ES2394152T3 - Huella proteómica para el diagnóstico de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y/o esteatosis - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para discriminar entre pacientes que padecen EHNA o esteatosis y pacientes que padecen otros tipos de enfermedades hepáticas, que comprende: a) detectar y cuantificar en una muestra de dicho sujeto los niveles de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y b) comparar los resultados obtenidos en el paso a) con valores de referencia de los niveles de dichas 10 proteínas o de los genes que codifican dichas proteínas, en donde, (i) si los niveles de las proteínas antitrombina III y factor citosólico 2 de neutrófilos o de los genes que codifican dichas proteínas son menores que los valores de referencia para cada una de dicha proteína, o gen y (ii) si los niveles de las proteínas glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y variantes son mayores que los valores de 20 referencia para cada una de dichas proteínas, o genes entonces el sujeto padece EHNA o esteatosis.

Description

Huella proteómica para el diagnóstico de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y/o esteatosis

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la farmacoproteómica y, más en particular, a una firma proteómica formada por una colección de biomarcadores para la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) y/o esteatosis. Dichos biomarcadores se pueden usar en métodos para diagnosticar EHNA y/o esteatosis, más específicamente para el diagnóstico temprano de EHNA y/o esteatosis, así como en métodos para determinar la predisposición de un sujeto a desarrollar EHNA y/o esteatosis, y para seguir el efecto de la terapia administrada a dicho sujeto con dichas afecciones.

Antecedentes de la invención

Los países occidentales representan una población de más de 200 millones de personas que padecen obesidad, por tanto considerados en riesgo de desarrollar una enfermedad hepática grasa no alcohólica (EHGNA). EHGNA es un término clinicopatológico que incluye trastornos que varían desde la simple acumulación de triglicéridos en los hepatocitos (esteatosis hepática) a la esteatosis hepática con inflamación (esteatohepatitis no alcohólica o EHNA).

El hígado graso, también denominado esteatosis hepática, se define como una acumulación excesiva de grasa en los hepatocitos. La esteatosis hepática implica la acumulación de triglicéridos en los hepatocitos, necrosis de hepatocitos, inflamación, obstrucción de pequeñas venas hepáticas y con frecuencia fibrosis con algunas veces evolución a cirrosis, cáncer hepatocelular y muerte de origen hepático (El-Serag H B, et al. Gastroenterology 2004;

126: 460-468, Dam-Larsen S, et al. Gut 2004; 53: 750-5).

La prevalencia mundial de la esteatosis hepática es muy alta, se asocia con varios factores tales como alcohol, diabetes, sobrepeso, hiperlipidemia, resistencia a insulina, hepatitis C de genotipo 3, abetalipoproteinemia y algunos fármacos (Bellentani S, et al. Ann. Intern. Med. 2000; 132: 112-7; Levitsky J, Mailliard M E. Semin. Liver Dis. 2004;

24: 233-47). Sin embargo, no hay recomendación estándar para el diagnóstico de la esteatosis hepática. La recomendación normal es medir GGT y ALT y realizar biopsia de hígado para la clasificación y determinación de fases (Bellentani S, et al. Ann. Intern. Med. 2000; 132: 112-7; Levitsky J, Mailliard M E. Semin. Liver Dis. 2004; 24: 233-47; Bravo A A, et al. N. Engl. J. Med. 2001: 344; 495-500). Puesto que la biopsia hepática todavía es un procedimiento invasivo y caro, con errores potenciales de muestreo, es ventajoso tener una prueba que de un buen valor predictivo del nivel de esteatosis hepática en un sujeto.

La solicitud de patente internacional WO2006/082500 divulga un método para el diagnóstico de la esteatosis hepática en un sujeto, que comprende estudiar 5 marcadores bioquímicos midiendo los valores de sus concentraciones en el suero o plasma de dicho sujeto. Dichos marcadores son: ApoA1 (apolipoproteína A1), alfa.2macroglobulina, ALT (alanina aminotransferasa), GGT (gamma glutamil transpeptidasa) y triglicéridos.

La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es una enfermedad progresiva del hígado de etiología desconocida caracterizada histológicamente por la acumulación de ácidos grasos, daño a los hepatocitos e inflamación que recuerda a la hepatitis alcohólica. EHNA es una fase crítica en el proceso que abarca desde la esteatosis hepática a la cirrosis e insuficiencia hepática. Unos antecedentes cuidadosos de la falta de ingesta de alcohol es esencial para establecer este diagnóstico. EHNA es una de las causas más comunes de aminotransferasas elevadas en sujetos remitidos para evaluación a los hepatólogos. La obesidad y la diabetes de tipo 2 están asociadas a EHNA. Dado que la prevalencia de estas enfermedades está en aumento, también se espera que la prevalencia de EHNA aumente y por lo tanto, esta enfermedad se ha convertido en un tema publico emergente en los Estados Unidos así como en otros países.

Se cree que EHNA surge de la interacción de muchos genes diferentes y factores del estilo de vida. La evaluación inicial de sujetos que se sospecha que padecen EHNA cuando están presentes, son fatiga y molestias en la zona abdominal superior derecha. La biopsia hepática está indicada en sujetos sintomáticos con aumentos en las aminotransferasas en suero de más de 6 meses de duración. Las características histológicas de EHNA, que son en la mayor parte indistinguibles de las de la hepatitis alcohólica, incluyen infiltración grasa macrovesicular, necrosis hepatocelular y degeneración por hinchamiento, hialina alcohólica y reacción inflamatoria.

Como es cierto para otras enfermedades complejas, los factores genéticos que contribuyen al desarrollo de EHNA se pueden identificar más fácilmente combinando estudios en sujetos con EHNA y en modelos animales de la enfermedad. Uno de estos modelos es el ratón deficiente en MAT1A (MAT1A-KO). Aproximadamente a la edad de 3 meses, los hígados de MAT1A-KO tienen histología normal pero son más sensibles a desarrollar esteatosis grave. Estos ratones desarrollan de forma espontánea EHNA y carcinoma hepatocelular aproximadamente a los 8 y 15 meses de edad, respectivamente [Lu SC, 2001, PNAS USA 98, 5560-5565]. El gen MAT1A codifica metionina adenosiltransferasa I y III, las principales enzimas responsables de la síntesis de S-adenosilmetionina (SAMe) en el hígado. Estudios anteriores concluyeron que los sujetos con cirrosis hepática y hepatitis alcohólica son deficientes en la síntesis de SAMe; y que el tratamiento con SAMe mejora la supervivencia en sujetos con cirrosis hepática alcohólica.

La solicitud de patente internacional WO2008/021192 divulga un método para el diagnóstico, evaluación de la gravedad y/o evaluación de la progresión o regresión de un trastorno de hígado en un sujeto, tal como esteatosis hepática o EHNA. El método comprende determinar una cantidad de uno o más metabolitos lipídicos en muestras de un líquido corporal de un sujeto y correlacionar la(s) cantidad(es) de uno o más metabolitos lipídicos con la presencia del trastorno hepático.

