WO2010101255A1 - クローン病診断試薬 - Google Patents

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WO2010101255A1
WO2010101255A1 PCT/JP2010/053682 JP2010053682W WO2010101255A1 WO 2010101255 A1 WO2010101255 A1 WO 2010101255A1 JP 2010053682 W JP2010053682 W JP 2010053682W WO 2010101255 A1 WO2010101255 A1 WO 2010101255A1
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disease
corn
yeast
crohn
antibody
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PCT/JP2010/053682
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泰世 須賀
妹子 森
雅棋 橋本
学 鈴木
智美 森口
貴昭 河口
恵子 斎藤
正和 高添
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味の素株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS

Definitions

  • the present invention relates to a method for specifically diagnosing Crohn's disease safely and with high sensitivity, a diagnostic reagent for Crohn's disease, and a diagnostic kit containing the reagent.
  • Crohn's disease is a disease classified into ulcerative colitis (UC) and local inflammatory bowel disease (IBD) based on abnormal immunological responses. Unlike UC, where inflammation is confined to the large intestine, Crohn's disease is a disease that can cause ulcers in all parts of the digestive tract from the oral cavity to the anus. Clinical symptoms are mainly abdominal pain and diarrhea, and symptoms such as fever, melena, weight loss due to absorption disorder, general malaise, and anemia often appear. In addition, skin symptoms such as pyoderma gangrenosum and erythema nodosum, joint lesions, and extraintestinal complications such as stomatitis may occur. However, the etiology of Crohn's disease has not been fully elucidated, and its diagnosis and treatment are limited.
  • the diagnosis of Crohn's disease has been made by comprehensively judging clinical findings, X-ray contrast examination, endoscopy, histological examination of biopsy specimens collected under the endoscope, These examinations take time to clean the inside of the intestine before the examination, and give a great physical and mental burden to the patient, such as administration of a contrast medium and insertion of an endoscope into the intestinal tract.
  • Experience and skill are required for procedures and discrimination.
  • Endoscopic inspection requires more advanced techniques.
  • it is difficult to differentiate from other inflammatory bowel diseases such as UC showing similar pathological findings, and a safe and simple diagnostic method specific to Crohn's disease is required.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Non-Patent Documents 1 to 3
  • the sensitivity prevalence of prevalence of disease
  • the sensitivity is only about 40%.
  • sensitivity can be improved by combining a plurality of antibodies (Patent Document 3)
  • problems such as difficulty in obtaining I2 antigen, OmpC antigen, flagellin antigen, and CRP antigen.
  • Diet like intestinal bacteria, can affect intestinal immunity as a foreign substance that passes through the intestinal tract.
  • component nutrition therapy is effective in the treatment of Crohn's disease, the presence of some dietary antigen as an etiology or exacerbation factor is suggested, but the involvement of a specific dietary antigen in Crohn's disease has not yet been clarified.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a novel method for diagnosing Crohn's disease in a safe, simple and specific manner, a reagent therefor and a diagnostic kit comprising the same.
  • the present inventors have confirmed that the sensitivity and specificity of Crohn's disease diagnosis (no disease correct diagnosis rate) can be further improved by using a combination of two or more of these 19 items.
  • the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows:
  • the diagnostic method of the present invention significantly improves the sensitivity and specificity of the diagnosis of Crohn's disease by combining the antibody titer measurement of anti-dietary component antibody specific for Crohn's disease, and requires a high level of technology and burdens the patient.
  • a diet component since a diet component is used, it has the further advantage that the acquisition of a reagent is easy.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of CBB staining of rice protein.
  • Lane M shows the protein molecular weight marker
  • Lane a shows the rice protein
  • the leftmost numerical value shows the molecular weight (kDa) of the protein.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of Western blotting of rice proteins.
  • Lane C shows the results of using serum from Crohn's disease patient (CD)
  • Lane H shows the results of using healthy human (HC) serum as an antibody
  • the leftmost numerical value shows the molecular weight (kDa) of the protein.
  • “A” indicates a band in which a specific reaction with an antibody in CD serum was observed.
  • the present invention provides a method for diagnosing Crohn's disease, which comprises measuring one or more Crohn's disease-specific anti-food component antibodies in a specimen collected from a diagnosis target.
  • Crohn's disease-specific anti-food component antibody refers to an antibody against a diet component that specifically increases the antibody titer in an animal suffering from Crohn's disease. Specifically, grapefruit, alfalfa, avocado , Cabbage, sushi, lettuce, onion, potato, spinach, tomato, oats, pecan nuts, yeast, sugarcane, celery, buckwheat, corn, rice and soy. , Also referred to as “anti-food ingredient antibody of the present invention”).
  • “Crohn's disease-specific” means that the frequency (positive rate; prevalence of diagnosis) of the antibody titer in animals affected with Crohn's disease is at least UC-affected animals and health It is significantly higher than the frequency in animals.
  • the anti-food component antibody of the present invention may be each antibody against polypeptide antigens (antigens of various diet components) contained in various diet components.
  • Polypeptide antigens of dietary ingredients are specifically grapefruit, alfalfa, avocado, cabbage, chopped tang, lettuce, onion, potato, spinach, tomato, oats, pecan nuts, yeast, sugar cane, celery, buckwheat, corn Any polypeptide antigen contained in the dietary components of rice and soybeans may be used as long as it is a polypeptide antigen specific to Crohn's disease.
  • rice, buckwheat, corn and sugarcane are preferable.
  • Polypeptide antigens contained in these are glutelin, glyoxylase 1, enolase, UDP-glucose pyrophosphorylase, asparatic in the case of rice. Protein, prolamin, oleosin etc., clathrin etc. if soba, 2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglyceratemutase, protein disulfide isomerase, ketol-acid reductoisomerase, elongation factor 1 alpha, phenylalanine ammonia-lyase etc.
  • sugarcane include triphosphate isomerase 1, NBS-LRR type RGA, and the like.
  • the diagnostic object may be any animal that can suffer from Crohn's disease (including non-human inflammatory bowel disease corresponding to human Crohn's disease). Specific examples include humans, non-human primates, dogs, cats, rabbits, rats, and mice.
  • the specimen for diagnosis is not particularly limited as long as it is a component or tissue derived from a subject that can be isolated from the subject to be diagnosed and may have Crohn's disease-specific anti-food component antibody.
  • blood Whole blood, serum, plasma), saliva, other body fluids, various tissues, etc. are mentioned, and serum or plasma is particularly preferable.
  • serum or plasma is particularly preferable. The same applies to samples of ulcerative colitis patients for reference and / or healthy subjects as controls.
  • the method for measuring each antibody in a sample may be any immunological measurement method that is used for detecting and measuring antibodies, such as enzymes, fluorescent materials, luminescent materials, radioactive materials, and colored materials. Any of the conventional measurement methods can be used, but the enzyme immunoassay method, immunochromatography method, etc. are preferred, and the amount of antibody in the sample can be easily quantified by the amount of coloration or absorbance. Enzyme immunoassays, such as ELISA, are particularly preferred.
  • a commercially available ELISA kit (93 Food IgGScreen / GENESIS Diagnostics, etc.) that can measure 93 items of food IgG can be used, or a private laboratory is requested to measure (Such as IgG Food Antibody Assessment / Genova Diagnostics). Any of various instruments, materials, reagents, labeling methods, and measurement conditions necessary for measurement can be used.
  • a conventional method is selected according to the type of the labeling substance.
  • the decomposition of the chromogenic substrate is measured as the absorbance with a spectrophotometer. It is advantageous.
  • the measurement of the anti-food component antibody of the present invention by the ELISA method is performed by first reacting a specimen with a preparation of the diet component to form an antigen-antibody complex, and then reacting with the enzyme-labeled anti-food component antibody. This is performed by adding a substance to be reacted, further adding an enzyme substrate to cause reaction, and measuring the labeling amount of the reaction product by enzyme activity.
  • a preparation of dietary ingredients can be prepared by treating the dietary ingredients by conventional methods.
  • the food component used as a raw material is preferably a commercially available fresh / frozen / freeze-dried product, or a powdered material thereof (Allergon, etc.), and a method for treating the diet component, preferably extraction. Extraction can be performed, for example, by treating the raw material physically (ultrasonic wave, French press, mortar, homogenizer, glass beads, freeze-thaw, etc.) or with a surfactant in water, an organic solvent, a buffer solution, or glycerol. . Extraction efficiency can be increased by adding salt or heating.
