KR20110131262A

KR20110131262A - 크론병 진단 시약

Info

Publication number: KR20110131262A
Application number: KR1020117023240A
Authority: KR
Inventors: 야스요 스가; 마이코 모리; 마사키 하시모토; 마나부 스즈키; 도모미 모리구치; 다카아키 가와구치; 게이코 사이토; 마사카즈 다카조에
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 2009-03-05
Filing date: 2010-03-05
Publication date: 2011-12-06
Also published as: CN102341705A; US20120058497A1; JPWO2010101255A1; CN102341705B; JP5660027B2; WO2010101255A1

Abstract

크론병을 안전하고 간편하게, 특이적으로 진단하기 위한 시약 및 방법을 제공한다. 대상으로부터 채취한 검체 중의 그레이프후루츠, 알팔파, 아보카도, 양배추, 피망, 양상추, 양파, 감자, 시금치, 토마토, 귀리, 피칸, 이스트, 사탕수수, 셀러리, 메밀, 옥수수, 쌀 및 대두로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 식이 성분에 대한 각 항체를 측정하는 것을 포함하는, 당해 대상에 있어서의 크론병의 진단 방법, 상기 식이 성분의 제조물을 포함하는 크론병의 진단용 시약 또는 키트를 제공한다.

Description

크론병 진단 시약{Diagnostic reagent for crohn's disease}

본 발명은 크론병을 안전하고 고감도로 특이적으로 진단하는 방법 및 크론병의 진단용 시약, 및 그 시약을 포함하는 진단용 키트에 관한 것이다.

크론병은 궤양성 대장염(UC)과 함께, 면역학적 응답의 이상에 기초하는 국소 염증성 장질환(IBD)으로 분류되는 질환이다. 염증이 대장으로 국한되는 UC와 달리, 크론병은 구강에서부터 항문까지의 소화관의 모든 부위에도 궤양이 생기는 병이다. 임상 증상으로서는, 복통, 설사가 주이며, 또한 발열, 하혈, 흡수 장해에 의한 체중 감소, 전신 권태감, 빈혈 등의 증상도 종종 나타난다. 또한, 괴저성 농피증, 결절성 홍반 등의 피부 증상, 관절 병변, 구내염 등의 장관외 합병증을 병발하는 경우가 있다.

그러나, 크론병의 병인은 아직 충분히 해명되고 있지 않아 그 진단과 치료에는 한계가 있다.

예를 들면, 크론병의 진단은, 임상 소견 외에, X선 조영 검사, 내시경 검사, 내시경하에 채취한 생검 표본의 조직 검사 등을 종합적으로 판단하여 이루어져 왔지만, 이러한 검사는 검사전의 장관 내부 청정에 시간을 필요로 하고, 조영제의 투여나 내시경의 장관으로의 삽입 등, 환자에 대해 육체적·정신적으로 큰 부담을 주는 데다가 손 기술 및 판별에 경험과 숙련된 기술을 필요로 한다.

특히, 소장형 또는 소장 우위의 소장 대장형의 경우, 소장 구조의 복잡성 및 발증 부위가 내시경의 삽입부(항문 또는 구강)로부터 먼 것 등의 이유에서, X선 조영 검사 또는 내시경에 의한 검사는, 한층 고도의 기술을 필요로 한다.

또한, 유사한 병리 소견을 나타내는 UC 등의 다른 염증성 장질환과의 감별이 곤란한 케이스도 많으며, 안전하고 간편하며 크론병에 특이적인 진단 방법이 요구되고 있다.

크론병의 발증 및 증악에는, 다양한 유전적 및 환경적 요인이 복잡하게 영향을 주고 있는 것으로 생각되지만, 그 중에서도 장내 세균을 포함하는 미생물 유래 항원의 관여가 시사되고 있으며, 미생물에 대한 이상 면역 응답이 크론병에 있어서의 염증 반응에 깊이 관여하고 있는 것으로 생각되고 있다. 예를 들면, 항사카로마이세스 세레비시아에(anti-Saccharomyces cerevisiae) 항체(ASCA), 항I2 항체, 항외막 단백질 C(OmpC) 항체, 항플라젤린 항체 등이, 크론병 환자의 혈청 중에서 특이적으로 증가하고 있는 것이 보고되어 있다. 한편, 미생물 이외에도, CRP나 돼지 아밀라제에 대한 항체가가 크론병 환자의 혈청 중에서 특이적으로 증가하고 있다는 보고도 있다. 이러한 지견에 기초하여, 이들 항체를 검출하는 것에 의한 비침습적인 크론병의 진단 방법이 제안되어 있다(특허문헌 1 및 2, 비특허문헌 1 내지 3).

그러나, 단일 항체를 마커로서 사용한 이들 방법에서는, 모두 감도(유병정진율(有病正診率))가 고작해야 40% 정도에 그친다. 복수의 항체를 조합함으로써 감도를 향상시킬 수 있지만(특허문헌 3), I2 항원, OmpC 항원, 플라젤린 항원, CRP 항원은 입수가 곤란한 등의 문제가 있다.

식이도 장내 세균과 같이, 장관을 통과하는 이물로서 장관 면역에 영향을 줄 가능성이 있다. 크론병의 치료에 성분 영양 요법이 유효한 점에서, 병인 또는 증악 인자로서 어떠한 식이 항원의 존재가 시사되지만, 특정한 식이 항원의 크론병으로의 관여는 아직 밝혀져 있지 않다.

특허문헌 1: 일본 공개특허공보 제(평)11-190734호 특허문헌 2: 특표(特表) 2004-526122호 특허문헌 3: 일본 공개특허공보 2006-308494호

비특허문헌 1: Jpn J Electroph 1999; 43: 139-145 비특허문헌 2: Gastroenterology 2002; 123: 689-699 비특허문헌 3: Gastroenterology 2000; 119: 23-31

본 발명이 해결하려고 하는 과제는, 크론병을 안전하고 간편하게, 특이적으로 진단하는 신규 방법, 및 이를 위한 시약 및 상기 시약을 포함하여 이루어지는 진단용 키트를 제공하는 것에 있다.

