BRPI0613169A2 - uso de uma combinação de pelo menos dois marcadores e kit para determinar os nìveis de pelos menos dois marcadores - Google Patents

Abstract

USO DE UMA COMBINAçãO DE PELO MENOS DOIS MARCADORES E KIT PARA DETERMINAR OS NìVEIS DE PELO MENOS DOIS MARCADORES. Refere-se a presente invenção ao uso de uma combinação de pelo menos dois marcadores selecionados a partir de uromodulina, MAC2BP, AGP1 e catepsina A, para a detecção in vitro de alterações fibróticas. Além disso, a presente invenção refere-se também a um kit para a determinação dos níveis dos ditos marcadores em uma amostra biológica.

Description

USO DE UMA. COMBINAÇÃO DE PELO MENOS DOIS MARCADORES EKIT PARA DETERMINAR OS NÍVEIS DE PELO MENOS DOISMARCADORES

Descrição

Refere-se a presente invenção ao uso demarcadores biológicos para identificação de fibrose.

Técnica Anterior

As alterações ou enfermidades fibróidesconstituem uma das principais causas de morbidez/ mor-talidade e a sua natureza crônica tem um efeito nos pa-cientes e sociedade com ônus financeiros consideráveis.

A fibrose progressiva de órgãos e tecidos, incluindo ofigado, pulmões, rins, coração, vasos sangüíneos e apele, compreende uma constelação de alterações relacio-nadas mecanicamente. Cada uma destas alterações tem emcomum um acúmulo alterado, excessiva de matriz extrace-lular, principalmente colágeno, que envolve uma desor-ganização da arquitetura de tecidos normais e, conse-quentemente, uma perda funcional.

Em particular, a fibrose hepática é a com-plicação principal de dano do fígado crônica e a suaprogressão conduz a cirrose a longo prazo. As causasmais freqüentes da fibrose hepática são a ingestão deálcool, infecções decorrentes do vírus de hepatite C eesteato-hepatite não-alcoólica (NASH). Ela contribuiainda em uma grande extensão para o desenvolvimento deinsuficiência hepática e hipertensão da veia porta.Em conseqüência, a avaliação da presençaou severidade de fibrose hepática constitui um parâme-tro importante na prática clinica e constitui um indi-cador valioso do risco de progressão da cirrose.

Além disso, a disponibilidade de métodosapropriados para avaliar a presença e severidade da fi-brose é uma ferramenta determinante na pesquisa de mo-léculas potencialmente antifibrose.

A biópsia do figado e o subseqüente examehistológico é ainda hoje a técnica de referência parase avaliar fibrose hepática. Não obstante, é uma téc-nica dispendiosa com aplicação limitada, que é agressi-va e dolorosa e também pode causar complicações para asaúde do indivíduo. A precisão e capacidade de repro-dução deste método é seriamente questionado devido aosproblemas inerentes na extração do espécime de tecido eàs variações intra- e inter-observador.

Propuseram-se várias abordagens para medira progressão dessas análises de rotina químicas e hema-tológicas, exames fisiológicos e marcadores de fibrosede soro.

Sugeriu-se a me'dição de proteínas de ma-triz extracelular ou de seus produtos de síntese e de-gradação no soro, por exemplo (US-5,316,914, EP-0283779).

US 6,631,330 propõe um método que utilizamodelos de regressão logística binária em uma série deparâmetros sorológicos clínicos (marcadores). Este es-quema foi usado para desenvolver o Fibrotest (Biopre-dictive, Paris, França), um indice de fibrose que com-bina a avaliação de cinco marcadores de fibrose de soroindiretos. Este teste, aplicado em combinação com Fi-broScan (Echosens, Paris, France) (Sandrin L. et al.2003. "Transient elastography: a new non-invasive me-thod for assessment of fibrose hepática"; UltrasoundMed. Biol. 29: 1705-1713), parece funcionar adequada-mente para a avaliação da progressão de fibrose nas in-fecções por vírus da hepatite C.

W02004/063753 propõe um método de avalia-ção baseado na análise de perfis de proteínas N-glycande soro.

Não obstante, novos métodos simples, quesão fáceis de realizar e não agressivos e que permitemavaliar apropriadamente o grau de fibrose hepática sãoainda necessários, particularmente nos estágios menosgraves de fibrose.

