JP2009500597A - 線維症のマーカー - Google Patents
線維症のマーカー Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009500597A JP2009500597A JP2008518876A JP2008518876A JP2009500597A JP 2009500597 A JP2009500597 A JP 2009500597A JP 2008518876 A JP2008518876 A JP 2008518876A JP 2008518876 A JP2008518876 A JP 2008518876A JP 2009500597 A JP2009500597 A JP 2009500597A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- kit
- use according
- markers
- fibrosis
- marker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
- G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本発明は、線維化変性のインビトロ検出のための、ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1およびカテプシンAの中から選択される少なくとも2つのマーカーの組合せの使用に関する。さらに、本発明は、生物試料中の該マーカーのレベルの測定のためのキットに関する。
Description
要約
本発明は、線維化変性のインビトロ検出のための、ウロモジュリン(uromodulin)、MAC2BP、AGP1およびカテプシンAから選択される少なくとも2つのマーカーの組合せの使用に関する。さらに、本発明は、また、生物試料中の該マーカーのレベルの測定のためのキットに関する。
記載
本発明は、線維症同定のための生物学的マーカーに関する。
本発明は、線維化変性のインビトロ検出のための、ウロモジュリン(uromodulin)、MAC2BP、AGP1およびカテプシンAから選択される少なくとも2つのマーカーの組合せの使用に関する。さらに、本発明は、また、生物試料中の該マーカーのレベルの測定のためのキットに関する。
記載
本発明は、線維症同定のための生物学的マーカーに関する。
線維化変性または疾患は、罹患/死亡の主な原因の一つを構成し、それらの慢性的な性質は、患者および社会にかなりの経済的負担を及ぼす。肝臓、肺、腎臓、心臓、血管および皮膚を含む器官および組織の進行性の線維化は、さまざまなメカニズムに関連した変性を含む。これらの変性のそれぞれは、共通して、細胞外マトリックス、主にコラーゲンの過剰な、変化した蓄積を有し、それは、正常な組織構造の無秩序化、そして、結果的に、機能喪失を伴う。
とりわけ、肝臓の線維化は、慢性肝臓損傷の主な合併症であり、その進行は、長期間で肝硬変を導く。最も頻繁な肝臓の線維化の原因は、アルコールの摂取、C型肝炎ウイルスによる感染および非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)である。さらに、それは、肝不全および門脈高血圧の進行に大きく寄与する。
結果的に、肝臓の線維化の存在および重篤度の評価は、臨床診療における重要なパラメーターであり、肝硬変進行の危険性の有益な指標を構成する。
さらに、線維化の存在および重篤度を評価する適切な方法の利用性は、潜在的抗線維化分子の探索における、測定ツールである。
肝臓生検およびそれに続く組織学的検討は、今日においてもなお、肝線維症を評価する参照技術である。それにもかかわらず、それは、適用の制限された費用のかかる技術であり、侵襲的で、痛みを伴い、そして、個人の健康に対し合併症の原因ともなり得る。この方法の正確性および再現性は、組織標本の抽出および観察者間および観察者内での変動による問題のために、かなり疑問である。
化学および血液学の通常の分析、生理学的試験および血清線維症マーカー等のあらゆるアプローチが、その進行を測定するために提案されてきた。
細胞外マトリックス蛋白質または血清中のその合成および分解産物の測定が、例えば、示唆されてきた(US-5,316,914, EP-0283779)。
US6,631,330は、一連の臨床血清学パラメーター(マーカー)に基づく、2元記号論理学回帰モデルを用いた方法を提案する。このスキームは、ファイブロテスト(Fibrotest)(Biopredictive、パリ、フランス)、5つの間接的な血清線維症マーカーの評価を組み合わせた線維症インデックスを発達させるために使用された。ファイブロスキャン(FibroScan)(Echosens、パリ、フランス) (Sandrin L. et al. 2003. “Transient elastography: a new non-invasive method for assessment of hepatic fibrosis”; Ultrasound Med. Biol. 29: 1705-1713)と組み合わされて適用されるこの試験は、C型肝炎ウイルス感染における線維症の進行を評価するために好適に機能するようである。
WO2004/063753は、血清N−グリカン蛋白質のプロフィールの分析に基づく評価法を提案する。
それにもかかわらず、実施が簡便で、非侵襲的であり、肝線維症の程度を適切に評価できる、新しい簡潔な方法が、とりわけ、線維症の比較的重篤でないステージにおいて、なお必要である。
多くの病的進行が、体液の分子構成の定量的および機能的変化に関連するという証拠が存在する。尿は容易に入手できる体液なので、線維症インジケーター分析物、例えば、尿中に検出可能な蛋白質の測定および定量に基づく肝線維症の評価方法の発展が、大変好ましく、有利である。
したがって、本発明の目的は、生物試料、好ましくは尿において、検出可能である相違するインジケーター分析物の測定および定量により、肝線維症の、そして、また、他の重要な臓器の線維症の存在および重篤度を評価する方法の発展である。このために、健常人および肝線維症を有する個人の尿中における、相違する蛋白質発現パターン(プロテオーム)を解析し、それによりバイオマーカーの候補として種々の蛋白質の選別を可能にする。
図面の簡単な説明
図1 肝線維症の患者における尿サンプル中の、ウロモジュリン(uromodulin)、MAC2BP、AGP1およびカテプシンAの増加および出現の同定。患者および対照個人からの代表的なゲルが示される。ことなるスポットは、1:ウロモジュリン、2:MAC2BP、3:AGP1および4:カテプシンAとして同定される。
