完成。PRO87299的多个部分可分开化学合成，并使用化学或酶促方法组合以生成全长PRO87299。

1.编码PRO87299的DNA的分离

编码PRO87299的DNA可以从cDNA文库获得，所述cDNA文库从认为具有所述PRO87299 mRNA且以可检测水平表达它的组织制备。因此，人的PRO87299DNA可以方便的从以人组织制备的cDNA文库获得，诸如实施例中所述。PRO87299编码基因也可从基因组文库或通过已知的合成流程(例如自动化核酸合成)获得。

可以用设计用于鉴定目的基因或由其编码的蛋白质的探针(诸如PRO87299的抗体或至少约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选文库。用选定探针筛选cDNA或基因组文库可使用标准流程进行，诸如Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，New York，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989所述。分离编码PRO87299的基因的一种备选方法是使用PCR方法学(Sambrook et al.，见上文；Dieffenbach et al.，PCR Primer：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)。

下文实施例描述了用于筛选cDNA文库的技术。选作探针的寡核苷酸序列应该足够长且足够明确(unambiguous)，使得假阳性降到最低。寡核苷酸优选是标记的，使得它在与所筛选文库中的DNA杂交时可检测出。标记方法是本领域公知的，包括使用放射标记物，像³²P-标记的ATP、生物素化或酶标记。杂交条件，包括中等严格性和高度严格性，见Sambrook et al，见上文。

在此类文库筛选方法中鉴定的序列可以与保藏的和公共数据库诸如GenBank或其它私有序列数据库中可得到的其它已知序列比较和对比。分子限定区域内的或跨越全长序列的序列同一性(或是在氨基酸水平上或是在核苷酸水平上)可使用本领域知道的和本文描述的方法来测定。

具有蛋白质编码序列的核酸可通过使用本文首次公开的推断氨基酸序列筛选选定cDNA或基因组文库来获得，并且必要时，使用Sambrook et al.，见上文所述常规引物延伸流程来检测可能不会逆转录为cDNA的mRNA的前体和加工中间产物。

2.宿主细胞的选择和转化

将宿主细胞用本文所述用于PRO87299生成的表达或克隆载体转染或转化，并在为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而恰当调整的常规营养培养基中培养。培养条件，诸如培养基、温度、pH等等，可以由熟练技术人员无需过多实验就选择。通常，用于使细胞培养物生产力最大化的原理、方案和实用技术可参见Mammalian Cell Biotechnology：aPractical Approach，M.Butler，ed.，IRL Press，1991和Sambrook et al.，见上文。

真核细胞转染和原核细胞转化的方法是普通技术人员所知道的，例如CaCl₂、CaPO₄、脂质体介导的和电穿孔。根据所用宿主细胞，转化使用对此类细胞适宜的标准技术进行。采用氯化钙的钙处理，如Sambrook et al.，见上文所述，或电穿孔通常用于原核细胞。用根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的感染用于某些植物细胞的转化，如Shaw et al.，Gene 23：315(1983)和1989年6月29日公开的WO89/05859所述。对于没有此类细胞壁的哺乳动物细胞，可采用Graham and van der Eb，Virology 52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主系统转染的一般情况参见美国专利4,399,216。进入酵母的转化通常依照Van Solingen et al.，J.Bact.130：946(1977)和Hsiao et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76：3829(1979)的方法来进行。然而，也可使用用于将DNA导入细胞的其它方法，诸如核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合、或聚阳离子例如polybrene、聚鸟氨酸。关于用于转化哺乳动物细胞的多种技术见Keown et al.，Methods inEnzymology 185：527-537(1990)和Mansour et al.，Nature 336：348-352(1988)。

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括原核生物、酵母、或高等真核细胞。合适的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公众可获得的，诸如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)；大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)；大肠杆菌菌株W3110(ATCC 27,325)和K5772(ATCC53,635)。其它合适的原核生物宿主细胞包括肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。这些例子是例示性的而非限制性的。菌株W3110是一个特别优选的宿主或亲本宿主，因为它是用于重组DNA产物发酵的常用宿主菌株。优选的是，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，菌株W3110可以修饰，在编码对宿主而言内源的蛋白质的基因中产生遗传突变，此类宿主的例子包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonAptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3phoA E15(argF-lac)169degP ompT kan^r；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^r；大肠杆菌W3110菌株40B4，它是具有非卡那霉素抗性degP删除突变的菌株37D6；及具有1990年8月7日授权的美国专利4,946,783中公开的突变型周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。或者，体外克隆方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反应也是合适的。

除了原核生物以外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是PRO87299编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach and Nurse，Nature 290：140(1981)；EP139,383，1985年5月2日公开)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主(美国专利4,943,529；Fleer et al.，Bio/Technology 9：968-975(1991))诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt et al.，J. Bacteriol.154(2)：737-742(1983))、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906；Van den Berg et al.，Bio/Technology 8：135(1990))、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)、和马克思克鲁维酵母(Kmarxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070；Sreekrishna et al.，J.Basic Microbiol.28：265-278(1988))；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Case et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76：5259-5263(1979))；许旺酵母属(Schwanniomyces)诸如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)(EP 394,538，1990年10月31日公开)；和丝状真菌诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)(WO 91/00357，1991年1月10日公开)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)(Balance et al.，Biochem. Biophys.Res.Commun.112：284-289(1983)；Tilburn et al.，Gene 26：205-221(1983)；Yelton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474(1984))和黑曲霉(A.niger)(Kelly and Hynes，EMBO J.4：475-479(1985))。甲基营养型酵母(Methylotropic yeast)适于本发明，包括但不限于能够在甲醇上生长的、选自以下属的酵母：汉逊氏酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克勒克氏酵母属(Kloeckera)、毕赤氏酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)、和红酵母属(Rhodotorula)。作为这类酵母的例子的具体物种列表可参见C.Anthony，The Biochemistry ofMethylotrophs，269(1982)。

适用于表达糖基化PRO87299的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞诸如果蝇S2和夜蛾Sf9，以及植物细胞。有用哺乳动物宿主细胞系的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)和COS细胞。更具体的例子包括用SV40转化的猴肾CVl系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.，J.GenVirol.36：59(1977))；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；和小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)。认为适宜宿主细胞的选择在本领域技术范围内。

3.复制型载体的选择和使用

可以将编码PRO87299的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入复制型载体用于克隆(DNA扩增)或表达。多种载体是公众可得到的。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种方法将适宜的核酸序列插入载体。通常，使用本领域已知的技术将DNA插入适宜的限制性内切酶位点。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。包含一种或多种这些构件的合适载体的构建采用技术人员已知的标准连接技术。

PRO87299不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽可以是在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特定切割位点的信号序列或其它多肽。通常，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的PRO87299编码DNA的一部分。信号序列可以是原核信号序列，选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp、或热稳定的肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，信号序列可以是例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母和克鲁维酵母的α-因子前导序列，后者见美国专利5,010,182)、或酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡糖淀粉酶前导序列(1990年4月4日公开的EP 362,179)、或1990年11月15日公开的WO 90/13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列来指导蛋白质的分泌，诸如来自相同或相关物种的分泌型多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列。

表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。众所周知多种细菌、酵母、和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV、或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。

表达和克隆载体通常将包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四环素；(b)补足营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。

适于哺乳动物细胞的选择标志的一个例子是能够鉴定有能力摄取PRO87299编码核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR或胸苷激酶。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的CHO细胞系，其制备和繁殖如Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980)所述。适用于酵母的选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.，1979，Nature 282：39；Kingsman et al.，1979，Gene 7：141；Tschemper et al.，1980，Gene 10：157)。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供了选择标志(Jones，1977，Genetics 85：12)。

表达和克隆载体通常包含与PRO87299编码核酸序列可操作连接的启动子以指导mRNA合成。受到多种潜在宿主细胞识别的启动子是众所周知的。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang et al.，Nature 275：615(1978)；Goeddel et al.，Nature 281：544(1979))、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，Nucleic acids Res.8：4057(1980)；EP36,776)、和杂合启动子诸如tac启动子(deBoer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：21-25(1983))。用于细菌系统的启动子还将包含与编码PRO87299的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。

适用于酵母宿主的启动子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzemanet al.，J.Biol.Chem.255：2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess et al.，J.Adv.Enzyme Reg.7：149(1968)；Holland，Biochemistry 17：4900(1978))的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、和葡糖激酶。

作为具有由生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 73,657。

在哺乳动物宿主细胞中由载体转录PRO87299受到例如由病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒(1989年7月5日公开的UK 2,211,504)、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40)基因组、由异源哺乳动物启动子例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子、及由热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。

可通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码PRO87299的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常大约10至300bp，作用于启动子以增加转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。增强子可以剪接到载体中，位于PRO87299编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人、或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码PRO87299的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。

适合在改动后在重组脊椎动物细胞培养物中合成PRO87299的其它方法、载体和宿主细胞见Gething et al.，Nature 293：620-625(1981)；Mantei et al.，Nature 281：40-46(1979)；EP 117,060；和EP117,058。

4.检测基因扩增/表达

基因的扩增和/或表达可以在样品中直接测量，例如根据本文提供的序列，使用适宜的标记探针，通过常规的Southern印迹、对mRNA转录定量的Northern印迹(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)或原位杂交。或者，可采用能识别特定双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体。继而可标记抗体，并可进行测定法，其中将双链体结合到表面上，从而在双链体在表面上形成时，可检测与双链体结合的抗体的存在。

或者，为了直接对基因产物的表达定量，可通过免疫学方法测量基因表达，诸如细胞或组织切片的免疫组化染色和细胞培养物或体液的测定法。可用于免疫组化染色和/或样品液体测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可针对天然序列PRO87299多肽或针对基于本文提供的DNA序列的合成肽或针对与PRO87299 DNA融合且编码特定抗体表位的外源序列来制备抗体。

5.多肽的纯化

可以从培养液或从宿主细胞裂解物中回收各种形式的PRO87299。如果是膜结合的，那么可使用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶促裂解使其从膜释放。PRO87299表达中所采用的细胞可通过多种物理或化学手段破裂，诸如冻融循环、超声处理、机械破裂、或细胞溶解剂。

可能期望从重组细胞蛋白质或多肽纯化PRO87299。下面的流程是合适纯化流程的例示：在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；蛋白A Sepharose柱以除去污染物诸如IgG；及结合PRO87299的表位标记形式的金属螯合柱。可采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，并描述于例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。纯化步骤的选择将取决于例如所用生成过程的性质和所产生的具体PRO87299。

E.组织分布

表达PRO87299的组织的位置可通过测定各种人组织中的mRNA表达来鉴定。此类基因的定位提供了关于哪些组织最有可能受刺激和抑制PRO87299多肽活性影响的信息。基因在特定组织中的定位还为下文讨论的活性阻断测定法提供了样品组织。

如前所述，各种组织中的基因表达可根据本文中提供的序列，使用恰当标记的探针，通过常规Southern印迹、对mRNA转录定量的Northern印迹(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980))、点印迹(DNA分析)、或原位杂交来测量。或者，可采用识别特定双链体，包括DNA双链体、RNA双链体、及DNA-RNA杂合双链体或DNA-蛋白质双链体的抗体。

或者，多种组织中的基因表达可通过免疫学方法来测量，诸如组织切片的免疫组化染色及细胞培养物或体液的测定法，以直接对基因产物的表达定量。可用于免疫组化染色和/或样品液测定法的抗体可以是单克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳动物中制备。方便的是，可针对天然序列PRO87299多肽或针对基于编码PRO87299多肽的DNA序列的合成肽或针对与编码PRO87299多肽和编码特定抗体表位的DNA融合的外源序列制备抗体。下文提供了用于生成抗体的通用技术及Northern印迹和原位杂交的专用方案。

F.抗体结合研究

PRO87299多肽的活性可进一步通过抗体结合研究来验证，其中分别测试了抗PRO87299抗体抑制PRO87299多肽对组织细胞的作用的能力。例示性抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的、和异源偶联的抗体，下文将描述它们的制备。

抗体结合研究可在任何已知测定法中进行，诸如竞争性结合测定法、直接和间接三明治式测定法、及免疫沉淀测定法。Zola，《Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques》，第147-158页，CRC Press，Inc.，1987。

竞争性结合测定法依赖于经标记标准品与测试样品分析物竞争与有限量的抗体结合的能力。测试样品中靶蛋白质的量与变成与抗体结合的标准品的量成反比。为了便于测定变成结合的标准品的量，抗体优选在竞争之前或之后不溶化，使得与抗体结合的标准品和分析物可方便的与仍然未结合的标准品和分析物分开。

三明治式测定法牵涉使用两种抗体，各自能够结合待检测蛋白质的不同免疫原性部分或表位。在三明治式测定法中，使测试样品分析物受到固定化在固相支持物上的第一抗体的结合，此后使第二抗体结合分析物，如此形成不溶性三元复合物。参见例如美国专利第4,376,110号。第二抗体自身可以是用可检测模块标记的(直接三明治式测定法)，或者可以使用用可检测模块标记的抗免疫球蛋白抗体测量(间接三明治式测定法)。例如，三明治式测定法的一种类型是ELISA测定法，在这种情况中可检测模块是酶。

对于免疫组化，组织样品可以是新鲜的或冷冻的，或者可以是例如在石蜡中包埋的且用防腐剂诸如福尔马林固定的。

G.基于细胞的测定法

免疫相关疾病的基于细胞的测定法和动物模型可用于进一步理解本文中所鉴定的基因和多肽与免疫相关疾病的形成和发病机理之间的关系。

在一种不同的方法中，将已知牵涉特定免疫相关疾病的细胞类型的细胞用本文所述cDNA转染，并分析这些cDNA刺激或抑制免疫功能的能力。合适细胞可用期望基因转染，并监测免疫功能活性。然后此类转染细胞系可用于测试多克隆或单克隆抗体或者抗体组合物抑制或刺激免疫功能，例如调控T细胞增殖或炎性细胞浸润的能力。用本文中所鉴定的基因的编码序列转染的细胞可进一步用于鉴定用于治疗免疫相关疾病的药物候选物。

另外，衍生自转基因动物(如下文所述)的原代培养物可用于本文中的基于细胞的测定法，尽管优选稳定的细胞系。从转基因动物衍生连续细胞系的技术是本领域众所周知的(参见例如Small et al.，Mol.Cell.Biol.，5：642-648(1985))。

一种合适的基于细胞的测定法是混合淋巴细胞反应(MLR)。《CurrentProtocols in Immunology》，单元3.12，J E Coligan，A M Kruisbeek，D HMarglies，E M Shevach，W Strober编，National Institutes of Health，John Wiley& Sons，Inc.。在此测定法中，测定测试化合物刺激或抑制激活的T细胞增殖的能力。将响应者T细胞的悬浮液与同种异基因刺激物细胞一起培养，并通过氚化胸苷摄取测量T细胞增殖。此测定法是T细胞反应性的通用测量方法。由于大多数T细胞在激活时响应并生成IL-2，因此此测定法中响应度的差异部分反映了响应性细胞的IL-2生成的差异。MLR结果可通过标准淋巴因子(IL-2)检测测定法来验证。《Current Protocols in Immunology》，见上文，3.15，6.3。

MLR测定法中的增殖性T细胞响应可能是由于测定分子的直接促有丝分裂特性或外部抗原诱导的激活。T细胞激活要求经由T细胞受体(TCR)介导的抗原特异信号和经由第二配体结合相互作用例如B7(CD80，CD86)/CD28结合相互作用介导的共刺激信号。CD28交联提高激活的T细胞的淋巴因子分泌。T细胞激活具有正负两种控制，经由具有积极或消极作用的配体的结合。CD28和CTLA-4是Ig超家族中结合B7的相关糖蛋白。结合B7的CD28对T细胞激活具有积极的共刺激效果；相反，结合B7的CTLA-4具有T细胞解激活效果。Chambers，C.A.and Allison，J.P.，Curr.Opin.Immunol.，9：396(1997)；Schwartz，R.H.，Cell，71：1065(1992)；Linsey，P. S.and Ledbetter，J.A.，Annu.Rev.Immunol.，11：191(1993)；June，C.H.et al.，Immunol.Today，15：321(1994)；Jenkins，M.K.，Immunity，1：405(1994)。在共刺激测定法中，对PRO87299多肽测定T细胞共刺激或抑制活性。