Há evidência de que muitos processos pato-lógicos são associados com alterações quantitativas efuncionais nos constituintes moleculares dos fluidoscorpóreos. Uma vez que a urina é um fluido corpóreofacilmente disponível, o desenvolvimento de um métodopara avaliar fibrose hepática baseado na determinação equantificação de analitos indicadores de fibrose, porexemplo, proteínas, detectáveis na urina, seria muitodesejável e vantajoso.

Conseqüentemente, o objetivo da presenteinvenção é o desenvolvimento de um método para avaliara presença e severidade de fibrose hepática, e tambémde outros órgãos vitais, pela determinação e quantifi-cação de diferentes analitos indicadores detectáveis emuma amostra biológica, preferentemente urina. Para es-te fim, os padrões de expressão de proteína diferenci-ais (proteome) na urina de indivíduos saudáveis e deindivíduos com fibrose hepática foram analisados, o quepermitiu a seleção de várias proteínas como candidatasa biomarcadores.

Descrição Breve dos Desenhos

Figura 1. Identificação do aumento e apa-rência das proteínas de uromodulinaa, MAC2BP, AGPl ecatepsina A em amostras de urina em pacientes com fi-brose hepática. Estão ilustrados géis representativesprovenientes de pacientes e de indivíduos de controle.Os diferentes pontos estão indicados como 1: uromoduli-naa, 2: MAC2BP, 3: AGP1, e 4: catepsina A.

Descrição Detalhada da Invenção

Em um primeiro aspecto, a presente inven-ção refere-se ao uso de uma combinação de pelo menosdois marcadores selecionados a partir de uromodulina,MAC2BP, AGPl e catepsina A, para a detecção in vitro dealterações fibróides. Este uso é caracterizado pelofato de que compreende a obtenção de uma amostra bioló-gica e medição da concentração dos ditos marcadores naamostra.Além disso, a invenção refere-se a um pro-cesso para avaliar in vitro a presence (ou ausência) eseveridade (estágio ou grau de desenvolvimento) de umaalteração fibróide. 0 ditto processo á characterizadopelo fato de que ele compreende:

a) obtenção de uma amostra biológica;

b) determinação dos níveis de pelo menos dois marca-dores na dita amostra, selecionados a partir de:uromodulina

- MAC2BP

- AGPl, ecatepsina A.

0 termo "marcador" refere-se a uma molécu-la ou composto cuja quantidade é avaliada. No métododa invenção, os quarto marcadores cujos níveis são de-terminados compreendem proteínas. A presença-ausênciaou aumento-diminuição dos ditos marcadores na amostrabiológica é uma indicação da presença ou severidade dauma alteração fibróide.

O termo "uromodulina" refere-se à proteínacodificada pelo gene identificado em seres humanos pelosímbolo UMOD (LOCUSLINK: 7369 Homo sapiens; UNIGENE:Hs. 164470), em qualquer de suas isoformas e em qual-quer espécie animal. A dita proteção também é conheci-da como glicoproteína Uromucoid ou Tamm-Horsfall (THP).

Em uma concretização particular a proteína é proteínahumana (Swiss-Prot Accession number P07911, Last upda-te: Release 47 10-May-2005).O termo "MAC2BP" refere-se à proteína co-dificada pelo gene em seres humanos pelo símboloLGALS3BP (LOCUSLINK: 394 9 Homo sapiens; UNIGENE: Hs.514535), em qualquer de suas isoformas e em qualquerespécie. A dita proteína é também conhecida como "pro-teína de ligação Galectin-3", "proteína de ligação Mac-2" (MAC2BP) ou "Antígeno associado a tumor 90K". Emuma concretização particular a proteína é proteína hu-mana (Swiss-Prot Accession number Q08380, Last update:Release 47 10-May-2005) . Isto é uma glicoproteína quepromove a adesão celular e pode estimular as defesascontra vírus e células de tumores.