  • the dietary component preparation includes commercially available protein extracts (BioChain, Antigen Laboratories, etc.) and / or allergen extracts for diagnosis (Torii Pharmaceutical Co., Ltd., Antigen Laboratories) Etc.) can be used.
  • the preparation of the diet component may be an isolated or purified product of the polypeptide antigen contained in the diet component.
  • the isolated or purified polypeptide antigen is prepared, for example, by (a) a known method of synthesizing a dietary component tissue or cell using a known method or a method equivalent thereto, and (b) a known peptide synthesis method using a peptide synthesizer or the like. Chemical synthesis, (c) culturing a transformant containing DNA encoding a polypeptide antigen, or (d) biochemical using a cell-free transcription / translation system using a nucleic acid encoding a polypeptide antigen as a template It is manufactured by synthesizing.
  • the crude fraction eg, membrane fraction, soluble fraction
  • the extract is purified by a combination of chromatography such as salting out, dialysis, gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like. It can also be separated.
  • the obtained protein can be used as a polypeptide antigen as it is, or a partial peptide can be prepared by limited degradation using a peptidase or the like and used as a polypeptide antigen.
  • the synthetic peptide includes, for example, a peptide having the same structure as a protein purified from a natural material using the method (a) described above, specifically, In the amino acid sequence of the protein, a peptide containing one or more amino acid sequences identical to the amino acid sequence at any position consisting of at least 3 amino acids, preferably 6 amino acids or more is used.
  • the cloning method is: (1) using a DNA probe designed on the basis of a gene sequence encoding a polypeptide antigen and isolating the DNA encoding the polypeptide antigen from a cDNA library of dietary components by a hybridization method; (2) Using a DNA primer designed based on a gene sequence encoding a polypeptide antigen, preparing a DNA encoding the antigen by PCR using a cDNA derived from a dietary component as a template, and expressing the DNA in accordance with the host The method of inserting in a vector etc. is mentioned.
  • a desired polypeptide antigen can be obtained by culturing a transformant obtained by transforming a host with the expression vector in an appropriate medium.
  • an expression vector into which a DNA encoding a polypeptide antigen prepared by the same method as in (c) above is inserted for example, the DNA controls T7, SP6 promoter, etc.
  • MRNA is synthesized using a transcription reaction solution containing RNA polymerase and substrate (NTPs) compatible with the promoter using the expression vector placed below as a template, and then a known cell-free translation system using the mRNA as a template.
  • NTPs RNA polymerase and substrate
  • Examples thereof include a method of carrying out a translation reaction using an extract (eg, an extract of Escherichia coli, rabbit reticulocyte, wheat germ, etc.). By appropriately adjusting the salt concentration and the like, the transcription reaction and the translation reaction can also be carried out collectively in the same reaction solution.
  • isolation or purification means that an operation for removing components other than the target component has been performed.
  • the content of the target polypeptide contained in the “isolated or purified polypeptide antigen” is usually 60% by weight or more, preferably 80% by weight or more, more preferably 90% by weight of the polypeptide in the sample. Above, most preferably 95% by weight or more.
  • polypeptide antigen a complete protein molecule or a peptide having antigenicity including a partial amino acid sequence thereof (partial peptide having antigenicity) can be used.
  • partial amino acid sequence include those consisting of 3 or more consecutive amino acid residues, preferably 4 or more, more preferably 5 or more, and even more preferably 6 or more consecutive amino acid residues. It is done. Some of these amino acid residues (eg, 1 to several) may be substituted with a substitutable group (eg, Cys, hydroxyl group, etc.).
  • Peptides used as polypeptide antigens have an amino acid sequence containing 1 to several such partial amino acid sequences.
  • the preparation of dietary components is immobilized on a suitable solid phase (eg, a multiwell plate for immunoassay, etc.). Immobilization can be performed by adding the preparation diluted with a general coating buffer as necessary to the solid phase and incubating for a certain period of time. After removing the liquid from the solid phase, an analyte is added to the solid phase to form an antigen-antibody complex, and the target antibody is captured on the solid phase.
  • a suitable solid phase eg, a multiwell plate for immunoassay, etc.
  • Examples of the substance that reacts with the anti-food component antibody include anti-immunoglobulin antibodies, protein A, protein G, and jacalin, and anti-immunoglobulin antibodies, particularly anti-IgG antibodies or anti-IgA antibodies are preferred.
  • Examples of the labeling enzyme include peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, microperoxidase, carboxypeptidase, and phosphorylase, but are not particularly limited.
  • the enzyme substrate is appropriately selected according to the type of the labeling enzyme.
  • peroxidase for example, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMB; Vector Laboratories Inc., # SK-4400) can be used.
  • TMB 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine
  • the amount of label bound to the solid phase that is, the amount of antibody can be measured.
  • Whether the anti-dietary component antibody examined in the diagnosis target is elevated can be determined by, for example, whether it is statistically significant in comparison with the antibody titer in healthy animals. For example, the average of measured values in healthy animals + SD (standard deviation), average + 2SD, average + 3SD, and the like can be used as a positive reference, but is not limited thereto.
  • two or more of the 19 types of anti-food component antibodies specific to Crohn's disease are the measurement target.
  • Antibody is the measurement target.
  • the diagnostic sensitivity and / or diagnostic specificity of Crohn's disease can be further improved.
  • it preferably contains an antibody against at least one dietary ingredient selected from grapefruit, cabbage, lettuce, oats, pecan nuts, yeast, sugarcane, celery, buckwheat and corn, More preferably, each antibody to corn is included.
  • the diagnostic method of the present invention uses three or four or more antibodies in combination.
  • each antibody against yeast, corn, and buckwheat or celery is more preferable to include at least each antibody against yeast, corn, and buckwheat or celery.
  • Specific examples of combinations include combinations of antibodies to the following dietary components. (Example of combination of two dietary ingredients) ⁇ Corn, cabbage corn, lettuce corn, buckwheat east, grapefruit east, cabbage yeast, celery yeast, lettuce east, buckwheat east, corn east, oats east, pecan nut sugar cane, cabbage -Sugar cane, corn sugar cane, yeast (examples of combinations of three dietary ingredients) -Yeast, corn, buckwheat-Yeast, corn, celery (examples of combinations of four dietary ingredients) ⁇ Yeast, corn, buckwheat, grapefruit, yeast, corn, buckwheat, cabbage, yeast, corn, buckwheat, Shishikang, yeast, corn, buckwheat, tomato, yeast, corn, buckwheat, soybean,
  • a diagnosis is performed by combining two or more anti-food component antibodies, a result is obtained in which only some antibodies are positive and other antibodies are negative. In this case, preferably, any one antibody is positive. If there is, it is determined that the diagnosis subject is affected by Crohn's disease or is likely to be affected. By doing so, diagnostic sensitivity can be remarkably improved while maintaining a certain diagnostic specificity.
  • the present invention also provides a diagnostic reagent for Crohn's disease comprising one or more dietary component preparations that react with the anti-food component antibody of the present invention.
  • dietary ingredient preparations include grapefruit, alfalfa, avocado, cabbage, chopped tang, lettuce, onion, potato, spinach, tomato, oats, pecan nuts, yeast, sugar cane, celery, buckwheat, corn, rice And a dietary ingredient selected from 19 kinds of soybeans.
  • the preparation method of the preparation is as described in the method of the present invention.
  • the obtained dietary ingredient preparation is provided in a state of being dissolved in water, a buffer solution, glycerol or the like in a container such as a plastic tube, and can be refrigerated or stored frozen until just before use.
  • the reagent for diagnosing Crohn's disease of the present invention comprises two or more (eg, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 or 15) dietary component preparations as a constituent. Good. Preferred combinations of two or more dietary ingredients are as described above.
  • a plurality of food component preparations may be mixed into one reagent or prepared as separate reagents, but substances that react specifically with each anti-food component antibody Is usually not convenient, and it is usually more convenient to prepare it as a separate reagent.
  • the present invention also provides a diagnostic kit for Crohn's disease comprising the reagent of the present invention.
