JP5229789B2 - 新規ストレスバイオマーカー及びその用途 - Google Patents
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かかるジョギングによるストレスの場合、上記ストレス判定方法[1]において、健常な哺乳動物から採取した血清の場合と比較して、アクチンβ及び/又はアポリポタンパク質Hの検出量が増加しているとき、評価対象の哺乳動物はストレスと判定されることになる。また、上記ストレス判定方法[1]において、健常な哺乳動物から採取した血清の場合と比較して、フェチュインβの検出量が減少しているとき、評価対象の哺乳動物はストレスと判定されることになる。
ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985)など任意の方法を用いることができる。
[水浸拘束試験]
1週間の予備飼育を行った7週齢のSprague-Dawley(SD)雄性ラット(体重150g〜180g)を用い、7日間飼料および水を自由に摂取させ、1日1回生理食塩水を経口投与した。24時間の絶食後、ストレスケージに動物を入れ、剣状突起の高さまで水に浸した。0.5時間、1時間及び5時間の水浸拘束後、動物をエーテル致死させた。また、絶食後に水浸拘束せずケージに入れ、水浸拘束と同じ時間を経過させたものを対照とした。
ストレス負荷前は24時間の絶食前にエーテル麻酔し尾静脈より採血を行った。また、ストレス負荷後は各時間の水浸拘束後にエーテル麻酔し、心臓より採血を行った。得られた血液を室温で1時間静置した後、遠心分離(3000rpm、15分)し、その上清を血清として−40℃で保管した。
[二次元電気泳動法(2−D)]
二次元電気泳動は、Tonge R., Shaw J., Middleton B., Rowlinson R., Rayner S., Young J., Pognan F., Hawkins E., Currie I. and Davison M. : Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics, 1(3),377-396 (2001)記載の方法に準じて行った。水浸拘束試験によって得られた血清をMultiple Affinity Removal Spin Cartridge, 0.45 mL Ms-3 (Mouse)(Agilent Technologies)で処理し、サンプル溶解液(4% CHAPS、7M Urea、2M Thiourea)に溶解させた。なお、対象群の等量混合物をストレス負荷0時間のサンプルとした。ストレスバイオマーカー解析用のサンプルについては、各サンプルをCy3あるいはCy5(GE Healthcare社製)で標識し、全サンプルの等量混合物はCy2(GE Healthcare社製)で標識した。3種の標識サンプルを混合し、混合サンプルと等量の2×等電点電気泳動用サンプルバッファー(4% CHAPS、2% DTT、7M Urea、2M Thiourea)を加え、膨潤用バッファー(2% CHAPS、0.002% Bromophenol blue、1% DTT、7M Urea、2M Thiourea)にて終容量450μLとなるように調製した。IPGバッファー(pH3−10 NL)(GE Healthcare社製)を0.5%加え、pH3−10 NLのImmobilineドライストリップ(GE Healthcare社製)で等電点電気泳動をおこなった。等電点電気泳動が完了したImmobilineドライストリップは平衡化した後、ゲル濃度10%で調製したアクリルアミドゲルにアプライし、二次元目の電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの画像イメージはTyphoon 9400 imager(GE Healthcare社製)にて読み込み、画像はDecyderソフトウェア(GE Healthcare社製)で解析した。
[水浸拘束試験]
1週間の予備飼育を行った7週齢のSD(Sprague-Dawley)雄性ラット(体重150g〜180g)を用い、7日間飼料および水を自由に摂取させ、1日1回生理食塩水を経口投与した。24時間の絶食後、ストレスケージに動物を入れ、剣状突起の高さまで水に浸し、10時間の水浸拘束を行った。
水浸拘束前後に採血を行った。得られた血液は室温で1時間静置した後、遠心分離(3000rpm、15分)し、その上清を血清として−40℃で保管した。なお、胃潰瘍が発症する前のストレス負荷前血清は、24時間の絶食をする前にエーテル麻酔し尾静脈より採取した。また、胃潰瘍発症後のストレス負荷後血清は、10時間の水浸拘束後にエーテル麻酔し心臓より採取し、二次元電気泳動に供試した。また、採血後直ちに胃を摘出し、潰瘍部分の面積を計測し、胃全体に対する潰瘍部分の面積の占める割合を潰瘍指数(%)とした。水浸拘束試験によるストレス性胃潰瘍の潰瘍指数は約20%だった。
[二次元電気泳動法(2−D)]
二次元電気泳動は、Tonge R., Shaw J., Middleton B., Rowlinson R., Rayner S., Young J., Pognan F., Hawkins E., Currie I. and Davison M. : Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics, 1(3), 377-396 (2001)記載の方法に準じて行った。水浸拘束試験によって得られた血清をMultiple Affinity Removal Spin Cartridge, 0.45 mL Ms-3(Mouse)(Agilent Technologies)で処理し、サンプル溶解液(4% CHAPS、7M Urea、2M Thiourea)に溶解させた。ストレスバイオマーカー解析用のサンプルについては、ストレス負荷前のサンプルをCy3(GE Healthcare社製)で、ストレス負荷後のサンプルをCy5(GE Healthcare社製)で、ストレス負荷前及び負荷後のサンプルの等量混合物をCy2(GE Healthcare社製)でそれぞれ標識した。3種の標識サンプルを混合し、等量の2×等電点電気泳動用サンプルバッファー(4% CHAPS、2% DTT、7M Urea、2M Thiourea)を加え、膨潤用バッファー(2% CHAPS、0.002% Bromophenolblue、1% DTT、7M Urea、2M Thiourea)にて終容量450μLとなるように調製した。IPGバッファー(pH3−10 NL)(GE Healthcare社製)を0.5%加え、pH3−10 NLのImmobilineドライストリップ(GE Healthcare社製)で等電点電気泳動をおこなった。等電点電気泳動が完了したImmobilineドライストリップは平衡化した後、ゲル濃度10%で調製したアクリルアミドゲルにアプライし、二次元目の電気泳動を行った。電気泳動後のゲルの画像イメージはTyphoon 9400 imager(GE Healthcare社製)にて読み込み、画像はDecyderソフトウェア(GE Healthcare社製)で解析した(図6)。