상기 과제의 해결에 있어서, 본 발명자들은 우선, 크론병에서는 장관 상피의 배리어 기구에 장해가 있기 때문에 막투과성이 항진하여, 항원에 폭로되기 쉽다는 보고가 있는 것에 주목하고, 식이 항원이 크론병에 있어서의 염증 반응에 관여하고 있을 가능성이 있다고 착상하였다. 그래서, 크론병 환자, UC 환자 및 건강인으로부터 채취한 혈청 중의, 다양한 식이 성분에 대한 항체가를 측정, 서로 비교하였다. 그 결과, 크론병 환자 유래의 검체에 있어서 특이적으로 혈청 항체가의 상승이 확인된 식이 성분 19 품목을 동정하는 것에 성공하였다. 이 중 14 품목에 관해서는, 지금까지 크론병과의 관련이 전혀 시사되어 있지 않은 식이 성분이었다.

또한, 본 발명자들은 이들 19 품목 중 2종 이상을 조합하여 사용함으로써, 크론병 진단의 감도 및 특이도(무병정진율(無病正診率))를 보다 향상시킬 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다:

[1] 대상으로부터 채취한 검체 중의, 그레이프후루츠, 알팔파, 아보카도, 양배추, 피망, 양상추, 양파, 감자, 시금치, 토마토, 귀리, 피칸, 이스트, 사탕수수, 셀러리, 메밀, 옥수수, 쌀 및 대두로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 식이 성분에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 당해 대상에 있어서의 크론병의 진단 방법(단, 1종의 식이 성분에 대한 항체를 측정하는 경우, 당해 식이 성분은 셀러리, 메밀, 옥수수, 이스트 및 대두 이외이다).

[2] 상기 항목 [1]에 있어서, 2종 이상의 식이 성분에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.

[3] 상기 항목 [2]에 있어서, 적어도 1종의 식이 성분이 셀러리, 메밀, 옥수수, 이스트 및 대두 이외인, 방법.

[4] 상기 항목 [2] 또는 [3]에 있어서, 그레이프후루츠, 양배추, 양상추, 귀리, 피칸, 이스트, 사탕수수, 셀러리, 메밀 및 옥수수로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 1종 식이 성분에 대한 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.

[5] 상기 항목 [2] 내지 [4] 중의 어느 하나에 있어서, 적어도 이스트 및 옥수수에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.

[6] 상기 항목 [2] 내지 [5] 중의 어느 하나에 있어서, 3종 이상의 식이 성분에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.

[7] 상기 항목 [6]에 있어서, 적어도 이스트, 옥수수, 및 메밀 또는 셀러리에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.

[8] 상기 항목 [1] 내지 [7] 중의 어느 하나에 있어서, 식이 성분에 함유되는 폴리펩티드 항원에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.

[9] 상기 항목 [8]에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원이 글루텔린(glutelin)인, 방법.

[10] 그레이프후루츠, 알팔파, 아보카도, 양배추, 피망, 양상추, 양파, 감자, 시금치, 토마토, 귀리, 피칸, 쌀 및 사탕수수로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 식이 성분의 조제물(調製物)을 함유하여 이루어지는, 크론병의 진단용 시약.

[11] 상기 항목 [10]에 있어서, 상기 조제물이, 단리 또는 정제된 폴리펩티드 항원인, 시약.

[12] 상기 항목 [11]에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원이, 글루텔린 또는 항원성을 갖는 이의 부분 펩티드인, 시약.

[13] 그레이프후루츠, 알팔파, 아보카도, 양배추, 피망, 양상추, 양파, 감자, 시금치, 토마토, 귀리, 피칸, 이스트, 사탕수수, 셀러리, 메밀, 옥수수, 쌀 및 대두로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2종 이상의 식이 성분의 조제물을 포함하여 이루어지는, 크론병의 진단용 키트.

[14] 상기 항목 [13]에 있어서, 상기 조제물이, 단리 또는 정제된 폴리펩티드 항원인, 키트.

[15] 상기 항목 [14]에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원이, 글루텔린 또는 항원성을 갖는 이의 부분 펩티드인, 키트.

본 발명의 진단 방법은, 크론병에 특이적인 항식이(抗食餌) 성분 항체의 항체가(抗體價) 측정을 조합함으로써, 크론병 진단의 감도 및 특이도를 훨씬 향상시켜 고도의 기술을 필요로 하며 환자에 대한 부담도 큰 내시경 등의 침습적 방법에 의한 진단의 적응 범위를 한정할 수 있는 점에서, 현저한 효과를 나타낸다. 또한, 식이 성분을 사용하기 때문에, 시약의 입수가 용이하다는 새로운 이점을 가진다.

도 1은 쌀 단백질의 CBB 염색의 결과를 도시하는 도면이다. 레인 M은 단백질 분자량 마커를, 레인 a는 쌀 단백질을 각각 나타내고, 좌단의 수치는 단백질의 분자량(kDa)을 나타낸다.
도 2는 쌀 단백질의 웨스턴 블로팅의 결과를 도시하는 도면이다. 레인 C는 크론병 환자(CD)의 혈청을, 레인 H는 건강인(HC)의 혈청을 항체로서 각각 사용한 결과를 나타내고, 좌단의 수치는 단백질의 분자량(kDa)을 나타낸다. 「A」는, CD의 혈청 중의 항체와 특이적인 반응이 나타난 밴드를 나타낸다.

본 발명은 진단 대상으로부터 채취한 검체 중의, 1종 이상의 크론병 특이적인 항식이 성분 항체를 측정하는 것을 포함하는, 크론병의 진단 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서 「크론병 특이적인 항식이 성분 항체」란, 크론병에 나환(罹患)된 동물에 있어서 특이적으로 항체가가 상승하는, 식이 성분에 대한 항체를 말하며, 구체적으로는, 그레이프후루츠, 알팔파, 아보카도, 양배추, 피망, 양상추, 양파, 감자, 시금치, 토마토, 귀리, 피칸, 이스트, 사탕수수, 셀러리, 메밀, 옥수수, 쌀 및 대두의 19종의 식이 성분에 대한 각 항체를 의미한다(이하, 「본 발명의 항식이 성분 항체」라고도 한다). 한편, 여기에서 「크론병 특이적」이란, 크론병에 나환된 동물에 있어서 항체가가 상승하고 있는 빈도(양성률; 유병정진률)가, 적어도 UC에 나환된 동물 및 건강 동물에 있어서의 당해 빈도에 비해서 유의적으로 높은 것을 말한다.

