ES2370671A1 - Método de pronóstico y diagnóstico de la estenosis aórtica que comprende la alfa-1-antiquimiotripsina como marcador. - Google Patents
Método de pronóstico y diagnóstico de la estenosis aórtica que comprende la alfa-1-antiquimiotripsina como marcador. Download PDFInfo
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Abstract
Método de pronóstico y diagnóstico de la estenosis aórtica que comprende la {al}-1- antiquimiotripsina como marcador.La presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para la determinación del riesgo de sufrir estenosis aórtica (EA), la presencia de EA y/o el pronóstico del desarrollo de una EA, mediante la detección y/o cuantificación de la proteína {al}-1-antiquimotripsina. Así mismo, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico y pronóstico de la EA.
Description
Método de pronóstico y diagnóstico de la
estenosis aórtica que comprende la
\alpha-1-antiquimiotripsina como
marcador.
La presente invención se refiere a un método de
obtención de datos útiles para la determinación del riesgo de sufrir
estenosis aórtica (EA), la presencia de EA y/o el pronóstico del
desarrollo de una EA, mediante la detección y/o cuantificación de la
proteína
\alpha-1-antiquimotripsina. Así
mismo, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico y
pronóstico de la EA.
\vskip1.000000\baselineskip
La EA es una enfermedad de elevada prevalencia
en los países desarrollados y es la responsable del mayor número de
reemplazos valvulares aórticos (Passik et al. Mayo Clin.
Proc. 1987; 62: 119-23). Solamente en Estados Unidos
se realizan más de 70.000 reemplazos valvulares aórticos anualmente.
El 2-3% de los adultos mayores de 65 años padecen EA
calcificada, y alrededor del 25% de estas personas padece esclerosis
aórtica (engrosamiento de la válvula aórtica sin obstrucción del
flujo de salida del ventrículo izquierdo) (Otto y O'Brien. Heart
2001; 85: 601-602). Por tanto, se espera un gran
aumento de la EA, debido al progresivo envejecimiento de la
población que conllevan las mejoras en sanidad.
Durante años, la EA degenerativa ha sido
considerada consecuencia inevitable del envejecimiento y se pensaba
en ella como un proceso pasivo secundario al depósito de calcio en
la válvula aórtica. En la actualidad, aunque no se conoce con
certeza su etiología, diversos autores han señalado que comparte los
mismos factores de riesgo que la aterosclerosis, ya que la EA es más
frecuente en pacientes con hipercolesterolemia, hipertensión
arterial, tabaquismo y diabetes (Nalini et al. Circulation
2003; 107:2181-84).
Además, recientemente se han encontrado
similitudes histológicas entre la válvula aórtica estenótica y la
placa de ateroma, lo que ha llevado a la hipótesis de que la EA
degenerativa es un proceso inflamatorio similar al aterosclerótico.
En diferentes trabajos, se ha demostrado que la válvula aórtica
desarrolla aterosclerosis con posterior depósito de calcio y
expresión de marcadores específicos de matriz ósea, como la
osteopondina (Stewart et al. J Am Coll Cardiol. 1997; 29:
630-4, Emile et al. Arterioscler Thromb Vasc
Biol. 1997; 17: 547-52, Kevin et al.
Circulation. 1995; 92: 2163-68, Srivatsa et
al. J Clin Invest. 1997; 99: 996-1009, Feldman
et al. Cathet Cardiovasc Diagn. 1993; 29:
1-7, Fernández-González et
al. Tex Heart Inst J. 1997; 24: 232). De igual forma se ha
documentado que la disfunción endotelial, con acumulación de lípidos
y proteínas (apolipoproteína (apo) B, apo(a) y apoE) (O'Brien
et al. 1996; 16: 523-32, Mohler et al.
Circulation. 2001; 103: 1522-8) juega un papel
importante en el inicio de la EA, así como el estrés oxidativo con
modificación de las enzimas del óxido nítrico juega también un papel
relevante (Arumugam et al. J Cardiovasc Surg. 1995; 10:
610-1, Rajamannan et al. J Am Coll Cardiol.
2003; 41: 842). Sin embargo, algunos datos sugieren que su mecanismo
patogénico no es igual que el de la aterosclerosis; así, en adultos
con EA severa solamente el 50% presenta enfermedad arterial
coronaria significativa. A su vez, la mayoría de los pacientes con
enfermedad arterial coronaria no presentan EA (Otto y O'Brien. Heart
2001; 85: 601-602). Además, algunos estudios
dirigidos a evaluar el efecto de las estatinas en la EA degenerativa
han descrito disminución de la enfermedad coronaria sin cambio en la
progresión de la EA degenerativa (Rossebo et al. N Engl J
Med. 2008. 25; 359: 1343-56, Cowell et al. N
Engl J Med. 2005. 9; 352: 2389-97, Chan et
al. Circulation 2010; 121: 306-14).
Es importante destacar que, aunque se han hecho
avances en el conocimiento de los mecanismos involucrados en este
proceso, no se está utilizado en la actualidad ningún marcador en el
diagnóstico/pronóstico de la EA.
La
\alpha-1-antiquimotripsina es una
alfa globulina glicoproteína miembro de la familia de las serpinas.
La \alpha-1-antiquimotripsina
inhibe algunas proteasas como la catepsina y es protectora del daño
producido por enzimas proteolíticas. En los últimos años se ha
evidenciado la participación de ésta proteína en la enfermedad de
Alzheimer y su deficiencia, con enfermedad hepática.
La identificación temprana de pacientes con
riesgo de desarrollar una estenosis valvular aórtica es de gran
importancia ya que disminuiría la mortalidad y morbilidad asociada a
esta enfermedad. La existencia en los servicios hospitalarios de
test específicos para el estudio de riesgo de padecer EA, podría ser
de gran ayuda para la prevención y posible profilaxis de dicha
enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona un método de
obtención de datos útiles para la determinación de la estenosis
aórtica (EA) o del riesgo de padecer EA o de la evolución de una EA
de forma rápida, sencilla y eficaz. Así mismo, la presente invención
se refiere al uso de un kit para determinar el riesgo de padecer EA
o para determinar la presencia de una EA o para predecir la
progresión de una EA, en una muestra biológica aislada.
La presente invención proporciona, por tanto,
una respuesta a la necesidad de disponer de biomarcadores que
permitan el diagnóstico y el pronóstico de la EA.
\newpage
La presente invención soluciona el problema
técnico de encontrar un buen biomarcador para la EA, a ser posible
que pueda ser monitorizado en plasma o suero sanguíneo, es decir,
que no implique una obtención de la muestra biológica más
invasiva.
En la presente invención, cabe destacar un
efecto sorprendente: la
\alpha-1-antiquimiotripsina
presenta niveles elevados en el tejido de válvula aórtica
estenótica, en su secretoma así como en el plasma sanguíneo de
enfermos con EA, en relación con los niveles de los individuos
control.