  • the kit of the present invention contains a preparation of dietary components alone or in combination of two or more, and as other components, necessary reagents depending on the type of immunological measurement method and the detection means employed. Can optionally be included.
  • a substance that reacts with an anti-food component antibody for example, a secondary antibody such as an anti-IgG antibody or an anti-IgA antibody
  • the substance may be labeled in advance with a labeling substance such as an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a radioisotope, or a colored substance, or a labeling substance can be separately included in the configuration of the kit.
  • the diet component preparation may be immobilized in advance on the solid phase, or the solid phase can be separately included in the configuration of the kit.
  • the kit of the present invention may contain a substrate corresponding to the labeling substance, or a detection reagent for detecting the reaction between the labeling substance and the substrate, and is suitable for the convenience of the measurement.
  • a specimen diluent, a secondary antibody diluent, a standard antibody, a buffer solution, a washing solution, an enzyme substrate solution, a reaction stop solution, and the like may be contained.
  • a standard serum derived from a healthy person used as a control may be included. Examples The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • Reference Example 1 Acquisition of human serum or plasma The blood of 80 patients with Crohn's disease, 44 patients with ulcerative colitis, and 52 healthy persons is subject to written consent at Social Insurance Central General Hospital or Ajinomoto Co., Inc. Collected to obtain serum or plasma. The specimens were displayed with numbers and anonymized.
  • Example 1 Diet 88 items Measurement of antibody titer (IgG) After blood collection, the obtained serum was frozen and stored frozen and sent to Genova Diagnostics (IL, USA) via Detox Co., Ltd. We requested measurement of Antibody Assessment (88 items of food).
  • IgG antibody titer
  • the breakdown of 88 food items is 7 dairy products (casein, cheddar cheese, cottage cheese, milk, goat milk, lactalbumin, yogurt), 22 vegetables (alfalfa, asparagus, avocado, radish, broccoli, cabbage, carrot , Celery, Cucumber, Garlic, Sushi Tang, Lettuce, Mushroom, Olive, Onion, Beans, Sweet Potato, Potato, Spinach, Green Bean, Tomato, Zucchini), 16 Fruits (Apple, Apricot, Banana, Blueberry, Cranberry, Grape, Grapefruit, lemon, orange, papaya, peach, pear, pineapple, plum, wooden crab, salmon), seafood and meat 19 items (spinning fish, crab, crab, lobster, oyster, salmon, salmon, shrimp, flounder, salmon, tuna , Beef, chicken, egg white, egg yolk, lamb, pork, ta Key), 19 cereals and nuts (almond, buckwheat, corn, corn gluten, gluten, beans, lentils, rye beans, oats, peanuts, perip
  • IgG was measured by ELISA, and the positive value was determined based on “average value + 2SD” in healthy persons of each dietary item.
  • the average number of serum antibody titer positive items in 88 diets was 11 in Crohn's disease patients, 2 in ulcerative colitis patients, and 1 in healthy people.
  • the antibody positive rate (number of positive samples / total number of samples ⁇ 100) in each item was calculated for Crohn's disease patients, ulcerative colitis patients, and healthy persons, respectively.
  • the positive rate and specificity number of negative samples / total number of samples ⁇ 100
  • diagnostic efficiency positive rate ⁇ specificity / 100
  • Results 19 food items that had a significantly higher positive rate in Crohn's disease patients than healthy people and ulcerative colitis patients (grapefruit, alfalfa, avocado, cabbage, celery, chopped tang, lettuce, onion, potato, spinach, tomato , Buckwheat, corn, oats, pecan nuts, rice, soybeans, yeast, sugar cane).
  • Table 1 shows the positive rates in 19 patients with Crohn's disease (CD), ulcerative colitis (UC), and healthy persons (HC).
  • an invasive method that enables specific and efficient diagnosis of Crohn's disease, requires advanced experience and techniques such as endoscopy, and gives physical and mental pain to patients. Even without passing, diagnosis of Crohn's disease can be performed safely and with high sensitivity.
  • Example 2 Measurement of Serum Antibody Titer for Preparation of Dietary Ingredients
  • corn, yeast, buckwheat, celery were selected, 98 CDs, 50 UCs, 52 Serum antibody titers for various dietary component preparations were measured for the HC serum of the examples.
  • a powder material was used as a preparation of dietary ingredients. It was obtained by suspending various powders of corn, yeast, buckwheat and celery (all manufactured by Allergon) in PBS (-) and centrifuging (5000 rpm, 5 minutes) as antigen solutions for measuring serum antibody titers. The supernatant was used.
  • the antigen solution was prepared with a coating buffer (SIGMA, cat.
  • a well prepared by adding 50 ⁇ l / well of an anti-human IgG antibody (EXBIO, cat. No.11-31-9-C100) diluted 1000 times with a coating buffer was prepared, and reference serum (BETHYL, cat. No. RS10-101) was reacted at 0.01 to 10 ⁇ g / ml, the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured at each concentration, a calibration curve was prepared, and the IgG titer of the serum sample was calculated.
  • the “average value + 2SD” of IgG titers of healthy people for various dietary components was calculated, and positive values were evaluated for cases above that.
  • the positive rate (number of positive specimens / total number of specimens ⁇ 100) in various dietary components was calculated for each CD, UC, and HC.
  • Results Table 4 shows the positive rates for various dietary components.
  • the antibody positive rate measured using a preparation of dietary components is almost the same as the positive rate measured by Genova Diagnostics (Table 1) for all CD, UC, and HC, regardless of the dietary material used. It was equivalent.
  • Tables 5-1 to 5-3 show the CD positive rate, the specificity of UC and HC, and the diagnostic efficiency of CD against UC when 2 to 4 items of the above four items of dietary ingredients are combined.
  • the combined positive rate of 2 to 4 items was about 70%, the specificity was 90% or more, and a diagnostic efficiency of about 65 to 74% was obtained.
  • the positive rate was slightly lower, but the specificity was about the same or higher.
  • Example 3 Identification of Antigen A useful dietary antigen obtained from the results of Example 1 was specifically identified as a protein that can be used as an antigen.
  • rice powder manufactured by Allergon
  • a suspension of powder equivalent to 125 ⁇ g per lane was subjected to SDS-PAGE. After separating the protein by SDS-PAGE, it was transferred to a PVDF membrane for 60 minutes under the condition of a constant current of 60 mA.
  • FIG. 1 shows the results of CBB staining of rice protein
  • FIG. 2 shows the results of Western blotting.
  • the protein in band A in FIG. 2 reacted specifically with the antibody in CD serum.
  • Table 6 shows the results of PMF analysis of the band A protein (about 33 kDa). From the molecular weight pattern of the peptide fragment obtained by PMF analysis, the protein of band A was estimated to be Glutelin (Accession No. ABF96730.1) (Table 7).
  • proteins other than Glutelin in rice powder are identified by the same method as described above, and various other rice powders such as buckwheat, corn, and sugarcane (all made by Allergon) are used as the above-mentioned rice powder.
  • useful protein antigens contained in various dietary components were identified.
  • Example 4 Measurement of serum antibody titer using Glutelin Total RNA was extracted from rice (Hitomebore) with Spectrum (trademark) Plant Total RNA kit (manufactured by SIGMA Aldrich). The full-length Glutelin gene was obtained using the following primers designed from the mRNA sequence (Accession No. NM_001056948) of Glutelin type-A 3 precursor (Accession No. ABF96730.1).
  • Anti-Glutelin antibody titers were measured by ELISA for 98 CD and 52 HC sera. Anti-Glutelin antibody titer is calculated by subtracting the value of the response to GST from the value obtained as a response to GST fusion protein (Glutelin-GST) according to the method of Sutton CL et al. (Gastroenterology 119: 23-31, 2000) did.
  • Glutelin-GST and GST were prepared in an equimolar number using a coating buffer (SIGMA, cat. No. 076K8206) to 100 ⁇ g / ml and 32 ⁇ g / ml, and ELISA plates (Sumitomo Bakelite) , Cat. No.
  • the plate was washed three times with a washing solution, and an HRP-labeled mouse anti-human IgG monoclonal antibody (Invitrogen, cat. No. 05-4220) diluted 500 times with the washing solution was reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction, washing with the washing solution is performed 3 times, TMB (BD Biosciences, cat. No. 555214) is reacted, the reaction is stopped with 2N sulfuric acid, and the wavelength is measured using a microplate reader (BIO-RAD Benchmark Plus). Absorbance at 450 nm was measured. Prepare a well containing 50 ⁇ l / well of anti-human IgG antibody (EXBIO, cat.