El documento US 6631330 divulga conjuntos de marcadores, métodos y kits para diagnosticar y seguir la fibrosis hepática y/o la presencia de lesiones necroinflamatorias hepáticas en un paciente. Dicho método implica el estudio de al menos 4 marcadores bioquímicos seleccionados de α2-macroglobulina, AST (aspartato aminotransferasa), ALT (alanina aminotransferasa), GGT (gammaglutamil transpeptidasa), γ-globulina, bilirrubina total, albúmina, α1globulina, α2-globulina, apoA1, IL-10, TGF-β1, Apo2 y apoB. Sin embargo, dicho documento no divulga marcadores útiles para el diagnóstico específico de EHNA.

Poynard Thierry y col. (Poynard Thierry et al., BMC Gastroenterology. 2006; 6(1):34) divulga un método de diagnóstico de EHNA/esteatosis que combina 13 parámetros: edad, sexo, altura, peso y niveles en suero de triglicéridos, colesterol, alfa 2 macroglobulina, apolipoproteína A1, haptoglobina, gamma-glutamil-transpeptidasa, transaminasas ALT, AST y bilirrubina total. Dicho método permite la discriminación entre pacientes que tienen EHNA y los que tienen esteatosis pero no EHNA. Sin embargo, dicho método no permite discriminar entre EHNA/esteatosis y otras enfermedades hepáticas.

El documento US 2007/037221 divulga marcadores y métodos para diagnosticar una patología hepática incluyendo hepatitis e hígado graso/esteatosis. El método divulgado en este documento se basa en la cuantificación de la glicosilación en proteínas marcadoras y la comparación de los valores obtenidos para la glicosilación de tales proteínas con valores de referencia en sujetos con y/o sin patologías hepáticas.

Santos-Gonzalez y col. (Santos-Gonzalez et al., Experimental Gerontology, 2007, 42 (8):798-806) divulga que la alimentación de ratas con una dieta basada en coenzima 010 produce una expresión diferencial de hemopexina, apolipoproteína H, cadena pesada del inter-α-inhibidor H4P, preprohaptoglobina, precursor de la cadena gamma del fibrinógeno, proteína similar a fetuina, precursor de α-1-antitripsina, peroxirredoxina de tipo II, inhibidor 3 de serina proteasa, proteína de unión a vitamina D y ApoAl en plasma.

La solicitud de patente internacional WO2004/055520 divulga un método de diagnóstico de la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) usando marcadores moleculares. El método consiste en detectar y cuantificar, in vitro en una muestra de tejido hepático, los niveles de una proteína que se puede usar como un marcador molecular de EHNA y que se selecciona de apolipoproteína A1, subunidad beta de la ATPasa mitocondrial, leucotrieno A4 hidrolasa, queratina 18, guanidina acetato N-metiltransferasa, superoxido dismutasa, albúmina, proteína antioxidante 2 (isoforma 1), prohibitina 1, metionina adenosil transferasa, deshidrogenasa de acil CoA de cadena larga, proteína que se une a selenio, proteína antioxidante 2 (isoforma 2), y combinaciones de las mismas. La invención consiste además en comparar los resultados obtenidos con los valores normales de dichas proteínas en tejido hepático sano. Dicho método se puede usar para diagnosticar EHNA y/o para evaluar el riesgo potencial de un sujeto a desarrollar EHNA. Sin embargo, este método comprende una biopsia hepática y ningún estudio ha demostrado que se pueda usar un único o un panel de biomarcadores como una alternativa a la biopsia hepática para el diagnóstico de EHNA.

Existe, por lo tanto, una necesidad de desarrollar un método de diagnóstico que de un buen valor predictivo del alcance de la esteatosis hepática y/o EHNA en un sujeto, y que fuera lo suficientemente fiable para reducir la necesidad de biopsia hepática.

Compendio de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para discriminar entre pacientes que padecen EHNA o esteatosis y pacientes que padecen otros tipos de enfermedades hepáticas, que comprende:

a) detectar y cuantificar en una muestra de dicho sujeto los niveles de antitrombina III, factor citosólico 2 de

neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I

del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas

proteínas y

b) comparar los resultados obtenidos en el paso a) con valores de referencia de dichas proteínas o de los

genes que codifican dichas proteínas,

en donde,

(i)

si los niveles de las proteínas antitrombina III y factor citosólico 2 de neutrófilos, o de los genes que codifican dichas proteínas son menores que los valores de referencia para cada una de dicha proteína, o gen y

(ii)

si los niveles de las proteínas glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteínas, o genes,

entonces el sujeto padece EHNA o esteatosis.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto que padece EHNA o esteatosis, que comprende:

a) detectar y cuantificar los niveles de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa

3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1

haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y

b) comparar los resultados obtenidos en el paso (a) con valores de referencia de dichas proteínas, o genes

que codifican dichas proteínas,

en donde

(i)

si los niveles de las proteínas antitrombina III y factor citosólico 2 de neutrófilos, o de los genes que codifican dichas proteínas son mayores que los valores de referencia y

(ii)

si los niveles de las proteínas glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas son menores que los valores de referencia entonces

la terapia administrada a dicho sujeto ha sido eficaz o está siendo eficaz.

En aún otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para identificar biomarcadores específicos de EHNA y/o esteatosis que comprende:

a) eliminar la seroalbúmina (HSA) contenida en una muestra de suero de un sujeto que padece dicha

enfermedad,

b) analizar el perfil de proteínas de la muestra de suero obtenida en el paso (a) y de una muestra,

c) comparar los perfiles de proteínas obtenidos en el paso (b) con un perfil obtenido en condiciones similares

de un sujeto control e

d) identificar aquellas proteínas del perfil obtenido de la muestra del paciente que están presente a niveles

sustancialmente diferentes con respecto al perfil obtenido de la muestra del sujeto control

en donde las proteínas identificadas en el paso (d) se identifican como biomarcadores específicos de EHNA y/o esteatosis.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende un conjunto de reactivos, en donde dicho conjunto consiste en reactivos para detectar las proteínas antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma, o los genes que codifican dichas proteínas y, opcionalmente, un reactivo para detectar una proteína de mantenimiento o el gen que codifica dicha proteína de mantenimiento.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa un diagrama esquemático del proceso de eliminación e imágenes que muestran una comparación de geles 2D de muestras de suero humano antes (A) y después (B) de la eliminación de la seroalbúmina humana (HSA) por medio de una columna de afinidad. Las cifras en las imágenes de los geles indican la posición de varios marcadores como sigue: 1, albúmina, 2, transferrina, 3, hemopexina (β-1B-glicoproteína), 4, α1-antitripsina.