Así, un primer aspecto de la invención se
refiere a un método de obtención de datos útiles (en adelante método
de la invención) para la determinación de la EA o del riesgo de
padecer EA o de la evolución de una EA que compren-
de:
de:
- a)
- obtener una muestra biológica aislada de un sujeto, y
- b)
- detectar y/o cuantificar el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen \alpha-1-antiquimotripsina que codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 50% de identidad con SEQ ID NO: 1, o un fragmento de dicho producto de expresión, en la muestra obtenida en el paso (a).
El término "estenosis aórtica (EA)" tal y
como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la
estenosis de la válvula aórtica, que es una valvulopatía
(cardiopatía valvular) caracterizada por el estrechamiento anormal
del orificio de la válvula aórtica del corazón. Esta reducción del
orificio valvular puede ser congénita o adquirida.
La expresión "determinación de la EA", tal
y como se utiliza en la presente descripción, se refiere, pero no se
limita, a la constatación de la presencia de la EA en un sujeto.
La expresión "riesgo de padecer EA", tal y
como se utiliza en la presente descripción, se refiere, pero no se
limita, a la predisposición de un sujeto de sufrir o desarrollar una
EA. Por tanto, el método se refiere a la obtención de datos útiles
para determinar si un sujeto está desarrollando o puede desarrollar
una EA.
El término "evolución de la EA", tal y como
se utiliza en la presente descripción, se refiere, pero no se
limita, a la progresión de la EA o a la probabilidad de presentar
insuficiencia cardíaca o de muerte por insuficiencia cardíaca, así
como a la predicción de la respuesta a un determinado tratamiento de
la EA.
El término "% de identidad" tal y como se
utiliza en la presente descripción, se refiere al % de identidad
entre dos secuencias de aminoácidos. El % de identidad es el
resultado de contar el número de posiciones a lo largo del
alineamiento de dos secuencias donde todos los aminoácidos en la
misma posición son idénticos.
El producto de expresión o el fragmento del
mismo, detectado y/o cuantificado en el paso (b) puede codificar
para una secuencia aminoacídica al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85,
90 o 95% idéntica a SEQ ID NO: 1.
El término "producto de expresión", tal y
como se utiliza en la descripción, hace referencia al producto
resultante de la transcripción (ARN) o de la traducción (proteína)
de un gen o de una secuencia nucleotídica de ADN, o a cualquier
forma resultante del procesamiento del producto resultante de la
transcripción o de la expresión de un gen o de una secuencia
nucleotídica de ADN.
El término "gen
\alpha-1-antiquimotripsina" se
refiere a la secuencia de ADN que codifica para la proteína
\alpha-1-antiquimotripsina, una
variante de la proteína
\alpha-1-antiquimotripsina o un
fragmento de las mismas, siempre y cuando dicha variante o dicho
fragmento sea funcionalmente equivalente.
La secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 es la
secuencia de aminoácidos de la proteína
\alpha-1-antiquimotripsina de
Homo sapiens (humanos) con número de acceso NP_001076.2 de la
base de datos NCBI.
En una realización preferida, el producto de
expresión o el fragmento del mismo, detectado y/o cuantificado en el
paso (b) codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos
un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1. En una realización más
preferida, dicho producto de expresión codifica para la secuencia
aminoacídica SEQ ID NO: 1 o para un fragmento de la misma.
En una realización preferida, el método de la
invención además comprende comparar los datos obtenidos en el paso
(b) con unos valores estándar para encontrar una desviación
significativa.
En una realización más preferida, el método de
la invención además comprende atribuir la desviación significativa a
la presencia de EA o al riesgo de padecer EA en el sujeto de
(a).
Preferiblemente, la muestra biológica del paso
(a) es un fluido biológico. Más preferiblemente, el fluido biológico
es sangre o suero o plasma sanguíneo.
Preferiblemente, la muestra biológica del paso
(a) comprende células. Preferiblemente, comprende un tejido.
La muestra biológica del paso (a) es una muestra
aislada de un organismo como el cuerpo humano o animal y puede
provenir de un fluido fisiológico y/o cualquier célula o tejido de
un organismo.
Preferiblemente, la muestra biológica aislada en
el paso (a) del método de la invención comprende células. Más
preferiblemente, estas células son de válvula aórtica. La muestra
biológica puede ser un tejido, por ejemplo, pero sin limitarse, una
biopsia o un aspirado por aguja fina. Aún más preferiblemente, la
muestra biológica aislada en el paso (a) puede ser un tejido de
válvula aórtica.
En una realización preferida, la muestra
biológica aislada en el paso (a) del método de la invención es un
fluido biológico. El fluido biológico puede incluir fluidos
excretados o secretados del cuerpo, así como fluidos que normalmente
no lo son. El fluido biológico puede incluir, aunque sin limitarse,
líquido amniótico que rodea el feto, humor acuoso, fluido
intersticial, linfa, leche materna, moco (incluyendo el drenaje
nasal y la flema), saliva, sebo (grasa de la piel), suero, sudor,
lágrimas, orina, líquido pericárdico, sangre y plasma sanguíneo. En
una realización más preferida, el fluido biológico es sangre, plasma
sanguíneo o suero sanguíneo.
La muestra biológica aislada en el paso (a) del
método de la invención puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse,
fresca, congelada, fijada o embebida en parafina.
El término "sujeto", tal y como se utiliza
en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos,
y más preferiblemente, humanos.
La expresión "detectar y/o cuantificar el
producto de expresión" en la muestra obtenida, tal y como se
emplea en la descripción del método de la invención, hace referencia
a la detección de la presencia y/o a la medida de la cantidad o la
concentración, preferiblemente de manera
semi-cuantitativa o cuantitativa. La medida puede
ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa
se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del
producto de expresión del gen
\alpha-1-antiquimotripsina basada
en una señal que se obtiene directamente de dicho producto de
expresión y que está correlacionada directamente con el número de
moléculas de producto de expresión del gen, presentes en la muestra.
Dicha señal puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de
intensidad de una propiedad química o física del producto de
expresión del gen
\alpha-1-antiquimotripsina. La
medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente
secundario (por ejemplo, un componente distinto de los productos de
expresión) o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida
de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de
reacción enzimática).
El término "comparar", tal y como se emplea
en la descripción del método primero de la invención, se refiere,
pero no se limita, a la comparación de la cantidad de producto de
expresión del gen
\alpha-1-antiquimotripsina de la
muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica
problema, con una cantidad de producto de expresión del gen
\alpha-1-antiquimotripsina de una
muestra de referencia deseable, descrita en otra parte de la
presente descripción. La muestra de referencia puede ser analizada,
por ejemplo, simultánea o consecutivamente junto con la muestra
biológica problema. La comparación del paso (c) del método de la
invención puede ser realizada manualmente o asistida por
ordenador.