O termo "AGP1" refere-se a uma proteínacodificada pelo gene identificado em seres humanos pelosímbolo ORMl (LOCUSLINK: 5004 Homo sapiens; UNIGENE:Hs. 494984), em qualquer uma de suas isoformas e emqualquer espécie. A dita proteína também é conhecidacomo "Alfa-l-ácido glicoproteína" (AGPl), ou orosomu-coide 1 (OMDl). Em uma concretização particular a pro-teína é proteína humana (Swiss-Prot Accession numberP02763, Last update: Release 47 10-May-2005). Foi des-crita a sua intervenção na modulação da atividade dosistema imune durante a fase de reação aguda. Ela so-fre alterações no seu padrão de glicolisação em pacien-tes com cirrose e também foi sugerida uma função promo-tora de fibrose hepática. Foi proposto um processo pa-ra diagnosticar enfermidade do fígado (hepatite, cirro-se, hepatocarcinoma) utilizando-se um anticorpo especí-fico para esta proteína (W02004058823).

A expressão "catepsina A" refere-se à pro-teína codificada pelo gene identificado em seres huma-nos pelo símbolo PPGB (LOCUSLINK: 5476 Homo sapiens:UNIGENE: Hs. 517076), em qualquer uma de suas isoformase em qualquer espécie. A dita proteína também é conhe-cida como "Precursor de proteína protetora lisossomal",carboxipeptidase C, "Proteína protetora para beta-galactossidase" ou pelo código E.C. 3.4.16.5. Em umaconcretização particular a proteína é proteína humana(Swiss-Prot Accession number P10619, Last update: Rele-ase 47 10-May-2005).

A amostra biológica onde a concentraçãodos marcadores é medida pode ser um homogenado de teci-do, um lisado de tecido ou um fluido biológico, por e-xemplo, sangue, plasma, soro, urina, saliva, líquidocérebro-espinal, lágrimas, líquido amniótico e leite, eassemelhados. Em uma concretização particular a ditaamostra biológica é sangue, plasma, soro ou urina. Emuma concretização preferida, a dita amostra biológica éuma amostra de urina.

A preparação da amostra biológica para suaavaliação de acordo com a presente invenção é realizadapor processos convencionais conhecidos por técnicos delaboratórios de análises, basicamente dependendo do ti-po de amostra biológica e da configuração do método dainvenção escolhido para a avaliação. Nas concretiza-ções mais simples, por exemplo, uma avaliação de amos-tra de urina utilizando-se tiras imunocromatográficas("imuno-tira" ou uma "dip-tira"), a amostra é aplicadadiretamente sem necessidade de preparação. Quando sãorequeridas determinações adicionais, visando a mediçãode diferentes marcadores ou a confirmação de resultadosanteriores, a avaliação pode ser realizada em alíquotasda mesma amostra ou de diferentes amostras tomadas apartir do mesmo paciente.

Na presente invenção, a amostra biológicapode ser proveniente de qualquer animal, particularmen-te qualquer animal mamífero, tal como, por exemplo, umanimal de laboratório (roedor, um coelho, um primata,um cachorro), um animal de estimação ou doméstico (umcachorro, um gato, um cavalo, um animal bovino ou suí-no) ou um animal selvagem. Em uma concretizações par-ticular da invenção, a dita amostra biológica provém deum homem ou de uma mulher.

A determinação dos níveis de um compostode acordo com a presente invenção significa que a quan-tidade do composto referido na amostra é avaliado (deuma maneira geral expressa na forma de concentração).A dita avaliação pode ser simplesmente uma determinaçãode presença-ausência, uma avaliação semi-quantitativa,ou com maior preferência uma avaliação quantitativa.

Uma concretização particular da invençãocompreende ainda comparar os níveis dos marcadores de-terminados com relação a um padrão ou valor de referên-cia. Em uma concretização específica da invenção, ní-veis acima de 1,5 vezes os níveis padrão estão relacio-nados com a presença de alterações fibróides. Em umaconcretização preferida, níveis de pelo menos duas ve-zes o valor de referência encontram-se ligados à pre-sença de uma alteração fibróide.

Dado que os mecanismos moleculares envol-vidos na fibrose são, pelo menos parcialmente, comuns,independentemente do tecido onde eles se desenvolvem, oórgão afetado pela alteração fibróide a avaliar podeser qualquer órgão. Por exemplo, a alteração fibróidea avaliar pode ser uma fibrose pulmonar, medular, hepa-tica, pancreática, renal, cardíaca ou multiorgânica.

Em uma concretização preferida, o uso com-binado dos marcadores da invenção destina-se a avaliara presença e severidade de fibrose hepática.