La figura 2 es una fotografía que muestra imágenes de geles 2D obtenidos después de correr la misma muestra de suero de EHNA con HSA eliminada en tres experimentos independientes.

La figura 3 es un gráfico que muestra la intensidad relativa de manchas diferenciales (0,67<R<1,5) esteatosis/control (S/C) y EHNA/control (N/C). Una vez que se analizaron las imágenes de geles 2D del control, esteatosis y EHNA, se detectaron 57 manchas diferenciales y se cuantificaron sus valores de intensidad. Los valores se muestran en las figuras. Las barras cuyo nombre de proteína correspondiente está dentro de una caja, corresponden a manchas diferenciales estadísticamente significativas (prueba de la t de Student) con un intervalo de confianza del 95% (p>0,05). El número total de manchas significativamente diferenciales es 20.

La figura 4 muestra 3 ejemplos de análisis por western blot de muestras de suero humanas de E (estatosis), N (EHNA) y C (control) incubadas con anticuerpos específicos para glutatión peroxidasa 3 (panel superior), antitrombina III (panel medio) y factor I del complemento (panel inferior) donde se observa la misma tendencia de regulación positiva o negativa que en la selección estadística del análisis de la imagen de geles 2D.

La figura 5 muestra el espectro de masa por MALDI-TOF de la mancha de proteína que muestra un peso molecular de 52602 Da y que tiene un pI de 5,25 en geles 2D y que corresponde a antitrombina III.

La figura 6 muestra el espectro de masa por MALDI-TOF de la mancha de proteína que muestra un peso molecular de 59761 Da y un pI de 5,35 en geles 2D y que corresponde al factor citosólico 2 de neutrófilos.

La figura 7 muestra el espectro de masa por MALDI-TOF de la mancha de proteína que muestra un peso molecular de 25400 Da y un pI de 5,56 en geles 2D y que corresponde a glutatión peroxidasa 3.

La figura 8 muestra el espectro de masa por MALDI-TOF de la mancha de proteína que muestra un peso molecular de 38600 Da y un pI de 5,38-5,56 y que corresponde a haptoglobina beta.

La figura 9 muestra el espectro de masa por MALDI-TOF de la mancha de proteína que muestra un peso molecular de 11900 Da y un pI de 6,61 y que corresponde a la isoforma básica de la haptoglobina alfa 1.

La figura 10 muestra el espectro de masa por MALDI-TOF de la mancha de proteína que muestra un peso molecular de 16882 Da y un pI de 5,4 y que corresponde a la isoforma ácida de la proteína haptoglobina alfa 2.

La figura 11 muestra el espectro de masa por MALDI-TOF de la mancha de proteína que muestra un peso molecular de 21892 Da y un pI de 5,48 y que corresponde a peroxirredoxina 2.

La figura 12 muestra el espectro de masa por MALDI-TOF de la mancha de proteína que muestra un peso molecular de 65720 Da y un pI de 5,68 y que corresponde al factor I del complemento.

La figura 13 muestra el espectro de masa por MALDI-TOF de la mancha de proteína que muestra un peso molecular de 16140 Da y un pI de 4,71 y que corresponde a la hemoglobina gamma.

La figura 14 muestra el espectro de masa por MALDI-TOF de la mancha de proteína que muestra un peso molecular de 30778 Da y un pI de 5,48 y que corresponde a apolipoproteína AI.

La figura 15 muestra el espectro de masa por MALDI-TOF de la mancha de proteína que muestra un peso molecular de 51512 Da y un pI de 5,03-5,62 y que corresponde a la cadena gamma del fibrinógeno.

Figura 16: Análisis de componentes principales (ACP) de los valores de absorbancia de ELISA. Los datos de ensayos ELISA para 7 proteínas (haptoglobina, factor I del complemento, antitrombina III, apolipoproteína A1, glutatión peroxidasa 3, peroxirredoxina 2 y factor citosólico 2 de neutrófilos) seleccionadas de la lista de 9 biomarcadores candidatos se normalizaron según la concentración de proteína total en suero de cada muestra. Los datos se obtuvieron de muestras de suero de 26 pacientes de EHNA (N) y 69 pacientes de esteatosis con un grado diferente de esteatosis (que variaba de S a S3). Todas las muestras se diagnosticaron por biopsia hepática.

Figura 17: Análisis de componentes principales (ACP) de los valores de absorbancia de ELISA para pacientes femeninas. Los datos de ensayos ELISA para 7 proteínas (las mismas que en la figura 16) se normalizaron según la concentración de proteína total en suero de cada muestra. Los datos se obtuvieron de muestras de suero de 11 pacientes femeninas de EHNA (N) y 41 pacientes femeninas de esteatosis con un grado diferente de esteatosis (que variaba de S a S3).

Figura 18: Análisis de componentes principales (ACP) de los valores de absorbancia de ELISA para pacientes masculinos. Los datos de ensayos ELISA para 7 proteínas (las mismas que en la figura 16) se normalizaron según la concentración de proteína total en suero de cada muestra. Los datos se obtuvieron de muestras de suero de 15 pacientes masculinos de EHNA (N) y 23 pacientes femeninas de esteatosis con un grado diferente de esteatosis (que variaba de S a S3).

Descripción detallada de la invención

Los inventores de la presente invención han descubierto un conjunto nuevo de marcadores moleculares presentes en plasma y/o suero que, de forma sorprendente, permiten detectar y/o diagnosticar no sólo EHNA sino también estatosis y, de forma más importante, permiten discriminar entre pacientes que padecen EHNA o esteatosis y pacientes que padecen otros tipos de enfermedades del hígado tal como hepatitis B, hepatitis C, hepatitis autoinmune o cirrosis biliar primaria. El nuevo conjunto de marcadores moleculares se basa en nueve proteínas que dan lugar a un conjunto de once biomarcadores (de aquí en adelante cada biomarcador se considera como una proteína) que, dependiendo de su nivel de expresión, serán indicativos o no de EHNA y/o esteatosis. El nuevo conjunto de marcadores moleculares comprende las siguientes proteínas: antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica, hemoglobina gamma, apolipoproteína AI y fibrinógeno gamma. Los pesos

5 moleculares de dichas proteínas se muestran en la Tabla 1

Proteína MW (Da) pI

Antitrombina III 52602 5,25

Factor citosólico 2 de neutrófilos 59761 5,35

Glutatión peroxidasa 3 25402 5,56

Haptoglobina cadena completa 45205

38600 5,38-5,56

beta 11900 6,61

alfa 1 (básica) alfa 2 (ácida) 16882 5,4

Peroxirredoxina 2 21892 5,48

Componente 1 del complemento 65720 5,68

Hemoglobina gamma 16140 4,71

Apolipoproteína A1 30778 5,48

Fibrinógeno, cadena gamma 51512 5,03-5,62

Básica y ácida se refiere, respectivamente, a la isoforma básica de la alfa 1 haptoglobina (punto isoeléctrico = 6.61) y a la isoforma ácida de la alfa 2 haptoglobina (punto isoeléctrico = 5.4) ya que ambas cadenas (alfa 1 y alfa 2)

10 presentan varias isoformas diferentes.