如在本发明中那样刺激性化合物的直接使用在使用4-1BB糖蛋白的实验中得到验证，4-1BB是肿瘤坏死因子受体家族的成员，结合接触过抗原的T细胞上表达的配体(4-1BBL)并发出T细胞激活和生长信号。Alderson，M.E.et al.，J.Immunol.，24：2219(1994)。

激动剂刺激性化合物的使用也已经通过实验得到验证。通过激动性抗4-1BB抗体处理的4-1BB激活增强肿瘤的根除。Hellstrom，I.and Hellstrom，K.E.，Crit.Rev.Immunol.，18：1(1998)。下文更详细描述的肿瘤治疗的免疫辅助疗法是本发明刺激性化合物的用途的另一个例子。

或者，免疫刺激或增强效果还可通过施用具有血管通透性增强特性的PRO87299来实现。血管通透性增强对可通过局部免疫细胞(例如单核细胞、嗜曙红粒细胞、PMN)浸润和炎症削弱的紊乱将是有益的。

另一方面，PRO87299多肽，以及作为T细胞增殖/激活、淋巴因子分泌、和/或血管通透性的直接抑制物的本发明的其它化合物，可直接用于遏制免疫应答。这些化合物可用于降低免疫应答的程度和治疗特征为过度活跃的、超过最佳的或自身免疫性的应答的免疫相关疾病。本发明化合物的此用途已经通过上文所述实验得到验证，其中结合受体B7的CTLA-4使T细胞解激活。本发明的直接抑制性化合物以类似方式发挥功能。遏制血管通透性的化合物的用途预计将是减轻炎症。此类用途在治疗与过度发炎有关的状况中将是有益的。

或者，结合刺激性PRO87299多肽并阻断这些分子的刺激效果的化合物，例如抗体，产生净抑制效果且可通过抑制T细胞增殖/激活和/或淋巴因子分泌而用于遏制T细胞介导的免疫应答。多肽刺激效果的阻断遏制哺乳动物的免疫应答。此用途已经在使用IL-2抗体的实验中得到验证。在这些实验中，抗体结合IL-2并阻断IL-2结合其受体，由此实现T细胞抑制效果。

H.动物模型

基于细胞的体外测定法的结果可进一步使用体内动物模型和T细胞功能的测定法来验证。多种众所周知的动物模型可用于进一步理解本文中所鉴定的基因在免疫相关疾病的形成和发病机理中的作用，及测试候选治疗剂的功效，包括抗体及天然多肽的其它拮抗剂，包括小分子拮抗剂。此类模型的体内本质使得它们能预报在人类患者中的响应。免疫相关疾病的动物模型包括非重组的和重组的(转基因的)两种动物。非重组动物模型包括例如啮齿类，例如鼠模型。此类模型可使用标准技术，例如皮下注射、尾静脉注射、脾植入、腹膜内植入、肾囊下的植入等，通过将细胞导入同基因小鼠来生成。

移植物抗宿主病在将有免疫能力的细胞移植到免疫遏制或耐受患者中时发生。供体细胞识别并应答宿主抗原。应答可从危及生命的严重炎症至腹泻和体重减轻的轻微病例变化。移植物抗宿主病模型提供了评估针对MHC抗原和次要移植物抗原的T细胞反应性的手段。一种合适的流程详细记载于《Current Protocols in Immunology》，J.E.Cologan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和W.Strober编，John Wiley & Sons，Inc.，1994，单元4.3。

皮肤同种异体移植物排斥的动物模型是测试T细胞介导体内组织破坏的手段及其在移植物排斥中的作用的测量方法。最常用的和公认的模型使用鼠尾部皮肤移植物。重复实验证明皮肤同种异体移植物排斥是由T细胞、辅助T细胞和杀伤效应物T细胞而非抗体介导的。Auchincloss，H.Jr.and Sachs，D.H.，《Fundamental Immunology》，第2版，W.E.Paul编，Raven Press，NY，1989，889-992。一种合适的流程详细记载于《Current Protocols inImmunology》，见上文，单元4.4。可用于测试本发明化合物的其它移植物排斥模型有异基因心脏移植模型，记载于Tanabe，M.et al.，Transplantation，58：23(1994)及Tinubu，S.A.et al.，J.Immunol.，4330-4338(1994)。

迟发型超敏感性的动物模型同样提供了细胞介导的免疫功能的测定法。迟发型超敏感性反应是T细胞介导的体内免疫应答，特征为在抗原挑战后一段时间流逝后才达到峰值的炎症。这些反应也在组织特异性自身免疫病中发生，诸如多发性硬化(MS)和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE，MS的一种模型)。一种合适的流程详细记载于《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元4.5。

EAE是T细胞介导的自身免疫病，特征为T细胞和单核细胞炎症和随后中枢神经系统中轴突的脱髓鞘。EAE通常认为是人MS的相关动物模型。Bolton，C.，Multiple Sclerosis，1：143(1995)。急性和复发-缓和两种模型都已开发。本发明的化合物可针对免疫介导的脱髓鞘病测试T细胞刺激性或抑制性活性，使用《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元15.1和15.2中所述方案。还可参见髓磷脂疾病的模型，其中将少突胶质细胞或施旺(Schwann)细胞移植到中枢神经系统中，如Duncan，I.D.et al.，Molec.Med.Today，554-561(1997)所述。

接触超敏感性是细胞介导的免疫功能的一种简单的迟发型超敏感性体内测定法。在此流程中，使皮肤暴露于外源半抗原，它引起迟发型超敏感性反应，对此测量和定量。接触敏感性牵涉初始敏化阶段，随后是引发阶段。引发阶段在T淋巴细胞遭遇它们先前已经接触过的抗原时发生。发生肿胀和发炎，使之成为人过敏性接触性皮炎的卓越模型。一种合适的流程详细记载于《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元4.2。还可参见Grabbe，S.and Schwarz，T，Immun.Today，19(1)：37-44(1998)。

关节炎的动物模型是胶原诱发的关节炎。此模型共享人自身免疫性类风湿性关节炎的临床、组织学和免疫学特征，是人自身免疫性关节炎的公认模型。小鼠和大鼠模型的特征为滑膜炎、软骨和软骨下骨的侵蚀。本发明的化合物可使用《Current Protocols in Immunology》，见上文，单元15.5中记载的方案来测试针对自身免疫性关节炎的活性。还可参见使用Issekutz，A.C.et al.，Immunology，88：569(1996)中记载的CD18和VLA-4整联蛋白的单克隆抗体的模型。

已经记载了一种哮喘模型，其中通过用卵清蛋白使动物敏化，然后用通过气雾剂投递的相同蛋白质对动物挑战而诱导抗原诱发的气道高反应性、肺嗜曙红细胞增多和炎症。几种动物模型(豚鼠、大鼠、非人灵长类)在用气雾剂抗原挑战后显示与人的特应性哮喘相似的症状。鼠模型具有人哮喘的许多特征。测试本发明化合物在治疗哮喘中的活性和效力的合适流程记载于Wolyniec，W.W.et al.，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，18：777(1998)及其引用的参考文献。

另外，本发明的化合物可在银屑病样疾病的动物模型上测试。有证据表明银屑病的T细胞发病机理。本发明的化合物可在Schon，M.P.etal.，Nat.Med.，3：183(1997)记载的scid/scid小鼠模型中测试，其中小鼠展示与银屑病类似的组织病理学皮肤损伤。另一种合适的模型是如Nickoloff，B.J.etal.，Am.J.Path.，146：580(1995)所述制备的人皮肤/scid小鼠嵌合体。

重组(转基因)动物模型可使用用于生成转基因动物的标准技术通过将本文中所鉴定的基因的编码部分导入目的动物的基因组来改造。可充当转基因操作对象的动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、绵羊、山羊、猪和非人灵长类，例如狒狒、黑猩猩和猴。本领域已知的用于将转基因导入此类动物的技术包括原核显微注射(pronucleic microinjection)(Hoppe and Wanger，美国专利第4,873,191号)；逆转录病毒介导的基因转移进入种系(例如Vander Putten et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：6148-615(1985))；胚胎干细胞中的基因寻靶(Thompson etal.，Cell，56：313-321(1989))；胚胎电穿孔(Lo，Mol.Cel.Biol.，3：1803-1814(1983))；精子介导的基因转移(Lavitrano et al.，Cell，57：717-73(1989))。综述参见例如美国专利第4,736,866号。

为了本发明的目的，转基因动物包括那些只在其部分细胞中携带转基因的动物(“镶嵌动物”)。转基因可作为单一转基因或者串联物例如头-头或头-尾串联物整合。还可能如下将转基因选择性导入特定细胞类型，例如Laskoetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：6232-636(1992)的技术。

转基因在转基因动物中的表达可通过标准技术来监测。例如，Southern印迹分析或PCR扩增可用于验证转基因的整合。然后可使用诸如原位杂交、Northern印迹分析、PCR或免疫细胞化学的技术分析mRNA表达水平。

动物可进一步检验免疫病病理学的征候，例如通过组织学检验以测定免疫细胞进入特定组织的浸润。还可进行阻断实验，其中用本发明的化合物处理转基因动物以测定化合物刺激或抑制T细胞增殖的程度。在这些实验中，将如上所述制备的结合PRO87299多肽的阻断性抗体施用于动物并测定对免疫功能的效果。

或者，可构建“敲除”动物，它由于编码本文中所鉴定的多肽的内源基因和导入动物胚胎细胞的改变的编码该多肽的基因组DNA之间的同源重组而具有缺陷的或改变的编码该多肽的基因。例如，编码特定多肽的cDNA可依照已建立的技术用于克隆编码该多肽的基因组DNA。可以将编码特定多肽的基因组DNA的一部分删除或用另一基因替换，诸如可用于监测整合的、编码选择标志的基因。通常，载体中包含数千碱基未改变的侧翼DNA(5′和3′末端都有)(关于同源重组载体的描述参见例如Thomas and Capecchi，Cell，51：503(1987))。将载体导入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，并选择其中所导入DNA与内源DNA发生同源重组的细胞(参见例如Li et al.，Cell，69：915(1992))。然后将所选细胞注射到动物(例如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合体(参见例如Bradley，在《Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells：A Practical Approach》中，E.J.Robertson编，IRL，Oxford，1987，第113-152页)。然后可将嵌合胚植入合适的假孕雌性代孕动物，并使胚胎足月产生“敲除”动物。在其生殖细胞中包含同源重组DNA的后代可通过标准技术鉴定，并用于繁殖其中动物的所有细胞都包含同源重组DNA的动物。敲除动物可以在例如由于缺乏该多肽而具有抵御某些病理状况的能力和形成病理状况方面表征。

I.免疫辅助疗法

在一个实施方案中，本发明的免疫刺激性化合物可用于肿瘤(癌症)治疗的免疫辅助疗法。现在已经明确确立了T细胞识别人肿瘤特异抗原。由MAGE、BAGE和GAGE基因家族编码的一组肿瘤抗原在所有成人正常组织中是沉默的，但在肿瘤中以显著量表达，诸如黑素瘤、肺肿瘤、头和颈肿瘤、及膀胱癌。DeSmet，C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：7149(1996)。已经证明T细胞的共刺激在体外和在体内都诱导肿瘤消退和抗肿瘤应答。Melero，I.etal.，Nature Medicine，3：682(1997)；Kwon，E.D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：8099(1997)；Lynch，D.H.etal.，Nature Medicine，3：625(1997)；Finn，O.J.and Lotze，M.T.，J.Immunol.，21：114(1998)。本发明的刺激性化合物可作为佐药单独施用，或者联合生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂，以刺激T细胞增殖/激活和对肿瘤抗原的抗肿瘤应答。生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂可以使用已知施用方案以常规量施用。本发明化合物的免疫刺激活性容许降低生长调节剂、细胞毒剂或化疗剂的量，由此潜在降低对患者的毒性。

J.药物候选物的筛选测定法

药物候选物的筛选测定法设计成鉴定与本文中所鉴定的基因编码的多肽或其生物学活性片段结合或复合或者以其它方式干扰所编码多肽与其它细胞蛋白质相互作用的化合物。此类筛选测定法将包括可适应化学文库高通量筛选，使之特别适于鉴定小分子药物候选物的测定法。所设想的小分子包括合成的有机或无机化合物，包括肽，优选可溶性肽、(多)肽-免疫球蛋白融合物、和特别是抗体，包括但不限于多克隆和单克隆抗体及抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体、及此类抗体或片段的嵌合的或人源化的型式，以及人抗体和抗体片段。测定法可以多种形式进行，包括蛋白质-蛋白质结合测定法、生化筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法，它们在本领域已全面表征。所有测定法的共同之处在于它们要求使药物候选物接触由本文中所鉴定的核酸编码的多肽，接触的条件和时间足以容许这两种成分相互作用。

在结合测定法中，相互作用指结合，而且可分离或检测反应混合物中形成的复合物。在一个具体的实施方案中，将由本文中所鉴定的基因编码的多肽或药物候选物通过共价或非共价附着固定在固相上，例如微量滴定板上。非共价附着通常是通过用多肽溶液包被固相并干燥来实现的。或者，可将对待固定多肽特异的固定化抗体，例如单克隆抗体，用于将它锚定至固相表面。测定法如下进行，将非固定化成分(它可以用可检测标记物标记)添加至固定化成分(例如含锚定成分的经包被表面)。当反应完成时，除去未反应成分，例如通过清洗，并检测锚定在固相表面上的复合物。若最初的非固定化成分携带可检测标记物，则固定在表面上的标记物的检出指示发生了复合。若最初的非固定化成分不携带标记物，则可通过例如使用特异性结合固定化复合物的经标记抗体来检测复合。

如果候选化合物与由本文中所鉴定的基因编码的特定蛋白质相互作用但不结合它，那么与该蛋白质的相互作用可通过众所周知的用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法来测定。此类测定法包括诸如交联、免疫共沉淀、及经由梯度或层析柱的共纯化的传统方法。另外，蛋白质-蛋白质相互作用可通过使用Fields及其同事描述的基于酵母的遗传系统(Fields and Song，Nature(London)，340：245-246(1989)；Chien et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582(1991))如Chevray and Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：5789-5793(1991)所公开的来监测。许多转录激活物，诸如酵母GAL4，由两个物理上离散的模块结构域组成，一个作为DNA结合结构域，另一个作为转录激活结构域。前述出版物中记载的酵母表达系统(通常称为“双杂交系统”)利用了这种特性，采用两种杂合蛋白，在其中之一中靶蛋白质与GAL4的DNA结合结构域融合，在另一中候选活化蛋白质与激活结构域融合。GAL1-lacZ报道基因在GAL4激活的启动子控制下的表达依赖于GAL4活性经蛋白质-蛋白质相互作用的重建。含相互作用多肽的菌落用β-半乳糖苷酶的显色底物来检测。使用双杂交技术来鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完整试剂盒(MATCHMAKER^TM)可从Clontech购得。此系统还可延伸至对参与特定蛋白质相互作用的蛋白质结构域的作图以及指出对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。

为了找到干扰本文中所鉴定的基因的产物与其它胞内或胞外组分相互作用的化合物，通常在足以容许两种产物相互作用和结合的条件和时间下制备包含基因产物及胞内或胞外组分的反应混合物。为了测试测试化合物抑制结合的能力，在缺乏和存在测试化合物时进行反应。另外，可以向第三份反应混合物中加入安慰剂，作为阳性对照。如上所述监测混合物中存在的基因产物和胞内或胞外组分之间的结合(复合物形成)。对照反应中形成复合物但含有测试化合物的反应混合物中没有形成复合物表明，测试化合物干扰基因产物与其反应配偶体的相互作用。