1.走行試験
被験者(A、B、C、D)4名で2km、約20分間のジョギング試験を実施した。
2.採血
ジョギング前後に被験者の上腕静脈より採血を行った。得られた血液を4℃で、一晩静置した後、遠心分離(3000rpm、15分)し、その上清を血清として−40℃で保管した。
3.ELISAによるアポリポタンパク質Hの検出
10倍希釈した血清を固相に、抗体にAnti-Apolipoprotein H, Mouse-Mono(1D2) MA1-25289(フナコシ株式会社製)を用いたダイレクトELISAにより、ジョギング前後の被験者A、B、C、Dの血清中におけるアポリポタンパク質Hを測定した。その結果、ジョギング後にアポリポタンパク質Hが一様に増加した(図8)。実施例1のラットの水浸拘束試験の結果ではアポリポタンパク質Hは減少したが、この違いはストレスの種類の差異、あるいは対象種の差異が考えられ、一定の動物種で一定のストレスを負荷することにより、一様に増加あるいは減少するマーカーであると考えられた。以上のことから、アポリポタンパク質Hのストレスマーカーとしての有効性が明らかとなった。また、抗アポリポタンパク質H抗体を用いたELISAや、さらに簡易なイムノクロマト法などにより、ストレス負荷個体の血清から容易にアポリポタンパク質Hが測定可能であり、その増減によりストレス負荷の判定できると考えられる。
1.走行試験
被験者(A、B、C、D)4名で2km、約20分間のジョギング試験を実施した。
2.採血
ジョギング前後に被験者の上腕静脈より採血を行った。得られた血液を4℃で、一晩静置した後、遠心分離(3000rpm、15分)し、その上清を血清として−40℃で保管した。
3.ELISAによるフェチュインβの検出
10倍希釈した血清を固相に、抗体にAnti-Fetuin B, Mouse-Mono(212621) MAB1725(フナコシ株式会社製)を用いたダイレクトELISAにより、ジョギング前後の被験者A、B、C、Dの血清中におけるフェチュインβを測定した。その結果、被験者Cを除いたA、B、Dでは、実施例1のラットの水浸拘束試験の結果と同様に、ジョギング後にフェチュインβが減少した。(図9)。以上のことから、フェチュインβのストレスマーカーとしての有効性が明らかとなった。また、抗フェチュインβ抗体を用いたELISAや、さらに簡易なイムノクロマト法などにより、ストレス負荷個体の血清から容易にフェチュインβが測定可能であり、その増減によりストレス負荷の判定できると考えられる。
1.走行試験
被験者(A、B、C、D)4名で2km、約20分間のジョギング試験を実施した。
2.採血
ジョギング前後に上腕静脈より採血を行った。得られた血液を4℃で、一晩静置した後、遠心分離(3000rpm、15分)し、その上清を血清として−40℃で保管した。
3.ELISAによるアクチンβの検出
固相化抗体にAnti-Actin β, Mouse-Mono(B11V08) AM00194PU-N(フナコシ株式会社製)を、HRP標識抗体にMouse monoclonal(mAbcam8226) to beta Actin-Loading Control (HRP)(アブカム株式会社製)を用いたサンドイッチELISAにより、ジョギング前後の被験者A、B、C、Dの血清中におけるアクチンを測定した。その結果、実施例1のラットの水浸拘束試験の結果と同様に、ジョギングによりアクチンの増加が認められた(図10)。以上のことから、アクチンβのストレスマーカーとしての有効性が明らかとなった。また、抗アクチンβ抗体を用いたELISAや、さらに簡易なイムノクロマト法などにより、ストレス負荷個体の血清から容易にアクチンβが測定可能であり、その増減によりストレス負荷の判定できると考えられる。
Claims (5)
- 非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清を二次元電気泳動に供試して、ストレスを負荷する前後にその発現量が変化するタンパク質であるエノラーゼβを検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法。
- 非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、被験物質を投与し、該被験物質を投与した非ヒト哺乳動物の血清からエノラーゼβ、又はエノラーゼβに特異的に結合する抗体を検出し、被験物質を投与しない場合と比較・評価することを特徴とするストレス抑制物質又はストレス増強物質のスクリーニング方法。
- 哺乳動物から採取した血清を二次元電気泳動に供試して、ストレスを負荷する前後にその発現量が変化するタンパク質であるエノラーゼβを検出し、健常な哺乳動物から採取した血清の場合と比較・評価することを特徴とするストレスの判定のためのデータを収集する方法。
- 哺乳動物から採取した血清中のエノラーゼβ、又はエノラーゼβに特異的に結合する抗体を検出し、健常な哺乳動物から採取した血清の場合と比較・評価することを特徴とするストレスの判定のためのデータを収集する方法。
- エノラーゼβ、若しくはエノラーゼβに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とするストレスを診断するためのキット。
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