Por tanto, la invención se refiere a un método in vitro para discriminar entre pacientes que padecen EHNA o esteatosis y pacientes que padecen otros tipos de enfermedades hepáticas, que comprende:

15 a) detectar y cuantificar en una muestra de dicho sujeto los niveles de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y b) comparar los resultados obtenidos en el paso a) con valores de referencia para los niveles de dichas

20 proteínas o de los genes que codifican dichas proteínas,

en donde,

(i) si los niveles de las proteínas antitrombina III y factor citosólico 2 de neutrófilos o de los genes que

25 codifican dichas proteínas son menores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen y

(ii) si los niveles de las proteínas glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas son mayores que los valores de referencia para cada una de

30 dichas proteínas, o genes

entonces el sujeto padece EHNA o esteatosis.

Además, la invención contempla el uso de cada uno de los polipéptidos mencionados anteriormente como

35 biomarcadores para el diagnóstico de EHNA o para la identificación de sujetos con predisposición a padecer EHNA. Por tanto, la invención contempla métodos in vitro para el diagnóstico de EHNA y/o esteatosis o para la identificación de sujetos que tienen predisposición a desarrollar EHNA y/o esteatosis que comprende determinar los niveles de al menos una proteína o variante de la misma en donde la proteína se selecciona del grupo de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2,

40 factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma en donde

(i)

si los niveles de antitrombina III o de los genes que codifican dicha proteína son menores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(ii)

si los niveles del factor citosólico 2 de neutrófilos o de los genes que codifican dicha proteína son menores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(iii) si los niveles de glutatión peroxidasa 3 o de los genes que codifican dicha proteína son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(iv)

si los niveles de alfa 2 haptoglobina ácida o de los genes que codifican dicha proteína son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(v)

si los niveles de haptoglobina beta o de los genes que codifican dicha proteína son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(vi)

si los niveles de peroxirredoxina-2 o de los genes que codifican dicha proteína son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(vii) si los niveles del factor I del complemento o de los genes que codifican dicha proteína son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(viii) si los niveles de alfa 1 haptoglobina básica o de los genes que codifican dicha proteína son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(ix) si los niveles de hemoglobina gamma o de los genes que codifican dicha proteína son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, variante o gen entonces

el sujeto padece EHNA o esteatosis o tiene predisposición a desarrollar EHNA o esteatosis.

El término “sujeto”, como se usa en el presente documento, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no está restringido a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano hombre o mujer de cualquier edad o raza. Ejemplos ilustrativos, no limitantes de sujetos según el primer método de la invención incluyen sujetos que bien se sospecha que tienen infiltración grasa del hígado, o sujetos con aumentos en suero de las aminotransferasas durante un período de tiempo largo (de más de 6 meses de duración) o sujetos que se sospecha que tienen EHNA y/o esteatosis, o sujetos a los que previamente se ha diagnosticado o no EHNA y/o esteatosis, o sujetos que reciben o han recibido previamente un tratamiento anti-EHNA o un tratamiento anti-esteatosis, o sujetos que tienen tejido con función hepática normal, es decir, un tejido determinado, por el experto en las técnicas médicas, que no tiene evidencia de infiltración grasa del hígado, a menudo acompañado por daño hepatocelular con inflamación. Los métodos para identificar sujetos que se sospecha que tienen EHNA y/o esteatosis pueden incluir exploración física, antecedentes familiares del sujeto, antecedentes del sujeto, biopsia hepática, o un número de tecnologías por imagen tal como ecografía.

El término “EHNA” se refiere a esteatohepatitis no alcohólica. Los métodos de diagnóstico para EHNA y la delineación clínica de los diagnósticos de EHNA son bien conocidos para los expertos en las técnicas médicas.

El término “esteatosis” (también denominado cambio graso, degeneración grasa o degeneración adiposa) se refiere

al proceso que describe la retención anormal de lípidos dentro de una célula.

Las expresiones “niveles de expresión mayores” y “niveles de expresión menores” de una proteína en una muestra

comparada con valores de referencia para dicha proteína, como se usa en el presente documento, se entienden como diferencias estadísticamente significativas en los niveles de expresión de una proteína en la muestra en estudio en comparación con un valor de referencia para los niveles de expresión de dicha proteína. Se entiende que los niveles de expresión en la proteína son mayores que un valor de referencia para dicha proteína si las diferencias en los niveles de expresión son de al menos el 5%, el 10% o el 20%, más preferido al menos el 50% o puede incluso ser tan alto como el 75% o el 100% del valor de referencia. Más preferido la diferencia en el nivel de expresión es al menos del 200%, es decir, dos veces, al menos el 500%, es decir, cinco veces, o al menos el 1000%, es decir 10 veces en la muestra a ensayar cuando se compara con el valor de referencia.

De forma similar, se entiende que los niveles de expresión de la proteína en estudio son menores que los valores de referencia para dicha proteína si los niveles de expresión de la proteína en estudio son al menos el 5%, el 10% o el 20%, más preferido al menos el 50% o puede incluso ser tan bajo como el 75% o el 100% del valor de referencia. Más preferido la diferencia en el nivel de expresión es al menos del 200%, es decir, dos veces, al menos el 500%, es decir, cinco veces, o al menos el 1000%, es decir 10 veces menores en la muestra a ensayar cuando se compara con el valor de referencia.

La determinación de los niveles de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichos polipéptidos permite la discriminación de pacientes que padecen EHNA o esteatosis de pacientes que sufren otras enfermedades hepáticas (por ejemplo, hepatitis A, hepatitis C, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune o síndrome de Wilson) pero no permite discriminar adicionalmente pacientes de EHNA de pacientes de esteatosis. Para este fin, la firma se debe complementar con un biomarcador adicional. En particular, los inventores también han descubierto que la apolipoproteína A1 es una proteína adicional expresada diferencialmente que, cuando se combina con el resto de los marcadores, permite el diagnóstico de esteatosis sin dar a los pacientes de EHNA falsos positivos. Además, los inventores también han descubierto que el fibrinógeno gamma es una proteína adicional expresada diferencialmente que, cuando se combina con el resto de los marcadores, permite el diagnóstico de EHNA sin dar a los pacientes de esteatosis falsos positivos.

