WO2007003670A1

WO2007003670A1 - Marcadores de fibrosis

Info

Publication number: WO2007003670A1
Application number: PCT/ES2006/000367
Authority: WO
Inventors: Fernando Corrales Izquierdo; Laura Sesma Aguirre; Joaquín FERNANDEZ IRIGOYEN; Jesús PRIETO VALTUEÑA; Matías AVILA ZARAGOZA
Original assignee: Proyecto De Biomedicina Cima, S.L.
Priority date: 2005-07-01
Filing date: 2006-06-22
Publication date: 2007-01-11
Also published as: AU2006264946A1; WO2007003670A8; JP2009500597A; EP1918715A1; ES2288358B1; CA2613833A1; MX2008000059A; CN101356439A; ES2288358A1; US20090117591A1; BRPI0613169A2; RU2008103370A

Abstract

La presente invención se refiere al uso de una combinación de al menos dos marcadores seleccionados entre Uromodulina, MAC2BP, AGPl, y Catepsina A, para la detección in vitro de alteraciones fibróticas. Además, la presente invención se refiere a un kit para determinar los niveles de dichos marcadores en una muestra biológica.

Description

MARCADORES DE FIBROSIS

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso de marcadores biológicos para la identificación de fibrosis.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN

Las alteraciones o enfermedades fibróticas constituyen una de las principales causas de morbi- mortalidad y su carácter crónico repercute sobre los propios pacientes y la sociedad con considerables cargas económicas. La fibrosis progresiva de órganos y tejidos, incluyendo el hígado, pulmones, ríñones, corazón, vasos sanguíneos y la piel, comprenden una constelación de alteraciones mecanisticamente relacionadas. Cada una de es-tas alteraciones tienen en común una acumulación excesiva y alterada de matriz extracelular, principalmente colágeno, que conlleva una desorganización de la arquitectura normal del tejido y, consecuentemente una pérdida funcional.

En particular, la fibrosis hepática es la principal complicación del daño hepático crónico y su progresión conduce a largo plazo a la cirrosis. Las causas más frecuentes de fibrosis hepática son la ingesta de alcohol, las infecciones por virus de hepatitis C y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) . Por otra parte, contribuye de un modo importante al desarrollo de insuficiencia hepática e hipertensión portal.

En consecuencia, la valoración de la presencia y severidad de la fibrosis hepática es un parámetro importante en la práctica clínica, y constituye un indicador valioso del riesgo de progresión a la cirrosis. Por otra parte, la disponibilidad de métodos apropiados para la valoración de la presencia y severidad de fibrosis constituye una herramienta determinante en la investigación de nuevas moléculas potencialmente anti- fibrosantes .

La biopsia de hígado y el posterior examen histológico es todavía hoy la técnica de referencia para evaluar la fibrosis hepática. Sin embargo, es una técnica cara, de aplicación limitada, invasiva y dolorosa, que además puede ocasionar complicaciones para la salud del individuo. La precisión y reproducibilidad de este método es seriamente cuestionada, por los problemas inherentes a la toma de muestra y a las variaciones intra- e interobservador.

Se han propuesto diversas aproximaciones para medir la progresión, como análisis de rutina químico y hematológico, exámenes fisiológicos, marcadores séricos de fibrosis.

Se ha sugerido por ejemplo la determinación de niveles séricos de proteínas de la matriz extracelular o de sus productos de sintesis-degradación (US-5.316914, EP-0283779) . US-6.631.330 propone un método mediante modelos de regresión logística binaria basados en una serie de parámetros (marcadores) clínicos serológicos. Con este esquema se ha desarrollado el Fibrotest (Biopredictive, Paris, Francia), un índice de fibrosis que combina la evaluación de cinco marcadores séricos indirectos de fibrosis. Este test, aplicado en combinación con FibroScan (Echosens, Paris, Francia) (Sandrin L. et al. 2003, "Transient elastography: a new noninvasive method for assessment of hepatic fibrosis"; Ultrasound Med. Biol. 29: 1705-1713), parece funcionar adecuadamente para la evaluación de la progresión de la fibrosis en la infección por el virus de la hepatitis C.