Em uma concretização particular, a inven-ção compreende o uso combinado de três marcadores sele-cionados a partir de uromodulina, MAC2BP, AGPl e catep-sina A. Preferentemente os níveis dos quatro marcado-res espeifiçados são determinados.

Opcionalmente, a presente invenção podeincluir o uso de outros marcadores adicionais. Os di-tos marcadores adicionais podem ser proteínas ou qual-quer outro tipo de composto (glicoproteínas, peptídios,pequenas moléculas, polissacarídeos, ácidos nucléicos,anticorpos, e outros).

A determinação dos níveis de marcadoresobjeto da presente invenção pode ser realizada por qua-quaisquer métodos analíticos conhecidos, com a escolhados mesmos dependendo basicamente dos requisitos e ne-cessidades que predominam sobre a avaliação que se de-seja para obter: velocidade-simplicidade, sensibilidadee especificidade, valor anunciador, e outros.

De acordo com diferentes configurações dainvenção, a determinação pode ser realizada, entre ou-tras, por processos colorimétricos, espectrofotométri-cos, de fluorescência, processos de quimioluminescên-cia, utilização de radioisótopos, NMR, cromatográficos,electroforéticos e processos químicos, imuno-ensaios(baseados em uma reação antígena-anticorpos) ou por umacombinação dos ditos métodos.

Em uma concretização particular, a deter-minação é realizada por espectrometria de massa, porexemplo, espectrometria de massa em tandém associadacom cromatografia líquida (LC-MS-MS) ou MALDI-TOF-MS(dessorção a laser auxiliada por matriz/ tempo de pas-sagem de espectrometria de massa de íonização MS).

Em uma concretização preferida da inven-ção, a determinação é realizada utilizando-se um imuno-ensaio. Imunoensaios aplicáveis no método da invençãoincluem: ensaios homogêneos, ensaios heterogêneos, imu-noensaios de enzimas (EIA, ELISA), ensaios competiti-vos, ensaios imunométricos (sanduíche), ensaios turbi-dimétricos, ensaios nefelométricos e as suas combina-ções. Os princípios e protocolos aplicáveis destes i-munoensaios são amplamente conhecidos e amplamente des-critos em manuais tais como "The immunoassay handbook",editado por David Wild, 2nd edition 2001, Nature Publi-shing Group, que fica incluído como uma referência.

Em uma concretização particular, o ditoimunoensaio é an ELISA ou um ensaio de immunocromato-grafia de fita ("dipstrip", "de tira imunocromatográfi-co" ou "imuno-tira"). Em outra concretização particu-lar, o dito imunoensaio é realizado em uma microplaque-ta de anticorpo.

No documento de patente US 5.753.517 pode-se encontrar informação detalhada, que não deverá serconsiderada como restritiva da presente invenção, empossíveis configurações e concretizações aplicáveis deum ensaio de tira imunocromatográfica quantitativa,tanto para testes dos tipos sanduíche quanto ensaios deinibição. 0 ensaio imunocromatográfico também pode a-dotar muitas outras configurações, tais como aquelasexpostas no documento de patente US 6.316.205, algumasdas quais permitem a análise de diversos marcadores di-ferentes no mesmo ensaio e na mesma amostra.

Para a avaliação final da presença (ou au-sência) ou severidade da alteração fibróide, preferen-temente fibrose hepática, na amostra biológica, os ní-veis dos marcadores determinados na amostra de teste(amostra biológica do paciente cuja fibrose se desejaavaliar) são comparados com valores de referência pré-estabelecidos. Quando uma avaliação qualitativa (posi-tiva-negativa) ou semi-qualitativa é suficiente, é ne-cessário apenas estabelecer um valor de corte para CADacomposto medido. Quando é requerida uma avaliaçãoquantitativa com sensibilidade e especificidade otimi-zadas, o valor ou Índices de referência podem, por e-xemplo, ser estabelecidos com uma análise de regressãologística dos valores discriminativos de cada um dosmarcadores medidos, e subseqüente construção de umafunção logística que vincula as medições obtidas paracada composto. A qualidade da função é analisada usan-do-se curvas ROC. Os procedimentos para construir fun-ções logísticas são amplamente conhecidas e também fo-ram usadas na avaliação de alterações fibróides, entreelas fibrose hepática, utilizando-se marcadores soroló-gicos. Estes procedimentos encontram-se expostos, porexemplo, no documento US 6.631.330, que fica incorpora-do como referência.

