MX2007005612A

MX2007005612A - Novedosas composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades inmuno relacionadas.

Info

Publication number: MX2007005612A
Application number: MX2007005612A
Authority: MX
Inventors: Daniel L Eaton; Hilary Clark; Bernd Wranik; Wenjun Ouyang; Lino Gonzalez; Kelly M Loyet
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2004-11-12
Filing date: 2004-11-12
Publication date: 2007-08-14
Also published as: AU2004325035A2; KR101224659B1; WO2006054961A2; CA2586615A1; IL182643A0; JP2008519599A; IL182643A; ES2602731T3; IL228819A0; AU2004325035B2; EP1812465B1; AU2004325035A1; JP4901747B2; CN101421298A; CA2586615C; KR20070086020A; EP1812465A1; BRPI0419117A

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones que contienen una novedosa proteina y metodos para utilizar esas composiciones en el diagnostico y tratamiento de enfermedades inmuno relacionadas.

Description

NOVEDOSAS COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INMUNO RELACIONADAS Campo de la Invención La presente invención - se refiere a composiciones y métodos útiles para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades inmuno relacionadas. Antecedentes de la Invención Las enfermedades inmuno relacionadas e inflamatorias son la manifestación o consecuencia de rutas biológicas sustancialmente complejas y a menudo de interconexión múltiple, que en fisiología normal son críticas para responder a insulto o lesión, iniciar reparación de insulto o lesión, y montar defensa innata o adquirida contra organismos extraños. La enfermedad o patología ocurre cuando estas rutas fisiológicas normales provocan insulto o lesión adicional ya sea directamente relacionadas a la intensidad de la respuesta, como una consecuencia de regulación anormal o estímulo excesivo, como una reacción a sí mismo, o como una combinación de estos. Aunque el génesis de éstas enfermedades a menudo involucra rutas de múltiples etapas y a menudo múltiples sistemas/rutas biológicas diferentes, la intervención en puntos críticos en una o más de estas rutas puede tener un efecto mejorador o terapéutico. La intervención terapéutica puede ocurrir ya sea por antagonismo de un proceso/ruta detrimental o estímulo de una ruta/proceso benéfico. Se conocen muchas enfermedades inmuno relacionadas y se han estudiado extensamente. Estas enfermedades incluyen enfermedades inflamatorias inmuno mediadas, enfermedades inflamatorias no inmuno mediadas, enfermedades infecciosas, enfermedades de inmunodeficiencia, neoplasia, etc. Los linfocitos T (células T) son un componente importante de la respuesta inmune de un mamífero. Las células T reconocen antígenos que están asociados con una automolécula codificada por genes dentro del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC= Mayor histocompatibility complex) . El antígeno puede ser exhibido junto con moléculas MHC en la superficie de células que presentan antígeno, células infectadas con virus, células de cáncer, injertos, etc. El sistema de células T elimina estas células alteradas que presentan una amenaza a la salud al mamífero anfitrión. Las células T incluyen células T auxiliares y células T citotóxicas. Las células T auxiliares proliferan extensamente siguiendo reconocimiento de un complejo antígeno-MHC o en una célula que presenta antígeno. Células T auxiliares también secretan una variedad de citosinas, es decir linfocinas, que juegan un papel central en la activación de células B, células T citotóxicas y una variedad de otras células que participan en la respuesta inmune. Enfermedades inmuno relacionadas pueden tratarse al suprimir la inmuno respuesta. Utilizando anticuerpos neutralizantes que inhiben moléculas con actividad estimulatoria inmune será benéfico en el tratamiento de enfermedades inmuno mediadas e inflamatorias. Moléculas que inhiben la inmuno repuesta pueden utilizarse (proteínas directamente o mediante el uso de angonistas de anticuerpos) para inhibir la inmuno respuesta y de esta manera mejorar la enfermedad inmuno relacionada . Células T CD4+ se conoce que son importantes reguladores de inflamación. Aquí, células T CD4+ se activaron y el perfil de genes diferencialmente expresados ante activación se realizó. Como tal, los genes específicos de activación pueden ser dianas terapéuticas potenciales. Co-estímulo in vivo es necesario para una respuesta proliferativa inmune productiva. La lista de moléculas co-estimulatorias es bastante extensa y aún no está claro exactamente que moléculas co-estimulatorias juegan papeles críticos en diferentes tipos y etapas de inflamación. El término desorden intestinal inflamatorio ("IBD"= infla matory bo el disorder) describe un grupo de desordenes inflamatorios crónicos de causas desconocidas en donde el intestino se inflama, a menudo provocando recurrentes calambres o diarrea. La preponderancia de IBD en los E.U.A. se estima que es de aproximadamente 200 por 100,000 de población. Pacientes con IBD pueden ser divididos en dos grupos principales, aquellos con colitis ulcerativa ( "UC"=ulcerative colitis) y aquellos con enfermedad de Crohn ( "CD"=Crohn's disease) . En pacientes con UC, hay una reacción inflamatoria primordialmente que involucra la mucosa colonica. La inflamación típicamente es uniforme y continua sin áreas intermedias de mucosa normal . Células de mucosa superficial así como el epitelio críptico y su mucosa están involucrados en una reacción inflamatoria con infiltración de neutrófilos. Finalmente, esta situación típicamente avanza a daño epitelial con pérdida de células epiteliales que resultan en múltiples ulceraciones, fibrosis, displasia y retracción longitudinal del colón. CD difiere de UC en que la inflamación se extiende a través de todas las capas de la pared intestinal e involucra mesenterio así como nodos linfáticos. CD puede afectar cualquier parte del canal alimentario desde la boca hasta el ano. La enfermedad a menudo es discontinua, es decir varios segmentos enfermos del intestino se separan de áreas aparentemente libres de la enfermedad. En CD la pared intestinal también se engruesa, lo que puede llevar a obstrucciones. Además, no son poco comunes las fístulas y fisuras. Clínicamente, IBD se caracterizan por diversas manifestaciones que resultan a menudo en un curso no pronosticable, crónico. A menudo diarrea con sangre y dolor abdominal están acompañados por fiebre y pérdida de peso. La anemia no es poco común al igual que fatiga severa. Manifestaciones de articulaciones en el rango desde artralgia a artritis aguda así como anormalidades en función del hígado están asociadas comúnmente con IB. Pacientes con IB también tienen un riesgo incrementado de carcinomas de colon comparado con la población en general. Durante "ataques" agudos de IBD, el trabajo y otra actividad normal usualmente son imposibles, y a menudo un paciente es hospitalizado. Aunque la causa de IBD permanece desconocida, se han implicado varios factores tales como genéticos, infecciosos y susceptibilidad inmunológica . IBD es mucho más común en caucásicos, especialmente aquellos de ascendencia judía. La naturaleza inflamatoria crónica de la condición ha indicado una búsqueda intensa para una causa infecciosa posible. Aunque se han encontrado agentes que estimulan inflamación aguda, ninguno se ha encontrado provoque la inflamación crónica asociada con IBD. La hipótesis que IBD es una enfermedad auto inmune está soportada por la manifestación extra intestinal previamente mencionada de IBD como artritis de articulaciones y la respuesta positiva conocida a IBD por tratamiento con agentes terapéuticos tales como glucocorticoides adrenales, ciclosporina, y azatioprina, que se conoce suprimen la inmuno respuesta. Además, el tracto Gl más que cualquier otro órgano del cuerpo está expuesto continuamente a sustancias antigénicas potenciales tales como proteínas de alimentos, subproductos bacterianos (LPS), etc. Además, el riesgo de cáncer de colon se eleva enormemente en pacientes con severa colitis ulcerativa, particularmente si la enfermedad ha existido por varios años. Aproximadamente 20-25% de pacientes con IBD eventualmente requieren cirugía para remoción del colon debido a sangrado masivo, enfermedad debilitante crónica, perforación del colon o riesgo de cáncer. La cirugía también en ocasiones se realiza cuando otras formas de tratamiento médico fallan o cuando los efectos secundarios de esteroides u otro medicamento amenazan la salud del paciente. Ya que la cirugía es invasiva y amenaza drásticamente la vida, no es un régimen de tratamiento altamente conveniente, y típicamente es el tratamiento de último recurso. A fin de comprender mejor esta enfermedad y posiblemente tratarla, experimentos determinan que un gen fue aumentado en su expresión tanto en CD como en UC cuando se compara con tejido normal. A pesar de los avances anteriormente identificados en investigación de desordenes inmunes, hay una gran necesidad por agentes de diagnóstico y terapéuticos adicionales capaces de detectar la presencia de desordenes inmunes en un mamífero y para reducir efectivamente estos desordenes. De acuerdo con esto, un objeto de la presente invención es identificar y caracterizar un polipéptido que es sobre expresado en diversas células inmune, involucradas en diversos desordenes inmunes y para utilizar ese polipéptido, y los ácidos nucleicos de codificación, para producir composiciones de materia útiles en el tratamiento terapéutico y detección de diagnóstico de desordenes inmunes en mamíferos. Compendio de la invención A. Modalidades La presente invención se refiere a composiciones y métodos útiles para el diagnóstico y tratamiento de enfermedad inmuno relacionada en mamíferos, incluyendo humanos. La presente invención se basa en la identificación de proteínas (incluyendo anticuerpos agonistas y antagonistas) que son un resultado de estímulo de la respuesta inmune en mamíferos. Enfermedades inmuno relacionadas pueden tratarse por supresión o mejora de la respuesta inmune. Moléculas que mejoran la respuesta inmune estimulan o potencian la respuesta inmune a un antígeno. Moléculas que estimulan la respuesta inmune pueden emplearse terapéuticamente en donde la mejora de la respuesta inmune será benéfica. En forma alterna, moléculas que suprimen la respuesta inmune atenúan o reducen la respuesta inmune a un antígeno (por ejemplo anticuerpos neutralizantes) pueden utilizarse terapéuticamente en donde la atenuación de la respuesta inmune será benéfica (por ejemplo inflamación) . De acuerdo con esto, los polipéptidos PR087299 agonistas y sus antagonistas también son útiles para preparar medicinas y medicamentos para el tratamiento de enfermedades inmuno relacionadas e inflamatorias. En un aspecto específico, estas medicinas y medicamentos comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido PR087299 agonista o su antagonista con un portador farmacéuticamente aceptable. De preferencia, la mezcla es estéril. En una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para identificar agonistas o antagonistas a un polipéptido PR087299 que comprende en contactar el polipéptido PR087299 con una molécula candidato y supervisar una actividad biológica mediada por el polipéptido PR087299. De preferencia, el polipéptido PR087299 es un polipéptido PR087299 de secuencia nativa. En un aspecto específico, el agonista o antagonista PR087299 es un anticuerpo anti- PR087299. En otra modalidad, la invención se refiere a una composición de materia que comprende un polipéptido PR087299 o un anticuerpo agonista o antagonista que liga el polipéptido en mezcla con un portador o excipiente. En un aspecto, la composición comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido o anticuerpo. En otro aspecto, cuando la composición comprende una molécula de inmuno estímulo, la composición es útil para: a) incrementar la infiltración de células inflamatorias en un tejido de un mamífero que lo requiere, b) estimular o mejorar una respuesta inmune en un mamífero que lo requiera, c) incrementar la proliferación de células inmunes en un mamífero que lo requiere en respuesta a un antígeno, d) estimular la actividad de células inmune o e) incrementar la permeabilidad vascular. En un aspecto adicional, cuando la composición comprende una molécula inmuno inhibitoria, la composición es útil para a) disminuir la infiltración de células inflamatorias en un tejido de un mamífero que lo requiere, b) inhibir o reducir una respuesta inmune en un mamífero que lo requiere, c) disminuir la actividad de células inmunes o d) disminuir la proliferación de células inmunes en un mamífero que lo requiere en respuesta a un antígeno. En otro aspecto, la composición comprende un ingrediente activo adicional que por ejemplo puede ser un anticuerpo adicional o un agente citotóxico o quimioterapéutico. De preferencia, la composición es estéril. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para tratar un desorden inmuno relacionado en un mamífero que lo requiere, que comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un polipéptido PR087299, un agonista del mismo o un antagonista del mismo. En un aspecto preferido, el desorden inmune relacionado se elige el grupo que consiste de: lupus sistémico eritematosis, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil crónica, espondiloartropatías, esclerosis sistémica, meopatías inflamatorias ideopáticas, síndrome de Sjógren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica auto inmune, trombocitopenia auto inmune, tiroiditis, diabetes melitus, enfermedad renal inmuno mediada, enfermedades desmielinantes de los sistemas nerviosos central y periférico tal como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinante ideopática o síndrome de Guillen Barren, y polineuropatía desmielinante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis activa crónica auto inmune, infecciosa, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, y colangitis esclerosante, enfermedad de intestino inflamatorio, enteropatías sensible a gluten y enfermedad de hipple, enfermedades de la piel auto inmunes o inmuno mediadas incluyendo enfermedades de piel bulosa, erictema multiforme y dermatitis de contacto, soriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a alimentos y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón tales como neumonía eosinofílicas, fibrosis pulmonar ideopática y neumonitis de hipersensibilidad, enfermedades asociadas a transplante incluyendo rechazo de injerto y enfermedad de injerto-contra-anfitrión. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo que liga específicamente a cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente o a continuación. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo humanizado, fragmento de anticuerpo o anticuerpo de cadena sencilla. En un aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado que liga a un polipéptido PR087299. En otro aspecto, el anticuerpo imita la actividad de un polipéptido PR087299 (un anticuerpo agonista) o por el contrario el anticuerpo inhibe o neutraliza la actividad de un polipéptido PR087299 (un anticuerpo antagonista) . En otro aspecto, el anticuerpo es una anticuerpo monoclonal, que de preferencia tiene residuos de región para determinación de complementariedad (CDR= complementarity determining región) no humanos y residuos de región de marco (FR=Framework región) humanos. El anticuerpo puede estar etiquetado y puede estar inmovilizado en un soporte sólido. En un aspecto adicional, el anticuerpo es un fragmente de anticuerpo con un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo anti-ideotípico . Todavía en otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-PR087299 , en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, la composición comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo. De preferencia, la composición es estéril . La composición puede administrarse en la forma de una formulación farmacéutica líquida, que puede conservarse para lograr estabilidad en almacenamiento extendida. En forma alterna, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo de cadena sencilla. En una modalidad adicional, la invención se refiere a un artículo de manufactura que comprende: (a) una composición de materia que comprende un polipéptido PR087299 o su agonista o antagonista; (b) un recipiente que contiene la composición; Y (c) una etiqueta fija al recipiente, o un inserto de empaque incluido en el recipiente que se refiere al uso del polipéptido PR087299 o su agonista o antagonista en el tratamiento de una enfermedad inmuno relacionada. La composición puede comprender una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido PR087299 o su agonista o antagonista. Todavía en otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad inmuno relacionada en un mamífero, que comprende detectar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido PR087299 (a) en una muestra de prueba de células de tejido obtenidas del mamífero y (b) en una muestra de control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo de célula, en donde un nivel de expresión superior o inferior en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control indica la presencia de la enfermedad inmuno relacionada en el mamífero del cual se obtuvieron las células de tejido para prueba. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar una enfermedad inmune en un mamífero, que comprende (a) contactar un anticuerpo anti-PR087299 con una muestra de pruebas de células de tejido que se obtienen del mamífero, y (b) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo y un polipéptido PR087299, en la muestra de prueba; en donde la formación del complejo es indicativa de la presencia o ausencia de la enfermedad. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa y puede realizarse en comparación con supervisar la formación de complejo en una muestra de control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo de células. Una mayor cantidad de complejos formados en la muestra de prueba indica la presencia o ausencia de una enfermedad inmune en el mamífero del cual las células del tejido para prueba se obtuvieron. El anticuerpo de preferencia transporta una etiqueta detectable. La formación de complejo puede supervisarse por ejemplo por microscopía de luz, citometría de flujo, fluorimetría, u otras técnicas conocidas en la especialidad. La muestra de prueba usualmente se obtiene de un individuo que se sospecha tiene una deficiencia o anormalidad del sistema inmune. En otra modalidad, la invención proporciona un método para determinar la presencia de un polipéptido PR087299 en una muestra que comprende exponer una muestra de células para prueba que se sospecha contiene el polipéptido PR087299 a un anticuerpo anti-PR087299 y determinar el enlace del anticuerpo a la muestra de células. En un aspecto específico, la muestra comprende una célula que se sospecha contiene el polipéptido PR087299 y el anticuerpo liga a la célula. El anticuerpo de preferencia es etiquetado en forma detectable y/o ligado a un soporte sólido. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un equipo de diagnóstico de enfermedad inmuno relacionada, que comprende un anticuerpo anti-PR087299 y un portador en empaque conveniente. El equipo de preferencia contiene instrucciones para utilizar el anticuerpo para detectar la presencia en el polipéptido PR087299. De preferencia, el portador es farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un equipo de diagnóstico, que contiene un anticuerpo anti-PR087299 en un empaque conveniente. El equipo de preferencia contiene instrucciones para utilizar el anticuerpo para detectar el polipéptido PR087299. En otra modalidad, la invención proporciona un método para diagnosticar una enfermedad inmune relacionada en un mamífero, que comprende detectar la presencia o ausencia de un polipéptido PR087299 en una muestra para prueba de células de tejido que se obtienen del mamífero, en donde la presencia o ausencia del polipéptido PR087299 en la muestra de prueba es indicativa de la presencia de una enfermedad inmuno relacionada en el mamífero. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para identificar un agonista de un polipéptido PR087299 que comprende: (a) contactar células y un compuesto de prueba a supervisar bajo condiciones adecuadas para la inducción de una respuesta celular normalmente inducida por un polipéptido PR087299; y (b) determinar la inducción de la respuesta celular para determinar si el compuesto de prueba es un agonista efectivo, en donde la inducción de la respuesta celular es indicativa al compuesto de prueba que es un agonista efectivo. En otra modalidad, la invención se refiere a un método para identificar un compuesto capaz de inhibir la actividad de un polipéptido PR087299 que comprende contactar un compuesto candidato con un polipéptido PR087299, bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen y determinar si la actividad del polipéptido PR087299 se inhibe. En un aspecto específico, ya sea el compuesto candidato o el polipéptido PR087299 se inmoviliza en un soporte sólido. En otro aspecto, el componente no inmovilizado transporta una etiqueta detectable. En un aspecto preferido, este método comprende las etapas de: (a) contactar células y un compuesto de prueba a supervisar en la presencia de un polipéptido PR087299 bajo condiciones adecuadas para la inducción de una respuesta celular normalmente inducida por un polipéptido PR087299; y (b) determinar la inducción de la respuesta celular para determinar si el compuesto de prueba es un antagonista efectivo. En otra modalidad, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que inhibe la expresión de un polipéptido PR087299 en células que normalmente expresan el polipéptido, en donde el método comprende contactar las células con un compuesto de prueba y determinar si la expresión del polipéptido PR087299 se inhibe. En un aspecto preferido, este método comprende las etapas de : (a) contactar células y un compuesto de prueba a supervisar bajo condiciones adecuadas para permitir extracción del polipéptido PR087299; y (b) determina la inhibición de la expresión del polipéptido. Todavía en otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para tratar un desorden inmuno relacionado en un mamífero que sufre del mismo, que comprende administrar al mamífero una molécula de ácido nucleico que codifica ya sea (a) un polipéptido PR087299, (b) un agonista de un polipéptido PR087299 o (c) un antagonista de un polipéptido PR087299, en donde el agonista o antagonista puede ser un anticuerpo anti-PR087299. En una modalidad preferida, el mamífero es humano. En otra modalidad preferida, el ácido nucleico se administra mediante terapia de genes ex vivo . En una modalidad preferida adicional, el ácido nucleico está comprendido en un vector, más preferiblemente un vector adenoviral, viral adenoasociado, lentiviral o retroviral. Todavía en otro aspecto, la invención proporciona una partícula viral recombinante que comprende un vector viral que esencialmente consiste de un promotor, ácido nucleico que codifica (a) un polipéptido PR087299, (b) un polipéptido agonista de un polipéptido PR087299, o (c) un polipéptido antagonista de un polipéptido PR087299 y una secuencia de señal para secreción celular del polipéptido, en donde el vector viral está en asociación con proteínas estructurales virales. De preferencia, la secuencia de señales de un mamífero, tal como de un polipéptido PR087299 nativo. En una modalidad aún adicional, la invención se refiere a una célula productora ex vivo que comprende una construcción de ácido nucleico que expresa proteínas estructurales retrovirales y también comprende un vector retroviral que consiste esencialmente de un promotor, ácido nucleico que codifica (a) un polipéptido PR087299, (b) un polipéptido agonista de un polipéptido PR087299 o (c) un polipéptido antagonista de un polipéptido PR087299, y una secuencia de señal para secreción celular del polipéptido, en donde la célula productora empaca al vector retroviral en asociación con las proteínas estructurales para producir partículas retrovirales recombinantes . En una modalidad aún adicional, la invención proporciona un método para incrementar la actividad de células inmunes en un mamífero, que comprende administrar al mamífero (a) un polipéptido PR087299, (b) un agonista de un polipéptido PR087299, o (c) un antagonista de un polipéptido PR087299, en donde la actividad de las células inmunes en el mamífero se incrementa. En una aspecto aún adicional, la invención proporciona un método para incrementar la proliferación de células inmunes en un mamífero, que comprende administrar al mamífero (a) un polipéptido PR087299, (b) un agonista de un polipéptido PR087299, o (c) un antagonista de un polipéptido PR087299, en donde la proliferación de células inmunes en el mamífero se incrementa . En una modalidad aún adicional, la invención proporciona un método para disminuir la proliferación de células inmunes en un mamífero, que comprende administrar al mamífero (a) un polipéptido PR087299, (b) un agonista de un polipéptido PR087299, o (c) un antagonista de un polipéptido PR087299, en donde la proliferación de células inmunes en el mamífero se disminuye. B. Modalidades Adicionales En otras modalidades de la presente invención, la invención proporciona vectores que comprenden DNA que codifica cualquiera de los polipéptidos previamente descritos. Células anfitrionas que comprenden cualquier vector semejante también se proporcionan. A manera de ejemplo, las células anfitrionas puedan ser células CHO, de E. coli , o levadura. Un proceso para producir cualquiera de los polipéptidos previamente descritos se proporciona adicionalmente y comprende cultivar células anfitrionas bajo condiciones adecuadas para expresión del polipéptido deseado y recuperar el polipéptido deseado del cultivo celular. En otras modalidades, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden cualquiera de los polipéptidos previamente descritos fusionados a un polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. Ejemplos de estas moléculas quiméricas comprenden cualquiera de los polipéptidos previamente descritos fusionados a una secuencia de etiqueta epítope o una región Fe de una inmunoglobulina. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo que liga específicamente a cualquiera de los polipéptidos descritos anteriormente o a continuación. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo humanizado, fragmento de anticuerpo o anticuerpo de cadena sencilla. Todavía en otras modalidades, la invención proporciona sondas oligonucleótido útiles para aislar secuencias de nucleótido cDNA y genómicas o como sondas anti sentido, en donde esas sondas pueden derivarse de cualquiera de las secuencias nucleótido descritas anteriormente o a continuación. En otras modalidades, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido PR087299.

En un aspecto, la molécula de ácido nucleico aislada comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, en forma alterna cuando menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 98% y en forma alterna al menos aproximadamente 99% identidad de secuencia de ácidos nucleicos a (a) una molécula de ADN (DNA) que codifica un polipéptido PR087299 que tiene una secuencia de aminoácidos de longitud íntegra como aquí se describe, una secuencia de aminoácidos que carece del péptido de señal como aquí se describe, un dominio extra celular de una proteína de transmembrana, con o sin el péptido de señal, como se describe aquí y cualquier otro fragmento específicamente definido de las secuencias de aminoácidos de longitud íntegra como aquí se describe, o (b) el complemento de la molécula de DNA de (a) . En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico aislada comprender una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácido nucleico, en forma alterna al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencias de ácidos nucleicos y en forma alterna al menos aproximadamente 99% de identidad secuencias de ácidos nucleicos a (a) una molécula de DNA que comprende la secuencia de codificación de un cDNA polipéptido PR087299 de longitud íntegra como se describe aquí, la secuencia de codificación de un polipéptido PR087299 que carece del péptido de señal como se describe aquí, la secuencia de codificación de un dominio extra celular de un polipéptido PR087299 de transmembrana con o sin el péptido de señal, como se describe aquí o la secuencia de codificación de cualquier otro fragmento específicamente definido de la secuencia de aminoácidos de longitud íntegra como que se describe aquí, o (b) el complemento de la molécula de DNA de (a) . En un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene cuando menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente identidad de secuencia de ácido nucleico, en forma alterna cuando menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 98% y en forma alterna al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos a una molécula de DNA que codifica el mismo polipéptido maduro como se ilustra en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) . Otro aspecto es que la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido PR087299 que ya es transmembrana con dominio eliminado o transmembrana con dominio inactivado o es complementario a esta secuencia de nucleótido de codificación, en donde el o los dominios de transmembrana de este polipéptido aquí se describen. Por lo tanto, dominios extra celulares solubles de los polipéptidos PR087299 aquí descritos se contemplan. Otra modalidad se dirige a fragmentos de una secuencia de codificación de polipéptido PR087299, o su complemento, que pueden encontrar uso tal como por ejemplo sondas de hibridación, para codificar fragmentos de un polipéptido PR087299 que opcionalmente puede codificar un polipéptido que comprende un sitio de enlace para un anticuerpo anti-PR087299 o como sondas oligonucleótido anti sentido. Estos fragmentos de ácido nucleico usualmente son al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 110 nucleótidos longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 130 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 140 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 160 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 170 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 190 nucleótidos de longitud, alterna al menos aproximadamente 200 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 250 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 350 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 400 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 700 nucleótidos de longitud en forma alterna al menos aproximadamente 800 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud y en forma alterna al menos aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de secuencia de nucleótidos referida más o menos 10% de la longitud de referencia. Se nota que fragmentos novedosos de una secuencia de nucleótidos que codifican polipéptido PR087299 puede determinarse en una forma rutinaria al alinear la secuencia de nucleótidos que codifican polipéptido PR087299 con otras secuencias de nucleótido conocidas utilizando cualquiera de una cantidad de programas de alineamiento y secuencias bien conocidos y determinar que el fragmento o fragmentos de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptido PR087299 son novedosos. Todas estas secuencias de nucleótidos que codifican polipéptido PR087299 se contemplan aquí. También se contemplan los fragmentos de polipéptido PR087299 codificados por estos fragmentos de molécula de nucleótido de preferencia aquellos de fragmentos de polipéptido PR087299 que comprenden un sitio de enlace para un anticuerpo anti-PR087299. En otra modalidad, la invención proporciona polipéptido PR087299 aislado codificado por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico aisladas aquí anteriormente identificadas. En un cierto aspecto, la invención se refiere a un polipéptido PR087299 aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 82% de dentidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna cuando menos aproximadamente 98% identidad de secuencia de aminoácidos y en forma alterna al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a un polipéptido PR087299 que tiene una secuencias de aminoácidos de longitud íntegra como se describe aquí, una secuencia de aminoácidos que carece el péptido de señal como se describe aquí, un dominio extracelular de una proteína de transmembrana con o sin el péptido de señal, como se suscribir aquí o cualquier otro fragmento específicamente definido de la secuencia de aminoácidos de longitud integra aquí descrita. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido PR087299 aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene cuando menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de aminoácidos y en forma alterna al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos mostrado en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) . En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido PR087299 aislado sin la secuencia de señal N-terminal y/o la metionina de inicio y se codifica por una secuencia de nucleótido que codifica esta secuencia de aminoácidos como se describió previamente. Procesos para producir lo mismo, aquí se describen también, en donde esos procesos comprenden cultivar una célula anfitriona que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de codificación apropiada bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PR087299 y recuperar el polipéptido PR087299 del cultivo celular. Otro aspecto que la invención proporciona, un polipéptido PR087299 aislado que ya es eliminado por dominio de transmembrana o inactivado por dominio de transmembrana. Procesos para producir el mismo también aquí se describen, en donde esos procesos comprenden cultivar una célula anfitriona, que comprende un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de codificación apropiado bajo condiciones adecuadas para expresión del polipéptido PR087299 y recuperar el polipéptido PR087299 del cultivo celular.

Todavía en otra modalidad, la invención se refiere a agonistas y antagonistas de un polipéptido PR087299 nativo como se define aquí. En una modalidad particular, el agonista o antagonista es un anticuerpo anti-PR087299 o una molécula pequeña. En una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para identificar agonistas o antagonistas a un polipéptido PR087299 que comprende contactar el polipéptido PR087299 con una molécula candidato y supervisar una actividad biológica mediada por el péptido PR087299. De referencia, el polipéptido PR087299 es un polipéptido PR087299 nativo. En una modalidad aún adicional, la invención se refiere a una composición de materias que comprende un polipéptido PR087299 o un agonista o antagonista de un polipéptido PR087299 como se describe aquí, o un anticuerpo anti-PR087299, en combinación con un portador. Opcionalmente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Otra modalidad de la presente invención se dirige al uso de un polipéptido PR087299, o un agonista o antagonista del mismo como se describió previamente, o un anticuerpo anti-PR087299 para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una condición que responde al polipéptido PR087299, su agonista o antagonista o un anticuerpo anti-PR087299. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS El archivo de esta patente contiene cuando menos un dibujo ejecutado en color. Copias de esta patente con dibujos en color se proporcionarán por la Oficina de Patentes y Marcas ante solicitud y pago de la cuota necesaria. La Figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N0:1) de una secuencia nativa cDNA PR087299, en donde SEQ ID NO : 1 es un clon designado aquí como "DNA332467". La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO:l mostrada en la Figura 1. La Figura 3 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO : 3 ) de un secuencia nativa cDNA HVEM de secuencia nativa (HVEM) , en donde SEQ ID NO: 3, es un clon designado aquí como "HVEM" . La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) derivada de la secuencia de codificación SEQ ID NO: 3 mostrada en la Figura 3. La Figura 5 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) de una secuencia nativa LIGHT, en donde SEQ ID NO : 5 es un clon aquí designado como "LIGHT".