図1 肝線維症の患者における尿サンプル中の、ウロモジュリン(uromodulin)、MAC2BP、AGP1およびカテプシンAの増加および出現の同定。患者および対照個人からの代表的なゲルが示される。ことなるスポットは、1:ウロモジュリン、2:MAC2BP、3:AGP1および4:カテプシンAとして同定される。
第一の態様において、本発明は、線維変化のインビトロ検出のための、ウロモジュリン(uromodulin)、MAC2BP、AGP1およびカテプシンAから選択される少なくとも2つのマーカーの組合せの使用に関する。この使用は、それが、生物学的サンプルを得ること、およびサンプル中の該マーカーの濃度を測定することを含むことを特徴とする。
さらに、本発明は、線維変化の存在(または非存在)および重篤度(進行のステージまたは程度)を評価する方法に関する。
該方法は、それが、
a)生物試料を得ること;
b)-ウロモジュリン
-MAC2BP
-AGP1、および
-カテプシンA
から選択される、該サンプル中の少なくとも2つのマーカーのレベルを決定すること、
を特徴とする。
a)生物試料を得ること;
b)-ウロモジュリン
-MAC2BP
-AGP1、および
-カテプシンA
から選択される、該サンプル中の少なくとも2つのマーカーのレベルを決定すること、
を特徴とする。
用語「マーカー」は、量が評価される分子または化合物に関する。本発明の方法において、レベルが測定される4つのマーカーは、蛋白質である。生物試料における該マーカーの存在−非存在または増加−減少は、線維化変性の存在または重篤度の指標である。
用語「ウロモジュリン」は、シンボルUMOD(LOCUSLINK: 7369 ホモサピエンス; UNIGENE: Hs. 164470)によりヒトにおいて同定される遺伝子により、そのアイソフォームのいずれかで、およびいずれかの動物種において、コードされる蛋白質に関する。該蛋白質は、ウロムコイド(Uromucoid)またはタム・ホースフォール(Tamm−Horsfall)糖蛋白質(THP)としても知られる。特定の実施態様において、蛋白質はヒト蛋白質(Swiss-Prot Accession number P07911, Last update: Release 47 10-May-2005)である。
用語「MAC2BP」は、シンボル「LGALS3BP」(LOCUSLINK: 3949 ホモサピエンス; UNIGENE: Hs. 514535)によりヒトにおいて同定される遺伝子により、そのアイソフォームのいずれかで、およびいずれかの動物種において、コードされる蛋白質に関する。該蛋白質は、「ガレクチン−3結合蛋白質(Galectin-3 binding protein)」、「Mac−2結合蛋白質(MAC2BP)」または「腫瘍関連抗原90K(Tumorassociated antigen 90K)」としても知られる。特定の実施態様において、蛋白質はヒト蛋白質(Swiss-Prot Accession number Q08380, Last update: Release 47 10-May-2005)である。これは、細胞接着を促進する糖タンパク質であり、そして、ウイルスおよび腫瘍細胞に対しての防御を刺激し得る。
用語「AGP1」は、シンボルORM1(LOCUSLINK: 5004 ホモサピエンス; UNIGENE: Hs. 494984)によりヒトにおいて同定される遺伝子により、そのアイソフォームのいずれかで、およびいずれかの動物種において、コードされる蛋白質に関する。該蛋白質は、「アルファ−1−酸 糖蛋白質(AGP1)」またはオロソムコイド1(orosomucoid 1)(OMD1)としても知られる。特定の実施態様において、蛋白質はヒト蛋白質(Swiss-Prot Accession number P02763, Last update: Release 47 10-May-2005)である。その急性期の間の免疫系活性化の調節における介入が記載されてきた。肝硬変の患者ではそのグリコシレーションパターンに変化を受け、肝線維症の促進機能もまた示唆されている。この蛋白質に対する特異的抗原を用いた肝臓疾患(肝炎、肝硬変、肝細胞癌)の診断法が提案されている(WO2004058823)。
表現「カテプシンA」は、シンボルPPGB(LOCUSLINK: 5476 ホモサピエンス: UNIGENE: Hs. 517076)にヒトにおいて同定される遺伝子により、そのアイソフォームのいずれかで、およびいずれかの動物種において、コードされる蛋白質に関する。該蛋白質は、また、「リソソーム保護蛋白質前駆体(Lysosomal protective protein precursor)」、カルボキシペプチダーゼC、「ベータガラクトシダーゼのための保護蛋白質(Protective protein for beta-galactosidase)」として、またはコードE.C. 3.4.16.5によっても知られている。特定の実施態様において、蛋白質はヒト蛋白質(Swiss-Prot Accession number P10619, Last update: Release 47 10-May-2005)である。
マーカーの濃度を測定する生物試料は、組織ホモジネートまたは生物学的液体、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、脳脊髄液、涙、羊水(amniotic liquid)およびミルク等であり得る。特定の実施態様において、該生物試料は、血液、血漿、血清または尿である。好ましい実施態様において、該生物試料は、尿試料である。
本発明による評価のための生物試料の調製は、分析実験技術により知られる常法により、基本的には、生物試料のタイプおよび評価のために選択される発明の方法の設定に依存して実施される。簡単な実施例、例えば、イムノクロマトグラフィーストリップ(immunochromatographic strip)(「イムノストリップ」または「ディップストリップ」)を用いた尿のサンプル評価において、試料は、調製の必要がなく、直接的に適用される。異なるマーカーの測定または以前の結果の確認を目的として、さらなる測定が必要とされるとき、評価は、同じ試料または同一被験者由来の異なる試料で実施される。
本発明において、生物試料は、いずれかの動物、とりわけいずれかの哺乳動物、例えば、実験動物(齧歯類、ウサギ、霊長類、イヌ)、ペットまたは家畜(イヌ、ネコ、ウマ、ウシまたはブタ動物)、または野生動物由来であり得る。本発明の特定の実施態様において、該生物試料は、男性または女性のヒト由来である。
本発明による化合物のレベルの測定は、試料中の参照化合物の量が評価されること(一般的に濃度として表現される)を意味する。該評価は、単に、存在−非存在の決定、準定量的評価、またはより好ましくは定量的評価であり得る。