K.用于治疗免疫相关疾病的组合物和方法

可用于治疗免疫相关疾病的组合物包括但不限于抑制或刺激免疫功能，例如T细胞增殖/激活、淋巴因子释放、或免疫细胞浸润的蛋白质、抗体、有机小分子、肽、磷酸肽、反义和核酶分子、三股螺旋分子等。

例如，反义RNA和DNA分子通过与靶mRNA杂交并阻止蛋白质翻译来直接阻断mRNA的翻译而起作用。在使用反义DNA时，优选衍生自翻译起始位点的寡脱氧核糖核苷酸，例如靶基因核苷酸序列的约-10和+10位置之间。

核酶是能够催化RNA特异切割的酶活性RNA分子。核酶通过与互补靶RNA的序列特异性杂交及后续内切核酸切割起作用。潜在RNA靶物内的特定核酶切割位点可通过已知技术来鉴定。进一步细节参见例如Rossi，CurrentBiology4，469-471(1994)及PCT公开号WO 97/33551(1997年9月18日公开)。

用于抑制转录的三股螺旋形式的核酸分子应当是单链且由脱氧核苷酸构成。这些寡核苷酸的碱基组成设计成使其经Hoogsteen碱基配对原则促进三股螺旋形成，这通常要求双链体的一条链上有一长段嘌呤或嘧啶。进一步细节参见例如PCT公开号WO 97/33551，见上文。

这些分子可通过上文讨论的任何筛选测定法或其任意组合和/或通过本领域技术人员众所周知的任何其它筛选技术来鉴定。

L.抗PRO87299抗体

本发明还提供了抗PRO87299抗体。例示性的抗体包括多克隆的、单克隆的、人源化的、双特异性的、和异源偶联的抗体。

1.多克隆抗体

抗PRO87299抗体可包括多克隆抗体。用于制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的。多克隆抗体可在哺乳动物中生成，例如通过一次或多次注射免疫剂和根据需要的佐剂。通常，免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹膜内注射而注射到哺乳动物中。免疫剂可包括PRO87299多肽或其融合蛋白。将免疫剂与已知在所免疫哺乳动物中有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的。此类免疫原性蛋白质的例子包括但不限于匙孔

血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可采用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酰基脂质A、合成的海藻糖dicorynomycolate)。免疫方案可以由本领域技术人员无需过多实验做出选择。

2.单克隆抗体

或者，抗PRO87299抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可使用杂交瘤法制备，诸如Kohler and Milstein，Nature 256：495(1975)所述。在杂交瘤法中，小鼠、仓鼠或其它适宜的宿主动物通常用免疫剂免疫以引发生成或能够生成将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。

免疫剂将通常包括PRO87299多肽或其融合蛋白。通常，或是使用外周血淋巴细胞(“PBL”)，若希望人起源的细胞，或是使用脾细胞或淋巴节细胞，若希望非人哺乳动物来源。然后，使用合适的融合剂，诸如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，Academic Press(1986)，pp.59-103)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人起源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适的培养基中培养，所述培养基优选含有抑制未融合的永生化细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。

优选的永生化细胞系是那些高效融合、支持选定的抗体生成细胞稳定的高水平的表达抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠源骨髓瘤系，可从例如索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diege，California，USA)和美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，Virginia，USA)获得。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York(1987)pp.51-63)。

然后可对杂交瘤细胞在其中培养的培养基测定针对PRO87299的单克隆抗体的存在。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和测定法是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson and Pollard，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

在鉴定得到期望的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，见上文)。适于这一目的的培养基包括例如Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基或RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在哺乳动物中作为腹水进行体内培养。

可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基或腹水分开或纯化。

单克隆抗体还可通过重组DNA技术来生成，诸如美国专利4,816,567中所述。编码本发明单克隆抗体的DNA易于使用常规流程分离和测序(例如使用能够特异性结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞是此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以修饰DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源鼠源序列(美国专利4,816,567；Morrison et al.，见上文)，或者通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可用此类非免疫球蛋白多肽替代本发明抗体的恒定区，或者可用它替代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体。

抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域众所周知的。例如，一种方法牵涉免疫球蛋白轻链和经修饰重链的重组表达。重链通常在Fc区中的任何点截短，从而防止重链交联。或者，相关半胱氨酸残基用另一种氨基酸残基替代或者删除，从而防止交联。

体外方法也适于制备单价抗体。消化抗体以生成其片段，特别是Fab片段，可使用本领域已知的常规技术来完成。

3.人抗体和人源化抗体

本发明的抗PRO87299抗体还可包括人源化抗体或人抗体。非人(例如鼠源)抗体的人源化形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)₂或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)中的互补决定区(CDR)残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的CDR残基替换的抗体。在有些情况中，将人免疫球蛋白的Fv框架残基用相应的非人残基替换。人源化抗体还可包含在受体抗体和输入CDR或框架序列中都没有发现的残基。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变区，其中整个或基本上整个CDR对应于非人免疫球蛋白的CDR，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白共有序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

用于人源化非人抗体的方法是本领域众所周知的。通常，人源化抗体中引入了一个或多个来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))，即用啮齿类CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中基本上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。

还可使用本领域已知的多种技术生成人抗体，包括噬菌体展示库(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991))。类似的，人抗体可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物，例如小鼠来生成。在攻击时，观察到人抗体生成，在所有方面与在人体中看到的非常相像，包括基因重排、装配和抗体全集。此方法记载于例如美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，及下列科学出版物：Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。

抗体还可以如上所述使用已知的选择和/或诱变方法进行亲和力成熟。优选的亲和力成熟的抗体具有比用于制备该成熟抗体的起始抗体(通常是鼠的、人源化的或人的)高5倍，更优选10倍，甚至更优选20或30倍的亲和力。

4.双特异性抗体

双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆，优选人或人源化抗体。在这种情况中，一种结合特异性是对PRO87299，另一种是对任何其它抗原，优选对细胞表面蛋白或者受体或受体亚基。

用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生成基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein and Cuello，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成十种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常通过亲和层析步骤来完成。1993年5月13日公开的WO93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.10：3655-3659(1991)中披露了类似的流程。

可将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。关于生成双特异性抗体的更多详情参见例如Suresh et al.，Methods in Enzymology 121：210(1986)。

根据WO 96/27011中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定区的至少部分C_H3区。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。

双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)₂双特异性抗体)。文献中描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science 229：81(1985)描述了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)₂片段的流程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成的情况下还原。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

Fab’片段可直接从大肠杆菌中回收，并化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.175：217-225(1992)描述了生成完全人源化的双特异性抗体F(ab′)₂分子。每个Fab′片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳房肿瘤靶的溶解活性。

还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域与另一个片段上的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.152：5368(1994)。设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.147：60(1991)。

例示性的双特异性抗体可结合本文中给定PRO87299多肽上的两种不同表位。或者，可以将抗PRO87299多肽臂与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28、或B7)或IgG的Fc受体(FcγR)诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂联合起来，从而将细胞防御机制聚焦于表达特定PRO87299多肽的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达特定PRO87299多肽的细胞。这些抗体拥有PRO87299结合臂及结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。另一种感兴趣的双特异性抗体结合PRO87299多肽，还结合组织因子(TF)。

5.异源偶联抗体

异源偶联抗体也在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。此类抗体建议例如用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)及用于治疗HIV感染(WO 91/00360；WO 92/200373；EP03089)。设想了可在体外使用合成蛋白质化学的已知方法制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐(iminothiolate)和4-巯基丁亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美国专利4,676,980中所公开的。

6.效应物功能工程改造

可能希望在效应物功能方面修饰本发明的抗体，从而增强例如抗体在治疗癌症中的效力。例如，可向Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见Caron et al.，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolffet al.，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。

7.免疫偶联物

本发明还关于包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。

上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。

抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。

在另一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核素)偶联的“配体”(如生物素)。

8.免疫脂质体

本文中所公开的抗体还可配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体可通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545。循环时间延长的脂质体披露于美国专利5,013,556。

可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有设定孔径的滤器，产生具有期望直径的脂质体。可如Martin et al.，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂(诸如多柔比星(Doxorubicin))。参见Gabizon et al.，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989)。

M.药用组合物

本发明的活性PRO87299分子(例如PRO87299多肽、抗PRO87299抗体、和/或各自变体)以及通过上文公开的筛选测定法鉴定的其它分子，可以药用组合物的形式施用以治疗免疫相关疾病。

本发明的活性PRO87299分子，优选多肽或抗体的治疗用配制剂如下制备供贮存，即以冻干剂型或水溶液的形式，将具有期望纯度的活性分子与任选的药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington′s PharmaceuticalSciences，16th edition，Osol，A.Ed.，1980)。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。

通过本文公开的筛选测定法鉴定的化合物可使用本领域众所周知的标准技术以类似方式配制。

脂转染或脂质体也可用于将PRO87299分子投递到细胞中。在使用抗体片段时，优选特异性结合靶蛋白质的结合结构域的最小抑制性片段。例如，基于抗体的可变区序列，可设计保留结合靶蛋白质序列的能力的肽分子。此类肽可化学合成和/或通过重组DNA技术生成(参见例如Marasco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7889-7893(1993))。

本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。或者/另外，组合物还可包含细胞毒剂、细胞因子或生长抑制剂。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合存在。

活性PRO87299分子还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington′sPharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.Ed.，1980。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

可制备PRO87299分子的持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。

N.治疗方法

设想了本发明的多肽、抗体和其它活性化合物可用于治疗多种免疫相关疾病和状况，诸如T细胞介导的疾病，包括那些特征为炎性细胞浸润进入组织、刺激T细胞增殖、抑制T细胞增殖、提高或降低血管通透性或其抑制的。

将用本发明的多肽、抗体和其它化合物治疗的例示性状况或紊乱包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼发型慢性关节炎、骨关节炎、脊椎关节病、系统性硬化(硬皮病)、特发性免疫性肌病(皮肌炎、多肌炎)、斯耶格伦氏(

)综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病诸如多发性硬化、特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征、和慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病诸如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型和其它非嗜肝病毒肝炎)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎和硬化性胆管炎、炎性肠病(溃疡性结肠炎、克罗恩氏(Crohn)病)、麸胶敏感性肠病、和惠普尔氏(Whipple)病、自身免疫或免疫介导的皮肤病包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、银屑病、变应性疾病诸如哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏和荨麻疹、肺的免疫学疾病诸如嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化和超敏感性肺炎、移植相关疾病包括移植物排斥和移植物抗宿主病。

在系统性红斑狼疮中，疾病的主要介质是生成对自身蛋白质/组织的自身反应性抗体及随后生成免疫介导的炎症。抗体或是直接或是间接介导组织损伤。尽管T淋巴细胞未显示出直接牵涉组织损伤，然而T淋巴细胞是形成自身反应性抗体所要求的。疾病的发生因此依赖T淋巴细胞。多个器官和系统在临床上受到影响，包括肾、肺、肌肉骨骼系统、粘膜皮肤、眼、中枢神经系统、心血管系统、胃肠道、骨髓和血液。

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性系统性自身免疫性炎性疾病，主要牵涉多个关节的滑膜，由此导致对关节软骨的损伤。发病机制依赖T淋巴细胞，而且与类风湿因子，针对自身IgG的自身抗体的生成有关，由此导致免疫复合物的形成，它在关节液和血液中达到高水平。关节中的这些复合物可诱发显著的淋巴细胞和单核细胞浸润到滑膜中及随后显著的滑膜变化；关节腔/液受到类似细胞的浸润及添加许多嗜中性粒细胞。受影响的组织主要是关节，常常是对称样式。然而，关节外疾病也存在两种主要形式。一种形式是形成关节外损伤，伴有正在进行的渐进性关节病和肺纤维化、血管炎和皮肤溃疡的典型损伤。关节外疾病的第二种形式是所谓的费尔提氏(Felty)综合征，它发生在RA病程晚期，有时在关节病已经沉寂后，且牵涉出现嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症和脾肿大。这可伴随着多个器官中的血管炎及梗塞、皮肤溃疡和坏疽的形成。患者还常常在受影响关节上面的皮下组织中形成类风湿性节结；晚期的节结具有由混合的炎性细胞浸润物包围的坏死中心。可在RA中出现的其它表现包括：心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎、伴有肺纤维化的间质性肺炎、干燥性角膜结膜炎和类风湿性节结。

幼发型慢性关节炎是一种慢性特发性炎性疾病，常常开始于16岁之前。其表型与RA有些相似；类风湿因子阳性的一些患者归入幼发型类风湿性关节炎。疾病细分为三种主要类别：少数关节的、多关节的和系统性的。关节炎可以是严重的，通常是破坏性的，并导致关节僵硬和生长迟缓。其它表现可包括慢性前葡萄膜炎和系统性淀粉样变。

脊椎关节病是具有一些普遍临床特征且普遍与HLA-B27基因产物表达有关的一组紊乱。这些紊乱包括：强直性脊柱炎、莱特尔氏(Reiter)综合征(反应性关节炎)、与炎性肠病有关的关节炎、与银屑病相关的脊椎炎、幼发型脊椎关节病及无差别(undifferentiated)脊椎关节病。区别性特征包括具有或没有脊椎炎的骶髂关节炎；炎性不对称关节炎；与HLA-B27有关(血清学上定义的MHC I型HLA-B基因座的等位基因)；眼炎症；及与其它类风湿性疾病有关的自身抗体的缺乏。对于诱发疾病来说关键的最相关细胞是CD8+T淋巴细胞，靶向由MHC I型分子呈递的抗原的细胞。CD8+T细胞可与MHC I型等位基因HLA-B27反应，就像它是由MHC I型分子表达的外源肽。已有假设，HLA-B27的表位可能模拟细菌或其它微生物的抗原性表位，因此诱导CD8+T细胞应答。

系统性硬化(硬皮病)的病因学未知。疾病的特点是皮肤硬化；这可能是由活性炎性过程诱导的。硬皮病可以是局部的或系统性的；血管损伤是普遍的，而且微血管系统中的内皮细胞损伤是系统性硬化发展中的早期且重要的事件；血管损伤可能由免疫介导。皮肤损伤中存在单核细胞浸润物及在许多患者中存在抗核抗体暗示免疫学基础。ICAM-1常常在皮肤损伤中成纤维细胞的细胞表面上调，说明T细胞与这些细胞相互作用可能在疾病的发病机理中起作用。牵涉的其它器官包括：胃肠道：平滑肌萎缩和纤维化，导致异常蠕动/运动；肾：同中心内皮下内膜增生，影响小弓形和叶间动脉，从而降低肾皮质血流，导致蛋白尿、氮血症和高血压；骨骼肌：萎缩、间质性纤维化、炎症；肺：间质性肺炎和间质性纤维化；及心：收缩带坏死、疤痕化/纤维化。

特发性炎性肌病，包括皮肌炎、多肌炎和其它，是导致肌肉软弱的未知病因的慢性肌肉炎性紊乱。肌肉损伤/发炎常常是对称的和渐进的。自身抗体与大多数形式有关。这些肌炎特异性自身抗体针对并抑制牵涉蛋白质合成的成分、蛋白质和RNA的功能。

斯耶格伦氏(

)综合征是由免疫介导的炎症及随后泪腺和唾液腺功能破坏引起的。该病可能与炎性结缔组织疾病有关或伴随着炎性结缔组织疾病。该病与针对Ro和La抗原的自身抗体生成有关，这两种抗原都是小RNA-蛋白质复合物。损害导致干燥性角膜结膜炎、口干燥、及其它表现或关联，包括胆汁性肝硬化、外周或感觉神经病、和可触知的紫癜。