La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 5 mostrada en a Figura 5. La Figura 7 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 7) de una secuencia variante PR087299, en donde SEQ ID NO: 7 es un clon designado aquí como "PR087299.short" . La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO: 7 mostrada en la Figura 7. La Figura 9 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 9) de una secuencia variante PR087299, en donde SEQ ID NO: 9 es un clon designado aquí como " PR087299. AFTNIP" . La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) derivada de la secuencia de codificación de SEQ ID NO : 9 mostrada en la Figura 9. La Figura 11 muestra variantes de ácido nucleico de PR087299 cDNA. La Figura 12 muestra la traducción de polipéptido de variantes PR087299. La Figura 13 muestra inhibición de proliferación de células T CD4+ por anticuerpos agonistas . La Figura 14 muestra el enlace específico de PR087299 a HVEM. La Figura 15 muestra el enlace PR087299 con HVEM cuando se compara con otros miembros de la familia. La Figura 16 muestra el enlace de PR087299 con HVEM es sensible a pH. La Figura 17 muestra el enlace PR087299 a HVEM en células transfectadas con HVEM. La Figura 18 muestra los anticuerpos a PR087299 pueden bloquear la interacción con HVEM. La Figura 19 muestra que PR087299 y LIGHT pueden ligar HVEM en forma simultánea. La Figura 20 muestra que PR087299 no está bloqueado por LIGHT que interactúa con HVEM. La Figura 21 muestra péptido BP-2 y gD que bloquean la interacción PR087299/HVEM. La Figura 22 muestra el efecto inhibitorio PR087299 en células T CD4+. La Figura 23 muestra la activación de polipéptido PR087299 por HVEM promueve su supervivencia en un modelo GVHR. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS I . Definiciones Los polipéptidos PR087299 aquí descritos pueden aislarse de una variedad de fuentes, tales como de tipos de tejido humano o de otra fuente, o preparados por métodos recombinantes o sintéticos. Todas las descripciones en esta especificación que se refieren al "polipéptido PR087299" se refieren a cada uno de los polipéptidos individualmente así como en conjunto. Por ejemplo, descripciones de la preparación de, purificación de, derivación de, formación de anticuerpos con o contra, administración de, composiciones que contienen, tratamiento de una enfermedad con, etc., se refieren a cada polipéptido de la invención, individualmente. El término "polipéptido PR087299" también incluye variantes de los polipéptidos PR087299 aquí descritos. Un "polipéptido PR087299 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido PR087299 correspondiente derivado de la naturaleza. Estos polipéptidos PR087299 de secuencia nativa pueden aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios recombinantes o sintéticos. El termino "polipéptido PR087299 de secuencia nativa" específicamente abarca formas truncadas o secretadas de origen natural del polipéptido PR087299 específico (por ejemplo una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes de origen natural (por ejemplo formas combinadas en forma alterna) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido. En diversas modalidades de la invención, los polipéptidos PR087299 de secuencia nativa aquí descritos son polipéptidos de secuencia nativa maduros o de longitud íntegra, que comprenden las secuencias de aminoácido de longitud íntegra ilustradas en las figuras acompañantes. Codones de arranque y parada se ilustran en tipo de letra negritas y subrayados en las figuras. Sin embargo, mientras que el polipéptido PR087299 descrito en las figuras acompañantes se ilustra que empieza con residuos metionina aquí designados como aminoácido posición 1 en las figuras, se concibe y es posible que otros residuos metionina ubicados ya sea corriente arriba o corriente abajo de la posición aminoácido 1 en las figuras puedan emplearse como un residuo aminoácido de partida para los polipéptidos PR087299. El polipéptido PR087299 "dominio extracelular" o "ECD" se refiere a una forma de polipéptido PR087299 que esencialmente está libre de los dominios transmembrana y citoplás ico . Ordinariamente, un polipéptido PR087299 ECD tendrá menos de 1% de estos dominios transmembrana y/o citoplásmicos y de preferencia tendrán menos de 0.5% de estos dominios. Se entenderá que cualesquiera dominios de transmembrana identificados para los polipéptidos PR087299 de la presente invención se identifican de acuerdo con criterios empleados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de dominio hidrofóbico. Las fronteras exactas de un dominio de transmembrana puedan variar pero muy probablemente no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier extremo del dominio como se identificó inicialmente aquí. Opcionalmente, por lo tanto, un dominio extracelular de un polipéptido PR087299 puede contener de aproximadamente 5 o menos aminoácidos en cualquier lado de la frontera dominio extracelular/dominio de transmembrana como se identifica en los ejemplos o especificación y estos polipéptidos, con o sin el péptido de señal asociado, y el ácido nucleico que los codifican, se contemplan por la presente invención. "Variante de polipéptido PR087299" significa un polipéptido PR087299 activo como se definió anteriormente o a continuación que tiene cuando menos 80% de identidad de secuencia de aminoácido con una secuencia de polipéptido PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra como se describe aquí, una secuencia de polipéptido PR087299 que carece del péptido de señal, como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido PR087299, con o sin el péptidos de señal, como describe aquí o cualquier otro fragmento de una secuencia de polipéptido PR087299 de longitud íntegra como se describe aquí. Estas variantes de polipéptido PR087299 incluyen, por ejemplo polipéptidos PR087299 en donde uno o más residuos aminoácidos se agregan, o eliminan en el extremo -N o -C de la secuencia de aminoácidos nativos de longitud íntegra. Ordinariamente, una variante del polipéptido PR087299 tendrá cuando menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 87%de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de aminoácidos, y en forma alterna al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de aminoácidos, en forma alterna al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de aminoácidos y en forma alterna al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos a una secuencia de polipéptido PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra como se describe aquí, una secuencia de polipéptido PR087299 que carece del péptido de señal, como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido PR087299 con o sin el péptido de señal como se describe aquí o cualquier otro fragmento específicamente definido de una secuencia de polipéptido PR087299 de longitud integra como se describe aquí. Ordinariamente, polipéptidos variantes PR087299 son al menos de aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, o más. "Por ciento (%) identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a la secuencias polipéptido PR087299 aquí identificadas, se define como el porcentaje de residuos aminoácido en una secuencia candidato que son idénticos con los residuos aminoácido en la secuencia de polipéptido PR087299 específica, después de alinear la secuencias e introducir espacios, de ser necesario para lograr la identidad de secuencia máxima porcentual, y sin considerar ninguna sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Alineamiento para propósitos de determinar la identidad de secuencia de aminoácidos en por ciento puede lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza en la técnica, por ejemplo utilizando soporte lógico de computadora disponible públicamente tal como el soporte lógico o programa BLAST, BLAST-2, ALIGN o egalign (DNASTAR) . Aquellos con destreza en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualesquiera algoritmos requeridos para lograr máximo alineamiento sobre la longitud íntegra de las secuencias que se comparan. Para los propósitos presentes, sin embargo valores en % de identidad de secuencias de aminoácidos se generan utilizando el programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa de computadora para comparación de secuencia ALIGN-2 tiene como autor Genentech, Inc. y el código fuente mostrado en la Tabla 1 siguiente se ha presentado con la documentación de usuario en U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en donde se registra bajo el registro de derechos autor de los E.U.A (U.S. Copyright Registration No. TXU510087) . El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede ser compilado del código fuente que se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa ALIGN-2 deberá ser compilado para utilizar en un sistema operativo UNIX, de preferencia UNIX V4. OD digital . Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para comparación de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos determinada A, con o contra una secuencia de aminoácidos B determinada (que puede ser en forma alterna redactada como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos para, con, o contra una secuencia de aminoácidos B determinada) se calcula como sigue : 100 veces la fracción X/Y. en donde X es el número de residuos aminoácido calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencia ALIGN-2 en que el alineamiento del programa de A y B en donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no sería igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. Como ejemplos de cálculos de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos que utilizan este método, las Tablas 2 y 3 demuestran cómo calcular el % de identidad de secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos designada "Proteína de Comparación" a la secuencia de aminoácidos designada "PR087299", en donde "PR087299" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido PR087299 hipotético de interés, "Proteína de Comparación" representa la secuencia de aminoácidos de un polipéptido contra el cual el polipéptido "PR087299" de interés se compara y "X, "Y" y "Z" cada una representan diferentes residuos aminoácido hipotéticos. Al menos que se establezca específicamente de otra forma, todos los valores de identidad de secuencia de aminoácidos aquí empleados se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente presedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2. Sin embargo, valores en % de identidad de secuencia de aminoácidos también pueden ser obtenidos como se describe a continuación utilizando el programa de computadora WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)) . La mayoría de los parámetros de investigación WU-BLAST-2 se establecen a los valores predefinidos. Aquellos que no se establecen en valores predefinidos, es decir los parámetros ajustables, se establecen con los siguientes valores: extensión de superposición = 1, fracción de súper posición = 0.125, umbral de palabra (T) = 11, y matriz de calificación = BLOSUM62. Cuando WU-BLAST-2 se emplea, un % de identidad de secuencias de aminoácidos, se determina al dividir (a) el número de residuos aminoácido idénticos correspondientes entre la secuencia de aminoácidos del polipéptido PR087299 de interés que tiene unas secuencias derivada del polipéptido PR087299 nativo y la secuencia de aminoácido de comparación de interés (es decir la secuencia contra la que el polipéptido PR087299 de interés se compara que puede ser un polipéptido variante (PR087299) co o se determina por WU-BLAST-2 por (b) el número total de residuos aminoácido del polipéptido PR087299 de interés. Por ejemplo, en la declaración "un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos A que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido PR087299 de interés. El por ciento de identidad de secuencia de amino ácidos también determinarse utilizando el programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). Programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 puede descargarse de http://www.ncbi.nlm.nih.gov o de otra foram obtenerse de National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en donde todos estos parámetros de búsqueda se establecen en valores predefinidos incluyendo por ejemplo, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-value = 0.01, constant for ulti-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 and scoring atrix = BLOSUM62. En situaciones en donde NCBI-BLAST2 se emplea para comparaciones de secuencia de amino ácidos, el % de identidad de secuencia de amino ácidos de una secuencia de amino ácidos determinada A para, con, o contra una secuencia de amino ácidos B (que puede ser redactada en forma alterna como una secuencia de amino ácidos A determinada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de amino ácidos para, con, o contra una secuencia de amino ácidos determinada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos amino ácidos calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencia NCBI-BLAST2 en que en ese progra ade alineamiento de A y B, y en donde Y es el número total de residuos amino ácidos en B . Se apreciará que cuando la longitud de secuencia de amino ácidos A no es igual a la longitud de secuencia de amino ácidos B, el % de identidad de secuencia de amino ácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de amino ácidos de B a A. "Polinucleótido variante PR087299" o "secuencia de ácidos nucleicos variante PR087299" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PR087299 activo como se define a continuación y que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia polipéptido PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra, como aquí se describe, una secuencia de polipéptido PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra que carece del péptido de señal, como aquí se describe, un dominio extracelular de un polipéptido PR087299, con o sin el péptido de señal, como se describe aquí o cualquier otro fragmento de una secuencia polipéptido PR087299 de longitud íntegra como se describe aquí. Ordinariamente, un polinucleótido variante PR087299 tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos y en forma alterna al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de polipéptido PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra como se describe aquí, una secuencia de polipéptido PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra que carece del péptido de señal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido PR087299, con o sin la secuencia de señal como se describe aquí, o cualquier otro fragmento de una secuencia polipéptido PR087299 de longitud íntegra como se describe aquí. Variantes no abarcan la secuencia de nucleótido nativo. Ordinariamente, los polinucleótidos variants PR087299 son al menos aproximadamente de 30 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más. "Por ciento (%) identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a secuencias de ácido nucleicos que codifican PR087299 aquí identificados, se define como el por ciento de nucleótidos en una secuencia candidato que son idénticos con los nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos PR087299 de interés, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para lograr el máximo por ciento de identidad de secuencia. Alineamiento para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de ácidos nucleicos puede lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza en la técnica, por ejemplo, utilizando programa de computadora disponible en forma pública tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Para los presentes propósitos, sin embargo se generan valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos utilizando el programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2 tiene como autor Genentech, Inc., y el código fuente ilustrado en la Tabla 1 siguiente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U.A. (U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559, en donde se ha registrado bajo el No. de Registro de Derechos de Autor de los E.U.A. No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede ser compilado del código fuente que se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa ALIGN-2 deberá ser compilado para utilizar en un sistema operativo UNIX, de preferencia UNIX V4. OD digital . Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencia de ácido nucleico, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos determinada C para, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D (que puede ser redactada en forma alterna como una secuencia de ácidos nucleicos C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos para, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D) se calcula como siguen: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencia ALIGN-2 en este programa el alineamiento de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D a C . Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, Tablas 4 y 5, demuestran como calcular el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos designada "DNA de Comparación" a la secuencia de ácidos nucleicos designada "PR087299-DNA" , en donde "PR087299-DNA" representa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica PR087299 hipotética de interés, "DNA de Comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra la cual la molécula de ácido nucleico "PR087299-DNA" de interés se compara, y "N", "L" y "V" cada uno representan diferentes nucleótidos hipotéticos. A menos que se establezca específicamente de otra forma, todos los valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos aquí empleados se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2. Sin embargo, valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos también pueden obtenerse como describe a continuación utilizando el programa de computadora WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996) ) . La mayoría de los parámetros de búsqueda WU-BLAST-2 se establecen a los valores predefinidos. Aquellos no establecidos a valores predefinidos, es decir, los parámetros ajustables, se establecen con los siguientes valores: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring atrix = BLOSUM62. Cuando WU-BLAST-2 se emplea, un valor de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos se determina al dividir (a) el número de nucleótidos idénticos correspondientes entre la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PR087299 de interés que tiene una secuencia derivada del ácido nucleico que codifica el polipéptido PR087299 de secuencia nativa y la molécula de interés de ácido nucleico de comparación (es decir la secuencia contra la cual la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PR087299 de interés se compara que puede ser una variante del polinucleótido PR087299) como se determina por WU-BLAST-2 por (b) el número total de nucleótidos de la molécula de interés de ácido nucleico que codifica el polipéptido PR087299. Por ejemplo, en la frase "una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos A que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos nucleicos B", la secuencia de ácidos nucleicos A es la molécula de interés del ácido nucleico de comparación y la secuencia de ácidos nucleicos B es la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de interés de ácido nucleico que codifica el polipéptido PR087299. El por ciento de identidad de secuencia de amino ácidos también puede determinarse utilizando el programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 puede descargarse de http://www.ncbi.nlm.nih.gov o de otra forma obtenerse de National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en donde todos esos parámetros de búsqueda se establecen en valores predefinidos incluyendo por ejemplo, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity length = 15/5, multi-pass e-valué = 0.01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 and scoring matrix BLOSUM62. En situaciones en donde NCBI-BLAST2 se emplea para comparaciones de secuencia de amino ácidos, el % de identidad de secuencia de amino ácidos de una secuencia de amino ácidos determinada A para, con, o contra una secuencia de amino ácidos B (que puede ser redactada en forma alterna como una secuencia de amino ácidos A determinada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de amino ácidos para, con, o contra una secuencia de amino ácidos determinada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos amino ácidos calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencia NCBI-BLAST2 en que en ese programa de alineamiento de A y B, en donde Y es el número total de residuos amino ácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de secuencia de amino ácidos A no es igual a la longitud de secuencia de amino ácidos B, el % de identidad de secuencia de amino ácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de amino ácidos de B a A. "Polinucleótido variante PR087299" o "secuencia de ácidos nucleicos variante PR087299" significa una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PR087299 activo como se define a continuación y que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia polipéptido PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra, como aquí se describe, una secuencia de polipéptido PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra que carece del péptido de señal, como aquí se describe, un dominio extracelular de un polipéptido PR087299, con o sin el péptido de señal, como se describe aquí o cualquier otro fragmento de una secuencia polipéptido PR087299 de longitud íntegra como se describe aquí. Ordinariamente, un polinucleótido variante PR087299 tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, en forma alterna al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos y en forma alterna al menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de polipéptido PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra como se describe aquí, una secuencia de polipéptido PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra que carece del péptido de señal como se describe aquí, un dominio extracelular de un polipéptido PR087299, con o sin la secuencia de señal como se describe aquí, o cualquier otro fragmento de una secuencia polipéptido PR087299 de longitud íntegra como se describe aquí. Variantes no abarcan la secuencia de nucleótido nativo. Ordinariamente, los polinucleótidos variantes PR087299 son al menos aproximadamente de 30 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más. "Por ciento (%) identidad de secuencia de ácidos nucleicos" con respecto a secuencias de ácido nucleicos que codifican PR087299 aquí identificados, se define como el por ciento de nucleótidos en una secuencia candidato que son idénticos con los nucleótidos en la secuencia de ácidos nucleicos PR087299 de interés, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para lograr el máximo por ciento de identidad de secuencia. Alineamiento para propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de ácidos nucleicos puede lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza en la técnica, por ejemplo, utilizando el programa de computadora disponible en forma pública tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Para los presentes propósitos, sin embargo se generan valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos utilizando el programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa de computadora de comparación de secuencia ALIGN-2 tiene como autor Genentech, Inc., y el código fuente ilustrado en la Tabla 1 siguiente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U.A. (U.S. Copyright Office), Washington D.C., 20559, en donde está registrado bajo el No. de Registro de Derechos de Autor de los E.U.A. No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede ser compilado del código fuente que se proporciona en la Tabla 1 siguiente. El programa ALIGN-2 deberá ser compilado para utilizar en un sistema operativo UNIX, de preferencia UNIX V4. OD digital . Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen por el programa ALIGN-2 y no varían. En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencia de ácido nucleico, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos determinada C para, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D (que puede ser redactada en forma alterna como una secuencia de ácidos nucleicos C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos para, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D) se calcula como siguen: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencia ALIGN-2 en este programa el alineamiento de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D a C . Como ejemplos de cálculos de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos, Tablas 4 y 5, demuestran como calcular el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos designada "DNA de Comparación" a la secuencia de ácidos nucleicos designada "PR087299-DNA" , en donde "PR087299-DNA" representa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica PR087299 hipotética de interés, "DNA de Comparación" representa la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico contra la cual la molécula de ácido nucleico "PR087299-DNA" de interés se compara, y "N" , "L" y "V" cada uno representan diferentes nucleótidos hipotéticos.

A menos que se establezca específicamente de otra forma, todos los valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos aquí empleados se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2. Sin embargo, valores de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos también pueden obtenerse como se describe a continuación utilizando el programa de computadora WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)) . La mayoría de los parámetros de búsqueda WU-BLAST-2 se establecen a los valores predefinidos. Aquellos no establecidos a valores predefinidos, es decir, los parámetros ajustables, se establecen con los siguientes valores: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. Cuando WU-BLAST-2 se emplea, un valor de % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos se determina al dividir (a) el número de nucleótidos idénticos correspondientes entre la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PR087299 de interés que tiene una secuencia derivada del ácido nucleico que codifica el polipéptido PR087299 de secuencia nativa y la molécula de interés de ácido nucleico de comparación (es decir la secuencia contra la cual la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido PR087299 de interés se compara que puede ser una variante del polinucleótido PR087299) como se determina por WU-BLAST-2 por (b) el número total de nucleótidos de la molécula de interés de ácido nucleico que codifica el polipéptido PR087299. Por ejemplo, en la frase "una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos A que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la secuencia de ácidos nucleicos B" , la secuencia de ácidos nucleicos A es la molécula de interés del ácido nucleico de comparación y la secuencia de ácidos nucleicos B es la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de interés de ácido nucleico que codifica el polipéptido PR087299. El por ciento de identidad de secuencia de ácidos nucleicos también puede determinarse utilizando el programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)) . El programa de comparación de secuencia NCBI-BLAST2 puede descargarse de http://www.ncbi.nlm.nih.gov o de otra forma obtenerse de National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en donde todos esos parámetros de búsqueda se establecen a valores predefinidos incluyendo por ejemplo, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10, minimum low complexity de longitud = 15/5, multi-pass e-value = 0.01, constant for multi-pass = 25, dropoff for final gapped alignment = 25 and scoring matrix BLOSUM62. En situaciones en donde NCBI-BLAST2 se emplea para comparaciones de secuencia, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de una secuencia de ácidos nucleicos determinada C para, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos determinada D (que en forma alterna pueda redactarse como una secuencia de ácidos nucleicos determinada C que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos para, con, o contra una secuencia de ácidos nucleicos dada D) se calcula como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencia NCBI-BLAST2 en ese programa el alineamiento de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos C no es igual a la longitud de la secuencia de ácidos nucleicos D, el % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de C a D no será igual al % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de D a C .

En otras modalidades, polinucleótidos variantes PR087299 son moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido PR087299 activo y que son capaces de hibridizar, de preferencia bajo severas condiciones de hibridación y lavado, a secuencias de nucleótido que codifican un polipéptido PR087299 de longitud íntegra como aquí se describe. Polipéptidos variantes PR087299 pueden ser aquellos que se codifican por un polinucleótido variante PR087299. "Aislado", cuando se utiliza para describir los diversos polipéptidos aquí descritos, significa polipéptido que se ha identificado y separado y/o recuperado por un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que típicamente interfieren con los usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el polipéptido será purificado (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de amino ácidos interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de copa de centrifugado, o (2) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, de preferencia, tinción de plata. Polipéptido aislado incluye polipéptido in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido PR087299 no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, polipéptido aislado se preparará por al menos una etapa de purificación. Un ácido nucleico que codifica polipéptido PR087299 "aislado" u otro ácido nucleico que codifica polipéptido es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el polipéptido. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado es diferente en la forma o ambiente en el que se encuentra en la naturaleza. Moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptido aislado por lo tanto se distinguen de la molécula de ácido nucleico que codifica polipéptido específico como existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico que codifica polipéptido aislado incluye moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptido obtenidas en células que ordinariamente expresan el polipéptido cuando por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosomal diferente de la de células naturales.

El término "secuencias de control" se refiere a secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazado operativamente en un organismo anfitrión particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace de ribosoma. Células eucarióticas se conoce que utilizan promotores, señales de poliadenilación, y mejoradores. Ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, DNA para un líder secretorio o de presecuencia se enlaza operativamente con DNA para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma se enlaza operativamente a una secuencia de codificación si se ubica para facilitar traducción. En general, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de DNA que se enlazan son contiguas, y en el caso de un líder secretorio, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, mejoradores no tienen que ser contiguos. El enlace se logra por ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, los enlazadores o adaptadores oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional. El término "anticuerpo" se emplea en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo anticuerpos monoclonales anti-PR087299 sencillos (incluyendo agonistas, antagonistas y anticuerpos neutralizantes) , composiciones de anticuerpo anti-PR087299 con especificidad poliepitópica, anticuerpos anti-PR087299 de cadena sencilla, y fragmentos de anticuerpos anti-PR087299 (ver a continuación) . El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por mutaciones de origen natural posible que pueden estar presentes en cantidades menores. "Severidad" de reacciones de hibridación se determina fácilmente por una persona con destreza ordinaria en la especialidad y en general es un cálculo empírico que depende de la longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, sondas más largas requieren superiores temperaturas para adecuado alineado, mientras que sondas más cortas requieren menores temperaturas. La hibridación en general depende de la capacidad de DNA desnaturalizado para realinear cuando están presentes hebras complementarias en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Entre mayor sea el grado de homología deseado entre la sonda y secuencia hibridizable, más alta será la temperatura relativa que puede utilizarse. Como resultado, se concluye que temperaturas relativas superiores tenderán a hacer más severas las condiciones de reacción, mientras que serán menores para temperaturas menores . Para detalles y explicación adicional de severidad de reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) . "Condiciones severas" o "condiciones de alta severidad", como se define aquí, pueden ser identificadas por aquellos que: (1) emplean baja concentración iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.0015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio 0.01% a 50 grados C; (2) se emplean durante hibridación un agente de desnaturalización tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0.1%/Ficoll al 0.1%/ polivinilpirolidona al 0.01%/amortiguador fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 M, citrato de sodio 75 mM a 42 grados C; o (3) se emplean formamida al 50%, 5 x SSC (0.75 M NaCl, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1%, solución de Denhardt 5 x, DNA de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), SDS al 0.1%, y dextran sulfato al 10% a 42 grados C, con lavados a 42 grados C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55 grados C, seguido por un lavado de alta severidad que consiste de 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55 grados C. "Condiciones moderadamente severas" pueden identificarse como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluye el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo temperatura, concentración iónica y %SDS) menos severas que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas es incubación durante la noche a 37 grados C en una solución que comprende: Formamida al 20%, 5 x SSC (150 mM NaCl , citrato trisódico a 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6) , solución de Denhardt 5 x, dextran sulfato al 10%, y DNA de esperma de salmón cizallado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido por lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50 grados C. La persona con destreza reconocerá como ajustar la temperatura, concentración iónica, etc. según sea necesario para ajustar factores tales como longuitud de sonda y semejantes. El término "etiquetado con epítope" cuando se utiliza aquí se refiere a un polipéptido quimérico que comprende polipéptido PR087299 fusionado a un "polipéptido de etiqueta" . El polipéptido de etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual puede hacerse un anticuerpo, sin embargo es lo suficientemente corto de manera tal que no interfiera con la actividad del polipéptido al cual se funciona. El polipéptido de etiqueta de preferencia también es bastante único ya que el anticuerpo no reacciona en forma cruzada sustancialmente con otros epítopes. Polipéptidos de etiqueta convenientes en general tienen cuando menos seis residuos aminoácido y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos aminoácido (de preferencia entre aproximadamente 10 y 20 residuos aminoácido) . Como se emplea aquí, el término "inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo que combinan la especificidad de enlace de una proteína heteróloga (una "adesina") con funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de enlace deseada que es diferente al reconocimiento de antígeno y sitio de enlace de un anticuerpo (es decir es "heterólogo") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contiguos que comprende al menos el sitio de enlace de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, (incluyendo IgA-1 y IgA-2), IgE, IgD o IgM. "Activo" o "actividad" para los presentes propósitos se refiere a una o varias formas de un polipéptido PR087299 que retienen una actividad biológica y/o inmunológica de un PR087299 nativo o de origen natural en donde la actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibitoria o estimulante) provocada por un PR087299 nativo o de origen natural, diferente a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico que posee un PR087299 de origen natural o nativo y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico que posee un PR087299 nativo o de origen natural. El término "antagonista" se emplea en sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquea inhibe o neutraliza parcial o totalmente una actividad biológica de un polipéptido PR087299 nativo aquí descrito. En forma similar el término "agonista" se emplea en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imite una actividad biológica de un polipéptido PR087299 nativo aquí descrito. Moléculas agonistas o antagonistas convenientes incluyen específicamente anticuerpos o fragmentos de anticuerpo agonistas o antagonistas, fragmentos o variantes de secuencia de aminoácidos de polipéptidos péptidos oligonucleótidos antisentido pequeñas moléculas orgánicas PR087299 en nativos, etcétera. Métodos para identificar agonistas o antagonistas de un polipéptido PR087299 pueden comprender contactar un polipéptido PR087299 con una molécula agonista o antagoniza candidato y medir un cambio detectable en una o más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido PR087299. "Tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como medidas profilácticas o preventivas en donde el objeto es evitar o frenar (reducir) la condición o desorden patológico objetivo. Aquellos que requieren tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el desorden así como aquellos tendientes a tener el desorden o aquellos en quienes se va a evitar el desorden. Administración "crónica" se refiere a administración de el o los agentes en un modo continuó en oposición a un modo agudo, para mantener el efecto (actividad) terapéutica inicial por un período prolongado de tiempo. Administración "intermitente" es tratamiento que no se realiza en forma consecutiva sin interrupción, sino más bien es de naturaleza ciclíca. "Mamífero" para propósito de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos, o mascotas, tales como perros, gatos, ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etcétera. De preferencia, el mamífero es humano. La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. "Portadores" como se emplea aquí incluyen portadores expedientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos a la célula o mamífero a los que se exponen a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución amortiguadora de pH acuoso. Ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinílpirolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, aspargina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcar alcoholes tales como manitol o sorbitol; contraiónes formadores de sales tales como sodio y/o surfactantes no iónicos tales como TWEER, polietilen glicol (PEG) , y PLUR0NICMR. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, de preferencia la región variable o de enlace antígeno del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab X F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng . 8(10) : 1057 1062 [1995] ) ; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace antígeno idénticos denominados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de enlace antígeno y un fragmento "Fe" residual, una designación que refleja la capacidad por cristalizar fácilmente.

Tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y todavía es capaz de entrelazar el antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpos mínimo que comprende un sitio de enlace y reconocimiento de antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variables de cadena pesada y una cadena ligera en asociación no covalente cerrada. Es en esta configuración que los tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlaces de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. En forma colectiva, los seis CDRs confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDRs específicos para un antígeno) tienen la capacidad para reconocer y ligar antígeno, aunque a menor afinidad que todo el sitio de enlace. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adisión de unos cuantos residuos en el extremo carboxi del dominio de cadena pesada CH1 incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para Fab' en donde el o los residuos cisteína de los dominios constantes contienen un grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab ' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo también son conocidos . Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda con base en la secuencia de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de éstas pueden ser adicionalmente divididas en subclases (isotipos) , por ejemplo IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgA, y IgA2. Fragmentos de anticuerpo de "Fv de cadena sencilla" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipéptido. De preferencia, el polipéptido Fv además comprende un enlanzador polipéptido entre los dominios VH y VL que permiten al sFv formar la estructura deseada para enlace de antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). 269-315 (1994) . El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos ciclos de enlaces de antígeno que, estos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipéptido (VH-VL) . Al utilizar un enlazador que es muy corto para permitir aparear entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a aparear con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Diacuerpos se describen más completamente por ejemplo en EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) . Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con usos de diagnóstico o terapéutico para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínaceos o no proteínaceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en pesos de anticuerpo como se determina por el método Lowry y más preferiblemente más de 99% en peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácido interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de copa de centrifugado o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción utilizando azul de Coomassie o de preferencia tinción con plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ con células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación. Un anticuerpo que "liga específicamente con" o es "específico para" un polipéptidos particular o un epítope en un polipéptido particular es aquél liga con ese polipéptido o epítope particular en un polipéptido particular sin ligar sustancialmente con cualquier otro polipéptido o polipéptido epítope. La palabra "etiqueta" cuando se emplea aquí, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo para generar un anticuerpo "etiquetado" . La etiqueta puede detectarse por sí misma (por ejemplo etiquetas radioisótopo o etiquetas fluorescentes) o en el caso de una etiqueta enzimática, pueden catalizar alteraciones químicas de un compuesto o composición de sustrato que son detectables. Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la cual puede adherirse el anticuerpo de la presente invención. Ejemplos de fases sólidas aquí abarcadas se incluyen aquellas jornadas parcial o totalmente de vidrio (por ejemplo vidrio de poro controlado), polisacárodos (por ejemplo agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, poliviníl alcohol y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo el contexto, la fase sólida puede comprender el depósito o pozo de una placa de ensayo; en otras, es una columna de purificación (por ejemplo una columna de cromatografía por afinidad) . Ese termino también incluye una fase sólida discontinúa de partículas discretas, tales como aquellas descritas en la patente de los E.U.A Número 4,275,149. 4, 275,149. Un "liposoma" es una pequeña vesicula compuesto por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante que es útil para el suministro de una droga (tal como un polipéptido PR087299 o su anticuerpo) a un mamífero. Los componentes de liposoma se disponen comúnmente en una formación bicapa similar al arreglo de lípido de membranas biológicas. Una "molécula pequeña" aquí se define para tener un peso molecular inferior a aproximadamente 500 Daltons . El termino "enfermedad inmune relacionada" significa una enfermedad que es un componente del sistema inmune de un mamífero que provoca, media o de otra forma contribuye a la morbidez en el mamífero. También se incluyen enfermedades en donde el estímulo o intervención de la respuesta inmune tiene un efecto mejorador en el avance de la enfermedad. Incluidas dentro de éste termino se encuentran enfermedades inflamatorias inmuno mediadas, enfermedades inflamatorias no inmuno mediadas, enfermedades infecciosas, enfermedades de inmunodeficiencia, neoplasia, etc. El termino "enfermedad mediada por célula T" significa una enfermedad en donde las células T directa o indirectamente median o de otros forma contribuye a una morbidez en un mamífero. La enfermedad mediada por célula T puede estar asociada con efectos mediados por células, efectos mediados por linfocinas, etc. e incluso efectos asociados con células B si las células B se estimulan por ejemplo por las linfocinas secretadas por las células T. Ejemplos de enfermedades inmuno relacionadas e inflamatorias, algunos de los cuales son inmunes o mediados por células T, que pueden tratarse de acuerdo con la invención incluyen lupus sistémico eritematosis, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatias, esclerosis sistémica (escleroderma) , miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis) , síndrome de Sjógren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturnal paroxismal) , trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitópenica idiopática, trombocitopenia immuno mediada), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica) , diabetes mellitus, enfermedad renal inmuno mediada (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial) , enfermedades desmielinantes de los sistemas nervioso central y periférico tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinante idiopática o síndrome de Guillain-Barré, y polineuropatía desmielinante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos) , hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, y colangitis esclerosante, enfermedad intestinal inflamatoria (colitis ulcerativa: enfermedad de Crohn) , enteropatía sensible a gluten, y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel autoinmunes o inmunomediadas, incluyendo enfermedades de piel bulosa, dermatitis de contacto y eritema multiforme, soriasis, enfermedades alérgicas tal como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a alimentos y urticaria, enfermedades immunológicas del pulmón tales como neumonías eosinofilícas, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis de hipersensibilidad, enfermedades asociadas a transplante incluyendo rechazo de injerto y enfermedad de injerto-contra-anfitrión. Enfermedades infecciosas incluyendo enfermedades virales tales como SIDA (AIDS) (infección HIV) , hepatitis A, B, C, D, y E, herpes, etc., infecciones bacterianas, infecciones fúngales, infecciones de protozoarios e infecciones parasitarias. El término "cantidad efectiva" es una concentración o cantidad de un polipéptido PR087299 y/o agonista/antagonista que resulta en lograr un propósito particular establecido. Una "cantidad efectiva" de un polipéptido PR087299 o su agonista o antagonista puede ser determinada empíricamente. Además, una "cantidad terapéuticamente efectiva" es una concentración o cantidad de un polipéptido PR087299 y/o agonista/antagonista que es efectivo para lograr un efecto terapéutico establecido. Esta cantidad también puede determinarse empíricamente.

El termino "agente citotóxico" como se emplea aquí, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de células y/o provoca destrucción de células. El termino se pretende que incluya isótopos radiactivos (por ejemplo At .2'11 -131 •125 ,90 Re 1186 ReJ Sm1 Bi 2'12 P 3"2, isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos, por ejemplo metotrexato, adriamicina, vinca alkaloides (vincristina, vinblastina, etoposido) , doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes de intercalado, enzimas y sus fragmentos, tales como enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano fangal de plantas o animales, incluyendo fragmentos y/o sus variantes, y los diversos agentes anti tumor o anti cáncer descritos a continuación. Otros agents cititóxicos se describen a continuación. Un agente tumoricidal provoca destrucción de células de tumor. Citotoxinas pueden ligarse covalentemente a un anticuerpo para hacer diana en la toxina a una célula particular de interés que exprese el antígeno. Citotoxinas útiles y su enlazador incluyen sin limitación los siguientes: Enlazadores : MC = maleimidocaproilo Val Cit = valina-citrulina, sitio dipéptido en enlazador escindible por proteaza. Citrulina = ácido 2 -amino-5-ureido pentanóico. PAB = p-aminobenzilcarbamoilo (porción de enlazador "auto inmoladora" ) Me N-metil -valina citrulina en donde la unión de péptido enlazador se ha modificado para evitar su escisión por catepsina B MC(PEG)6-0H = aleimidocaproil- polietilen glicol, conectado al anticuerpo-cisteinas . SPP = N-Succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato SMCC = N-Succinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1 carboxilato DROGAS CITOTÓXICAS: MMAE = mono-metil auristatina E (MW 718) MMAF = variante de auristatina E (MMAE) con una fenilalanina en el extremo C de la droga (MW 731.5) MMAF-DMAEA = MMAF con DMAEA (dimetilaminoetilamina) en un enlace amida a la fenilalanina C-terminal (MW 801.5) MMAF-TEG = MMAF con tetraetilen glicol esterificado a la fenilalanina MMAF-NtBu = N-t-butilo, conectado con una amida al extremo C-de MMAF AEVB = auristatina E valeril benzilhidrazona, enlazador ácido lábil a través del extremo C de AE (MW 732) AFP =Auristatina F fenilen diamina; (la variante fenilalanina enlazada al anticuerpo a través del extremo C-mediante un espaciador fenilendiamina) (MW 732). Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se emplea aquí, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento una célula ya sea in vi tro o in vivo . De esta manera, el agente inhibidor de crecimiento puede ser aquel que reduce significativamente el por ciento de células en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyan agentes que bloquean avance de ciclo celular (en un sitio diferente a la fase S) tales como agentes que inducen freno Gl y freno en fase M. Bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido, y bleomicina. Aquellos agentes que frenan Gl también derraman en el arresto de fase S, por ejemplo agentes de alquilación de DNA tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C Mayor información puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer endelsohn and Israel, eds., capítulo 1, con título "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. WB Saunders : Philadelphia, 1995), en especial p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son drogas anti -cáncer ambas derivadas del árbol tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del tejo europeo es un análogo semi sintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el armado de microtubulos de dimeros de tubulina y estabilizan microtubulos al evitar despolimerización, lo que resulta en la inhibición de mitosis en células. Un "agente quicioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen adriamicina, doxorubicina, epirubicina, 5-fluorouracilo, citosina arabinosida ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfan, citoxina, taxoides, por ejemplo, paclitaxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) , y doxetaxel (Taxotere, Rhdne-Poulenc Rorer, Antony, Francia), toxotere, metotrexato, cisplatina, melfalan, vinblastina, bliomicina, etoposido, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinoreibina, carboplatina, teniposido, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (ver Patente de los E.U.A. Número 4,675,187) melfalan y otras mostazas de nitrógeno relacionadas. También se incluyen en esta definición agentes hormonales que actúan para regular o inhibir acción de hormonas en tumores tales como tamoxifen y onapristona.