本発明の特定の実施態様は、さらに、参照標準または値に関して測定されるマーカーのレベルの比較を含む。本発明の特定の実施態様において、標準レベルの約1.5倍のレベルは、線維化変性の存在に関する。好ましい実施態様において、参照値の少なくとも2倍のレベルは、線維変化の存在に関係する。
線維化に関わる分子メカニズムは、それが進行する組織にかかわりなく、少なくとも部分的に共通しているので、評価される線維変化に罹患した器官はいずれの器官であり得る。例えば、評価される線維変化は、肺、延髄、肝臓、膵臓、腎臓、心臓または多臓器の線維症であり得る。
好ましい実施態様において、本発明のマーカーの組み合わされた使用は、肝線維症の存在および重篤度を評価することである。
特定の実施態様において、本発明は、ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1、およびカテプシンAから選択される3つのマーカーの組み合わせ使用を含む。好ましくは、4つの特定されたマーカーのレベルが測定される。
場合により、本発明は、他の付加的なマーカーの使用を含み得る。該付加的なマーカーは、蛋白質またはいずれかの他のタイプの化合物(糖タンパク質、ペプチド、小分子、ポリサッカライド、核酸、抗体等)であり得る。
本発明の目的物である、マーカーのレベルの測定は、いずれの公知の分析法により実施され得、その選択は、基本的に、当業者が得ることを欲する、評価に渡り主要な、要求および必要:スピード−簡潔性、感受性および特異性、予測値等に依存する。
本発明の異なる機器構成により、測定は、他の中で、比色分析の、分光光度の、蛍光光度の、化学発光の方法によって、放射性同位元素、分光光度、NMR、クロマトグラフィー、電気泳動および化学的方法、イムノアッセイ(抗原−抗体反応に基づく)を用いて、または該方法の組み合わせにより、実施され得る。
特定の実施態様において、測定は、質量分析、例えば、液体クロマトグラフィーに関連したタンデム質量分析計(LC-MS-MS)またはMALDI-TOF-MS(マトリックス−関連 レーザー脱離/イオン化質量分析飛行時間形MS)により実施される。
本発明の好ましい実施態様において、測定は、イムノアッセイを用いて実施される。本発明の方法により適用されるイムノアッセイは、均一アッセイ(homogeneous assay)、不均一アッセイ(heterogeneous assay)、酵素免疫アッセイ(EIA、ELISA)、競合アッセイ、イムノメトリックアッセイ(immunometric assay)(サンドウィッチ)、比濁アッセイ、ネフェロアッセイ(nephelometric assay)およびそれらの組み合わせを含む。これらイムノアッセイで適用される原理およびプロトコールは良く知られ、引用文献として含められる「The immunoassay handbook」(デイビッド ワイルド編集、第2版、2001、Nature Publishing group)等の手引き書に十分に記載されている。
特定の実施態様において、該イムノアッセイはELISAまたはストリップイムノクロマトグラフィーアッセイ(「ディップストリップ」、「イムノクロマトグラフィックストリップ」または「イムノストリップ」)である。他の特定の実施態様において、該イムノアッセイは抗体チップ上で実施される。
特許文献US5,753,517において、サンドウィッチタイプ試験および阻害アッセイの両方のため、適用できる可能性のある、定量的なイムノクロマトグラフィーストリップアッセイの機器構成および実施例について、我々は、詳細な情報を見出すことができるが、それは、本発明を制限するものとして取り上げるべきではない。イムノクロマトグラフィーアッセイ(immunochromatographic assay)は、また、例えば、特許文献US6,316,205に開示されているもの等の、多くの他の機器構成を採用し得るが、そのうちのいくつかは、同じアッセイおよび同じサンプルで幾つかの異なるマーカーの解析を可能にする。
生物試料における、線維化変性、好ましくは肝線維症の存在(または非存在)または重篤度の最終的な評価のために、試験試料(我々が評価したい線維症の患者の生物学的サンプル)中で測定されたマーカーのレベルは、予め確立された参照値と比較される。定量的(陽性−陰性)または準定量的評価が十分であるとき、測定されるそれぞれの化合物に対し、カットオフ値を確立することが、ただ必要である。最適化された感受性および特異性を有する定量的評価が必要とされるとき、参照値またはインデックスは、例えば、測定されるマーカーのそれぞれ1つの差別的な値の記号論理学回帰分析、およびそれに続く、それぞれの化合物のために得られた測定値を結びつける記号論理学的関数の構築により規定され得る。記号論理学的関数の質は、ROCカーブを用いて解析される。記号論理学的関数を構築する方法は、良く知られており、線維的変化の評価においてもまた使用されてきており、それらの中で、肝線維症は、血清学的マーカーを使用する。これらの方法は、例えば、文献US6,631,330(引用により組み込まれる)で開示される。
本発明の好ましい実施態様にいて、マーカーは尿試料における肝線維症の存在および重篤度を評価するために使用され、ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1、およびカテプシンAから選択される少なくとも2つのマーカーのレベルを測定することにより実施される。特定の実施態様において、該マーカーのために得られた測定は、記号論理学関数によって結びつけられる。
本発明の目的は、例えば、潜在的に抗線維化活性を有する薬剤を選択し、スクリーニングするための方法への使用である。この方法は、a)被検体(好ましくは動物)に試験する薬剤を投与すること;b)試験の異なる時点で(投与の前、間および/または後)、動物から生物試料を摘出し、本発明の方法にしたがって、マーカーレベルを測定すること;およびc)異なる処置段階で得られた試料で実施された測定を比較し、例えば、処置されていない対照動物と比較することを含む。
他の適用において、本発明は、動物または患者の器官、好ましくは肝臓の線維化状態の進行を制御することを可能にし、その結果、動物または患者は、定義されたマーカーの異なるサンプリングおよび評価にかけられる。更なる特定の適用において、本発明は、時間と共に抗線維化処置に対する応答を評価することを可能にする。
本発明の他の態様は、少なくとも2つの以下のマーカー:ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1、およびカテプシンAのための特定のプローブを用いて、該マーカーの濃度を測定することを特徴とする。
