JP2007225607A - 抗ストレス薬剤のスクリーニング方法及び有効性の判定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】抗ストレス薬剤を服用している哺乳動物から採取した血清を二次元電気泳動に供試して、プラスミノーゲン、α1−マクログロブリンの1015残基目〜1218残基目を含む約35kDaのフラグメント、補体成分4aの1450残基目〜1737残基目を含む約35kDaのフラグメント、グルタチオンペルオキシダーゼのいずれか1種以上を検出し、抗ストレス薬剤の非服用時の場合と比較・評価することにより、抗ストレス薬剤の有効性を判定する。
【選択図】なし
Description
[抗ストレス薬剤としての酵素処理食肉の調製]
脂肪や結合組織をできるだけ取り除いた後細切した豚モモ肉に対してプロテアーゼ「アマノ」PおよびSを各50ppmずつ添加し、50℃で3時間の反応後、80℃で1時間の失活処理を行った。これをHydrolyzed Pork Meat(以下HPM)とした。このHPM(50mg/100g・体重)を用いて、胃炎・胃潰瘍予防効果を検証し、ストレス性胃潰瘍の評価系として水浸拘束試験を行った。なお、対照として生理食塩水(1ml/100g・体重)を、比較として加熱豚肉(50mg/100g・体重)を用いた。
1週間の予備飼育を行った7週齢のSD(Sprague-Dawley)雄性ラット(体重150g〜180g)を用い、1日1回7日間連続で飼料を経口投与した。24時間の絶食後、ストレスケージに動物を入れ、剣状突起の高さまで水に浸し、10時間の水浸拘束を行った。また、上記飼料とは別に、試験区としてHPM(50mg/100g・体重)、対照区として生理食塩水(1ml/100g・体重)、比較区として加熱豚肉(50mg/100g・体重)を1日1回7日間それぞれ経口投与した(各区n=3)。10時間の水浸拘束後、動物をエーテル致死させ、直ちに胃を摘出し胃大湾側に沿って切断後、潰瘍部分面積の計測により潰瘍指数を求めた。結果を図1に示す。その結果、HPMを50mg/100g・体重投与したラットの潰瘍指数は、生理食塩水を投与した対照および加熱豚肉を50mg/100g・体重投与したラットに比べ、有意に減少した。
[採血]
1週間の予備飼育を行った7週齢のSD(Sprague-Dawley)雄性ラット(体重150g〜180g)を用い、1日1回7日間連続で飼料及びHPM(50mg/100g・体重)を経口投与した。24時間の絶食後、ストレスケージに動物を入れ、剣状突起の高さまで水に浸し、10時間の水浸拘束を行った。水浸拘束前後に採血を行った。得られた血液は室温で1時間静置した後、遠心分離(3,000rpm、15分)し、その上清を血清として−40℃で保管した。なお、ストレス負荷前血清は、24時間の絶食をする前にエーテル麻酔し、負荷のかからない尾静脈より採取した。また、胃潰瘍発症後のストレス負荷後血清は、10時間の水浸拘束後にエーテル麻酔し、血液をなるべく全量採取できる心臓より採取し、二次元電気泳動に供試した。なお、対照として生理食塩水(1ml/100g・体重)を用いた。
二次元電気泳動は、「Ettan DIGE 簡易マニュアル(GE Healthcare社)」記載の方法に準じて、解析用とピック(Pick)用をそれぞれ別個に行った。水浸拘束試験によって得られた血清をMontage Albumin Deplete Kit(Millipore Corporation社製)、及び2-D Clean-Up Kit(GE Healthcare社製)で処理し、風乾したものを溶解液(7M 尿素、2M チオ尿素、4% CHAPS、0.03M Tris)で5mg/mlに調製した。(解析用は、水浸拘束によるストレス負荷前、水浸拘束によるストレス負荷後、およびこれらの等量混合物をそれぞれCy3、Cy5、Cy2(GE Healthcare社製)で標識し、サンプルとした。)サンプルに2×サンプルバッファー(7M 尿素、2M チオ尿素、4% CHAPS、2% DTT)を等量混合したのち、膨潤バッファー(7M 尿素、2M チオ尿素、2% CHAPS、1% DTT、0.002% BPB)に溶解し、IPGバッファー(pH3−10)(GE Healthcare社製)を終濃度1%となるように添加して1次元目の電気泳動に供した。