El término "valores estándar", tal y como
se emplea en la descripción del método de la invención, se refiere a
la cantidad absoluta o relativa de producto de expresión del gen
\alpha-1-antiquimotripsina que
permite discriminar la presencia de la EA. Los valores estándar
adecuados pueden ser determinados por el método de la presente
invención a partir de una muestra de referencia que puede ser
analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la
muestra biológica problema. Más preferiblemente, los valores
estándar pueden derivarse de los límites de distribución normal de
una cantidad fisiológica encontrada en una población de sujetos
control. Dicha cantidad fisiológica puede ser determinada por varias
técnicas bien conocidas, como por ejemplo, el cálculo de la media de
la cantidad de producto de expresión del gen
\alpha-1-antiquimotripsina en una
población de sujetos control determinado mediante el método de la
presente invención.
La desviación significativa puede ser
establecida por un experto en la materia mediante el uso de
diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin
limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza,
determinación del valor p, test de Student o funciones
discriminantes de Fisher. Preferiblemente, los intervalos de
confianza son al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%,
al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p
es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001.
Preferiblemente, la presente invención permite detectar
correctamente la enfermedad en al menos el 60%, en al menos el 70%,
en al menos el 80%, o en al menos el 90% de los sujetos de un
determinado grupo o población analizada.
De acuerdo con la presente invención, la
detección de la cantidad de producto de expresión del gen
\alpha-1-antiquimotripsina puede
ser llevada a cabo por cualquier método conocido en el estado de la
técnica.
En una realización preferida del método primero
de la invención, la detección del producto de la expresión del gen
se realiza analizando el nivel de ARN mensajero (ARNm) derivado de
su transcripción, donde el análisis del nivel de ARNm se puede
realizar, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante amplificación
por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en
combinación con la reacción en cadena de la polimerasa
(RT-PCR), retrotranscripción en combinación con la
reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o
cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos;
microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos
depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN
elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante
fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in
situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método
de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia
a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante
resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico
por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro
tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o
por cualquier otro medio.
En una realización preferida, el producto de
expresión de la secuencia nucleotídica del gen
\alpha-1-antiquimotripsina o el
fragmento de dicho producto de expresión, que se detecta y/o
cuantifica en el paso (b) del método de la invención, es una
secuencia aminoacídica que tiene al menos un 50% de identidad con
SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma. Más preferiblemente, es
una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 70% de identidad
con SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la misma. Aún más
preferiblemente, es SEQ ID NO: 1, o un fragmento de la
misma.
misma.
Preferiblemente, la detección y/o cuantificación
del paso (b) del método de la invención se realiza mediante
electroforesis, inmunoensayo, cromatografía, tecnología de
microarrays y/o espectrometría de masas.
La detección y/o cuantificación del paso (b) del
método de la invención puede llevarse a cabo mediante cualquier
combinación de cualquiera de las técnicas mencionadas. La detección
puede realizarse evaluando la presencia o la ausencia del producto
de expresión o del fragmento del mismo.
La electroforesis es una técnica analítica de
separación basada en el movimiento o la migración de macromoléculas
disueltas en un medio (el tampón de electroforesis), a través de una
matriz o un soporte sólido, como resultado de la acción de un campo
eléctrico. El comportamiento de la molécula depende de su movilidad
electroforética, que a su vez depende de la carga, el tamaño y la
forma de la molécula. Existen numerosas variantes de esta técnica
según el equipo que se utilice para llevar a cabo la separación. La
electroforesis puede ser elegida de la lista que comprende:
electroforesis capilar, electroforesis en papel, electroforesis en
gel de agarosa, electroforesis en gel de poliacrilamida, enfocado
isoeléctrico o electroenfoque o electroforesis bidimensional.
Un inmunoensayo es un ensayo bioquímico que mide
la concentración de una sustancia en una muestra biológica usando
una reacción de un anticuerpo o anticuerpos contra su antígeno. El
ensayo se basa en la unión específica de un anticuerpo con su
antígeno. La detección y/o cuantificación del anticuerpo y/o del
antígeno puede realizarse con diversos métodos. Uno de los más
comunes es el mareaje del antígeno o el anticuerpo. Este mareaje
puede consistir, aunque sin limitarse, en una enzima, un
radioisótopo (radioinmunoensayo), un marcador magnético
(inmunoensayo magnético) o un fluoróforo. Además hay otras técnicas
como la aglutinación, la nefelometría, la turbidimetría o el
inmunoblot. Los inmunoensayos heterogéneos pueden ser
competitivos o no competitivos. En un inmunoensayo competitivo la
respuesta es inversamente proporcional a la concentración de
antígeno de la muestra. En un ensayo no competitivo, también llamado
ensayo en sándwich, los resultados son directamente proporcionales a
la concentración de antígeno. Una técnica de inmuno ensayo que puede
usarse en la presente invención es el ensayo inmunoadsorbente ligado
a enzimas o ELISA (del inglés "Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay").
En una realización preferida, el inmunoensayo es
un inmunoblot. Para llevar a cabo la técnica del
inmunoblot, también llamada Western blot o
inmunodetección en membrana, se obtiene un extracto de proteínas a
partir de una muestra biológica aislada de un sujeto y se separan
las proteínas mediante electroforesis en un medio de soporte capaz
de retenerlas. Una vez separadas las proteínas se transfieren a un
soporte diferente o membrana donde pueden ser detectadas mediante el
uso de anticuerpos específicos que reconocen la proteína
\alpha-1-antiquimotripsina, sus
variantes o los fragmentos de las mismas. Esta membrana se híbrida
con un primer anticuerpo específico (o anticuerpo primario) que
reconoce la proteína
\alpha-1-antiquimotripsina, su
variante o un fragmento de las mismas. A continuación, la membrana
se hibrida con un segundo anticuerpo (o anticuerpo secundario) capaz
de reconocer de manera específica al anticuerpo primario y que se
encuentra conjugado o unido con un compuesto marcador. En una
realización alternativa, es el anticuerpo primario que reconoce la
proteína
\alpha-1-antiquimotripsina, su
variante o un fragmento de las mismas, el que está conjugado o unido
a un compuesto marcador, y no es necesario el uso de un anticuerpo
secundario. Son conocidos en el estado de la técnica diferentes
formatos, soportes y técnicas que pueden ser empleados para la
realización de este aspecto preferido del método de la
invención.
En otra realización preferida, el inmunoensayo
es una inmunohistoquímica (IHQ). Las técnicas de inmunohistoquímica
permiten la identificación, sobre muestras tisulares o citológicas
de determinantes antigénicos característicos. El análisis mediante
inmunohistoquímica se realiza sobre cortes de tejido, ya sea
congelado o incluido en parafina, procedente de una muestra
biológica aislada de un sujeto. Estos cortes se hibridan con un
anticuerpo específico o anticuerpo primario que reconoce a la
proteína
\alpha-1-antiquimotripsina, sus
variantes o fragmentos de las mismas. A continuación, los cortes se
hibridan con un anticuerpo secundario capaz de reconocer de manera
específica el anticuerpo primario y que se encuentra conjugado o
unido con un compuesto marcador. En una realización alternativa, es
el anticuerpo primario que reconoce la proteína
\alpha-1-antiquimotripsina, su
variante o un fragmento de las mismas, el que está conjugado o unido
a un compuesto marcador, y no es necesario el uso de un anticuerpo
secun-
dario.
dario.