系统性血管炎是这样的疾病，其中原发性损伤是炎症，后续对血管的损伤导致由受影响血管供应的组织缺血/坏死/变性，且在有些情况中最终导致终端器官功能障碍。血管炎病还可作为其它免疫-发炎介导疾病诸如类风湿性关节炎、系统性硬化等的继发损伤或后遗症发生，特别是在还与免疫复合物形成有关的疾病中。原发性系统性血管炎组中的疾病包括：系统性坏死性血管炎：节结性多动脉炎、过敏性血管炎和肉芽肿病、多脉管炎；韦格纳氏(Wegener)肉芽肿病；淋巴瘤样肉芽肿病；和巨细胞性动脉炎。各种各样的血管炎病包括：粘膜与皮肤淋巴结综合征(MLNS或川畸氏(Kawasaki)病)、分离的CNS血管炎、贝切特氏(Behet)病、血栓闭塞性血管炎(伯格氏(Buerger)病)和皮肤坏死性小静脉炎。所列大多数类型的血管炎的发病机理认为主要是由于免疫球蛋白复合物在血管壁中沉积及随后经ADCC、补体活化或者两者诱导的炎性应答。

节结病是病因学未知，特征在于几乎机体任何组织中都存在上皮样肉芽肿的状况；最常见的是牵涉肺。发病机理牵涉患病部位持续存在活化的巨噬细胞和淋巴样细胞及随后由这些细胞类型释放局部和系统性活性产物而导致的慢性后遗症。

自身免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血、免疫性全血细胞减少症和阵发性夜间血红蛋白尿，是由于生成与红细胞(和在有些情况中以及其它血细胞，包括血小板)表面表达的抗原反应的抗体的结果，是经补体介导的溶解和/或ADCC/Fc受体介导的机制去除那些抗体包被细胞的反映。

在自身免疫性血小板减少症，包括血小板减少性紫癜，和其它临床背景中免疫介导的血小板减少症中，由于抗体或补体附着于血小板及随后经补体溶解、ADCC或Fc受体介导的机制去除而发生血小板破坏/去除。

甲状腺炎，包括格雷夫斯氏(Graves)病、桥本氏(Hashimoto)甲状腺炎、幼发型淋巴细胞性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎，是由于针对甲状腺抗原的自身免疫应答及产生与存在于甲状腺中且通常对甲状腺特异的蛋白质反应的抗体。现有的实验模型包括自发性模型：大鼠(BUF和BB大鼠)和鸡(肥胖鸡品系)；可诱导模型：用甲状腺球蛋白、甲状腺微粒体抗原(甲状腺过氧化物酶)免疫动物。

I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病是胰岛β细胞的自身免疫性破坏；该破坏由自身抗体和自身反应性T细胞介导。胰岛素或胰岛素受体的抗体也可产生胰岛素不响应的表型。

免疫介导的肾病，包括肾小球肾炎和肾小管间质性肾炎，是由于抗体或T淋巴细胞介导的对肾组织的损伤，或是直接由于生成针对肾抗原的自身反应性抗体或T细胞，或是间接由于针对其它非肾抗原有反应性的抗体和/或免疫复合物在肾中沉积。因此，导致免疫复合物形成的其它免疫介导的疾病也可作为间接后遗症诱导免疫介导的肾病。直接和间接的免疫机制都导致炎性应答，它在肾组织中产生/诱导损伤形成，导致器官功能受损，在有些情况中发展成肾衰竭。体液和细胞两种免疫机制都可牵涉损伤的发病机理。

中枢和周围神经系统的脱髓鞘病，包括多发性硬化；特发性脱髓鞘多神经病或格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征；和慢性炎性脱髓鞘多神经病，认为具有自身免疫基础，而且由于对少突胶质细胞或对髓鳞脂直接造成损害而导致神经脱髓鞘。在MS中，有证据表明该病的诱导和发展依赖T淋巴细胞。多发性硬化是依赖T淋巴细胞的脱髓鞘病，而且具有复发-缓和过程或漫长的渐进过程。病因未知；然而，病毒感染、遗传恶病质、环境和自身免疫性都会起作用。损伤含有主要由T淋巴细胞介导的浸润物、小胶质细胞和浸润的巨噬细胞；CD4+T淋巴细胞是损伤处的主要细胞类型。少突胶质细胞死亡和随后脱髓鞘的机理未知，但是可能是由T淋巴细胞驱动的。

炎性和纤维化肺病，包括嗜曙红细胞性肺炎；特发性肺纤维化和超敏性肺炎，可能牵涉不受调控的免疫-发炎应答。抑制该应答将具有治疗益处。

自身免疫或免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎，由自身抗体介导，其发生依赖T淋巴细胞。

银屑病是T淋巴细胞介导的炎性疾病。损伤含有T淋巴细胞、巨噬细胞和抗原加工细胞，及一些嗜中性粒细胞的浸润物。

变应性疾病，包括哮喘；变应性鼻炎；特应性皮炎；食物超敏性；和荨麻疹，依赖T淋巴细胞。这些疾病主要由T淋巴细胞诱导的炎症、IgE介导的炎症或二者组合介导。

移植相关疾病，包括移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)，依赖T淋巴细胞；抑制T淋巴细胞功能具有改善作用。

其中干预免疫和/或炎性应答有益的其它疾病有传染病，包括但不限于病毒感染(包括但不限于AIDS、甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎和疱疹)、细菌感染、真菌感染、及原生动物和寄生虫感染(刺激MLR的分子(或衍生物/激动剂)可在治疗上用于增强对传染因子的免疫应答)；免疫缺陷病(刺激MLR的分子/衍生物/激动剂可在治疗上用于增强对遗传性、获得性、感染诱发的(如在HIV感染中)或医源性(即如源自化疗)免疫缺陷的状况的免疫应答)；和瘤形成。

已经证实，有些人癌症患者形成了对瘤细胞上抗原的抗体和/或T淋巴细胞应答。还在瘤形成的动物模型中证明，增强免疫应答可导致该特定瘤的排斥或消退。在MLR中增强T淋巴细胞应答的分子可用于在体内增强针对瘤形成的免疫应答。在MLR中增强T淋巴细胞增殖性应答的分子(或以激动性方式影响相同受体的小分子激动剂或抗体)可在治疗上用于治疗癌症。在MLR中抑制淋巴细胞应答的分子在体内在瘤形成过程中也起到遏制对瘤的免疫应答的作用；此类分子可以是由瘤细胞自身表达的，或者它们的表达是由瘤在其它细胞中诱导的。此类抑制性分子的拮抗作用(或是用抗体、小分子拮抗剂或是通过其它手段)增强免疫介导的肿瘤排斥。

另外，抑制具有促炎特性的分子在再灌注损伤、中风、心肌梗死、动脉粥样硬化、急性肺损伤、失血性休克、烧伤、败血病/感染性休克、急性肾小管坏死、子宫内膜异位症、变性关节病和胰腺炎中可能具有治疗效益。

依照已知方法，诸如静脉内施用，如推注或通过持续一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入(鼻内、肺内)路径，将本发明的化合物例如多肽或抗体施用于哺乳动物，优选人。优选静脉内或吸入施用多肽和抗体。

在免疫辅助疗法中，可将其它治疗方案，诸如施用抗癌药，与施用本发明的蛋白质、抗体或化合物联合。例如，将用本发明的免疫佐药治疗的患者还可接受抗癌药(化疗剂)或放射疗法。此类化疗剂的制备和剂量给药方案可依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验决定。此类化疗剂的制备和剂量给药方案还记载于《Chemotherapy Service》，M.C.Perry编，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。化疗剂可在施用免疫佐药之前或之后，或者可以与它同时给予。另外，抗雌激素化合物诸如他莫昔芬或抗孕酮诸如奥那司酮(参见EP 616812)可以以此类分子知道的剂量给予。

可能希望还施用针对其它免疫疾病相关或肿瘤相关抗原的抗体，诸如结合CD20、CD11a、CD18、ErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4或血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。或者/另外，可将本文中所公开的结合相同或者两种或多种不同抗原的两种或多种抗体共施用于患者。有时，还对患者施用一种或多种细胞因子可能是有益的。在一个实施方案中，PRO87299多肽与生长抑制剂共施用。例如，可首先施用生长抑制剂，后续PRO87299多肽。然而，还设想了同时施用或首先施用。生长抑制剂的合适剂量就是那些目前所使用的，而且可由于生长抑制剂和PRO87299多肽的联合作用(协同作用)而降低。

对于免疫相关疾病的治疗或严重程度降低，本发明化合物的适宜剂量将取决于如上文所定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程，无论施用药剂是为了预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对化合物的响应、及主治医师的判断。将化合物恰当的一次性或通过一系列治疗施用于患者。

例如，根据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量是约lμg/kg-15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)多肽或抗体，无论是例如通过一次或多次分开的施用，或是通过连续输注。典型日剂量的范围可以是约1μg/kg-100mg/kg或更多，取决于上文所述因素。对于持续数天或更长的重复施用，根据状况，持续治疗直至出现期望的对疾病症状的遏制。然而，其它剂量方案可能是有用的。此疗法的进程易于通过常规技术和测定法监测。

O.制品

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含可用于诊断或治疗上文所述紊乱的物质(例如，包含PRO87299分子)的制品。制品包含容器和用法说明书。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器和试管。容器可以由多种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有有效诊断或治疗状况的组合物，而且可具有无菌存取口(例如容器可以是具有皮下注射针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管)。组合物中的活性剂通常是本发明的多肽或抗体。容器上或与容器相关的用法说明书或标签指明该组合物用于诊断或治疗所选择的状况。制品还可包含第二容器，其中装有制药学可接受的缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和/或右旋糖溶液。它还可包含商业和使用者立场上所期望的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。

P.免疫相关疾病的诊断和预后

细胞表面蛋白质，诸如在某些免疫相关疾病中过表达的蛋白质，是药物候选物或疾病治疗的卓越靶物。此类蛋白质及由在免疫相关疾病状态中扩增的基因编码的分泌型蛋白质在这些疾病的诊断和预后中找到了额外用途。例如，针对在多发性硬化、类风湿性关节炎或其它免疫相关疾病中扩增的基因的蛋白质产物的抗体可用作诊断剂或预后剂。

例如，抗体，包括抗体片段，可用于定性或定量检测由扩增的或过表达的基因编码的蛋白质(“标志物基因产物”)的表达。抗体优选配备了可检测的，例如荧光标记物，而且可通过光学显微镜检术、流式细胞术、荧光测定法或本领域知道的其它技术来监测结合。这些技术是特别合适的，如果过表达的基因编码细胞表面蛋白质的话。此类结合测定法基本上如上文所述进行。

抗体结合标志物基因产物的原位检测可通过例如免疫荧光或免疫电子显微镜检术来进行。为此目的，自患者采集组织学标本，并对它施加经标记抗体，优选将抗体覆盖在生物学样品上。此流程还容许测定标志物基因产物在所检验组织中的分布。对于本领域技术人员显而易见的是，极其多种组织学方法可容易的用于原位检测。

提供下列实施例仅仅为了例示目的，而非意图以任何方式限制本发明的范围。

在此完整收入本说明书中引用的所有专利和文献作为参考。

实施例

除非另有说明，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。下文实施例和整篇说明书中以ATCC编号所鉴别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)。

实施例1：PRO87299的克隆

搜索表达序列标签(EST)DNA数据库(Merck/Washington University)，鉴定出包含目的结构域，尤其是免疫球蛋白(Ig)结构域和免疫受体基于酪氨酸抑制基序(ITIM)的EST。搜索使用计算机程序BLAST或BLAST2进行[Altschul et al.，Methods in Enzymology 266：460-480(1996)]，比较目的结构域与序列的6种读码框翻译结果。将BLAST得分为70(或在有些情况中为90)或更高且不编码已知蛋白质的比较用程序“phrap”(Phil Green，University ofWashington，Seattle，Washington)簇集并在必要时装配成共有DNA序列。

基于如上所述序列，合成寡核苷酸：1)以通过PCR鉴定包含目的序列的cDNA文库，和2)作为探针用于分离PRO87299的全长编码序列的克隆。正向和反向PCR引物的范围通常是20-30个核苷酸，常常设计成产生长约100-1000bp的PCR产物。探针序列通常长40-55nt。在有些情况中，当共有序列大于约1-1.5kbp时，合成另外的寡核苷酸。为了对几个文库筛选全长克隆，依照Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，见上文，通过PCR扩增用PCR引物对筛选来自文库的DNA。然后，使用探针寡核苷酸和引物对之一，将阳性文库用于分离编码目的基因的克隆。

所采用的寡核苷酸探针如下：

正向引物：hBTig.EcoRI.F2

5′TTGAATTCATGAAGACATTGCCTGCCATGC3′(SEQ ID NO：11)

反向引物：hBTig.BamHI.R2

5′TTGGATCCTTAACTCCTCACACATATGGATGCATATTC3′(SEQ ID NO：12)

克隆中使用了人血cDNA文库。用于分离cDNA克隆的cDNA文库是通过标准方法使用商品化试剂(诸如购自Invitrogen，San Diego，CA)构建的。将cDNA用含NotI位点的寡dT引发，与SalI半磷酸化(hemikinased)衔接头以平端连接，用NotI切割，通过凝胶电泳恰当分离，并以限定取向克隆到合适的克隆载体(诸如pRKB或pRKD；pRK5B是不含SfiI位点的pRK5D前体；参见Holmes et al.，Science 253：1278-1280(1991))的唯一XhoI和NotI位点间。

图1(SEQ ID NO：1)显示了克隆的完整核苷酸序列，在本文中称为DNA332467。DNA332467克隆含单一可读框，表观翻译起始位点位于核苷酸第24-26位，终止信号位于核苷酸第891-893位(图1，SEQ ID NO：1)。预测多肽前体长289个氨基酸，计算分子量约32781道尔顿，估算pI约6.27。对图2(SEQ ID NO：2)所示全长PRO87299序列的分析证明存在如图2所示多个重要多肽结构域，其中为这些多肽结构域给出的位置大致如图所示。

使用图2(SEQ ID NO：2)所示全长序列的ALIGN-2序列对比分析，对当前蛋白质数据库的分析证明PRO87299氨基酸序列和已知蛋白质序列之间不存在序列同一性。

实施例2：PRO87299变体的克隆

对来自16名不同供体的B细胞RNA筛选PRO87299的序列变体。对此RNA进行RT-PCR以生成全长PRO87299。将PCR产物克隆到容许高通量测序的载体中，并通过双通路测序分析。几个PRO87299变体显示出最低限度变异(图11A-F)。然而，找到了一种外显子3删除即跨膜结构域删除的截短形式(图7，SEQ ID NO：7)。该截短形式删除了天然蛋白质的核苷酸403-547，产生长度只有241个氨基酸的变异PRO87299多肽(图8，SEQ ID NO：8)，而天然PRO87299的长度是289个氨基酸。缺少跨膜结构域可能意味着此PRO87299变体是一种分泌形式。

发现了在外显子3的5’端包含18个碱基对插入的另一种PRO87299变体(图9，SEQ ID NO：9)。此18个碱基对插入编码另外的6个氨基酸(AFTNIP)，插入PRO87299编码核酸的读码框，产生长度为295个氨基酸的变异PRO87299多肽(图10，SEQ ID NO：10)。图12A-B显示了短型和AFTNIP型二者及其它变体。

所有PRO87299多肽的氨基酸51-117处找到的IgG结构域对于PRO87299多肽的功能可能是重要的。

实施例3：受刺激后T细胞的微阵列分析

常常包含数以千计的基因序列的核酸微阵列可用于鉴定在患病组织中较之其正常对应物差异表达的基因。在使用核酸微阵列时，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品逆转录并标记以产生cDNA探针。然后将cDNA探针与固定在固相支持物上的核酸阵列杂交。阵列的设置使得阵列各成员的序列和位置是已知的。例如，可将已知在某些疾病状态表达的基因选集排列在固相支持物上。标记探针与特定阵列成员的杂交指示衍生该探针的样品表达该基因。若来自测试(在这种情况中，激活的CD4+T细胞)样品的探针的杂交信号大于来自对照(在这种情况中，未受刺激的CD4+T细胞)样品的探针的杂交信号，则在测试组织中过表达的一种或多种基因得到鉴定。此结果的意义是在测试组织中过表达的蛋白质不仅可用作疾病状况存在的诊断标志物，而且还可用作疾病状况治疗的治疗靶。