  • Reference serum (BETHYL, cat. No. RS10-101) was reacted at 0.01 to 10 ⁇ g / ml, the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured at each concentration, a calibration curve was prepared, and the IgG titer of the serum sample was calculated.
  • antigen protein can be supplied uniformly and stably by utilizing recombinant protein production, and if a single antigen protein supplied in this way is used, stable production and reliability of diagnostic kits can be achieved. Improvements can be realized.

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Abstract

　クローン病を安全で簡便に、かつ特異的に診断するための試薬及び方法を提供する。対象から採取した検体中の、グレープフルーツ、アルファルファ、アボカド、キャベツ、しし唐、レタス、玉ねぎ、ジャガイモ、ほうれん草、トマト、オーツ麦、ピーカンナッツ、イースト、サトウキビ、セロリ、そば、コーン、米及び大豆からなる群より選択される１種以上の食餌成分に対する各抗体を測定することを含む、該対象におけるクローン病の診断方法、前記食餌成分の調製物を含むクローン病の診断用試薬又はキットを提供する。

Description

クローン病診断試薬
　本発明は、クローン病を安全かつ高感度で特異的に診断する方法及びクローン病の診断用試薬、並びにその試薬を含む診断用キットに関する。
　クローン病は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）とともに、免疫学的応答の異常に基づく局所の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に類別される疾患である。炎症が大腸に限局するＵＣと異なり、クローン病は口腔から肛門までの消化管の全ての部位にも潰瘍ができる病気である。臨床症状としては、腹痛、下痢が主で、さらに発熱、下血、吸収障害による体重減少、全身倦怠感、貧血などの症状もしばしば現れる。また、壊疽性膿皮症、結節性紅斑などの皮膚症状、関節病変、口内炎などの腸管外合併症を併発することがある。
　しかし、クローン病の病因は未だ十分に解明されておらず、その診断と治療には限界がある。
　例えば、クローン病の診断は、臨床所見のほか、Ｘ線造影検査、内視鏡検査、内視鏡下に採取した生検標本の組織検査などを総合的に判断して行われてきたが、これらの検査は、検査前の腸管内部清浄に時間を要し、造影剤の投与や内視鏡の腸管への挿入など、患者に対し肉体的・精神的に多大の負担を与えるものであるうえ、手技及び判別に経験と熟練した技術を必要とする。
　殊に、小腸型又は小腸優位の小腸大腸型の場合、小腸の構造の複雑さ及び発症部位が内視鏡の挿入部（肛門又は口腔）から遠いことなどの理由で、Ｘ線造影検査或いは内視鏡による検査は、一層高度の技術を要する。
　また、類似した病理所見を示すＵＣなどの他の炎症性腸疾患との鑑別が困難なケースも多く、安全で簡便、かつクローン病に特異的な診断方法が求められている。
　クローン病の発症及び増悪には、様々な遺伝的及び環境的要因が複雑に影響していると考えられるが、なかでも腸内細菌を含む微生物由来抗原の関与が示唆されており、微生物に対する異常な免疫応答がクローン病における炎症反応に深く関わっていると考えられている。例えば、抗Saccharomyces cerevisiae抗体（ＡＳＣＡ）、抗Ｉ２抗体、抗外膜タンパク質Ｃ（ＯｍｐＣ）抗体、抗フラジェリン抗体などが、クローン病患者の血清中で特異的に増加していることが報告されている。一方、微生物以外でも、ＣＲＰやブタアミラーゼに対する抗体価がクローン病患者の血清中で特異的に増加しているとの報告もある。かかる知見に基づき、これらの抗体を検出することによる非侵襲的なクローン病の診断方法が提案されている（特許文献１及び２、非特許文献１～３）。
　しかし、単一の抗体をマーカーとして用いたこれらの方法では、いずれも感度（有病正診率）がたかだか４０％程度に止まる。複数の抗体を組み合わせることにより感度を向上させることができるが（特許文献３）、Ｉ２抗原、ＯｍｐＣ抗原、フラジェリン抗原、ＣＲＰ抗原は入手が困難であるなどの問題がある。
　食餌も、腸内細菌と同様に、腸管を通過する異物として腸管免疫に影響を与える可能性がある。クローン病の治療に成分栄養療法が有効であることから、病因もしくは増悪因子として何らかの食餌抗原の存在が示唆されるが、特定の食餌抗原のクローン病への関与はいまだ明らかにされていない。
特開平１１－１９０７３４号公報 特表２００４－５２６１２２号公報 特開２００６－３０８４９４号公報
Jpn J Electroph 1999；43：139-145 Gastroenterology 2002；123：689-699 Gastroenterology 2000；119：23-31
　本発明が解決しようとする課題は、クローン病を、安全で簡便に、かつ特異的に診断する新規方法、並びにそのための試薬及びそれを含んでなる診断用キットを提供することにある。
　前記課題の解決にあたり、本発明者らはまず、クローン病では腸管上皮のバリア機構に障害があるため膜透過性が亢進し、抗原に曝露されやすいとの報告があることに注目し、食餌抗原がクローン病における炎症反応に関与している可能性があると着想した。そこで、クローン病患者、ＵＣ患者及び健康人から採取した血清中の、種々の食餌成分に対する抗体価を測定、相互に比較した。その結果、クローン病患者由来の検体において特異的に血清抗体価の上昇が認められた食餌成分１９品目を同定することに成功した。このうち１４品目については、これまでクローン病との関連が全く示唆されていない食餌成分であった。
　さらに、本発明者らは、これらの１９品目のうちの２種以上を組み合わせて用いることにより、クローン病診断の感度及び特異度（無病正診率）をより向上させることができることを確認して、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである：
〔１〕対象から採取した検体中の、グレープフルーツ、アルファルファ、アボカド、キャベツ、しし唐、レタス、玉ねぎ、ジャガイモ、ほうれん草、トマト、オーツ麦、ピーカンナッツ、イースト、サトウキビ、セロリ、そば、コーン、米及び大豆からなる群より選択される１種以上の食餌成分に対する各抗体を測定することを特徴とする、該対象におけるクローン病の診断方法（但し、１種の食餌成分に対する抗体を測定する場合、該食餌成分はセロリ、そば、コーン、イースト及び大豆以外である）。
〔２〕２種以上の食餌成分に対する各抗体を測定することを特徴とする、〔１〕の方法。
〔３〕少なくとも１種の食餌成分がセロリ、そば、コーン、イースト及び大豆以外である、〔２〕の方法。
〔４〕グレープフルーツ、キャベツ、レタス、オーツ麦、ピーカンナッツ、イースト、サトウキビ、セロリ、そば及びコーンからなる群より選択される少なくとも１種の食餌成分に対する抗体を測定することを特徴とする、〔２〕又は〔３〕の方法。
〔５〕少なくともイースト及びコーンに対する各抗体を測定することを特徴とする、〔２〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕３種以上の食餌成分に対する各抗体を測定することを特徴とする、〔２〕～〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕少なくともイースト、コーン、並びにそば又はセロリに対する各抗体を測定することを特徴とする、〔６〕の方法。
〔８〕食餌成分に含有されるポリペプチド抗原に対する各抗体を測定することを特徴とする、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕前記ポリペプチド抗原がGlutelinである、〔８〕の方法。
〔１０〕グレープフルーツ、アルファルファ、アボカド、キャベツ、しし唐、レタス、玉ねぎ、ジャガイモ、ほうれん草、トマト、オーツ麦、ピーカンナッツ、米及びサトウキビからなる群より選択される食餌成分の調製物を含有してなる、クローン病の診断用試薬。
〔１１〕前記調製物が、単離又は精製されたポリペプチド抗原である、〔１０〕の試薬。
〔１２〕前記ポリペプチド抗原が、Glutelin又は抗原性を有するその部分ペプチドである、〔１１〕の試薬。
〔１３〕グレープフルーツ、アルファルファ、アボカド、キャベツ、しし唐、レタス、玉ねぎ、ジャガイモ、ほうれん草、トマト、オーツ麦、ピーカンナッツ、イースト、サトウキビ、セロリ、そば、コーン、米及び大豆からなる群より選択される２種以上の食餌成分の調製物を含んでなる、クローン病の診断用キット。
〔１４〕前記調製物が、単離又は精製されたポリペプチド抗原である、〔１３〕のキット。
〔１５〕前記ポリペプチド抗原が、Glutelin又は抗原性を有するその部分ペプチドである、〔１４〕のキット。