用語「プローブ」は、4つの示されたマーカー(ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1、およびカテプシンA)の一つと特異的に反応する分子で、その反応が、着色、蛍光、発光生成物またはマーカー、または他の検出可能なマーカーであり得る、反応強度を示すマーカー−トレーサーにより、直接的にまたは間接的に検出され得る分子に関する。特定の実施態様において、プローブは、ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1、およびカテプシンAの特異的なリガンドであり、例えば、レクチンまたは抗体(抗体(複数))である。好ましい実施態様において、該プローブは、特異的な抗体、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり得る。
他の更なる実施態様において、本発明は、ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1、およびカテプシンAから選択される少なくとも2つのレベルを測定するキットに関し、それは、該マーカーの2、3または4のいずれかの組み合わせのための特異的なプローブを含むことを特徴とする。特定の実施態様において、キットは、該マーカーの2つのための2つの特異的なプローブを含む(例えば、カテプシンAに対する1つのプローブおよびウロモジュリンに対する他のプローブ;またはMAC2BPに対する1つのプローブ、AGP1に対する他のプローブおよびウロモジュリンに対する他のプローブ;等)。他の実施態様において、キットは、該マーカー3つに対する3つのプローブのいずれかの組み合わせを含む。他の実施態様において、キットは少なくとも4つのプローブを含み、その1つは、それぞれ、4つのマーカー、ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1、およびカテプシンAの1つに対する。好ましい実施態様において、プローブの少なくとも1つは、検出し定量化することを欲するマーカーに対する特異的な抗体である。他の特定の実施態様において、全てのキットのプローブは、特異的抗体である。
本発明のキットのプローブは、同じ組成物または分離された組成物に含まれ得、同じキット内の、固体基盤(例えば、ELISAのためのマイクロプレート上、またはイムノクロマトグラフィーのためのストリップ上)に、またはいくつかの組成基盤(composition substrate)上に付着されている。特定の実施態様において、キットはイムノアッセイキットである。好ましい実施態様において、本発明のキットは、イムノクロマトグラフィー用のキットである。
好ましい実施態様において、本発明のキットは、イムノクロマトグラフィー用のキットであり、本発明の方法の4つのマーカーの1つに対する少なくとも1つの特異的な抗体(プローブ)、および少なくとも1つのイムノクロマトグラフィーのストリップまたは膜を含む。好ましい実施態様において、該マーカーまたはそれらの部分に特異的な抗体は、それらをコーティングして、標識された粒子に結合され得る。特定の実施態様において、該特異的な抗体は、クロマトグラフィーストリップ(chromatographic strip)または膜に埋め込まれる。さらに、他の物質または試薬、例えば、標識された粒子に結合されるか、結合されていない、内部対照のための抗体が、クロマトグラフィーストリップに結合され得る。
特定の実施態様において、本発明のキットは、イムノクロマトグラフィー用のキットであり、以下を含む:本発明の方法のマーカーの少なくとも2つまたはそれ以上に対し、より好ましくは特異的な、2つまたはそれ以上のプローブ、抗体;それらに結合する特異的抗体に合致した特定のマーカーに特異的な2つまたはそれ以上のイムノクロマトグラフィーストリップ;並びに、イムノクロマトグラフィーアッセイを完了させるための分析物および特異的抗体の間の反応を検出するために必要な他の試薬および物質。
本発明のキットは、また、他の任意の物質および試薬、例えば、二次抗体、緩衝液、希釈剤、着色剤またはトレーサー(蛍光、発光、等)、標準、キャリブレーションコントロール、テストカートリッジ、バイアル、ボトル、チューブ、針、クロマトグラフィーストリップ、マイクロプレートおよび使用説明書を含み得る。
特定の実施態様において、本発明のキットは、適応「線維症の存在および重篤度の評価用」および、より好ましくは、「肝線維症の存在および重篤度の評価用」でラベルされたパッケージングを含む。特定の実施態様において、それは、「尿における測定用」の適応を含む。該適応は、その同等な適応が、中間段階として、または最終結果として、線維症、好ましくは肝臓の線維症の存在および/または重篤度を評価することを含む方法において、および/または尿中で測定することによって、キットを適用しまたは使用することを黙示的に意味する限りにおいて、同等と考えられる他の適応によって置き換えられることができる。
本発明の実施態様
以下の実施例は、本特許(出願)の発明の目的の態様を非限定的に説明することを目的とする。
以下の実施例は、本特許(出願)の発明の目的の態様を非限定的に説明することを目的とする。
この試験において、異なる程度および起源の肝線維症を有する11人の患者より得られた尿試料を、6人の対照の個人より得られた尿試料と比較した。肝線維症の臨床学的な決定は、尿を得た日と同日に採取された肝臓生検試料の解剖病理学的試験を用いて実施された。KNODELL(Knodell RG, Ishak KG, Black WC, Chen TS, Craig R, Kaplowitz N et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology 1981 Sep-Oct; 1: 431- 435)に基づき評価された、第4の態様に一致する線維症インデックスまたはスコアーを、このために用いた。
尿の試料を収集するために、出所病院の慣習的な臨床プロトコルを用いた。対照個人の尿試料を、同様に、その病院からの健常人から収集した。