El termino "citosina" es un termino genérico para proteínas liberadas por una población cellular que actúan en otra célula como mediadores intercelulares . Ejemplos de estas citosinas son linfocinas, monosinas, y hormonas polipéptido tradicionales. Entre las citosinas se incluyen hormona de crecimiento tal como hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento N-metionilo y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteínas tales como hormonas para estímulo de folículo (FSH= follicle stimulating hormone) , hormona de estímulo de tiroides (TSH=thyroid stimulating hormone), y hormona luteinizante (LH= luteinizing hormone) ; factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; lactógeno placentario; factor- y factor- ß en necrosis de tumor; sustancia de inhibición mulleriana- ; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento vascular endotelial; integrina; trombopoietina (TPO) ; factores de crecimiento de nervios tales como NGF- ?; factores de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento de transformación (TGFs=transforming growth factors) tales como TGF-a y TGF- ?; factor de crecimiento tipo insulina-I y -II; eritropoietina (EPO) ; factores osteoinductivos ; interferonas tales como interferona- a , - ß , y ? ; factores de estímulo de colonias (CSFs=colony stimulating factors ) tales como macrófago-CSF (M-CSF) ; granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF (G-CSF) ; interleusinas (ILs) tales como IL-1, I -la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; un factor de necrosis del tumor tal como TNF- o TNF-/?; y otros factores de polipéptido incluyendo LIF y kit ligando (KL) . Como se emplea aquí, el termino citosina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citosinas de secuencia nativa. Cómo se emplea aquí, el termino "inmunoadhesina" designa moléculas tipo anticuerpo que combinan la especificidad de enlace de una proteína heteróloga (una "adhesina") con funciones efectoras de dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de enlace deseada que es diferente al sitio de enlace y reconocimiento de antígeno de un anticuerpo (es decir es "heteróloga"), y una secuencia de dominio constantemente de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos el sitio de enlace de un receptor o un ligando. La secuencia de dominio constantemente de inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede obtenerse de cualquier inmunoglobulina tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, (incluyendo IgA-1 y IgA-2), IgE, IgD o IgM. Como se emplea aquí, el termino "células inflamatorias" designa células que mejorar la respuesta inflamatoria tales como células mononucleares, eosinófilos, macrófagos y neutrófilos polimorfonucieares (PMN=polymorphonuclear neutrophils) . Tabla 1 /* * C C increased from 12 to 15 * Z is average of EQ * B is average of ND * match with stop is _M; stop stop = 0; J (joker) match = 0 */ #define _M 8 /* valué of a match with a stop */ int _day[26] [26] = { /* A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z */ /* */ { 2, 0, 2, 0, 0, 4, 1, 1, 1, 0, 1, 2, 1, 0,_M, 1, 0, 2, 1, 1, 0, 0, 6, 0, 3, ?}, /* B */ { 0, 3, 4, 3, 2, 5, 0, 1, 2, 0, 0, 3, 2, 2,_M, 1, 1, 0, 0, 0, 0, 2, 5, 0, 3, 1}, /* C */ { 2, 4,15, 5, 5, 4, 3, 3, 2, 0, 5, 6, 5, 4,_M, 3, 5, 4, 0, 2, 0, 2, 8, 0, 0, 5}, /* D */ { 0, 3, 5, 4, 3, 6, 1, 1, 2, 0, 0, 4, 3, 2,_M, 1, 2, 1, 0, 0, 0, 2, 7, 0, 4, 2}, /* E */ { 0, 2, 5, 3, 4, 5, 0, 1, 2, 0, 0, 3, 2, 1,_M, 1, 2, 1, 0, 0, 0, 2, 7, 0, 4, 3}, /* F */ { 4, 5, 4, 6, 5, 9, 5, 2, 1, 0, 5, 2, 0, 4,_M, 5, 5, 4, 3, 3, 0, 1, 0, 0, 7, 5}, /* G */ { 1, 0, 3, 1, 0, 5, 5, 2, 3, 0, 2, 4, 3, 0,_M, 1, 1, 3, 1, 0, 0, 1, 7, 0, 5, 0}, /* H */ { 1, 1, 3, 1, 1, 2, 2, 6, 2, 0, 0, 2, 2, 2,_M, 0, 3, 2, 1, 1, 0, 2, 3, 0, 0, 2}, /* I */ { 1, 2, 2, 2, 2, 1, 3, 2, 5, 0, 2, 2, 2, 2,_M, 2, 2, 2, 1, 0, 0, 4, 5, 0, 1, 2}, /* J */ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, o, o, 0,_M, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0}, /* K */ { 1, 0, 5, 0, 0, 5, 2, 0, 2, 0, 5, 3, 0, 1,_M, 1, 1, 3, 0, 0, 0, 2, 3, 0, 4, 0}, /* L */ { 2, 3, 6, 4, 3, 2, 4, 2, 2, 0, 3, 6, 4, 3,_M, 3, 2, 3, 3, 1, 0, 2, 2, 0, 1, 2}, /* M */ { 1, 2, 5, 3, 2, 0, 3, 2, 2, 0, 0, 4, 6, 2, M, 2, 1, 0, 2, 1, 0, 2, 4, 0, 2, l}, /* N */ { 0, 2, 4, 2, 1, 4, 0, 2, 2, 0, 1, 3, 2, 2,_M, 1, 1, 0, 1, 0, 0, 2, 4, 0, 2, 1}, /* O */ {_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M, 0,_M,_M,_M,_ _M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M} , /* P */ { 1, 1, 3, 1, 1, 5, 1, 0, 2, 0, 1, 3, 2, 1,_M, 6, O, 0, 1, 0, 0, 1, 6, 0, 5, 0}, /* Q */ { 0, 1, 5, 2, 2, 5, 1, 3, 2, 0, 1, 2, 1, 1,_M, O, 4, 1, 1, 1, 0, 2, 5, 0, 4, 3}, /* R */ { 2, 0, 4, 1, 1, 4, 3, 2, 2, 0, 3, 3, 0, 0,_M, 0, 1, 6, 0, 1, 0, 2, 2, 0, 4, 0}, /* S */ { 1, 0, 0, 0, 0, 3, 1, 1, 1, 0, 0, 3, 2, 1,_M, 1, 1, 0, 2, 1, 0, 1, 2, 0, 3, 0}, /* ? * i { 1, 0, 2, 0, 0, 3, 0, 1, 0, 0, 0, 1, 1, 0,_M, 0, 1, 1, 1, 3, 0, 0, 5, 0, 3, 0}, /* U */ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, o, o, o, o, o, o, o, 0,_M, 0, 0, o, o, o, o, o, o, o, o, o}, /* V */ { 0, 2, 2, 2, 2, 1, 1, 2, 4, 0, 2, 2, 2, 2,_M, 1, 2, 2, 1, 0, 0, 4, 6, 0, 2, 2}, /* W */ { 6, 5, 8, 7, 7, 0, 7, 3, 5, 0, 3, 2, 4, 4 , _M , 6 , 5 , 2, 2, 5, 0, 6,17, 0, 0, 6}, /* X */ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, o, 0,_M, 0, 0, o, o, o, o, o, o, o, o, o}, /* y * / { 3, 3, 0, 4, 4, 7, 5, 0, 1, 0, 4, 1, 2, 2, M, 5, 4, 4, 3, 3, 0, 2, 0, 0,10, 4}, /* Z */ { 0, 1, 5, 2, 3, 5, 0, 2, 2, 0, 0, 2, 1, 1,_M, 0, 3, 0, 0, 0, 0, 2, 6, 0, 4, 4} }; /* */ #include <stdio.h> #include <ctype.h> #define MAXJMP 16 /* max jumps in a diag */ #define MAXGAP 24 /* don't continué to penalize gaps larger than this */ #define JMPS 1024 /* max jmps in an path */ #define MX 4 /* save if there ' s at least MX 1 bases since last jmp */ #define DMAT 3 /* valué of atching bases */ #define DMIS 0 /* penalty for mismatched bases */ #define DINSO 8 /* penalty for a gap */ #define DINS1 1 /* penalty per base */ #define PINSO 8 /* penalty for a gap */ #define PINS1 4 /* penalty per residue */ struct jmp { short n [MAXJMP] ; /* size of jmp (neg for dely) */ unsigned short x [MAXJMP] ; /* base no. of jmp in seq x */ }; /* limits seq to 2A16 1 */ struct diag { int score; /* score at last jmp */ long offset; /* offset of prev block */ short ijmp; /* current jmp index struct jmp DP; /* list of jmps */ }; struct path { int spc; /* number of leading spaces */ short n[JMPS]; /* size of jmp (gap) */ int x[JMPS] ; /* loe of jmp (last elem before gap) */ }; char *ofile; /* output file ñame */ char *namex [2] /* seq ñames: getseqsO */ char *prog; /* prog ñame for err msgs */ char *seqx[2] ; /* seqs : getseqsO */ int dmax; /* best diag: nw ( ) */ int dmaxO ; /* final diag */ int dna; /* set if dna: main() */ int endgaps; /* set if penalizing end gaps */ int gapx, gar /* total gaps in seqs */ int lenO, lenl; /* seq lens */ int ngapx, ngapy; /* total size of gaps */ int smax; /* max score: nw ( ) */ int *xbm; /* bitmap for matching */ long offset ; /* current offset in jmp file */ struct diag *dx; /* holds diagonals */ struct path pp [2] ; /* holds path for seqs */ char *calloc () , *p char *getseq () , *c /* Needleman-Wunsch alignment program * usage : progs filel file2 * where filel and file2 are two dna or two protein sequences . * The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity * Any Unes beginning with ';', '>' or '<' are ignored * Max file length is 65535 (limited by unsigned short x in the jmp struct) * A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA * Output is in the file "align. out" * The program may créate a tmp file in /tmp to hold info about traceback. * Original versión developed under BSD 4.3 on a vax 8650 */ #include "nw.h" #include "day.h" static _dbval[26] = { 1, 14, 2, 13, 0,0, 4, 11, 0,0, 12, 0,3, 15, 0,0, 0,5, 6, 8, 8, 7, 9,0 ,10,0 }; static _pbval [26] = { 1, 2| (1<<('D' 'A' ) ) | (1<< ( 'N* 'A')), 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, OxFFFFFFF, 1<<10, 1<<11, 1<<12, 1«13, 1<<14, 1<<15, 1<<16, 1<<17, 1<<18, 1<<19, 1<<20, 1<<21, 1<<22, 1<<23, 1<<24, 1<<25 | (1<< ( 'E' ' A ' ) ) | (1<< ( ' Q ' 'A')) } ; main(ac, av) main int ac ; char *av [ ] ,- { prog = av [0] ; if (ac != 3) { fprintf (stderr, "usage : %s filel file2\n", prog) ; fprintf (stderr, "where filel and file2 are two dna or two protein sequences . \n" ) ; fprintf (stderr, "The sequences can be in upper or lower case\n"); fprintf (stderr, "Any Unes beginning with ';' or '<' are ignored\n"); fprintf (stderr, "Output is in the file \ " align. out\"\n") ; exit (1) ; } namex[0] = av[l]; namex [1] = av [2] ; seqx[0] = getseq (namex [0] , &len0) ; seqx[l] = getseq (namex [1] , &lenl) ; xbm = (dna)? dbval : pbval ; endgaps = 0; /* 1 to penalize endgaps */ ofile = "align. out"; /* output file */ nw ( ) ; /* fill in the matrix, get the possible jmps */ readjmps(); /* get the actual jmps */ printO; /* print stats, alignment */ cleanup(O); /* unlink any tmp files */ /* do the alignment, return best score: main() * dna: valúes in Fitch and Smith, PNAS, 80, 1382 1386, 1983 * pro: PAM 250 valúes * When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer * a new gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx * to a gap in seq y. */ nw ( ) nw { char *px, *py; /* seqs and ptrs */ int *ndely, *dely; /* keep track of dely */ int ndelx, delx; /* keep track of delx */ int *tmp; /* for swapping rowO , rowl */ int mis; /* score for each type */ int insO, insl; /* insertion penalties */ register id; /* diagonal index */ register ij ; /* jmp index */ register *col0, *coll; /* score for curr, last row */ register xx, yy; /* index into seqs */ dx = (struct diag *) g_calloc ( " to get diags", lenO+lenl+1, sizeof (struct diag)); ndely = (int * ) g_calloc ( " to get ndely" , lenl+1, sizeof (int) ) ; dely = (int * ) g_calloc ( "to get dely" , lenl+1, sizeof (int) ) ; colO = (int *) g_calloc ("to get colO", lenl+1, sizeof (int) ) ; coll = (int *)g_calloc ("to get coll", lenl+1, sizeof (int) ) ; insO = (dna)? DINSO : PINSO; insl = (dna)? DINS1 : PINS1; smax = 10000; if (endgaps) { for (colO [0] = dely[0] = insO, yy = 1; yy <= lenl; yy++) { colO [yy] = dely [yy] = colO [yy 1] insl; ndely [yy] = yy; } col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 */ } else for (yy = 1; yy <= lenl; yy++) dely [yy] = insO; /* fill in match matrix */ for (px = seqx[0] , xx = 1; xx <= lenO; px++, xx++) { /* initialize first entry in col */ if (endgaps) { if (xx == 1) coll [0] = delx = (insO+insl) ; else coll[0] = delx = colO [0] insl; ndelx = xx; } else { coll [0] = 0; delx = insO; ndelx = 0; } ... nw for (py = seqx[l], yy = 1 ; yy <= lenl; py++, yy++) { mis = colO [yy 1] ; if (dna) mis += (xbm[*px 'A1 ] &xbm [*py 'A'])? DMAT : DMIS; else mis += _day[*px 'A'] [*py 'A']; /* update penalty for del in x seq; * favor new del over ongong del * ignore MAXGAP if weighting endgaps */ if (endgaps || ndely [yy] < MAXGAP) { if (colO [yy] insO >= dely [yy] ) { dely[yy] = colO [yy] (insO+insl) ; ndely [yy] = 1 ; } else { dely[yy] = insl; ndely [yy] ++; } } else { if (colO [yy] (insO+insl) >= dely [yy] ) { dely [yy] colO [yy] (insO+insl) ndely [yy] = 1 ; } else ndely [yy] ++; } /* update penalty for del in y seq; * favor new del over ongong del */ if (endgaps | | ndelx < MAXGAP) { if (coll [yy 1] insO >= delx) { delx = coll [yy 1] (insO+insl) ; ndelx = 1 ,- } else { delx = insl; ndelx++; } } else { if (coll [yy 1] (insO+insl) >= delx) { delx = coll [yy 1] (insO+insl); ndelx = 1; } else ndelx++; } /* pick the máximum score; we ' re favoring * mis over any del and delx over dely */ ... nw id = xx yy + lenl 1; if (mis >= delx && mis >= dely [yy] ) coll [yy] = mis; else if (delx >= dely[yy] ) { coll [yy] = delx; ij = dx[id] .ijmp; if (dx[id] . jp.n[0] && ( ! dna | | (ndelx >= MAXJMP && xx > dx[id] . jp.x [i j ] +MX) | | mis > dx[id] .score+DINSO) ) { dx [id] . ijmp++; if (++ij >= MAXJMP) { writejmps (id) ; ij = dx[id] .ijmp = 0; dx[id] .offset = offset; offset += sizeof (struct jmp) + sizeof (offset) ; } } dx[id] . jp.n[ij] = ndelx; dx[id] . jp.xfij] = xx; dx[id] .score = delx; } else { coll [yy] = delyfyy] ; ij = dx[id] .ijmp; if (dx[id] . jp.n[0] && (!dna | | (ndelytyy] >= MAXJMP && xx > dx[id] . jp.x [ij ] +MX) | | mis > dx[id] .score+DINSO) ) { dx [id] . ijmp++; if (++ij >= MAXJMP) { writejmps (id) ; ij = dx[id] .ijmp = 0; dx[id] .offset = offset; offset += sizeof (struct jmp) + sizeof (offset) ; } } dx[id] . jp.n[ij] = ndely[yy] ; dx [id] . jp.x [ij ] = xx; dx[id] .score = delytyy] ; } if (xx == lenO && yy < lenl) { /* last col */ if (endgaps) coll [yy] = insO+insl* (lenl yy) ; if (coll [yy] > smax) { smax = coll [yy] ; d ax = id; } } if (endgaps && xx < lenO) coll [yy 1] = insO+insl* (lenO xx) ,- if (coll [yy 1] > smax) { smax = coll [yy 1] ; dmax = id; } tmp = colO; colO = coll; coll = tmp; } (void) free((char *)ndely); (void) free((char *)dely) (void) free((char *)col0) (void) free((char *)coll) * print ( only routine visible outside this module * static: * getmat () trace back best path, count matches: print () * pr_align() print alignment of described in array p[ ] : print () * dumpblockO dump a block of Unes with numbers, stars : pr_align() * nums() put out a number line: dumpblockO * putlineO put out a line (ñame, [num], seq, [num]) : dumpblockO * stars () put a line of stars: dumpblockO * stripname O strip any path and prefix from a seqname */ #include "nw.h" #define SPC 3 #define P_LINE 256 /* máximum output line */ #define P_SPC 3 /* space between ñame or num and seq */ extern _day[26] [26]; int olen; /* set output line length */ FILE *fx; /* output file */ print () print { int lx, ly, firstgap, lastgap; /* overlap */ if ((fx = fopen(ofile, "w")) == 0) { fprintf (stderr, " %s : can't write %s\n" , prog, ofile) ; cleanup (1) ; } fprintf (fx, "<first sequence: %s (length = %d) \n" , namex [0] , lenO) ; fprintf (fx, "<second sequence: %s (length = %d) \n" , namex [1] , lenl) ; olen = 60 , lx = lenO ly = lenl. firstgap = lastgap = 0; if (dmax < lenl 1) { /* leading gap in x */ pp[0] . spc = firstgap = lenl dmax 1; ly = pp [0] .spc; } else if (dmax > lenl 1) { /* leading gap in y */ PPtl] • spc = firstgap = dmax (lenl 1) ; lx = pp [1] .spc; } if (dmaxO < lenO 1) { /* trailing gap in x */ lastgap = lenO dmaxO 1; lx = lastgap; } else if (dmaxO > lenO 1) { /* trailing gap in y */ lastgap = dmaxO ( lenO 1 ) ; ly = lastgap ; } getmat (lx, ly, firstgap, lastgap) ,- pr_align ( ) ; } /* * trace back the best path, count matches */ static getmat (lx, ly, firstgap, lastgap) getmat int lx, ly; /* "core" (minus endgaps) */ int firstgap, lastgap; /* leading trailing overlap */ { int nm, iO, il, sizO, sizl; char outx [32] ; double pct; register nO , ni; register char *p0, *pl; /* get total matches, score */ iO = il = sizO = sizl = 0; pO = seqx[0] + pp[l] .spc; pl = seqx[l] + pp[0] . spc ; nO = pp [1] . spc + 1 ; ni = pp [0] . spc + 1 ; nm = O ; while ( *pO && *pl ) { if (sizO) { pl + +; nl + +; S i Z O ; } else if (sizl) { pO + +; nO + + ; sizl ; } else { if (xbm[*pO 'A'] &xbm[*pl 'A'] nm++; if (nO + + == pp[0] .x[iO] ) s i z O = pp [ O ] . n [ i O + + ] ; if (nl + + == pp[l] -x[il] ) sizl = pp[l] .n[il + + ] ; pO + +; pl + +; } } /* pct homology: * if penalizing endgaps, base is the shorter seq * else, knock off overhangs and take shorter core */ if (endgaps) lx = (lenO < lenl) ? lenO : lenl; else Ix = (lx < ly) ? lx : ly; pct = 100.* (double) nm/ (double) lx; fprintf (fx, "\n") ; fprintf (fx, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarity\n" , nm, (nm == 1)? "" : "es", lx, pct); fprintf (fx, "<gaps in first sequence: %d" , gapx); ...getmat if (gapx) { (void) sprintf (outx, " (%d %s%s)", ngapx, (dna)? "base" : "residue" , (ngapx == 1 ) ? " " : " s " ) ; fprintf (fx, "%s", outx); fprintf (fx, " , gaps in second sequence: %d" , gapy); if (gapy) { (void) sprintf (outx, " (%d %s%s)", ngapy, (dna)? "base" : "residue" , (ngapy == 1 ) ? " " : " s " ) ; fprintf (fx, "%s", outx); } if (dna) fprintf (fx, "\n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, gap penalty = %d + %d per base) \n" , smax, DMAT, DMIS, DINSO, DINS1) ; else fprintf (fx, "\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d per residue) \n", smax, PINSO, PINS1) ; if (endgaps) fprintf (fx, "<endgaps penalized. left endgap : %d %s%s, right endgap: %d %s%s\n", firstgap, (dna)? "base" : "residue", (firstgap == 1)? "" : "s", lastgap, (dna)? "base" : "residue", (lastgap == 1 ) ? " " : " s " ) ; else fprintf (fx, "<endgaps not penalized\n" ) ; } static nm; /* matches in core for checking */ static lmax; /* lengths of stripped file ñames */ static ij [2] ; /* jmp index for a path */ static nc [2] ; /* number at start of current line */ static ni [2] ; /* current elem number for gapping */ static siz [2] ; static char *ps[2]; /* ptr to current element */ static char *po [2 ] ; /* ptr to next output char slot * / static char out [2 ] [P_LINE] ; / * output line */ static char star [P_LINE] ; /* set by stars ( ) * / /* * print alignment of described in struct path pp [ ] */ static pr_align ( ) pr_align { int nn; /* char count */ int more; register i; for (i = 0, lmax = 0; i < 2; i++) { nn = stripname (namex [i] ) ; if (nn > lmax) lmax = nn; nc [i] = 1 ; ni [i] = 1; siz [i] = ij [i] = 0; ps [i] = seqx [i] ; po [i] = out [i] ; } for (nn = nm = 0, more = 1; more; ) { ...pr_align for (i = more = 0; i < 2; i++) { /* * do we have more of this sequence? */ if (!*ps[i]) continué; more++; if (pp[i] .spc) { /* leading space */ *po[i]++ = • A- pp[i] .spc } else if (siz [i]) { /* in a gap */ *po [i] ++ = siz [i] else { we ' re putting seq element */ *p? [i] = *ps [i] ; if (islower (*ps [i] ) ) *ps[i] = toupper (*ps [i] ) ; po[i]++; ps [i] ++; /* * are we at next gap for this seq? */ if (ni ti] == pp[i] .x[ij [i]]) { /* * we need to merge all gaps * at this location */ siz[i] = pp [i] .n[ij [i] + + ] ; while (ni [i] == pp [i] .x [ij [i] ] ) siz[i] += pp [i] .n[ij [i] + + ] ; } ni [i] ++; } } if (++nn == olen | | ¡more && nn) { dumpblock () ; for (i = 0; i < 2; i++) po [i] = out [i] ; nn = 0 ; } } } /* * dump a block of Unes, including numbers, stars pr_align ( ) */ static dumpblock ( ) dumpblock { register i; for (i = 0; i < 2; i++) *po[i] = Ao? ... dumpblock (void) putc(An', fx) ; for (i = 0; i < 2; i++) { if (*out[i] && (*out[i] != ' ' | | *(po[i]) I - I ) ) { if (i == 0) nums ( i ) ; if (Í == 0 SS *out [1] ) stars () ; put line (i) ; if (i == 0 && *out [1] ) fprintf (fx, star) ; if (i == 1) nums ( i) ; I- * put out a number line: dumpblockO */ static nums (ix) nums int ix; /* index in out [ ] holding seq line */ char nline [P_LINE] ; register i, j ; register char *pn, *px, *py; or (pn = nline, i = 0; i < lmax+P_SPC; i++, pn++) *pn = ' ' ; for (i = nc [ix] , py = out [ix] ; *py; py++, pn++) { if (*py == " ' | | *py == ' ') *pn = ' ' ,- else { if (i%10 == 0 | | (i == 1 && nc[ix] != 1) j = ( i < 0 ) ? i : i ; for (px = pn; j; j /= 10, px ) *px = j%10 + ' 0' ; if (i < 0) rpx else * "rp>nn = 1 + +; } *pn = AC-nc [ix] = i ; for (pn = nline; *pn; pn++) (void) putc(*pn, fx) ; (void) putc('\n', fx) ; /* * put out a line (ñame , [num] , seq, [num] ) : dumpblock O * / static putline (ix) putline int ix; { Table 1 (cont') ...putline int i ; register char *px; for (px = namex [ix] , i = 0; *px && *px != ' : ' ; px++, i++) (void) putc(*px, fx) ; for (; i < lmax+P_SPC; i++) (void) putc ( ' ' , fx) ; /* these count from 1: * ni [ ] is current element (from 1) * nc [ ] is number at start of current line */ for (px = out [ix] ; *px; px++) (void) putc (*px&0x7F, fx) ; (void) putc('\n', fx) ; } /* * put a line of stars (seqs always in out [0] , out [1] ) : dumpblock ( ) */ static stars () stars { int i ; register char *p0, *pl, ex, *px; if (!*out[0] | | (*out[0] == ' ' S *(po[0] ) == ' ') !*out[l] | | (*out[l] == • ' && *(po[l]) == ' ')) return; px = star; for (i = lmax+P_SPC; i; i ) *px++ = ' ' ; for (pO = out[0], pl = out [1] ; *p0 && *pl; p0++, pl++) { if (isalpha (*p0) && isalpha (*pl) ) { if (xbm[*p0 *A*]&xbm[*pl 'A']) { ex = ' * ' ,- nm++ ; } else if (!dna && _day[*pO 'A'] [*pl 'A'] > ex else ex = else ex *px++ = CX; } *px++ = n A *px = ' \0 ' ; /" * strip path or prefix from pn, return len: pr_align(' */ static stripname (pn) stripname char *pn; /* file ame (may be path) */ { register char *px, *py; py = 0; for (px = pn; *px; px++) if (*px == '/') py = px + 1; if (py) (void) strcpy(pn, py) ; return (strlen (pn) ) ; Ar* * cleanupO cleanup any tmp file * getseq O read in seq, set dna, len, axlen * g_calloc () calloc () with error checkin * readjmpsO get the good jmps, from tmp file if necessary * writejmpsO write a filled array of jmps to a tmp file: nw () A #include "nw.h" #include <sys/file.h> char *jname = "/tmp/homgXXXXXX" ; /* tmp file for jmps */ FILE *fj ; int cleanupO; /* cleanup tmp file */ long lseek ( ) ; /* * remove any tmp file if we blow */ cleanup (i) cleanup int i ; { if (fj) (void) unlink (jname) ; exit (i) ; } /* * read, return ptr to seq, set dna, len, maxlen * skip Unes starting with ';', '<', or '>' * seq in upper or lower case */ char * getseq(file, len) getseq char *file; /* file ñame */ int *len; /* seq len */ { char line [1024], *pseq; register char *px, *py; int natgc, tlen; FILE *fp; if ( (fp = fopen(file, "r") ) == 0) { fprintf (stderr , "%s : can't read %s\n" , prog, file) ; exit (1) ; } tlen = natgc = 0; while (fgetsdine, 1024, fp) ) { if Aliñe == ';' | | *line == •<* | | *line == '>') continué; for (px = line; *px != An1; px++) if (isupper (*px) | | islower (*px) ) tlen++; } if ( (pseq = malloc ( (unsigned) (tlen+6) ) ) == 0) { fprintf (stderr , "%s : malloc () failed to get %d bytes for %s\n" , prog, tlen+6, file); exit (1) ; } pseq[0] = pseq[l] = pseq [2] = pseq [3] = ' \0 ' ; ...getseq py = pseq + 4 ; *len = tlen; rewind (fp) ; while (fgetsdine, 1024, fp) ) { if Aliñe == ';' | | *line == '<' || *line = = ' >' ) continué ; for (px = line; *px != '\n'; px++) { if (isupper (*px) ) *py++ = *px; else if (islower (*px) ) *PY++ = toupper (*px) ; if ( index ("ATGCU",* (py 1))) natgc++ ; } } *py++ = A?' ; *py = *\0> ; (void) fclose(fp); dna = natge > (tlen/3) ; return (pseq+4) ; } char * g_calloc (msg, nx, sz) g calloc char *msg; /* program, calling routine */ int nx, sz; /* number and size of elements */ char *px, *calloc() ; if ( (px = calloc ( (unsigned) nx, (unsigned) sz) ) == 0) { if (*msg) { fprintf (stderr, "%s: g_calloc () failed %s (n=%d, sz=%d)\n", prog, msg, nx, sz) ; exit (1) ; } } return (px) ; } /* * get final jmps from dx [ ] or tmp file, set pp [ ] , reset dmax: main () */ readjmps () readjmps { int fd = 1; int siz, iO, il; register i, j, xx; if (fj) { (void) fclose(fj); if ( (fd = open(jname, 0_RDONLY, 0)) < 0) { fprintf (stderr, "%s: can't open ( ) %s\n" , prog, jname) ; cleanup (1) ; } } for (i = iO = il = 0, dmaxO = dmax, xx = lenO; ; i++) { while (1) { for ( j = dx [dmax] . ij mp ; j >= 0 && dx [dmax] . j p . x [j ] >= xx; j ) ... readjmps if (j < 0 && dx [dmax] .offset && fj ) { (void) lseek(fd, dx [dmax] .offset , 0) ; (void) read(fd, (char *) &dx [dmax] . jp, sizeof (struct jmp)); (void) read(fd, (char * ) &dx [dmax] . offset , sizeof (dx [dmax] . offset) ) ; dx [dmax] .ijmp = MAXJMP 1; } else break; } íf (i >= JMPS) { fprintf (stderr, "%s: too many gaps in alignment\n" , prog); cleanup (1) ; } íf (j >= 0) { siz = dx [dmax] . jp.n [j ] ; xx = dx[dmax] . jp.x[j] ; dmax + = siz; if (siz < 0) { /* gap in second seq */ pp [1] .n[il] = siz; xx + = siz; /* id = xx yy + lenl 1 */ pp[l] .x[il] = xx dmax + lenl 1; gapy++; ngapy = siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = ( siz < MAXGAP | | endgaps) ? siz : MAXGAP; i 1++ ; } else if (siz > 0) { /* gap in first seq */ pp [0] . n [iO] = siz; p [ 0 ] . x [ i 0 ] = x ; gapx++; ngapx += siz; /* ignore MAXGAP when doing endgaps */ siz = (siz < MAXGAP | | endgaps) ? siz : MAXGAP; Í0++; } } else break; } /* reverse the order of jmps A for (j = 0, iO ; j < iO; j++, iO ) { i = pp[0] .n[j] ; pp[0] .n[j] = pp[0] .n[i0] ; pp[0] .n[i0] = i; i = pp[0] .x[j] ; pp[0] .x[j] = pp[0] .x[i0] ; pp[0] .x[i0] = i; } for (j = 0, il ; j < il; j++, il ) { i = pp[l] .n[j] ; pp[l] .n[j] = pp[l] .n[il] ; pp [ 1 ] . n [ i 1 ] = i ; i = pp[l] .x[j] ; pp[l] .x[j] = pp[l] .x[il] ; pp [ 1 ] . x [ i 1 ] = i ; } if (fd >= 0) (void) cióse (fd); if (fj) { (void) uníink (jname) ; fj = 0; offset = 0; } } /* * write a filled jmp struct offset of the prev one (if any) : nw ( ) */ writejmps (ix) writejmps int ix; { char *mktemp () ; if (!fj) { if (mktemp (jname) < 0) { fprintf (stderr, "%s: can ' t mktemp 0 %s\n" , prog, jname) ; cleanup (1) ,- } if ((fj = fopen(jname, "w")) == 0) { fprintf (stderr, "%s: can't write %s\n" , prog, j ñame) exit (1) } (void) fwrite ( (char *) &dx [ix] . jp, sizeof (struct jmp) , 1, fj) ; (void) fwrite ( (char *) &dx [ix] . offset , sizeof (dx [ix] .offset) , 1, fj ) ; } Tabla 2 PR087299 XXXXXXXXXXXXXXX (longitud=15 amino ácidos) Proteína de XXXXXYYYYYYY (longitud=12 comparación amino ácidos) % de identidad de secuencia de aminoácidos= (el número de residuos aminoácidos de idéntica correspondencia entre las dos secuencias polipéptido como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de residuos aminoácido del polipéptido PR087299)= 5 dividido por 15=33.3% Tabla 3 PR087299 XXXXXXXXXX (longitud=10 amino ácidos) Proteina de XXXXXYYYYYYZZYZ (longitud=15 comparación amino ácidos) de identidad de secuencia de aminoácidos= (el número de residuos aminoácidos de idéntica correspondencia entre las dos secuencias polipéptido como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de residuos aminoácidos del polipéptido PR087299)= 5 dividido por 10=50% Tabla 4 PR087299-DNA NNNNNNNNNNNNNN (longitud=14 nucleótidos) DNA de NNNNNNLLLLLLLLLL (longitud=16 comparación nucleótidos) % de identidad de secuencia de ácidos nucleicos= (el número de nucleotidos de idéntica correspondencia entre las dos secuencias de ácido nucleico como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos PR087299-DNA)=6 dividido por 14=42.9% Tabla 5 PR087299-DNA NNNNNNNNNNNN (longitud=12 nucleótidos) DNA de NNNNLLLW (longitud=9 comparación nucleótidos] de identidad de secuencia de ácidos nucleicos= (el número de nucleotidos de idéntica correspondencia entre las dos secuencias de ácido nucleico como se determina por ALIGN-2) dividido por (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos PR087299-DNA) =4 dividido por 12=33.3% II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS DE LA INVENCIÓN A. Polipéptidos PR087299 de longitud íntegra La presente invención proporciona polipéptidos que codifican secuencias de nucleótidos recientemente identificadas y aisladas referidas a en la presente solicitud como polipéptidos PR087299. En particular, cDNAs que codifican diversos polipéptidos PR087299 se han identificado y aislado como se describe con mayor detalle en los siguientes ejemplos. Las secuencias de nucleótidos actuales de esos clones pueden fácilmente determinarse al secuenciar el clon depositado utilizando métodos rutinarios en la especialidad. La secuencia de aminoácidos pronosticada puede determinarse a partir de la secuencia de nucleótidos empleando destreza rutinaria. Para los polipéptidos PR087299 y que codifican ácidos nucleicos aquí descritos, los solicitantes han identificado lo que se considera es el marco de lectura mejor identificable con la información de secuencia disponible en el momento. B. VARIANTES POLIPÉPTIDO PR087299 Además de los polipéptidos PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra aquí descritos, se contempla que variantes PR087299 pueden prepararse. Variantes PR087299 pueden prepararse al introducir cambios de nucleótidos apropiados en PR087299, y/o por síntesis de polipéptido PR087299 deseado. Aquellos con destreza en la técnica apreciarán que cambios de aminoácidos pueden alterar procesos post-traducción de PR087299, tales como cambiar el número o posición de sitios de glicosilación o alterar las características de anclaje de membrana. Variaciones en el PR087299 de secuencia de longitud íntegra nativa o en diversos dominios del PR087299 aquí descritos, pueden realizarse por ejemplo utilizando cualquiera de las técnicas y guías para mutaciones conservadoras y no conservadoras establecidas por ejemplo en la patente de los E.U.A. Número 5,364,934. Las variaciones pueden ser una sustitución, eliminación o inserción de uno o más codones que codifican el PR087299 que resulta en un cambio en la secuencia de aminoácidos del PR087299 en comparación con la secuencia nativa PR087299. Opcionalmente, la variación es por sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios de PR087299. Guía para determinar que residuo aminoácido puede insertarse sustituirse o eliminarse sin afectar adversamente la actividad deseada, puede encontrarse al comparar la secuencia de PR087299 con la de moléculas de proteína conocidas homologas y reducir el número de cambios de secuencia de aminoácidos realizados en regiones de alta homología. Sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades químicas y/o estructurales similares, tales como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir reemplazo de aminoácidos conservadores. Inserción o eliminaciones pueden opcionalmente estar en el rango de aproximadamente uno a cinco aminoácidos. La variación permitida puede determinarse al hacer sistemáticamente inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probar las variantes resultantes por actividad exhibida por la secuencia nativa madura o de longitud íntegra. Fragmentos polipéptido PR087299 se proporcionan aquí . Estos fragmentos pueden truncarse en el extremo N o extremo C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo cuando se comparan con una proteína nativa de longitud íntegra. Ciertos fragmentos carecen de residuos aminoácido que no son esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido PR087299. Fragmentos PR087299 pueden prepararse por cualquiera de una cantidad de técnicas convencionales. Fragmentos péptido deseados pueden ser químicamente sintetizados. Un enfoque alterno involucra generar fragmentos PR087299 por digestión enzimática, por ejemplo al tratar la proteína con una enzima que se conoce escinde proteínas en sitios definidos por residuos aminoácido particulares, o al digerir el DNA con enzimas de restricción convenientes y aislar el fragmento deseado. Todavía otra técnica conveniente involucra aislar y amplificar un fragmento de DNA que codifica un fragmento polipéptido deseado por reacción de cadena polimeraza (PCR=Polimerer chain reaction) . Oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento DNA, se emplean en los cebadores 5 ' y 3 ' en la PCR. De preferencia, fragmentos polipéptido PR087299 comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido PR087299 nativo aquí descrito.