Por tanto, en una forma de realización particular, el primer método de la invención comprende además detectar y cuantificar la proteína apolipoproteína A1, o el gen que codifica dicha proteína, en donde si la proteína apolipoproteína A1, o el gen que codifica dicha proteína, está disminuido comparado con los valores de referencia, entonces el sujeto padece, o tiene predisposición a desarrollar esteatosis.

Asimismo, en otra forma de realización particular, el primer método de la invención comprende además detectar y cuantificar la proteína fibrinógeno gamma, o el gen que codifica dicha proteína, en donde si la proteína fibrinógeno gamma, o el gen que codifica dicha proteína, está disminuido comparado con los valores de referencia, entonces el sujeto padece, o tiene predisposición a desarrollar EHNA.

Además, los biomarcadores adicionales que permiten discriminar entre EHNA y esteatosis también se pueden usar como biomarcadores aislados para el diagnóstico de EHNA/esteatosis o para la identificación de sujetos con predisposición a padecer EHNA/esteatosis. Por tanto, la invención contempla métodos in vitro para el diagnóstico de EHNA y/o esteatosis o para la identificación de sujetos que tienen predisposición a desarrollar EHNA y/o esteatosis que comprende determinar los niveles de al menos una proteína o variante de la misma en donde la proteína se selecciona del grupo de apolipoproteína A1 y fibrinógeno gamma en donde

(i)

si los niveles de apolipoproteína A1 o de los genes que codifican dicha proteína son menores que los valores de referencia para dicha proteína o gen entonces el sujeto padece esteatosis o tiene predisposición a desarrollar estatosis o

(ii)

si los niveles de fibrinógeno gamma o de los genes que codifican dicha proteína son menores que los valores de referencia para dicha proteína o gen entonces el sujeto padece EHNA o tiene predisposición a desarrollar EHNA.

Como se sabe en la técnica la “similitud” entre dos proteínas se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos sustitutos conservados de una proteína a la secuencia de una segunda proteína. El grado de identidad entre dos proteínas se determina usando algoritmos y métodos informáticos que son ampliamente conocidos para el experto en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente usando el algoritmo BLASTP [BLASTManual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].

Las proteínas de la invención pueden estar modificadas postraduccionalmente. Por ejemplo, las modificaciones postraduccionales que están en el ámbito de la presente invención incluyen corte de péptido señal, glicosilación, acetilación, isoprenilación, proteolisis, miristoilación, plegamiento de proteínas y procesamiento proteolítico, etc. Además, las proteínas pueden incluir aminoácidos no naturales formados mediante modificación postraduccional o introduciendo aminoácidos no naturales durante la traducción.

En el contexto de la presente invención, la expresión de una proteína o de un gen que codifica dicha proteína está “regulada por descenso” cuando el nivel de expresión de dicha proteína o gen disminuye comparado con valores de referencia.

En el contexto de la presente invención, la expresión de una proteína o de un gen que codifica dicha proteína está “regulada por aumento” cuando el nivel de expresión de dicha proteína o gen aumenta comparado con valores de referencia.

En el contexto del primer método de la invención, se entiende “valores de referencia” como valores del nivel de las mismas proteínas (o de los genes que codifican dichas proteínas) en muestras biológicas de sujetos control, esto es, sujetos sanos o sujetos sin antecedentes clínicos de enfermedad hepática grasa no alcohólica (EHGNA). Además, los autores de la presente invención también han observado que la firma de biomarcadores descrita en el presente documento permite la discriminación entre esteatosis y EHNA y otras enfermedades hepáticas. Por tanto, también se pueden usar muestras de pacientes que padecen dichas otras enfermedades hepáticas (hepatitis C, hepatitis B, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune y síndrome de Wilson) como muestras control para obtener valores de referencia para comparar con los valores de los pacientes en estudio.

Para llevar a cabo el primer método de la invención, se obtiene una muestra del sujeto en estudio. El término “muestra” como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra que se puede obtener del paciente. El método presente se puede aplicar a cualquier tipo de muestra biológica de un sujeto, tal como una muestra de biopsia, tejido (tejido hepático), célula o fluido (suero, saliva, semen, esputo, líquido cefalorraquídeo (LCR), lágrimas, moco, sudor, leche, extractos de cerebro y similares).

En una forma de realización particular, la muestra es suero o plasma que se puede obtener por métodos convencionales. En otra forma de realización particular, la muestra es suero o plasma con HSA eliminada. El plasma o suero se puede utilizar directamente para la identificación de los niveles de expresión de las proteínas, o se extrae el ácido nucleico de dicho plasma o suero para determinar los niveles de expresión de los genes que codifican dichas proteínas.

La determinación de los niveles de expresión de las proteínas se puede llevar a cabo mediante técnicas inmunológicas tales como por ejemplo, ELISA, western blot o inmunofluorescencia. El western blot se basa en la detección de proteínas previamente separadas mediante electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes e inmovilizadas en una membrana, generalmente nitrocelulosa mediante la incubación con un anticuerpo específico y un sistema de revelado (por ejemplo, quimioluminiscencia). El análisis mediante inmunofluorescencia requiere el uso de un anticuerpo específico para la proteína diana para el análisis de la expresión. El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con enzimas de modo que los conjugados formados entre el antígeno diana y el anticuerpo marcado dan como resultado la formación de complejos enzimáticamente activos. Puesto que uno de los componentes (el antígeno o el anticuerpo marcado) están inmovilizados sobre un soporte, los complejos antígenoanticuerpo están inmovilizados sobre el soporte y de esta manera, se pueden detectar mediante la adición de un sustrato que es convertido por la enzima en un producto que es detectable mediante, por ejemplo, espectrofotometría o fluorometría. Por tanto, en una forma de realización preferida, las proteínas se detectan mediante western blot, ELISA, una matriz de proteínas o una electroforesis bidimensional. El experto en la materia apreciará que, si las proteínas que forman la firma específica de EHNA o esteatosis se van a detectar mediante electroforesis bidimensional, el gel bidimensional se debe teñir para detectar los polipéptidos. Se puede usar cualquier método de tinción que sea lo suficientemente sensible para detectar las proteínas que forman la firma e incluye, sin limitación, tinción con plata, tinción con azul de Coomassie, tinción con Spyro Ruby, tinción con colorantes de escuarilio, tinción con colorantes fluorescentes de cianina como se describe en Mujumdar, R. B. et al., (Cytometry, 1989, 10:11-19 y documento US5268486), tinción con colorantes de difluoruro de boro dipirrometeno como se describe en el documento US4774339 y similares.