核酸杂交和微阵列技术的方法学是本领域众所周知的。在一个实施例中，用于杂交的核酸和探针的特定制备物、载玻片和杂交条件都详细记载于2001年3月30日提交的PCT专利申请流水号PCT/US01/10482，在此收入作为参考。

在此实验中，使用含用于生成分离的CD4+T细胞群的抗CD8、抗CD16、抗CD19、抗CD36和抗CD56抗体的RossetteSep^TM方案(购自Stem CellTechnologies，Vancouver BC)从单一供体纯化CD4+T细胞。用抗CD3抗体(以不刺激增殖的浓度使用)及ICAM-1或抗CD28抗体激活分离的CD4+T细胞。24或72小时时，收获细胞，提取RNA，并在Affimax^TM(Affymetrix Inc.Santa Clara，CA)微阵列上运行分析。纯化后立即收获未刺激的(静息)细胞并进行相同的分析。比较其表达在激活细胞较之静息细胞中在两个时间点中任一时上调的基因。

这些实验的结果是本发明的PRO87299多肽在用抗CD3/ICAM-1和抗CD3/抗CD28激活的分离的CD4+T细胞中与分离的静息CD4+T细胞相比显著过表达。如上所述，这些数据证明本发明的PRO87299多肽不仅可用作一种或多种免疫紊乱存在的诊断标志物，而且还可用作这些免疫紊乱治疗的治疗靶。

实施例4：淋巴瘤中的PRO87299

淋巴瘤在美国是第6位最常见的恶性肿瘤。估计在美国1990年新发43,000例淋巴瘤。非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤占到其中大半，第二位的何杰金氏淋巴瘤远远落后。非何杰金氏淋巴瘤的发病率随年龄逐渐升高。但在何杰金氏病中，20-30岁患者发病率较高，30-55岁之间达到稳定水平，55岁后再次升高。男性对何杰金氏病和非何杰金氏淋巴瘤二者的风险都比女性高。恶性淋巴瘤的主要临床表现是淋巴结肿胀，症状包括发烧、不适和体重减轻。淋巴瘤的常见原发部位包括锁骨上、腋窝、纵隔、主动脉周、子宫颈和腹股沟淋巴结。淋巴瘤还有可能转移至其它器官。

何杰金氏病最早由Thomas Hodgkin在1832年记载。何杰金氏病是淋巴样细胞的无限制增殖，淋巴样细胞变得更大，具有丰富的浅色细胞质和两个或更多含较大核仁的卵形、具裂片细胞核。具有这种外观的细胞称为里-施(Reed-Sternberg)细胞。里-施细胞对于何杰金氏病的诊断是重要的，但它们的单独存在不足以做出诊断。何杰金氏病与非何杰金氏淋巴瘤在细胞类型、淋巴结组织学和症状学诸如发烧方面截然不同。何杰金氏病通常表现为一组周围淋巴结增大，可牵涉邻近的结，但很少是结外的。何杰金氏病的起因未知，但在先埃-巴(EpsteinBarr)病毒感染和bcl-2易位与何杰金氏病的形成有关。

非何杰金氏淋巴瘤是淋巴结中出现的免疫系统的瘤，但在诸如细胞类型和患者所展现的症状学等因素方面与何杰金氏病有差异。大多数非何杰金氏淋巴瘤是B细胞表型的，标志物CD19和CD20呈阳性。较少数目是T细胞淋巴瘤，对标志物CD2和CD3呈阳性。

分析含基因表达信息的私有数据库(

Gene Logic Inc.，Gaithersburg，MD)，试图鉴定PRO87299多肽(及其编码核酸)是否在淋巴瘤中较之正常淋巴组织显著上调。具体而言，使用可通过Gene Logic公司(Gaithersburg，MD)获得的、与

数据库一起使用的软件或Genentech公司编写和开发的、与

数据库一起使用的私有软件进行

数据库的分析。分析中阳性命中的评估基于若干标准，包括例如组织特异性、肿瘤特异性、及正常的必要组织和/或正常的增殖组织中的表达水平。结果是PRO87299确实证实在淋巴瘤中较之其它肿瘤和正常组织有高表达。

实施例5：炎性肠病中的PRO87299

在此实验中，使用微阵列测定法来寻找在IBD中较之正常肠组织过表达的基因。从IBD患者获取活检样品。对于每位IBD患者，样品取自患病(或是UC或是克罗恩氏病)组织和健康肠，从而可以更好的比较表达样式。所有样品保存于-70℃直至准备好RNA分离。将活检样品在600ul RLT缓冲液(+BME)中匀浆，使用Qiagen^TM Rneasy微型柱(Qiagen)及柱上DNA酶处理遵循制造商的指导分离RNA。RNA分离后，使用RiboGreen^TM(MolecularProbes)遵循制造商的指导对RNA定量，在琼脂糖凝胶上检查完整性。标记适量的RNA供微阵列分析，在私有的Genentech微阵列和Affymetrics^TM微阵列上运行样品。比较在IBD组织中较之正常肠表达上调的基因，将来自同一患者正常肠和IBD组织的活检样品相比。此实验的结果显示PRO87299鉴定为在克罗恩氏病样品中较之正常肠组织显著过表达。

实施例6：PRO87299在NK细胞中的表达

天然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统的重要效应细胞。它们特化成实施对已经感染病毒、寄生虫或者已经变成癌性的宿主细胞的杀伤。在表型上，NK细胞大型粒状淋巴细胞，占到循环中淋巴细胞群的约2％。它们通常以细胞表面表达的CD56和CD16来鉴定。它们在骨髓中从与T细胞共享的CD34+前体细胞成熟而成。成熟NK细胞与T细胞共享CD8表达、溶细胞机械、和有些KIR，但仍然在缺少CD3和T细胞受体方面与T细胞截然不同。像细胞毒性T细胞，它们含有颗粒，其中充满介导靶细胞溶解的孔形成蛋白、细胞毒素、丝氨酸酯酶、和蛋白聚糖。细胞毒性T细胞和NK细胞二者都在接触时通过结合它们的靶物并爆发式投递它们的致死化学品，在靶细胞的膜中生成孔来发挥杀伤作用。不像细胞毒性T细胞，NK细胞不需要在启动溶解前识别特定抗原。相反，NK细胞激活可以由已经显示出介导增殖和细胞毒性活性的生长因子和细胞因子(特别是IL-2、IL-12和IL-15)或者由两类NK细胞受体之间的精密平衡(一类激活细胞，另一类抑制细胞)介导。杀伤Ig样受体(KIR)是在遭遇细胞表面上的I型MHC分子时传送抑制信号的NK细胞受体。这对于杀伤癌性细胞和病毒感染细胞二者是重要的。因为病毒常常遏制I型MHC在其感染的细胞中表达，病毒感染细胞变得对NK细胞的杀伤作用易感。同样，癌细胞降低或没有I型MHC表达，它们也变得对NK细胞的杀伤作用易感。天然细胞毒性受体(NCR)构成了NK细胞上的激活受体家族。在有些效应物-靶物系统中，NCR的表面密度与NK细胞的溶细胞活性有关，而在其它系统中，杀伤作用需要NCR、另一种激活受体NKG2D及其衔接(adaptor)多肽DAP10之间的合作。另外，共受体诸如2B4和NTB-A的参与可影响信号强度。NCR和NKG2D、凝血素和MICA、MICB的配体分别不由大多数正常细胞表达，但在大多数肿瘤细胞系中诱导。肿瘤细胞对配体的表达触发显著的免疫应答，导致肿瘤细胞排斥。用IL-15或IL-12激活NK细胞已经显示出诱导细胞毒和增殖两种效果。连接粘附分子2(JAM2)已经显示出结合NK细胞，而且假说在淋巴细胞外渗至发炎部位中发挥作用。

因此，比较这三种激活模式较之静息NK细胞的基因差异表达的DNA微阵列实验有可能揭示NK细胞活性的新基因或新基因关联。可开发通过这些微阵列揭示的靶特异基因的治疗用抗体、肽或小分子，用于治疗免疫介导的炎性疾病和恶性肿瘤。通过负选择使用NK细胞分离试剂盒及MACS^TM磁性细胞分选系统(Miltenyi Biotec)从白血球袋(leukopack)分离外周血NK细胞。通过PE抗CD56的染色确认细胞纯度供FACS分析。细胞制备物的纯度范围从89％至96％。细胞培养：在6孔板中建立体外培养物，每孔5ml培养液。培养基：RPMI 1640，10％热灭活的FBS，100单位/mL青霉素，100mg/mL链霉素，2mM L-谷氨酰胺，和5.5x10^-5 Mβ-巯基乙醇。实验处理：时间0小时，未处理CD56(+)细胞；时间16小时，未处理、IL2(10nM)、IL15(10nM)、JAM-IT(10nM)刺激。通过CD56和CD69的细胞表面表达的FACS，监测NK细胞的激活。在此系列实验中确定了，与正常静息NK细胞相比，PRO87299在CD56+NK细胞中表达。

实施例7：PRO87299作为杂交探针的用途

下面的方法描述了编码PRO87299的核苷酸序列作为杂交探针的用途。

采用包含本文所披露的全长或成熟PRO87299的编码序列的DNA作为探针用于筛选人组织cDNA文库或人组织基因组文库中的同源DNA(诸如那些编码PRO87299的天然存在变体的)。

含任一文库DNA的滤膜的杂交和清洗在下面的高严格性条件下进行。放射性标记的PRO87299衍生探针与滤膜的杂交在50％甲酰胺，5x SSC，0.1％ SDS，0.1％焦磷酸钠，50mM磷酸钠pH 6.8，2x Denhardt氏溶液和10％硫酸右旋糖苷的溶液中于42℃进行20小时。滤膜的清洗在0.1x SSC和0.1％SDS的水溶液中于42℃进行。

然后可使用本领域已知的标准技术来鉴定与编码全长天然序列PRO87299的DNA具有期望序列同一性的DNA。

实施例8：PRO87299在大肠杆菌中的表达

此实施例通过大肠杆菌中的重组表达例示了非糖基化形式的PRO87299的制备。

首先使用选定的PCR引物扩增编码PRO87299的DNA序列。引物应当包含与选定的表达载体上的限制酶位点对应的限制酶位点。可采用多种表达载体。合适载体的一个例子是pBR322(衍生自大肠杆菌；参见Bolivar et al.，Gene，2：95(1977))，它包含氨苄青霉素和四环素抗性的基因。将载体用限制酶消化并去磷酸化。然后将PCR扩增序列连接到载体中。载体优选包含编码抗生素抗性基因、trp启动子、多组氨酸前导(包含头6个STII密码子、多组氨酸序列和肠激酶切割位点)、PRO87299编码区、λ转录终止子和argU基因的序列。

然后使用Sambrook et al.，见上文中描述的方法用连接混合液转化选定的大肠杆菌菌株。通过在LB平板上生长的能力来鉴定转化子，然后挑选抗生素抗性菌落。可分离质粒DNA，并通过限制性分析和DNA测序进行确认。

选定的克隆可在液体培养基中培养过夜，诸如补充有抗生素的LB培养基。随后可用过夜培养物接种大规模培养。然后将细胞培养至期望光密度，在此期间开启表达启动子。

将细胞再培养若干小时后，可通过离心收获细胞。通过离心收获的细胞沉淀物可使用本领域已知的多种试剂溶解，然后可使用金属螯合柱在容许蛋白质紧密结合的条件下纯化溶解的PRO87299蛋白质。

使用如下流程，PRO87299可以多组氨酸标记形式在大肠杆菌中表达。首先用选定的PCR引物扩增编码PRO87299的DNA。引物包含与选定的表达载体上的限制酶位点对应的限制酶位点，及提供有效和可靠的翻译起始、金属螯合柱上的快速纯化及肠激酶的蛋白水解切除的其它有用序列。然后将PCR扩增的多组氨酸标记的序列连接到表达载体中，用于转化基于菌株52(W3110 fuhA(tonA)lon galE rpoHts(htpRts)clpP(lacIq))的大肠杆菌宿主。首先将转化子在含50mg/ml羧苄青霉素的LB培养基中于30℃振荡培养至O.D.600达到3-5。然后将培养物在CRAP培养基(通过在500mL水中混和3.57g(NH₄)₂SO₄，0.71g柠檬酸钠·2H₂O，1.07g KCl，5.36g Difco酵母提取物，5.36g Sheffield hycase SF，以及110mM MPOS pH 7.3，0.55％(w/v)葡萄糖和7mM MgSO₄来配制)中稀释50-100倍，并于30℃振荡培养大约20-30小时。取出样品，通过SDS-PAGE分析来验证表达，并将大量培养物离心以沉淀细胞。冷冻细胞沉淀物直至纯化和重折叠。

将来自0.5至1升发酵液的大肠杆菌细胞浆(6-10g沉淀物)重悬于10倍体积(w/v)的7M胍，20mM Tris pH 8缓冲液。加入固体亚硫酸钠和连四硫酸钠至终浓度分别为0.1M和0.02M，并将溶液于4℃搅动过夜。此步骤产生所有半胱氨酸残基通过亚硫酸酰化(sulfitolization)而封闭的变性蛋白质。将溶液在Beckman超速离心机中以40,000rpm离心30分钟。将上清液用3-5倍体积的金属螯合柱缓冲液(6M胍，20mM Tris pH 7.4)稀释，并通过0.22微米滤器过滤至澄清。将澄清的提取物加到在金属螯合柱缓冲液中平衡的5ml Qiagen Ni-NTA金属螯合柱上。用含50mM咪唑(Calbiochem，Utrol grade)pH 7.4的另外缓冲液清洗柱子。用含250mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质。合并含有期望蛋白质的级分并贮存于4℃。利用根据蛋白质的氨基酸序列计算的消光系数通过其在280nm的吸光度估计其浓度。

通过将样品在新鲜配制的重折叠缓冲液中缓慢稀释使蛋白质重折叠，所述重折叠缓冲液含20mM Tris pH 8.6，0.3M NaCl，2.5M尿素，5mM半胱氨酸，20mM甘氨酸和1mM EDTA。选择重折叠体积使得最终的蛋白质浓度在50至100μg/ml之间。将重折叠溶液于4℃温和搅动12-36小时。通过加入TFA至终浓度0.4％(pH大约3)终止重折叠反应。在进一步纯化蛋白质之前，将溶液通过0.22微米滤器过滤，并加入乙腈至终浓度2-10％。将重折叠蛋白质在Poros R1/H反相柱上层析，使用0.1％ TFA作为流动缓冲液，并用10至80％的乙腈梯度洗脱。在SDS聚丙烯酰胺凝胶上分析具A280吸光度的级分的等分试样，并合并含均一重折叠蛋白质的级分。通常，大多数蛋白质的正确重折叠形式在最低乙腈浓度得到洗脱，因为那些形式是最紧凑的，使其疏水内部免于与反相树脂的相互作用。聚集形式常常在较高乙腈浓度得到洗脱。除了从期望形式中解除蛋白质的错误折叠形式，反相步骤还从样品中去除内毒素。

合并含期望折叠的PRO87299多肽的级分，并用对准溶液的温和氮流去除乙腈。通过透析或通过使用在配制缓冲液中平衡的G25 Superfine(Pharmacia)树脂的凝胶过滤将蛋白质配制到含0.14M氯化钠和4％甘露醇的20mM Hepes pH 6.8中，并无菌过滤。

本文所公开的PRO87299多肽已经如上所述成功表达。

实施例9：PRO87299在哺乳动物细胞中的表达

此实施例通过哺乳动物细胞中的重组表达例示了潜在糖基化形式的PRO87299的制备。

采用载体pRK5(参见1989年3月15日公开的EP 307,247)作为表达载体。任选的是，使用诸如Sambrook et al.，见上文中描述的连接方法，将PRO87299 DNA连接到经选定的限制酶消化的pRK5中以容许插入PRO87299 DNA。所得载体称为pRK5-PRO87299。