　本発明の診断方法は、クローン病に特異的な抗食餌成分抗体の抗体価測定を組み合わせることによって、クローン病診断の感度及び特異度を格段に向上させ、高度の技術を要し患者への負担も大きい内視鏡などの侵襲的方法による診断の適応範囲を限定することができる点で、顕著な効果を奏する。また、食餌成分を用いるので、試薬の入手が容易であるとのさらなる利点を有する。
図１は、米タンパク質のＣＢＢ染色の結果を示す図である。レーンＭはタンパク質分子量マーカーを、レーンａは米タンパク質をそれぞれ示し、左端の数値はタンパク質の分子量（ｋＤａ）を示す。 図２は、米タンパク質のウェスタンブロッティングの結果を示す図である。レーンＣはクローン病患者（ＣＤ）の血清を、レーンＨは健康人（ＨＣ）の血清を抗体としてそれぞれ用いた結果を示し、左端の数値はタンパク質の分子量（ｋＤａ）を示す。「Ａ」は、ＣＤの血清中の抗体と特異的な反応が見られたバンドを示す。
　本発明は、診断対象から採取した検体中の、１種以上のクローン病特異的な抗食餌成分抗体を測定することを含む、クローン病の診断方法を提供する。本発明において「クローン病特異的な抗食餌成分抗体」とは、クローン病に罹患した動物において特異的に抗体価が上昇する、食餌成分に対する抗体をいい、具体的には、グレープフルーツ、アルファルファ、アボカド、キャベツ、しし唐、レタス、玉ねぎ、ジャガイモ、ほうれん草、トマト、オーツ麦、ピーカンナッツ、イースト、サトウキビ、セロリ、そば、コーン、米及び大豆の１９種の食餌成分に対する各抗体を意味する（以下、「本発明の抗食餌成分抗体」ともいう）。尚、ここで「クローン病特異的」であるとは、クローン病に罹患した動物において抗体価が上昇している頻度（陽性率；有病正診率）が、少なくともＵＣに罹患した動物及び健康動物における当該頻度に比して有意に高いことをいう。
　また、本発明の抗食餌成分抗体は、各種食餌成分に含有されるポリペプチド抗原（各種食餌成分の抗原）に対する各抗体であってもよい。食餌成分のポリペプチド抗原は、具体的には、グレープフルーツ、アルファルファ、アボカド、キャベツ、しし唐、レタス、玉ねぎ、ジャガイモ、ほうれん草、トマト、オーツ麦、ピーカンナッツ、イースト、サトウキビ、セロリ、そば、コーン、米及び大豆の食餌成分に含有されるポリペプチド抗原であって、クローン病特異的なポリペプチド抗原であれば如何なるものであってもよい。本発明では、上記１９種類の食餌成分のうち、米、そば、コーン及びサトウキビが好ましく、これらに含まれるポリペプチド抗原としては、米であればglutelin、glyoxylase 1、enolase、UDP-glucose pyrophosphorylase、asparatic protease、prolamin、oleosin等が、そばであればclathrin等が、コーンであれば2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglyceratemutase、protein disulfide isomerase、ketol-acid reductoisomerase、elongation factor 1 alpha、phenylalanine ammonia-lyase等が、サトウキビであればtriphosphate isomerase 1、NBS-LRR type RGA等が例示される。
　本発明の診断方法において、診断対象は、クローン病（ヒトのクローン病に相当する非ヒト炎症性腸疾患を含む）に罹患し得る任意の動物であってよいが、例えば哺乳動物であり、具体的にはヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、及びマウスなどが例示される。
　診断のための検体は、診断対象から単離可能であって、クローン病特異的な抗食餌成分抗体が存在する可能性のある対象由来の成分又は組織であれば、特に限定されず、例えば血液（全血、血清、血漿）、唾液、その他の体液、各種組織等が挙げられるが、特に血清又は血漿が好ましい。参考のための潰瘍性大腸炎患者及び／又は対照とする健康人の検体を用いる場合には、それらの検体についても同様である。
　検体中の各抗体の測定方法は、免疫学的測定法として、抗体を検出し測定するために使用される方法であればいずれでもよく、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性物質、着色物質などを標識物質とする慣用の測定方法がいずれも使用可能であるが、酵素免疫測定法、イムノクロマトグラフィー法などが好ましく、さらに、検体中の抗体量を着色量や吸光度によって容易に数値化できる点で酵素免疫測定法、例えばＥＬＩＳＡ法が特に好ましい。多品目に対する抗体を同時に測定する方法としては、例えば食品93品目IgGが測定可能な市販のELISAキット（93 Food IgGScreen/GENESIS Diagnostics社など）を用いることができ、又は民間の検査機関に測定を依頼することもできる（IgG Food Antibody Assessment/Genova Diagnostics社など）。測定に必要な各種器具、資材、試薬類、標識方法及び測定条件は、既知のものがいずれも使用可能である。
　抗体に結合した標識量の測定は、標識物質の種類に応じて慣用の方法が選択され、例えば、酵素を標識物質とする場合には発色基質の分解を分光光度計により吸光度として測定するのが有利である。
　例えば、ＥＬＩＳＡ法による本発明の抗食餌成分抗体の測定は、まず、検体を食餌成分の調製物と反応させて抗原－抗体複合体を生成させ、次いで、酵素標識した、抗食餌成分抗体と反応する物質を添加し、さらに酵素基質を添加して反応させ、反応生成物の標識量を酵素活性により測定することにより行うことができる。
　食餌成分の調製物は、慣用の方法により食餌成分を処理することによって調製できる。原料となる食餌成分は、市販の生鮮・冷凍・凍結乾燥品、又はその粉末材料（Allergon社など）、食餌成分の処理方法としては、好ましくは抽出が挙げられる。抽出は、例えば原料を、水、有機溶媒、緩衝液、又はグリセロール中で物理的に（超音波、フレンチプレス、乳鉢、ホモジナイザー、ガラスビーズ、凍結融解など）又は界面活性剤で処理することによって行える。塩の添加や、加温することにより抽出効率を上げることが可能である。また、食餌成分の調製物としては、前記方法で得られる抽出物のほかに、市販のタンパク質抽出液（BioChain社、Antigen Laboratories社など）及び/又は診断用アレルゲンエキス（鳥居薬品株式会社、Antigen Laboratories社など）等を使用可能である。
　食餌成分の調製物としては、食餌成分に含有される上記ポリペプチド抗原の単離又は精製物であってもよい。単離又は精製されたポリペプチド抗原は、例えば、（ａ）食餌成分の組織又は細胞から公知の方法或いはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプチドシンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（ｃ）ポリペプチド抗原をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養、あるいは（ｄ）ポリペプチド抗原をコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。
（ａ）食餌成分の組織又は細胞からポリペプチド抗原を調製する場合、その組織又は細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例：膜画分、可溶性画分）をそのままポリペプチド抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤又はアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られたタンパク質をそのままポリペプチド抗原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれをポリペプチド抗原とすることもできる。
（ｂ）化学的にポリペプチド抗原を調製する場合、合成ペプチドとしては、例えば上述の（ａ）の方法を用いて天然材料より精製したタンパク質と同一の構造を有するもの、具体的には、該タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いてポリペプチド抗原を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法（例えば、Molecular Cloning 2nd ed.（J. Sambrook et al., Cold Spring HarborLab. Press, 1989）に記載の方法など）に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（１）ポリペプチド抗原をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブを用い、食餌成分のｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により該ポリペプチド抗原をコードするＤＮＡを単離するか、（２）ポリペプチド抗原をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、食餌成分由来のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法により該抗原をコードするＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを宿主に適合する発現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望のポリペプチド抗原を得ることができる。