Em uma concretização preferida da invençãomarcadores são usados para avaliação da presença e se-veridade da fibrose hepática em amostras de urina, e érealizada pela determinação dos níveis de pelo menosdois dos marcadores selecionados a partir de uromoduli-na, MAC2BP, AGPl e catepsina A. Em uma concretizaçãoparticular, as medições obtidas para os ditos marcado-res são ligadas por uma função logística.

O objeto da invenção é do uso, por exem-plo, em um método para selecionar e resguardar drogascom atividade antifibrose potencial. Este processocompreende a) administrar ao paciente (preferentementeum animal) a droga a estudar; b) em pontos diferentesdo estudo (antes, durante e/ou depois da administração)coletar amostras biológicas a partir do animal e deter-minar os níveis de marcador de acordo com a presenteinvenção; e c) comparar as determinações realizadas nasamostras obtidas nas diferentes fases de tratamento ecomparadas com os animais de controle, por exemplo nãotratados.

Em outra aplicação, a invenção permitecontrolar a progressão do estado fibróide de um órgão,preferentemente o fígado, de um animal ou paciente, deforma que o animal ou paciente é submetido a diferentesamostragens e avaliações dos marcadores definidos. Emuma aplicação mais particular, a invenção permite obtera avaliação da resposta ao tratamento antifibrose com otempo.

Outro aspecto da invenção é caracterizadopelo fato de que a concentração dos ditos marcadoresémedida utilizando-se sondas específicas para pelo menosdois dos seguintes marcadores: uromodulina, MAC2BP,AGPl e catepsina A.

O termo "sonda" refere-se a uma moléculaque reage especificamente com um dos quatro marcadoresindicados (uromodulina, MAC2BP, AGPl e catepsina A), ecuja reação pode ser detectada, seja diretamente ou in-diretamente, por um marcador-indicador da intensidadede reação, que pode ser um produto ou marcador colori-do, fluorescente, luminoso, ou qualquer outro marcadorsuscetível de ser detectado. Em uma concretização par-ticular, a sonda é um ligante específico de uromoduli-na, MAC2BP, AGPl ou catepsina A, por exemplo, uma Iec-tina ou um anticorpo (anticorpos) . Em uma concretiza-ção preferida, a dita sonda é um anticorpo específico,seja ele policlonal ou monoclonal.

Em um outro aspecto adicional, a invençãorefere-se a um kit para determiner os níveis de pelomenos dois dos marcadores selecionados a partir de uro-modulina, MAC2BP, AGPl e catepsina A, caracterizado porcompreender sondas específicas para qualquer combinaçãode 2, 3 ou 4 dos ditos marcadores. Em uma concretiza-ção específica, o kit contém duas sondas específicaspara dois dos ditos marcadores (por exemplo, uma sondapara catepsina A e outra para uromodulina; ou uma paraMAC2BP, outra para AGPl e uma outra para uromodulina; eassim por diante). Em outra concretização, o kit con-tém qualquer combinação de 3 sondas para 3 dos dittosmarcadores. Em outra concretização, o kit contém pelomenos 4 sondas, uma para cada um dos 4 marcadores uro-modulina, MAC2BP, AGPl e catepsina A. Em uma concreti-zação preferida, pelo menos uma das sondas é um anti-corpo específico para o marcador que se deseja detectare quantificar. Em outra concretização particular, to-das as sondas do kit são anticorpos específicos.

A sonda ou sondas do kit da invenção podemestar contidas na mesma composição ou em composiçõesseparadas, aderentes a um substrato sólido (por exem-pio, uma microplaqueta para ELISA ou em uma tira paraimunocromatografia) ou em diversos substratos de compo-sição dentro do mesmo kit. Em uma concretização espe-cifica, o kit é um kit de imunoensaio. Em uma concre-tização preferida, o kit da invenção é um kit para ELI-SA. Em outra concretização, o kit da invenção é um kitpara imunocromatografia.