En WO2004/063753 se propone un método de valoración basado en el análisis de perfiles de proteina N-glicanos séricos . Sin embargo, son todavía necesarios nuevos métodos simples, fácilmente realizables y no invasivos que permitan valorar apropiadamente el grado de fibrosis hepática, particularmente en los estadios menos graves de fibrosis . Existen evidencias de que muchos procesos patológicos se asocian con cambios cuantitativos y funcionales de los constituyentes moleculares de los fluidos corporales. Siendo la orina un fluido corporal fácilmente disponible, seria muy deseable y ventajoso el desarrollo de un método de valoración de la fibrosis hepática basado en la determinación y cuantificación de analitos indicadores de fibrosis, por ejemplo proteínas, detectables en muestras de orina.

El objeto de la presente invención es por tanto el desarrollo de un método de valoración de la presencia y severidad de fibrosis hepática, y también de otros órganos vitales, mediante la determinación y cuantificación de distintos analitos indicadores detectables en una muestra biológica, preferentemente orina. Para ello se ha realizado un análisis de los patrones diferenciales de expresión de proteínas (proteoma) en orina de individuos sanos e individuos con fibrosis hepática, que ha permitido seleccionar diversas proteinas candidatas como biomarcadores .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Identificación del incremento y aparición de proteinas Uromodulina, MAC2BP, AGP-I y Catepsina A en muestras de orina de pacientes con fibrosis hepática. Se muestran geles representativos del análisis de los pacientes y controles. Las bandas diferenciales están indicadas como 1: Uromodulina, 2: MAC2BP, 3: AGPl y 4: Catepsina A.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto la presente invención se refiere al uso de una combinación de al menos dos marcadores seleccionados entre Uromodulina, MAC2BP, AGPl y Catepsina A, para la detección in vítro de alteraciones fibróticas. Este uso se caracteriza porque comprende obtener una muestra biológica y medir la concentración de dichos marcadores en la muestra.

Por otro lado, la invención se refiere a un procedimiento para valorar in vitro la presencia (o ausencia) y severidad (estadio o grado de desarrollo) de una alteración fibrótica. Dicho procedimiento se caracteriza porque comprende: a) obtener una muestra biológica/ b) determinar en dicha muestra los niveles de al menos dos marcadores seleccionados entre: - Uromodulina, - MAC2BP, - AGPl, y

Catepsina A.

El término "marcador" se refiere ^' a una molécula o compuesto de la que se valora su cantidad. En el método de la invención, los cuatro- marcadores cuyos niveles se determinan son proteínas . La presencia-ausencia o incremento-disminución de dichos marcadores en la muestra biológica es indicativa de la presencia o severidad de una alteración fibrótica.

El término "Uromodulina" se refiere a la proteina codificada por el gen identificado en el hombre por el simbolo UMOD (LOCUSLINK: 7369 Homo sapiens; UNIGENE:

Hs.164470), en cualquiera de sus isoformas y en cualquier especie animal. Dicha proteina se conoce también como Uromucoide o Glicoproteina de Tamm-Horsfall (THP) . En una realización particular la proteína es la proteína humana (Swiss-Prot Accession number P07911, Last update : Reléase 47 10-May-2005) . El término "MAC2BP" se refiere a la proteína codificada por el gen identificado en el hombre por el símbolo LGALS3BP (LOCUSLINK: 3959 Homo sapiens; UNIGENE: Hs.514535), en cualquiera de sus isoformas y en cualquier especie. Dicha proteína se conoce también como "Galectin- 3 binding protein", "Mac-2 binding protein" (MAC2BP) o "Tumor-associated antigen 9OK". En una realización particular la proteína es la proteína humana (Swiss-Prot Accession number Q08380, Last update: Reléase 47 10-May- 2005) . Esta es una glicoproteina que promueve la adhesión celular y puede estimular las defensas frente a virus y células tumorales.