En modalidades particulares, sustituciones conservadoras de interés se ilustran en la tabla 6 bajo el encabezado de sustituciones preferidas. Si estas sustituciones resultan en un cambio en actividad biológica, entonces más cambios sustanciales, denominados sustituciones ejemplares en la tabla 6, o como se describe más a continuación con referencia a las clases de aminoácidos, se introducen y los productos se supervisan. Tabla 6 Residuo Sustituciones Sustituciones original ejemplares preferidas Ala (A) val ; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys ; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg He (I) leu; val ; met ; ala; phe; norleucina leu Leu (L) norleucina; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu Modificaciones sustanciales en función o identidad inmunológica del polipéptido PR087299 se logran al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto al mantener a) la estructura principal del polipéptido en el área de sustitución, por ejemplo como una conformación de hoja o helicoidal, b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o c) en volumen de la cadena lateral . Residuos de origen natural se dividen en grupos con base en propiedades de cadena lateral comunes: 1) Hidrofóbicos : norleucina, met, ala, val, leu, ile; 2) Hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; 3)Acídicos: asp, glu; 4) Básicos: asn, gln, his, lys, arg; 5) Residuos que influencian la orientación de cadena: gly, pro; y 6) Aromáticos : trp, tyr, phe. Sustituciones no conservadoras involucrarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Estos residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios de sustitución conservadora o más preferiblemente en los sitios restantes (no conservados) . Las variaciones pueden realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótido (dirigida por sitio) , exploración de alanina y mutagénesis PCR. Mutagénesis dirigida en sitio [Cárter et al., Nucí. Acids Res., 13 :4331 (1986) ; Zoller et al., Nucí. Acids Res., 10:6487 (1987) ] , mutagénesis de cassette [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de selección de restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden realizarse en DNA clonado para producir el DNA variante PR087299. Análisis de exploración de aminoácidos también puede emplearse para identificar uno o más aminoácidos sobre una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos están aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Estos aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina típicamente es un aminoácido de exploración preferido entre este grupo debido a que elimina a la cadena lateral más allá del carbono-beta y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. La alanina también se prefiere típicamente debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente tanto en posiciones enterradas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co . , N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades adecuadas de variante, puede emplearse un aminoácido isotérico. C. Modificaciones de PR087299 Modificaciones covalentes de PR087299 se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente 8 incluye reaccionar residuos aminoácido dirigidos o diana de un polipéptido PR087299 con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales selectas o residuos N- o C-terminales del PR087299. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo para reticular o entre lazar PR087299 con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para utilizar en el método para purificar anticuerpos PR087299 y viceversa. Agentes de entrelazamiento comúnmente empleados incluyen por ejemplo 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehido, N-hidroxisuccinimida esteres, por ejemplo esteres con ácido 4-azidosalicilico, imidoesteres homobifuncionales, incluyendo disuccinimidil esteres tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1 , 8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil) ditio] propioimidato . Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos glutaminilo y asparaginilo a los residuos gluta ilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, hidroxilación de prolina y glicina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos cerilo o trionilo, metilación de grupos alfa amino de cadenas laterales lisina arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co . , San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilación de la amina N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal . Otro tipo de modificación covalente del péptido PR087299 incluido dentro del alcance de esta invención, comprende alterar el patrón de glicosilación activo del polipéptido. "Alterar el patrón de glicosilación nativo" se pretende para los propósitos presentes que significa eliminar uno o más porciones carbohidrato que se encuentran en la secuencia nativa PR087299 (ya sea al retirar el sitio de glicosilación subyacente o al eliminar la glicosilación por medio químicos y/o enzimáticos) y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa PR087299. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, que involucra un cambio en la naturaleza y proporciones de las diversas porciones carbohidrato presentes . Adición de sitios de glicosilación al polipéptido PR087299 puede lograrse al alterar la secuencia de aminoácidos. La alteración puede realizarse por ejemplo por la adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o trionina a la secuencia nativa PR087299 (para sitios de glicosilación O-enlazados) . La secuencia de aminoácidos PR087299 puede opcionalmente ser alterada a través de cambios al nivel de DNA, particularmente al montar el DNA que codifica el polipéptido PR087299 en bases preselectas de manera tal que se generan codones que traducirán en los aminoácidos deseados . Otro medio para incrementar el número de porciones carbohidrato en el polipéptido PR087299 es por acoplamiento químico o enzi ático de glicócidos al polipéptido. Estos métodos se describen en la técnica, por ejemplo en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit . Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981) . La remoción de porciones carbohidrato presentes en el polipéptido PR087299 puede lograrse química o enzimáticamente o por sustitución mutacional de codones que codifican los residuos aminoácido que sirven como dianas para glicosilación. Técnicas de desglicosilación química se conocen en la especialidad y describen por ejemplo por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys . , 259:52 (1987) and by Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981) . Escisión enzimática de porciones carbohidrato en polipéptidos puede lograrse por el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura et al., Meth. Enzymol . , 138:350 (1987). Otro tipo de modificación covalente de PR087299 comprende enlazar el polipéptido PR087299 a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilene glicol (PEG), polipropilene glicol, o polioxialquilenos, en la forma establecida en las patentes de los E.U.A. Números 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. El PR087299 de la presente invención también puede modificarse de manera tal que forme una molécula quimérica que comprende PR087299 fusionado a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos. En una modalidad, esta molécula quimérica que comprende una fusión de PR087299 con un polipéptido de etiqueta que proporciona un epítope al cual puede ligar selectivamente un anticuerpo anti -etiqueta. La etiqueta epítope generalmente se coloca en el extremo amino o carboxilo de PR087299. La presencia de estas formas etiquetadas con epítope de PR087299 puede detectarse utilizando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. También el proporcionar la etiqueta epítope permite al PR087299 ser fácilmente purificado por purificación de afinidad utilizando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que liga a la etiqueta epítope. Diversos polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en la técnica. Ejemplos incluyen poli-histidina (poly-his) o poli-histidina-glicina (etiquetas poly-his-gly) ; el polipéptido etiqueta flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell.

Biol., 8:2159-2165 (1988)]; la etiqueta c-myc los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4 , B7 y 9E10 de los mismos [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de glicoproteína D (gD) de virus herpes simplex [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Otros polipéptidos etiqueta incluyen el péptido flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido epítope KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido epítope de alfa tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; y la etiqueta de péptido de proteína 10 gen T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]. En una modalidad alterna, la molécula quimérica puede comprender una fusión del PR087299 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como una "inmunoadhesina"), esta fusión puede ser a la región Fe de una molécula IgG. Las fusiones IgG de preferencia incluyen la sustitución de una forma soluble (dominio tras membrana eliminado o inactivado) de un polipéptido PR087299 en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula Ig. En una modalidad particularmente preferida, la fusión de inmunoglobulina incluye las regiones bisagra, CH2 y CH3 , o la bisagra, CH1, CH2 y CH3 de una molécula IgGl . Para la producción de fusiones de inmunoglobulina ver también la patente de los E.U.A. Número 5,428,130 otorgada en junio 27, 1995. D. Preparación de PR087299 La descripción siguiente se refiere primordialmente a la producción de PR087299 al cultivar células transformadas o transfectadas con un vector que contiene ácido nucleico PR087299. Por supuesto se contempla que los métodos alternos, que son bien conocidos en la técnica pueden ser empleados para preparar PR087299. Por ejemplo, la secuencia PR087299 o sus porciones, puede producirse por síntesis de péptido directa utilizando técnicas de fase sólida (ver por ejemplo Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co . , San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc . , 85:2149-2154 (1963)). Síntesis de proteína in vi tro puede realizarse utilizando técnicas manuales o por automatización. Síntesis automatizada puede lograrse por ejemplo utilizando un aparato Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Diversas porciones de PR087299 pueden ser sintetizadas químicamente por separado y combinadas empleando métodos químicos o enzimáticos para producir PR087299 de longitud íntegra . 1. Aislamiento de DNA que codifica PR087299. DNA que codifica PR087299 puede obtenerse de una biblioteca cDNA preparada a partir de tejido que se considera posee el PR087299 mRNA y para expresarlo a un nivel detectable. De acuerdo con esto, PR087299 humano puede ser convenientemente obtenido de una biblioteca cDNA preparada de tejido humano, tal como se describe en los ejemplos. El gen que codifica PR087299 también puede obtenerse de una biblioteca genómica o por procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo síntesis de ácido nucleico automatizada) . Pueden supervisarse bibliotecas con sondas (tales como anticuerpos PR087299 u oligonucléotidos de al menos aproximadamente 20-80) diseñados para identificar en gen de interés en la proteína codificada por él . La supervisión de la biblioteca genómica o cDNA con la sonda selecta puede conducirse utilizando procedimientos estándar tal como se describe en Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alterno para aislar el gen que codifica PR087299 es utilizar metodología PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]. Los siguientes ejemplos describen técnicas para supervisar una biblioteca cDNA. Las secuencias oligonucleotido seleccionadas como sondas deberán ser de longitud suficiente y suficientemente no ambiguas que se minimicen falsos positivos. El oligonucleótido de preferencia se etiqueta de manera tal que puede ser detectado ante hibridación a DNA en la biblioteca que se supervisa. Métodos para etiquetado son bien conocidos en la técnica, e incluyen el uso de radio etiquetas como ATP etiquetado con 32P, biotinilación o etiquetado de enzima. Condiciones de hibridación, incluyendo moderada severidad y alta severidad se proporcionan en Sambrook et al . , supra . Secuencias identificadas en estos métodos de supervisión de bibliotecas pueden compararse y alinearse con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de secuencias privadas. Identidad de secuencia (ya sea a nivel aminoácido o nucleótido) dentro de regiones definidas de la molécula o a través de las secuencia de longitud integra pueden determinarse utilizando métodos conocidos en la especialidad y como se describe aquí . Ácido nucleico que tiene secuencias de codificación de proteína puede obtenerse al supervisar bibliotecas genómicas o cDNA selectas utilizando las secuencias de aminoácidos deducida aquí descrita por primera vez, y de ser necesario utilizando procedimientos de extensión de cebador convencionales como se describe en Sambrook et al., supra, para detectar precursores e intermediarios de procesamiento de mRNA que pueden no haber sido transcritos en forma inversa en cDNA. 2. Selección y transformación de células anfitrionas Células anfitrionas se transfectan o transforman con vectores de clonación o expresión aquí descritos para producción de PR087299 y cultivan en medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tales como medio, temperatura, pH y semejantes pueden seleccionarse por la persona con destreza en la especialidad sin indebida experimentación. En general, principios, protocolos y técnicas prácticas para llevar al máximo la productividad de cultivos celulares, pueden encontrarse en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., supra. Métodos de transfección de células eucarióticas y transformación de células procarióticas se conocen para la persona con destreza ordinaria, por ejemplo CaC?2, CaP0 , mediada por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula anfitriona empleada, la transformación se emplea utilizando técnicas estándar apropiadas a estas células. En el tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio como se describe en Sambrook et al., supra, o electroporación, generalmente se emplea para procariotas. Infección con Agrobacterium tumefaciens se emplea para transformación de ciertas células de plantas, como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para células de mamíferos sin estas paredes celulares, el método de precipitación de fosfato de calcio de Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) puede emplearse. Aspectos generales de transíecciones de sistemas anfitriones de células de mamífero se han descrito en la Patente de los E.U.A. No. 4,399,216. Transformaciones en levadura típicamente se llevan a cabo de acuerdo con el método de Van Solingen et al., J. Bact . , 130:946 (1977) and Hsiao et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, otros métodos para introducir DNA en células, tales como microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas o policationes, por ejemplo polibreno, poliornitina también pueden emplearse. Para diversas técnicas para transformar células de mamíferos ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Células anfitrionas convenientes para clonar o expresar el DNA en los vectores presentes incluyen procariota, levadura o células eucariotas superiores. Procariotas convenientes incluyen pero no están limitados a eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como E. coli . Diversas cepas de E. coli están disponibles al público, tales como la cepa MM294 de E. COli K12 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); la cepa de E. coli W3110 (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células anfitrionas procarióticas convenientes incluyen Enterobacteriaceae tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli , Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella , por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans , y Shigella , así como Bacilos tales como B . subtilis y B . licheniformis (por ejemplo, B . licheniformis 41P descritos en DD 266,710 publicada en abril 12 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces . Estos ejemplos son ilustrativos en vez de limitantes. La cepa W3110 es un anfitrión o anfitrión precursor particularmente preferido debido a que es una cepa anfitriona común para fermentaciones de productos de DNA recombinantes. De preferencia, la célula anfitriona secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas .

Por ejemplo, la cepa W3110 puede ser modificada para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas al anfitrión, con ejemplos de estos anfitriones que incluyen la cepa 1A2 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA; la cepa 9E4 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 ; la cepa 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55,244), que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; la cepa 37D6 de E. coli W3110, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 ( argF-lac) 169 degrP ompT rbs7 ilvG kanr; la cepa 40B4 de E. coli W3110, que es cepa 37D6 con una mutación de eliminación degP no resistente a canamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de los E.U.A. No. 4,946,783 otorgada el 7 de agosto de 1990. En forma alterna, métodos de clonación in vi tro, por ejemplo PCR u otras reacciones polimerasa de ácido nucleico son convenientes. Además de procariotas, microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levadura son anfitriones de expresión o clonación convenientes para vectores que codifican PR087299. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo anfitrión eucariótico inferior comúnmente empleado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 publicada el 2 de mayo de 1985) ; anfitriones Kluyveromyces (Patente de los E.U.A. No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154 (2) : 737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans , and K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicada el 31 de octubre 1990) ; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991) , y anfitriones Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys . Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly and Hynes, EMBO J. , 4:475-479 [1985]). Levaduras metilotrópicas aquí son convenientes e incluyen pero no están limitadas a levadura capaz de crecimiento en metanol seleccionada de los géneros que consisten de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras pueden encontrarse en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982) . Células anfitrionas convenientes para la expresión de PR087299 glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como células de plantas. Ejemplos de líneas celulares anfitrionas de mamíferos útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y COS. Ejemplos más específicos incluyen líneas CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol . , 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2 , HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) . La selección de la célula anfitriona apropiada se considera dentro de la destreza en la técnica. 3. Selección y Uso de un Vector Replicable El ácido nucleico (por ejemplo, cDNA o DNA genómico) que codifica PR087299 puede insertarse en vector replicable para clonación (amplificación del DNA) o para expresión. Diversos vectores están disponibles al público. El vector puede por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácidos nucleicos apropiada puede insertarse en el vector por una variedad de procedimientos. En general, DNA se inserta en uno o varios sitios de endonucleasa de restricción apropiadas utilizando técnicas conocidas en la especialidad. Componentes de vector generalmente incluyen pero no están limitados a uno o más de una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. La construcción de vectores convenientes que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándar que son conocidas por la persona con destreza en especialidad. El PR087299 puede producirse en forma recombinante no solo de manera directa sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterologo, que puede ser una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector o puede ser parte del DNA que codifica PR087299 que se inserta en el vector. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal procariótica seleccionada por ejemplo del grupo de fosfatasa alcalina, penicillinase, lpp, o líderes de enterotoxina termo-estable II. Para secreción de levadura, la secuencia de señal puede ser, por ejemplo, el líder invertasa de levadura, líder en factor alfa (incluyendo los líderes de factor alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces , este último se describe en la Patente de los E.U.A. No. 5,010,182), o un líder de fosfatasa acida, el líder de glucomilasa C. albicans) (EP 362,179 publicada el 4 de abril 1990), o la señal descrita en WO 90/13646 publicada el 15 de noviembre de 1990. En expresión de células de mamífero, secuencias de señal de mamífero pueden emplearse para dirigir secreción de la proteína, tales como secuencias de señal de polipéptidos secretados de iguales o especies relacionadas así como líderes secretorios virales. Tanto vectores de expresión como clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite al vector replicar en una o más células anfitrionas selectas. Estas secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levadura y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen de plásmido 2µ es adecuado para levadura y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. Vectores de expresión y clonación típicamente contienen un gen de selección también denominado un marcador seleccionable. Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli . Un ejemplo de marcadores seleccionables convenientes para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico que codifica PR087299, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula anfitriona apropiada cuando DHFR de tipo silvestre empleado es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección conveniente para utilizar en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la habilidad para desarrollar el triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. Vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor enlazado operativamente con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica PR087299-para dirigir síntesis de mRNA. Promotores reconocidos por una variedad de células anfitrionas potenciales son bien conocidos. Promotores adecuados para utilizar con anfitriones procarióticos incluyen los sistemas promotores beta-lactamasa y lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], y promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Promotores para utilizar en sistemas bacterianos también contienen una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) enlazado operativamente con el DNA que codifica PR087299.

Ejemplos de secuencias promotoras convenientes para utilizar con anfitriones de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg . , 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como enolasa, gliceraldehído-3 -fosfato dehidrogenasa, hexocinasa, piruvate decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato utasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otros promotores de levadura que son promotores inducibles tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento son las regiones promotoras para alcohol dehidrogenasa 2 , isocitocromo C, fosfatasa acida, enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehído-3 -fosfato dehidrogenasa, y enzimas responsables por utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores convenientes para utilizar en expresión de levadura se describen adicionalmente en EP 73,657. La transcripción de PR087299 de vectores en células anfitrionas de mamífero es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus polioma, virus de pustulación avícola (UK 2,211,504 publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus se sarcoma aviario, citomegalovirus, un retrovirus, virus de hepatitis-B y virus de simio 40 (SV40) , de promotores de mamíferos heterologos, por ejemplo, el promotor actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre que estos promotores sean compatibles con los sistemas de células anfitrionas. La transcripción de un DNA que codifica el PR087299 por eucariotas superiores, puede incrementarse al insertar una secuencia mej oradora en el vector. Mejoradores son elementos de acción cis de DNA, usualmente de 10 a 300 bp, aproximadamente que actúan en un promotor para incrementar su transcripción. Muchas secuencias mej oradoras ahora se conocen de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, alfa-feto proteína, e insulina) . Típicamente sin embargo, se utilizará un mejorador de un virus de células eucarióticas. Ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el lado posterior o tardío del origen de replicación (bp 100-270), el mejorador promotor temprano de citomegalovirus, el mejorador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y Mejoradores de adenovirus. El mejorador puede ser combinado en el vector en la posición 5 ' o 3 ' a la secuencia de codificación PR087299, pero de preferencia se ubica en el sitio 5' del promotor. Vectores de expresión empleados en células anfitrionas eucarióticas (células de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el mRNA. Estas secuencias están comúnmente disponibles de las regiones sin traducción 5 ' y ocasionalmente 3 ' , de DNAs eucarióticos o virales o cDNAs . Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritas como fragmentos de poliadenilación en la porción no traducida del mRNA que codifica PR087299. Todavía otros métodos, vectores y células anfitrionas adecuadas para adaptación a las síntesis de PR087229 en cultivo de células de vertebrado recombinantes se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117,058. 4. Detectar amplificación/expresión de genes La amplificación y/o expresión de genes puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo por transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de mRNA [Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201 5205 (1980) ] , transferencia en mancha (análisis DNA) o hibridación in si tu , utilizando una sonda apropiadamente etiquetada, con base en las secuencias que aquí se proporcionan. En forma alterna, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de DNA, dúplex de RNA, y dúplex híbridos de DNA-RNA o dúplex de DNA-proteína . Los anticuerpos a su vez pueden etiquetarse y el ensayo puede llevarse a cabo en donde el dúplex se liga a una superficie, de manera tal que ante la formación del dúplex en la superficie, la presencia de anticuerpo ligado al dúplex puede detectarse. Expresión de genes, en forma alterna puede medirse por métodos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo del cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto de gen. Anticuerpos útiles para tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos muestra ya puede ser monoclonal o policlonal y puede prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido PR087299 de secuencia nativa o contra un péptido sintético con base en las secuencias de DNA que aquí se proporcionan o contra secuencia exógena fusionada a PR087299 DNA y codificar un epítope de anticuerpo específico. 5. Purificación de polipéptido Formas de PR087299 pueden recuperarse de medio de cultivo o de Usados de células anfitrionas. Si el ligado a membrana puede liberarse de la membrana utilizando una solución detergente conveniente (e.g. Triton-X 100) o por escisión enzimática. Células empleadas en la expresión de PR087299 pueden romperse por diversos medios físicos o químicos, tales como ciclo de congelado-descongelado, sonicación, ruptura mecánica o agentes de lisis celular. Puede ser conveniente el purificar PR087299 de polipéptidos o proteínas de células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación conveniente: por fraccionación en una columna de intercambio de iones; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa ; cromatografía en sílice o una resina de intercambio de cationes tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración de gel utilizando por ejemplo Sephadex G-75; columnas de proteína A Sefarosa para retirar contaminantes tales como IgG; y columnas quelantes de metal para ligar formas etiquetadas de epítope de PR087299. Diversos métodos de purificación de proteínas pueden emplearse y estos métodos se conocen en la técnica y describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982) . La o las etapas de purificación selectas dependerán por ejemplo de la naturaleza del proceso de producción empleado y el PR087299 particular producido. E. Distribución de tejido La ubicación de tejidos que expresan PR087299 puede identificarse al determinar la expresión de mRNA en diversos tejidos humanos. La ubicación de estos genes proporciona información respecto a qué tejidos son más probables que se afecten por las actividades de estímulo e inhibición de los polipéptidos PR087299. La ubicación de un gen en un tejido específico también proporciona tejido muestra para los ensayos de bloqueo de actividad discutidos a continuación. Como se anotó anteriormente, la expresión de genes en diversos tejidos puede medirse por transferencia Southern convencional, transferencia Northern para cuantificar la transcripción de mRNA (Thomas, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:5201 5205 [1980]), transferencia punto (análisis de DNA), o hibridación in si tu, utilizando una sonda apropiadamente etiquetada con base en las secuencias que aquí se proporcionan. En forma alterna, pueden emplearse anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de DNA, dúplex de RNA y dúplex híbridos de DNA-RNA o dúplex de DNA-proteína . La expresión de genes en diversos tejidos, en forma alterna puede medirse por métodos inmunológicos, tales como tinción inmunohistoquímica de secciones de tejido y ensayo de cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto de gen. Anticuerpos útiles para tinción inmunohistoquímica y/o ensayo de fluidos de muestra ya puede ser monoclonal o policlonal, y puede prepararse en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contar una secuencia nativa de un polipéptido PR087299 o contra un péptido sintético con base en las secuencias de DNA que codifican el polipéptido PR087299 o contra una secuencia exógena fusionada a un DNA que codifica un polipéptido PR087299 y que codifica un epítope de anticuerpo específico. Técnicas generales para generar anticuerpos, y en especial protocolos para transferencia Northern e hibridación in si tu, se proporcionan a continuación. F. Estudios de enlace de anticuerpo La actividad de los polipéptidos PR087299 puede ser adicionalmente verificada por estudios de enlace de anticuerpo, en donde la habilidad de los anticuerpos anti-PR087299 para inhibir el efecto de los polipéptidos PR087299 respectivamente, en células de tejido, se prueba. Anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados, la preparación de los cuales se describirá a continuación. Estudios de enlace de anticuerpo pueden llevarse a cabo en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de enlace competitivos, ensayos de emparedado directo o indirecto y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987). Ensayos de enlace competitivos se basan en la capacidad de una norma etiquetada para competir con el analito de muestra para prueba para ligar con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de proteína diana en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de la norma que se liga a los anticuerpos. Para facilitar el determinar la cantidad de la norma que se liga, los anticuerpos de preferencia se insolubilizan antes o después de la competencia, de manera tal que la norma y analito que se ligan a los anticuerpos pueden separarse convenientemente de la norma y analito que quedan sin ligar. Ensayos de emparedado involucran el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de ligar a una porción inmunogénica diferente o epítope de la proteína a detectar. En un ensayo emparedado, el analito muestra de prueba se liga por un primer anticuerpo que se inmoviliza en un soporte sólido, y posteriormente un segundo anticuerpo liga al analito, formando de esta manera un complejo de tres partes insoluble. Ver por ejemplo la Patente de los E.U.A. Número 4,376,110. El segundo anticuerpo por sí mismo puede ser etiquetado por una porción detectable (ensayos de emparedado directo) o puede ser medido utilizando un anticuerpo de anti-inmunoglobulina que se etiqueta con un porción detectable (ensayo de emparedado indirecto) . Por ejemplo, un tipo de ensayo de emparedado es un ensayo ELISA, en cuyo caso la porción detectable en una enzima. Para inmunohistoquímica, la muestra de tejido puede ser fresca o congelada o puede ser incrustada en parafina y fija con un conservador tal como formalina, por ejemplo. G. Ensayos basados en células Ensayos basados en células y modelos de animales para enfermedades inmunorelacionadas, pueden emplearse para comprender adicionalmente la relación entre los genes y polipéptidos aquí identificados y el desarrollo y patogénesis de enfermedad inmunorelacionada . En un enfoque diferente, células de un tipo conocido involucrado en una enfermedad inmunorelacionada particular, se transectan con los cDNAs aquí descritos, y la capacidad de estos cDNAs para estimular o inhibir la función inmune, se analiza. Células convenientes pueden ser transfectadas con el gen deseado, y supervisadas para actividad de función inmune. Estas líneas celulares transectadas pueden entonces ser utilizadas para probar la capacidad de anticuerpos poli- o monoclonales o composiciones de anticuerpos para inhibir o estimular la función inmune, por ejemplo para modular la proliferación de células T o infiltración de células inflamatorias. Células transfectadas con las secuencias de codificación de los genes aquí identificados, además pueden emplearse para identificar candidatos de drogas para el tratamiento de enfermedades inmunorelacionadas . Además, cultivos primarios derivados de animales transgénicos (como se describe a continuación) pueden emplearse en los ensayos basados en células presentes, aunque se prefieren líneas celulares estables. Técnicas para derivar líneas celulares continuas de animales transgénicos son bien conocidas en la especialidad (ver, e.g., S all et al., Mol. Cell. Biol. 5: 642-648 [1985] ) . Un ensayo basado en células conveniente es la reacción de linfocitos mixta (MLR = Mixed Lymphocyte Reaction) . Current Protocols in Immunology, unit 3.12; edited by J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Margues, E M Shevach, W Strober, National Institutes of Health, Published by John Wiley & Sons, Inc. En este ensayo, la capacidad de un compuesto de prueba para estimular o inhibir la proliferación de células T activadas, se ensaya. Una suspensión de células T respondientes se cultiva con células estimuladoras halogeneicas y la proliferación de células T se mide por absorción de timidina tritiada. Este ensayo es una medida general de reactividad de células T. Ya que la mayoría de las células T responde a y produce IL-2 ante activación, diferencias en respuesta en este ensayo en parte reflejan diferencias en producción de IL-2 por las células respondientes. Los resultados de MLR pueden verificarse por ensayo de detección de linfocina (IL-2) estándar. Current Protocols in Immunology, anterior, 3.15, 6.3. Una respuesta de célula T proliferativa en un ensayo MLR puede deberse a propiedades mitogénicas directas de una molécula ensayada o a activación inducida por antígeno externo. La activación de célula T requiere una señal específica de antígeno mediada a través de un receptor de célula T (TCR) y una señal co-estimulatoria mediada a través de una segunda interacción de enlace de ligando, por ejemplo la interacción de enlace B7 (CD80, CD86)/CD28. Reticulado CD28 aumenta la secreción de linfocina por células T activadas. La activación de célula T tiene tanto controles negativos como positivos a través del enlace de ligandos que tienen un efecto negativo o positivo. CD28 y CTLA-4 son glicoproteínas relacionadas en la superfamilia Ig que liga a B7. El enlace CD28 con B7 tiene un efecto de coestímulo positivo de activación de células T; por el contrario, enlace CTLA-4 con B7 tiene un efecto de desactivación de célula T. Chambers, C. A. and Allison, J. P., Curr. Opin. I munol. (1997) 9:396. Schwartz, R. H., Cell (1992) 71:1065; Linsey, P. S. and Ledbetter, J. A., Annu. Rev. Immunol. (1993) 11:191; June, C. H. et al, Immunol . Today (1994) 15:321; Jenkins , M. K. , Immunity (1994) 1:405. En un ensayo de coestímulo, los polipéptidos PR087299 se ensayan para actividad inhibitoria o coestimulatoria de células T. Uso directo de un compuesto estimulante como en la invención, se ha validado en experimentos con 4-1BB glicoproteína, un miembro de la familia de receptor de factor e necrosis de tumor, que liga a un ligando (4- 1BBL) expresado en células T cebadas y señala la activación y crecimiento de células T. Alderson, M. E. et al., J. Immunol. (1994) 24:2219. El uso de un compuesto de estímulo de agonista también se ha validado experimentalmente . La activación de 4-1BB por tratamiento con un anticuerpo anti-4-lBB agonista mejora la erradicación de tumores. Hellstrom, I. and Hellstrom, K. E., Crit . Rev. Immunol . (1998) 18:1. Terapia de inmunoadyuvante para tratamiento de tumores, descrita con más detalle a continuación, es otro ejemplo del uso de compuestos estimulantes de la invención. En forma alterna, un efecto de mejora o estímulo inmune también puede lograrse por administración de un PR087299 que tiene propiedades para mejora de permeabilidad vascular. La permeabilidad vascular mejorada será benéfica a desordenes que pueden ser atenuados por infiltración local de células inmunes (por ejemplo, monocitos, eosinófilos, PMNs) e inflamación. Por otra parte, polipéptidos PR087299 así como otros compuestos de la invención, que son inhibidores directos de proliferación/activación de célula T, secreción de linfocina y/o permeabilidad vascular, pueden emplearse directamente para suprimir la inmunorespuesta . Estos compuestos son útiles para reducir el grado de inmunorespuesta y para tratar enfermedades inmunorelacionadas, caracterizado por una respuesta hiperactiva, súper óptima o autoinmune. Este uso de los compuestos de la invención se ha validado por los experimentos anteriormente descritos en donde enlace de CTLA-4 con receptor B7 desactiva células T. Los compuestos inhibitorios directos de la invención funcionan de manera análoga. El uso del compuesto que suprime la permeabilidad vascular se esperará que reduzca la inflamación. Estos usos serán benéficos para tratar condiciones asociadas con inflamación excesiva. En forma alterna, compuestos, por ejemplo anticuerpos que ligan a polipéptidos PR087299 de estímulo y bloquean el estímulo de estas moléculas, producen un efecto inhibitorio neto y pueden utilizarse para suprimir la respuesta inmune mediada por células T al inhibir la proliferación/activación de células T y/o secreción de linfocina. El bloquear el efecto estimulante de los polipéptidos suprime la inmunorespuesta del mamífero. Este uso se ha validado en experimentos que utilizan un anticuerpo anti-IL2. En estos experimentos, el anticuerpo liga a IL2 y bloque el enlace de IL2 a su receptor de esta manera logrando un efecto inhibitorio de célula T. H. Modelos de animales Los resultados de los ensayos in vi tro basados en células pueden ser además verificados utilizando modelos y ensayos en animales in vivo para función de células T. Una variedad de modelos de animales bien conocidos puede utilizarse para comprender adicionalmente el papel de los genes aquí identificados en el desarrollo y patogénesis de enfermedad inmunorelacionada y probar la eficacia de agentes terapéuticos candidatos, incluyendo anticuerpo, y otros antagonistas de los polipéptidos nativos, incluyendo antagonistas de moléculas pequeñas. La naturaleza in vivo de estos modelos los hace predictivos de respuestas en pacientes humanos. Modelos en animales de enfermedades inmunorelacionadas incluyen tanto animales no recombinantes como recombinantes (transgénicos) . Modelos de animales no recombinantes incluyen por ejemplo roedores, por ejemplo modelos murinos. Estos modelos pueden generarse al introducir células en ratones singeneicos utilizando técnicas estándar, por ejemplo inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implante en el bazo, implante intraperitoneal, implante bajo la cápsula renal, etc. Enfermedad de injerto-contra-anfitrión ocurre cuando células inmunocompetentes se transplantan en pacientes tolerantes o inmunosuprimidos . Las células donadoras reconocen y responden a antígenos anfitriones. La respuesta puede variar de severa inflamación que amenaza la vida a ligeros casos de diarrea y pérdida de peso. Modelos de enfermedad de injerto-contra-anfitrión proporcionan un medio para estimar la reactividad de células T contra antígenos MHC y antígenos de transplante menor. Un procedimiento conveniente se describe en detalle en Current Protocols in Immunology, anterior, unidad 4.3. Un modelo de animal para rechazo de haloinjerto de piel es un medio para probar la capacidad de células T para mediar destrucción de tejido in vivo y una medida de su papel en rechazo de transplante. Los modelos más comunes y aceptados utilizan injertos de piel-cola murinos. Experimentos repetidos han mostrado que rechazo de haloinjerto de piel es mediado por células T, células T auxiliares y células T destructoras-efectoras, y no anticuerpos. Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2nd ed. , W. E. Paul ed. , Raven Press, NY, 1989, 889-992. Un procedimiento conveniente se describe en detalle en Current Protocols in Immunology, anterior, unidad 4.4. Otros modelos de rechazo de transplante que pueden utilizarse para probar los compuestos de la invención son los modelos de transplante de corazón halogeneico descritos en Tanabe, M. et al, Transplantation (1994) 58:23 and Tinubu, S. A. et al, J. Immunol. (1994) 4330-4338. Modelos de animales para hipersensibilidad de tipo retardado proporcionan un ensayo de función inmunomediada por células por igual . Reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasado son una imnunorespuesta in vivo mediada por células T, caracterizada por inflamación que no alcanza un pico hasta después de un periodo de tiempo transcurrido después de la prueba con un antígeno. Estas reacciones también ocurren en enfermedades autoinmunes específicas de tejido tales como esclerosis múltiple (MS=Multiple Scleroris) y encefalomielitis autoinmune experimental (EAE=Experimental autoimmune encephalomyelitis, un modelo para MS) . Un procedimiento conveniente se describe en detalle en Current Protocols in Immunology, anterior unidad 4.5. EAE es una enfermedad autoinmune mediada por células T caracterizadas por inflamación de células mononucleares y célula T y subsecuente desmielinación de axones en el sistema nervioso central . EAE generalmente se considera como un modelo en animal relevante para MS en humanos. Bolton, C, Múltiple Sclerosis (1995) 1:143. Se han desarrollado tanto modelos de remisión de relapso como agudos. Los compuestos de la invención pueden probarse para actividad inhibitoria o estimulante de células T contra enfermedad desmielinante inmunomediada utilizando el protocolo descrito en Current Protocols in Im unology, anterior unidades 15.1 y 15.2. Ver también los modelos para enfermedad de mielina en donde oligodendrocitos o células de Schwann se injertan en el sistema nervioso central como se describe en Duncan, I . D. et al, Molec. Med. Today (1997) 554-561. Hipersensibilidad de contacto es un ensayo in vivo de hipersensibilidad de tipo retrasado simple de función inmune mediada por células . En este procedimiento, exposición cutánea a haptenos exógenos que da lugar a una reacción de hipersensibilidad de tipo retrasado que se mide y cuantifica. La sensibilidad de contacto involucra una fase de sensibilización inicial seguida por una fase de provocación. La fase de provocación ocurre cuando linfocitos T encuentran en antígeno al cual previamente han tenido contacto. Ocurren hinchado o inflamación, haciendo a este un modelo excelente de dermatitis de contacto alérgica humana. Un procedimiento conveniente se describe en detalle en Current Protocols in Immunology, Eds. J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., 1994, unit 4.2. Ver también Grabbe, S. and Schwarz, T, Immun. Today 19 (1) : 37-44 (1998) . Un modelo de animal para artritis es artritis inducida por colágeno. Este modelo comparte características clínicas histológicas e inmunológicas de artritis reumatoide autoinmune humana y es un modelo aceptable para artritis autoinmune humana. Modelos en ratones y ratas se caracterizan por sinovitis, erosión de cartílagos y hueso subcondrial . Los compuestos de la invención pueden probarse para actividad contra artritis autoinmune utilizando los protocolos descritos en Current Protocols in Immunology, anterior, unidades 15.5. Ver también el modelo que utiliza un anticuerpo monoclonal a integrinas CD18 y VLA-4 descrito en Issekutz, A.C. et al., Immunology (1996) 88:569. Un modelo de asma se ha descrito en donde hiperreactividad de vías respiratorias inducida por antígeno, eosinofilia pulmonar e inflamación, se inducen al sensibilizar un animal con ovalbumina y después someter a prueba al animal con la misma proteína suministrada por aerosol . Varios modelos de animales (conejillos de indias, ratas, primates no humanos) muestran síntomas similares a asma atópico en humanos ante prueba con antígenos en aerosol. Modelos murinos tienen muchas de las características de asma humano. Procedimientos convenientes para probar los compuestos de la invención para actividad y efectividad en el tratamiento del asma, se describen por Wolyniec, W. W. et al, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. (1998) 18:777 y las referencias ahí citadas. Adicionalmente, los compuestos de la invención pueden probarse en modelos de animales para enfermedades tipo psoriasis. La evidencia sugiere una patogénesis de células T en psoriasis. Los compuestos de la invención pueden probarse en un modelo de ratón scid/scid descrito por Schon, M. P. et al, Nat. Med. (1997) 3:183, en donde el ratón demuestra lesiones en la piel histopatológicas que semejan psoriasis. Otro modelo conveniente es la quimera de ratón scid/piel humana preparada como se describe por Nickoloff, B. J. et al, Am. J. Path. (1995) 146:580. Modelo de animales recombinantes (transgénicos) pueden someterse a ingeniería al introducir la porción de codificación de los genes aquí identificados en el genoma de animales de interés, utilizando técnicas estándar para producir animales transgénicos. Animales que pueden servir como una diana para manipulación transgénica, incluyen sin limitación, ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, ovejas, cabras, cerdos y primates no humanos, por ejemplo mandriles, chimpancés y monos. Técnicas conocidas en la especialidad para introducir un transgen en dichos animales incluyen microinyección pronucléica (Hoppe and Wanger, U.S. Patent No. 4,873,191); transferencia de genes mediada por retro virus en líneas germinales (e.g., Van der Putten et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]); diana de genes en células madre embriónicas (Thompson et al., Cell 56, 313-321 [1989]); electroporación de embriones (Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]); transferencia de genes mediadas por esperma (Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 [1989]) . Para revisión ver por ejemplo la patente de los E.U.A. Número 4,736,866. Para el propósito de la presente invención, animales transgénicos incluyen aquellos que transportan el transgen solo en partes o células ("animales mosaico") el transgen puede integrarse ya sea como un solo transgen o en concatámeros, por ejemplo tándems cabeza-a-cabeza o cabeza-a-cola. Introducción selectiva de un transgen en un tipo de célula particular es también posible siguiendo por ejemplo la técnica de Lasko et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992). La expresión del transgen en animales transgénicos puede supervisarse por técnicas estándar. Por ejemplo, análisis de transferencia Southern o amplificación PCR puede emplearse para verificar la integración del transgen. El nivel de expresión de mRNA puede entonces analizarse utilizando técnica tales como hibridación in si tu, análisis de transferencia Northern, PCR o inmunocitoquímica .