在一个实施方案中，选定的宿主细胞可以是293细胞。将人293细胞(ATCC CCL 1573)在组织培养皿中在诸如补充有胎牛血清和任选的营养成分和/或抗生素的DMEM等培养基中培养至汇合。将约10μg pRK5-PRO87299DNA与约1μg编码VA RNA基因的DNA(Thimmappaya et al.，Cell，31：543(1982))混合，并溶于500μl 1mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，0.227M CaCl₂。向此混合液中逐滴加入500μl 50mM HEPES(pH 7.35)，280mM NaCl，1.5mMNaPO₄，并于25℃沉淀10分钟。将沉淀物悬浮并加到293细胞中，使其于37℃静置约4小时。吸去培养基并加入2ml含20％甘油的PBS达30秒。然后用无血清培养基清洗293细胞，加入新鲜培养基，并将细胞温育约5天。

转染后大约24小时，去除培养基，并用培养基(单独)或含200μCi/ml³⁵S-半胱氨酸和200μCi/ml ³⁵S-甲硫氨酸的培养基置换。温育12小时后，收集条件培养基，在旋转滤器上浓缩，并加到15％SDS凝胶上。处理后的凝胶可干燥，并对胶片曝光选定的一段时间以显现PRO87299多肽的存在。含转染细胞的培养物可进行进一步温育(在无血清培养基中)，并在选定的生物测定法中测试培养基。

在一种备选技术中，可使用Somparyrac et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，12：7575(1981)描述的硫酸右旋糖苷法将PRO87299瞬时导入293细胞。将293细胞在旋转摇瓶中培养至最大密度，加入700μg pRK5-PRO87299 DNA。首先通过离心从旋转摇瓶浓缩细胞并用PBS清洗。将DNA-右旋糖苷沉淀物在细胞沉淀物上温育4小时。将细胞用20％甘油处理90秒，用组织培养基清洗，再次放入装有组织培养基、5μg/ml牛胰岛素和0.1μg/ml牛运铁蛋白的旋转摇瓶。大约4天后，将条件培养基离心并过滤以去除细胞和碎片。然后可通过任何选定的方法诸如透析和/或柱层析来浓缩并纯化含所表达PRO87299的样品。

在另一个实施方案中，可在CHO细胞中表达PRO87299。可使用已知试剂诸如CaPO₄或DEAE-右旋糖苷将pRK5-PRO87299转染到CHO细胞中。如上所述，可将细胞培养物温育，并用培养基(单独的)或含放射性标记物诸如³⁵S-甲硫氨酸的培养基置换培养基。测定PRO87299多肽的存在后，可用无血清培养基置换培养基。优选的是，将培养物温育约6天，然后收获条件培养基。然后可通过任何选定的方法来浓缩并纯化含所表达PRO87299的培养液。

还可在宿主CHO细胞中表达表位标记的PRO87299。可将PRO87299亚克隆到pRK5载体外。亚克隆插入片段可进行PCR以融合到杆状病毒表达载体中，与选定的表位标签诸如多组氨酸标签处于同一读码框。然后可将多组氨酸标记的PRO87299插入片段亚克隆到含SV40启动子/增强子的载体中，所述载体包含选择标记诸如DHFR以选择稳定的克隆。最后，可用含SV40启动子/增强子的载体转染CHO细胞(如上所述)。可如上所述进行标记以验证表达。然后可通过任何选定的方法诸如Ni²⁺-螯合亲和层析来浓缩并纯化含所表达多组氨酸标记的PRO87299的培养液。

PRO87299还可通过瞬时表达流程在CHO和/或COS细胞中表达，或者通过其它稳定表达流程在CHO细胞中表达。

CHO细胞中的稳定表达使用如下流程进行。将蛋白质作为IgG构建物(免疫粘附素)表达，其中将相应蛋白质的可溶形式(例如胞外结构域)的编码序列与含铰链、CH2和CH3结构域的IgG1恒定区序列融合，和/或是多组氨酸标记形式。

PCR扩增后，使用如Ausubel et al.，Current Protocols of Molecular Biology，Unit 3.16，John Wiley and Sons(1997)中所描述的标准技术将各DNA亚克隆到CHO表达载体中。将CHO表达载体构建成在目的DNA的5’和3’具有相容限制性位点以容许cDNA方便的穿梭。用于在CHO细胞中表达的载体如Lucas et al.，Nucl.Acids Res.24：9(1774-1779)(1996)中所述，利用SV40早期启动子/增强子来驱动目的cDNA和二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达。DHFR表达容许选择质粒在转染后的稳定维持。

使用商品化转染试剂(Quiagen)、

或

(Boehringer Mannheim)将12微克期望质粒DNA导入大约1 x 10⁷个CHO细胞。如Lucas et al.，见上文中所述培养细胞。将大约3 x 10⁷个细胞冻存于安瓿中以供如下所述的进一步培养和生产。

通过置于水浴中融化含质粒DNA的安瓿并震荡混合。将内容物转移到装有10mL培养基的离心管中，并以1000rpm离心5分钟。吸出上清液，并将细胞重悬于10mL选择培养基(含5％ 0.2μm渗滤胎牛血清的0.2μm过滤PS20)。然后将细胞等分到装有90mL选择培养基的100mL转瓶中。1-2天后，将细胞转移到装有150mL选择性生长培养基的250mL转瓶中，并于37℃温育。再过2-3天后，以3x10⁵个细胞/mL接种250mL、500mL和2000mL转瓶。通过离心并重悬于生产培养基而用新鲜培养基置换细胞培养基。尽管可采用任何合适的CHO培养基，实际上可使用1992年6月16日授权的美国专利5,122,469中描述的生产培养基。以1.2x10⁶个细胞/mL接种3L生产转瓶。第0天，测定pH。第1天，对转瓶采样并开始喷入过滤空气。第2天，对转瓶采样，将温度转变成33℃，并加入30mL 500g/L葡萄糖和0.6mL10％防沫剂(例如35％聚二甲基硅氧烷乳液，Dow Corning 365医用乳液)。在整个生产过程中，根据需要调节pH使其保持在7.2左右。10天后，或者直至存活力降至70％以下，通过离心收获细胞培养物并通过0.22μm滤器过滤。滤出液贮存于4℃或立即加到柱上以进行纯化。

对于多组氨酸标记的构建物，使用Ni-NTA柱(Qiagen)纯化蛋白质。纯化前，向条件培养基中加入咪唑至浓度5mM。于4℃用泵将条件培养基以4-5ml/分钟的流速加到在含0.3M NaCl和5mM咪唑的20mM Hepes pH 7.4中平衡的6ml Ni-NTA柱上。加样后，用另外的平衡缓冲液清洗柱子，并用含0.25M咪唑的平衡缓冲液洗脱蛋白质。随后将高度纯化的蛋白质用25mlG25 Superfine(Pharmacia)柱脱盐至含10mM Hepes，0.14M NaCl和4％甘露醇，pH 6.8的贮存缓冲液中，并贮存于-80℃。

免疫粘附素(含Fc)构建物如下从条件培养基中纯化。用泵将条件培养物加到在20mM磷酸钠缓冲液，pH 6.8中平衡的5ml蛋白A柱(Pharmacia)上。加样后，用平衡缓冲液彻底清洗柱子，然后用100mM柠檬酸，pH 3.5进行洗脱。洗脱的蛋白质立即通过将1ml级分收集到装有275μL 1M Tris缓冲液，pH9的管中而中和。随后如上文关于多组氨酸标记的蛋白质所述将高度纯化的蛋白质脱盐至贮存缓冲液中。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶和经Edman降解的N-末端氨基酸测序评估均一性。

本文所公开的许多PRO87299多肽已经如上所述成功表达。

实施例10：PRO87299在酵母中的表达

下面的方法描述了PRO87299在酵母中的重组表达。

首先，构建酵母表达载体用于由ADH2/GAPDH启动子的PRO87299的细胞内生成或分泌。将编码PRO87299和启动子的DNA插入选定质粒的合适限制酶位点以指导PRO87299的细胞内表达。对于分泌，可将编码PRO87299的DNA与编码用于PRO87299表达的ADH2/GAPDH启动子、天然PRO87299信号肽或其它哺乳动物信号肽或者例如酵母α因子或转化酶分泌信号/前导序列、及接头序列(如果需要)的DNA一起克隆到选定的质粒中。

然后可以用上文所述表达质粒转化酵母细胞诸如酵母菌株AB110，并在选定的发酵培养基中培养。经转化酵母的上清液可通过使用10％三氯乙酸的沉淀及通过SDS-PAGE的分离、随后使用考马斯蓝的凝胶染色进行分析。

随后可通过离心从发酵培养液中去除酵母细胞并使用选定的针筒滤器浓缩培养液来分离和纯化重组PRO87299。含PRO87299的浓缩液可使用选定的柱层析树脂进一步纯化。

本文所公开的许多PRO87299多肽已经如上所述成功表达。

实施例11：PRO87299在杆状病毒感染的昆虫细胞中的表达

下面的方法描述了PRO87299在杆状病毒感染的昆虫细胞中的重组表达。

将编码PRO87299的序列融合到杆状病毒表达载体内所包含的表位标签的上游。此类表位标签包括多组氨酸标签和免疫球蛋白标签(像IgG的Fc区)。可采用多种质粒，包括衍生自商品化质粒诸如pVL1393(Novagen)的质粒。简而言之，用与5′和3′区互补的引物通过PCR扩增编码PRO87299的序列或PRO87299编码序列的期望部分，诸如编码跨膜蛋白质胞外结构域的序列或编码成熟蛋白质的序列，如果所述蛋白质是细胞外的话。5′引物将掺入侧翼(选定的)限制酶位点。然后用那些选定的限制酶消化产物，并亚克隆到表达载体中。

使用脂转染试剂(lipofectin，可从GIBCO-BRL购买)将上述质粒和BaculoGold^TM病毒DNA(Pharmingen)共转染到草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(“Sf9”)细胞(ATCC CRL 1711)中，产生重组杆状病毒。于28℃温育4-5天后，收获释放的病毒并用于进一步扩增。病毒感染和蛋白质表达如O′Reilley et al.，Baculovirus expression vectors：A Laboratory Manual，Oxford：Oxford University Press(1994)所述进行。

然后可纯化所表达的多组氨酸标记的PRO87299，例如通过如下的Ni²⁺-螯合亲和层析。如Rupert et al.，Nature，362：175-179(1993)所述从重组病毒感染的Sf9细胞制备提取物。简而言之，清洗Sf9细胞，重悬于超声处理缓冲液(25mL Hepes pH 7.9，12.5mM MgCl₂，0.1mM EDTA，10％甘油，0.1％NP-40，0.4M KCl)，在冰上超声处理2次各20秒。通过离心使超声处理物澄清，将上清液在加样缓冲液(50mM磷酸盐，300mM NaCl，10％甘油，pH 7.8)中稀释50倍并通过0.45μm滤器过滤。制备柱床体积5mL的Ni²⁺-NTA琼脂糖柱(可从Qiagen购买)，用25mL水清洗并用25mL加样缓冲液平衡。将过滤后的细胞提取物以0.5mL/分钟加到柱上。用加样缓冲液清洗柱子至基线A₂₈₀，此时开始收集级分。接着，用第二清洗缓冲液(50mM磷酸盐，300mMNaCl，10％甘油，pH 6.0)清洗柱子，洗脱非特异性结合的蛋白质。再次达到A₂₈₀基线后，用第二清洗缓冲液中的0至500mM咪唑梯度冲洗柱子。收集1mL级分，并通过SDS-PAGE和银染或者通过使用偶联有碱性磷酸酶的Ni²⁺-NTA(Qiagen)的Western印迹进行分析。合并含所洗脱His₁₀标记的PRO87299的级分，并针对加样缓冲液进行透析。

或者，IgG标记的(或Fc标记的)PRO87299的纯化可使用已知的层析技术进行，包括例如蛋白A或蛋白G柱层析。

本文所公开的许多PRO87299多肽已经如上所述成功表达。

实施例12：结合PRO87299的抗体的制备

特异性结合PRO87299的抗体通过用PRO87299-Fc构建物免疫小鼠而生成。此构建物是通过将编码PRO87299胞外结构域(氨基酸1-155)的区域连接到含人Fc结构域的质粒中而生成的，由此生成PRO87299(ECD)-Fc嵌合物。制备此蛋白质，纯化，并注射到小鼠爪垫中。

用于生成单克隆抗体的技术是本领域已知的，且描述于例如Goding，见上文。用在完全弗氏佐剂中乳化的PRO87299(ECD)-Fc嵌合物通过1-100微克量的皮下或腹膜内注射免疫小鼠诸如Balb/c。或者，将免疫原在MPL-TDM佐剂(Ribi Immunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化并注射到动物的后爪垫中。10至12天后用在选定佐剂中乳化的追加PRO87299(ECD)-Fc嵌合物对已免疫小鼠进行加强免疫。此后，持续数周，还可通过追加免疫注射对小鼠进行加强免疫。可通过眼窝后放血定期从小鼠获取血清样品，用于在ELISA测定法中测试以检测抗PRO87299抗体。

在检测到合适的抗体滴度后，对抗体呈“阳性”的动物进行最后的PRO87299(ECD)-Fc嵌合物静脉内注射。3至4天后，处死小鼠并收获脾细胞。然后将脾细胞与选定的鼠骨髓瘤细胞系融合(使用35％聚乙二醇)，诸如P3X63AgU.1，可从ATCC，No.CRL1597获取。融合产生杂交瘤细胞，然后可分配到96孔组织培养板中，其中装有HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培养基以抑制未融合细胞、骨髓瘤杂合体和脾细胞杂合体的增殖。

在ELISA中对杂交瘤细胞筛选针对PRO87299的反应性。产生了特异性结合PRO87299的9种抗体。将阳性杂交瘤细胞腹膜内注射到同基因Balb/c小鼠中以生成含有抗PRO87299单克隆抗体的腹水。或者，可在组织培养瓶或滚瓶中培养杂交瘤细胞。腹水中生成的单克隆抗体的纯化可使用硫酸胺沉淀后续凝胶排阻层析来完成。或者，可采用基于抗体与蛋白A或蛋白G结合的亲和层析。

如先前所述，产生了特异性结合PRO87299的9种抗体。在这9种抗体中，称为5F5.1的抗体测定为激动性抗体。激动剂活性是通过对CD4+T细胞增殖的抑制测定的。如先前实施例2中所述从人血分离CD4+T细胞，与交联的板结合抗体一起培养。准备好96孔板，即与浓度为10μg/ml的山羊抗小鼠IgG一起于37℃温育过夜并用PBS清洗以除去过量物。向含有或不含抗PRO87229抗体的IgG包被板中加入抗CD3/抗CD28抗体。根据胸苷摄取的测量，抗CD3(0.1μg/ml)和抗CD28(0.25μg/ml)的组合刺激CD4+T细胞增殖，而添加抗PRO87299抗体将增殖降低5倍(图13)。抗CD3抗体单独使用不显示增殖，对照抗体也不显示增殖。5F5.1抗PRO87299抗体的激动剂活性可通过热灭活而消除。5F5.1杂交瘤系依照布达佩斯条约保藏于ATCC(见实施例19)。

使用可溶性抗体进行了第二个实验。抗CD3(10μg/ml)和抗CD28(5μg/ml)在加到细胞培养基中时也显示出提高CD4+T细胞增殖。抗PRO87299抗体与两种刺激性抗体一起加到细胞培养基中显示出将CD4+T细胞增殖抑制可达50％。所用抗PRO87299抗体的范围是5-200μg/ml，对CD4+细胞增殖的抑制作用在此范围中是剂量依赖性的。

抗体5E10是特异性结合PRO87229但不具有激动性效果的抗体。此抗体显示出识别初级B细胞和CD4+T细胞上的PRO87299。使用FACS分析，它还可识别PRO87299转染细胞。5E10抗体一贯不具有激动性效果。