El término "AGPl" se refiere a la proteina codificada por el gen identificado en el hombre por el símbolo ORMl (LOCUSLINK: 5004 Homo sapiens; UNIGENE: Hs.494894), en cualquiera de sus isoformas y en cualquier especie. Dicha proteina se conoce también como "Alpha-1- acid glycoprotein 1" (AGPl), u Orosomucoide 1 (OMDl). En una realización particular la proteina es la proteina humana (Swiss-Prot Accession number P02763, Last update : Reléase 47 10-May-2005) . Se ha descrito su intervención en la modulación de la actividad del sistema inmune durante la fase de reacción aguda. Sufre alteraciones en su patrón de glicosilación en pacientes con cirrosis y se ha sugerido también una función promotora de la fibrosis hepática. Se ha propuesto un procedimiento de diagnóstico de enfermedades hepáticas (hepatitis, cirrosis, hepatocarcinoma) mediante un anticuerpo especifico para esta proteina (WO2004058823) .

La expresión "Catepsina A" se refiere a una proteina codificada por el gen identificado en el hombre por el símbolo PPGB (LOCUSLINK: 5476 Homo sapiens; UNIGENE: Hs.517076), en cualquiera de sus isoformas y en cualquier especie. Dicha proteina se conoce también como "Lysosomal protective protein precursor", Carboxipeptidasa C, "Protective protein for beta-galactosidase" o por el código E. C. 3.4.16.5. En una realización particular la proteina es la proteina humana (Swiss-Prot Accession number P10619, Last update: Reléase 47 10-May-2005) . La muestra biológica donde se mide la concentración de los marcadores puede ser un homogeneizado tisular, un Usado celular o un fluido biológico, por ejemplo sangre, plasma, suero, orina, saliva, liquido cefalorraquídeo, lágrima, liquido amniótico y leche, etc. En una realización particular dicha muestra biológica es sangre, plasma, suero u orina. En una realización preferente dicha muestra biológica es una muestra de orina.

La preparación de la muestra biológica para su valoración según la presente invención se realiza por los procedimientos habituales y conocidos por los técnicos del laboratorio de análisis, dependiendo fundamentalmente del tipo de muestra biológica y la configuración del método de la invención escogidos para la valoración. En las realizaciones más sencillas, por ejemplo una valoración en muestra de orina mediante tira inmunocromatográfica ("immunostrip" o una tira "dipstrip") , la muestra se aplica directamente sin necesidad de preparación. Cuando es necesario realizar diferentes ensayos, para determinación de diferentes marcadores o para confirmación, la valoración puede realizarse en alícuotas de la misma muestra o de diferentes muestras tomadas del mismo sujeto.

En la presente invención, la muestra biológica puede proceder de cualquier animal, particularmente cualquier animal mamífero, como por ejemplo un animal de investigación (roedor, un conejo, un primate, un perro), una mascota o un animal doméstico (un perro, un gato, un caballo, un animal vacuno, bovino, porcino) o un animal salvaje. En una realización particular de la invención dicha muestra biológica procede de un hombre o una mujer. La determinación de los niveles de un compuesto según la presente invención, significa que se hace una valoración de la cantidad (generalmente expresada como concentración) de dicho compuesto en la muestra. Dicha valoración puede ser simplemente una determinación de presencia-ausencia, una valoración semicuantitativa, o más preferentemente una valoración cuantitativa.

Una realización particular de la invención comprende además comparar los niveles de los marcadores determinados frente a un estándar o valor de referencia. En una realización concreta de la invención, los niveles superiores a 1,5 veces los niveles estándar se relacionan con la presencia de alteraciones fibróticas. En una realización preferente los niveles de al menos dos veces el valor de referencia se relacionan con la presencia de una alteración fibrótica.