Los animales además pueden examinarse por signos de patología de enfermedad inmune, por ejemplo por examen histológico para determinar infiltración de células inmunes en tejidos específicos. Experimentos de bloqueo también pueden realizarse en donde los animales transgénicos se tratan con compuestos de la invención, para determinar la extensión del estímulo o inhibición de proliferación de células T de los compuestos. En estos experimentos, bloqueo de anticuerpos que ligan al polipéptido PR087299, preparado como se describió anteriormente, se administran al animal y el efecto en la función inmune, se determina. En forma alterna, animales con genes inoperativos "knock out" pueden construirse que tienen un gen defectuoso o alterado que codifica un polipéptido aquí identificado, como resultado de recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica el polipéptido y DNA genómico alterado que codifica el mismo polipéptido introducido en una célula embriónica del animal. Por ejemplo, cDNA que codifica un polipéptido particular puede emplearse para clonar DNA genómico que codifica en polipéptido de acuerdo con técnicas establecidas. Una porción del DNA genómico que codifica un polipéptido particular, puede eliminarse o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede utilizarse para supervisar la integración. Típicamente, varias kilobases de DNA de flanqueo no alterado (ambas en los extremos 5' y 3') se incluyen en el vector [ver e.g., Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores recombinantes homólogos] . El vector se introduce en una línea celular madre embriónica (por ejemplo por electropuración) y células en donde el DNA introducido se ha recombinado homólogamente con DNA endógeno, se eligen [ver e.g., Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Las células selectas se inyectan entonces en un blastocisto de un animal (por ejemplo u ratón o rata) para formar quimeras de agregación [ver por ejemplo Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp . 113-152] . Un embrión quimérico puede entonces implantarse en un animal sustituto hembra pseudo preñada conveniente y el embrión se lleva a término para crear un animal con genes inoperativos "knock out". Progenie que guarda el DNA recombinado homólogamente en sus células germinales pueden identificarse por técnicas estándar y utilizarse para desarrollar animales en donde todas las células del animal contienen el DNA recombinado homólogamente. Animales con genes inoperativos "knock out", pueden caracterizarse por ejemplo por su habilidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido. I. Terapia inmunoadjuvante En una modalidad, los compuestos inmunoestimuladores de la invención pueden emplearse en terapia inmunoadjuvante para el tratamiento de tumores (cáncer) . Esta ahora bien establecido que las células T reconocen antígenos específicos de tumor humano. Un grupo de antígenos de tumor, codificado por las familias MAGE, BAGE y GAGE de genes, son silenciosos en todos los tejidos normales adultos, pero se expresan en cantidades significantes en tumores tales como melanomas, tumores de pulmón, tumores de cabeza y cuello y carcinomas de vejiga. DeSmet, C. et al., (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93:7149. Se ha mostrado que el coestímulo de células T induce regresión de tumor y una respuesta antitumor tanto in vi tro como in vivo . Melero, I. et al., Nature Medicine (1997) 3:682; Kwon, E. D. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1997) 94: 8099; Lynch, D. H. et al, Nature Medicine (1997) 3:625; Finn, O. J. and Lotze, M. T., J. Immunol . (1998) 21:114. Los compuestos estimulatorios de la invención pueden administrarse como adyuvantes, solos o junto con un agente regulador del crecimiento, agente citotóxico o agente quimioterapéutico, para estimular proliferación/activación de células T y una respuesta antitumor a antígenos de tumor. El agente regulador de crecimiento, citotóxico o quimioterapéutico puede administrarse en cantidades convencionales utilizando regímenes de administración conocidos. Actividad de inmunoestímulo por los compuestos de la invención permite que cantidades reducidas de los agentes reguladores de crecimiento, citotóxicos o quimioterapéuticos, de esta manera reduciendo potencialmente la toxicidad al paciente . J. Ensayos de supervisión para candidatos de drogas Ensayos de supervisión para candidatos de drogas se diseñan para identificar compuestos que ligan a o complejan con los polipéptidos codificados por los genes aquí identificados o su fragmento biológicamente activo, o de otra forma interfieren con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Estos ensayos de supervisión incluirán ensayos susceptibles a supervisión de alto rendimiento de bibliotecas químicas, haciéndolos particularmente adecuados para identificar candidatos de drogas de moléculas pequeñas . Moléculas pequeñas contempladas incluyen compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos, incluyendo péptidos, de preferencia péptidos solubles, fusiones de (poli) péptido-inmunoglobulina, y en particular anticuerpos incluyendo sin limitación, anticuerpos poli-inmunoclonales, y fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos anti-ideotípicos , y versiones quiméricas o humanizadas de estos anticuerpos o fragmentos así como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos. Los ensayos pueden realizarse en una variedad de formatos, incluyendo ensayos de enlace proteína-proteína, ensayos de supervisión bioquímica, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la especialidad. Todos los ensayos son comunes en que requieren contacto del candidato de droga con un polipéptido codificado por un ácido nucleico aquí identificado bajo condiciones y por un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interactúen. En ensayos de enlace, la interacción enlaza y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una modalidad particular, el polipéptido codificado por el gen aquí identificado o el candidato de droga, se inmoviliza en fase sólida, por ejemplo en una placa de microtitulación, por conexiones covalentes o no covalentes . Conexión no covalente en general se logra al revestir la superficie sólida con una solución del polipéptido y secado. En forma alterna, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido a inmovilizar, puede utilizarse para anclarlo a una superficie sólida. El ensayo se realiza al agregar el componente no inmovilizado, que puede ser etiquetado por una etiqueta detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo la superficie revestida que contiene el componente anclado. Cuando se completa la reacción, los componentes no reaccionados se retiran, por ejemplo mediante lavado, y los complejos anclados en la superficie sólida se detectan. Cuando el componente no inmovilizado originalmente transporta una etiqueta detectable, la detección de la etiqueta inmovilizada en la superficie indica que ocurrió el complejado. Cuando el componente no inmovilizado originalmente no transporta una etiqueta, puede detectarse complejado, por ejemplo al utilizar un anticuerpo etiquetado que liga específicamente el complejo inmovilizado. Si el compuesto candidato interactúa con, pero no liga a una proteína particular codificada por un gen aquí identificado, su interacción con esa proteína puede ser ensayada por métodos bien conocidos para detectar interacciones de proteína-proteína. Esos ensayos incluyen enfoques tradicionales tales como reticulación o entrelazamiento, co-inmunoprecipitación y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas . Además, interacciones proteína-proteína pueden supervisarse utilizando un sistema genético basado en levadura descrito por [Fields and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)] como se describe por Chevray and Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991) . Muchos activadores de transcripción, tales como GAL4 levadura, consiste de dos dominios modulares físicamente discretos, uno que actúa como el dominio de enlace de DNA, mientras que el otro funciona como el dominio de activación de transcripción. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones anteriores (en general referido como el "sistema de dos híbridos"), aprovecha esta propiedad, y emplea dos proteínas híbridas, una en donde la proteína diana se fusiona a un dominio de enlace DNA de GAL4 , y otra en donde las proteínas de activación candidato se fusionan al dominio de activación. La expresión del gen reportero GAL1 - lacZ bajo el control del promotor activado por GAL4 , depende de la reconstitución de actividades GAL4 mediante interacción proteína-proteína. Colonias que contienen polipéptidos de interacción se detectan con un sustrato cromogénico para ß -galactosidasa un equipo completo (MATCHMAKERMR) para identificar interacciones proteína- proteína entre dos proteínas específicas utilizando la técnica de dos híbridos, esta comercialmente disponible de Clontech. Este sistema también puede extenderse a cartografiar dominios de proteína involucrados en interacciones de proteína específicas así como para localizar residuos aminoácidos que son cruciales para estas interacciones. A fin de encontrar compuestos que interfieren con la interacción de un gen aquí identificado y otros componentes intra- o extra celulares pueden probarse, una mezcla de reacción se prepara usualmente que contiene el producto del gen y el componente intra- o extra celular bajo condiciones y por un tiempo que permite la interacción y enlace de los dos productos. Para probar la habilidad de un compuesto de prueba para inhibir el enlace, la reacción se ejecuta en la ausencia y en la presencia del compuesto de prueba. Además, puede agregarse un placebo a una tercer mezcla de reacción para servir como un control positivo. El enlace (formación de complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra- o extra celular presente en la mezcla, se supervisa como se describió anteriormente. La formación de un complejo en la o las reacciones de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de prueba, indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su socio de reacción. K. Composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades inmuno relacionadas. Las composiciones útiles en el tratamiento de enfermedades inmunorelacionadas, incluyen sin limitación, proteínas, anticuerpos, moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas anti-sentido y ribozimas, moléculas de triple hélice, etc., que inhiben o estimulan la función inmune, por ejemplo proliferación/activación de células T, liberación de linfocina o infiltración de células inmunes. Por ejemplo, moléculas de RNA y RNA anti-sentido actúan para bloquear directamente la traducción de mRNA al hibridizar a mRNA diana y evitar traducción de proteína. Cuando se emplea DNA anti-sentido, oligodeoxiribonucleótidos derivados del sitio de iniciación de traducción, por ejemplo entre las posiciones aproximadas -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos de gen diana, se prefieren. Las ribozimas son moléculas de RNA enzimáticas capaces de catalizar la escisión específica de RNA. Las ribozimas actúan por hibridación específica de secuencia al RNA diana complementario, seguido por escisión endonucleolítica . Sitios de escisión de ribozimas específicos dentro de una diana RNA potencial, pueden identificarse por técnicas conocidas. Para mayores detalles, ver por ejemplo Rossi, Current Biology 4, 469-471 (1994), y la publicación de PCT Número WO 97/33551 (publicada en septiembre 18, 1997) . Moléculas de ácido nucleico en formación de triple hélice empleadas para inhibir transcripción deberán de ser de una sola hebra y estar compuestas de dioxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos se diseña de manera tal que promueva la formación de triple hélice mediante reglas de apareo base Hoogsteen, que en general requieren tramos sustanciales de purinas o pirimidinas en una hebra de un dúplex. Para mayores detalles, ver por ejemplo la publicación de PCT Número WO 97/33551, supra. Estas moléculas pueden ser identificadas por cualquiera o cualquier combinación de los ensayos de supervisión discutidos anteriormente y/o por cualquier otra técnica de supervisión bien conocida por aquellos con destreza en la técnica. L. Anticuerpos anti-PR087299 La presente invención además proporciona anticuerpos anti-PR087299. Anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecífieos y heteroconjugados. 1. Anticuerpos policlonales Los anticuerpos anti-PR087299 pueden comprender anticuerpos policlonales. Métodos para preparar anticuerpos policlonales se conocen por la persona con destreza. Anticuerpos policlonales pueden desarrollarse en un mamífero, por ejemplo por una o más inyecciones de un agente de inmunización y si así se desea, un adyuvante. Típicamente, el agente de inmunización y/o adyuvante se inyectará en el mamífero por múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales . El agente inmunizante puede incluir el polipéptido PR087299 o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil el conjugar el agente de inmunización a una proteína conocida que es inmunogénica en el mamífero que se inmuniza. Ejemplos de estas proteínas inmunogénicas incluyen pero no están limitadas a hemocianina de erizo de mar, albúmina de suero, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soya. Ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse incluyen adyuvante completo de Freund, y adyuvante MPL-TDM ( onofosforil lípido A, trehalosa dicorinomicolato sintética) . El protocolo de inmunización puede seleccionarse por una persona con destreza en la técnica sin indebida experimentación. 2. Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos anti-PR087299 pueden en forma alterna ser anticuerpos monoclonales. Anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando métodos de hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal anfitrión apropiado, típicamente se inmuniza con agente de inmunización para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que específicamente ligarán al agente inmunizante. En forma alterna, los linfocitos pueden ser inmunizados in vi tro . El agente de inmunización típicamente incluirá el polipéptido PR087299 o una proteína de fusión del mismo. En general, ya sea se emplean linfocitos de sangre periférica ("PBLs" = Peripheral Blood Lymphocytes) si se desean células de origen humano, o células de bazo o células de nodo linfático se emplean en fuentes de mamíferos no humanos según se desee. Los linfocitos se fusionan entonces con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión conveniente, tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp . 59-103]. Líneas celulares inmortalizadas son usualmente células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Usualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo conveniente que de preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células precursoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"), estas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan expresión de alto nivel estable de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo selectas, y son sensibles a un medio, tal como medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que pueden obtenerse por ejemplo de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63] . El medio de cultivo en donde las células de hibridoma se cultivan, puede ser ensayado por la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra PR087299. De preferencia, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma, se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vi tro, tal como radioinmunoensayo (RÍA) O ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzima (ELISA) . Estas técnicas y ensayos se conocen en la especialidad. La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede por ejemplo ser determinada por el análisis Scatchard de Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980) . Después que se identifican las células de hibridoma deseadas, los Clones pueden ser subclondos por procedimientos de dilución limitante y desarrollados por métodos estándar [Goding, supra] . Medio de cultivo conveniente para este propósito incluye por ejemplo medio Tagle modificado con Dulbecco y medio RPMI-1640. En forma alterna, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como ascitos en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subClones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o fluido de ascitos por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como por ejemplo proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforésis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Los anticuerpos monoclonales también pueden ser elaborados por métodos de DNA recombinantes tales como aquellos descritos en la Patente de los E.U.A. Número 4,816,567. DNA que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede fácilmente aislarse y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo al utilizar sondas oligonucleótido que son capaces de ligar específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de este DNA. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en los vectores de expresión, que después se transectan en células anfitrionas tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células de mieloma que de otra forma no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes. El DNA también puede ser modificado por ejemplo al sustituir la secuencia de codificación para dominios constantes de cadena pesada y ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homologas [Patente de los E.U.A. Número 4,816,567; Morrison et al., supra] o por unión covalente de la secuencia de codificación de inmunoglobulina de todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no- inmunoglobulina . Este polipéptido no-inmunoglobulina puede ser sustituido por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede ser sustituido por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención, para crear un anticuerpo bivalente quimérico. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes. Métodos para preparar anticuerpos monovalentes son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método involucra expresión recombinante de cadena ligera de inmuno globulina y cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca generalmente en un punto en la región Fe para evitar reticulado o entrelazamiento de cadena pesada. En forma alterna. Los residuos cisterna relevantes se sustituyen con otro residuo aminoácido o se eliminan para evitar reticulado o entrelazamiento . Métodos in vi tro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. Digestión de anticuerpos para producir sus fragmentos, particularmente fragmentos Fab, puede lograrse utilizando técnicas rutinarias conocidas en la especialidad. 3. Anticuerpos humanos y humanizados Los anticuerpos anti-PR087299 de la invención además pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo murino), son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o sus fragmentos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de enlace de antígeno de anticuerpos) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo de recipiente) en donde los residuos de una región de determinación de complementareidad (CDR) del recipiente se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata o conejo que tenga las deseadas especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, residuos de marco Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo de recipiente ni en las secuencias de marco o CDR importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en donde todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o esencialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado en forma óptima también comprenderá cuando menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op . Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]. Métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácido introducidos en él de una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácidos no humanos a menudo se refieren como residuos de "importación", que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], al sustituir CDRs de roedores o secuencias CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpo "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los E.U.A. Número 4,816,567), en donde sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos roedores. Anticuerpos humanos también pueden producirse utilizando varias técnicas conocidas en la especialidad, incluyendo bibliotecas de exhibición fago [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las técnicas de Colé et al. y Boerner et al . están también disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol . , 147(1) :86-95 (1991)]. Similarmente, anticuerpos humanos pueden elaborarse al introducir sitios de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo ratones en donde los genes de inmunoglobulina endógenos han sido inactivados parcial o completamente. Ante prueba, se observa producción de anticuerpo humano, que semeja cercanamente la vista en humanos en todos los aspectos, incluyendo re-arreglo, ensamblado y repertorio de anticuerpos de genes. Este enfoque se describe por ejemplo en las Patentes de los E.U.A. Números 5,545,807; ,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol . 13 65-93 (1995) . Los anticuerpos también pueden ser madurados por afinidad utilizando métodos de mutagénesis y/o selección conocidos como se describió anteriormente. Anticuerpos madurados por afinidad preferidos tienen afinidad que es cinco veces, más preferible 10 veces, incluso más preferible 20 o 30 veces mayor que el anticuerpo de partida (generalmente murino humanizado o humano) del cual se prepara el anticuerpo madurado. 4. Anticuerpos biespecíficos Anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, de preferencia humanos o humanizados que tienen especificidad de enlace para al menos dos antígenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de enlace es para PR087299, la otra es para cualquier otro antígeno y de preferencia para una proteína de superficie celular o receptor o sub-unidad receptora . Métodos para producir anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadenas pesada/cadena ligera de inmunoglobulina en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido al surtido al azar de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta usualmente se logra por etapas de cromatografía por afinidad. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, publicado el 13 de mayo 1993, y en Traunecker et al., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991) . Dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión de preferencia es con dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primer región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para enlace de cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina se insertan en vectores de expresión separados y se co-transectan en un organismo anfitrión conveniente. Para mayores detalles de generar anticuerpos biespecíficos, ver por ejemplo Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). De acuerdo con otro enfoque descrito en WO 96/27011, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo, puede someterse a ingeniería para llevar al máximo el por ciento de heterodímeros que se recuperan de cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales aminoácido pequeñas de la interfase de la primer molécula de anticuerpo se reemplazan con más grandes cadenas laterales (por ejemplo tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas laterales grandes, se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar grandes cadenas laterales aminoácido con más pequeñas (por ejemplo alanina o trionina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos secundarios indeseados tales como homodímeros . Anticuerpos bioespecíficos pueden preparase como anticuerpos de longitud íntegra o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos bioespecíficos F(ab')2) . Técnicas para generar anticuerpos bioespecíficos de fragmentos de anticuerpo se han descrito en la literatura. Por ejemplo, pueden preparase anticuerpos bioespecíficos utilizando enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente complejante ditiol arcenito de sodio para estabilizar ditioles vecinales y evitar formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados entonces se convierten a derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' TNB después se reconvierte a Fab' tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' para formar el anticuerpo bioespecífico . Los anticuerpos bioespecíficos producidos pueden emplearse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los fragmentos Fab' pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar anticuerpos bioespecíficos . Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217 225 (1992) describe la producción de una molécula de anticuerpo bioespecífico totalmente humanizada F(ab')2. Cada fragmento Fab' fue secretado por separado de E. coli y sometió a acoplamiento químico directo in vi tro para formar el anticuerpo bioespecífico. El anticuerpo bioespecífico así formado fue capaz de ligar a células que sobrexpresan al receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como disparar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humanas . Varias técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo bioespecíficos directamente de cultivo celular recombinante también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos bioespecíficos se han producido utilizando cremalleras leucina. Kostelny et al., J. Immunol . 148(5) :1547 1553 (1992). Los péptidos cremallera leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las pociones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpos se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444 6448 (1993), ha proporcionado un mecanismo alterno para producir fragmentos de anticuerpo bioespecíficos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador que es muy corto para permitir apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios VH y V de un fragmento son forzados a aparear con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo bioespecíficos por el uso de Fv de cadenas sencilla (sFv) también se ha reportado. Ver Gruber et al., J. Immunol . 152:5368 (1994) . Anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo, anticuerpos triespecífieos pueden ser preparados. Tutt et al., J. Im unol. 147:60 (1991). Anticuerpos bioespecíficos ejemplares pueden ligar a dos epítopes diferentes en un polipéptido PR087299 dado aquí. En forma alterna, un brazo polipéptido PR087299 puede ser combinado con un brazo que liga a una molécula de disparo o activadora en un leucocito tal como una molécula receptora de célula T (por ejemplo CD2 , CD3 , CD28, o B7) o receptores Fe para IgG (Fc^R), tal como Fc?RI (CD64), Fc/RII (CD32) y Fc^RIII (CD16) para enfocar mecanismos de defensa celulares a la célula que expresa el polipéptido PR087299 particular. Anticuerpos bioespecíficos también pueden emplearse para localizar agentes citotóxicos en células que expresan un polipéptido PR087299 particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace PR087299 y un brazo que liga un agente citotóxico o un quelador radionuclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otro anticuerpo bioespecífico de interés liga el polipéptido PR087299 y además liga factor de tejido (TF=Tissue factor) . 5. Anticuerpos heteroconjugados Anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Estos anticuerpos por ejemplo se han propuesto para hacer diana en células de sistema inmune a células indeseadas [Patente de los E.U.A. Número. 4,676,980] , y para tratamiento de infección HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] . Se contempla que los anticuerpos pueden prepararse in vi tro utilizando métodos conocidos en química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que involucran agentes de entrelazamiento. Por ejemplo, inmunotoximas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio a disulfuro o al forma un enlace tioeter. Ejemplos de reactivos convenientes para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos descritos por ejemplo en la patente de los E.U.A. Número 4,676,980. 6. Ingeniería de función efectora Puede ser conveniente el modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para mejorar, por ejemplo la efectividad del anticuerpo para tratar cáncer. Por ejemplo, uno o varios residuos cisteina pueden introducirse en la región Fe, permitiendo de esta manera formación de enlace disulfuro intercadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o incrementado exterminio de células mediada por complemento y citotoxidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC=Antibody dependent cellular cytoxicity) . Ver Carón et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol . , 148: 2918-2922 (1992). Anticuerpos homodimericos con actividad antitumor mejorada también pueden prepararse utilizando entrelazadores heterobifuncionales como se describen en Wolff et al. Cáncer Research, 53: 2560-2565 (1993). En forma alterna, puede someterse a ingeniería un anticuerpo que tenga regiones Fe duales y de esta manera puede tener capacidades ADCC y lisis de complemento mejorada. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989) . 7. Inmunoconjugados . La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como una agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano fungal de plantas o animales, o sus fragmentos) o un isótopo radioactivo (es decir un radiocojugado) . Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de estos inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden emplearse incluyen cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena hexotoxina A (de Pseudomunas aeruginasa) , cadena resina A, cadena abrina A, cadena modecina A, alfa sarcina, proteínas de Aleuri tes fordii , proteínas de diantina, proteínas de fitolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP S) , e inhibidor de mormodica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotenos. Una variedad de radionuclidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplo incluyen 212Bi, 131I, 131In, 9°Y, y 186Re. Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se elaboran utilizando una variedad de agentes de acoplamiento-proteína bifuncionales tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoester (tales como dimetil adipimidato HCl) , esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutareldéhido) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina), disocianatos (tales como tolilen 2,6-disocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenzeno) . Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina resina como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminpentacetico (MX-DTPA) etiquetado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para conjugar radionucleótido con el anticuerpo. Ver WO94/11026. En otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en pre-diana de tumor en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al paciente, seguido por eliminación de conjugado no ligado de la circulación utilizando un agente de liberación y la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido) . 8. Inmunoliposomas Los anticuerpos aquí descritos también pueden formularse como inmunoliposomas. Liposomas que contienen el anticuerpo, se preparan por métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y en las patentes de los E.U.A. Números 4,485,045 y 4,544,545. Liposomas con tiempo de circulación mejorado se describe en la patente de los E.U.A. Número 5,013,556. Liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol, fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE) . Se extruyen liposomas a través de filtros de tamaño de poro definido para dar liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos Fab1 del anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados a los liposomas como se describe en Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como doxorubicina) esta contenida opcionalmente en el liposoma. Ver Gabizon et al., J. National Cáncer Inst . , 81 (19) : 1484 (1989) . M. Composiciones farmacéuticas Las moléculas PR087299 activas de la invención (por ejemplo polipéptidos PR087299, anticuerpos anti-PR087299 y/o variantes de cada uno) así como otras moléculas identificadas por los ensayos de supervisión anteriormente descritos, pueden ser administradas para el tratamiento de enfermedades inmunorelacionadas, en la forma de composiciones farmacéuticas. Formulaciones terapéuticas de la molécula PR087299 activa, de preferencia un polipéptido o anticuerpo de la invención, se preparan para almacenamiento al mezclar la molécula activa que tiene el grado de pureza deseado con portadores excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed. [1980]) en la forma de formulaciones leofilizadas o soluciones acuosas. Portadores excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos a los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácidos ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio; fenol, butil o benzil alcohol; alquil parabenos tal como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofilicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa, o dextriñas; agentes quelates tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sales tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo complejos Zn-proteína) ; y/o surfactantes no-iónicos tales como TWEENMR, PLURONICSMR o polietilen glicol (PEG) . Compuestos identificados por los ensayos de supervisión aquí descritos pueden formularse en forma análoga, utilizando técnicas estándar bien conocidas en la especialidad. Lipofecciones o liposomas también pueden emplearse para suministrar la molécula PR087299 en células. Cuando se emplean fragmentos de anticuerpo, el fragmento inhibitorio más pequeño que específicamente liga al dominio de enlace de la proteína diana se prefiere. Por ejemplo, con base en la secuencia de región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas péptido que retienen la capacidad por ligar la secuencia de proteína diana. Estos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse por tecnología de DNA recombinante (ver por ejemplo Marasco et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]). La presente formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, particularmente aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sí. De forma alterna, o además, la composición puede comprender un agente citotóxico, citosina o agente inhibidor de crecimiento. Estas moléculas están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. Las moléculas PR087299 activas también pueden atraparse en microcápsulas preparadas por ejemplo por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo hidroximetil celulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacrilato) , respectivamente en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo limposomas, microesféras de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol , A. Ed. (1980) . Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril. Preparaciones de liberación sostenida de las moléculas PR087299 pueden prepararse. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen al anticuerpo, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poliláctidas (patentes de los E.U.A.

Número 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutamico y ? -etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOTMR (microesféras inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y leuprolida acetato), y ácido poli-D- (- ) -3-hidroxibutírico . Mientras que polímeros tales como etilen-vinil acetato y ácido láctico-ácido-glicólico permiten la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo más corto. Cuando anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo por largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de exposición a la humedad a 37 grados C resultando en una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenisidad. Estrategias racionales pueden diseñarse para estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que es formación de enlace S-S intermolecular a través de intercambio tio-disulfuro, puede lograrse estabilización el modificar residuos sulfidrilo, liofilizar soluciones acídicas, controlar contenido de humedad utilizando aditivos apropiados y desarrollar composiciones de matriz de polímero específicas. N. Métodos de tratamiento. N. Métodos de Tratamiento Se contempla que los polipéptidos, anticuerpos y otros compuestos activos de la presente invención, pueden utilizarse para tratar diversas enfermedades y condiciones inmunorelacionadas, tales como enfermedades mediadas por células T, incluyendo aquellas caracterizadas por infiltración de células inflamatorias en un tejido, estímulo de proliferación de célula T, inhibición de proliferación de célula T, permeabilidad vascular incrementado o disminuida o su inhibición. Condiciones o desórdenes ejemplares a tratar con los polipéptidos, anticuerpos y otros compuestos de la invención, incluyen pero no están limitados a lupus sitémico eritematosis, ESTE PÁRRAFO YA LO TIENE, HAY QUE TOMARLO DE LA PAG. 10 LÍNEA 18 HASTA FIN DE PÁRRAFO!!! En Lupus sistémico eritematoso, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos auto-reactivos a auto proteínas/tejidos y la subsecuente generación de inflamación inmunomediada. Anticuerpos median ya sea directa o indirectamente la lesión de tejido. Aunque linfocitos T no se han mostrado directamente involucrados en daño de tejido, se requieren linfocitos T para el desarrollo de anticuerpos auto-reactivos. El génesis de la enfermedad de esta manera es dependiente de linfocitos T. Se afectan múltiples órganos y sistemas clínicamente incluyendo riñon, pulmón, sistema musculoesquelético, mucocutáneo, ojo, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, médula ósea y sangre. La artritis reumatoide (RA = Rheumatoid arthritis) es una enfermedad inflamatoria autoinmune sistémica crónica que primordialmente involucra la membrana sinovial de múltiples articulaciones con resultante lesión al cartílago articular. La patogénesis es dependiente de linfocito T y está asociada con la producción de factores reumatoides, auto-anticuerpos dirigidos contra auto-IgG, con la formación resultante de complejos inmunes, que alcanzan altos niveles en fluidos de articulación y sangre. Estos complejos en la articulación pueden inducir el infiltrado marcado de linfocitos y monolitos en el sinovio y subsecuentes cambios sinoviales marcados; el fluido/espacio de la articulación si es infiltrado por células similares con la adición de numerosos neutrófilos. Tejidos afectados primordialmente son las articulaciones, a menudo en un patrón simétrico. Sin embargo, una enfermedad extra-articular también ocurre en dos formas principales. Una forma es el desarrollo de lesiones extra-articulares con la enfermedad de articulación progresiva en proceso y lesiones típicas de fibrosis pulmonar, vasculitis y úlceras cutáneas. La segunda forma de enfermedad extra-articular es el así denominado síndrome de Felty que ocurre posteriormente en el curso de la enfermedad RA, en ocasiones después de que la enfermedad de la articulación se ha vuelto inactiva e involucra la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia . Esto puede estar acompañado por vasculitis en múltiples órganos con formaciones de infartos, úlceras de la piel y gangrena. Pacientes a menudo desarrollan nodulos reumatoides en el tejido subcutáneo sobrepuesto a las articulaciones afectadas; la etapa tardía de nodulos tiene centros necróticos circundados por un infiltrado celular inflamatorio mixto. Otras manifestaciones que pueden ocurrir en RA incluyen: pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria, neumonitos interticial con fibrosis pulmonar, queratoconjuntivitis seca, y nodulos reumatoides. Artritis crónica juvenil es una enfermedad inflamatoria idiopática crónica empieza a menudo a menos de 16 años de edad. Su fenotipo tiene ciertas similaridades con RA; algunos pacientes que son factor reumatoide positivo se clasifican como de artritis reumatoide juvenil. La enfermedad se sub-clasifica en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular y sistémicas. La artritis puede ser severa y típicamente es destructiva y lleva a anquilosis de articulación y crecimiento retardado. Otras manifestaciones pueden incluir uveitis anterior crónica y amiloidosis sistémica. Las espondiloartropatías son un grupo de desórdenes con algunas características clínicas comunes y la asociación común con la expresión del producto de gen HLA-B27. Los desórdenes incluyen: esponilitis anquilosante, síndrome de Reiter (artritis reactiva), artritis asociada con enfermedad intestinal inflamatoria, espondilitis asociada con soriasis, espondiloartropatía de inicio juvenil y espondiloartropatía no diferenciada. Características distintivas incluyen sacroileitis con o sin espondilitis; artritis asimétrica inflamatoria; asociación con HLA-B27 (un alelo definido serológicamente del sitio HLA-B de la clase I MHC) ; inflamación ocular y ausencia de autoanticuerpos asociados con otra enfermedad reumatoide. La célula más implicada como clave para inducción de la enfermedad es el linfocito T CD8+, una célula que hace diana en antígeno presentado por moléculas MHC clase I . Células T CD8+ pueden reaccionar contra el alelo MHC clase I HLA-B27 como si fuera un péptido extraño expresado por moléculas MHC clase I . Se ha teorizado que un epítope de HLA-B27 puede imitar un epítope bacteriano u otro antigénico microbiano y de esta manera inducir una respuesta de célula T CD8+. Esclerosis sistémica (escleroderma) tiene una etiología desconocida. Una marca de contraste de la enfermedad es la induración de la piel; probablemente esto se induce por un proceso inflamatorio activo. Escleroderma puede ser localizada o sistémica; lesiones vasculares son comunes y lesión de célula endotelial en la microvasculatura es un evento temprano e importante en el desarrollo de esclerosis sistémica; la lesión vascular puede ser inmuno mediada. Una base inmunológica se implica por la presencia de infiltrados de células mono-nucleares en las lesiones cutáneas y la presencia de anticuerpos anti -nucleares en muchos pacientes. ICAM-1 a menudo se aumenta la expresión en la superficie celular de fibroblastos en lesiones de la piel sugiriendo que la interacción de células T con estas células puede tener un papel en la patogénesis de la enfermedad. Otros órganos involucrados incluyen: el tracto gastrointestinal: atrofia de músculo liso y fibrosis que resulta en peristalsis/movilidad anormal; riñon: proliferación íntima subendotelial concéntrica que afecta pequeñas arterias arqueadas e interlobulares con flujo sanguíneo cortical renal reducido, resulta en proteinuria, azotemia e hipertensión; músculo esquelético: atrofia, fibrosis intersticial; inflamación; pulmón: neumonitis intersticial y fibrosis intersticial; y corazón: necrosis con banda de contracción, cicatrización/fibrosis . Miopatías inflamatorias idiopáticas incluyendo dermatomiositis, polimiositis y otras, son desórdenes de inflamación de músculo crónica de etiología desconocida que resulta en debilidad del músculo. Lesión/inflamación del músculo a menudo es simétrica y progresiva.