Em uma concretização preferida, o kit dainvenção é um kit para imunocromatografia que compreen-de pelo menos um anticorpo especifico (a sonda) para umdos quatro marcadores do método da invenção e pelo me-nos uma tira ou membrana imunocromatográfica. Em umaconcretização particular, os anticorpos específicos pa-ra o ditto marcador, ou parte dos mesmos, podem servinculados a partículas rotuladas, revestindo as mes-mas. Em uma concretização particular, os ditos anti-corpos específicos são embutidos em uma tira ou membra-na cromatográfica. Adicionalmente, outro material oureagentes, tais como anticorpos para controle interno,sejam vinculados ou não vinculados a partículas rotula-das, podem ser aderentes à tira cromatográfica.

Em uma concretização particular o kit dainvenção é um kit para imunocromatografia que contém:duas ou mais sondas, anticorpos, preferentemente espe-cíficos para pelo menos dois ou mais dos marcadores dométodo da invenção; duas ou mais tiras imunocromatográ-ficas específicas para um marcador particular de acordocom o anticorpo específico que adere ao mesmo; bem comooutros reagentes e materiais necessários para detectara reação entre o analito e o anticorpo especifico paracompletar um ensaio de imunocromatográfico completo.

O kit da invenção pode conter também ou-tros materiais e reagentes opcionais, por exemplo, an-ticorpos secundários, amortecedores, diluentes, coranteou indicadores (fluorescentes, luminescentes, e asseme-lhados) , padrões, controles de calibragem, cartuchos deteste, frascos, garrafas, tubos, agulhas, tiras croma-tográficas, microplaguetas e instruções para uso.

Em uma concretização particular o kit dainvenção compreende uma embalagem com um rótulo com aindicação "para avaliação da presença e severidade defibrose", e com maior preferência "para avaliação dapresença ou severidade de fibrose hepática". Em umaconcretização particular ele inclui a indicação "paradeterminação em urina". A dita indicação pode sersubstituída por outras indicações consideradas equiva-lenttes na medida em que as ditas indicações equivalen-tes signifiquem implicitamente a aplicação ou uso dokit em um método que inclui, seja como uma etapa inter-mediária ou um resultado final, a avaliação da presençae/ou severidade de fibrose, preferentemente hepáticae/ou por determinação em urina.

Concretização da Invenção

O exemplo seguinte ajuda a ilustrar, pormeios não limitativos, a concretização da invenção ob-jeto do presente pedido de patente.

EXEMPLO

Neste estudo, amostras de urina obtidas apartir de 11 pacientes com fibrose hepática de diferen-te graus e fontes foram comparadas com amostras de uri-na obtidas a partir de 6 indivíduos de controle. A de-terminação clínica de fibrose hepática foi efetuada u-tilizando-se o estudo anatomopatológico de amostras debiópsia hepática coletadas no mesmo dia em que a urinafoi obtida. 0 índice de fibrose ou contagem correspon-dente ao quarto aspecto avaliado em KNODELL (KnodellRG, Ishak KG, Black WC, Chen TS, Craig R, Kaplowitz Net al. Formulation and application of a numerical scor-ing system for assessing histological activity in as-ymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology 1981Sep-Oct; 1: 431- 435) foi usado para isto.

Para coletar as amostras de urina, utili-zearam-se os protocolos clínicos convencionais do hos-pital de origem. As amostras de urina dos indivíduosde controle foram coletadas da mesma maneira, a partirde pessoas saudáveis do hospital.