Dado que los mecanismos moleculares implicados en la fibrosis son, al menos en parte, comunes, independientemente del tejido en el que se desarrolle, el órgano afectado por la alteración fibrótica a valorar puede ser cualquier órgano. Por ejemplo, la alteración fibrótica a valorar puede ser una fibrosis pulmonar, medular, hepática, pancreática, renal, cardiaca o multiorgánica . En una realización preferente, el uso combinado de los marcadores de la invención es para valoración de la presencia y severidad de fibrosis hepática.

En una realización particular la invención comprende el uso combinado de tres marcadores seleccionados entre

Uromodulina, MΑC2BP, AGPl y Catepsina A. Preferentemente se determinan los niveles de los cuatro marcadores especificados .

Opcionalmente, la presente invención puede incluir el uso de otros marcadores adicionales. Dichos marcadores adicionales pueden ser proteínas o cualquier otro tipo de compuesto (glicoproteinas, péptidos, moléculas pequeñas, polisacáridos, ácidos nucleicos, anticuerpos, etc) .

La determinación de los niveles de los marcadores objeto de la presente invención puede realizarse por cualquier procedimiento analítico conocido, cuya elección dependerá fundamentalmente de los requerimientos y necesidades que primen sobre la valoración que se quiera obtener: rapidez-sencillez, sensibilidad y especificidad, valor predictivo, etc.

Según distintas configuraciones de la invención, la determinación puede realizarse entre otros por procedimientos colorimétricos, espectrofotométricos, fluorescencia, quimioluminiscencia, mediante radioisótopos, espectrométricos, RMN, cromatográficos, electroforéticos, químicos, inmunoensayos (basados en una reacción antigeno-anticuerpo) o mediante una combinación de dichos métodos .

En una realización particular, la determinación se realiza por espectrometría de masas, por ejemplo espectrometría de masas en tándem asociada con cromatografía liquida (LC-MS) o MALDI-TOF-MS {matrix- assisted láser desorption/ionization mass spectrometry time-of flight MS) . En una realización preferente de la invención la determinación se realiza mediante un inmunoensayo . Son inmunoensayos aplicables en el método de la invención, entre otros: ensayos homogéneos, ensayos heterogéneos, enzima-inmunoensayos (EIA, ELISA) , ensayos competitivos, ensayos inmunométricos (sandwich) , ensayos turbidimétricos, ensayos nefelométricos y sus combinaciones. Los principios y protocolos de aplicación de estos inmunoensayos son bien conocidos y están extensamente descritos en manuales como "The immunoassay handbook" editado por David WiId, 2^a Edición 2001, Nature Publishing Group, el cual se incluye como referencia.

En una realización particular dicho inmunoensayo es un ELISA o un ensayo de inmunocromatografia en tira ("dipstrip", "immunochromatographic strip" o "immunostrip") . En otra realización particular dicho inmunoensayo se realiza en un chip de anticuerpos.

En el documento de patente US5.753.517 puede encontrarse información detallada, que no debe tomarse como limitativa de la presente invención, sobre posibles configuraciones aplicables y modos de realización de un ensayo inmunocromatografico en tira cuantitativo, tanto para ensayos tipo sandwich como para ensayos de inhibición. El ensayo inmunocromatografico puede adoptar también otras muchas configuraciones, como las que se describen en el documento de patente USβ.316.205, algunas de las cuales permiten analizar varios marcadores distintos en un mismo ensayo y sobre una misma muestra.

Para la valoración final de la presencia (o ausencia) o severidad de la alteración fibrótica, preferentemente fibrosis hepática, en la muestra biológica, se comparan los niveles de los marcadores determinados en la muestra problema (muestra biológica del sujeto cuya fibrosis se quiere valorar) con unos valores de referencia preestablecidos. Cuando es suficiente con una valoración cualitativa (positivo- negativo) o semicuantitativa, basta con establecer un valor de corte para cada compuesto medido. Cuando se requiera una valoración cuantitativa con una sensibilidad y especificidad optimizadas, los valores o Índices de referencia pueden establecerse por ejemplo mediante un análisis de regresión logística del valor discriminativo de cada uno de los marcadores medidos, y posterior construcción de una función logística que relaciona las medidas obtenidas para cada compuesto. La calidad de la función logística se analiza mediante curvas ROC. Los procedimientos para construcción de funciones logísticas son bien conocidos y se han utilizado también en la valoración de alteraciones fibróticas, entre ellas la fibrosis hepática, mediante marcadores serológicos . Estos procedimientos se describen por ejemplo en el documento USβ.631.330, que queda incorporado por referencia.