Autoanticuerpos están asociados con la mayoría de las formas. Estos autoanticuerpos específicos de miositis se dirigen contra e inhiben la función de componentes, proteínas y RNA's, involucrados en síntesis de proteínas. El síndrome de Sjógren se debe a inflamación inmune-mediada y subsecuente destrucción funcional de las glándulas lagrimales y glándulas salivares. La enfermedad puede estar asociada con o acompañada por enfermedades de tejido conectivo inflamatorias. La enfermedad se asocia con producción de autoanticuerpos contra antígenos Ro y La, ambos de los cuales son complejos de proteínas de RNA pequeñas. Lesiones resultan en queratoconjuntivitis seca, xerostomia, con otras manifestaciones o asociaciones incluyendo cirrosis biliar, neuropatía periférica o sensorial, y púrpura palpable . Vasculitis sistémicas son enfermedades en donde la lesión primaria es inflamación y subsecuente daño a los vasos sanguíneos que resulta en isquemia/necrosis/degeneración a tejidos, suministrado por los vasos afectados y eventualmente disfunsión del órgano final en algunos casos. Vasculitides también puede ocurrir como una lesión secundaria o secuelas a otras enfermedades mediadas inmune- inflamatorias tales como artritis reumatoide, esclerosis sistémica, etc., particularmente en enfermedades también asociadas con la formación de inmuno complejos. Enfermedades en el grupo vasculitis sistémica primaria incluyen: vasculitis necrotizantes sistémica: poliarteritis nodosa, angiitis alérgica y granulomatosis, poliangiitis; granulomatosis de Wegener; granulomatosis linfomatoide ; y arteritis de células gigantes. Vasculitis misceláneas incluyen: síndrome de nodos linfáticos mucocutáneos (MLNS o enfermedad de Kawasaki) , vasculitis de CNS aislada, enfermedad de Behet, tromboangiitis obliterans (enfermedad de Buerger) y venulitis necrotizante cutánea.

El mecanismo patogénico de la mayoría de los tipos de vasculitis citados se considera que primordialmente se debe al depósito de complejos de inmunoglobulina en la pared del vaso y subsecuente inducción de una respuesta inflamatoria ya sea por ADCC, activación de complemento o ambos . La Sarcoidosis es una condición de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epitelioides casi en cualquier tejido en el cuerpo; la participación del pulmón es más común. La patogénesis involucra la persistencia de macrófagos activados y células linfoides en sitios de la enfermedad con subsecuentes secuelas crónicas resultantes de la liberación de productos activos local y sistémicamente desprendidos por estos tipos de células. Anemina hemolítica autoinmune incluyendo anemia hemolítica autoinmune, pancitopenia inmune, y hemoglobinuria noctural paroxismal es un resultado de producción de anticuerpos que reaccionan con antígenos expresados en la superficie de glóbulos rojos (y en algunos casos, otras células de la sangre incluyendo plaquetas por igual) y es un reflejo de la eliminación de esas células revestidas con anticuerpo mediante lisis mediada por complemento y/o mecanismos mediados por receptor Fc/ADCC. En trombocitopenia autoimmune incluyendo púrpura trombocitopénica, y trombocitopenia inmuno mediada en otros ambientes clínicos, destrucción/eliminación de plaquetas ocurre como resultado ya sea de conexión de anticuerpo o complemento con plaquetas y subsecuente eliminación por lisis de complemento, mecanismos mediados por receptor FC o ADCC. Tiroiditis incluyendo la enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, y tiroiditis atrófica, son el resultado de una respuesta autoinmune contra antígenos de tiroides con producción de anticuerpos que reaccionan con proteínas presentes en y a menudo específicas para la glándula tiroides. Modelos experimentales existen que incluyen modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollos obesos) ; modelos inducibles: inmunización de animales ya sea con tiroglobulina, antígeno microsomal de tiroides (peroxidasa tiroide) . Diabetes mellitus tipo I o diabetes dependiente de insulina es la destrucción autoinmune de células ß de isleta pancreática; esta destrucción está mediada por auto-anticuerpos y células T auto-reactivas. Anticuerpos a insulina o el receptor de insulna también pueden producir el fenotipo sin respuesta a insulina. Enfermedades renales inmuno mediadas, incluyendo glomerulonefritis y nefritis tubulointerstitial , son el resultado de lesión mediada por anticuerpo o linfocito T a tejido renal ya sea directamente como resultado de la producción de anticuerpos autoreactivos o células T contra antígenos renales o indirectamente como resultado del depósito de anticuerpos y/o complejos inmunes en el riñon que son rectivos contra otros antígenos no-renales. De esta manera, enfermedades inmune-mediadas que resultan en la formación de inmune-complejos también pueden inducir enfermedad renal inmuno-mediada como una secuela indirecta. Tanto mecanismos inmunes directos como indirectos resultan en respuesta inflamatoria que produce/induce desarrollo de lesión en tejidos renales con el resultante desequilibrio funcional del órgano y en algunos casos avance hasta falla renal. Tanto mecanismos inmunes celulares como humorales pueden estar involucrados en la patogénesis de lesiones. Enfermedades desmielinantes de los sistemas nerviosos central y periférico, incluyendo Esclerosis Múltiple; polineuropatia desmielinante idiopática o síndrome de Guillain-Barré; y Polineuropatia Desmielinante Inflamatoria Crónica, se considera que tienen una base autoinmune y resultan en desmielinación de nervios como resultado de daño provocado al oligodendrocitos o a la mielina directamente. En MS hay evidencia para sugerir la inducción y avance de enfermedad es dependiente de linfocitos T. Esclerosis Múltiple es una enfermedad desmielinante que depende de linfocito T ya sea tiene un curso de relapso-remisión o un curso progresivo crónico. La etiología se desconoce; sin embargo, infecciones virales, predisposición genética, ambiente y autoinmunidad todos contribuyen. Lesiones contienen infiltrados de células microgliales mediadas predominantemente por linfocito T y macrófagos infiltrantes; linfocitos T CD4+ son el tipo de célula predominante en las lesiones. El mecanismo de muerte celular de oligodendrocito y subsecuente desmielinación no se conoce pero probablemente es dirigido por linfocito T. Enfermedad Pulmonar Fibrótica E Inflamatoria, incluyendo Neumonías Eosinofílicas; Fibrosis Pulmonar Idiopática, y Neumonitis de Hipersensibilidad pueden involucrar una respuesta inmune-inflamatoria desregulada. La inhibición de esa respuesta sería de beneficio terapéutico. Enfermedad de la Piel Autoinmune o Inmuno-mediada incluyendo Enfermedades de Piel Bulosa, Eritema Multiforme, y Dermatitis de Contacto son mediadas por auto-anticuerpos, el génesis del cual depende de linfocito T. Soriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por linfocito T. Lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrófagos y células de procesamiento de antígeno, y algunos neutrófilos. Enfermedades alérgicas, incluyendo asma; rinitis alérgica; dermatitis atópica; hipersensibilidad a alimentos; y urticaria dependen de linfocitos T. Estas enfermedades predominantemente están mediadas por inflamación inducida por linfocito T, inflamación mediada por IgE o una combinación de ambas. Enfermedades asociadas con transplante, incluyendo rechazo de Injerto y Enfermedad de- Injerto- Contra-Anfitrión (GVHD = Graft-Versus-Host-Disease) dependen de linfocito T; inhibición de la función de linfocito T es mejoradora. Otras enfermedades en donde la intervención de la respuesta inmune y/o inflamatoria tiene beneficio, son enfermedad infecciosa que incluye pero no está limitada a infección viral (incluyendo pero no limitada a sida, hepatitis A, B, C, D, E y herpes) infección bacteriana, infecciones fúnjales e infecciones de protozoarios y parasitarias (moléculas (o derivados/agonistas) que estimulan MLR pueden utilizarse terapéuticamente para mejorar la respuesta inmune a agentes infecciosos) , enfermedades de inmunodeficiencia (moléculas/derivados/ agonistas) que estimulan MLR pueden utilizarse terapéuticamente para mejorar la respuesta inmune para condiciones de inmunodeficiencia heredada, adquirida, inducida por infección (tal como en infección HIV) o iatrogénicas (es decir de quimioterapia) y neoplasia. Se ha demostrado que algunos pacientes de cáncer humanos desarrollan un anticuerpo y/o respuesta linfocito T antígenos en células neoplásicas. También se ha mostrado en modelos de animales de neoplasia que la mejora de la respuesta inmune puede resultar en el rechazo o regresión de ese neoplasma particular. Moléculas que mejoran la respuesta de linfocito T en MLR tienen utilidad in vivo para mejorar la respuesta inmune contra neoplasia. Moléculas que mejoran la respuesta proliferativa de linfocito T en el MLR (o agonistas de molécula pequeña o anticuerpos que afectan el mismo receptor en una formadora agonística) pueden utilizarse terapéuticamente para tratar cáncer. Moléculas que inhiben la respuesta de linfocitos en MLR también funcionan in vivo durante neoplasia para suprimir la respuesta inmune a un neoplasma; estas moléculas ya pueden expresarse por las células de neoplásticas mismas o su expresión puede inducirse por el neoplasma en otras células. Antagonismo de estas moléculas inhibidoras (ya sea con anticuerpo, agonistas de molécula pequeña u otros medios) mejoran el rechazo de tumor inmuno mediado. Adicionalmente, inhibición de moléculas con propiedades pro inflamatorias pueden tener beneficio terapéutico en lesión de reperfusión; derrame o ataque cerebral; infarto al miocardio; arteriosclerosis; lesión pulmonar aguda; choque hemorrágico; quemadura; choque séptico/sepsis; necrosis tubular aguda; endometriosis ; enfermedad de articulaciones degenerativa y pancreatitis. Los compuestos de la presente invención, por ejemplo polipéptidos o anticuerpos se administran a un mamífero, de preferencia a un humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, como un bolo o por infusión continua sobre un periodo de tiempo, por rutas intramuscular, intraperitoneal, intracerebro espinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica, o de inhalación (intranasal o intrapulmonar) . Administración intravenosa o inhalada de polipéptidos y anticuerpos se prefiere. En terapia de inmuno-adyuvantes, otros regímenes terapéuticos tales como administración de un agente anti-cáncer, pueden combinarse con la administración de las proteínas, anticuerpos o compuestos de la presente invención. Por ejemplo, el paciente a tratar con un inmuno-adyuvante de la invención también puede recibir un agente aquí cáncer (agente quimioterapéutico) o terapia de radiación. Programas de dosificación y preparación para estos agentes quimioterapéuticos, pueden emplearse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determine empíricamente por el practicante con destreza. Programas de dosis y preparación para esta quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed . , M. C. Perry, Williams & Nilkins, Bal timore, MD (1992) . El agente quimioterapéutico puede preceder, o seguir a la administración del inmuno-adyuvante o puede ser administrado en forma simultánea. Adicionalmente, un compuesto ante estrógeno tal como tamoxifen o una antiprogesterona tal como una pistona (ver EP616812) puede suministrarse en dosis conocidas por estas moléculas . Puede ser conveniente también administrar anticuerpos contra otra enfermedad inmune asociada o antígenos asociados de tumor tales como anticuerpos que ligan a CD20, CDlla, CD18, ErbB2 , EGFR, ErbB3 , ErbB4 , o factor endotelial vascular (VEGF=vascular endothelial factor) . En forma alterna, o además, dos o más anticuerpos que ligan el mismo o dos o más antígenos diferentes aquí descritos, pueden ser coadministrados al paciente. En ocasiones, puede ser benéfico también administrar una o más citocinas al paciente. En una modalidad, los polipéptidos PR087299 se coadministran con un agente inhibidor de crecimiento. Por ejemplo, el agente inhibidor de crecimiento puede administración primero, seguido por un polipéptido PR087299. Sin embargo, también se contempla primero administración o administración simultánea. Dosis convenientes para el agente inhibidor de crecimiento son aquellas actualmente empleadas y pueden reducirse debido a la acción combinada (sinergia) del agente inhibidor de crecimiento y el polipéptido PR087299. Para el tratamiento o reducción de la severidad de la enfermedad y inmuno relacionada, la dosis apropiada de un compuesto de la invención dependerá del tipo de enfermedad a tratar, como se definió anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, ya sea que el agente se administre para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica y respuesta del paciente al compuesto, y la discreción del médico a cargo. El compuesto se administra convenientemente al paciente de una vez o sobre una serie de tratamientos. Por ejemplo, dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad aproximadamente 1 µ g/kg a 15 µ g/kg (por ejemplo 0.1-20 mg/kg) de polipéptido u anticuerpo es una dosis candidato inicial para administración a paciente, ya sea por ejemplo por una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosis diaria típica puede estar en el rango de aproximadamente l g/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas en varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que ocurre una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosis pueden ser útiles. El avance en esta terapia se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales. O. Artículos de Manufactura.

En otra modalidad de la invención, un artículo de manufactura que contiene materiales (por ejemplo comprende una molécula PR087299) útil para el diagnóstico o tratamiento de los desórdenes anteriormente descritos, se proporciona. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una instrucción. Recipientes convenientes incluyen, por ejemplo botellas, ampolletas, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es efectiva para diagnóstico o tratamiento de la condición y puede tener una comporta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o una ampolleta que tiene un tapón perforarle por una aguja de inyección hipodérmica) . El agente activo en la composición usualmente es un polipéptidos o un anticuerpo de la invención. Una instrucción o etiqueta en, o asociada con el recipiente, indica que la composición se emplea para diagnóstico o tratamiento de la condición selecta. El artículo de manufactura también puede comprender un segundo recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como salino amortiguado con fosfatos, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incidir otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaque con instrucciones para uso . P. Diagnóstico Y Pronóstico De Enfermedad Inmundo Relacionada Proteínas de superficie celular, tales como proteínas que se sobre expresan en ciertas enfermedades inmuno relacionadas, son excelentes dianas para candidatos de droga o tratamiento de enfermedad. Las mismas proteínas junto con proteínas secretadas codificadas por los genes amplificados en estados de enfermedad inmuno relacionados, encuentran uso adicional en el diagnóstico el pronóstico de estas enfermedades. Por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra los productos de proteínas de genes amplificados en esclerosis múltiple, artritis reumatoide u otra enfermedad inmuno relacionada, pueden utilizarse como de diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, anticuerpos incluyendo fragmentos de anticuerpos, pueden emplearse para detectar en forma cualitativa o cuantitativa la expresión de proteínas codificadas por genes amplificados o sobre expresados ("productos de gen marcador"). El anticuerpo de preferencia está equipado con una etiqueta detectable, por ejemplo fluorescente, y puede supervisare el enlace por microscopía de luz, sito metería de flujo, flúorimetería u otras técnicas conocidas en la especialidad. Estas técnicas son particularmente convenientes si el gen sobre expresado codificar una proteína de superficie celular. Estos ensayos de enlace se realizan esencialmente como se describió con anterioridad. Detección in si tu de enlace de anticuerpo a los productos de gen marcador, puede realizarse por ejemplo por inmundo florescencia o microscopía de inmuno electrones. Para este propósito, un espécimen histológico se retira del paciente y se le aplica un anticuerpo etiquetado, de preferencia al superponer el anticuerpo en una muestra biológica. Este procedimiento también permite determinar la distribución del producto de gen marcador en el tejido examinado. Será aparente para aquellos con destreza la técnica que una amplia variedad de métodos históricos están fácilmente disponibles para detección in si tu . Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente y no se pretende que limiten el alcancé de la presente invención en forma alguna .

Todas las referencias de patentes y de la literatura citadas en la especificación presente aquí se incorporan por referencia en su totalidad. EJEMPLOS . Reactivos comercialmente disponibles referidos a los ejemplos se emplearon de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes a menos que se indique de otra forma. La fuente de estas células identificadas las siguientes ejemplos y a través del especificación, por números de accesos ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA. EJEMPLO 1: Clonación de PR087299 Una base de datos de ADN con la etiqueta de frecuencia expresada (EST=expressed sequence tag) (Merck/Washington University) fue buscada y se identificó una EST que contienen dominios de interés, específicamente uno o varios dominios de inmunoglobulina (Ig) y uno o varios motivos de inhibición inmundo tirocina (ITIM= Immuno Tyrosine Inhibition Motif(s)). La búsqueda se realizó utilizando el programa de computadora BLAST o BLAST2 [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)] utilizando una comparación de los dominios de interés a una traducción de 6 cuadros de la secuencia. Estas comparaciones resultan en una calificación BLAST de 70 (o en algunos casos 90) o mayor que no codifica proteínas conocidas se enjambraron y de ser necesarias ensamblaron en secuencias DNA consenso con el programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) . Con base en la secuencia descrita anteriormente, se sintetizaron oligonucléotidos : 1) para identificar por PCR una biblioteca cDNA que contiene la secuencia de interés, y 2) para utilizar como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud integral por PR087299. Cebadores PCR directos o inversos generalmente están en el rango de 20 a 30 nucleótidos y a menudo se designa para dar un producto PCR de aproximadamente 100-1000bp. Las secuencias de sonda típicamente son de 40-55bp de longitud. En algunos casos, oligonucléotidos adicionales se sintetizan cuando la secuencia consenso es mayor que aproximadamente 1-1.5kbp. Para supervisar varias bibliotecas para un clon de longitud íntegra, DNA de las bibliotecas se supervisa por amplificación PCR, de acuerdo con Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, supra, con él par cebador PCR. Una biblioteca positiva se utiliza entonces para aislar clones que codifican el gen de interés utilizando la sonda oligonucléotido y uno de los pares cebadores .

Las sondas oligonucleótidas empleadas fueron como sigue: cabador directo: hBTig.EcoRI.F2 5' TTGAATTCATGAAGACATTGCCTGCCATGC 3' (SEQ ID NO: 11) Cebador inverso: hBTig . BamHI . R2 5 ' TTGGATCCTTAACTCCTCACACATATGGATGCATATTC 3' (SEQ ID NO: 12) Una biblioteca cDNA de sangre humana se utiliza para clonación. La biblioteca cDNA utilizada para aislar los clones cDNA se construye por métodos estándar utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como aquellos de Invitrogen, San Diego, CA. El cDNA se cebó con oligo dT que contiene un sitio Notl enlazado con romo con adaptadores Salí hemiquinazados o hemicinados con Notl, y mencionados apropiadamente por electroforésis en gel, y clonados en una orientación definida en un vector de clonación conveniente (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio Sfil; ver Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) en los sitios únicos Xhol y Notl. Toda la secuencia de nucleótidos del clon, aquí designada como DNA332467, se ilustra en la figura 1 (SEQ ID NO: 1) . El clon DNA332467 contiene un solo marco de lectura abierto con un sitio de inicio de traducción aparente en posiciones del nucleótido 24-26 y una señal de parada en posiciones de nucleótido 891-893 (Figura 1, SEQ ID N0:1) . El precursor del polipéptidos pronosticado es de 289 aminoácidos de longitud, tienen peso molecular calculado de aproximadamente 32781 Daltons y una pl estimada de aproximadamente 6.27. Análisis de la secuencia PR087299 de longitud integra ilustrada en la Figura 2 (SEQ ID NO : 2 ) evidencia la presencia de una variedad de dominios polipéptido importantes como se ilustra en la Figura 2, en donde las ubicaciones dadas para esos dominios polipéptido son aproximadas como se describió. Un análisis de la base de datos de proteínas actual, utilizando el análisis de alineamiento de secuencia ALIGN-2 de la secuencia de longitud integra mostrada en la Figura 2 (SEQ ID NO:2), identidad de secuencia evidenciada entre la secuencia de amino ácidos PR087299 y no hay secuencias de proteínas conocidas. EJEMPLO 2: Clonación de variantes PR087299. PR087299 se superviso para variantes de secuencia en RNA de célula B de 16 diferentes donadores. RT-PCR se realizo en este RNA para producir el PR087299 de longitud integra. Los productos PCR se clonaron en vectores que permiten secuenciado de alto rendimiento y analizaron por secuencia de doble paso. Diversas variantes PR087299 mostraron variación mínima (Figura 11A-F) . Sin embargo, una versión truncada se encontró que fue eliminada de exon 3, que elimina el dominio de transmembrana (Figura 7, SEQ ID NO: 7). La versión truncada se elimina de ácidos nucleicos 403-547 de la proteína nativa, resultando en un polipéptido PR087299 variante (Figura 8, SEQ ID NO: 8) que solo tiene 241 amino ácidos de longitud, mientras que el PR087299 nativo es de 289 amino ácidos de longitud. Una falta de dominio transmembrana puede significar que esta variante PR087299 es una forma secretada. Se descubrió una variante PR087299 adicional, que comprende una inserción de 18 pares base nucleótido en el extremo 5' de exon 3 (Figura 9, SEQ ID N0:9). Esta inserción de 18 pares base codifica 6 amino ácidos adicionales (AFTNIP) , y se inserta en el ácido nucleico de codificación PR087299 en cuadro, resultando en un polipéptido PR087299 variante (Figura 10, SEQ ID NO: 10) que tiene 295 amino ácidos de longitud. Tanto la forma corta y como la forma AFTNIP se ilustran junto con otras variantes en la Figura 12A-B. El dominio IgG encontrado en los amino ácidos 51-117 de todo el polipéptido PR087299 puede ser importante para la función del polipéptido PR087299.

EJEMPLO 3: Análisis de Micro hilera de células T estimuladas Micro hileras de ácido nucleico, a menudo que contienen miles de secuencias de genes, son útiles para identificar genes expresados diferencialmente en tejidos enfermos en comparación con sus contrapartes normales. Utilizando micro hileras de ácido nucleico, muestras de mRNA de prueba y control de muestras de tejido de control y prueba se someten a trascripción inversa y etiquetan para generar sondas cDNA. Las sondas cDNA después se hibridizan a un arreglo o hilera de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. El arreglo o hilera se configura de manera tal que la secuencia y posición de cada miembro del arreglo se conoce. Por ejemplo, una selección de genes que se conoce se expresa en ciertos estados de enfermedad pueden arreglarse en un soporte sólido. La hibridación de una sonda etiquetada con un miembro de arreglo en particular indica que la muestra de la cual se derivo la sonda expresa ese gen. Si la señal de la hibridación de una sonda de una muestra de prueba (en este caso células T CD4+ activadas) es mayor que la señal de hibridación de una muestra de control (en este casos, células T CD4 + no estimuladas) , el o los genes sobre expresados en el tejido de prueba se identifican. La implicación de este resultado es que una proteína sobre expresada en un tejido de prueba es útil no solo como un marcador de diagnosticó por la presencia de la condición de enfermedad, sino también como una diana terapéutica para tratamiento de la condición de enfermedad. La metodología de hibridación de ácidos nucleicos y tecnología de micro hileras son bien conocidas en la técnica. En un ejemplo, la preparación específica de ácidos nucleicos para hibridación y sondas, porta objetos y condiciones de hibridación todos se detallan en la solicitud de patente PCT número de serie PCT/US01/10482, presentada en marzo 30, 2001 y que aquí se incorpora por referencia. En este experimento, Células T CD4+ se purificaron de un solo donador utilizando el protocolo RossetteSepMR de (Stem Cell Technologies, Vancouver BC) , que contiene anticuerpos anti-CD8, anti-CD16, anti-CD19, anti-CD36 y anti-CD56 para producir una población de células T CD4+ aisladas. Células T CD4+ aisladas se activaron con un anticuerpo anti-CD3 (empleando una concentración que no estimula la proliferación) junto con ya sea un anticuerpo ICAM-1 o anti-CD28. A 24 o 72 horas, las células se recolectaron, se extrajo RNA y el análisis se ejecuta en micro hileras AffimaxM (Affymetrix Inc. Santa Clara, CA) . Células no estimuladas (en reposo) se recolectaron inmediatamente después de purificación, y sometieron al mismo análisis. Se compararon genes de los cuales la expresión se incrementa en cualquiera de los dos puntos en tiempo en células activadas contra en reposo. El resultado de estos experimentos, es que polipéptidos PR087299 de la presente invención se sobre expresan significativamente en células T CD4+ aisladas activadas por anti-CD3/lCAM-l y anti-CD3/anti-CD28 en comparación con células T CD4+ en reposo aisladas. Como se describió anteriormente, estos datos demuestran que los polipéptidos PR087299de de la presente invención son útiles no solo como marcadores de diagnostico para la presencia de uno o más desordenes inmunes, sino también sirven como dianas terapéuticas para el tratamiento de esos desordenes inmunes. EJEMPLO 4: PR087299 en Linfoma. Linfoma es la sexta enfermedad más común en los E.U.A. Hubo un estimado de 43,000 nuevos casos de linfoma en los E.U.A. en 1990. Linfoma no Hodgkin representa la mayoría de los casos, con los casos de linfoma Hodgkin un segundo lugar distante. La incidencia de linfoma no Hodgkin aumenta progresivamente con la edad. Pero en la enfermedad de Hodgkin, hay alta incidencia en pacientes con edades 20-30, una meseta entre 30-55 y otro aumento 44 después de la edad de 55 años. Hombres tienen mayor riesgo tanto para la enfermedad de Hodgkin como linfoma no Hodgkin, en comparación con las mujeres. La manifestación clínica principal de linfoma maligno es el hinchado de nodos linfáticos y síntomas que incluyen fiebre, malestar y pérdida de peso. Sitios primarios comunes de linfoma incluyen nodos linfáticos supraclaviculares, axilares, de medio espino, peri aórticos, cervicales e inguinales. Linfoma también tiene el potencial por metástasis a otros órganos. La enfermedad de Hodgkin se describo primero por Thomas Hodgkin en 1832. La enfermedad de Hodgkin es una proliferación no restringida de una célula linfoide que se vuelve muy grande, con abundante citoplasma pálido y dos o más núcleos lobulados ovales que contienen nucléolos grandes. Células con esta apariencia se conocen como células Reed-Sternberg . Las células Reed-Sternberg son importantes para el diagnostico de la enfermedad de Hodgkin, pero su presencia sola no es suficiente para diagnostico. La enfermedad de hodgkin es distinta de linfoma no Hodgkin por el tipo de célula, histología de nodo linfático, y la sintomatología, tal como fiebre. La enfermedad de Hodgkin generalmente se presenta como un agrandamiento de un solo grupo de nodos linfáticos periféricos y puede involucrar nodos contiguos, pero infrecuentemente es extranodal . La causa de enfermedad de Hodgkin es desconocida, pero previa infección de Virus Epstein Barr y translocaciones bcl-2 están asociadas con el desarrollo de la enfermedad de Hodgkin. Los linfomas no-Hodgkin son neoplasmas del sistema inmune que surgen en nodos linfáticos, pero se diferencian de la enfermedad de Hodgkin por factores tales como el tipo de célula y la sintomatología exhibida por el paciente. La mayoría de los linfomas no Hodgkin son de fenotipo célula B y son positivos para los marcadores CD19 y CD20. Un número menor son linfomas de célula T y son positivos para los marcadores CD2 y CD3. Una base de datos de propiedad que contiene información de expresión de genes (GeneExpress® , Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD) se analizo en un intento por identificar si el polipéptido PR087299 (y sus ácidos nucleicos de codificación) se aumenta su expresión significativamente en linfoma en comparación con tejidos linfáticos normales. Específicamente, el análisis de la base de datos GeneExpress® se realiza utilizando ya sea soporte lógico disponible a través de Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD, para utilizar con la base de datos GeneExpress® o con soporte lógico de propiedades escrito y desarrollado en Genentech, Inc. para utilizar con la base de datos GeneExpress®. La calificación de aciertos positivo en el análisis se basa en varios criterios incluyendo por ejemplo, especificidad de tejido, especificidad de tumor y nivel de expresión en tejidos de proliferación normal y/o esencialmente normal. El resultado es que PR087299 no evidencia alta expresión en linfoma en comparación con otros tumores y tejidos normales . EJEMPLO 5: PR087299 en Enfermedad intestinal inflamatoria. En este experimento, un ensayo de micro hileras se emplea para encontrar genes que se sobre expresan en IBD en comparación con tejido intestinal normal. Biopsias de pacientes con IBD se obtuvieron. Por cada paciente IBD, se tomaron muestras de tejido enfermo (ya sea UC o Crohn) y de intestino sano, de manera tal que los patrones de expresión pudieron ser mejor comparados. Todas las muestras se almacenaros a -70 grados C hasta que están listos para aislamiento de RNA. Las biopsias se homogenizaron en 600 µ l de amortiguador RLT (+ BME) y RNA se aisló utilizando mini columnas QiagenMR. Rneasy (Qiagen) con tratamiento DNasa en columna siguiendo las guías del fabricante. Después de aislamiento RNA, RNA se cuantifico utilizando RiboGreenMR. (Molecular Probes) siguiendo las guías de los fabricantes y verifico en geles de agarosa por integridad. Cantidades apropiadas de RNA se etiquetaron para análisis de micro hilera y muestras se realizaron en micro hileras Genentech de propiedad y micro hileras AffymetricsMR. Se compararon genes de los cuales la expresión se aumenta en tejido IBD contra intestino normal, igualando biopsias de intestino normal y tejidos IBD del mismo paciente. Los resultados de este experimento mostraron que PR087299 se ha identificado como significativamente expresado en muestras de Enfermedad Crohn en comparación con tejido intestinal normal. EJEMPLO 6: Expresión de PR087299 en células NK. Células de estructuras naturales (NK Natural killer) son una célula de factor importante del sistema inmune innato. Se especializan en realizar exterminio contra células anfitrionas que ya han sido infectadas por virus, parásitos o que se han vuelto cancerosas. Fenotípicamente, células NK son grandes linfocitos granulares que constituyen -2% de la población de linfocitos en circulación. Comúnmente se identifican por expresión de superficie celular de CD56 y CD16. Maduran en la medula ósea de una célula precursora CD34+ que comparten con células T. La célula NK madura, comparte expresión de CD8 , maquinaria cito lítica y algunos KIRs, con células T, pero permanece distinta de células T por la falta de CD3 y los receptores de célula T. Como las células T citotóxicas, contienen granulos llenos con proteína formadora de poros, citotóxinas, serina esterasas y proteoglicanos que median la lisis de células diana. Tanto células T citotóxicas como las células NK exterminan en contacto al ligar a sus dianas y suministrar su ráfaga letal de productos químicos que producen orificios en la membrana celular diana. A diferencia de las células T citotóxicas, las células NK destructoras no requieren reconocer un antígeno específico antes de iniciar la lisis. Por el contrario, la activación de células NK puede mediarse por factores de crecimiento y citosinas (en particular, IL-2, IL-12 y IL-15 se han mostrado que median las actividades proliferativas y citotóxicas o por un equilibrio delicado entre dos clases de receptores de células NK, uno que activa las células, y otro que las inhibe. Receptores tipo Ig destructores (Kira Killer Ig-like receptors) son receptores de células NK que transmiten e inhiben señal si encuentran moléculas MHC clase I en una superficie celular. Esto es importante para exterminar tanto células cancerosas como células viralmente infectadas. Debido a que los virus a menudo suprimen la expresión MHC de clase I en células que infectan, la célula infectada con virus se vuelve susceptible a exterminio por células NK. Igualmente, células de cáncer tienen reducida o no tienen expresión MHC clase I y también se vuelven susceptibles a exterminio por células NK. Receptores de citotoxicidad natural (NCRs= Natural cytotoxicity receptors) constituye una familia de receptores de activación en células NK. En algunos sistemas efectores-diana, la densidad superficial de NCRs se correlaciona con la actividad cito lítica de las células NK, mientras que en otros sistemas, el exterminio requiere la cooperación entre NCR, otro receptor de activación NKG2D y su polipéptido adaptador DAP10. Adicionalmente, la resistencia de las señales puede ser influenciada por acoplamiento de co-receptores tales como 2B4 y NTB-A. Los ligandos para NCRs y NKG2D, hemoglutaninas y MICA, MICB respectivamente no se expresan por la mayoría de las células normales, sino se inducen en la mayoría de las líneas de células de tumor. Expresión de los ligándos por células de tumor dispara una respuesta inmune dramática que resulta en rechazo de células de tumor. La activación de células NK con IL-15 o IL-12 se ha mostrado que induce tanto efectos citotóxicos como proliferativos . La molécula de adhesión de unión 2 (JAM2 = Junctional adhesión molecule 2) se ha mostrado que liga a células NK y se ha teorizado que juega un papel en la extravasación de linfocitos a sitos de inflamación.