또한, 본 발명의 항식이 성분 항체는, 각종 식이 성분에 함유되는 폴리펩티드 항원(각종 식이 성분의 항원)에 대한 각 항체라도 좋다. 식이 성분의 폴리펩티드 항원은, 구체적으로는, 그레이프후루츠, 알팔파, 아보카도, 양배추, 피망, 양상추, 양파, 감자, 시금치, 토마토, 귀리, 피칸, 이스트, 사탕수수, 셀러리, 메밀, 옥수수, 쌀 및 대두의 식이 성분에 함유되는 폴리펩티드 항원으로서, 크론병 특이적인 폴리펩티드 항원이면 어떤 것이라도 좋다. 본 발명에서는, 상기 19종류의 식이 성분 중, 쌀, 메밀, 옥수수 및 사탕수수가 바람직하고, 이들에 포함되는 폴리펩티드 항원으로서는, 쌀이라면 글루텔린, 글리옥실라제 1, 에놀라제, UDP-글루코즈 피로포스포릴라제, 아스파라트 프로테아제, 프롤라민, 올레오신 등이, 메밀이라면 클라트린 등이, 옥수수라면 2,3-비스포스포글리세레이트-비의존성 포스포글리세레이트뮤타제, 단백질 디설파이드 이소머라제, 케톨-산 레덕토이소머라제, 연장인자 1 알파, 페닐알라닌 암모니아-리아제 등이, 사탕수수라면 트리포스페이트 이소머라제 1, NBS-LRR 타입 RGA 등이 예시된다.

본 발명의 진단 방법에 있어서, 진단 대상은 크론병(인간의 크론병에 상당하는 비인간 염증성 장질환을 포함한다)에 나환될 수 있는 임의의 동물이면 좋은데, 예를 들면 포유 동물이며, 구체적으로는 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 토끼, 래트 및 마우스 등이 예시된다.

진단을 위한 검체는 진단 대상으로부터 단리 가능하며, 크론병 특이적인 항식이 성분 항체가 존재할 가능성이 있는 대상 유래의 성분 또는 조직이면, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 혈액(전혈, 혈청, 혈장), 타액, 그 밖의 체액, 각종 조직 등을 들 수 있지만, 특히 혈청 또는 혈장이 바람직하다. 참고를 위한 궤양성 대장염 환자 및/또는 대조로 하는 건강인의 검체를 사용하는 경우에는, 이들 검체에 관해서도 마찬가지이다.

검체 중의 각 항체의 측정 방법은, 면역학적 측정법으로서, 항체를 검출하여 측정하기 위해서 사용되는 방법이면 어느 것이라도 좋으며, 효소, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 물질, 착색 물질 등을 표식 물질로 하는 관용의 측정 방법이 모두 사용 가능하지만, 효소 면역 측정법, 면역 크로마토그래피법 등이 바람직하고, 또한, 검체 중의 항체량을 착색양이나 흡광도에 의해 용이하게 수치화할 수 있는 점에서 효소 면역 측정법, 예를 들면 ELISA법이 특히 바람직하다. 다품목에 대한 항체를 동시에 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 식품 93 품목 IgG가 측정 가능한 시판 ELISA 키트(93 Food IgG Screen/GENESIS Diagnostics사 등)를 사용할 수 있고, 또는 민간 검사 기관에 측정을 의뢰할 수도 있다(IgG Food Antibody Assessment/Genova Diagnostics사 등). 측정에 필요한 각종 기구, 자재, 시약류, 표식 방법 및 측정 조건은, 공지의 것이 모두 사용 가능하다.

항체에 결합한 표식양의 측정은, 표식 물질의 종류에 따라서 관용의 방법이 선택되며, 예를 들면, 효소를 표식 물질로 하는 경우에는 발색 기질의 분해를 분광 광도계에 의해 흡광도로서 측정하는 것이 유리하다.

예를 들면, ELISA법에 의한 본 발명의 항식이 성분 항체의 측정은, 우선, 검체를 식이 성분의 조제물과 반응시켜 항원-항체 복합체를 생성시키고, 계속해서, 효소 표식한, 항식이 성분 항체와 반응하는 물질을 첨가하고, 또한 효소 기질을 첨가하여 반응시키고, 반응 생성물의 표식양을 효소 활성에 의해 측정함으로써 실시할 수 있다.

식이 성분의 조제물은, 관용의 방법에 의해 식이 성분을 처리함으로써 조제할 수 있다. 원료가 되는 식이 성분은, 시판 중인 신선·냉동·동결 건조품, 또는 이의 분말 재료[참조: Allergon사 등 제조], 식이 성분의 처리 방법으로서는, 바람직하게는 추출을 들 수 있다. 추출은, 예를 들면 원료를, 물, 유기 용매, 완충액, 또는 글리세롤 중에서 물리적으로(초음파, 프렌치프레스, 유발, 균질기, 유리 비드, 동결 융해 등) 또는 계면활성제로 처리함으로써 실시할 수 있다. 염의 첨가나, 가온함으로써 추출 효율을 향상시키는 것이 가능하다. 또한, 식이 성분의 조제물로서는, 상기 방법으로 수득되는 추출물 이외에, 시판 중인 단백질 추출액[참조: BioChain사, Antigen Laboratories사 등 제조] 및/또는 진단용 알레르겐 추출물[참조: 토리이야쿠힌 가부시키가이샤, Antigen Laboratories사 등 제조] 등이 사용 가능하다.

식이 성분의 조제물로서는, 식이 성분에 함유되는 상기 폴리펩티드 항원의 단리 또는 정제물이라도 좋다. 단리 또는 정제된 폴리펩티드 항원은, 예를 들면, (a) 식이 성분의 조직 또는 세포로부터 공지의 방법 또는 그것에 준하는 방법을 사용하여 조제, (b) 펩티드 합성기(peptide synthesizer) 등을 사용하는 공지의 펩티드 합성 방법으로 화학적으로 합성, (c) 폴리펩티드 항원을 암호화하는 DNA를 함유하는 형질 전환체를 배양, 또는 (d) 폴리펩티드 항원을 암호화하는 핵산을 주형으로 하여 무세포 전사/번역계를 사용하여 생화학적으로 합성함으로써 제조된다.

(a) 식이 성분의 조직 또는 세포로부터 폴리펩티드 항원을 조제하는 경우, 이의 조직 또는 세포를 균질화한 후, 조분획물(예: 막 획분, 가용성 획분)을 그대로 폴리펩티드 항원으로서 사용할 수도 있다. 또는 산, 계면활성제 또는 알코올 등으로 추출을 실시하고, 당해 추출액을, 염석, 투석, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 조합함으로써 정제 단리할 수도 있다. 수득된 단백질을 그대로 폴리펩티드 항원으로 할 수도 있고, 펩티다제 등을 사용한 한정 분해에 의해 부분 펩티드를 조제하고 이를 폴리펩티드 항원으로 할 수도 있다.