En una realización preferida de la invención, se usan los marcadores en una valoración de la presencia y severidad de la fibrosis hepática sobre muestras de orina, y se realiza mediante determinación de los niveles de al menos dos de los marcadores seleccionados entre Uromodulina, MAC2BP, AGPl y Catepsina A. En una realización particular las mediciones obtenidas para dichos marcadores se relacionan mediante una función logística. El objeto de la invención resulta de utilidad por ejemplo en un procedimiento para selección y screening de fármacos con potencial actividad antifibrosante . Este procedimiento comprende a) administrar al sujeto (preferentemente un animal) el fármaco a estudiar; b) en diferentes momentos del estudio (antes, durante y/o después de la administración) tomar muestras biológicas del animal y determinar los niveles de los marcadores conforme a la presente invención; y c) comparar las determinaciones realizadas sobre las muestras obtenidas en las distintas fases del tratamiento y frente a muestras de animales control, por ejemplo no tratados.

En otra aplicación, la invención permite controlar la progresión del estado fibrótico de un órgano, preferentemente el hígado, de un animal o un paciente, para lo que el animal o el paciente es sometido a distintas tomas de muestras y valoración de los marcadores definidos. En una aplicación más particular, la invención permite valorar en el tiempo la respuesta a un tratamiento antifibrosante.

En otro aspecto la invención se caracteriza porque la concentración de dichos marcadores se mide mediante sondas específicas para al menos dos de los siguientes marcadores: Uromodulina, MAC2BP, AGPl o Catepsina A.

El término "sonda" se refiere a una molécula que reacciona específicamente con uno de los cuatro marcadores señalados (Uromodulina, MAC2BP, AGPl o Catepsina A) , y cuya reacción puede detectarse, directa o indirectamente, mediante un marcador-trazador de la intensidad de la reacción, que puede ser un producto o marcador coloreado, fluorescente, luminiscente o cualquier otro marcador detectable. En una realización particular la sonda es un ligando especifico de Uromodulina, MAC2BP, AGPl o Catepsina A, por ejemplo una lectina o un anticuerpo (anticuerpos) . En una realización preferente, dicha sonda es un anticuerpo especifico, policlonal o monoclonal.

En otro aspecto adicional la invención se refiere a un kit para determinar los niveles de al menos dos de los marcadores seleccionados entre Uromodulina, MAC2BP, AGPl y Catepsina A, caracterizado porque comprende sondas especificas para una combinación cualquiera de 2, 3 ó 4 de dichos marcadores. En una realización concreta, el kit contiene dos sondas especificas para dos de dichos marcadores (por ejemplo una sonda para Catepsina A y otra para Uromodulina; o una para MAC2BP, otra para AGPl y otra para Uromodulina; etc) . En otra realización el kit contiene una combinación cualquiera de 3 sondas para 3 de los marcadores citados. En otra realización el kit contiene al menos 4 sondas, una para cada uno de los 4 marcadores Uromodulina, MAC2BP, AGPl y Catepsina A. En una realización preferente al menos una de las sondas es un anticuerpo especifico para el marcador que se desea detectar y cuantificar. En otra realización particular todas las sondas del kit son anticuerpos específicos.

La sonda o sondas del kit de la invención pueden estar contenidas en una misma composición o en composiciones separadas, adheridas a un sustrato sólido (por ejemplo en una microplaca para ELISA o en una tira para inmunocromatografia) o en diversas composiciones- sustratos dentro del mismo kit. En una realización concreta el kit es un kit para inmunoensayo. En una realización preferente el kit de la invención es un kit para ELISA. En otra realización el kit de la invención es un kit para inmunocromatografia.