Por lo tanto, un experimento de micro hileras de DNA compara expresión diferencial de genes de estos tras modos de activación contra células NK en reposos, tienen el potencial para revelar genes novedosos o asociaciones de genes novedosos con actividad de células NK. Anticuerpos terapéutico, péptidos o moléculas pequeñas pueden desarrollarse a genes específico diana por estas micro hileras para el tratamiento de enfermedades y malignidades inflamatorias inmuno mediadas. Células NK de sangre periférica se aislaron de leukopacks por selección negativa utilizando el equipo de aislamiento de células NK con el sistema clasificador de células magnético MACSMR (Miltenyi Biotec) . La pureza celular se confirma al teñir con PE anti-CD56 para análisis FACS. La pureza de preparados celulares estuvo en el rango de 89% a 96%. Cultivo celular: Se disponen cultivos in vi tro en placas de 6 pozos 5 ml de cultivo/pozo. Medios: RPMI 1640, FBS inactivado con calor al 10%, 100 unidades/mL de Penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, y 5.5 x 10-5 Beta-mercaptoetanol . Tratamientos Experimentales : Tiempo 0 horas, células CD56 (+) sin tratar. Tiempo 16 horas. Sin tratar, IL2 (lOnM) , IL15(10nM), JAM-IT(lOnM) estimulado. Activación de células NK se supervisa por FACS para expresión de superficie celular de CD56 y CD69. En esta serie de experimentos se determina que PR087299 se expresa en células NK CD56+, cuando se compara con células NK en reposo normales. EJAMPLO 7:Uso de PR087299 como una sonda de hibridización El siguiente método describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica PR087299 como una sonda de hibridización. DNA que comprende la secuencia de codificación de PR087299 de longitud íntegra o maduro como se describe aquí, se emplea como una sonda para supervisar DNAs homólogos (tales como aquellos que codifican variantes de origen natural de PR087299) en bibliotecas cDNA de tejido humano o bibliotecas genómicas de tejido humano. Hibridización y lavado de filtros que contiene ya sea DNAs de biblioteca, se realiza bajo las siguientes condiciones de alta severidad. Hibridización de la sonda derivada PR087299 radio etiquetada a los filtros, se realiza en una solución de forma amida al 50%, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.1% pirofosfato de sodio, fosfato de sodio 50 mM, solución de Denhardt pH 6.8, solución de Denhardt 2x, y dextran sulfato al 10% a 42 grados C por 20 horas. El lavado de los filtros se realiza en una solución acuosa de SSC O.lx y SDS al 0.1% a 42 grados C. DNAs que tienen la identidad de secuencia deseada con el DNA que codifica PR087299 de secuencia nativa de longitud íntegra puede ser identificado utilizando técnicas estándar conocidas en la especialidad. EJEMPLO 8 : Expresión de PR087299 en E. coli Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada de PR087299 por expresión recombinante en E. coli . La secuencia de DNA que codifica PR087299 inicialmente se amplifica utilizando cebadores PCR selectos. Los cebadores deberán contener sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión selecto. Una variedad de vectores de expresión puede emplearse. Un ejemplo de un vector conveniente es pBR322 (derivado de E. coli; ver Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes de resistencia a tetraciclina y ampicilina. El vector se digiere con enzima de restricción y desfosforila. Las secuencias es amplificadas por PCR después se ligan en el vector. El vector de preferencia incluirá secuencias que codifican gen de resistencia a antibiótico, un promotor TRP, un líder polii (incluyendo los primeros 6 codones STII, secuencia polii y sitio de decisión de enterocinasa) , la región de codificación PR087299, terminador de transcripción lambda y un gen argU.

La mezcla de ligación después se utiliza para transformar una cepa E. coli selecta utilizando los métodos descritos en Sambrook et al., supra. Se identifican transformantes por su habilidad para desarrollar en placas LB y después se eligen colonias resistentes a antibióticos. DNA plásmido puede aislarse y confirmarse por análisis de restricción y secuenciado de DNA. Clones selectos pueden desarrollarse durante la noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo durante la noche puede subsecuentemente emplearse para inocular un cultivo a mayor escala. Las células después se desarrollan a una densidad óptica deseada, durante lo cual se activa el promotor de expresión. Después de cultivar las células por varias horas más, las células pueden ser cosechadas por centrifugación. El precipitado celular obtenido por la centrifugación puede solubilizarse utilizando diversos agentes conocidos en la especialidad y la proteína PR087299 solubilizada puede entonces ser purificada utilizando una columna de quelación de metal bajo condiciones que permiten fuerte enlace de la proteína. PR087299 puede expresarse en E. coli en una forma etiquetada poli-His, utilizando el siguiente procedimiento. El DNA que codifica PR087299 inicialmente se amplifica utilizando cebadores PCR selectos. Los cebadores contendrán sitios de enzima de restricción que corresponden a los sitios de enzima de restricción en el vector de expresión selecto, y otras secuencias útiles que proporcionan un inicio de traducción eficiente y confiable, rápida purificación en una columna de quelación de metal, y remoción proteolítica con eterocinasa. Las secuencias amplificadas por PCR, etiquetadas poli-His después se ligan en un vector de expresión, que se utiliza para transformar un anfitrión de E. coli con base en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP(lacIq). Los transformantes primero se desarrollan en LB que contienen 50 mg/ml de carbenicilina a 30 grados C con agitación hasta que se alcanza un O.D. 600 de 3-5. Cultivos se diluyen de 50 a 100 veces en medio CRAP (preparado al mezclar 3.57 g (NH4)2S04, 0.71 g de citrato de sodio «2H20, 1.07 g de KCl, 5.36 g de extracto de levadura Difco, 5.36 g de Sheffield hycase SF en 50 mL de agua así como MPOS 110 mM, pH 7.3, 0.55% (p/v) de glucosa y 7 mM MgS04) y desarrollar por aproximadamente 20 a 30 horas a 30 grados C con agitación. Las muestras se retiran para verificar la expresión por análisis SDS PAGE y el cultivo en volumen se centrifuga para precipitar las células. Los precipitados celulares se congelan hasta purificación y plegado . Pasta de E. coli de 0.5 a 1 L de fermentaciones (6 10 g de granulos) se resuspenden en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 M, Tris 20 mM, amortiguador pH 8. Sulfito de sodio sólido y tetrationato de sodio se agregan para constituir concentraciones finales de 0.1M y 0.02 M, respectivamente y la solución se agita durante la noche a 4 grados C. Esta etapa resulta en una proteína desnaturalizada con todos los residuos cisteína bloqueados por sulfitalización. La solución se centrifuga a 40,000 rpm en una ultra centrífuga Beckman por 30 min. El sobre nadante se diluye con 3,5 volúmenes de amortiguador de columna con quelato de metal (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7.4) y filtran a través de filtros de 0.22 mieras para clarificar. El extracto clarificado se carga en una columna de quelato de metal Ni-NTA Qiagen de ml equilibrada en el amortiguador de columna de quelato de metal . La columna se lava con amortiguador adicional que contiene imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol) pH 7.4. La proteína se eluye con amortiguador que contiene imidazol 250 mM. Fracciones que contienen la proteína deseada se reúnen y almacenan a 4 grados C. La concentración de proteínas se estima por su absorbancia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado con base en su secuencia de aminoácidos. Las proteínas se pliegan al diluir la muestra lentamente en amortiguador de plegado recientemente preparado que consiste de Tris 20 mM, pH 8.6, NaCL 0.3 M, urea 2.5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de plegado se eligen de manera tal que la concentración de proteína final esté entre 50 y 100 microgramos/ml . La solución de plegado se agita ligeramente a 4 grados C por 12 a 36 horas. La reacción de plegado se neutraliza por la adición de TFA a una concentración final de 0.4% (pH a aproximadamente 3) . Antes de mayor purificación de la proteína, la solución se filtra a través de un filtro de 0.22 mieras, y se agrega acetonitrilo a una concentración final de 2-10%. La proteína plegada se cromatografía en una columna fase inversa poros Rl/H utilizando un amortiguador móvil de TFA 0.1% con elusión con un gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Alicotas de fracciones con absorbancia A280 se analizan en geles SDS poliacrilamida y fracciones que contienen proteína plegada homogénea se reúnen. En general, las especies adecuadamente plegadas de la mayoría de las proteínas se eluyen a las más bajas concentraciones de acetonitrilo ya que esas especies son las más compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de interacción con resina de fase inversa.

Especies agregadas usualmente se eluyen a superiores concentraciones de acetonitrilo. Además, para resolver formas mal plegadas de proteínas de la forma deseada, la etapa de fase inversa, también elimina endotoxina de las muestras . Fracciones que contienen el polipéptido PR087299 plegado se reúnen y el acetonitrilo se retira utilizando una ligera corriente de nitrógeno dirigida a la solución. Se formulan proteínas en Hepes 20 mM, pH 6.8 con cloruro de sodio 0.14 M y manitol al 4% por diálisis o por filtración en gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el amortiguador de formulación y filtradas estériles. Los polipéptidos PR087299 aquí descritos se expresaron exitosamente como se describió con anterioridad. EJEMPLO 9: Expresión de PR087299 en células de mamífero Este ejemplo ilustra la preparación de una forma potencialmente glicosilada de PR087299 por expresión recombinante en células de mamífero. El vector, pRK5 (ver EP 307,247, publicado en marzo 15, 1989), se emplea como el vector de expresión.

Opcionalmente, el DNA PR087299 se liga en pRK5 con las enzimas de restricción selectas para permitir inserción del DNA PR087299 utilizando métodos de ligación tal como se describe en Sambrook et al., supra. El vector resultante se denomina pRK5-PR087299. En una modalidad, las células anfitrionas selectas pueden ser células 293. Células 293 humanas (ATCC CC1 1573) se desarrollan a confluencia en placas de cultivo de tejido en medio tal como DMEM suplementado con suero bovino fetal y opcionalmente componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 µg de DNA pRK5-PR087299 se mezclan con aproximadamente 1 µg de DNA que codifica el gen RNA VA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y disuelven en 500 µl de Tris-HCl lmM, EDTA 0.1 mM, CaCl2 0.227 M. A esta mezcla se agrega por gotas 500 µl de HEPES 50 mM (pH 7.35), NaCl 280 mM, NaP04 1.5 mM, y un precipitado se deja que se forme por 10 minutos a 25 grados C. El precipitado se suspende y agrega a la célula 293 y deja que sedimente por aproximadamente 4 horas a 37 grados C. El medio de cultivo se separa por aspiración y 2 ml de glicerol al 20% en PBS se agregan por 30 segundos. Las células 293 después se lavan con medio libre de suero, medio fresco se agrega y las células se incuban por aproximadamente 5 días . Aproximadamente 24 horas después de las tranfecciones , el medio de cultivo se retira y reemplaza con medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 200 µCi/ml de 35S de cisteína y 200 µCi/ml de 35S de metionina. Después de una incubación de 12 horas, el medio acondicionado se recolecta, concentra en un filtro de centrifugado y carga en el gel SDS al 15%. El gel procesado puede secarse y exponerse a película por un periodo de tiempo selecto para revelar la presencia del polipéptido PR087299. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden someterse a mayor incubación (en medio libre de suero) y el medio se prueba en bioensayos selectos. En una técnica alterna, PR087299 puede reproducirse en células 293 en forma transitoria o pasajera utilizando el método de transulfato descrito por Somparyrac et al., Proc. Nati. Acad. Sci., 12:7575 (1981) . Células 293 se desarrollan a densidad máxima en un matraz de centrifugado y 700 µg de DNA pRK5-PR087299 se agregan. Las células primero se concentran del matraz de centrifugado por centrifugación y lavan con PBS. El precipitado de DNA-dextran se incuba en el precipitado celular por 4 horas. Las células se tratan con glicerol al 20% por 90 segundos, lavan con medio de cultivo de tejido y reintroducen en el matraz de centrifugado que contiene medio de cultivo de tejido, 5 µg/ml de insulina bovina y 0.1 µg/ml de transferina bovina. Después de aproximadamente 4 días, el medio acondicionado se centrifuga y filtra para retirar células y desechos. La muestra que contiene PR087299 expresado después se concentra y purifica por cualquier método selecto, tal como diálisis y/o cromatografía en columna. En otra modalidad, PR087299 puede expresarse en células CHO. pRK5-PR087299 puede transíectarse en células CHO utilizando reactivos conocidos tales como CaP04 o DEAE-dextran. Como se describe anteriormente, los cultivos de células pueden incubarse, y el medio a reemplazarse con medio de cultivo (solo) o medio que contiene una radioetiqueta tal como 35S-methionine . Después de determinar la presencia de polipéptido PR087299, el medio de cultivo puedes ser reemplazado con medio libre de suero. De preferencia, los cultivos se incuban por aproximadamente 6 días, y después se cosecha el medio acondicionado. El medio que contiene el PR087299 expresado después puede concentrarse y purificarse por cualquier método selecto. PR087299 etiquetado con epítope también puede expresarse en células CHO anfitrionas. PR087299 puede subclonarse de vector pRK5. El inserto es un clon puede someterse a PCR para fusionar en cuadro con una etiqueta epítope selecta de manera tal como una etiqueta poli-his en un vector de expresión baculovirus. El inserto PR087299 etiquetado con poli-his puede ser subclonado en un vector que contiene mej orador/promotor SV40 que contiene un mercado de selección tal como DHFR para selección de Clones estables. Finalmente, las células CHO pueden transfectarse (como se describe anteriormente) con el vector que contiene el mej orador/promotor SV40. El etiquetado puede realizarse como se describe anteriormente para verificar expresión. El medio de cultivo que contiene el PR087299 etiquetado con poli-hys expresado puede ser entonces concentrado y purificado por cualquier método selecto tal como cromatografía definida quelato-Ni2+ . PR087299 también puede expresarse en células CHO y/COS por un procedimiento de expresión transitorio o en células CHO por otro procedimiento de expresión estable. Expresión estable en células CHO se realiza utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas se expresan como una construcción IgG (inmunoadhesina) , en donde las secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo dominios extracelulares) de las proteínas respectivas se fusionan a una secuencia de región constante IgGl que contiene la bisagra, dominios CH2 y CH2 y/o es una forma etiquetada poli-His. Después de amplificación PCR, los DNAs respectivos se subclonan en un vector de expresión CHO utilizando técnicas estándar como se describe en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997) . Vectores de expresión CHO se construyeron para tener sitios de restricción compatibles 5' y 3' del DNA de interés para permitir el entremezclado conveniente de los cDNA. El vector empleó expresión en células CHO como se describe en Lucas et al., Nucí. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996), y utiliza el mej orador/promotor temprano SV40 para dirigir la expresión del cDNA de interés y dihidrofolato reductasa (DHFR) . La expresión de DHFR permite selección de mantenimiento estable del plásmido después de transfección. Doce microgramos del DNA plásmido deseado se introducen en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando reactivos de transfección comercialmente disponibles Superfect® (Quiagen) , Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim) . Las células se desarrollan como se describe por Lucas et al., supra. Aproximadamente 3 x 10"7 células se congelan en una ampolleta para mayor crecimiento y producción como se describe a continuación. Las ampolletas que contienen el DNA plásmido se descongelan al colocar en un baño de agua y mezclan por torbellino. Los contenidos se transfieren por pipeta a un tubo de centrífuga que contiene 10 mL de medio y centrifugan a 1000 rpm por 5 minutos. El sobrenadante se aspira y las células se resuspenden en 10 mL de medio selectivo (0.2 µ m de PS20 filtrado con suero bovino fetal diafiltrado 0.2 µ m, al 5%) . Las células después se toman alícuotas en un centrifugador de 100 mL que contienen 90 mL de medio selectivo. Después de 1-2 días, las células se transfieren a un centrifugador de 250 mL lleno con 150 mL de medio de crecimiento selectivo e incuban a 37 grados C. Después de otros 2-3 días, centrifugadores de 250 mL, 500 mL y 2000 mL se siembran con 3 x 105 células/mL. El medio celular se intercambia con medio fresco por centrifugación y resuspensión en medio de producción. Aunque cualquier medio CHO conveniente puede emplearse, puede actualmente utilizarse un medio de producción descrito en la patente de los E.U.A. No. 5,122,469, otorgada en junio 16, 1992. Un centrifugador de producción de 3 L se siembra a 1.2 x 106 células/mL. El día 0, se determina el pH. El día 1, el centrifugador se muestrea y el burbujeo con aire filtrado se inicia. El día 2, el centrifugador se muestrea, se cambia la temperatura a 33 grados C, y 30 mL de 500 g/L de glucosa y 0.6 mL de antiespuma al 10% (por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsión) se toma. A través de la producción, el pH se ajusta según sea necesario para mantenerlo alrededor de 7.2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad bajo a menos de 70%, el cultivo celular se recolecta por centrifugación y filtra a través de un filtro a 0.22 µ m . El filtrado ya se almacena a 4 grados C o carga inmediatamente en columnas para purificación. Para las construcciones etiquetas con poli-His, las proteínas se purificaron utilizando una columna Ni-NTA (Qiagen) . Antes de purificación, se agrega imidazol al medio acondicionado a una concentración de 5 mM. El medio acondicionado se bombea en una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada en Hepes 20 mM, pH 7.4, amortiguador que contiene NaCl 0.3 M e imidazol 5 mM a un gasto de flujo de 4-5 ml/min. a 4 grados C. Después de cargar, la columna se lava con amortiguador de equilibrio adicional y la proteína se eluye con amortiguador de equilibrio que contiene imidazol 0.25 M. La proteína altamente purificada subsecuentemente desalifica en un amortiguador de almacenamiento que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0.14 M y manitol al 4%, pH 6.8, con una columna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y almacena a -80 grados C. Construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fe) se purifican del medio acondicionado como sigue. El medio acondicionado se bombea en una columna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que se ha equilibrado en amortiguador fosfato de Na 20 mM, pH 6.8. Después de cargar, la columna se lava extensamente con amortiguador de equilibrio antes de elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3.5. La proteína eluida se neutraliza inmediatamente al recolectar fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 µl de amortiguador Tris 1 M Tris, pH 9. La proteína altamente purificada subsecuentemente desalifica en amortiguador de almacenamiento como se describió con anterioridad para las proteínas etiquetadas poli-His. Se estima la homogeneidad por geles SDS poliacrilamida y por secuenciado de amino ácido N-terminal por degradación Edman . Muchos de los polipéptidos PR087299 aquí descritos se expresaron exitosamente como se describió con anterioridad. EJEMPLO 10: Expresión de PR087299 en Levadura El siguiente método describe expresión recombinante de PR087299 en levadura. Primero, vectores de expresión de levadura se construyen para producción intracelular o secreción de PR087299 del promotor ADH2/GAPDH. DNA que codifica PR087299 y el promotor se insertan en sitios de enzima de restricción convenientes en el plásmido selecto para dirigir expresión intracelular de PR087299. Para secreción, DNA que codifica PR087299 puede clonarse en el plásmido selecto, junto con DNA que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido de señal PR087299 nativo u otro péptido de señal de mamífero, o por ejemplo, un factor alfa de levadura o secuencia líder/señal secretoria de invertasa, y secuencias enlazadoras (si se requieren) para expresión de PR087299. Células de levadura, tales como la cepa de levadura AB110, pueden ser transformadas entonces con plásmidos de expresión anteriormente descritos y cultivadas en medio de fermentación selecto. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden analizarse por precipitación con ácido tricloroacétido al 10% y separación por SDS-PAGE, seguido por tinción de los geles con tinción Azul de Coomassie. PR087299 recombinante puede ser aislado subsecuentemente y purificado al retirar las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación y después concentrar el medio utilizando filtros de cartucho selectos. El concentrado que contiene PR087299 además puede purificarse utilizando resinas de cromatografía en columna selectas. Muchos de los polipéptidos PR087299 aquí descritos se expresaron exitosamente como se describió con anterioridad. EJEMPLO 11: Expresión de PR087299 en Células de Insecto Infectadas con Baculovirus El siguiente método describe expresión recombinante de PR087299 en células de insecto infectadas en Baculovirus. La codificación de secuencia para PR087299 se fusiona corriente arriba de una etiqueta de epítope contenida dentro de un vector de expresión de baculovirus. Estas etiquetas epítope incluyen etiquetas poli-his y etiquetas de inmunoglobulina (como regiones Fe de IgG) . Una variedad de plásmidos puede emplearse, incluyendo plásmido derivado de plásmidos comercialmente disponibles, tales como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia que codifica PR087299 o la porción deseada de la secuencia de codificación de PR087299 tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular, se amplifica por PCR con sebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El sebador 5' puede incorporar sitios de enzima de restricción de flanqueo (selectos) . El producto entonces se digiere con aquellas enzimas de restricción selectas y subclona en el vector de expresión. Baculovirus recombinantes se generan por co-transfección del plásmido anterior y DNA de virus BaculoGoldMR (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ( "Sf9 " ) (ATCC CRL 1711 ) utilizando lipofectina (comercialmente disponible de GIBCO-BRL) . Después de 4 -5 días de incubación a 28 grados C, los virus desprendidos o liberados se cosechan y utilizan para mayores amplificaciones. Infección viral y expresión de proteínas se realizan como se describe por O'Reilley et al . , Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual , Oxford: Oxford University Press (1994) . PR087299 etiquetado con Poli-his expresaron puede entonces ser purificado, por ejemplo por cromatografía de afinidad quelato-Ni2+ como sigue. Se preparan extractos de células Sf9 infectadas con virus recombinante como se describió por Rupert et al . , Nature, 362:175-179 (1993). Brevemente, células Sf9 se lavan, resuspenden en amortiguador de sonicación (Hepes 25 mL, pH 7.9; MgC12 12.5 mM; EDTA 0.1 mM; glicerol al 10%; NP-40 al 0.1%; KCl 0.4 M) , y sonicaron dos veces por 20 segundos en hielo. Los sonicados se liberan por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en amortiguador de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7.8) y filtran a través de un filtro de 0.45 µ m . Una columna de agarosa NÍ2+-NTA (comercialmente disponible de Qiagen) se prepara con un volumen de lecho de 5 mL, lava con 25 mL de agua y equilibra con 25 mL de amortiguador de carga. El extracto celular filtrado se carga la columna a 0.5 mL por minuto. La columna se lava a línea base a A28o con amortiguador de carga, en cuyo punto se inicia la recolección de fracciones. A continuación, la columna se lava con un amortiguador de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol 10%, pH 6.0), que eluye proteína no específicamente ligada. Después de alcanzar de nuevo la línea base A28o, la columna se revela con un gradiente de 0 a 500 mM de imidazol en el amortiguador de lavado secundario. Fracciones de 1 mL se recolectan y analizan por SDS-PAGE y tinción con plata o transferencia Western con Ni2+-NTA-conjugado con fosfatasa alcalina (Qiagen) . Fracciones que contienen el PR087299 etiquetado con His?0 se reúnen y dializan contra amortiguador de carga. En forma alterna, purificación del PR087299 etiquetado con IgG (o etiquetado Fe) puede realizarse utilizando técnicas de cromatografía conocidos, incluyendo por ejemplo, cromatografía en columna de Proteína G o Proteína A. Muchos de los polipéptidos PR087299 aquí descritos se expresaron exitosamente como se describió con anterioridad. EJEMPLO 12: Preparación de Anticuerpos que Ligan PR087299 Anticuerpos que ligan específicamente PR087299 se generaron por inmunización de ratones con construcción Fc-PR087299. Esta construcción se elaboró al ligar la región que codifica dominio extracelular de PR087299 (amino ácidos 1-155) en un plásmido que contiene un dominio Fe humano, haciendo de esta manera una quimera PR087299 (ECD) -Fe. Esta proteína se produce, purifica e inyecta en la planta de la pata de ratones . Técnicas para producir anticuerpos monoclonales se conocen en la especialidad y se describen, por ejemplo en Goding, supra. Ratones, tales como Balb/c, se inmunizaron con la quimera PR087299 (ECD) -Fe emulsificada en adyuvante completo de Freund e inyectan subcutánea e intraperitonealmente en una cantidad desde 1-100 microgramos. En forma alterna, el inmunogeno se emulsifica en adyuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e inyecta en las plantas de las patas traseras de los animales. Los ratones inmunizados se reforzaron 10 a 12 días después con quimera PR087299 (ECD) -Fe adicional emulsificada en el adyuvante selecto. Posteriormente, por varias semanas, los ratones también pueden ser reforzados con inyecciones de inmunización adicionales. Muestras de suero se obtuvieron periódicamente de los ratones por sangrado retro-orbital para prueba en ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-PR087299. Después de que se detecta un título de anticuerpo conveniente, los animales "positivo" para anticuerpos se inyectaron con una inyección intravenosa final de quimera PR087299 (ECD) -Fe . Tres a cuatro días después, los ratones se sacrificaron y las células de vaso se recolectan. Las células de vaso se fusionan (utilizando polietilen glicol al 35%) a una línea celular de mieloma murino selecto tal como P3X63AgU.l, disponible de ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que después se revisten en placas de cultivo de tejido de 96 pozos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina, y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma, e híbridos de células de vaso. Las células de hibridoma se supervisaron en una ELISA para reactividad contra PR087299. Nueve anticuerpos se generaron que específicamente ligan a PR087299. Las células de hibridoma positivas se inyectan intraperitonealmente en ratones Balb/c singenéicos para producir ascitos que contienen anticuerpos monoclonales anti-PR087299. En forma alterna, las células de hibridoma pueden desarrollarse en matraces de cultivo de tejido o botellas giratorias. Purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascitos se logra utilizando precipitación de sulfato de amonio, seguido por cromatografía de exclusión de gel . En forma alterna, cromatografía de afinidad basada en ligar de anticuerpo a proteína A o proteína G puede emplearse. Como se estableció previamente, se generaron nueve (9) anticuerpos que ligan específicamente a PR087299. De estos nueve, el anticuerpo designado 5F5.1, se determina que es un anticuerpo agonista. La actividad agonista se determina al inhibir la proliferación de células T CD4+. Células T CD 4+ se aislaron de sangre humana como se describió previamente en el Ejemplo 2, y cultivaron con anticuerpos ligados a placas reticuladas o entrelazadas. Placas de 96 pozos se prepararon por incubación durante la noche a 37 grados C con IgG a cabra-anti -ratón a una concentración de 10 /g/ml y lavaron con PBS para retirar el exceso. Anticuerpos anti-CD3/anti-CD28 se agregan a las placas revestidas con IgG con o sin el anticuerpo anti-PR087229. La combinación de anti-CD3 (0.1 g/ml) y anti-CD28 (0.25 //g/ml) estimuló la proliferación de células T CD4+ , y la adición del anticuerpo anti-PR087299 reduce la proliferación 5 veces como se mide por absorción de timidina (Figura 13) . Anticuerpo anti-CD3 solo no mostró proliferación, y un anticuerpo de control tampoco mostró proliferación. La actividad agonista del anticuerpo anti-PR087299 5F5.1 puede ser abolida por inactivación térmica. La línea de hibridoma 5F5.1 se deposita con ATCC bajo el Tratado de Budapest (ver Ejemplo 19) . Se realizó un segundo experimento utilizando anticuerpos solubles. Anti-CD3 (10 /g/ml) y anti-CD28 (5 //g/ml) cuando se agregan al medio de cultivo celular también mostraron incremento en proliferación de células T CD 4+. Anticuerpo anti-PR087299 agregado en el medio de cultivo celular con los dos anticuerpos estimulatorios mostró inhibición de proliferación de células T CD4+ hasta el 50%. El rango de anticuerpo anti-PR087299 empleado fue 5-200 //g/ml, y la inhibción de proliferación de célula T CD4+ fue dependiente de dosis en este rango. Un anticuerpo que liga específicamente PR087299 pero no tiene un efecto agonista es el anticuerpo 5E10.

Este anticuerpo se muestra que reconoce PR087299 en células B primarias y células T CD4+. También puede reconocer células transfectadas con PR087299 utilizando análisis FACS. El anticuerpo 5E10 consistentemente no tuvo efecto agonista. Por lo tanto, anticuerpos que ligan específicamente PR087299 se han generado. Anticuerpos antagonistas anti-PR087299 tienen utilidad para estimular una respuesta inmune que puede ser útil para tratar deficiencias inmunes y proteger contra infección por patógenos. Anticuerpos agonistas anti-PR087299 tienen utilidad para reducer la proliferación de células T CD4+, disminuyendo la respuesta inmune, y serán útiles para tratar enfermedades autoinmunes, linfoma y enfermedad de intestino inflamatorio. EJEMPLO 13: Purificación de Polipéptidos PR087299 Utilizando Anticuerpos Específicos EJEMPLO 13; Purificación de Polipéptidos PR087299 Utilizando Anticuerpos Específicos Polipéptidos PR087299 sin tratamiento previo o recombinantes pueden purificarse por una variedad de técnicas estándar en la especialidad de purificación de proteínas. Por ejemplo, el polipéptido pro-PR087299, polipéptido PR087299 maduro o pre-PR087299 se purifica por cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos para el polipéptido PR087299 de interés. En general, una columna de inmunoafinidad se construye al acoplar covalentemente el anticuerpo polipéptido PR087299 a resina cromatográfica activada. Se preparan inmunoglobulinas policlonales a partir de suero inmune ya sea por precipitación con sulfato de amonio o por purificación en proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Igualmente, anticuerpos monoclonales se preparan a partir de fluido de ascitos de ratón por precipitación de sulfato de amonio o cromatografía en proteína A inmovilizada. Inmunoglobulina parcialmente purificada se conecta covalentemente a una resina cromatográfica tal como SEPHAROSETMMR CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology) . El anticuerpo se aclopa a la resina, la resina se bloquea y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esta columna de inmunoafinidad se utiliza en la purificación de polipéptido PR087299 al preparar una fracción de células que contienen polipéptido PR087299 en una forma soluble. Esta preparación se deriva por solubilización de la célula entera o de una fracción subcelular que se obtiene mediante centrifugación diferencial por la adición de detergente o por otros métodos bien conocidos en la especialidad. En forma alterna, polipéptido PR087299 soluble que contiene una secuencia de señal, puede secretarse en cantidad útil en el medio en donde se desarrollan las células. Una preparación que contiene polipéptido PR087299 soluble se pasa sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava bajo condiciones que permiten la absorbancia preferencial de polipéptido PR087299 (por ejemplo amortiguadores de alta concentración iónica en la presencia de detergente) .

Después, la columna se eluye bajo condiciones que rompen el enlace de polipéptido PR087299/anticuerpo (por ejemplo un amortiguador de bajo pH tal como aproximadamente pH 2 3, o una alta concentración de un caotropo tal como urea o ion tiocianato) y se recolecta el polipéptido PR087299. EJEMPLO 14 : Supervisión de Droga Ésta invención es particularmente útil para supervisar compuestos al utilizar polipéptidos PR087299 o su fragmento de enlace en cualquiera de una variedad de técnicas de supervisión de droga. El polipéptido PR087299 o fragmento empleado en esta prueba ya puede estar libre en solución, fijo a un soporte sólido, transportado en una superficie celular o ubicado intracelularmente. Un método para supervisión de droga utiliza células anfitrionas eucarióticas o procarióticas que se transforman de manera estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido PR087299 o fragmento. Drogas se supervisan contra estas células transformadas en ensayos de enlace competitivos. Estas células, ya sea en forma viable o fija, pueden utilizarse para ensayos de enlace estándar. Se puede medir por ejemplo la formación de complejos entre polipéptido PR087299 o fragmento y el agente que se prueba. De manera alterna, se puede examinar la disminución en formación de complejo entre el polipéptido PR087299 y su célula diana o receptores diana provocada por el agente que se prueba. De esta manera, la presente invención proporciona métodos para supervisar drogas o cualesquiera otro agentes que puedan afectar una enfermedad o desorden asociado con polipéptido PR087299. Estos métodos comprenden contactar este agente con un polipéptido PR087299 o su fragmento y ensayar (i) por la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido PR087299 o fragmento, o (ii) la presencia de un complejo entre el polipéptido PR087299 o fragmento y la célula, por métodos bien conocidos en la técnica. En estos ensayos de enlace competitivos, el polipéptido PR087299 o fragmento típicamente se etiqueta. Después de adecuada incubación, polipéptido PR087299 libre o fragmento se separa de aquel presente en la forma ligada, y la cantidad de etiqueta libre o sin complejar es una medida de la capacidad del agente particular para ligar al polipéptido PR087299 o interferir con el complejo de polipéptido PR087299/célula. Otra técnica para supervisión de droga proporciona supervisión de alto rendimiento para compuestos que tienen afinidad de enlace conveniente a un polipéptido y se describen en detalle en WO84/03564, publicada en septiembre 13, 1984. Dicho brevemente, grandes cantidades de diferentes compuestos de pruebas de péptido pequeño se sintetizan en un substrato sólido, tales como pasadores de plástico o alguna otra superficie. Como se aplica a un polipéptido PR087299, los compuestos de prueba de péptido se reaccionan con el polipéptido PR087299 y lavan. Polipéptido PR087299 ligado se detecta por métodos bien conocidos en especialidad. Polipéptido PR087299 purificado también puede revestirse directamente sobre placas para utilizar en las técnicas de supervisión de droga anteriormente mencionadas. Además, anticuerpos no neutralizantes pueden emplearse para capturar el péptido e inmovilizarlo en el soporte sólido . Esta invención también contempla el uso de ensayos de supervisión de droga competitivos en donde anticuerpos neutralizantes capaz de ligar polipéptido PR087299 compiten específicamente con un compuesto de prueba para ligar al polipéptido PR087299 o sus fragmentos. De esta manera, los anticuerpos pueden emplearse para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con el polipéptido PR087299. EJEMPLO 15: Diseño Racional de Droga La meta de diseño de droga racional es producir análogos estructurales de polipéptido biológicamente activo de interés (es decir un polipéptido PR087299) o de moléculas pequeñas con las cuales interactúa, por ejemplo agonistas, antagonistas o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos puede utilizarse para adaptar drogas que son formas más activas o estables del polipéptido PR087299 o que mejoran o interfieren con la función del polipéptido PR087299 in vivo (c.f., Hodgson, Bio/Technology, 9: 19 21 (1991)). 19-21 (1991)). En un enfoque, la estructura tridimensional del polipéptido PR087299, o de un complejo inhibidor polipéptido PR087299, se determina por cristalografía de rayos X, por modelado con computadora o más típicamente por una combinación de los dos enfoques. Tanto la forma y cargas del polipéptido PR087299 deben evaluarse para elucidar la estructura y determinar el o los sitios activos de la molécula. Menos a menudo, información útil respecto a la estructura del polipéptido PR087299 puede lograrse al modelar con base en la estructura de las proteínas homologas. En ambos casos, información estructural relevante se emplea para diseñar moléculas tipo polipéptido PR087299 análogas o para identificar inhibidores eficientes. Ejemplos útiles de diseño de droga racional pueden incluir moléculas que tienen actividad o estabilidad mejorada como se muestra por Braxton and Wells, Biochemistry, 31:7796 7801 (1992), o que actúan como inhibidores agonistas o antagonistas de péptidos nativos como se ilustra por Athauda et al., J. Biochem., 113:742 746 (1993). También es posible aislar un anticuerpo específico diana, seleccionado por ensayo funcional, como se describió con anterioridad, y después resolver su estructura cristalina. Este enfoque en principio da por resultado un núcleo farmacéutico (pharmacore) en el cual puede basarse subsecuente diseño de droga. Es posible el superar la cristalografía de proteína totalmente al generar anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) a un anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Como una imagen en el espejo de una imagen en el espejo, el sitio de enlaces de los anti-ids se esperará que sea análogo al receptor original. El anti-id puede entonces utilizarse para identificar y aislar péptidos de bancos que péptidos química o biológicamente producidos. Los péptidos aislados entonces actuarán como el núcleo farmacéutico.