A análise das amostras de urina de pacien-tes com fibrose e provenientes de pessoas saudáveis foirealizada utilizando-se eletroforese bidimensional eespectrofotometria de massa. Para fazer isto, analisa-ram-se aproximadamente 50 ml de amostra proveniente depacientes e indivíduos de controle. As amostras foramconcentradas utilizando-se concentradores Amicon Ultra(Millipore) com dimensão de corte de 5000 Da e a urinafoi re-suspensa em um amortecedor de Iise que continha7M Uréia, 2M tiouréia, (4% vol/vol) de 3-[colamidopropil) dimetil amônio]-1-propanossulfonato,1% (col/col) DRR e 0,5% Biolytes 3/10. A quantidade deproteína foi determinada utilizando-se o kit de análiseBradford (Bio-rad), com a albumina diluída não amorte-cedor de Iise como padrão. Eletroforese bidimensional(2DE) foi realizada utilizando-se 100 μς de proteínatotal. A primeira dimensão foi relizada em uma ProteanIEF Cell proveniente da BioRad, utilizando-se tiras de17 cm IPG provenientes da BioRad e foi reidratada ati-vamente, isto é, aplicando-se uma tensão de 50V sob umatemperatura de 20°C, durante 12 horas. Os géis opera-ram a 60.000 V h., utilizando-se uma rampa de tensãodesignada pelo fabricante. As tiras foram equilibradasem 5OmM TRIS, pH7, 6M de uréia, 30% de glicerol, 2% SDSe resíduos de azul de bromofenol. Realizou-se um pro-cesso de redução utilizando-se 2% DTT e outro processode alquilação utilizando-se iodoacetamida 2%. As tirasforam carregadas diretamente em géis de poliacrilamida12,5% (18cm χ 20cm χ lmm) e foram vedadas com agarose1%. A segunda dimensão na SDS-PAGE foi realizada du-rante 15 horas. Os géis foram coloridos utilizando-semordente de fluorescência Spyro-Ruby proveniente da Bi-oRad. As imagens foram digitalizadas utilizando-se Mo-lecular Imager FX proveniente da BioRad e foram anali-sadas utilizando-se o programa PGQUEST 7.1 provenienteda BioRad. Desta maneira, obteve-se uma resolução me-dia de 300 proteínas, e realizou-se uma comparação uti-lizando-se PDQUEST, em que aumentos ou diminuições depelo menos duas vezes, foram aceitos como diferenças.

Com este critério, detectaram-se 4 bandas de proteínasem amostras de urina a partir de pacientes com degene-ração fibrótica, cujo aumento ou aparência foi sistemá-tica em todos os ensaios.

As amostras selecionadas foram analisadasutilizando-se a digestão tríptica das diferentes prote-ínas, seguida por nanocromatografia líquida acoplada aum espectrômetro de massa Q TOF Micro utilizando-se umafonte de ionização de eletro-spray (ESI/MS/MS) seguin-do-se o protocolo descrito adiante. A digestão em gelfoi realizada com 6 ng/μΐ de tripsina re-suspensa em 50mM de bicarbonato de amônio a 37 0C durante a noite. Osprodutos dos peptídios trípticos foram extraídos comácido fórmico 1% e acetonitrilo 2%. Finalmente, a se-paração dos peptídeos trípticos foi realizada em colunacapilar Nano EaseTM Atlantis, C18, 3 pm, 75 pm χ 10 cmde fase inversa, proveniente da Waters, equilibrada comacetonitrilo 5% e ácido fórmico 0,2%. Depois da inje-ção de 6 μΐ de amostra, a coluna foi lavada durante 5minutos com o mesmo amortecedor e os peptídeos forameluídos utilizando-se um gradiente linear de 5-50% ace-tonitrilo em 30 minutos sob um fluxo constante de 0,2μΐ/min. A coluna foi acoplada em linha a um Q-TOF Mi-cro proveniente da Waters, utilizando-se uma fonte deionização do tipo nano-spray, PicoTip proveniente daWaters. A temperatura capilar foi de 80°C e a tensãode spray foi de 1,8-2-2 kV. Os espectros de MS/MS fo-ram coletados automaticamente na dependência do dado.Os três ions mais intensos foram fragmentados sucessi-vamente por dissociação induzida por colisão (CID) uti-lizando-se uma janela de isolamento 2.5 e uma energiade colisão relativa de 35%. 0 processamento de dadosfoi executado utilizando-se os programas de análiseMassLynx 4.0 e ProteinLynx Global Server 2 provenienteda Waters.