(b) 화학적으로 폴리펩티드 항원을 조제하는 경우, 합성 펩티드로서는, 예를 들면 상기의 (a)의 방법을 사용하여 천연 재료로부터 정제한 단백질과 동일한 구조를 갖는 것, 구체적으로는, 당해 단백질의 아미노산 배열에 있어서 적어도 3개 이상, 바람직하게는 6개 이상의 아미노산으로 이루어지는 임의의 개소의 아미노산 배열과 동일한 아미노산 배열을 1종 또는 2종 이상 함유하는 펩티드 등이 사용된다.

(c) DNA를 함유하는 형질 전환체를 사용하여 폴리펩티드 항원을 제조하는 경우, 당해 DNA는, 공지의 클로닝 방법(예를 들면, Molecular Cloning 2nd ed.(J. Sambrook et al., Cold Spring HarborLab. Press, 1989)에 기재된 방법 등)에 따라서 제작할 수 있다. 당해 클로닝 방법이란, (1) 폴리펩티드 항원을 암호화하는 유전자 서열에 기초하여 디자인한 DNA 프로브를 사용하고, 식이 성분의 cDNA 라이브러리로부터 하이브리드화법에 의해 당해 폴리펩티드 항원을 암호화하는 DNA를 단리하거나, (2) 폴리펩티드 항원을 암호화하는 유전자 서열에 기초하여 디자인한 DNA 프라이머를 사용하고, 식이 성분 유래의 cDNA를 주형으로 하여 PCR법에 의해 당해 항원을 암호화하는 DNA를 조제하고, 당해 DNA를 숙주에 적합한 발현 벡터에 삽입하는 방법 등을 들 수 있다. 당해 발현 벡터에서 숙주를 형질 전환하여 수득되는 형질 전환체를 적당한 배지 중에서 배양함으로써, 원하는 폴리펩티드 항원을 수득할 수 있다.

(d) 무세포 전사/번역계를 이용하는 경우, 상기 (c)와 같은 방법에 의해 조제한 폴리펩티드 항원을 암호화하는 DNA를 삽입한 발현 벡터(예를 들면, 당해 DNA가 T7, SP6 프로모터 등의 제어하에 놓여진 발현 벡터 등)를 주형으로 하고, 당해 프로모터에 적합한 RNA 폴리머라제 및 기질(NTPs)을 포함하는 전사 반응액을 사용하여 mRNA를 합성한 후, 당해 mRNA를 주형으로 하여 공지의 무세포 번역계(예: 대장균, 토끼 망상 적혈구, 밀 배아 등의 추출액)를 사용하여 번역 반응을 실시하는 방법 등을 들 수 있다. 염 농도 등을 적당히 조정함으로써, 전사 반응과 번역 반응을 동일 반응액 중에서 일괄적으로 실시할 수도 있다.

또한, 「단리 또는 정제」란, 목적으로 하는 성분 이외의 성분을 제거하는 조작이 이루어지고 있는 것을 의미한다. 「단리 또는 정제된 폴리펩티드 항원」에 포함되는, 목적으로 하는 폴리펩티드의 함유량은, 시료 중의 폴리펩티드의 통상 60중량% 이상, 바람직하게는 80중량% 이상, 보다 바람직하게는 90중량% 이상, 가장 바람직하게는 95중량% 이상이다.

폴리펩티드 항원으로서는 완전한 단백질 분자나 이의 부분 아미노산 배열을 포함하는 항원성을 갖는 펩티드(항원성을 갖는 부분 펩티드)를 사용할 수 있다. 부분 아미노산 배열로서는, 예를 들면 3개 이상의 연속하는 아미노산 잔기로 이루어지는 것, 바람직하게는 4개 이상, 보다 바람직하게는 5개 이상, 한층 바람직하게는 6개 이상의 연속하는 아미노산 잔기로 이루어지는 것을 들 수 있다. 이러한 아미노산 잔기의 일부(예: 1개 내지 수개)는 치환 가능한 기(예: Cys, 하이드록실기 등)에 의해 치환되어 있어도 좋다. 폴리펩티드 항원으로서 사용되는 펩티드는, 이러한 부분 아미노산 배열을 1개 내지 수개 포함하는 아미노산 배열을 가진다.

바람직한 일 실시 형태에 있어서는, 식이 성분의 조제물은, 적당한 고상(固相)(예를 들면, 면역분석용 멀티웰 플레이트 등) 위에 고정화된다. 고정화는, 필요에 따라 일반적인 코팅용 완충액으로 희석한 당해 조제물을 고상에 첨가하고, 일정 시간 동안 인큐베이트함으로써 실시할 수 있다. 고상으로부터 액체를 제거한 후, 당해 고상에 검체를 첨가하여 항원-항체 복합체를 형성시키고, 목적 항체를 고상 위에 포착한다.

항식이 성분 항체와 반응하는 물질로서는, 예를 들면, 항면역 글로불린 항체, 프로테인 A, 프로테인 G, 자칼린 등을 들 수 있고, 항면역 글로불린 항체, 특히 항IgG 항체 또는 항IgA 항체가 바람직하다.

표식 효소로서는, 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 알칼리포스파타제, 마이크로퍼옥시다제, 카르복시펩티다아제, 포스포릴라제 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.

효소 기질은, 표식 효소의 종류에 따라서 적절히 선택되지만, 퍼옥시다제를 표식 효소로 하는 경우는, 예를 들면, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB; Vector Laboratories Inc.사, #SK-4400)을 사용할 수 있다.

반응액을 제거하고, 마이크로플레이트 리더 등을 사용하여, 고상 위의 측정 파장 450nm에 있어서의 흡광도를 측정함으로써, 고상에 결합한 표식양 즉 항체량을 측정할 수 있다.