因此，已经生成了特异性结合PRO87299的抗体。抗PRO87299拮抗性抗体可用于刺激免疫应答，它在治疗免疫缺陷和防止病原体感染中将是有用的。抗PRO87299激动性抗体可用于降低CD4+T细胞的增殖，因此降低免疫应答，它在治疗自身免疫病、淋巴瘤和炎性肠病中将是有用的。实施例13：PRO87299多肽使用特异性抗体的纯化

可通过蛋白质纯化领域的多种标准技术来纯化天然或重组PRO87299多肽。例如，使用对目的PRO87299多肽特异的抗体通过免疫亲和层析纯化原PRO87299多肽、成熟PRO87299多肽或前PRO87299多肽。通常，免疫亲和柱是通过将抗PRO87299多肽抗体与活化的层析树脂共价偶联而构建的。

多克隆免疫球蛋白是通过用硫酸胺沉淀或通过固定化蛋白A(PharmaciaLKB Biotechnology，Piscataway，N.J.)纯化从免疫血清中制备的。同样的，单克隆抗体是通过硫酸胺沉淀或固定化蛋白A层析从小鼠腹水中制备的。将部分纯化的免疫球蛋白共价附着于层析树脂诸如CnBr活化的SEPHAROSE^TM(Pharmacia LKB Biotechnology)。依照制造商的说明书将抗体与树脂偶联，封闭树脂，并清洗衍生的树脂。

此类免疫亲和柱通过从细胞制备含可溶形式PRO87299多肽的级分而用于PRO87299多肽的纯化。此制备物是通过向全细胞或经差速离心获得的亚细胞级分中加入去污剂的溶解或通过本领域众所周知的其它方法衍生的。或者，含信号序列的可溶性PRO87299多肽可以有用数量分泌到培养细胞的培养基中。

使含可溶性PRO87299多肽的制备物流过免疫亲和柱，并在容许PRO87299多肽优先吸附的条件下清洗柱子(例如存在去污剂时的高离子强度缓冲液)。然后，在破坏抗体/PRO87299多肽结合的条件下(例如低pH缓冲液，诸如大约pH 2-3，或高浓度离液剂，诸如尿素或硫氰酸根离子)洗脱柱子，并收集PRO87299多肽。

实施例14：药物筛选

本发明特别可用于在任何多种药物筛选技术中使用PRO87299多肽或其结合片段筛选化合物。此类测试中所采用的PRO87299多肽或片段可以是游离于溶液中，附着于固相支持物，携带在细胞表面上，或位于细胞内。一种药物筛选方法利用经表达PRO87299多肽或片段的重组核酸稳定转化的真核或原核宿主细胞。在竞争性结合测定法中针对此类转化细胞筛选药物。此类细胞，或是存活或是固定形式，可用于标准结合测定法。可测量例如PRO87299多肽或片段和所测试试剂之间复合物的形成。或者，可检验PRO87299多肽和其靶T细胞或靶受体之间复合物形成因所测试试剂引起的减少。

因此，本发明提供了筛选可影响PRO87299多肽相关疾病或紊乱的药物或任何其它试剂的方法。这些方法包括使此类试剂与PRO87299多肽或其片段接触并通过本领域众所周知的方法测定(i)是否存在试剂和PRO87299多肽或片段之间的复合物，或(ii)是否存在PRO87299多肽或片段和细胞之间的复合物。在此类竞争性结合测定中，PRO87299多肽或片段通常进行了标记。适当温育后，将游离PRO87299多肽或片段与以结合形式存在的分开，游离或未复合标记物的量是特定试剂结合PRO87299多肽或干预PRO87299多肽/细胞复合物的能力的测量手段。

药物筛选的另一种技术提供了对多肽具有合适结合亲和力的化合物的高通量筛选，详细记载于1984年9月13日公开的WO84/03564。简而言之，在固相基质诸如塑料针或一些其它表面上合成许多不同小肽测试化合物。在应用于PRO87299多肽时，使肽测试化合物与PRO87299多肽反应并清洗。通过本领域众所周知的方法检测结合的PRO87299多肽。也可将纯化的PRO87299多肽直接包被到板上用于上述药物筛选技术。另外，非中和性抗体可用于捕捉肽并将其固定在固相支持物上。

本发明还设想了竞争性药物筛选测定法的用途，其中能够特异性结合PRO87299多肽的中和性抗体与测试化合物竞争与PRO87299多肽或其片段的结合。以这种方式，抗体可用于检测与PRO87299多肽共享一种或多种抗原性决定簇的任何肽的存在。

实施例15：理性药物设计

理性药物设计的目标是生成目的生物学活性多肽(即PRO87299多肽)或与它们相互作用的小分子例如激动剂、拮抗剂或抑制剂的结构类似物。任何这些例子可用于形成作为更有活性或稳定形式的PRO87299多肽或者在体内增强或干预PRO87299多肽功能的药物(参见Hodgson，Bio/Technology，9：19-21(1991))。

在一种方法中，通过x射线结晶学、通过计算机建模、或最常见的是通过这两种方法的联合，测定了PRO87299多肽或PRO87299多肽-抑制剂复合物的三维结构。PRO87299多肽的形状和电荷都必须确定以阐明分子的结构和确定活性位点。不太常见的是，关于PRO87299多肽的有用结构信息可通过基于同源蛋白质结构的建模来获得。在这两种情况中，使用相关结构信息来设计类似PRO87299多肽样分子或鉴定有效抑制剂。理性药物设计的有用例子可包括如Braxton and Wells，Biochemistry 31：7796-7801(1992)所示具有改进活性或稳定性的分子，或者如Athauda et al.，J.Biochem.113：742-746(1993)所示充当天然肽的抑制剂、激动剂或拮抗剂的分子。

还有可能分离通过如上所述功能测定法选择的靶特异性抗体，然后解析其晶体结构。这种方法原则上产生药核(pharmacore)，随后可在此基础上设计药物。通过生成有功能的、有药理学活性的抗体的抗独特型抗体(抗id)，有可能绕过蛋白质结晶学。作为镜像的镜像，抗id的结合位点预期将是最初受体的类似物。然后可将抗id用于从化学或生物学生成的肽库中鉴定和分离肽。然后所分离的肽将充当药核。

根据本发明，可获得足量的PRO87299多肽以进行诸如X射线结晶学等分析性研究。另外，本文所提供的关于PRO87299多肽氨基酸序列的知识将为那些采用计算机建模技术替代或补充x射线结晶学的提供指导。

实施例16：PRO87299特异性结合HVEM

蛋白质文库筛选确定了PRO87299特异性结合HVEM。将PRO87299的胞外结构域与人Fc融合，产生PRO87299(ECD)-Fc。此融合蛋白以胺偶联Biacore^TM(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)CM5传感器芯片，大约9000响应单位，大体如Chen，Y.et al.，J.Mol Biol 293：865-881(1999)中所述。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore^TM Inc.)。将PRO87299(ECD)-Fc稀释并以一定流速注入以达到大约9000响应单位(RU)的偶联蛋白质。在同一芯片上的第二流动槽中，以胺偶联对照蛋白质，人PRO4346-Fc(Genbank编号AK057097)，大约18500响应单位。注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。然后以2μg/ml的浓度注入来自SPDI蛋白质文库(由大约2000种蛋白质组成)的个别蛋白质，通过响应单位作为时间函数的变化来评估结合情况。发现HVEM结合PRO87299(ECD)-Fc，但不结合对照PRO4346-Fc。如图14中所示，PRO87299和HVEM的结合导致超过对照1200响应单位的高度显著增加。使用简单的一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore^TM评估软件3.2版)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。作为比率koff/kon来计算平衡解离常数(Kd)。

如图15中所示，PRO87299选择性结合HVEM。在此实验中，将PRO87299(ECD)-Fc和CD28家族成员hCTLA4-Fc、hPD-1-Fc、hICOS-Fc或hCD28-Fc以胺偶联Biacore^TM CM5芯片，大约8000响应单位。然后各自测定其结合HVEM的能力。为了生成HVEM-Fc蛋白质，将编码HVEM氨基酸1-199的核酸与Fc连接，产生HVEM-Fc融合蛋白。将此HVEM-Fc克隆到表达载体中，它在稳定转染到CHO细胞中后将生成融合蛋白。使用蛋白A Sepharose^TM(Amersham)通过亲和层析将所有Fc标记的蛋白质纯化至超过90％纯度。结果是以5μl/min注入的2μg/ml HVEM-Fc选择性结合PRO87299，但不结合所测试CD28家族成员的其它成员。通过测试对其已知配体的结合响应(数据未显示)证实了各CD28家族成员的活性是阳性的(CD28家族成员和配体购自R&D systems)。

PRO87299对HVEM的结合依赖pH，但不依赖NaCl浓度。如上所述使用Biacore^TM测定法，HVEM-Fc的两份独立纯化物结合以胺偶联至Biacore^TMCM5芯片的PRO87299。如图16中所示，结合不受2.5M NaCl处理的破坏；但PRO87299/HVEM复合物可用10mM甘氨酸pH 3.0解离。

PRO87299/HVEM相互作用可受PRO87299的抗体的阻断。在此实验中，将HVEM-Fc以胺与Biacore^TM CM5传感器芯片偶联，大约7500响应单位。以5μl/min的流速注入PRO87299(ECD)-Fc达两分钟。注入后105秒记录响应单位(RU)。PRO87299(ECD)-Fc(8nM)产生100RU的响应。将各抗体以渐增的浓度与PRO87299(ECD)-Fc(8nM)预先混合并温育1小时。然后以随机次序一式两份测量各样品的结合情况，每次注入后用10mM甘氨酸pH2.5使结合表面再生。如图18中所示，抗PRO87299抗体5E10和3B1.9以浓度依赖性方式阻断PRO87299与HVEM的结合，而激动性抗体5F5.1不具有阻断效果。单独注入抗体不显示与固定化HVEM的结合(数据未显示)。浓度是根据PRO87299(ECD)-Fc的表观降低分子量(55kDa)和150kDa的抗体质量计算的。

PRO87299在基于细胞的测定法中结合HVEM。在此实验中，将人293细胞(ATCC CCL 1573)在组织培养板中在诸如补充有胎牛血清和任选的营养成分和/或抗生素的DMEM等培养基中培养至汇合。将约10μg pRK5-HVEMDNA与约1μg编码VARNA基因(Thimmappaya et al.，Cell 31：543(1982))的DNA混合，并溶于500μl 1mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，0.227M CaCl₂。向此混合液中逐滴加入500μl 50mM HEPES(pH 7.35)，280mM NaCl，1.5mMNaPO₄，并于25℃沉淀10分钟。将沉淀物悬浮并加到293细胞中，使其于37℃静置约4小时。吸去培养基并加入2ml含20％甘油的PBS达30秒。然后用无血清培养基清洗293细胞，加入新鲜培养基，并将细胞温育约5天。或者，将约10μg pRK5-HVEM DNA与LipofectAMINE^TM(Gibco/BRL，Gaithersburg MD)试剂混合，遵循制造商的说明书进行转染。用HVEM转染293细胞后，将它们与I¹²⁵放射性标记的PRO87299(ECD)-Fc一起温育，容许结合发生。然后用未标记的PRO87299(ECD)-Fc竞争掉放射性标记的PRO87299，通过Scatchard分析测定估算结合位点总数和解离常数(Kd)。图17(A)是Scatchard图，图17(B)是置换图，显示PRO87299(ECD)-Fc结合HVEM瞬时转染细胞。此数据显示PRO87299的Kd是约25nM。放射性标记的PRO87299(ECD)-Fc对模拟转染293HEK细胞的总结合是对HVEM转染细胞的2.5％(数据未显示)。使用这种方法学，测定了HVEM/LIGHT/PRO87299相互作用的亲和力。它显示于下文表7。

表7

所表达蛋白质	配体	Kd(nM)
所表达蛋白质	配体	Kd(nM)	HVEM	I-125-PRO87299-Fc	25
HVEM	I-125-LIGHT-FLAG	2.5	HVEM	I-125-PRO87299-Fc	25
HVEM	I-125-LIGHT-FLAG	2.5	PRO87299	I-125-HVEM-Fc	5.5
LIGHT	I-125-HVEM-Fc	7	PRO87299	I-125-HVEM-Fc	5.5
LIGHT	I-125-HVEM-Fc	7	PRO87299/LIGHT	I-125-HVEM-Fc	0.5

正如此实施例中先前所讨论的，抗PRO87299抗体(3B1.9)剂量依赖性的与PRO87299(ECD)-Fc竞争对HVEM的结合。

总之，根据经蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-抗体阻断和体内分析的测定而确定，这份资料显示PRO87299特异性结合HVEM。

实施例17：PRO87299和LIGHT可同时结合HVEM

出版物已经显示LIGHT(GenBank编号：NM_172014，SEQ ID NO：5，SEQID NO：6)可结合HVEM(Marsters，S.A.et al.，Curr.Biol.8(9)：525-528(1998)；Mauri D.N.et al.，Immunity 8：21-30(1998))。为了确认LIGHT和PRO87299可同时结合HVEM，我们进行了共结合实验。将HVEM-Fc以胺与Biacore^TMCM5传感器芯片偶联，大约150响应单位。为了达到近乎饱和的PRO87299-Fc结合，固定较小量的HVEM-Fc是重要的。图19显示了LIGHT(25nM)和PRO87299-Fc(17nM)以5μl/min独立注入1200秒(分别是红色和蓝色曲线)。然后以相同方式注入相同终浓度的LIGHT和PRO87299-Fc混合物(绿色曲线)。独立注入的LIGHT和PRO87299-Fc传感图(灰色曲线)的计算和紧密匹配实验数据，证实了LIGHT和PRO87299能够同时结合HVEM。浓度是根据25kDa的LIGHT单体分子量和PRO87299-Fc的降低分子量(55kDa)的。

PRO87299与HVEM的相互作用不受LIGHT阻断。将PRO87299-Fc以胺与Biacore^TM CM5传感器芯片偶联，大约9800响应单位。将LIGHT(购自AlexisTM，Cat.#552-018-C010)以渐增的浓度与4nM HVEM一起温育1小时。如图20中所示，PRO87299-Fc/HVEM结合不受浓度渐增至终浓度300nM的LIGHT阻断。LIGHT活性通过与CM5传感器芯片上固定化HVEM-Fc的结合得到证实(数据未显示)。单独的LIGHT不结合固定化PRO87299-Fc(数据未显示)。所有结合传感图是以随机次序、一式两份运行的。响应单位是作为基线和以5μl/min注入2分钟结束前15秒之间的差异记录的。浓度是基于LIGHT单体的分子量为25kDa而单体HVEM的分子量为55kDa。此数据显示LIGHT不阻断HVEM对PRO87299的结合。

HVEM最初鉴定为单纯疱疹病毒-1(HSV-1)进入细胞的入口的细胞受体，而且显示结合HSV-1糖蛋白D(gD)(Mongomery et al.，Cell 87：427-436(1996))。HVEM包含三个富含半胱氨酸结构域(CRD)，它是所有TNFR家族成员的常见结构特征。与HVEM复合的gD蛋白质的晶体结构解析显示，HVEM的第一个CRD结合gD蛋白质，而HVEM的第二个CRD为第一个CRD提供结构支持(Carfi et al.，Mol.Cell 8：169-179(2001))。结果是PRO87299与LIGHT相互作用且不竞争HVEM结合，导致PRO87299与HVEM/LIGHT复合物的外表面相互作用的假说。为了检验这种假说，生成了能够阻断HVEM结合疱疹糖蛋白D(gD)但不结合LIGHT的噬菌体衍生肽(BP-2)(Sarrias et al.，Mol.Immuno.37：665-673：(2000))。在抑制gD结合的浓度，BP-2抑制PRO87299与HVEM的结合(图21A)。在一项直接比较中，重组gD蛋白质(Δ290-299形式；Milne et al.，J Virology 77：8962-8972(2003))还抑制HVEM结合PRO87299(图21B)。此结果在显示重组gD(Δ290-299)抑制可溶性PRO87299-Fc和HVEM-Fc对表达HVEM或PRO87299的293细胞的结合(分别是图21C和D)的细胞结合测定法中得到重复。这些结果表明，PRO87299在不同于LIGHT结合位点的位点上与HVEM的第一个CRD相互作用。PRO87299与LIGHT和HVEM二者相互作用的发现将容许生成可选择性抑制PRO87299/HVEM相互作用但不破坏PRO87299/LIGHT相互作用的针对HVEM的抗体或小分子。这项发现设想的另一种类型的抗体或小分子是将阻断PRO87299/HVEM相互作用和PRO87299/LIGHT相互作用二者的抗体或小分子。这两类不同的分子可具有不同治疗效果。