As análises das amostras de urina utili-zando-se eletroforese bidimensional permitiram a sepa-ração de cerca de 700 proteínas diferentes, como podeser observado na imagem de gel ilustrada na Figura 1.Cada um dos três géis das amostras de pacientes foicomparado com aqueles dos indivíduos de controle e qua-tro bandas foram selecionadas para sua análise subse-qüente. Quatro delas apenas apareceram nas amostrasdos pacientes e uma delas é claramente aumentada nessesindivíduos. As bandas dos géis produzidas a partir dos11 pacientes e 6 indivíduos de controle foram suprimi-das e digeridas com tripsina, utilizando-se o protocoloindicado na seção anterior. As digestões trípticas fo-ram então analisadas utilizando-se espectrometria demassa MALDI-TOF, impressão digital de peptídio e espec-trometria de massa LC-ESI-QUAD-TOF, para ser capaz deestudar as ditas bandas. As ditas proteínas foram i-dentificadas como uromodulina, MAC2BP, AGPl e catepsinaA, marcadas como 1, 2, 3 e 4 respectivamente na Figura1. A análise da presença ou ausência destas proteínasfoi analisada tanto nos géis bidimensionais dos pacien-tes de controle, guanto naqueles gue foram obtidos apartir dos pacientes e obteve-se uma distribuição guese encontra ilustrada na Tabela 1. Tal como pode serobservado nesta tabela, pelo menos 2 dos marcadores a-parecem em todos os estudos dos pacientes com degenera-ção fibróide, enguanto que os mesmos não são observadosnos indivíduos de controle.Tabela 1. Comparação do aumento (para uromodulina) oupresença (para AGP1, catepsina A e MAC2BP) das diferen-tes proteínas. Análise por eletroforese bidimensional,análise de imagem e espectrofotometria de massa MALDI-TOF ou ESI/MS/MS.

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Claims (23)

1. - Uso de uma combinação de pelo menosdois marcadores selecionados a partir de uromodulina,MAC2BP, AGPl e catepsina A, caracterizado por se desti-nar à detecção in vitro de alterações fibróticas.

2. - Uso de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de compreender:a) obtenção de uma amostra biológica; eb) medição da concentração dos ditos mar-cadores na amostra.

3. - Uso de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que a dita amostra biológicaé selecionada a partir de sangue, plasma, soro e urina.

4. - Uso de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que adita amostra biológica provém de um animal mamífero.

5. - Uso de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que adita amostra biológica provém de um homem ou de uma mulher.

6. - Uso de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de com-preender ainda comparar os níveis de marcadores com umvalor de referência.

7. - Uso de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que níveis de pelo menos du-as vezes os valores de referência são ligados à presen-ça de uma alteração fibrótica.

8. - Uso de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que adita alteração fibrótica é selecionada a partir de fi-brose pulmonar, medular, hepática, pancreática, renal,cardíaca ou de vários órgãos.

9. - Uso de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que adita alteração fibrótica é uma fibrose hepática.

10. - Uso de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que adita concentração de marcador é determinada por um mé-todo selecionado a partir de um método colorimétrico,espectrofotométrico, NMR, cromatográfico, eletroforéti-co, um imunoensaio ou uma combinação dos ditos métodos.

11. - Uso de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de quecompreender uma combinação de 3 dos marcadores especi-ficados na dita reivindicação 1.

12. - Uso de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato decompreender a combinação dos 4 marcadores deuromodulina, MAC2BP, AGPl e catepsina A.

13. - Uso de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 a 12, caracterizado pelo fato de que aconcentração dos ditos marcadores é medida utilizando-se sondas específicas para pelo menos dois dosmarcadores.

14. - Uso de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dassondas é um anticorpo específico.

15. - Kit para determinar os níveis de pelomenos dois marcadores selecionados a partir deuromodulina, MAC2BP, AGPl e catepsina A, caracterizadopelo fato de compreender sondas específicas paraqualquer combinação de 2, 3 ou 4 dos ditos marcadores.

16. - Kit de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dassondas é um anticorpo específico.

17. - Kit de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato de serum kit para imunoensaio.

18. - Kit de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de serum kit para imunocromatografia.

19. - Kit de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de serum kit para ELISA.

20. - Kit de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15 a 19, caracterizado pelo fato decompreender ainda outros componentes selecionados apartir de anticorpos secundários, isótopos,amortecedores, diluentes, padrões, controles decalibragem, cartuchos de teste, frascos, tirascromatográficas, micro-plaquetas e instruções de uso.

21. - Kit de acordo com qualquer uma dasreivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato decompreender acondicionamento com rótulo com a indicaçãopara a avaliação da presença e seriedade da fibrose ouuma indicação equivalente.

22. - Kit de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de incluir indicação para aavaliação da presença e seriedade de fibrose hepática.

23. - Kit de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o rótulo tambémcompreende a indicação para a determinação na urina.