（ｄ）無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記（ｃ）と同様の方法により調製したポリペプチド抗原をコードするＤＮＡを挿入した発現ベクター（例えば、該ＤＮＡがＴ７、ＳＰ６プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するＲＮＡポリメラーゼおよび基質（ＮＴＰｓ）を含む転写反応液を用いてｍＲＮＡを合成した後、該ｍＲＮＡを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して行うこともできる。
　なお、「単離又は精製」とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作がなされていることを意味する。「単離又は精製されたポリペプチド抗原」に含まれる、目的とするポリペプチドの含有量は、試料中のポリペプチドの通常６０重量％以上、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、最も好ましくは９５重量％以上である。
　ポリペプチド抗原としては完全なタンパク質分子やその部分アミノ酸配列を含む抗原性を有するペプチド（抗原性を有する部分ペプチド）を用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば３個以上の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上、いっそう好ましくは６個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例：１ないし数個）は置換可能な基（例：Ｃｙｓ、水酸基等）によって置換されていてもよい。ポリペプチド抗原として用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を１ないし数個含むアミノ酸配列を有する。
　好ましい一実施態様においては、食餌成分の調製物は、適当な固相（例えば、イムノアッセイ用マルチウェルプレート等）上に固定化される。固定化は、必要に応じて一般的なコーティング用緩衝液で希釈した該調製物を固相に添加し、一定時間インキュベートすることにより行うことができる。固相から液体を除去した後、該固相に検体を添加して抗原－抗体複合体を形成させ、目的の抗体を固相上に捕捉する。
　抗食餌成分抗体と反応する物質としては、例えば、抗免疫グロブリン抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、ジャカリン等が挙げられ、抗免疫グロブリン抗体、特に抗ＩｇＧ抗体又は抗ＩｇＡ抗体が好ましい。
　標識酵素としては、ペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、マイクロペルオキシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ホスホリラーゼなどが挙げられるが、特に限定されない。
　酵素基質は、標識酵素の種類に応じて適宜選択されるが、ペルオキシダーゼを標識酵素とする場合は、例えば、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（TMB；Vector Laboratories Inc.社、#SK-4400）を用いることができる。
　反応液を除去し、マイクロプレートリーダー等を用いて、固相上の測定波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、固相に結合した標識量すなわち抗体量を測定することができる。
　診断対象において調べられた抗食餌成分抗体が上昇しているか否かの判定は、例えば、健康動物における抗体価との比較において、統計学的に有意であるか否かによって行うことができる。例えば、健康動物における測定値の平均＋ＳＤ（標準偏差）、平均＋２ＳＤ、平均＋３ＳＤなどを陽性の基準とすることができるが、これらに限定されない。
　本発明の診断方法の好ましい実施態様においては、上記１９種のクローン病特異的な抗食餌成分抗体のうちの２種以上（例、２、３、４、５、６、８、１０又は１５種）の抗体が測定対象となる。２種以上の抗体を組み合わせることによって、クローン病の診断感度及び／又は診断特異度をさらに向上させることができる。２種以上の抗体を組み合わせる場合、グレープフルーツ、キャベツ、レタス、オーツ麦、ピーカンナッツ、イースト、サトウキビ、セロリ、そば及びコーンから選ばれる少なくとも１種の食餌成分に対する抗体を含むことが好ましく、少なくともイースト及びコーンに対する各抗体を含むことがより好ましい。また、別の好ましい態様において、本発明の診断方法は、３種又は４種以上の抗体を組み合わせて用いる。３種以上の抗体を組み合わせる場合、少なくともイースト、コーン、並びにそば又はセロリに対する各抗体を含むことがより好ましい。具体的な組合せの例としては、以下の食餌成分に対する抗体の組合せが挙げられる。
（２種の食餌成分の組合せの例）
・コーン、キャベツ
・コーン、レタス
・コーン、そば
・イースト、グレープフルーツ
・イースト、キャベツ
・イースト、セロリ
・イースト、レタス
・イースト、そば
・イースト、コーン
・イースト、オーツ麦
・イースト、ピーカンナッツ
・サトウキビ、キャベツ
・サトウキビ、コーン
・サトウキビ、イースト
（３種の食餌成分の組合せの例）
・イースト、コーン、そば
・イースト、コーン、セロリ
（４種の食餌成分の組合せの例）
・イースト、コーン、そば、グレープフルーツ
・イースト、コーン、そば、キャベツ
・イースト、コーン、そば、しし唐
・イースト、コーン、そば、トマト
・イースト、コーン、そば、大豆
・イースト、コーン、そば、セロリ
・イースト、コーン、アルファルファ、セロリ
・イースト、コーン、サトウキビ、セロリ
（５種の食餌成分の組合せの例）
・イースト、コーン、そば、グレープフルーツ、アルファルファ
・イースト、コーン、そば、グレープフルーツ、サトウキビ
・イースト、コーン、そば、セロリ、アルファルファ
・イースト、コーン、そば、セロリ、サトウキビ
・イースト、コーン、そば、しし唐、アルファルファ
・イースト、コーン、そば、しし唐、サトウキビ
・イースト、コーン、そば、トマト、アルファルファ
・イースト、コーン、そば、トマト、サトウキビ
・イースト、コーン、そば、大豆、アルファルファ
・イースト、コーン、そば、大豆、サトウキビ
　２種以上の抗食餌成分抗体を組み合わせて診断を行う場合、一部の抗体のみ陽性で他の抗体については陰性となる結果が生じるが、その場合、好ましくは、いずれか１つの抗体について陽性であれば、診断対象はクローン病に罹患しているか罹患する可能性が高いと判定する。そうすることにより、一定の診断特異度を維持したまま、診断感度を格段に向上させることができる。
　本発明はまた、本発明の抗食餌成分抗体と反応する１種以上の食餌成分調製物を含む、クローン病の診断用試薬を提供する。具体的には、食餌成分調製物は、グレープフルーツ、アルファルファ、アボカド、キャベツ、しし唐、レタス、玉ねぎ、ジャガイモ、ほうれん草、トマト、オーツ麦、ピーカンナッツ、イースト、サトウキビ、セロリ、そば、コーン、米及び大豆の１９種から選ばれる食餌成分を処理することにより調製される。当該調製物の調製法は、上記の本発明の方法において記載したとおりである。得られた食餌成分調製物は、例えば、プラスチックチューブ等の容器中に、水、緩衝液、グリセロール等に溶解した状態で提供され、使用直前まで冷蔵もしくは凍結保存することができる。
　上述のように、本発明のクローン病の診断においては、検体中の２種以上の抗食餌成分抗体を測定することが好ましい。したがって、好ましい実施態様において、本発明のクローン病診断用試薬は、２種以上（例、２、３、４、５、６、８、１０又は１５種）の食餌成分調製物を構成として含んでよい。好ましい２種以上の食餌成分の組合せとしては、上記した通りである。
　尚、複数の食餌成分調製物が用いられる場合、それらを混合して１つの試薬としてもよく、あるいは別々の試薬として調製してもよいが、それぞれの抗食餌成分抗体に特異的に反応する物質を提供することは容易ではないので、通常別々の試薬として調製する方が好都合である。
　本発明はまた、本発明の試薬を含むクローン病の診断用キットを提供する。本発明のキットは、食餌成分調製物を単独で又は２種以上の組合せで含み、他の成分として、免疫学的測定方法の種類や採用される検出手段に応じて、必要とされる試薬類を任意に包含し得る。好ましくは、抗食餌成分抗体と反応する物質（例えば、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＡ抗体などの二次抗体）を含み得る。該物質は、酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、着色物質などの標識物質で予め標識化されていてもよいし、別途、標識物質をキットの構成に含めることもできる。また、食餌成分調製物は予め固相に固定化されていてもよいし、別途、固相をキットの構成に含めることもできる。