En virtud de la presente invención, cantidades suficientes de polipéptido PR087299 pueden hacerse disponibles para realizar estudios analíticos tales como cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido PR087299 que aquí se proporciona, suministrará guía a aquellos que emplea técnicas de modulado por computadora en lugar de o además de cristalografía de rayos X. EJEMPLO 16- PR087299 específicamente liga HVEM Supervisión de biblioteca de proteínas determina que PR087299 liga específicamente a HVEM. El dominio extracelular de PR087299 se fusiona a Fe humano para crear PR087299 (ECD) -Fe. Esta proteína de fusión se acopla con amina a un chip sensor CM5 BiacorMR (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a aproximadamente 9000 unidades de respuesta como se describe generalmente en Chen, Y. et al., J. Mol Biol 293:865-881 (1999) . Brevemente, chips biosensores de dextran carboximetilado (CM5, BIAcoreMR Inc.) se activaron con hidrocloruro de N- etil -N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (?HS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. PR087299 (ECD) -Fe se diluye e inyecta a un gasto de flujo para lograr aproximadamente 9000 unidades de respuesta (RU = response units) de proteína acoplada. En una segunda celda de flujo en el mismo chip, una proteína de control, PR04346-Fc humana (nombre de acceso Genbank AK057097) , se acopló por amina a aproximadamente 18500 unidades de respuesta. Una inyección de etanolamina 1M se realiza para bloquear grupos sin reaccionar. Proteínas individuales de la biblioteca de proteínas SPDI, que consisten de aproximadamente 2000 proteínas después se inyectaron a una concentración de 2µg/ml y se estimó el enlace por cambio en unidad de respuesta como función del tiempo. HVEM se encontró que liga PR087299 (ECD) -Fe pero no el control PR04346-Fc. Como se ilustra en la Figura 14, la asociación de PR087299 y HVEM resulta en un aumento altamente significante de 1200 unidades de respuesta sobre el control. Velocidades de asociación (Kon) y velocidades de disociación (Koff) se calcularon utilizando un modelo de enlace Langmuir uno-a-uno simple (Soporte Lógico de Evaluación BIAcoreMR versión 3.2) al ajustar simultáneamente el sensorgrama de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calculó como la proporción koff/k0n- PR087299 liga selectivamente a HVEM como se ilustra en la Figura 15. En este experimento, PR087299 (ECD) -Fe y los miembros de familia CD28 hCTLA4-Fc, hPD- 1-Fc, hICOS-Fc o hCD28-Fc se acoplaron por amina a un chip CM5 BiacorMR a aproximadamente 8000 unidades de respuesta. Cada uno se ensayó por su habilidad para ligar HVEM. Una proteína HVEM-Fc se elaboró al ligar los ácidos nucleicos que codifican aminoácidos 1-199 de HVEM a un Fe, resultando en una proteína de fusión HVEM-Fc. Este HVEM-Fc se clona en un vector de expresión que producirá la proteína de fusión cuando se transfecte en forma estable en células CHO. Todas las proteínas etiquetadas Fe se purificaron a más de 90% en pureza por cromatografía de afinidad utilizando Proteína A SefaroseMR (Amersham) . El resultado fue 2µg/ml o HVEM-Fc inyectado a 5µl/min ligado selectivamente a PR087299 y no al otro miembro de miembro de la familia CD28 probados. La actividad de cada miembro de la familia CD28 se confirma positiva al probar la respuesta de enlace a sus ligandos conocidos (datos no mostrados) (miembros de la familia CD28 y ligandos se adquirieron de R&D systems) . El enlace de PR087299 con HVEM dependen del pH pero es independiente de la concentración de NaCl . Utilizando el ensayo BiacorMR como se describió anteriormente, dos purificaciones independientes de HVEM-Fc ligan amina PR087299 acoplada al chip CM5 BiacoreMR. Como se ilustra en la Figura 16, el enlace no se interrumpe por tratamiento con NaCl 2.5 M; por el complejo PR087299/HVEM puede disociarse con glicina lOmM a pH 3.0. Interacción PR087299/HVEM puede bloquearse por anticuerpos a PR087299. En este experimento, HVEM-Fc se acopló con amina a un chip sensor CM5 BiacorMR a aproximadamente 7500 unidades de respuesta. Inyecciones de PR087299 (ECD) -Fe se realizaron a dos minutos a un gasto de flujo de 5µl/min. Unidades de respuestas (RU) se registraron 105 segundos después de inyección. PR087299 (ECD) -Fe (8nM) dio una respuesta de 100 RUs . Cada anticuerpo a concentración incrementada, se premezcló con PR087299 (ECD) -Fe (8nM) e incubó por una hora. El enlace de cada muestra después se midió en orden aleatorio y en duplicado, y glicina lOmM ph 2.5 se utiliza para regenerar la superficie de enlace después de cada inyección. Como se ilustra en la Figura 18, anticuerpos 5E10 y 3B1.9 anti-PR087299 bloquean el enlace de PR087299 en HVEM en una forma dependiente de concentración, mientras que el anticuerpo agonista 5F5.1 no tiene efecto de bloqueo. Inyecciones de anticuerpos solas no mostraron enlace al HVEM inmovilizado (datos no mostrados) . Concentraciones se calcularon con base en el peso molecular reducido aparente de PR087299 (ECD) -Fe (55 kDa) y una masa de anticuerpo de 150 kDa. PR087299 liga a HVEM en un ensayo basado en células. En este experimento, células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se desarrollan a confluencia en placas de cultivo de tejido en un medio tal como DMEM suplementado con suero bovino fetal y opcionalmente, componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente lOµg de DNA pRK5-HVEM se mezclan con aproximadamente 1 µg de DNA que codifica el gen RNA VA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y disuelto en 500 µl de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0.1 mM, CaC12 0.227 M. A esta mezcla, se agrega por gotas 500 µl de HEPES 50 mM (pH 7.35), NaCl 280 mM, NaP04 1.5 mM, y un precipitado se deja que se forme por 10 minutos a 25 grados C. El precipitado se suspende y agrega a las células 293 y deja que sedimenten por aproximadamente cuatro horas a 37 grados C. El medio de cultivo se aspira y 2 ml de glicerol al 20% en PBS se agregan por 30 segundos. Las células 293 después se lavan con medio libre de suero, medio fresco se agrega y las células se incuban por aproximadamente 5 días. En forma alterna, aproximadamente 10 µg de DNA pRK5-HVEM se mezclan con reactivo LipofectAMINMR (Gibco/BRL, Gaithersburg MD) y se realiza transfección al seguir las instrucciones de fabricante. Después de que se transfectan las células 293 con HVEM se incuban con PR087299 (ECD) -Fe radioetiquetado I125 y se deja que ocurra el enlace. El PR087299 radioetiquetado después se hace incompetente con PR087299 (ECD) -Fe no etiquetado y el número estimado de sitios de enlace totales y la constante de disociación (Kd) determina por análisis Scatchard. La Figura 17 (A) es un trazo Scatchard y la Figura 17 (B) es un atraso de desplazamiento que muestra enlace PR087299 (ECD) -Fe con células transfectadas transitoriamente con HVEM. Estos datos muestran que la Kd de PR087299 es aproximadamente 25nM. Enlace total de PR087299 (ECD) -Fe radioetiquetado para imitar células HEK 293 transfectadas fue 2.5% de aquel de células transfectadas HVEM (datos no mostrados) . Utilizando esta metodología, la afinidad de interacciones HVEM/LIGHT/PR087299 se determinó. Esto se ilustra en la Tabla 7 siguiente. Tabla 7 El anticuerpo anti-PR087299 (3B1.9) compitió en forma dependiente de dosis con enlace de PR087299 (ECD) -Fe a HVEM como se discutió previamente en este Ejemplo. Tomados en conjunto, estos datos muestran que PR087299 liga específicamente a HVEM como se determina por ensayo mediante interacción de proteína-proteína, bloqueo de proteína-anticuerpo y análisis in vivo . EJEMPLO 17 - PR087299 y LIGHT pueden ligar HVEM simultáneamente . Publicaciones han mostrado que LIGHT (GenBank Accession No: NM_172014, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 6) puede ligar a HVEM (Marsters, S.A. et al., Curr. Biol. 8 (9), 525-528 (1998). Mauri D.N. et al., Immunity (8), 21-30, (1998)). Para confirmar que LIGHT y PR087299 pueden ligar HVEM simultáneamente, realizamos un experimento coenlace. HVEM-Fc se acoplo por amina al chip sensor CM5 BiacoreMR a -150 unidades de response. La menor cantidad de HVEM-Fc inmovilizado fue importante para alcanzar enlace de casi saturación de PR087299-FC La Figura 19 muestra que LIGHT (25nM) y PR087299-Fc (17nM) se inyectaron independientemente a 5//l/min por 1200 segundos (curvas roja y azul, respectivamente). Después, una mezcla de LIGHT y PR087299-Fc a las mismas concentraciones finales se inyectó en forma idéntica (curva verde) . La suma calculada de los sensorgramas LIGHT y PR087299-Fc inyectados individualmente (curva gris) correspondió cercanamente con los datos experimentales, confirmando que LIGHT y PR087299 son capases de ligar HVEM simultáneamente. Las concentraciones se basaron en el monómero LIGHT de peso molecular de 25 kDa y el peso molecular reducido de PR087299-FC (55 kDa) . La interacción de PR087299 con HVEM no se bloquea por LIGHT. PR087299-FC se acopló con amina a un chip sensor BiacoreMR CM5 a -9800 unidades de respuesta. LIGHT (adquirido de AlexisMR, Cat. #552-018-C010) se incubó a las crecientes concentraciones con 4nM HVEM por 1 hora. Como se muestra en la Figura 20, enlace de PR087299-Fc/HVEM no se bloquea por crecientes concentraciones de LIGHT a una concentración final de 300 nM. Actividad de LIGHT se confirmó al enlazar con HVEM-Fe inmovilizado en un chip sensor CM5 (datos no mostrados) . LIGHT solo no liga a PR087299-Fc inmovilizado (datos no mostrados) . Todos los sensorgramas de enlace se corrieron en orden al azar y en duplicado. Unidades de respuesta se registraron como la diferencia entre línea base y 15 segundos antes del fin de una inyección de 2 minutos a 5 /l/min. Concentraciones se basan en peso moleculares de 25 kDa para monómero LIGHT y 55kDa para monómero HVEM. Estos datos muestran que LIGHT no bloquea enlace de HVEM con PR087299. HVEM se identificó inicialmente como el receptor celular para la entrada del virus herpes simplex-1 (HSV-1) en la célula, y se mostró que ligar HSV-1 glicoproteína D (gD) (Mongomery et al., Cell 87:427-436 (1996)). HVEM contienen tres dominios ricos en cisteína (CRD) que es una característica estructural común a todos los miembros de la familia TNFR. La resolución de la estructura de cristal de proteína gD en complejo con HVEM, mostró que el primer CRD de HVEM liga a la proteína gD, mientras que el segundo CRD de HVEM proporciona soporte estructural para el primer CRD (Carfi et al., Mol. Cell 8:169-179 (2001)). El resultado es que PR087299 interactúa con LIGHT y no compite por enlace HVEM, lleva a la hipótesis que PR087299 interactúa con la superficie externa del complejo HVEM/LIGHT. Para probar esta hipótesis, se genera un péptido derivado fago (BP-2) que es capaz de bloquear enlace HVEM a la glicoproteína de herpes D (gD) , pero no a LIGHT (Sarrias et al., Mol. Immuno. 37:665-673: (2000)). A concentraciones que inhiben enlace gD, BP-2 inhibió el enlace de PR087299 a HVEM (Figura 21A) . En una comparación directa, una proteína gD recombinante (? 290-299 forma. Milne et al., J Virology. 77:8962-8972 (2003)) también inhibió enlace de HVEM a PR087299 (Figura 21B) . Este resultado se repitió en ensayos de enlace de célula que muestran que gD recombinante (? 290-299) inhibe el enlace de PR087299-Fc soluble y HVEM-Fc a células 293 expresan HVEM o PR087299 (Figuras 21C y D respectivamente) . Estos resultados indican que PR087299 interactúa con el primer CRD de HVEM en un sitio que es distinto del sitio de enlace LIGHT. El descubrimiento que PR087299 interactúa tanto con LIGHT como HVEM, permitirá la generación de anticuerpos o moléculas pequeñas contra HVEM que puede inhibir selectivamente la interacción PR087299/HVEM sin deteriorar la interacción PR087299/LIGHT. Otro tipo de anticuerpo o molécula pequeña que se contempla por este descubrimiento es aquel que bloqueará tanto la interacción PR087299/HVEM como la interacción PR087299/LIGHT. Estas dos clases diferentes de moléculas pueden tener efectos terapéuticos diferentes. EJEMPLO 18: PR087299 inhibe la activación célula T. Como se mencionó en Ejemplo 1, PR087299 se clono para adicional investigación en proteínas que contienen el dominio ITIM. El dominio intracelular de PR087299 contienen dos dominios ITIM que son fosforilados en forma inducible, lo que permite el reclutamiento y enlace de SHP-1 y SHP-2, lo que indica que la función de PR087299 es inhibitoria (Watanabe N. , et al., Nature Immuno. 1-10 (2003)). En este experimento, células T CD4+ primarias se estimularon por diferentes concentraciones de anticuerpo anti-CD3 inmovilizado. Una proteína de control etiquetada con Fe, HVEM-Fc o DcR3-Fc también se retículo sobre la placa al utilizar un anticuerpo anti-Fc pre-revestido . La proliferación de la células T CD4+ se midió por incorporación de H3 timidina después de una incubación de 72 horas. Este experimento se realizó en pozos triplicados, y la inhibición se ilustra como un promedio (Figura 22A) . HVEM se teoriza que es inhibitorio a la proliferación de célula T debido a su bloqueo de LIGHT. Este experimento muestra que no es la represión HVEM/LIGHT, sino PR087299 que activa HVEM que provoca la reducción de proliferación de célula T. Para mostrar adicionalmente que PR087299 es inhibitorio a proliferación de célula T, se realizo el experimento como se describió con anterioridad, pero incluyendo el anticuerpo 3B1.9 anti-PR087299 inhibitorio. El anticuerpo 3B1.9 se muestra que bloquea el enlace de PR087299 con HVEM (ver Ejemplo 16) . Cuando se estimularon células T CD4+ por anti-CD3 inmovilizado en placa y +/- HVEM. El anticuerpo 3B1.9 y un anticuerpo de control después se agregaron al medio. Los datos muestran que el anticuerpo 3B1.9 puede interferir con la interacción de PR087299/HVEM y de esta manera aliviar la célula de la señal inhibitoria. El resultado son las células tratadas 3B1.9 que proliferan a la misma velocidad que las células sin tratar (Figura 22B) . Solo cuando grandes concentraciones de HVEM se emplean fue el anticuerpo 3B1.9 ineficaz. Estos datos demuestran que PR087299 o anticuerpos agonistas pueden tener utilidad para suprimir enfermedades auto inmunes relacionadas a célula T, o por el contrario, anticuerpos antagonistas tales como 3B1.9 serán útiles para estimular células T para evitar o rechazar infecciones por patógenos. EJEMPLO 19: Enfermedades de Injerto contra Anfitrión Enfermedad de injerto-contra-anfitrión ocurre cuando células inmunocompetentes se transplantan en pacientes tolerantes o inmunosupri idos . Las células T donadoras reconocen antígenos anfitriones y se activan, secretan citocinas, proliferan y diferencian en células efectoras. Esta respuesta se conoce como reacción injerto-contra-anfitrión (GVHR = graft-versus-host-reaction) . La respuesta GVHR comprende un síndrome de múltiples órganos y los efectos pueden variar de inflamación severa que amenaza la vida a casos ligeros de diarrea y pérdida de peso. Modelos de enfermedad de injerto-contra-anfitrión en ratones se han empleado para modelar los desordenes clínicos de GVHR aguda y crónica que ocurren después de transplante de medula ósea y enfermedades auto inmunes. Un procedimiento general se describe en detalle en Current Protocols in Immunology, supra, unidad 4.3. En este caso, PBMCs humanos se purificaron de paquete leucocitario (leukopack) de un donador normal por gradiente Ficol . Células CD8 y NK se agotaron utilizando equipos de agotamiento de células MACS CD8 y NK. 40xl0e6 células se inyectaron en ratones hembra SCID Beige 8 a 10 semanas de edad el día 0. 100 µ g de HVEM-Fc o proteína de control se inyectaron intravenosamente en día 0, 2, 4, 6, 8, 10. Como se ilustra en la Figura 23, la activación de PR087299 por HVEM-Fc en un modelo GVHR prolongó en forma significativa la supervivencia. Los ratones no tratados con HVEM-Fc tuvieron 100% de mortalidad al día 13 de postreconstitución. Ratones tratados con HVEM-Fc vivieron al día 19 posterior a reconstitución en un procedimiento y al día 30 posterior a reconstitución en otro. Este resultado indica que la activación de PR087299 por un agonista será útil en transplante de tejido, mientras que la administración de un agonista PR087299 evitará o aliviará el rechazo del tejido transplantado por el anfitrión. EJEMPLO 20: Depósito de Materiales La siguiente línea de célula de hibridoma se ha depositado con la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209 USA (ATCC): Designación de ATCC No . Fecha de Depósito Hibridoma/Anticuerpo Btig5F5.1 PTA-no asignado noviembre 10, 2004 Btig3B1.9 PTA-no asignado noviembre 10, 2004 Este Depósito se realiza bajo las disposiciones del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismo con el Propósito de Procedimiento de Patentes y los Reglamentos correspondientes (tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable por 30 años a partir de la fecha de Depósito. La línea celular se hará disponible por ATCC bajo los términos del tratado de Budapest, y sujeto a un convenio entre Genentech, Inc. y ATCC, lo que asegura (a) que esté disponible acceso al cultivo durante el trámite de la solicitud de patente a uno determinado por el Comisionado que tenga derecho de acuerdo con 37 CFR §1.14 y 35 USC §122, y (b) que todas las restricciones en la disponibilidad al público del cultivo así depositado serán retiradas en forma irrevocable al otorgar la patente. La cesonaria de la presente solicitud ha convenido que si el cultivo al depositar hubiera o se perdiera o destruyera cuando se cultiva bajo condiciones convenientes, será rápidamente reemplazado ante notificación con un espécimen viable del mismo culture. La disponibilidad de la línea celular depositada no habrá de considerarse como una licencia para práctica de la invención en contravención a los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patente. La especificación descrita anterior se considera suficiente para permitir a una persona con destreza en la técnica el practicar la invención. La presente invención no habrá de limitarse en alcance por el material depositado, ya que la modalidad depositada se pretende como una sola ilustración de ciertos aspectos de la invención y cualesquiera construcciones que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta invención. El Depósito de material aquí no constituye una admisión de que la descripción escrita aquí contenida sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo su mejor modo, ni habrá de considerarse que limite el alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. Sin duda, diversas modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí, serán aparentes aquellos con destreza en la técnica de la descripción anterior y que caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Ácido nucleico aislado que tiene al menos 80% identidad de secuencia de ácidos nucleicos a una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:l) .
2. Ácido nucleico aislado que tiene al menos 80% identidad de secuencia de ácidos nucleicos a una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido mostrado en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) . .
3. Ácido nucleico aislado que consiste de la secuencia de codificación de longitud íntegra de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO : 1 ) .
4. Ácido nucleico aislado que consiste de la secuencia de codificación de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 7 (SEQ ID NO: 7) .
5. Ácido nucleico aislado que consiste de la secuencia de codificación de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 9 (SEQ ID NO: 9) .
6. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.
7. El vector de la reivindicación 6, enlazado operativamente a secuencias de control reconocidas por una célula anfitriona transformada con el vector.
8. Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 7.
9. La célula anfitriona de la reivindicación 8, caracterizada porque la célula es una célula CHO, una 5 célula de E. coli o una célula de levadura.
10. Un proceso para producir un polipéptido PR087299 que comprende cultivar la célula anfitriona de la reivindicación 9, bajo condiciones adecuadas para expresión del polipéptido PR087299 y recuperar el 0 polipéptido PR087299 del cultivo de celular.
11. Un polipéptido aislado que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de amino ácidos a una secuencia de amino ácidos del polipéptido mostrado en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) . 5
12. Un polipéptido aislado que tiene al menos 80% identidad de secuencia de amino ácidos a una secuencia de amino ácidos del polipéptido mostrada en la Figura 8 (SEQ ID N0:8).
13. Un polipéptido aislado que consiste de la o secuencia de amino ácidos del polipéptido mostrada en la Figura 10 (SEQ ID NO: 10) .
14. Una molécula quimérica que comprende un polipéptido de conformidad con la reivindicación 11, fusionado a una secuencia de amino ácidos heteróloga.
15. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la secuencia de amino ácidos heteróloga es una secuencia de etiqueta epítope o una región Fe de una inmunoglobulina.
16. Un anticuerpo que liga específicamente a polipéptido PR087299 que tiene al menos 80% de la identidad de secuencia de amino ácidos de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) .
17. Un anticuerpo que liga específicamente a amino ácidos 1-155 de PR087299 como se muestra en la Figura 2 (SEQ ID NO : 2 ) .
18. Un anticuerpo que liga específicamente a una variante PR087299 que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de amino ácidos a la Figura 8 (SEQ ID NO: 8) .
19. Un anticuerpo que liga específicamente a una variante PR087299 como se muestra en la Figura 10 (SEQ ID NO: 10) .
20. Un anticuerpo que liga específicamente a PR087299, y bloquea la interacción de HVEM (SEQ ID NO: 4) , pero no bloquea la interacción de LIGHT (SEQ ID NO: 6) .
21. Un anticuerpo que liga específicamente a PR087299 y bloqueas la interacción de LIGHT (SEQ ID NO:6), pero no bloquea la interacción de HVEM (SEQ ID NO: 4) .
22. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo es un agonista PR087299.
23. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo inhibe proliferación de células T CD4+.
24. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la proliferación de células de linfoma.
25. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la proliferación de células NK.
26. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo de cadena sencilla.
27. Un anticuerpo aislado producido por el hibridoma Btig5F5.1 (ATCC No. de Acceso ) o el hibridoma Btig3B1.9 (ATCC No. de Acceso ) .
28. Un anticuerpo aislado que tiene la actividad biológica de un anticuerpo producido por el hibridoma Btig5F5.1 (ATCC No. de acceso ) o el hibridoma Btig3B1.9 (ATCC No. de acceso ), en donde la actividad biológica es la inhibición de proliferación de células T CD4+.
29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque es un fragmento de un anticuerpo.
30. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico o humanizado.
31. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque está conjugado a un agente inhibidor de crecimiento.
32. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque está conjugado a un agente citotóxico.
33. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el agente citotóxico se elije del grupo que consiste de antibióticos, isótopos radioactivos y encimas nucleolicas .
34. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el agente citotóxico es una toxina.
35. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la toxina se elije del grupo que consiste de auristatina, maitansinoide y calicheamicina.
36. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la toxina se elije del grupo que consiste de; mono-metil auristatina E
(MMAE) , MMAF-dimetilaminoetilamino (MMAF, MMAF-DMAEA) , MMAF-TEG (MMAF-tetraetilen glicol) , MMAF-NtBu, y AEVB (auristatina E valeril benzilhidrazona) , y AFP (Auristatina F fenileno diamino) . 37. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la toxina se liga covalentemente al anticuerpo por un enlazador.
38. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el enlazador se elije del grupo que consiste de maleimidocaproilo (MC) , valínea-citrulina (val-cit, ve), citrullínea (ácido 2-amino-5-ureido pentanoico) , PAB (p-aminobenzilcarbamoilo) , Me (N-metil-valínea citrulina) , MC(PEG)6-0H (maleimidocaproil-polietilen glicol), SPP (N-Succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato) , SMCC (N-Succinimidil 4 - (N-maleimidometil) ciclohexan-1 carboxilato), y MC-vc-PAB.
39. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque se produce en bacterias .
40. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque se produce en células CHO.
41. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque se etiqueta en forma detectable.
42. Una composición de materia que comprende el anticuerpo de la reivindicación 16, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.
43. Una composición de materia que comprende (a) un polipéptido de la reivindicación 11, (b) un agonista del polipéptido, (c) un antagonista del polipéptido, o (d) un anticuerpo que liga al polipéptido, en combinación con un portador.
44. La composición de la materia de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de (a) , (b) , (c) o (d) .
45. Un artículo de manufactura, que comprende: un recipiente; una etiqueta de recipiente; y una composición de materia que comprende un anticuerpo que liga al polipéptido PR087299, contenido dentro del recipiente, en donde la etiqueta en el recipiente indica que la composición de la materia puede utilizarse para tratar una enfermedad inmuno relacionada, linfoma o enfermedad inflamatoria de intestino.
46. Un método para estimular la inmuno respuesta en un mamífero, el método se caracteriza porque comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un anticuerpo que liga específicamente a PR087299, en donde se estimula la inmuno respuesta.
47. Un método para aliviar un desorden inmuno relacionado en un mamífero que lo requiere, que comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de: (a) un anticuerpo que liga específicamente a PR087299; (b) HVEM (SEQ ID N0:4), HVEM-Fc, o SU fragmento; (c) LIGHT (SEQ ID N0:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; o (d) un agonista de molécula pequeña de PR087299.
48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado por que el desorden inmuno relacionado es lupus sistémico eritematosis, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis juvenil crónica, espondiloartropatías, esclerosis sistémica, miopatía inflamatoria ideopática, síndrome de Sjógren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica auto inmune, trombocitopenia auto inmune, tiroiditis, diabetes melitus, enfermedad renal inmuno mediada, enfermedades desmielinantes de los sistemas nerviosos central y periférico tal como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinante ideopática o síndrome de Guillen Barré, y polineuropatía desmielinante inflamatoria crónica, una enfermedad hepatobiliar, hepatitis activa crónica auto inmune, infecciosa, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa, y colangitis esclerosante, enfermedad de intestino inflamatorio, enteropatías sensible a gluten y enfermedad de Whipple, enfermedades de la piel auto inmunes o inmuno mediadas incluyendo enfermedades de piel bulosa, erictema multiforme y dermatitis de contacto, soriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a alimentos y urticaria, una enfermedad inmunológica del pulmón, neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar ideopática y neumonitis de hipersensibilidad, una enfermedad asociada a transplante incluyendo rechazo de injerto y enfermedad de injerto-contra-anfitrión.
49. Método para determinar la presencia de un polipéptido PR087299 en una muestra que se sospecha contiene el polipéptido, el método comprende exponer la muestra a: (a) un anticuerpo anti-PR087299; (b) HVEM (SEQ ID NO:4), HVEM-Fc, o su fragmento; o (c) LIGHT (SEQ ID NO:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; y determinar el enlace a PR087299.
50. Un método para diagnosticar una enfermedad inmuno relacionada en un mamífero, el método se caracteriza porque comprende contactar: (a) un anticuerpo anti-PR087299; (b) HVEM (SEQ ID NO : 4 ) , HVEM-Fc, o su fragmento; o (b) LIGHT (SEQ ID N0:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; o que específicamente liga a PR087299 con una muestra de prueba de células de tejido que se obtienen del mamífero y detectar la formación de un complejo entre (a) , (b) o (c) y el polipéptido PR087299 en la muestra de prueba, en donde la formación del complejo es indicativa de la presencia de una enfermedad inmuno relacionada en el mamífero del cual se obtuvieron las células de tejido de prueba .
51. Un método para diagnosticar una inmuno respuesta inflamatoria en un mamífero, el método se caracteriza porque comprende detectar el nivel de expresión de polipéptido PR087299, que comprende: (a) un anticuerpo anti-PR087299 ; (b) HVEM (SEQ ID N0:4), HVEM-Fc, o su fragmento; o (b) LIGHT (SEQ ID N0:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; en una muestra de prueba de células de tejido que se obtienen del mamífero y en una muestra de control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo de célula, en donde un nivel superior o inferior de expresión del polipéptido PR087299 en la muestra de prueba, en comparación con la muestra de control, es indicativo de la presencia de una inmuno respuesta inflamatoria en el mamífero del cual se obtuvieron las células de tejido de prueba.
52. Un método para diagnosticar linfoma en un mamífero, el método se caracteriza porque comprende detectar el nivel de expresión de polipéptido PR087299, que comprende: (a) un anticuerpo anti-PR087299 ; (b) HVEM (SEQ ID NO:4), HVEM-Fc, o su fragmento; o (b) LIGHT (SEQ ID NO:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; en una muestra de prueba de células de tejido que se obtienen del mamífero y en una muestra de control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo de célula, en donde un nivel superior o inferior de expresión del polipéptido PR087299 en la muestra de prueba, en comparación con la muestra de control, es indicativo de la presencia de linfoma en el mamífero del cual se obtuvieron las células de tejido de prueba .
53. Un método para aliviar linfoma en un mamífero que lo requiere, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de: (a) un anticuerpo anti-PR087299 ; (b) HVEM (SEQ ID NO:4), HVEM-Fc, o su fragmento; o (b) LIGHT (SEQ ID N0:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; que liga específicamente a polipéptido PR087299.
54. Un método para diagnosticar enfermedades inflamatoria intestinal en un mamífero, el método se caracteriza porque comprende detectar el nivel de expresión de polipéptido PR087299, que comprende: (a) un anticuerpo anti-PR087299 ; (b) HVEM (SEQ ID N0:4), HVEM-Fc, o su fragmento; o (b) LIGHT (SEQ ID NO:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; en una muestra de prueba de células de tejido que se obtienen del mamífero y en una muestra de control de células de tejido normal conocidas del mismo tipo de célula, en donde un nivel superior o inferior de expresión del polipéptido PR087299 en la muestra de prueba, en comparación con la muestra de control, es indicativo de la presencia de enfermedad inflamatoria intestinal en el mamífero del cual se obtuvieron las células de tejido de prueba.
55. Un método para aliviar enfermedad inflamatoria intestinal en un mamífero que lo requiere, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de: (a) un anticuerpo anti-PR087299 ; (b) HVEM (SEQ ID N0:4), HVEM-Fc, o su fragmento; o (b) LIGHT (SEQ ID NO:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; que liga específicamente a PR087299.
56. Un método para supervisar compuestos candidato que modulan PR087299, caracteriza porque comprende las etapas de: incubar una mezcla que comprende PR087299 con: (a) un anticuerpo anti-PR087299 ; (b) HVEM (SEQ ID NO:4), HVEM-Fc, o su fragmento; o (b) LIGHT (SEQ ID NO:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; y el compuesto candidato, bajo condiciones en las cuales, pero por la presencia de compuestos candidato, PR087299 liga a (a) , (b) o (c) a una afinidad de referencia; detectar la afinidad de enlace de PR087299 al compuesto candidato para determinar la afinidad del compuesto candidato; en donde una diferencia entre la afinidad de referencia y la afinidad del compuesto candidato, indica que el compuesto candidato modula PR087299.
57. Un método para supervisar compuestos candidato que modulan PR087299, caracterizado porque comprende las etapas de : transíectar células con PR087299; contactar el compuesto candidato con las células transfectadas con PR087299; contactar (a) un anticuerpo anti-PR087299 ; (b) HVEM (SEQ ID NO:4), HVEM-Fc, o su fragmento; o (b) LIGHT (SEQ ID N0:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; con células transfectadas con PR087299 como un medio para reducir proliferación de células transfectadas; comparar la proliferación de células reducidas de células transfectadas con PR087299 contactadas con el compuesto candidato con células transfectadas con PR087299 con (a) , (b) o (c) , en donde la proliferación reducida de células transfectadas con PR087299, indica que el compuesto candidato modula PR087299.
58. Un método para supervisar compuestos candidato que modulan PR087299, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) aislar células T CD4+; (b) contactar el compuesto candidato con las células T CD4+ aisladas; (c) contactar un anticuerpo anti-PR087299 , HVEM (SEQ ID N0:4) , HVEM-Fc, o su fragmento, o LIGHT (SEQ ID NO:6), LIGHT-Fc, o su fragmento, con las células T CD4+ aisladas como un medio para reducir la proliferación de células T CD4+; (d) comparar la proliferación de células reducida (b) con (c) , en donde la proliferación reducida de células T CD4+, indica que el compuesto candidato modula PR087299.
59. Un método para aliviar rechazo de tejido trasplantado en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de: (a) un anticuerpo anti-PR087299 ; (b) HVEM (SEQ ID NO:4), HVEM-Fc, o su fragmento; o (b) LIGHT (SEQ ID NO:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; con lo que se alivia el rechazo del tejido injertado.
60. Un método para aliviar rechazo de células transplantadas en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de: (a) un anticuerpo anti-PR087299 ; (b) HVEM (SEQ ID NO:4), HVEM- Fe, o su fragmento; o (b) LIGHT (SEQ ID N0:6), LIGHT-Fc, o su fragmento; con lo que se alivia el rechazo de las células transplantadas.