一次元目にはpH3〜10の範囲のImmobilineドライストリップを用い、ゲル1枚あたり解析用は150μg、ピック用は600μgのタンパク質量に相当するサンプルをアプライした。Immobilineドライストリップは乾燥防止のためにミネラルオイルを重層し、Ettan IPGphor(GE Healthcare社製)により等電点電気泳動を行った。等電点電気泳動が完了したImmobilineドライストリップは還元アルキル化した後、ゲル濃度10%で調製したポリアクリルアミドゲルにアプライし、二次元目の電気泳動を行った。電気泳動が完了した解析用ゲルは、Tyhoon 9400(GE Healthcare社製)により画像を読み込んだ。また、ピック用ゲルは、Deep Purple(GE Healthcare社製)で染色したのちTyphoon9400にて画像を読み込んだ。
水浸拘束によるストレス負荷前後の泳動像を、HPM投与及び生理食塩水投与の各々につき、Decyder(GE Healthcare)ソフトウェアで解析し、解析用ゲルを用いて変化のあるスポットを見出し、ピック用ゲルとマッチングさせた。なお、ストレス負荷後のタンパク質の検出量が増加したものは赤色で、減少したものは緑色で表示されている(図2上参照)。また、変化のあった4スポット(5,23,26,32)を青数字で示す(図2下参照)。青数字5で示されるスポットa、青数字26で示されるスポットb、青数字23で示されるスポットc、青数字32で示されるスポットd(図3上参照)、の各スポットについての検出量の測定結果を図3〜6に示す。
変化が見られたスポットをピック用ゲルから切り出し、トリプシンでゲル内消化後、ペプチド混合物を抽出した。MALDI-TOF/TOF MS Ultraflex (Bruker Daltonics)を用い、MALDI-TOF/MS(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight/MassSpectrometry;マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間型質量分析法)により分解成分の分子量を測定し得られたピークを解析後、Mascot検索で、Database1:NCBInr、Peptide Mass Tolerance:±0.1〜1.0Da、Fragment Mass Tolerance:±0.5〜1.5Da、Max Missed Clevages:1の検索条件によりコンビネーションサーチを行い、ゲノム及びタンパク質データベースから検索したところ、表1(HPM投与により水浸拘束ストレス胃潰瘍の予防個体で変化するたんぱく質)に示すように、プラスミノーゲン(等電点:6.79、分子量:93214)、α1−マクログロブリン(等電点:6.46、分子量:168388)、補体成分4a(等電点:6.99、分子量:193639)、及びグルタチオンペルオキダーゼ(等電点:8.26、分子量:25657)であることがわかった。また上記画像解析データと分解成分同定データから、抗ストレス薬剤としてのHPMを投与したことにより増加したタンパク質はプラスミノーゲンであり、減少したタンパク質はコンポーネント4aであった。また、生理食塩水を投与したサンプルにおいては、変化が見られたのに対して、抗ストレス薬剤としてのHPMを投与した場合に変化が見られなかったタンパク質は、α1−マクログロブリンとグルタチオンペルオキシダーゼであった。
1.水浸拘束試験
1週間の予備飼育を行った7週齢のSD(Sprague-Dawley)雄性ラット(体重150g〜180g)を用い、試験区としてHPM(50mg/100g・体重)、対照区として生理食塩水(1ml/100g・体重)を1日1回7日間それぞれ経口投与した。24時間の絶食後、ストレスケージに動物を入れ、剣状突起の高さまで水に浸し、10時間の水浸拘束を行った。10時間の水浸拘束後、動物をエーテル致死させた。
生理食塩水あるいはHPM投与前はエーテル麻酔し尾静脈より、生理食塩水あるいはHPM投与後は24時間の絶食前にエーテル麻酔し尾静脈より、また、ストレス負荷後は10時間の水浸拘束後にエーテル麻酔し心臓より、それぞれ採血を行った。得られた血液を室温で1時間静置した後、遠心分離(3000rpm、15分)し、その上清を血清として−40℃で保管した。