　また、本発明のキットには、標識物質に応じた基質、又は標識物質と基質との反応を検出するための検出試薬が含まれていてもよく、さらに測定の実施の便宜のために適当な検体希釈液、二次抗体希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄液、酵素基質液、反応停止液などが含まれていてもよい。他に、対照として用いられる健康人由来の標準血清が含まれていてもよい。
　以下に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されるものではない。
参考例１　ヒト血清或いは血漿の取得
　クローン病患者８０例、潰瘍性大腸炎患者４４例及び健康人５２例の血液は、社会保険中央総合病院或いは味の素（株）にて文書を用いた同意の下採取し、血清或いは血漿を得た。検体は番号等で表示し、匿名化した。
実施例１　食餌８８品目抗体価（ＩｇＧ）の測定
　血液採取後、すみやかに遠心分離し取得した血清を冷凍保存し、デトックス（株）を介してGenova Diagnostics（IL, USA）に送付し、IgG Food Antibody Assessment（食餌８８品目）測定を依頼した。食餌８８品目の内訳は、乳製品７品目（カゼイン、チェダーチーズ、カッテージチーズ、牛乳、ヤギのミルク、ラクトアルブミン、ヨーグルト）、野菜２２品目（アルファルファ、アスパラガス、アボカド、大根、ブロッコリー、キャベツ、人参、セロリ、きゅうり、にんにく、しし唐、レタス、マッシュルーム、オリーブ、玉ねぎ、豆、さつまいも、じゃがいも、ほうれん草、サヤインゲン、トマト、ズッキーニ）、果物１６品目（りんご、杏、バナナ、ブルーベリー、クランベリー、ぶどう、グレープフルーツ、レモン、オレンジ、パパイヤ、桃、梨、パイナップル、プラム、木苺、苺）、魚介・肉類１９品目（はまぐり、鱈、カニ、ロブスター、牡蠣、鯛、鮭、鰯、海老、カレイ、鱒、ツナ、牛肉、鶏肉、卵白、卵黄、ラム、豚肉、ターキー）、穀類・ナッツ類１９品目（アーモンド、そば、コーン、コーングルテン、グルテン、いんげん豆、レンズ豆、ライ豆、オーツ麦、ピーナッツ、ピーカンナッツ、うずら豆、米、ライ麦、胡麻、大豆、ひまわりの種、くるみ、小麦）、その他５品目（イースト、サトウキビ、チョコレート、コーヒー、はちみつ）であった。IgGはELISAにより測定され、それぞれの食餌品目の健康人における「平均値＋2SD」を基準として、それ以上のものを陽性とした。食餌８８品目における血清抗体価陽性品目数の平均はクローン病患者で１１品目、潰瘍性大腸炎患者で２品目、健康人では１品目であった。
　各品目における抗体の陽性率（陽性検体数／全検体数×１００）をそれぞれクローン病患者、潰瘍性大腸炎患者、健康人について算出した。
　次に、２～５品目を組合せた時の陽性率及び特異度（陰性検体数／全検体数×１００）、診断効率（陽性率×特異度／１００）を算出した。
結果
　クローン病患者において健康人及び潰瘍性大腸炎患者より有意に陽性率が高かった食餌品目は１９品目（グレープフルーツ、アルファルファ、アボカド、キャベツ、セロリ、しし唐、レタス、玉ねぎ、じゃがいも、ほうれん草、トマト、そば、コーン、オーツ麦、ピーカンナッツ、米、大豆、イースト、サトウキビ）であった。１９品目のクローン病患者（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎患者（ＵＣ）、及び健康人（ＨＣ）における陽性率を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、各測定によって得られた吸光度（抗体量）から、１９種の食餌抗原に対する抗体２種を組合せた場合における、感度（クローン病患者の全検体に対し陽性と判定された検体数；陽性率）を算出した結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　各測定によって得られた吸光度（抗体量）から、各食餌抗原に対する抗体単独及びそれら抗体を２種～１９種組合せた場合における、感度、及び特異度を算出した。２品目から５品目を組合せた時の一部の組合せについて、ＣＤ陽性率、ＵＣ、ＨＣの特異度、ＵＣに対するＣＤの診断効率を表３－１～表３－４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以上の結果より、抗体を組合せることによって、１種の抗体量を単独で測定した場合と比較して、感度が有意に向上することが明らかとなった。また各組合せにおいて高い特異性が見られ、感度と特異度を掛け合わせて算出した診断効率も同様に、抗体の組合せにおいて顕著に向上した。
　したがって、本発明によれば、クローン病の特異的かつ効率的な診断が可能となり、内視鏡検査など高度の経験と技術を要し、しかも患者に身体的・精神的苦痛与える侵襲的方法を経ないでも、安全かつ高感度にクローン病の診断が実施可能となる。
実施例２　食餌成分の調製物に対する血清抗体価の測定
　上記の結果より得られた有用な食餌成分のうち、コーン、イースト、そば、セロリを選択し、98例のＣＤ、50例のＵＣ、52例のＨＣの血清について、各種食餌成分の調製物に対する血清抗体価の測定を行った。なお、本実施例では食餌成分の調製物として粉末材料を使用した。
　血清抗体価測定用の抗原液として、コーン、イースト、そば、セロリの各種粉末（いずれもAllergon社製）をPBS(-)で懸濁し、遠心分離（5000rpm、5分間）することにより得られた上清を用いた。抗原液は、タンパク質濃度がそれぞれ1μg/mlとなるようcoating buffer（SIGMA社製、cat. No. 076K8206）により調製し、ELISAプレート（住友ベークライト社製、cat. No. MS-8896F）に50μl/wellで添加し、4℃で一晩反応させた。ウェル中の抗原液を除去した後、洗浄液（0.1% Tween20含有PBS(-)で20倍希釈したイムノブロック（DSファーマバイオメディカル社製、cat. No. KN001A））により1回洗浄し、蒸留水で5倍希釈したイムノブロックを室温で1時間反応させた。洗浄液で1回洗浄した後、洗浄液で10000倍希釈した血清を添加し、室温で2時間反応させた。反応後、洗浄液で3回洗浄を行い、洗浄液で500倍希釈したHRP標識マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体（Invitrogen社製、cat. No. 05-4220）を加えて室温で1時間反応させた。その後、洗浄液で洗浄を3回行い、TMB（BD Biosciences社製、cat. No. 555214）を反応させ、2N 硫酸で反応を停止し、マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Benchmark Plus）を用いて波長450nmの吸光度を測定した。
　同プレートに、coating bufferで1000倍希釈した抗ヒトIgG抗体（EXBIO社製、cat. No.11-31-9-C100）を50μl/well添加したウェルを準備し、reference serum（BETHYL社製、cat. No.RS10-101）を0.01～10μg/mlで反応させ、波長450nmの吸光度を各濃度において測定して検量線を作成し、血清サンプルのIgG Titerを算出した。
　各種食餌成分に対する健康人のIgG Titerの「平均値+2SD」を算出し、それ以上の場合を陽性と評価した。各種食餌成分における陽性率（陽性検体数／全検体数×１００）を、ＣＤ、ＵＣ、ＨＣごとに算出した。
結果
　各種食餌成分に対する陽性率を表４に示す。食餌成分の調製物を用いて測定した抗体陽性率は、使用した食餌原料が異なるにも関わらず、ＣＤ、ＵＣ、ＨＣのいずれもGenova Diagnosticsにて測定した陽性率（表１）と比べてほぼ同等であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　さらに、上記４品目の食餌成分の２～４品目を組み合わせたときの、ＣＤ陽性率、ＵＣ及びＨＣの特異度、ＵＣに対するＣＤの診断効率を、表５－１～５－３に示す。食餌成分の調製物を用いて測定した場合、２～４品目を組み合わせた陽性率はいずれも約70%、特異度も90%以上であり、約65～74%の診断効率が得られた。本結果は、Genova Diagnosticsにて測定した結果（表３－１～３－３）と比較すると陽性率はやや低いものの、特異度は同程度以上であった。これらの結果により、本測定方法を用いたクローン病の診断が可能であることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
実施例３　抗原の同定
　実施例１の結果より得られた有用な食餌の抗原について、具体的に抗原として使用可能なタンパク質の同定を行った。
　その中の一つとして、米の粉末（Allergon社製）を2% SDS溶液に懸濁し、1レーン当り125μg相当の粉末の懸濁液をSDS-PAGEに供した。SDS-PAGEでタンパク質を分離した後、60mA定電流の条件で60分間、PVDF膜に転写した。PVDF膜をラピッドステインCBB（ナカライテスク社製）で染色してタンパク質を検出した後、ＨＣの血清及び米に対する抗体価が陽性であったＣＤの血清をそれぞれ1000倍希釈したものを１次抗体とし、5000倍希釈したHRP標識抗ヒトIgG抗体（GEヘルスケア社製）を２次抗体として、ウェスタンブロッティングを行った。ＣＤの血清により特異的に検出されたバンドについて、プロテイン・リサーチ・ネットワーク（http://protein-research.org/）にてPeptide Mass Finger printing（PMF）解析を行った。