線維症の患者および健常人からの尿試料の分析を、2次元電気泳動および質量分析を用いて実施した。このために、患者および対照個人からの約50mlの試料を分析した。試料を、カットサイズ5000DaのAmicon Ultra (Millipore) concentratorを用いて濃縮し、その尿を、7M尿素、2Mチオウレア、(4% vol/vol)の3-[コールアミドプロピル) ジメチル アンモニウム] -1-プロパンスルホネート、1% (col/col) DRRおよび0.5% バイオライト(Biolytes)3/10を含む溶解緩衝液に再懸濁した。蛋白質の量を、Bradford analysisキット(Bio-rad)を使用し、溶解緩衝液に希釈したアルブミンを標準として測定した。2次元電気泳動(2DE)を100μgの全蛋白質を用いて測定した。第1次元をBioRadよりのProtean IEF Cell上で、BioRadよりの17cmIPGストリップを用いて実施し、そして、それを積極的に再水和し、つまり、20℃の温度で、50Vの電圧を12時間与えた。ゲルを60,000 V hで、製造者により設計されたランプ電圧を用いて泳動した。ストリップを、50mM TRIS、pH7、6M尿素、30%グリセロール、2% SDSおよび少量のブロモフェノールブルー中で平衡化した。還元方法は、2%DTTを用いて実施し、他のアルキル化は2%ヨードアセトアミドを用いた。ストリップは、12.5%ポリアクリルアミドゲル(18cmX20cmX1cm)上に直接載せ、それらを1%アガロースでシールする。SDS−PAGE中の第2次元を15時間実施する。ゲルをBioRadよりのSpyro-Ruby蛍光色素を用いて染色した。イメージをBioRadよりのMolecular Imager FXを用いてデジタル化し、BioRadからのPGQUEST 7.1プログラムを用いて解析した。この方法で、300個の蛋白質の平均解析が得られ、比較をPDQUESTを用い行い、ここで、少なくとも2倍の増加または減少が、相違として受け入れられた。この基準で、4つの蛋白質バンドが、線維症の患者からの尿試料中で検出され、その増加または出現が全ての試験で一致した。
選択された試料は、以下に記載するプロトコルに従って、異なる蛋白質のトリプシン消化、それに続く、電子スプレイイオン源を用いたQ TOFマイクロ質量分析計に結合した液体ナノクロマトグラフィー(ESI/MS/MS)を用いて解析した。ゲル内消化を、50mM炭酸アンモニウム中に懸濁した6 ng/μlのトリプシンで、37℃一晩実施した。トリプシン消化したペプチドを1% ギ酸および2% アセトニトリルで抽出した。最後に、トリプシン消化したペプチドの分離を、5%アセトニトリルおよび0.2%ギ酸で平衡化された、Watersからの逆相Atlantis, C18 , 3 μm, 75 μm x 10 cm Nano EaseTM キャピラリーカラム上で実施した。6μlの試料の注入後、カラムを5分間同じ緩衝液で洗浄し、ペプチドを30分間、0.2μl/minの定常流速で5-50%アセトニトリルの線形グラジエントを用いて溶出した。カラムを、Watersからのナノスプレイ型イオン源PicoTipを用いて、WatersからのQ-TOF Microにオンラインで接続した。キャピラリーの温度は80℃であり、スプレイの電源は1.8-2-2kVであった。MS/MSスペクトルをデータに依存して自動的に収集した。3つの最も強いイオンを、2.5単離ウインドーおよび35%の相対的衝突エネルギーを用いて、衝突惹起解離(CID)により連続的にフラグメント化した。データプロセッシングを、Watersからの解析プログラムMassLynx4.0およびProteinLynx Global Server 2を用いて実施した。
図1に見られるゲルイメージに認められるように、2次元電気泳動を用いた尿試料の解析は、約700の異なる蛋白質の分離を可能にした。患者の試料のゲルのそれぞれは、対照個人のそれと比較され、4つのバンドをその後の解析に選択した。それら4つのみが患者の試料中で現れ、それらの1つが、それら個人の中で明らかに増加する。11人の患者および6人の対照個人から作成したゲルからのバンドを切り出し、前のセクションで示したプロトコルを用いてトリプシンで消化した。該バンドを研究することができるように、トリプシン消化物を、それから、MALDI-TOF質量分析計、ペプチドフィンガープリンティング、およびLC-ESI-QUAD-TOF質量分析計を用いて解析した。該蛋白質を、図1中にそれぞれ1、2、3および4として記されている、ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1およびカテプシンAと同定した。これら蛋白質の存在または非存在の解析を、対照個人および患者から得られた2次元ゲルの両方で解析し、表1に示される分布が得られた。この表で観察することができるように、少なくとも2つのマーカーが、全ての線維症患者の試験で出現し、一方、それらは対照個人では観察されない。
Claims (23)
- 線維化変性のインビトロ検出のための、ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1およびカテプシンAから選ばれる少なくとも2つのマーカーの組み合わせの使用。
- a)生物試料を得ること;および
b)試料中の該マーカーの濃度を測定すること
を含むことを特徴とする、請求項1に記載の使用。 - 該生物試料が、血液、血漿、血清および尿から選択されることを特徴とする、請求項2に記載の使用。
- 該生物試料が、哺乳動物由来であることを特徴とする、請求項2または3に記載の使用。
- 該生物試料が、男性または女性のヒト由来であることを特徴とする、請求項2−4のいずれかに記載の使用。
- さらに、マーカーのレベルを参照値と比較することを含むことを特徴とする、請求項1−5のいずれかに記載の使用。
- 参照値の少なくとも2倍のレベルが、線維化変性の存在に関連づけられることを特徴とする、請求項6に記載の使用。
- 該線維化変性が、肺、延髄、肝臓、膵臓、腎臓、心臓または多臓器の線維症から選択されることを特徴とする、請求項1−7のいずれかに記載の使用。
- 該線維化変性が、肝線維症であることを特徴とする、請求項1−8のいずれかに記載の使用。
- 該マーカーの濃度が、比色分析、分光光度、NMR、クロマトグラフィー、電気泳動、イムノアッセイまたは該方法の組み合わせから選択される方法により測定されることを特徴とする、請求項1−9のいずれかに記載の使用。
- 請求項1で特定されたマーカーの3つの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項1−10のいずれかに記載の使用。
- ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1およびカテプシンAの4つのマーカーの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項1−11のいずれかに記載の使用。
- 該マーカーの濃度が、少なくとも2つのマーカーに対する特異的なプローブを使用して測定されることを特徴とする、請求項2−12のいずれかに記載の使用。
- プローブの少なくとも1つが特異的な抗体であることを特徴とする、請求項12に記載の使用。
- ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1およびカテプシンAの2、3または4のいずれかの組み合わせに対し特異的なプローブを含むことを特徴とする、ウロモジュリン、MAC2BP、AGP1およびカテプシンAから選択される少なくとも2つのマーカーのレベルを測定するためのキット。
- 少なくとも1つのプローブが、特異的抗体であることを特徴とする、請求項15に記載のキット。
- イムノアッセイ用のキットであることを特徴とする、請求項15または16のいずれかに記載のキット。
- イムノクロマトグラフィー用のキットであることを特徴とする、請求項15−17のいずれかに記載のキット。
- ELISA用のキットであることを特徴とする、請求項15−17のいずれかに記載のキット。
- さらに、二次抗体、トレーサー、緩衝液、希釈剤、標準、キャリブレーションコントロール、テストカートリッジ、バイアル、クロマトグラフィーストリップ、マイクロプレートおよび使用説明書から選択される他の成分を含むことを特徴とする、請求項15−19のいずれかに記載のキット。
- 線維症の存在および重篤度の評価用の適応または同等の適応でラベルされたパッケージングを含むことを特徴とする、請求項15−20のいずれかに記載のキット。
- 肝線維症の存在および重篤度の評価用の適応を有する、請求項21に記載のキット。
- ラベルが、尿中の測定用の適応も含む、請求項21に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES200501611A ES2288358B1 (es) | 2005-07-01 | 2005-07-01 | Marcadores de fibrosis. |
PCT/ES2006/000367 WO2007003670A1 (es) | 2005-07-01 | 2006-06-22 | Marcadores de fibrosis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009500597A true JP2009500597A (ja) | 2009-01-08 |
Family
ID=37604101
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008518876A Withdrawn JP2009500597A (ja) | 2005-07-01 | 2006-06-22 | 線維症のマーカー |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090117591A1 (ja) |
EP (1) | EP1918715A1 (ja) |
JP (1) | JP2009500597A (ja) |
CN (1) | CN101356439A (ja) |
AU (1) | AU2006264946A1 (ja) |
BR (1) | BRPI0613169A2 (ja) |
CA (1) | CA2613833A1 (ja) |
ES (1) | ES2288358B1 (ja) |
MX (1) | MX2008000059A (ja) |
RU (1) | RU2008103370A (ja) |
WO (1) | WO2007003670A1 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011007797A1 (ja) * | 2009-07-14 | 2011-01-20 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 糖タンパク質の測定方法、肝疾患の検査方法、糖タンパク質定量用試薬および肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質 |
JP2016540218A (ja) * | 2013-12-10 | 2016-12-22 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 肝疾患の鑑別診断 |
US9796761B2 (en) | 2009-07-14 | 2017-10-24 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Glycan markers as measure of disease state of hepatic diseases |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8426142B2 (en) * | 2008-06-02 | 2013-04-23 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | IgA nephropathy testing method and test kit |
WO2010079253A2 (es) | 2009-01-09 | 2010-07-15 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Biomarcadores para el diagnóstico de fibrosis |
EP2401689B1 (en) * | 2009-02-26 | 2018-05-09 | Universite D'Angers | Improved diagnosis of liver fibrosis or cirrhosis |
WO2012054870A2 (en) * | 2010-10-21 | 2012-04-26 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Biomarkers for hcv infected patients |
CA2831827A1 (en) | 2011-04-05 | 2012-10-11 | Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc | Compounds and methods for altering activin receptor-like kinase signalling |
CN102645540A (zh) * | 2012-04-01 | 2012-08-22 | 安徽四正医药科技有限公司 | 一种用于诊断肝纤维化和早期肝硬化的血液标志物 |
US20170232276A1 (en) * | 2014-09-30 | 2017-08-17 | Primegen Biotech, Llc | Treatment of fibrosis using deep tissue heating and stem cell therapy |