实施例18：PRO87299抑制T细胞激活

如实施例1中所述，克隆PRO87299供进一步研究含ITIM结构域蛋白质。PRO87299的胞内结构域包含两个可诱导磷酸化的ITIM结构域，容许募集和结合SHP-1和SHP-2，表明PRO87299的功能是抑制性的(Watanabe N.，et al.，Nature Immuno.1-10(2003))。在此实验中，用不同浓度的固定化抗CD3抗体刺激初级CD4+T细胞。还通过使用预包被抗Fc抗体将Fc标记的对照蛋白质，HVEM-Fc或DcR3-Fc交联到板上。通过温育72小时后的H³胸苷掺入，测量CD4+T细胞的增殖。此实验以一式三个孔进行，以平均值显示抑制作用(图22A)。假说HVEM由于其对LIGHT的阻断而对T细胞增殖是抑制性的。此实验显示，不是HVEM/LIGHT阻遏而是HVEM活化PRO87299引起了T细胞增殖的降低。

为了进一步显示PRO87299对T细胞增殖是抑制性的，如上所述进行了实验，但包括抑制性抗PRO87299抗体3B1.9。3B1.9抗体显示出阻断PRO87299与HVEM的结合(见实施例16)。通过板固定化抗CD3和+/-HVEM刺激CD4+T细胞。然后将3B1.9抗体和对照抗体加到培养基中。数据显示3B1.9抗体可干扰PRO87299/HVEM相互作用，如此解除细胞的抑制信号。结果是3B1.9处理细胞以与未处理细胞相同的速率增殖(图22B)。只有在使用高浓度的HVEM时，3B1.9抗体才是无效的。此数据证明PRO87299或激动性抗体可用于遏制T细胞相关自身免疫病，或者相反，拮抗性抗体诸如3B1.9将可用于刺激T细胞以防止病原体感染。

实施例19：移植物抗宿主病

移植物抗宿主病在将免疫活性细胞移植到免疫遏制或耐受的患者中时发生。供体T细胞识别宿主抗原并变得激活、分泌细胞因子、增殖和分化成效应细胞。这种应答称为移植物抗宿主反应(GVHR)。GVHR应答包括多器官综合征，而且结果可从危及生命的严重炎症至腹泻和体重减轻的轻微病例变化。小鼠中的移植物抗宿主病模型已经用于模拟骨髓移植后发生的急性和慢性GVHR和自身免疫病的临床紊乱。一种通用流程详细记载于CurrentProtocols in Immunology，见上文，unit 4.3。在这种情况中，通过Ficol梯度从正常供体的白血球袋纯化人PBMC。使用MACS CD8和NK细胞消减试剂盒消减CD8和NK细胞。第0天将40x10⁶个细胞注射到8-10周龄雌性SCIDBeige小鼠中。在第0、2、4、6、8、10天静脉内注射100μg HVEM-Fc或对照蛋白质。如图23中所示，GVHR模型中HVEM-Fc对PRO87299的活化显著延长存活。未用HVEM-Fc处理的小鼠在重建(reconstitution)后第13天达到100％死亡率。用HVEM-Fc处理的小鼠在一个流程中存活至重建后第19天，在另一个流程中存活至重建后第30天。此结果表明激动剂对PRO87299的活化将可用于组织移植，其中施用PRO87299激动剂将预防或减轻宿主对移植组织的排斥。

实施例20：材料保藏

以下杂交瘤细胞系已保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209USA)(ATCC)：

杂交瘤/抗体名称 ATCC编号保藏日期

Btig5F5. 1PTA-未指定 2004年11月10日

Btig3B1.9 PTA-未指定 2004年11月10日

此保藏是依据布达佩斯条约关于国际承认的用于专利程序的微生物保藏的规定及其(布达佩斯条约)细则进行的。这保证了从保藏之日起维持存活培养物30年。此细胞系可根据布达佩斯条约的条款通过ATCC获得，并服从Genentech公司和ATCC之间的协议，它保证了(a)在专利申请悬而未决期间依据37 CFR§1.14和35 USC§122由委员决定的个人有资格获取所述培养物，及(b)在所述专利授予后对公众获取所保藏培养物的所有限制将不可撤回的取消。

本申请的受让人已同意若保藏的培养物在合适条件下培养时死亡、丢失或遭到破坏，则他将在接到通知后迅速用同一培养物的存活样本更换。所保藏细胞系的可用性并不解释为对违反任何政府的机构依据其专利法所授予的权利实践本发明的许可。

认为前述书面说明足以使本领域技术人员能够实践本发明。本发明并不限于所保藏材料的范围，因为所保藏实施方案意图作为本发明某些方面的单一例示，而且功能上相当的任何构建物都在本发明的范围内。本文中的材料保藏并非承认本文中所包含的书面说明不足以能够实践本发明的任何方面，包括其最佳模式，也不能解释为将权利要求的范围限制于它所描述的具体例示。实际上，根据上面的描述，除了本文所显示和描述的，本发明的多种修饰对于本领域技术人员是显而易见的，而且在所附权利要求的范围内。

Claims

1.分离的核酸，其与包含图1(SEQ ID NO：1)所示核苷酸序列的核苷酸序列具有至少80％核酸序列同一性。

2.分离的核酸，其与编码图2(SEQ ID NO：2)所示多肽的核苷酸序列具有至少80％核酸序列同一性。

3.分离的核酸，其由图1(SEQ ID NO：1)所示核苷酸序列的全长编码序列组成。

4.分离的核酸，其由图7(SEQ ID NO：7)所示核苷酸序列的编码序列组成。

5.分离的核酸，其由图9(SEQ ID NO：9)所示核苷酸序列的编码序列组成。

6.包含权利要求1的核酸的载体。

7.权利要求6的载体，可操作连接受到经该载体转化的宿主细胞识别的控制序列。

8.包含权利要求7的载体的宿主细胞。

9.权利要求8的宿主细胞，其中所述细胞是CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细胞。

10.用于生成PRO87299多肽的方法，包括在适于表达所述PRO87299多肽的条件下培养权利要求9的宿主细胞并从细胞培养物回收所述PRO87299多肽。

11.分离的多肽，其与图2(SEQ ID NO：2)所示多肽的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。

12.分离的多肽，其与图8(SEQ ID NO：8)所示多肽的氨基酸序列具有至少80％氨基酸序列同一性。

13.分离的多肽，其由图10(SEQ ID NO：10)所示多肽的氨基酸序列组成。

14.嵌合分子，其包含依照权利要求11的多肽且其与异源氨基酸序列融合。

15.权利要求14的嵌合分子，其中所述异源氨基酸序列是表位标签序列或免疫球蛋白的Fc区。

16.抗体，其特异性结合与图2(SEQ ID NO：2)具有至少80％氨基酸序列同一性的PRO87299多肽。

17.抗体，其特异性结合如图2(SEQ ID NO：2)所示PRO87299的氨基酸1-155。

18.抗体，其特异性结合与图8(SEQ ID NO：8)具有至少80％氨基酸序列同一性的PRO87299变体。

19.抗体，其特异性结合如图10(SEQ ID NO：10)所示PRO87299变体。

20.抗体，其特异性结合PRO87299且阻断HVEM(SEQ ID NO：4)相互作用但不阻断LIGHT(SEQ ID NO：6)相互作用。

21.抗体，其特异性结合PRO87299且阻断LIGHT(SEQ ID NO：6)相互作用但不阻断HVEM(SEQ ID NO：4)相互作用。

22.权利要求16的抗体，其中所述抗体是PRO87299激动剂。

23.权利要求16的抗体，其中所述抗体抑制CD4+T细胞增殖。

24.权利要求16的抗体，其中所述抗体抑制淋巴瘤细胞增殖。

25.权利要求16的抗体，其中所述抗体抑制NK细胞增殖。

26.权利要求16的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体、人源化抗体或单链抗体。

27.分离的抗体，其由杂交瘤Btig5F5.1(ATCC编号____)或杂交瘤Btig3B1.9(ATCC编号____)生成。

28.分离的抗体，其具有由杂交瘤Btig5F5.1(ATCC编号____)或杂交瘤Btig3B1.9(ATCC编号____)生成的抗体的生物学活性，其中所述生物学活性是抑制CD4+T细胞增殖。

29.权利要求16的抗体，其是抗体片段。

30.权利要求16的抗体，其是嵌合或人源化抗体。

31.权利要求16的抗体，其与生长抑制剂偶联。

32.权利要求16的抗体，其与细胞毒剂偶联。

33.权利要求32的抗体，其中所述细胞毒剂选自抗生素、放射性同位素和溶核酶。

34.权利要求32的抗体，其中所述细胞毒剂是毒素。

35.权利要求34的抗体，其中所述毒素选自auristatin、美登木素生物碱和加利车霉素。

36.权利要求34的抗体，其中所述毒素选自：MMAE(monomethylauristatinE)、MMAF、MMAF-DMAEA、(MMAF-二甲氨基乙胺)、MMAF-TEG(MMAF-三缩四乙二醇)、MMAF-NtBu、和AEVB(auristatin E戊酰苄腙)、及AFP(Auristatin F苯二胺)。

37.权利要求34的抗体，其中毒素通过接头共价附着于抗体。

38.权利要求34的抗体，其中所述接头选自：马来酰亚胺己酰基(MC)、缬氨酸-瓜氨酸(val-cit，vc)、瓜氨酸(2-氨基-5-脲基戊酸)、PAB(对氨基苄基氨基甲酰基)、Me(N-甲基-缬氨酸瓜氨酸)、MC(PEG)6-OH(马来酰亚胺己酰基-聚乙二醇)、SPP(N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯)、SMCC(N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸酯)、和MC-vc-PAB。

39.权利要求16的抗体，其是在细菌中生成的抗体。

40.权利要求16的抗体，其是在CHO细胞中生成的抗体。

41.权利要求16的抗体，其是可检测标记的抗体。

42.组合物，其包含权利要求16的抗体连同药学可接受载体。

43.组合物，其包含(a)权利要求11的多肽、(b)所述多肽的激动剂、(c)所述多肽的拮抗剂、或(d)结合所述多肽的抗体，连同载体。

44.权利要求43的组合物，其包含治疗有效量的(a)、(b)、(c)或(d)。

45.制品，其包括：

(a)容器；

(b)所述容器上的标签；和

(c)装在所述容器内的包含结合PRO87299多肽的抗体的组合物，其中所述容器上的标签指示所述组合物可用于治疗免疫相关疾病、淋巴瘤或炎性肠病。

46.在哺乳动物中激发免疫应答的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效量的特异性结合PRO87299的抗体，其中所述免疫应答得到激发。

47.在有所需要的哺乳动物中减轻免疫相关紊乱的方法，包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的

(a)特异性结合PRO87299的抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段，或

(d)PRO87299的小分子激动剂。

48.权利要求47的方法，其中所述免疫相关紊乱是系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、骨关节炎、幼发型慢性关节炎、脊椎关节病、系统性硬化、特发性炎性肌病、斯耶格伦氏综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少症、甲状腺炎、糖尿病、免疫介导的肾病、中枢或周围神经系统的脱髓鞘病、特发性脱髓鞘多神经病、格-巴二氏综合征、慢性炎性脱髓鞘多神经病、肝胆病、传染性或自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、炎性肠病、麸胶敏感性肠病、惠普尔氏病、自身免疫或免疫介导的皮肤病、大疱性皮肤病、多形红斑、接触性皮炎、银屑病、变应性疾病、哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏、荨麻疹、肺的免疫学疾病、嗜曙红细胞性肺炎、特发性肺纤维化、超敏感性肺炎、移植相关疾病、移植物排斥或移植物抗宿主病。

49.用于测定怀疑含有PRO87299多肽的样品中是否存在所述多肽的方法，所述方法包括：

(1)使所述样品暴露于

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段；并

(2)测定与PRO87299的结合。

50.在哺乳动物中诊断免疫相关疾病的方法，所述方法包括：

(1)使特异性结合PRO87299的

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段

接触从所述哺乳动物获得的组织细胞的测试样品；并

(2)检测测试样品中是否形成(a)、(b)或(c)与PRO87299多肽之间的复合物，其中所述复合物的形成指示获取测试组织细胞的哺乳动物中存在免疫相关疾病。

51.在哺乳动物中诊断炎性免疫应答的方法，所述方法包括检测从哺乳动物获得的组织细胞的测试样品中和相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品中PRO87299多肽的表达水平，包括

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段，

其中测试样品中与对照样品相比所述PRO87299多肽的表达水平更高或更低指示获取测试组织细胞的哺乳动物中存在炎性免疫应答。

52.在哺乳动物中诊断淋巴瘤的方法，所述方法包括检测从哺乳动物获得的组织细胞的测试样品中和相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品中PRO87299多肽的表达水平，包括

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段，

其中测试样品中与对照样品相比所述PRO87299多肽的表达水平更高或更低指示获取测试组织细胞的哺乳动物中存在淋巴瘤。

53.在有所需要的哺乳动物中减轻淋巴瘤的方法，包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的特异性结合PRO87299多肽的

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段。

54.在哺乳动物中诊断炎性肠病的方法，所述方法包括检测从哺乳动物获得的组织细胞的测试样品中和相同细胞类型的已知正常组织细胞的对照样品中PRO87299多肽的表达水平，包括

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段，

其中测试样品中与对照样品相比所述PRO87299多肽的表达水平更高或更低指示获取测试组织细胞的哺乳动物中存在炎性肠病。

55.在有所需要的哺乳动物中减轻炎性肠病的方法，包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的特异性结合PRO87299的

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段。

56.筛选调控PRO87299的候选化合物的方法，包括如下步骤：

(1)将包含PRO87299的混合物与

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段

和候选化合物一起在不存在候选化合物时PRO87299以参比亲和力结合(a)、(b)或(c)的条件下温育；

(2)检测在存在候选化合物时PRO87299对(a)、(b)或(c)的结合亲和力以测定候选化合物亲和力，其中参比亲和力和候选化合物亲和力之间有差异指示该候选化合物调控PRO87299。

57.筛选调控PRO87299的候选化合物的方法，包括如下步骤：

(1)用PRO87299转染细胞；

(2)使候选化合物接触经PRO87299转染的细胞；

(3)使经PRO87299转染的细胞接触

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段

作为降低转染细胞增殖的手段；

(4)将候选化合物接触的经PRO87299转染的细胞之细胞增殖的降低与(a)、(b)或(c)接触的经PRO87299转染的细胞进行比较，其中经PRO87299转染的细胞增殖降低指示该候选化合物调控PRO87299。

58.筛选调控PRO87299的候选化合物的方法，包括如下步骤：

(1)分离CD4+T细胞；

(2)使分离的CD4+T细胞接触候选化合物；

(3)使分离的CD4+T细胞接触

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段

作为降低CD4+T细胞增殖的手段；

(4)将(2)的细胞增殖的降低与(3)进行比较，其中CD4+T细胞增殖降低指示该候选化合物调控PRO87299。

59.在哺乳动物中减轻移植组织排斥的方法，包括施用有效量的

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段，

由此移植组织排斥得到减轻。

60.在哺乳动物中减轻移植细胞排斥的方法，包括施用有效量的

(a)抗PRO87299抗体，

(b)HVEM(SEQ ID NO：4)、HVEM-Fc、或其片段，或

(c)LIGHT(SEQ ID NO：6)、LIGHT-Fc、或其片段，

由此移植细胞排斥得到减轻。