진단 대상에 있어서 조사된 항식이 성분 항체가 상승하고 있는지 여부의 판정은, 예를 들면, 건강 동물에 있어서의 항체가와의 비교에 있어서, 통계학적으로 유의적인지 여부에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면, 건강 동물에 있어서의 측정 값의 평균+SD(표준 편차), 평균+2SD, 평균+3SD 등을 양성의 기준으로 할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 진단 방법의 바람직한 실시 형태에 있어서는, 상기 19종의 크론병 특이적인 항식이 성분 항체 중 2종 이상(예, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 또는 15종)의 항체가 측정 대상이 된다. 2종 이상의 항체를 조합함으로써, 크론병의 진단 감도 및/또는 진단 특이도를 더욱 향상시킬 수 있다. 2종 이상의 항체를 조합하는 경우, 그레이프후루츠, 양배추, 양상추, 귀리, 피칸, 이스트, 사탕수수, 셀러리, 메밀 및 옥수수로부터 선택되는 적어도 1종의 식이 성분에 대한 항체를 포함하는 것이 바람직하고, 적어도 이스트 및 옥수수에 대한 각 항체를 포함하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 다른 바람직한 형태에 있어서, 본 발명의 진단 방법은, 3종 또는 4종 이상의 항체를 조합하여 사용한다. 3종 이상의 항체를 조합하는 경우, 적어도 이스트, 옥수수 및 메밀 또는 셀러리에 대한 각 항체를 포함하는 것이 보다 바람직하다. 구체적인 조합의 예로서는, 이하의 식이 성분에 대한 항체의 조합을 들 수 있다.

(2종의 식이 성분의 조합의 예)

·옥수수, 양배추

·옥수수, 양상추

·옥수수, 메밀

·이스트, 그레이프후루츠

·이스트, 양배추

·이스트, 셀러리

·이스트, 양상추

·이스트, 메밀

·이스트, 옥수수

·이스트, 귀리

·이스트, 피칸

·사탕수수, 양배추

·사탕수수, 옥수수

·사탕수수, 이스트

(3종의 식이 성분의 조합의 예)

·이스트, 옥수수, 메밀

·이스트, 옥수수, 셀러리

(4종의 식이 성분의 조합의 예)

·이스트, 옥수수, 메밀, 그레이프후루츠

·이스트, 옥수수, 메밀, 양배추

·이스트, 옥수수, 메밀, 피망

·이스트, 옥수수, 메밀, 토마토

·이스트, 옥수수, 메밀, 대두

·이스트, 옥수수, 메밀, 셀러리

·이스트, 옥수수, 알팔파, 셀러리

·이스트, 옥수수, 사탕수수, 셀러리

(5종의 식이 성분의 조합의 예)

·이스트, 옥수수, 메밀, 그레이프후루츠, 알팔파

·이스트, 옥수수, 메밀, 그레이프후루츠, 사탕수수

·이스트, 옥수수, 메밀, 셀러리, 알팔파

·이스트, 옥수수, 메밀, 셀러리, 사탕수수

·이스트, 옥수수, 메밀, 피망, 알팔파

·이스트, 옥수수, 메밀, 피망, 사탕수수

·이스트, 옥수수, 메밀, 토마토, 알팔파

·이스트, 옥수수, 메밀, 토마토, 사탕수수

·이스트, 옥수수, 메밀, 대두, 알팔파

·이스트, 옥수수, 메밀, 대두, 사탕수수

2종 이상의 항식이 성분 항체를 조합하여 진단을 행하는 경우, 일부의 항체만 양성이고 다른 항체는 음성이 되는 결과가 발생하지만, 그 경우, 바람직하게는, 어느 하나의 항체에 관해서 양성이면, 진단 대상은 크론병에 나환되어 있거나 나환될 가능성이 높다고 판정한다. 이와 같이 함으로써, 일정한 진단 특이도를 유지한 채, 진단 감도를 훨씬 향상시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 항식이 성분 항체와 반응하는 1종 이상의 식이 성분 조제물을 포함하는, 크론병의 진단용 시약을 제공한다. 구체적으로는, 식이 성분 조제물은, 그레이프후루츠, 알팔파, 아보카도, 양배추, 피망, 양상추, 양파, 감자, 시금치, 토마토, 귀리, 피칸, 이스트, 사탕수수, 셀러리, 메밀, 옥수수, 쌀 및 대두의 19종으로부터 선택되는 식이 성분을 처리함으로써 조제된다. 당해 조제물의 조제법은, 상기의 본 발명의 방법에 있어서 기재한 바와 같다. 수득된 식이 성분 조제물은, 예를 들면, 플라스틱 튜브 등의 용기 중에, 물, 완충액, 글리세롤 등에 용해된 상태로 제공되고, 사용 직전까지 냉장 또는 동결 보존될 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 크론병의 진단에 있어서는, 검체 중의 2종 이상의 항식이 성분 항체를 측정하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명의 크론병 진단용 시약은, 2종 이상(예, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10또는 15종)의 식이 성분 조제물을 구성으로서 포함해도 좋다. 바람직한 2종 이상의 식이 성분의 조합으로서는, 상기한 바와 같다.

또한, 복수의 식이 성분 조제물이 사용되는 경우, 이들을 혼합하여 1개의 시약으로 해도 좋고, 또는 개별적인 시약으로서 조제해도 좋지만, 각각의 항식이 성분 항체에 특이적으로 반응하는 물질을 제공하는 것은 용이하지 않기 때문에, 통상 개별적인 시약으로서 조제하는 편이 적절하다.

본 발명은 또한, 본 발명의 시약을 포함하는 크론병의 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 식이 성분 조제물을 단독으로 또는 2종 이상의 조합으로 포함하고, 다른 성분으로서, 면역학적 측정 방법의 종류나 채용되는 검출 수단에 따라, 필요한 시약류를 임의로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항식이 성분 항체와 반응하는 물질(예를 들면, 항IgG 항체, 항IgA 항체 등의 2차 항체)을 포함할 수 있다. 당해 물질은 효소, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위원소, 착색 물질 등의 표식 물질로 미리 표식화되어 있어도 좋고, 별도로 표식 물질을 키트의 구성에 포함시킬 수도 있다. 또한, 식이 성분 조제물은 미리 고상에 고정화되어 있어도 좋고, 별도로 고상을 키트의 구성에 포함시킬 수도 있다.

또한, 본 발명의 키트에는, 표식 물질에 따른 기질, 또는 표식 물질과 기질의 반응을 검출하기 위한 검출 시약이 포함되어 있어도 좋고, 또한 측정 실시의 편의를 위해 적당한 검체 희석액, 2차 항체 희석액, 표준 항체, 완충액, 세정액, 효소 기질액, 반응 정지액 등이 포함되어 있어도 좋다. 이외에, 대조로서 사용되는 건강인 유래의 표준 혈청이 포함되어 있어도 좋다.

이하에, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 예에 의해 조금도 한정되는 것이 아니다.