Una vez que se identifican las manchas que muestran diferencias estadísticamente significativas entre las dos condiciones, las proteínas que forman la firma se identifican en base a sus pesos moleculares y su punto isoeléctrico. La identidad de las manchas de proteínas encontradas en el gel bidimensional se puede confirmar cortando la mancha, realizando una digestión en el gel y una posterior espectrometría de masas. Los niveles de las proteínas en las manchas seleccionadas se pueden cuantificar usando cualquier técnica conocida tal como densitometría de los geles teñidos y determinación de volumen (intensidad x altura), electroforesis diferencial en gel (DIGE) en donde las proteínas que se van a separar se marcan con fluoróforos antes de su fraccionamiento electroforético y se mezclan después con un patrón interno que representa todas las proteínas en la muestra y que se puede usar para fines de normalización.

Las regiones de los geles donde se encuentra la proteína que se expresa diferencialmente se pueden cortar y confirmar la identidad de la mancha de proteína mediante secuenciación directa usando técnicas tales como determinación directa de la masa (MALI-MS) o secuenciación en escalera de péptidos (MALDI-MS/ESI-MS). De forma alternativa, las manchas de proteínas se pueden digerir con cualquier proteasa adecuada o reactivo químico e identificar los péptidos resultantes usando una técnica seleccionada de nano-espray ESI-MS/MS, perfil de masa de péptidos mediante ESI-MS, perfil de masa de péptidos mediante MALDI-MS, secuenciación interna mediante degradación de Edman o secuenciación N-terminal. También se pueden analizar las mezclas de proteínas sin separación previa. Estos procedimientos empiezan con la digestión proteolítica de las proteínas en una mezcla compleja. Los péptidos resultantes con frecuencia se inyectan en una columna de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) que separa péptidos en base a la hidrofobicidad. El HPLC se puede acoplar directamente a un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo usando ionización de electrospray. Los péptidos que eluyen de la columna se pueden identificar mediante espectrometría de masa en tándem (MS/MS). Se puede usar el marcaje con etiquetas de isótopos para comparar cuantitativamente la concentración de proteínas entre dos o más muestras de proteínas.

En una forma de realización preferida, el análisis de la muestra de proteínas se lleva a cabo mediante digestión tríptica en el gel seguida por MALDI-TOF.

Cuando se usa un método inmunológico, se puede usar cualquier anticuerpo o reactivo que se sabe se une a las proteínas diana con alta afinidad para detectar la cantidad de proteínas diana. Se prefiere sin embargo el uso de un anticuerpo, por ejemplo sueros policlonales, sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos monoclonales, fragmentos

de anticuerpos, Fv, Fab, Fab’ y F(ab’)2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados.

Por otra parte, la determinación de los niveles de expresión de proteína se puede llevar a cabo construyendo una micromatriz de tejidos (TMA) que contiene las muestras del sujeto ensambladas, y determinar los niveles de expresión de las proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica bien conocidas en el estado de la técnica.

De forma alternativa, el primer método de la invención se puede poner en práctica determinando los niveles de expresión de los genes que codifican las proteínas citadas o las variantes de las mismas. La determinación de los niveles de expresión de un gen se puede llevar a cabo midiendo los niveles de expresión del ARNm de dicho gen. Para este fin, la muestra se puede tratar para disgregar de forma física o mecánica la estructura del tejido o célula, para liberar los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica para preparar los ácidos nucleicos para análisis adicional. Los ácidos nucleicos se extraen de la muestra mediante procedimientos que conoce el experto en la materia y disponibles comercialmente. El ARN se extrae después a partir de muestras congeladas o recientes mediante cualquiera de los métodos típicos en la técnica [Sambrook, J., et al., 2001 Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3]. Preferiblemente, se tiene cuidado para evitar la degradación del ARN durante el proceso de extracción.

El nivel de expresión se puede determinar usando el ARNm obtenido de una muestra de tejido fijada en formalina, embebida en parafina. El ARNm se puede aislar de una muestra patológica de archivo o una muestra de biopsia que primero se desparafiniza. Un método de desparafinización de ejemplo implica lavar la muestra en parafina con un solvente orgánico, tal como xileno, por ejemplo. Las muestras desparafinizadas se pueden rehidratar con una solución acuosa de un alcohol inferior. Los alcoholes inferiores adecuados, incluyen por ejemplo, metanol, etanol, propanoles y butanoles. Las muestras desparafinizadas se pueden rehidratar con lavados sucesivos con soluciones de alcoholes inferiores de concentración decreciente, por ejemplo. De forma alternativa, la muestra se desparafiniza y rehidrata simultáneamente. La muestra se lisa después y se extrae el ARN de la muestra.

Mientras que todas las técnicas de determinación del perfil de expresión génica (RT-PCR, SAGE, o TaqMan) son adecuadas para el uso al realizar los métodos anteriores de la invención, los niveles de expresión de ARNm de los genes se determinan con frecuencia mediante transcripción inversa- reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR).

En el contexto de la presente invención, el conjunto de biomarcadores divulgado en el presente documento se puede usar para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto que padece EHNA y/o esteatosis que ha recibido previamente tratamiento anti-EHNA y/o tratamiento anti-esteatosis.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro (de aquí en adelante segundo método de la invención) para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto que padece EHNA o esteatosis, que comprende:

a) detectar y cuantificar los niveles de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa

3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1

haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y

b) comparar los resultados obtenidos en el paso (a) con valores de referencia para los niveles de dichas

proteínas o genes que codifican dichas proteínas,

en donde

(a)

si los niveles de las proteínas antitrombina III y factor citosólico 2 de neutrófilos o de los genes que codifican dichas proteínas son mayores que los valores de referencia y

(b)

si los niveles de las proteínas glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas son menores que los valores de referencia entonces

la terapia administrada a dicho sujeto ha sido eficaz o está siendo eficaz.

El experto en la materia apreciará que los valores de referencia, como se entiende en el contexto del segundo método de la invención, se refiere a valores de los niveles de expresión de las diferentes proteínas, o los genes que codifican dichas proteínas en un sujeto que padece EHNA o esteatosis y que ha sido tratado con un compuesto control o que no ha sido tratado.

En una forma de realización particular, el segundo método de la invención comprende además detectar y cuantificar la proteína apolipoproteína A1 o el gen que codifica dicha proteína, en donde si la proteína apolipoproteína A1 o el gen que codifica dicha proteína, disminuye en comparación con los valores de referencia, entonces la terapia administrada a dicho sujeto no a sido eficaz o no está siendo eficaz para el tratamiento de la esteatosis.

En otra forma de realización particular, el segundo método de la invención comprende además detectar y cuantificar la proteína fibrinógeno gamma o el gen que codifica dicha proteína, en donde si la proteína fibrinógeno gamma o el gen que codifica dicha proteína, disminuye en comparación con los valores de referencia, entonces la terapia administrada a dicho sujeto no a sido eficaz o no está siendo eficaz para el tratamiento de EHNA.