\newpage
Por medio de técnicas cromatográficas se puede
separar las moléculas según su carga, su tamaño o su peso molecular,
por su polaridad o por su potencial redox, entre otros. La técnica
cromatográfica puede ser, aunque sin limitarse, cromatografía
líquida (de partición, de absorción, de exclusión, de intercambio
iónico), cromatografía gaseosa o cromatografía de fluidos
supercríticos.
La tecnología de microarrays de la
presente invención se basa, por ejemplo, pero sin limitarse, en la
fijación en un soporte sólido de una molécula que reconoce el
producto de expresión de la presente invención. El microarray
de anticuerpos es uno de los más comunes microarrays de
proteínas. En este caso los anticuerpos se colocan en pequeños
puntos, se fijan en el soporte sólido (llamado chip de proteínas) y
se usan para capturar moléculas y así detectar las proteínas en una
muestra biológica, como pueden ser un lisado celular, un medio
condicionado, suero u
orina.
orina.
El término "soporte sólido" tal y como se
emplea en la presente descripción se refiere a una gran variedad de
materiales, por ejemplo, pero sin limitarse, resina de intercambio
iónico o adsorción, vidrio, plástico, látex, nylon, gel, ésteres o
celulosa, esferas paramagnéticas o una combinación de algunos de
ellos.
Más preferiblemente, la detección y/o
cuantificación del paso (b) del método de la invención se realiza
mediante cromatografía líquida acoplada a espectrómetro de masas en
tándem (LC-MS/MS).
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
del producto de expresión del gen de la
\alpha-1-antiquimotripsina o de un
fragmento del mismo, como marcador:
- a)
- para la determinación del riesgo de padecer EA,
- b)
- para determinar la presencia de una EA, o
- c)
- para predecir la progresión de una EA.
El producto de expresión puede codificar para
una secuencia aminoacídica al menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 o
95% idéntica a SEQ ID NO: 1 o a un fragmento de la misma.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 50% de identidad
con SEQ ID NO: 1, o de un fragmento de la misma, como marcador:
- a)
- para la determinación del riesgo de padecer EA,
- b)
- para determinar la presencia de una EA, o
- c)
- para predecir la progresión de una EA.
La secuencia aminoacídica es al menos 55, 60,
65, 70, 75, 80, 85, 90 o 95% idéntica a SEQ ID NO: 1 o a un
fragmento de la misma.
En una realización preferida, la secuencia
aminoacídica tiene al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1 o
un fragmento de la misma. En una realización más preferida, la
secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 1 o de un fragmento de SEQ ID
NO: 1.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de un kit que comprende cebadores y/o sondas que hibridan con la
secuencia de un gen
\alpha-1-antiquimotripsina que
codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 50% o
al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1, o que codifica para
SEQ ID NO: 1, para determinar el riesgo de padecer EA o para
determinar la presencia de una EA o para predecir la progresión de
una EA, en una muestra biológica aislada.
El término "cebadores" se refiere a los
oligonucleótidos con secuencias nucleotídicas idénticas o
complementarias reversas que permitan la amplificación de algún
fragmento del gen
\alpha-1-antiquimotripsina
mediante, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
El término "cebador" se refiere a secuencias de entre
15-30 nucleótidos que hibridan con una de las
cadenas del ácido nucleico molde y permiten la amplificación de una
secuencia de ADN mediante una reacción de PCR. El término
"sonda" se refiere a una secuencia de ARN o ADN idéntica o
complementaria reversa a la secuencia del gen
\alpha-1-antiquimotripsina, capaz
de hibridar con dicha secuencia y que puede estar marcada o no con
cualquier compuesto marcador conocido en el estado de la
técnica.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de un kit que comprende anticuerpos capaces de unirse a una
secuencia aminoacídica que tiene al menos un 50% o al menos un 70%
de identidad con SEQ ID NO:1, o que codifica para SEQ ID NO: 1, o a
un fragmento de la misma, para determinar el riesgo de padecer EA o
para determinar la presencia de una EA o para predecir la progresión
de una EA, en una muestra biológica aislada.
El término "anticuerpo", tal como se
utiliza en la presente descripción, se refiere a moléculas de
inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas
de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de
unión y fijación de antígeno que se une específicamente
(inmunorreacciona) con una proteína. Hay cinco isotipos o clases
principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM),
inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A
(IgA) e inmunoglobulina E (IgE).
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. A) Muestra una imagen representativa
de un gel bidimensional de tejido de válvulas aórtica realizado
mediante 2D-DIGE y posteriormente teñido con plata.
Rodeado por un círculo se muestra la mancha proteica cuya expresión
varía al comparar pacientes con EA con individuos sanos. B) Muestra
un esquema en 3 dimensiones de la variación de la expresión de la
proteína resaltada en (A) entre individuos con EA e individuos
controles.
Figura 2. A) Muestra una inmunohistoquímica de
válvulas aórticas sanas y estenóticas contra
\alpha-1-antiquimotripsina. Se
utilizaron criosecciones de 6 \mum de tejido de válvulas con EA y
de tejido de válvulas sanas. Los resultados muestran una mayor
expresión de
\alpha-1-antiquimotripsina en los
cortes de válvulas con EA al ser comparados con válvulas sanas. Como
control negativo se realizó una inmunohistoquímica sin incubación
con el anticuerpo contra la
\alpha-1-antiquimotripsina. B)
Muestra el número de células positivas para
\alpha-1-antiquimotripsina por
\mum^{2} en tejido de válvula aórtica control frente a tejido de
válvula aórtica estenótica: el número de células que expresan
\alpha-1-antiquimotripsina es
significativamente superior en el tejido de válvula aórtica
estenótica.
Figura 3. Muestra unos immunoblots donde
se confirma una mayor expresión de
\alpha-1-antiquimotripsina en
muestras procedentes de pacientes con EA en comparación con
pacientes control. A) Electroforesis bidimensional de muestras de
tejido de válvula aórtica de pacientes con EA y de individuos
control. En el mareaje contra la
\alpha-1-antiquimotripsina se
detectó una mancha proteica de 70 kDa
sobre-expresada en pacientes con EA frente a
individuos sanos. Representación gráfica de la cantidad de proteína
en la muestra control (C) y en la muestra de pacientes con EA (EA)
en unidades arbitrarias. B) Inmunoblot contra la
\alpha-1-antiquimotripsina en 4
muestras de secretomas control (C1-C4) y 4 de
secretomas de pacientes con EA (P1-P4).