실시예

참고예 1 인간 혈청 또는 혈장의 취득

크론병 환자 80예, 궤양성 대장염 환자 44예 및 건강인 52예의 혈액은, 사회보험중앙종합병원 또는 아지노모토 가부시키가이샤에서 문서를 사용한 동의하에 채취하고, 혈청 또는 혈장을 수득하였다. 검체는 번호 등으로 표시하고, 익명화하였다.

실시예 1 식이 88 품목 항체가(IgG)의 측정

혈액 채취후, 신속하게 원심 분리하여 취득한 혈청을 냉동 보존하고, 데톡스 가부시키가이샤를 통해 Genova Diagnostics(IL, USA)에 송부하고, IgG Food Antibody Assessment(식이 88 품목) 측정을 의뢰하였다. 식이 88 품목의 내역은, 유제품 7 품목(카세인, 체다 치즈, 코티지 치즈, 우유, 염소의 젖, 락트알부민, 요구르트), 야채 22 품목(알팔파, 아스파라거스, 아보카도, 무, 브로콜리, 양배추, 당근, 셀러리, 오이, 마늘, 피망, 양상추, 버섯, 올리브, 양파, 콩, 고구마, 감자, 시금치, 스트링 빈(string bean), 토마토, 주키니), 과일 16 품목(사과, 살구, 바나나, 블루베리, 크랜베리, 포도, 그레이프후루츠, 레몬, 오렌지, 파파야, 복숭아, 배, 파인애플, 서양자두, 라즈베리, 스트로베리), 어개·육류 19 품목(대합, 대구, 게, 랍스터, 굴, 도미, 연어, 정어리, 새우, 가자미, 송어, 참치, 쇠고기, 계육, 난백, 난황, 새끼양, 돼지고기, 칠면조), 곡류·너트류 19 품목(아몬드, 메밀, 옥수수, 옥수수글루텐, 글루텐, 까치콩, 렌즈콩, 리마콩, 귀리, 땅콩, 피칸, 강낭콩, 쌀, 호밀, 참깨, 대두, 해바라기씨, 호두, 밀), 기타 5 품목(이스트, 사탕수수, 초콜렛, 커피, 꿀)이었다. IgG는 ELISA에 의해 측정되고, 각각의 식이 품목의 건강인에게 있어서의 「평균값+2SD」를 기준으로 하여, 그 이상의 것을 양성으로 하였다. 식이 88 품목에 있어서의 혈청 항체가 양성 품목수의 평균은 크론병 환자에서 11 품목, 궤양성 대장염 환자에서 2 품목, 건강인에서는 1 품목이었다.

각 품목에 있어서의 항체의 양성률(양성 검체수/전검체수×100)을 각각 크론병 환자, 궤양성 대장염 환자, 건강인에 관해서 산출하였다.

다음에, 2 내지 5 품목을 조합했을 때의 양성률 및 특이도(음성 검체수/전 검체수×100), 진단 효율(양성률×특이도/100)을 산출하였다.

결과

크론병 환자에 있어서 건강인 및 궤양성 대장염 환자보다 유의적으로 양성률이 높았던 식이 품목은 19 품목(그레이프후루츠, 알팔파, 아보카도, 양배추, 셀러리, 피망, 양상추, 양파, 감자, 시금치, 토마토, 메밀, 옥수수, 귀리, 피칸, 쌀, 대두, 이스트, 사탕수수)이었다. 19 품목의 크론병 환자(CD), 궤양성 대장염 환자(UC), 및 건강인(HC)에 있어서의 양성률을 표 1에 기재한다.

또한, 각 측정에 의해 수득된 흡광도(항체량)로부터, 19종의 식이 항원에 대한 항체 2종을 조합한 경우에 있어서의, 감도(크론병 환자의 전검체에 대해 양성이라고 판정된 검체수; 양성률)를 산출한 결과를 표 2에 기재한다.

각 측정에 의해 수득된 흡광도(항체량)로부터, 각 식이 항원에 대한 항체 단독 및 이들 항체를 2종 내지 19종 조합한 경우에 있어서의, 감도, 및 특이도를 산출하였다. 2 품목에서부터 5 품목을 조합했을 때의 일부의 조합에 관해서, CD 양성률, UC, HC의 특이도, UC에 대한 CD의 진단 효율을 표 3-1 내지 표 3-4에 기재한다.

[표 3-1]

[표 3-2]

[표 3-3]

[표 3-4]

이상의 결과로부터, 항체를 조합함으로써, 1종의 항체량을 단독으로 측정한 경우와 비교하여, 감도가 유의적으로 향상되는 것이 명확해졌다. 또한 각 조합에 있어서 높은 특이성이 나타나며, 감도와 특이도를 곱하여 산출한 진단 효율도 마찬가지로, 항체의 조합에 있어서 현저하게 향상되었다.

따라서, 본 발명에 의하면, 크론병의 특이적이고 효율적인 진단이 가능해지며, 내시경 검사 등 고도의 경험과 기술을 필요로 하고, 게다가 환자에게 신체적·정신적 고통을 주는 침습적 방법을 거치지 않고도, 안전하고 고감도로 크론병의 진단이 실시 가능해진다.

실시예 2 식이 성분의 조제물에 대한 혈청 항체가의 측정

상기의 결과로부터 수득된 유용한 식이 성분 중, 옥수수, 이스트, 메밀, 셀러리를 선택하고, 98예의 CD, 50예의 UC, 52예의 HC의 혈청에 관해서, 각종 식이 성분의 조제물에 대한 혈청 항체가를 측정하였다. 또한, 본 실시예에서는 식이 성분의 조제물로서 분말 재료를 사용하였다.

혈청 항체가 측정용의 항원액으로서, 옥수수, 이스트, 메밀, 셀러리의 각종분말[참조: 모두 Allergon사 제조]을 PBS(-)로 현탁하고, 원심 분리(5000rpm, 5분간)함으로써 수득된 상청을 사용하였다. 항원액은 단백질 농도가 각각 1㎍/ml이 되도록 코팅용 완충액(SIGMA사 제조, cat. No. 076K8206)에 의해 조제하고, ELISA 플레이트(스미토모베이크라이트사 제조, cat. No. MS-8896F)에 50㎕/웰로 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 웰 중의 항원액을 제거한 후, 세정액(0.1% Tween20 함유 PBS(-)로 20배 희석한 이뮤노블록(immunoblock)(DS 파마바이오메디칼사 제조, cat. No. KN001A))에 의해 1회 세정하고, 증류수로 5배 희석한 이뮤노블록을 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세정액으로 1회 세정한 후, 세정액으로 10000배 희석한 혈청을 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 세정액으로 3회 세정을 실시하고, 세정액으로 500배 희석한 HRP 표식 마우스 항인간 IgG 모노클로날 항체(invitrogen사 제조, cat. No. 05-4220)를 가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 세정액으로 세정을 3회 실시하고, TMB(BD Biosciences사 제조, cat. No. 555214)를 반응시켜 2N 황산으로 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 리더(BI0-RAD Benchmark Plus)를 사용하여 파장 450nm의 흡광도를 측정하였다.