EP3327441B1 (en) * | 2015-07-24 | 2021-02-17 | Public University Corporation Nagoya City University | Method for assisting diagnosis of conditions of myelofibrosis, method for monitoring therapeutic effect, and a device therefor |
CN114280300B (zh) * | 2021-12-28 | 2023-04-25 | 四川大学华西医院 | 尿液蛋白在诊断代谢性肝病中的应用 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4894442A (en) * | 1985-04-12 | 1990-01-16 | Kuraray Co., Ltd. | Monoclonal antibodies that bind to alpha-acid glycoprotein |
DE3832432A1 (de) * | 1988-09-23 | 1990-03-29 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zum nachweis der funktionsfaehigkeit der nierentubuli |
US5604105B1 (en) * | 1990-10-12 | 1999-08-24 | Spectral Diagnostics Inc | Method and device for diagnosingand distinguishing chest pain in early onset thereof |
WO1993008215A1 (en) * | 1991-10-16 | 1993-04-29 | Cetus Oncology Corporation | Secreted mac-2-binding glycoprotein |
US6242246B1 (en) * | 1997-12-15 | 2001-06-05 | Somalogic, Inc. | Nucleic acid ligand diagnostic Biochip |
WO2002089657A2 (en) * | 2001-05-04 | 2002-11-14 | Biosite, Inc. | Diagnostic markers of acute coronary syndromes and methods of use thereof |
-
2005
- 2005-07-01 ES ES200501611A patent/ES2288358B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-06-22 MX MX2008000059A patent/MX2008000059A/es not_active Application Discontinuation
- 2006-06-22 US US11/988,092 patent/US20090117591A1/en not_active Abandoned
- 2006-06-22 CA CA002613833A patent/CA2613833A1/en not_active Abandoned
- 2006-06-22 WO PCT/ES2006/000367 patent/WO2007003670A1/es active Application Filing
- 2006-06-22 BR BRPI0613169-7A patent/BRPI0613169A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-06-22 JP JP2008518876A patent/JP2009500597A/ja not_active Withdrawn
- 2006-06-22 CN CNA2006800313387A patent/CN101356439A/zh active Pending
- 2006-06-22 AU AU2006264946A patent/AU2006264946A1/en not_active Abandoned
- 2006-06-22 RU RU2008103370/15A patent/RU2008103370A/ru not_active Application Discontinuation
- 2006-06-22 EP EP06794042A patent/EP1918715A1/en not_active Withdrawn
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011007797A1 (ja) * | 2009-07-14 | 2011-01-20 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 糖タンパク質の測定方法、肝疾患の検査方法、糖タンパク質定量用試薬および肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質 |
JP5031928B2 (ja) * | 2009-07-14 | 2012-09-26 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 糖タンパク質の測定方法、肝疾患の検査方法、糖タンパク質定量用試薬および肝疾患病態指標糖鎖マーカー糖タンパク質 |
JP2012185172A (ja) * | 2009-07-14 | 2012-09-27 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 糖タンパク質の測定方法、肝疾患の検査方法および糖タンパク質定量用試薬 |
US8623608B2 (en) | 2009-07-14 | 2014-01-07 | Sysmex Corporation | Method for measuring glycoprotein, method for examining liver disease, reagent for quantitative determination of glycoprotein, and glycan-marker glycoprotein as an index for clinical conditions of liver disease |
US9796761B2 (en) | 2009-07-14 | 2017-10-24 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Glycan markers as measure of disease state of hepatic diseases |