En una realización preferente el kit de la invención es un kit para inmunocromatografia que comprende al menos un anticuerpo (la sonda) especifico frente a uno de los cuatro marcadores del método de la invención y al menos una tira o membrana inmunocromatografica. En una realización particular los anticuerpos específicos frente a dicho marcador, o una parte^' de ellos, pueden estar unidos a partículas marcadas, recubriéndolas. En una realización particular dichos anticuerpos específicos están embebidos en la tira o membrana cromatográfica. Adicionalmente, a la tira cromatográfica pueden adherirse otros materiales o reactivos, como anticuerpos para control interno, unidos o no a partículas marcadas. En una realización particular el kit de la invención es un kit para inmunocromatografia que contiene: dos ó más sondas, anticuerpos preferentemente, especificas para al menos dos ó más de los marcadores del método de la invención; dos ó más tiras inmunocromatograficas, especificas para un marcador concreto en función del anticuerpo especifico que se adhiera a ella; asi como otros reactivos y materiales necesarios para detectar la reacción entre el analito y el anticuerpo especifico y en general para completar un ensayo inmunocromatografico . El kit de la invención puede contener otros materiales y reactivos opcionales, por ejemplo anticuerpos secundarios , tampones, diluyentes, colorantes o trazadores (fluorescentes, luminiscentes, etc) , estándares, controles de calibración, cartuchos para ensayo, viales, botellas, tubos, agujas, tiras cromatográficas, microplacas e instrucciones de uso.

En una realización particular el kit de la invención comprende un embalaje con una etiqueta con la indicación "para valoración de la presencia y severidad de fibrosis", y más preferentemente "para valoración de la presencia y severidad de fibrosis hepática". En una realización particular incluye la indicación "para determinación en orina". Dichas indicaciones pueden ser sustituidas por otras indicaciones consideradas equivalentes en la medida que dichas indicaciones equivalentes signifiquen implícitamente la aplicación o utilización del kit en un método que incluya, bien como paso intermedio o como resultado final, la valoración de la presencia y/o severidad de fibrosis, preferentemente hepática y/o mediante determinación en orina.

MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

El siguiente ejemplo pretende ilustrar, en modo alguno limitativo, la realización de la invención objeto de la presente solicitud de patente.

EJEMPLO

En este estudio se compararon muestras de orina obtenidas de 11 pacientes con fibrosis hepática de distinto grado y origen, con muestras de orina obtenidas de 6 individuos control. La determinación clinica de la fibrosis hepática se realizó mediante el estudio anatomopatológico de muestras de biopsia hepática recogidas el mismo dia en que se obtuvo la orina. Se utilizó para ello como base el Índice o "score" de fibrosis que se corresponde con el cuarto aspecto valorado en el índice de KNODELL (Knodell RG, Ishak KG, Black WC, Chen TS, Craig R, Kaplowitz N et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis. Hepatology 1981 Sep-Oct; 1:431- 435) .

Para la recogida de las muestras de orina se siguieron los protocolos clínicos convencionales del ^• hospital de origen. Las muestras de orina de los individuos control se recogieron del mismo modo, entre personas sanas del entorno del centro hospitalario.