固相化抗体にAnti-Complement 4a (C4a), Mouse-Mono(99-H7)0300-0177(フナコシ)を、ビオチン標識抗体にAnti C4a (H-155)SC25815(コスモバイオ)を用いたサンドイッチELISAにより、各血清中の補体成分4aの相対量を測定した。その結果、生理食塩水あるいはHPM投与前を100%とした時の生理食塩水あるいはHPMの投与後、ストレス負荷後の補体成分4aを図7に示した。生理食塩水あるいはHPMの1週間の投与により補体成分4aの値に変化は認められなかった。しかし、ストレス負荷後では、生理食塩水投与群で補体成分4aはほとんど検出されず、一方、HPM投与群では各個体で30〜40%前後の残存が認められた。このことから、HPM投与により免疫に関与する補体成分4aの減少を防ぐことが可能であり、このことがストレス性の胃潰瘍の予防になんらかの効果を示しているものと考えられた。また、抗補体成分4a抗体を用いることで、ELISA、あるいはさらに簡易なイムノクロマト法などによりストレス負荷個体の血清から容易に補体成分4aを測定できることから、補体成分4aのストレスマーカーとしての有効性と、測定方法を示すことができた。
Claims (5)
- 非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、抗ストレス候補薬剤を投与し、該抗ストレス候補薬剤を投与した非ヒト哺乳動物の血清を二次元電気泳動に供試して、プラスミノーゲン、α1−マクログロブリンの1015残基目〜1218残基目を含む約35kDaのフラグメント、補体成分4aの1450残基目〜1737残基目を含む約35kDaのフラグメント、グルタチオンペルオキシダーゼのいずれか1種以上を検出し、非ヒト哺乳動物に抗ストレス候補薬剤を投与しない場合と比較・評価することを特徴とする抗ストレス薬剤のスクリーニング方法。
- 非ヒト哺乳動物に、ストレスを負荷する前後又は同時に、抗ストレス候補薬剤を投与し、該抗ストレス候補薬剤を投与した非ヒト哺乳動物の血清からプラスミノーゲン、α1−マクログロブリンの1015残基目〜1218残基目を含む約35kDaのフラグメント、補体成分4aの1450残基目〜1737残基目を含む約35kDaのフラグメント、グルタチオンペルオキシダーゼのいずれか1種以上のタンパク質若しくはペプチド、又はこれらのいずれかに特異的に結合する抗体を検出し、非ヒト哺乳動物に抗ストレス候補薬剤を投与しない場合と比較・評価することを特徴とする抗ストレス薬剤のスクリーニング方法。
- 抗ストレス薬剤を服用している哺乳動物から採取した血清を二次元電気泳動に供試して、プラスミノーゲン、α1−マクログロブリンの1015残基目〜1218残基目を含む約35kDaのフラグメント、補体成分4aの1450残基目〜1737残基目を含む約35kDaのフラグメント、グルタチオンペルオキシダーゼのいずれか1種以上を検出し、抗ストレス薬剤の非服用時の場合と比較・評価することを特徴とする抗ストレス薬剤の有効性の判定方法。
- 抗ストレス薬剤を服用している哺乳動物から採取した血清中のプラスミノーゲン、α1−マクログロブリンの1015残基目〜1218残基目を含む約35kDaのフラグメント、補体成分4aの1450残基目〜1737残基目を含む約35kDaのフラグメント、グルタチオンペルオキシダーゼのいずれか1種以上のタンパク質若しくはペプチド、又はこれらのいずれかに特異的に結合する抗体を検出し、抗ストレス薬剤の非服用時の場合と比較・評価することを特徴とする抗ストレス薬剤の有効性の判定方法。
- プラスミノーゲン、α1−マクログロブリンの1015残基目〜1218残基目を含む約35kDaのフラグメント、補体成分4の1450残基目〜1737残基目を含む約35kDaのフラグメント、グルタチオンペルオキシダーゼのいずれか1種以上のタンパク質若しくはペプチド、これらのいずれかに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする抗ストレス薬剤の有効性判定用キット。
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