Además, la invención contempla el uso de cada uno de los diferentes marcadores para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto que padece EHNA o esteatosis. Por tanto, la invención contempla métodos in vitro para seguir el efecto de una terapia administrada a un sujeto que padece EHNA o esteatosis que comprende determinar los niveles de al menos una proteína en donde la proteína se selecciona del grupo de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma en donde

(i)

si los niveles de antitrombina III o de los genes que codifican dicha proteína son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(ii)

si los niveles del factor citosólico 2 de neutrófilos o de los genes que codifican dicha proteína son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(iii) si los niveles de glutatión peroxidasa 3 o de los genes que codifican dicha proteína son menores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(iv)

si los niveles de alfa 2 haptoglobina ácida o de los genes que codifican dicha proteína son menores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(v)

si los niveles de haptoglobina beta ácida o de los genes que codifican dichas proteína son menores que los valores de referencia para cada una de dicha proteína, o gen o

(vi)

si los niveles de peroxirredoxina-2 o de los genes que codifican dicha proteína son menores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(vii) si los niveles del factor I del complemento o de los genes que codifican dicha proteína son menores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(viii) si los niveles de alfa 1 haptoglobina básica o de los genes que codifican dicha proteína son menores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen o

(ix) si los niveles de hemoglobina gamma o de los genes que codifican dicha proteína son menores que los valores de referencia para cada una de dichas proteína, o gen entonces

la terapia administrada a dicho sujeto ha sido eficaz o está siendo eficaz. Los “valores de referencia” corresponden a los de los niveles de expresión de pacientes que padecen EHNA o esteatosis y que no han sido tratados o han sido tratados con placebo.

Los términos “EHNA”, “esteatosis”, “muestra”, “sujeto”, “regulado por disminución” y “regulado por aumento” ya se han definido y se pueden aplicar al presente método.

En una forma de realización particular del segundo método de la invención, la muestra es suero o plasma, preferiblemente suero o plasma donde se ha eliminado HSA.

En el contexto del segundo método de la invención, “valores de referencia” se entiende como los niveles de las

proteínas según la invención (o los genes que codifican dichas proteínas) en una muestra biológica de un sujeto que padece EHNA y/o esteatosis que ha recibido previamente tratamiento anti-EHNA o tratamiento anti-esteatosis.

Como entiende el experto en la materia, todos los métodos y técnicas citados previamente para determinar los niveles de expresión de proteínas y genes también se pueden usar en el segundo método de la invención.

En otra forma de realización particular, la detección de proteínas se lleva a cabo mediante western blot, ELISA, una matriz de proteínas o electroforesis bidimensional.

También se divulga un método in vitro para identificar biomarcadores específicos de EHNA o esteatosis que comprende:

a) eliminar la seroalbúmina humana (HSA) contenida en una muestra de suero de un sujeto que padece dicha

enfermedad,

b) analizar la composición de proteínas de la muestra de suero obtenida en el paso (a),

c) comparar la composición de proteínas obtenida en el paso (b) con la composición de proteínas obtenida de

un sujeto control, y

d) identificar aquellas proteínas que se expresan en la composición de proteínas obtenida en el paso (b) a

diferentes niveles que en la composición de proteínas obtenida del sujeto control,

en donde las proteínas identificadas son biomarcadores específicos de EHNA o esteatosis.

En el paso (a), el método comprende eliminar la HSA del suero. Una estrategia clásica de eliminación para albúmina implica el uso del colorante hidrofóbico azul de Cibacron, un colorante de clorotriacina que tiene alta afinidad por la albúmina, aunque usar ligandos de anticuerpos de afinidad para HSA produce una eliminación más específica comparada con el método tradicional de eliminación con azul de Cibacron. Los medios de afinidad están hechos de matrices con anticuerpos para la proteína específica unidos covalentemente. Los medios de inmunoafinidad para la eliminación de HSA están disponibles comercialmente, empaquetados como columnas de centrifugación que son compatibles con la centrifugación. Por otra parte, existen kits comercialmente disponibles para la eliminación de HSA de muestras de suero y plasma, tal como el kit Vivapure anti-HSA de Sartorius, Gotinga, Alemania.

En el paso (b), el método comprende analizar la composición de proteínas de la muestra de suero del sujeto de la que se ha eliminado HSA. Como entiende el experto en la materia, se pueden usar múltiples aproximaciones para identificar la composición de proteínas de una muestra y, en particular, del suero. En un método posible se divulga que las proteínas de la muestra de la que se ha eliminado HSA se fraccionan usando electroforesis en gel. En otro método se divulga que la electroforesis en gel es una electroforesis en gel bidimensional. Otros métodos para la caracterización de las proteínas presentes en una muestra de proteínas implican la huella peptídica (PMF) es una técnica de identificación de proteínas sensible que comprara las masas de péptidos obtenidos experimentalmente con digeridos teóricos de las proteínas disponibles en las bases de datos. Más recientemente, se ha desarrollado la

tecnología de identificación multidimensional de proteínas (MUDPIT) o “shotgun proteomics”. Esta técnica difiere de

PMF en que se digiere la muestra entera antes de la separación y se procesa la mezcla de péptidos resultante usando cromatografía líquida en 2D y espectrofotometría de masas en tándem (MS/MS). Las secuencias de péptidos se predicen a partir de los espectros de masa de disociación inducida por colisión (CID) observados mediante comparación con bases de datos publicadas. Se divulga que primero se somete el suero a una electroforesis (por ejemplo, electroforesis bidimensional) para separar las proteínas y después se identifican las proteínas usando un espectrofotómetro de masas (véase el ejemplo 1). Los métodos y condiciones para llevar a cabo la electroforesis y la técnica de espectrofotometría de masas son ampliamente conocidas del estado de la técnica.

Una vez que se conoce la composición de proteínas del suero, el paso (c) comprende comparar el perfil de proteínas obtenido en el paso (b) con el perfil de proteínas obtenido de un sujeto control en condiciones similares (es decir, preferiblemente con eliminación de seroalbúmina en paralelo con la muestra a ensayar). En el contexto del método anterior, un “sujeto control” se entiende como un sujeto sano o un sujeto sin antecedentes clínicos de EHNA y/o esteatosis. El paso de comparación se puede llevar a cabo mediante inspección visual de los diferentes perfiles de proteínas. De forma alternativa, si el perfil de proteínas se ha obtenido mediante electroforesis en gel bidimensional, los perfiles de proteínas se pueden comparar usando el software PDQuest.