El análisis de las muestras de orina de pacientes con fibrosis y de los individuos control, se llevó a cabo mediante electroforesis bidimensional y espectrometría de masas. Para ello, se analizaron unos 50 mi de muestra de pacientes y de individuos control. Se concentraron las muestras utilizando concentradores Amicon Ultra (Millipore) con un tamaño de corte de 5000 Da y se resuspendió la orina en un tampón de lisis que contenía Urea 7M, tiourea 2M, 4% (vol/vol) de 3-[(3- colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato, 1% (vol/vol) DTT y 0.5% Biolitos 3/10. Se determinó la cantidad de proteína en cada caso utilizando el kit de análisis de Bradford (Bio-Rad) , con la albúmina diluida en el tampón de lisis como estándar. Se realizó la electroforesis bidimensional (2DE) , utilizando lOOμg de proteína total. La primera dimensión se llevó a cabo en una Protean IEF CeIl de BioRad, utilizando tiras IPG de 17 cm de BioRad y la rehidratación se llevará a cabo de manera activa, es decir aplicando un voltaje de 5OV y a una temperatura de 20⁰C, durante 12h. Los geles se corrieron a 60.000 V h, usando una rampa de voltaje diseñada por el fabricante. Se equilibraron las tiras en 5OmM TRIS pH 7.5, 6M de urea, 30% de glicerol, 2% SDS y trazas de azul de bromofenol. Se realizó un proceso de reducción añadiendo DTT al 2% y otro proceso de alquilación utilizando iodoacetamida al 2%. Las tiras se cargaron directamente sobre geles de poliacrilamida al 12.5% (18cm X 20cm X lmm) y se sellaron con agarosa al 1%. La segunda dimensión en geles SDS-PAGE fue llevada a cabo durante 15 h. Los geles fueron teñidos utilizando tinción de fluorescencia Sypro-Ruby de BioRad. Las imágenes se digitalizaron utilizando Molecular Imager FX de BioRad y se analizaron usando el programa de PDQUEST 7.1 de BioRad. De este modo, se obtuvo una resolución promedio de 300 proteínas, y se realizó una comparación diferencial mediante PDQUEST, en la que se aceptaban como diferencias, los incrementos o disminuciones de un mínimo de dos veces. Con este criterio se obtuvieron cuatro bandas proteicas pertenecientes a las muestras de orina de los pacientes fibróticos cuyo incremento o aparición resultaba consistente en todos los ensayos.

Las muestras seleccionadas fueron analizadas mediante la digestión tríptica de las distintas proteínas, seguida de nanocromatografía líquida acoplada a un espectrómetro de masas Q TOF Micro mediante una fuente de ionización electroespray (ESI/MS/MS) siguiendo el protocolo que se describe a continuación. Se llevó a cabo la digestión en gel, con 6 ng/μl de tripsina resuspendida en 50 mM de bicarbonato amónico a 37⁰C durante toda la noche. Los péptidos obtenidos se extrajeron con ácido fórmico al 1% y acetonitrilo al 2%. Finalmente, se llevó a cabo la separación en fase reversa de los digeridos trípticos utilizando una columna capilar Atlantis, Cis, 3μm, 75 μm x 10 cm Nano Ease™ de Waters, equilibrada en acetonitrilo 5% y ácido fórmico 0.2%. Después de la inyección de 6 μl de muestra, la columna fue lavada durante 5 min con el mismo tampón y los péptidos se eluyeron utilizando un gradiente linear de 5- 50% de acetonitrilo en 30 min con un flujo constante de 0.2 μl/min. La columna se encuentra acoplada online con un Q-TOF Micro de Waters, por medio de una fuente de ionización tipo nano-spray PicoTip de Waters. La temperatura del capilar fue de 80⁰C y el voltaje del spray fue 1.8-2.2 kV. Los espectros de masas/masas fueron recogidos de modo automático dependiente de dato. Los tres iones más intensos de cada espectro fueron fragmentados secuencialmente por disociación inducida por colisión (CID) usando una ventana de aislamiento de 2.5 y una energía relativa de colisión del 35%. El procesamiento de los datos se llevó a cabo utilizando los programas de análisis MassLynx 4.0 y ProteinLynx Global Server 2 de Waters .