Representación gráfica de la cantidad de proteína en las muestras
control (C) y en las de pacientes con EA (EA) en unidades
arbitrarias y "valor p" de la prueba estadística t de Student.
C) Inmunoblot contra la
\alpha-1-antiquimotripsina en 4
muestras de plasma control (C1-C4) y 4 de plasma de
pacientes con EA (P1-P4). Representación gráfica de
la cantidad de proteína en las muestras control (C) y en las de
pacientes con EA (EA) en unidades arbitrarias y "valor p" de la
prueba estadística t de
Student.
Student.
Figura 4. A) Muestra los cromatogramas de MRM
donde se observan las transiciones más características para cada uno
de los dos péptidos proteotípicos seleccionados de la
\alpha-1-antiquimotripsina. B)
Muestra la representación gráfica de los valores de media y
desviación estándar para cada transición correspondiente a tres
inyecciones independientes de cada muestra en el espectrómetro de
masas 4000-Qtrap (Applied Biosystems). C). Muestra
la representación gráfica de los resultados de la cuantificación
mediante MRM para cada una de las transiciones monitorizadas.
"P" son pacientes y "C" controles.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos, que ilustran pero no
limitan la presente invención, describen unos ensayos realizados por
los inventores que ponen de manifiesto la especificidad y
efectividad de la
\alpha-1-antiquimotripsina como
biomarcador de la EA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las válvulas aórticas estenóticas (n=20) fueron
obtenidas de pacientes de ambos sexos (55% hombres, 45% mujeres) con
una edad media 74 \pm 3,9 años que fueron sometidos a reemplazo
valvular por estenosis aórtica (EA) degenerativa. Todos los
pacientes (100%) presentaban hipertensión, el 50% tenían
hiperlipemia y un 60%, diabetes. La cirugía fue realizada según las
guías de práctica clínica habituales. La enfermedad arterial
coronaria estaba presente en el 60% de los sujetos incluidos en el
estudio. Aquellos pacientes con insuficiencia aórtica, enfermedad de
la válvula mitral o cualquier sospecha de enfermedad reumática no
fueron incluidos en el estudio (Tabla 1).
Las válvulas aórticas de sujetos controles
fueron obtenidas en las autopsias de individuos fallecidos por
enfermedades no cardiovasculares, sin enfermedad coronaria o
diabetes mellitus y cuyas válvulas aórticas presentaban un
aspecto macroscópicamente normal (n = 20). (Tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
El estudio fue realizado de acuerdo a las
recomendaciones de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el
Comité Ético del Hospital Virgen de la Salud (Toledo, España). El
consentimiento informado fue obtenido de todos los sujetos incluidos
en el estudio.
\vskip1.000000\baselineskip
Las válvulas con EA fueron procesadas en un
plazo máximo de 2 horas desde que se realizó la cirugía,
manteniéndose el tejido a 4ºC en medio RPMI. Se lavaron 3 veces con
tampón fosfato para reducir los contaminantes de sangre. Las
válvulas controles fueron procesadas en un tiempo máximo de 8 horas
desde el fallecimiento del individuo. Para realizar la extracción
proteica, un fragmento de válvula fue congelado en nitrógeno líquido
y homogeneizado con mortero. Entre 0,1-0,3 g del
polvo obtenido fue resuspendido en 400 \mul de tampón de
extracción de proteína (10 mM Tris pH 7,5, 500 mm NaCl, 0,1% Tritón
X-100, el 1% \beta-mercaptoetanol,
1 mM PMSF). El homogeneizado fue centrifugado a 21.000 g durante 15
minutos a 4ºC. El sobrenadante (E1), con la mayor parte de las
proteínas solubles, fue recogido y almacenado a -20ºC. El
pellet fue solubilizado en tampón de lisis (7 M Urea, 2M
Tiourea, 4% CHAPS) y centrifugado de nuevo a 21.000 g. Este segundo
sobrenadante (E2) estaba enriquecido en proteínas hidrofóbicas,
principalmente proteínas de membrana. Los restos celulares y los
lípidos fueros eliminados. Ambos extractos proteicos E1 y E2 fueron
analizados conjuntamente para el análisis de electroforesis
bidimensional diferencial (2D-DIGE). La
concentración de proteínas fue determinada mediante el método
Bradford-Lowry.
\vskip1.000000\baselineskip
Los extractos de proteínas fueron resuspendidos
en tampón de rehidratación (7M urea, 2M tiourea, 4% CHAPS, 1% TBP,
2% anfolitos) y aplicados a tiras IPG de pH 4-7. El
isoelectroenfoque (IEF) fue desarrollado horizontalmente y a una
temperatura constante de 20ºC. Una vez finalizado el IEF, las tiras
fueron equilibradas para facilitar el paso de las proteínas a la
segunda dimensión. La separación proteica fue realizada atendiendo
al peso molecular en geles SDS-PAGE al 12%,
utilizando sistema Protean II (Bio-Rad) a 25 mA/gel
a 4ºC. A continuación, los geles fueron teñidos con plata. Este
protocolo es compatible con la espectrometría de masas. Por último,
los geles fueron escaneados con el Densitómetro Calibrado
GS-800 (Bio-Rad).
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras fueron marcadas según las
instrucciones de la casa comercial (GE Healthcare, Piscataway, NJ),
50 \mug de extracto proteico de válvulas aórticas estenóticas y 50
\mug de extracto proteico de válvulas aórticas control fueron
marcados con 400 pmol (1 \mul) del fluorocromo correspondiente,
Cy3 ó Cy5, según el diseño experimental. Además, un control interno
con todas las muestras del experimento fue preparado poniendo en un
único tubo 50 \mug de cada una de las muestras y marcando la
mezcla con Cy2. Las muestras fueron incubadas en hielo durante 30
minutos en la oscuridad para permitir la reacción de mareaje. Dicha
reacción fue detenida añadiendo 1 \mul de lisina 10 mM por cada 50
\mug de muestra e incubando de nuevo en hielo durante 10 minutos y
en la oscuridad.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez las muestras fueron marcadas, la muestra
de válvula estenótica, la muestra de válvula control y el
mancomunado de todas las muestras objeto del experimento fueron
mezcladas (150 \mug de proteína total), según diseño experimental,
diluidas en tampón de rehidratación (30 mM TRIS, 7 m urea, 2M
tiourea, CHAPS 4%) y aplicadas a las tiras IPG de 24 cm pH
4-7. La primera dimensión fue realizada en el
sistema IPGphor III System (GE Helathcare) siguiendo el siguiente
programa de IEF: 500 V durante 30 minutos, 1000 V durante 1 h, 2000
V en 1 h en gradiente lineal, 5000 V en 2 h en gradiente lineal,
8000 V en 1 h en gradiente lineal, y de 8000 V hasta 88000 v/h.
Después de la primera dimensión, las tiras fueron equilibradas con
tampón de equilibrado (TriCl pH 8,8 1,5 M, 6M urea, 87% glicerol, 2%
SDS). Posteriormente, las proteínas fueron separadas en geles
SDS-PAGE al 12% de acrilamida/bisacrilamida.