JP2016540218A (ja) * | 2013-12-10 | 2016-12-22 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 肝疾患の鑑別診断 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2006264946A1 (en) | 2007-01-11 |
EP1918715A1 (en) | 2008-05-07 |
WO2007003670A1 (es) | 2007-01-11 |
ES2288358B1 (es) | 2008-11-16 |
MX2008000059A (es) | 2008-03-19 |
ES2288358A1 (es) | 2008-01-01 |
BRPI0613169A2 (pt) | 2010-12-21 |
RU2008103370A (ru) | 2009-08-10 |
WO2007003670A8 (es) | 2008-01-17 |
CA2613833A1 (en) | 2007-01-11 |
US20090117591A1 (en) | 2009-05-07 |
CN101356439A (zh) | 2009-01-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2009500597A (ja) | 線維症のマーカー | |
KR20180123978A (ko) | 간암 고위험군의 간암 발병 모니터링 또는 진단용 바이오마커 및 그 용도 | |
KR101219519B1 (ko) | 렉틴을 이용한 암 진단 방법 | |
KR101559101B1 (ko) | 혈액유래 암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암 진단방법 | |
JP5090332B2 (ja) | 炎症及び感染症のためのバイオマーカーとしての短鎖srlアルコールデヒドロゲナーゼ(dhrs4)の測定 | |
US20150219672A1 (en) | Novel biomarkers for non-alcoholic fatty liver disease, and methods for detecting non-alcoholic fatty liver disease by using such biomarkers | |
EP2444814B9 (en) | Biomarker for mental disorders including cognitive disorders, and method using said biomarker to detect mental disorders including cognitive disorders | |
KR100394940B1 (ko) | 간 질환 진단을 위한 혈중 아사이알로당단백질양의측정방법 및 측정용 킷트 | |
KR20150062915A (ko) | 혈액 당단백질을 이용하는 암 마커 및 이를 이용하는 암 진단방법 | |
US8642347B2 (en) | Urinary CA125 peptides as biomarkers of ovarian cancer | |
EP2313782B1 (en) | Proteomic fingerprint for the diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis (nash) and/or steatosis | |
KR101527283B1 (ko) | 당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 마커 스크리닝 방법 및 간세포암 마커 | |
JP4850001B2 (ja) | 新規ストレスバイオマーカー及びその用途 | |
KR101219516B1 (ko) | 암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암 진단방법 | |
US9921225B2 (en) | Phenyl glyoxal probes | |
WO2021095824A1 (ja) | 大腸癌の診断を補助する方法、キット及びバイオマーカー | |
JP7307479B2 (ja) | IgA腎症診断用キット | |
KR102131860B1 (ko) | 아르기닌이 메틸화된 ggt1에 특이적으로 결합하는 대장암 진단용 바이오마커 조성물 | |
KR20130102693A (ko) | 유방암 진단용 단백질 마커 아포리포단백질 (a), 이의 검출 방법 및 이에 대한 항체를 포함하는 유방암 진단키트 | |
KR102346864B1 (ko) | 방광암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커 조성물, 키트 및 이를 이용한 진단 방법 | |
JP2013515274A (ja) | 酸性およびシステインに富む分泌(sparc)タンパク質srm/mrmアッセイ | |
WO2014177701A1 (en) | Process for diagnosing a human subject with diseases affecting the kidneys, or at risk of acquiring diseases affecting the kidneys | |
US20120214169A1 (en) | Differential levels of haptoglodin isoforms in small cell lung cancer | |
JP2004051536A (ja) | 歯周病疾患マーカー蛋白質及びそれを利用した歯周病診断方法 | |
You | Discovery of novel potential protein diagnostic biomarkers for Prostate Cancer in serum and tears |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090610 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20101117 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20101117 |