동 플레이트에, 코팅용 완충액으로 1000배 희석한 항인간 IgG 항체(EXBIO사 제조, cat. No. 11-31-9-C100)를 50㎕/웰 첨가한 웰을 준비하고, 레퍼런스 혈청(reference serum)(BETHYL사 제조, cat. No. RS10-101)을 0.01 내지 10㎍/ml에서 반응시키고, 파장 450nm의 흡광도를 각 농도에 있어서 측정하여 검량선을 작성하고, 혈청 샘플의 IgG 역가를 산출하였다.

각종 식이 성분에 대한 건강인의 IgG 역가의 「평균값+2SD」를 산출하고, 그 이상인 경우를 양성으로 평가하였다. 각종 식이 성분에 있어서의 양성률(양성 검체수/전검체수×100)을, CD, UC, HC별로 산출하였다.

결과

각종 식이 성분에 대한 양성률을 표 4에 기재한다. 식이 성분의 조제물을 사용하여 측정한 항체 양성률은, 사용한 식이 원료가 상이함에도 불구하고, CD, UC, HC 모두 Genova Diagnostics로 측정한 양성률(표 1)과 비교하여 거의 동등하였다.

또한, 상기 4 품목의 식이 성분의 2 내지 4 품목을 조합했을 때의, CD 양성률, UC 및 HC의 특이도, UC에 대한 CD의 진단 효율을, 표 5-1 내지 5-3에 기재한다. 식이 성분의 조제물을 사용하여 측정한 경우, 2 내지 4 품목을 조합한 양성률은 모두 약 70%, 특이도도 90% 이상이며, 약 65 내지 74%의 진단 효율이 수득되었다. 본 결과는, Genova Diagnostics로 측정한 결과(표 3-1 내지 3-3)와 비교하면 양성률은 약간 낮지만, 특이도는 동정도(同程度) 이상이었다. 이러한 결과에 의해, 본 측정 방법을 사용한 크론병의 진단이 가능한 것이 시사되었다.

[표 5-1]

[표 5-2]

[표 5-3]

실시예 3 항원의 동정

실시예 1의 결과로부터 수득된 유용한 식이의 항원에 관해서, 구체적으로 항원으로서 사용 가능한 단백질의 동정을 실시하였다.

그 중의 하나로서, 쌀의 분말[참조: Allergon사 제조]을 2% SDS 용액에 현탁하고, 1 레인당 125㎍ 상당의 분말 현탁액을 SDS-PAGE에 제공하였다. SDS-PAGE에서 단백질을 분리한 후, 60mA 정전류의 조건으로 60분간, PVDF막에 전사하였다. PVDF 막을 래피드 스테인(Rapid Stain) CBB[참조: 나카라이테스크사 제조]로 염색하여 단백질을 검출한 후, HC의 혈청 및 쌀에 대한 항체가가 양성이었던 CD의 혈청을 각각 1000배 희석한 것을 1차 항체로 하고, 5000배 희석한 HRP 표식 항인간 IgG 항체[참조: GE 헬스케어사 제조]를 2차 항체로 하여, 웨스턴 블로팅을 실시하였다. CD의 혈청에 의해 특이적으로 검출된 밴드에 관해서, 프로테인·리서치·네트워크(http://protein-research.org/)로 Peptide Mass Finger printing(PMF) 해석을 실시하였다.

결과

쌀 단백질의 CBB 염색 결과를 도 1에, 웨스턴 블로팅의 결과를 도 2에 각각 도시한다. 도 2 중의 밴드 A의 단백질이, CD 혈청 중의 항체와 특이적으로 반응하였다. 밴드 A의 단백질(약 33kDa)을 PMF 해석한 결과를 표 6에 기재한다. PMF 해석에 의해 수득된 펩티드 프래그먼트의 분자량 패턴으로부터, 밴드 A의 단백질은 글루텔린(등록 번호 ABF96730.1)로 추정되었다(표 7).

또한, 쌀 분말에 있어서의 글루텔린 이외의 단백질을 상기와 같은 방법으로 동정하고, 또한 쌀 이외의 식이 성분으로서, 메밀, 옥수수 및 사탕수수의 각종 분말[참조: 모두 Allergon사 제조]을 사용하고, 상기의 쌀 분말과 같은 처리에 의해 각종 식이 성분에 포함되는 유용한 단백질 항원을 동정하였다. 이들 결과를 표 8에 기재한다.

실시예 4 글루텔린을 사용한 혈청 항체가의 측정

쌀(히토메보레)로부터 Spectrum(상표) 플랜트 토탈 RNA 키트(Plant Total RNA kit)[참조: SIGMA Aldrich사 제조]로 총 RNA를 추출하였다. 글루텔린 타입-A 3 전구체(등록 번호 ABF96730.1)의 mRNA 서열(등록 번호 NM_-001056948)로 설계한 이하의 프라이머를 사용하여, 전장 글루텔린 유전자를 취득하였다.

취득한 글루텔린 유전자를 발현 벡터 pGEX-6P-1[참조: GE 헬스케어사 제조]에 도입하고, His 태그-GST(글루타티온 S-트랜스퍼라제) 융합 글루텔린 발현 벡터(pGEX-GSTOSG30His)를 구축하였다. pGEX-GSTOSG30His를 도입한 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL[참조: Stratagene사 제조]을 사용하고, GST-글루텔린-His 태그 융합 단백질을 발현하고, 균체로부터 Ni-NTA 아가로즈[참조: QIAGEN사 제조]로 정제를 실시하고, 이하의 항글루텔린 항체가 측정에 공시하였다.

98예의 CD 및 52예의 HC의 혈청에 관해서 ELISA에 의해 항글루텔린 항체가의 측정을 실시하였다. 항글루텔린 항체가는, Sutton CL 외의 방법(Gastroenterology 119: 23-31, 2000)에 따라, GST 융합 단백질(글루텔린-GST)에 대한 반응으로서 수득된 값으로부터 GST에 대한 반응의 값을 뺌으로써 산출하였다.