\vskip1.000000\baselineskip
Los geles en SDS-PAGE fueron
escaneados utilizando el Typhoon 9400 (Typhoon 9400 Variable Mode
Imager, GE Healthcare) aplicando las longitudes de onda de
excitación y emisión específicas de cada fluorocromo, filtros y
valores de sensibilidad del fotomultiplicador (PTM) para cada
fluorocromo, Cy3, Cy5 y Cy2 (valores PTM; 480 V, 490 V, 500 V,
respectivamente) (Figura 1A).
La cuantificación proteica relativa en las
muestras de válvulas estenóticas y sanas fue realizada a través del
programa DeCyder v6.5 (Figura 1B) y con el módulo estadístico
multivariante EDA (del inglés, "Extended data analysis")
mediante el módulo DIA (del inglés, "Differential
in-gel analysis"), que detecta y cuantifica
las manchas proteicas de las tres imágenes correspondientes a cada
gel. El algoritmo que emplea este módulo para la detección de las
manchas se basa en la co-detección de las tres
señales fluorescentes (2 muestras y 1 control interno) y permite
diferenciar las verdaderas manchas proteicas de los artefactos del
gel. Por otra parte, la cuantificación se basa en el cálculo de las
relaciones Cy3/Cy2 y Cy5/Cy2, lo que permite tener un valor de
intensidad normalizado para cada
mancha.
mancha.
Una vez completada esta fase, los datos
generados mediante DIA fueron importados al módulo BVA (del inglés,
"Biological Variation Analysis"), para el emparejamiento
de las manchas detectadas entre las imágenes de los diferentes geles
del estudio para obtener después datos estadísticos sobre los
niveles de expresión de las manchas en los diferentes grupos de
estudio. Se puede concluir que existe variación cuando los niveles
de expresión de las proteínas están alterados más de 1,5 veces y
dicha variación se considera estadísticamente significativa cuando
se encuentra dentro del intervalo de confianza del 95% (valor
p<0.05) determinado por la prueba t-Student.
Finalmente, un análisis multivariante a través
del Análisis de Componentes Principales (PCA) fue realizado
utilizando el algoritmo incluido en el modulo EDA del programa
DeCyder v 6.5, basado en las manchas proteicas que son emparejadas
en todos los geles. El análisis jerárquico fue realizado utilizando
el coeficiente de Pearson, basado en las manchas proteicas que se
encontraban en el 90% de los geles del estudio. Los geles fueron
teñidos con solución de plata (GE-Healthcare)
después de ser escaneados.
\vskip1.000000\baselineskip
Las manchas proteicas diferencialmente
expresadas fueron recortadas de los geles manualmente, digeridas
automáticamente usando el "Ettan Digester" (GE
Healthcare) e identificadas. Los fragmentos del gel fueron reducidos
utilizando 10 mM dithiothreitol (DTT) en bicarbonato amónico 50 mM
(99% pureza) y alquilados con iodoacetamida 55 mM en bicarbonato
amónico 50 mM. Los fragmentos de gel fueron entonces lavados con
bicarbonato amónico 50 mM, metanol al 50% (para HPLC) y acetonitrilo
(para HPLC) tras lo cual fueron secados en "speedvac"
(Thermo Fisher). Se añadió tripsina modificada de cerdo a una
concentración final de 20 ng/\mul en bicarbonato amónico 20 mM a
los fragmentos de gel que fueron digeridos durante la noche a 37ºC.
Finalmente, la extracción peptídica fue realizada en acetonitrilo al
60% en agua y 0,1% de ácido fórmico (99,5% pureza).
Una vez finalizada la digestión, una alícuota de
cada reacción fue mezclada con una alícuota de matriz de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinámico
en acetonitrilo al 50% y 0,1% de ácido trifluoroacético. La mezcla
fue depositada en capa fina en una placa del espectrómetro 384
Opti-TOF 123x81 mm MALDI (Applied Biosystems) y
secada a temperatura ambiente. Los datos de
MALDI-MS/MS fueron obtenidos en modo automático
utilizando un espectrómetro de masas 4800 Plus
MALDI-TOF/TOF Analyzer (Applied Biosystems) (MALDI,
del inglés "matrix assisted laser desortion ionization";
TOF, del inglés "time of flight").
Los espectros fueron adquiridos en modo
ión-positivo con un láser Nd:YAG de 355 nm de
longitud de onda, a una frecuencia de 200 Hz. De
100-2000 espectros individuales fueron obtenidos.
Para el análisis de fragmentos de iones en modo de tiempo de vuelo
en tándem (TOF/TOF), los precursores fueron acelerados a 8 kV y
seleccionados en la puerta de entrada de iones. Los fragmentos
generados por colisión de los precursores con aire (CID, del inglés
"collision-induced dissociation") en la
cámara de colisión fueron además acelerados a 15 kV en la fuente 2 y
sus masas fueron analizadas después de pasar por el reflector de
iones. El análisis automático de los datos de masas fue realizado
usando el programa informático "4000 Series Explorer" versión
3.5.3 (Applied Biosystems). La calibración interna de los espectros
de masas del MALDI-TOF fue realizada usando 2 iones
de la autolisis de tripsina (m/z = 842,510 y m/z = 2211,105,
respectivamente). Para las calibraciones del
MALDI-MS/MS, fueron utilizados los espectros de
iones fragmento obtenidos del
"Glub-fibrinopeptide"
(4800MALDI/TOF-TOF, Applied Biosystem). Los datos de
MALDI-MS y MS/MS fueron combinados mediante el
programa "GPS Explorer" versión 3.6, que permite la realización
de búsquedas no redundantes en la base de datos de proteínas
Swissprot 56.2 usando el programa Mascot versión 2.2 (Matrix
science), con una tolerancia de masas de 50 ppm y permitiendo la
pérdida de un lugar de corte. Los espectros
MALDI-MS/MS y las búsquedas fueron revisadas
manualmente en detalle usando este programa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El anticuerpo contra
\alpha-1-antiquimiotripsina con
referencia ab9374 de Abcam fue utilizado para realizar la
inmunohistoquímica (Fig. 2) y los inmunoblots (Fig. 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Para el estudio del secretoma, una valva de las
válvulas con EA y una valva de las válvulas control fueron disecadas
y cultivadas por separado en medio RPMI libre de aminoácidos y
suplementado con arginina y lisina marcadas, a
37ºC.
37ºC.