El análisis de las muestras de orina mediante electroforesis bidimensional, permitió la separación de alrededor de 700 proteínas diferentes, como se puede ver en la imagen del gel mostrada en la Figura 1. Se comparó cada uno de los geles de las muestras de pacientes con las de individuos control y se seleccionaron cuatro bandas para su posterior análisis. Cuatro de ellas únicamente aparecen en las muestras de los pacientes y una de ellas está claramente incrementada en esos individuos, como se muestra en la Figura 1. Se cortaron las bandas seleccionadas de los geles obtenidos de los 11 pacientes y de los 6 individuos control y se procedió a su digestión mediante tripsina, usando el protocolo indicado en el apartado anterior. Posteriormente se analizaron los digeridos trípticos mediante espectrometría de masas de MALDI-TOF, huella peptidica y espectrometría de masas LC-ESI-QUAD-TOF, para poder estudiar las bandas anteriormente mencionadas. Dichas proteínas se identificaron como MAC2BP, Uromodulina, AGPl y Catepsina A, marcadas como 1, 2, 3 y 4 respectivamente en la figura 1. Se analizó la presencia o ausencia de estas proteínas tanto en los geles bidimensionales de los individuos control, como en los obtenidos de los pacientes y se obtuvo una distribución que se muestra en la Tabla 1. Como puede observarse en esta Tabla, al menos 3 de los marcadores aparecen en todos los pacientes fibróticos estudiados, mientras que no se observan en los individuos control.

Tabla 1. Comparación del incremento (para Uromodulina) o presencia (para AGPl, Catepsina A y MAC2BP) de las diferentes proteínas . Análisis mediante electroforesis bidimensional , análisis de imagen y espectrometría de masas de MALDI-TOF o ESI/MS/MS.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de una combinación de al menos dos marcadores seleccionados entre Uromodulina, MAC2BP, AGPl, y Catepsina A, para la detección in vitro de alteraciones fibróticas .

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende : a) obtener una muestra biológica, y b) medir la concentración de dichos marcadores en la muestra.

3. Uso según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha muestra biológica está seleccionada entre sangre, plasma-, suero y orina.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó

3, caracterizado porque dicha muestra biológica procede de un animal mamífero.

5. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a

4, caracterizado porque dicha muestra biológica procede de un hombre o una mujer.

6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

5, caracterizado porque además comprende comparar los niveles de los marcadores con un valor de referencia.

7. Uso según la reivindicación 6, caracterizado porque niveles de al menos dos veces el valor de referencia se relacionan con la presencia de una alteración fibrótica.

8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque dicha alteración fibrótica está seleccionada entre una fibrosis pulmonar, medular, hepática, pancreática, renal, cardiaca o multiorgánica .

9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque dicha alteración fibrótica es una fibrosis hepática.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dicha concentración de marcadores se determina mediante un método seleccionado entre un método colorimétrico, espectrométrico, RMN, cromatográfico, electroforético, un inmunoensayo o una combinación de dichos métodos .

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

10, caracterizado porque comprende la combinación de 3 de los marcadores especificados en dicha reivindicación 1.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

11, caracterizado porque comprende la combinación de los 4 marcadores Uromodulina, MAC2BP, AGPl y Catepsina A.

13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, caracterizado porque la concentración de dichos marcadores se mide mediante sondas especificas para al menos dos de los marcadores.

14. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque al menos una de las sondas es un anticuerpo especifico .

15. Un kit para determinar los niveles de al menos dos marcadores seleccionados entre Uromodulina, MAC2BP, AGPl, y Catepsina A, caracterizado porque comprende sondas especificas para una combinación cualquiera de 2, 3 ó 4 de dichos marcadores.

16. Un kit según la reivindicación 15, caracterizado porque al menos una de las sondas es un anticuerpo especifico .

17. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, caracterizado porque es un kit para inmunoensayo .

18. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque es un kit para inmunocromatografía. _r

19. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque es un kit para ELISA.

20. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque comprende además otros componentes seleccionados entre anticuerpos secundarios, trazadores, tampones, diluyentes, estándares, controles de calibración, cartuchos para ensayo, viales, tiras cromatográficas, microplacas e instrucciones de uso.

21. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, caracterizado porque comprende un embalaje con una etiqueta con la indicación para valoración de la presencia y severidad de fibrosis o una indicación equivalente .

22. Un kit según la reivindicación 21 con la indicación para valoración de la presencia y severidad de fibrosis hepática.

23. Un kit según la reivindicación 21 donde la etiqueta comprende además la indicación para determinación, en orina .