結果
　米タンパク質のCBB染色結果を図１に、ウェスタンブロッティングの結果を図２にそれぞれ示す。図２中のバンドＡのタンパク質が、ＣＤ血清中の抗体と特異的に反応した。バンドＡのタンパク質（約33kDa）をPMF解析した結果を表６に示す。PMF解析により得られたペプチドフラグメントの分子量パターンより、バンドＡのタンパク質はGlutelin（Accession No. ABF96730.1）と推定された（表７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　また、米粉末におけるGlutelin以外のタンパク質を上記と同様の方法で同定し、さらに米以外の食餌成分として、そば、コーン及びサトウキビの各種粉末（いずれもAllergon社製）を用いて、上記の米粉末と同様の処理により各種食餌成分に含まれる有用なタンパク質抗原を同定した。これらの結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
実施例４　Glutelinを用いた血清抗体価の測定
　米（ひとめぼれ）よりSpectrum（商標） Plant Total RNA kit（SIGMA Aldrich社製）でtotal RNAを抽出した。Glutelin type-A 3 precursor（Accession No. ABF96730.1）のmRNA配列（Accession No. NM_001056948）より設計した以下のプライマーを用い、全長Glutelin遺伝子を取得した。
　Forward primer：GGATCCATGGCAACCATCAAATTCCCTATAG（配列番号：１）
　Reverse primer：GCGGCCGCTTAGTGGTGATGATGGTGATGTGCACTC（配列番号：２）
　取得したGlultelin遺伝子を発現ベクターpGEX-6P-1（GEヘルスケア社製）に導入し、Hisタグ、GST（Glutathione S-Transferase）融合Glutelin発現ベクター（pGEX-GSTOSG30His）を構築した。pGEX-GSTOSG30Hisを導入した大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL（Stratagene社製）を用い、GST-Glutelin-Hisタグ融合タンパク質を発現し、菌体よりNi-NTA Agarose（QIAGEN社製）で精製を行い、以下の抗Glutelin抗体価測定に供試した。
　98例のＣＤ及び52例のＨＣの血清についてELISAにより抗Glutelin抗体価の測定を行った。抗Glutelin抗体価は、Sutton CLらの方法（Gastroenterology 119:23-31, 2000）に従い、GST融合タンパク（Glutelin-GST）に対する反応として得られた値からGSTに対する反応の値を引き算することにより算出した。
　抗原液として、Glutelin-GST及びGSTについて等モル数になるようcoating buffer（SIGMA社製、cat. No. 076K8206）を用いて100μg/ml及び32μg/mlに調製し、ELISAプレート（住友ベークライト社製、cat. No. MS-8896F）に50μl/wellで添加し、4℃で一晩反応させた。抗原液を除去した後、洗浄液（0.1% Tween20含有PBS(-)で20倍希釈したイムノブロック（DSファーマバイオメディカル社製、cat. No. KN001A））により1回洗浄し、0.1% Tween20含有PBS(-)で5倍希釈したイムノブロックを室温で1時間反応させた。洗浄液で1回洗浄した後、洗浄液で100倍希釈した血清をウェルに添加し、室温で2時間反応させた。次いで洗浄液で3回洗浄し、洗浄液で500倍希釈したHRP標識マウス抗ヒトIgGモノクローナル抗体（Invitrogen社製、cat. No. 05-4220）を室温で1時間反応させた。反応後、洗浄液による洗浄を3回行い、TMB（BD Biosciences社製、cat. No. 555214）を反応させ、2N 硫酸で反応を停止し、マイクロプレートリーダー（BIO-RAD Benchmark Plus）を用いて波長450nmの吸光度を測定した。
　同プレートに、coating bufferで1000倍希釈した抗ヒトIgG抗体（EXBIO社製、cat. No.11-31-9-C100）を50μl/well添加したウェルを準備し、reference serum（BETHYL社製、cat. No.RS10-101）を0.01～10μg/mlで反応させ、波長450nmの吸光度を各濃度において測定して検量線を作成し、血清サンプルのIgG Titerを算出した。
結果
　ＨＣにおけるIgG Titerの「平均値+2SD」以上を陽性と評価した。ＨＣのIgGの平均値は0.09であり、2SDの値は0.56であったため、0.64以上を陽性とした。このときのCDにおける陽性検体は、98例中29例であり、陽性率は30%であった。これに対して、健康人における陽性検体は52例中2例であり、陽性率は3.8％であった。
　以上の結果は、表１中の米について示されたＣＤにおける陽性率30%及び健康人における陽性率0%と同等の陽性率であった。
　このように食餌に対する抗体価測定方法として、食餌成分の粉末材料又は食餌中の単一抗原タンパク質を代用することにより、その食餌に対する抗体の陽性判定及びクローン病診断が可能となる。また、リコンビナントタンパク質産生を利用することにより抗原タンパク質を均一かつ安定に供給することができ、そのようにして供給された単一の抗原タンパク質を用いれば、診断キットの安定的な生産及び信頼性の向上を実現することが可能となる。
　クローン病に特異的な抗食餌成分抗体の測定を組み合わせることによって、クローン病の診断効率及び特異性を格段に向上させることが可能となり、また高度の技術を要し患者への負担も大きい内視鏡などの侵襲的方法を経ないでも、クローン病の確定診断が可能となる範囲が格段に拡張される。
　本出願は、日本で出願された特願2009-052692（出願日：2009年3月5日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (15)

  1. 　対象から採取した検体中の、グレープフルーツ、アルファルファ、アボカド、キャベツ、しし唐、レタス、玉ねぎ、ジャガイモ、ほうれん草、トマト、オーツ麦、ピーカンナッツ、イースト、サトウキビ、セロリ、そば、コーン、米及び大豆からなる群より選択される１種以上の食餌成分に対する各抗体を測定することを特徴とする、該対象におけるクローン病の診断方法（但し、１種の食餌成分に対する抗体を測定する場合、該食餌成分はセロリ、そば、コーン、イースト及び大豆以外である）。
  2. 　２種以上の食餌成分に対する各抗体を測定することを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 　少なくとも１種の食餌成分がセロリ、そば、コーン、イースト及び大豆以外である、請求項２記載の方法。
  4. 　グレープフルーツ、キャベツ、レタス、オーツ麦、ピーカンナッツ、イースト、サトウキビ、セロリ、そば及びコーンからなる群より選択される少なくとも１種の食餌成分に対する抗体を測定することを特徴とする、請求項２又は３記載の方法。
  5. 　少なくともイースト及びコーンに対する各抗体を測定することを特徴とする、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　３種以上の食餌成分に対する各抗体を測定することを特徴とする、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　少なくともイースト、コーン、並びにそば又はセロリに対する各抗体を測定することを特徴とする、請求項６記載の方法。
  8. 　食餌成分に含有されるポリペプチド抗原に対する各抗体を測定することを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記ポリペプチド抗原がGlutelinである、請求項８に記載の方法。
  10. 　グレープフルーツ、アルファルファ、アボカド、キャベツ、しし唐、レタス、玉ねぎ、ジャガイモ、ほうれん草、トマト、オーツ麦、ピーカンナッツ、米及びサトウキビからなる群より選択される食餌成分の調製物を含有してなる、クローン病の診断用試薬。
  11. 　前記調製物が、単離又は精製されたポリペプチド抗原である、請求項１０に記載の試薬。
  12. 　前記ポリペプチド抗原が、Glutelin又は抗原性を有するその部分ペプチドである、請求項１１に記載の試薬。
  13. 　グレープフルーツ、アルファルファ、アボカド、キャベツ、しし唐、レタス、玉ねぎ、ジャガイモ、ほうれん草、トマト、オーツ麦、ピーカンナッツ、イースト、サトウキビ、セロリ、そば、コーン、米及び大豆からなる群より選択される２種以上の食餌成分の調製物を含んでなる、クローン病の診断用キット。
  14. 　前記調製物が、単離又は精製されたポリペプチド抗原である、請求項１３に記載のキット。
  15. 　前記ポリペプチド抗原が、Glutelin又は抗原性を有するその部分ペプチドである、請求項１４に記載のキット。
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