Las muestras de medio de cultivo fueron
recogidas a las 24, 48, 72, 96 y 120 horas para encontrar el tiempo
de máxima secreción proteica. Dicho tiempo resultó ser a 96
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 28 ml de sangre fueron extraídos
de cada paciente o individuo control en tubos estériles con EDTA. La
sangre fue centrifugada a 750 g durante 10 minutos a temperatura
ambiente para obtener el plasma, que fue dividido en partes
alícuotas y almacenado a - 80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La electroforesis unidimensional de proteínas
obtenidas a partir de muestras de válvulas aórticas estenóticas y
control (Figura 3A) y de muestras del secretoma de dichas válvulas
(Figura 3B) y de muestras de plasma sanguíneo de los pacientes con
EA y controles (Figura 3C), fue realizada en geles
SDS-PAGE al 12% utilizando el sistema de
electroforesis Miniprotean II de Bio-Rad, aplicando
un voltaje inicial de 80 V durante 5-10 minutos,
seguido de un voltaje constante de 25 mA durante 1 hora. Después del
SDS-PAGE las proteínas fueron transferidas a
membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad) mediante
transferencia semiseca durante 40 minutos a 20 V, utilizando el
siguiente tampón de transferencia: Tris 25 mM, Glicina 151,8 mM y
metanol al 20%.(v/v). A continuación, las proteínas fueron teñidas
sumergiendo las membranas de nitrocelulosa en una solución de Rojo
Ponceau al 0,2% en ácido tricloroacético 30% (p/v) y ácido
sulfosalicílico al 30% (p/v) durante 1 minuto, tras lo cual las
membranas fueron lavadas con agua destilada para eliminar el exceso
de colorante. Una imagen digitalizada de cada membrana fue tomada
con el densitómetro calibrado GS-800. Las proteínas
fueron bloqueadas utilizando un tampón fosfato con Tween20 0,1%
(v/v) y con leche en polvo desnatada 7,5% (p/v) durante 1 hora en
agitación a temperatura ambiente. Las membranas fueron lavadas 3
veces durante 10 minutos en un tampón fosfato con Tween20 0,1%
(v/v). A continuación, las membranas fueron incubadas durante 1 hora
a temperatura ambiente con el anticuerpo específico contra
\alpha-1-antiquimiotripsina,
diluido 1:1.000 en el tampón de lavado con 5% (p/v) de leche en
polvo desnatada. Tras realizar otros 3 lavados de 10 minutos en el
tampón de lavado, las membranas fueron incubadas durante 1 hora a
temperatura ambiente con el anticuerpo secundario correspondiente
(anticuerpo anti-conejo desarrollado en cabra y
unido a la peroxidasa), diluido 1:5.000 en tampón de lavado con 5%
(p/v) de leche en polvo desnatada. Finalmente, tras otros 3 lavados
de 10 minutos, las membranas fueron reveladas utilizando el sustrato
quimioluminiscente ECL (GE Healthcare). Las intensidades de las
bandas fueron cuantificadas realizando una densitometría de cada una
de ellas y restando el ruido de fondo mediante el programa Quantity
One 4.6.5. Los resultados obtenidos, medidos en
intensidad\cdotmm^{2}, fueron analizados con el programa
informático de análisis estadístico GraphPad Prism 4.0, mediante una
prueba T no paramétrica para determinar diferencias significativas
con valores p< 0,05.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se utilizaron secciones de tejido, tanto de
válvulas aórticas estenóticas como de válvulas aórticas control, de
6 \mum de grosor fijadas en formalina, previamente descalcificadas
en Shandon-TBD1 (Thermo Scientific), embebidas en
OCT y congeladas en nitrógeno líquido. Las secciones se bloquearon
en tampón fosfato con Tween 20 (0,1%) con BSA al 1% durante 1 hora.
Posteriormente, las secciones de tejido fueron incubadas con el
anticuerpo primario 1 hora a temperatura ambiente. Por último, las
secciones fueron incubadas con el anticuerpo secundario
IgG-HRP-conjugado. El revelado fue
realizado añadiendo el cromógeno 3-3
diaminobenzidina. Los cortes fueron teñidos con hematoxilina y
deshidratados en un gradiente de alcoholes (70%, 95%, alcohol
absoluto). Finalmente, los cortes fueron lavados en xilol y montados
con el medio de montaje DPX, para sellar las láminas de vidrio con
el tejido. Como control negativo, todo el procedimiento completo de
inmunohistoquímica fue realizado en ausencia del anticuerpo primario
(Figura 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Las proteínas de las muestras de plasma fueron
reducidas y alquiladas con DTT 100 mM en bicarbonato amónico 50 mM
durante 30 minutos a 37ºC, seguido de iodoacetamida 550 mM en
bicarbonato amónico 50 mM a temperatura ambiente y en oscuridad
durante otros 20 minutos. Transcurrido ese tiempo, se añadió 60%
bicarbonato amónico 50 mM y 15% acetonitrilo a las muestras y, a
continuación, una solución de tripsina porcina modificada (1
\mug/\mul) con una relación 1 \mug tripsina/50 \mug proteína
fue añadida. La digestión fue incubada a 37ºC durante un mínimo de 6
horas (generalmente, durante toda la noche). La reacción fue
detenida añadiendo 2% ácido fórmico y las muestras fueron limpiadas
utilizando micro columnas de centrífuga
(spin-columns) con resina C18
(Pep-Clean, Pierce). El digerido tríptico fue secado
a vacío en centrífuga "speed-vac" y
resuspendido en una solución 2% acetonitrilo con 2% ácido
fórmico.
El sistema LC-MS/MS está formado
por un sistema nano-LC TEMPO (Applied Biosystems)
combinado con un nano-autosampler. Tres
inyecciones de cada digerido (2 \mug en cada inyección) fueron
realizadas usando fase móvil A (2% acetonitrilo, 0.1% ácido fórmico)
con un flujo de 10 \mul/minuto durante 5 minutos. Los péptidos
fueron cargados así en una pre-columna C18 para
pre-concentrar y desalar las muestras. A
continuación, los péptidos fueron separados mediante
nanocromatografía de fase reversa en una columna capilar de C18,
usando fase móvil A (2% acetonitrilo, 0.1% ácido fórmico) y fase
móvil B (98% acetonitrilo, 0.1% ácido fórmico), con un flujo de 300
nl/minuto, aplicando el siguiente gradiente: 2-15% B
en los 2 primeros minutos, incrementando a 50% B durante los 38
minutos siguientes, 50-90% B en 2 minutos,
manteniendo 95% B durante 3 minutos, volviendo en 1 minuto a
condiciones iniciales (2% B) y manteniéndolas durante 14 minutos
más. El análisis LC-MS/MS fue realizado en un equipo
híbrido de tipo triple cuadrúpolo/trampa de iones lineal AB/MDS
Sciex 4000 Q TRAP con fuente NanoSprayll (Applied Biosystems). Tanto
este sistema como el sistema nano-LC TEMPO se
controlan mediante el software Analyst v.1.4.2. La adquisición fue
realizada en modo positivo, con un voltaje de ionización de 2800 V,
con un "gas cortina" de 10, un "gas nebulizador" de 20 y
una "temperatura de interfaz" de 150ºC. El nitrógeno fue
utilizado tanto en el caso del gas de colisión como en el del "gas
cortina". Las transiciones MRM fueron optimizadas para obtener
una transmisión y una sensibilidad máximas. Los parámetros fueron
optimizados para cada una de las transiciones y se resumen en la
Tabla 3. Un total de 3 transiciones MRM (fragmentos diagnósticos)
por péptido fueron monitorizadas para cada muestra individual, y con
tres réplicas por muestra (Tabla 4, Figura 4A).