항원액으로서, 글루텔린-GST 및 GST에 관해서 등몰수가 되도록 코팅용 완충액(SIGMA사 제조, cat. No. 076K8206)을 사용하여 100㎍/ml 및 32㎍/ml로 조제하고, ELISA 플레이트(스미토모베이크라이트사 제조, cat. No. MS-8896F)에 50㎕/웰로 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 항원액을 제거한 후, 세정액(0.1% Tween20 함유 PBS(-)로 20배 희석한 이뮤노블록(DS파마바이오메디칼사 제조, cat. No. KN001A))에 의해 1회 세정하고, 0.1% Tween20 함유 PBS(-)로 5배 희석한 이뮤노블록을 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세정액으로 1회 세정한 후, 세정액으로 100배 희석한 혈청을 웰에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 다음에 세정액으로 3회 세정하고, 세정액으로 500배 희석한 HRP 표식 마우스 항인간 IgG 모노클로날 항체(Invitrogen사 제조, cat. No. 05-4220)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 세정액에 의한 세정을 3회 실시하여, TMB(BD Biosciences사 제조, cat. No. 555214)를 반응시키고 2N 황산으로 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 리더(BI0-RAD Benchmark Plus)를 사용하여 파장 450nm의 흡광도를 측정하였다.

동 플레이트에, 코팅용 완충액으로 1000배 희석한 항인간 IgG 항체(EXBIO사 제조, cat. No. 11-31-9-C100)를 50㎕/웰 첨가한 웰을 준비하고, 레퍼런스 혈청(BETHYL사 제조, cat. No. RS10-101)을 0.01 내지 10㎍/ml에서 반응시키고, 파장 450nm의 흡광도를 각 농도에 있어서 측정하여 검량선을 작성하고, 혈청 샘플의 IgG 역가를 산출하였다.

결과

HC에 있어서의 IgG 역가의 「평균값+2SD」이상을 양성으로 평가하였다. HC의 IgG의 평균값은 0.09이며, 2SD의 값은 0.56이었기 때문에, 0.64 이상을 양성으로 하였다. 이 때의 CD에 있어서의 양성 검체는, 98예 중 29예이며, 양성률은 30%이었다. 이것에 대해, 건강인에 있어서의 양성 검체는 52예 중 2예이며, 양성률은 3.8%이었다.

이상의 결과는, 표 1 중의 쌀에 관해서 기재된 CD에 있어서의 양성률 30% 및 건강인에 있어서의 양성률 0%와 동등한 양성률이었다.

이와 같이 식이에 대한 항체가 측정 방법으로서, 식이 성분의 분말 재료 또는 식이 중의 단일 항원 단백질을 대용함으로써, 그 식이에 대한 항체의 양성 판정 및 크론병 진단이 가능해진다. 또한, 리콤비넌트 단백질(recombinant protein) 산생을 이용함으로써 항원 단백질을 균일하고 안정적으로 공급할 수 있고, 이와 같이 하여 공급된 단일 항원 단백질을 사용하면, 진단 키트의 안정적인 생산 및 신뢰성의 향상을 실현하는 것이 가능해진다.

산업상 이용가능성

크론병에 특이적인 항식이 성분 항체의 측정을 조합함으로써, 크론병의 진단 효율 및 특이성을 훨씬 향상시키는 것이 가능해지고, 또한 고도의 기술을 필요로 하고 환자에 대한 부담도 큰 내시경 등의 침습적 방법을 거치지 않고도, 크론병의 확정 진단이 가능해지는 범위가 훨씬 확장된다.

본 출원은, 일본에서 출원된 특원2009-052692(출원일: 2009년 3월 5일)를 기초로 하고 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Diagnostic reagent for Crohn's disease <130> 091518 <150> JP 2009-052692 <151> 2009-03-05 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for amplifying glutelin gene <400> 1 ggatccatgg caaccatcaa attccctata g 31 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for amplifying glutelin gene <400> 2 gcggccgctt agtggtgatg atggtgatgt gcactc 36

Claims

대상으로부터 채취한 검체 중의, 그레이프후루츠, 알팔파, 아보카도, 양배추, 피망, 양상추, 양파, 감자, 시금치, 토마토, 귀리, 피칸, 이스트, 사탕수수, 셀러리, 메밀, 옥수수, 쌀 및 대두로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 식이 성분에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 당해 대상에 있어서의 크론병의 진단 방법(단, 1종의 식이 성분에 대한 항체를 측정하는 경우, 당해 식이 성분은 셀러리, 메밀, 옥수수, 이스트 및 대두 이외이다).
제1항에 있어서, 2종 이상의 식이 성분에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제2항에 있어서, 적어도 1종의 식이 성분이 셀러리, 메밀, 옥수수, 이스트 및 대두 이외인, 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 그레이프후루츠, 양배추, 양상추, 귀리, 피칸, 이스트, 사탕수수, 셀러리, 메밀 및 옥수수로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 1종의 식이 성분에 대한 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제2항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 이스트 및 옥수수에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제2항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 3종 이상의 식이 성분에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제6항에 있어서, 적어도 이스트, 옥수수, 및 메밀 또는 셀러리에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 식이 성분에 함유되는 폴리펩티드 항원에 대한 각 항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원이 글루텔린(glutelin)인, 방법.
그레이프후루츠, 알팔파, 아보카도, 양배추, 피망, 양상추, 양파, 감자, 시금치, 토마토, 귀리, 피칸, 쌀 및 사탕수수로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 식이 성분의 조제물(調製物)을 함유하여 이루어지는, 크론병의 진단용 시약.
제10항에 있어서, 상기 조제물이, 단리 또는 정제된 폴리펩티드 항원인, 시약.
제11항에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원이, 글루텔린 또는 항원성을 갖는 이의 부분 펩티드인, 시약.
그레이프후루츠, 알팔파, 아보카도, 양배추, 피망, 양상추, 양파, 감자, 시금치, 토마토, 귀리, 피칸, 이스트, 사탕수수, 셀러리, 메밀, 옥수수, 쌀 및 대두로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2종 이상의 식이 성분의 조제물을 포함하여 이루어지는, 크론병의 진단용 키트.
제13항에 있어서, 상기 조제물이, 단리 또는 정제된 폴리펩티드 항원인, 키트.
제14항에 있어서, 상기 폴리펩티드 항원이 글루텔린 또는 항원성을 갖는 이의 부분 펩티드인, 키트.