Debido a la complejidad de la muestra y para
maximizar la especificidad, se utilizó una resolución de
"unidad" (unit) en el primer y tercer cuadrúpolos (Q1 y
Q3). Un "tiempo de permanencia" (dwell time) de 50 ms
fue empleado. Durante este tiempo, los cuadrúpolos monitorizan cada
una de las transiciones, cíclicamente. Las abundancias fueron
obtenidas en base a las áreas de los picos cromatográficos (Figura
4B), que fueron calculadas como integral bajo la curva definida por
cada pico usando el algoritmo IntelliQuant, incluido en el software
Analyst 1.4.2. Dichas áreas fueron importadas al programa SPSS,
donde fueron realizadas las comparaciones estadísticas
correspondientes (Figura 4C, Tabla 4).
<110> FUHNPAIIN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método de pronóstico y diagnóstico
de la estenosis aórtica que comprende la
\alpha-1-antiquimiotripsina como
marcador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2145.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 423
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
Claims (19)
1. Método de obtención de datos útiles para la
determinación de la estenosis aórtica (EA) o del riesgo de padecer
EA o de la evolución de una EA que comprende:
- a)
- obtener una muestra biológica aislada de un sujeto, y
- b)
- detectar y/o cuantificar el producto de expresión de una secuencia nucleotídica de un gen \alpha-1-antiquimotripsina que codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 50% de identidad con SEQ ID NO: 1, en la muestra obtenida en el paso (a).
2. Método según la reivindicación 1, donde el
producto de expresión detectado y/o cuantificado en el paso (b) es
de una secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia
aminoacídica que tiene al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO:
1.
3. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, donde el producto de expresión detectado y/o
cuantificado en el paso (b) es de una secuencia nucleotídica que
codifica para la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 que además comprende comparar
los datos obtenidos en (b) con unos valores estándar para encontrar
una desviación significativa.
5. Método según la reivindicación 4 que además
comprende atribuir la desviación significativa a la presencia de EA
o al riesgo de padecer EA en el sujeto de (a).
6. Método según las reivindicaciones
1-5, donde la muestra biológica del paso (a) es un
fluido biológico.
7. Método según las reivindicaciones
1-6, donde el fluido biológico es sangre o suero o
plasma sanguíneo.
8. Método según las reivindicaciones
1-6, donde la muestra biológica del paso (a)
comprende células.
9. Método según las reivindicaciones
1-6, donde la muestra biológica del paso (a)
comprende un tejido.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, donde el producto de
expresión, de la secuencia nucleotídica del gen
\alpha-1-antiquimotripsina es una
secuencia aminoacídica que tiene al menos un 50% o al menos un 70%
de identidad con SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 1.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, donde el producto de expresión
es detectado por PCR.
12. Método según la reivindicación 10, donde la
secuencia aminoacídica es detectada por electroforesis,
inmunoensayo, cromatografía, tecnología de microarrays y/o
espectrometría de masas.
13. Método según la reivindicación 12 donde la
secuencia aminoacídica es detectada por cromatografía líquida
acoplada a espectrometría de masas en tándem.
14. Uso del producto de expresión del gen de la
\alpha-1-antiquimotripsina como
marcador:
- a)
- para la determinación del riesgo de padecer EA,
- b)
- para determinar la presencia de una EA, o
- c)
- para predecir la progresión de una EA.
15. Uso de una secuencia aminoacídica de la
proteína
\alpha-1-antiquimotripsina que
tiene al menos un 50% de identidad con SEQ ID NO: 1, como
marcador:
- a)
- para la determinación del riesgo de padecer EA,
- b)
- para determinar la presencia de una EA, o
- c)
- para predecir la progresión de una EA.
16. Uso según la reivindicación 15, donde la
secuencia aminoacídica de la proteína
\alpha-1-antiquimotripsina tiene
al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1.
17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
15 ó 16, donde la secuencia aminoacídica de la proteína
\alpha-1-antiquimotripsina es SEQ
ID NO: 1.
18. Uso de un kit que comprende cebadores y/o
sondas que hibridan con la secuencia de un gen
\alpha-1-antiquimotripsina que
codifica para una secuencia aminoacídica que tiene al menos un 50% o
al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO: 1, o que codifica para
SEQ ID NO: 1, para determinar el riesgo de padecer EA o para
determinar la presencia de una EA o para predecir la progresión de
una EA, en una muestra biológica aislada.
19. Uso de un kit que comprende anticuerpos
capaces de unirse a una secuencia aminoacídica de la
\alpha-1-antiquimotripsina que
tiene al menos un 50% o al menos un 70% de identidad con SEQ ID NO:
1, o que codifica para SEQ ID NO: 1, para determinar el riesgo de
padecer EA o para determinar la presencia de una EA o para predecir
la progresión de una EA, en una muestra biológica aislada.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES201030759A ES2370671B1 (es) | 2010-05-20 | 2010-05-20 | Método de pronóstico y diagnóstico de la estenosis aórtica que comprende la alfa-1-antiquimiotripsina como marcador. |
PCT/ES2011/070365 WO2011144791A1 (es) | 2010-05-20 | 2011-05-20 | Método de pronóstico y diagnóstico de la estenosis aórtica que comprende la alfa-1-antiquimiotripsina como marcador |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ES201030759A ES2370671B1 (es) | 2010-05-20 | 2010-05-20 | Método de pronóstico y diagnóstico de la estenosis aórtica que comprende la alfa-1-antiquimiotripsina como marcador. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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ES2370671A1 true ES2370671A1 (es) | 2011-12-21 |
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Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
GIL-DONES F. et al "Valvular aortic stenosis: a proteomic insight" Clinical Medicine Insight: Cardiology (4 febrero 2010) vol. 4; páginas 1-7; DOI 10.4137/CMC.S3884; todo el documento. * |
IMAI K. et al "C-Reactive protein predicts severity, progression and prognosis of asymptomatic aortic valve stenosis" American Heart Journal (octubre 2008) vol. 156; Nº 4; páginas 713-718; DOI 10.1016/j.ahj.2008.04.011; todo el documento. * |
LIM P. et al "Predictors of outcome in patients with severe aortic stenosis and normal left ventricular function: role of B-type natriuretic peptide" European Heart Journal (2004) vol. 25; Nº: 22; páginas 2048-2053; DOI 10.1016/j.ehj.2004.09.033; todo el documento. * |
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