Por último, el paso (d) del método divulgado incluye la identificación de las proteínas que se expresan diferencialmente entre los perfiles obtenidos en la muestra a ensayar y los perfiles de proteínas de la muestra control. La identificación de esas proteínas que se expresan diferencialmente en la muestra de EHNA/esteatosis con respecto a la muestra control se lleva a cabo usando técnicas estándar e incluye tanto secuenciación directa del Nterminal como por degradación de Edman o espectrometría de masas de una digestión proteolítica de la proteína. La proteína se puede digerir con un proteasa o reactivo químico de elección directamente en el gel o se puede electroeluir y después digerir en un tubo de ensayo. Los péptidos que resultan de la digestión se pueden analizar directamente mediante diferentes técnicas de espectrometría de masas (MALDI-TOF o ESI-MS). De forma alternativa, si la complejidad de la mezcla de péptidos no permite el análisis directo por espectrometría de masas, es posible separar los péptidos usando técnicas convencionales. Las técnicas de separación adecuadas, que permiten la separación de una muestra compleja de péptidos en múltiples fracciones, las conoce el experto en la materia e incluyen, pero no están limitadas a isoelectroenfoque, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, HPLC de fase reversa, cromatografía de fase reversa de pares de iones, cromatografía de afinidad y similares. Aunque adecuadas en principio, las técnicas como SDS PAGE, electroforesis en geles bidimensionales, cromatografía de exclusión por tamaño son menos apropiadas apara la separación de péptidos de longitud generalmente limitada.

Se han descrito varias tecnologías para separar digeridos peptídicos mediante cromatografía líquida, incluyendo (RP)-HPLC de fase reversa, y cromatografía líquida bidimensional. Para muestras de péptidos obtenidos de digestiones proteolíticas, los planteamientos de 2D-LC son particularmente adecuados para la separación, proporcionando también ventajas significativas con respecto a la automatización y rendimiento. También la electroforesis capilar (CE) es un método adecuado para la separación de péptidos. 2D-LC usa generalmente columnas de intercambio iónico (normalmente, intercambio catiónico fuerte, SCX) acopladas en serie con la columna de fase reversa, operado en una serie de ciclos. En cada ciclo se aumenta la concentración de sal en la columna de intercambio iónico, para eluir los péptidos según su carga iónica en el sistema de fase reversa. En el presente documento, los péptidos se separan por hidrofobicidad mediante por ejemplo, un gradiente con CH3CN.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit útil en la ejecución de la metodología descrita en el presente documento. Por tanto, dicho kit comprende un conjunto de reactivos para detectar los niveles de expresión de todas

o genes que codifican dichas proteínas según la invención, en donde dicho conjunto consiste en reactivos para detectar las proteínas antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o los genes que codifican dichas proteínas y, opcionalmente, un reactivo para detectar una proteína de mantenimiento o el gen que codifica dicha proteína de mantenimiento.

En una forma de realización particular, el conjunto de reactivos consiste además en un reactivo para detectar la proteína apolipoproteína A1 o el gen que codifica dicha proteína. En otra forma de realización particular, el conjunto de reactivos consiste además en un reactivo para detectar la proteína fibrinógeno gamma o el gen que codifica dicha proteína.

En otra forma de realización particular, los reactivos para detectar las proteínas según la invención, o los genes que codifican dichas proteínas, comprenden,

(i)

un conjunto de ácidos nucleicos capaces de hibridar específicamente con los genes que codifican dichas proteínas, o

(ii)

un conjunto de anticuerpos, o un fragmento de los mismos, capaces de detectar un antígeno, capaz de unirse específicamente a dichas proteínas.

Los ácidos nucleicos capaces de hibridar específicamente con los genes que codifican dichas proteínas son, por ejemplo, uno o más pares de oligonucleótidos cebadores para la amplificación específica de fragmentos de los ARNm (o sus ADNc correspondientes) de los genes que codifican dichas proteínas y/o una o más sondas para la identificación de uno o más genes seleccionados de dichos genes.

Los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, capaces de detectar un antígeno, capaces de unirse específicamente a las proteínas según la invención son, por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, fragmentos de

anticuerpos, Fv, Fab, Fab’ y F(ab’)2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados.

Dichos reactivos, específicamente, las sondas y los anticuerpos, se puede fijar sobre un soporte sólido, tal como una membrana, un plástico o un cristal, opcionalmente tratados para facilitar la fijación de dichas sondas o anticuerpos sobre el soporte. Dicho soporte sólido, que comprende, al menos, un conjunto de anticuerpos capaces de unirse específicamente a la proteína de la presente invención, o variante de la misma, o sondas que hibridan específicamente con los genes que codifican dichas proteínas, respectivamente, se pueden usar para detectar los niveles de expresión de las proteínas según la invención, o variante de las mismas, o de los genes que codifican dichas proteínas, por medio de la tecnología de matrices.

Los kits de la invención opcionalmente comprende reactivos adicionales para detectar un polipéptido codificado por un gen de mantenimiento o el ARNm codificado por dichos genes de mantenimiento. La disponibilidad de dicho reactivo adicional permite la normalización de las medidas tomadas en las diferentes muestras (por ejemplo, la muestra a ensayar y la muestra control) para excluir que las diferencias en la expresión de los diferentes biomarcadores sean debidas a diferentes cantidades de proteína total en la muestra más que a diferencias reales en los niveles relativos de expresión. Los genes de mantenimiento, como se usa en el presente documento, se refiere a genes que codifican proteínas que se expresan de forma constitutiva y llevan a cabo funciones celulares esenciales. Los genes de mantenimiento preferidos para su uso en la presente invención incluyen β-2-microglobulina, ubiquitina, proteína ribosómica de 18S, ciclofilina, GAPDH y actina.

El siguiente ejemplo se proporciona como meramente ilustrativo y no se debe considerar como limitante del ámbito de la invención.

Ejemplo 1

Detección de biomarcadores de EHNA/esteatosis en suero

Muestras

Se obtuvieron 61 muestras de suero humano de diferentes centros de salud:

Control (15 muestras) Esteatosis (15 muestras) EHNA (22 muestras) Hepatitis C (16 muestras) Hepatitis B (3 muestras) Cirrosis biliar primaria (3 muestras) Hepatitis autoinmune (2 muestras) Síndrome de Wilson (1 muestra)

Las muestras se clasificaron en 8 categorías diferentes: Controles (C) para muestras de donantes sanos, sujetos con esteatosis (S), sujetos con EHNA (N), Hepatitis C (VHC), Hepatitis C (VHC) and hepatitis autoinmune (AH) así como cirrosis biliar primaria (CI) and síndrome Wilson (W).

Eliminación de HSA

Para eliminar la HSA, mejorando así la separación por electroforesis 2D, se usó un kit comercial basado en una resina de afinidad (kit Vivapure anti-HSA, de Sartorius, Gotinga, Alemania) que contiene fragmentos de anticuerpos generados contra la albúmina humana. Se requirió un volumen pequeño (20 μl) de suero para obtener aproximadamente 300 μg de proteínas de suero sin HSA con este procedimiento. La figura 1 muestra un dibujo esquemático del proceso de eliminación e imágenes de geles de 2D que muestran el efecto de la eliminación de HSA sobre la resolución y sensibilidad.

Diseño experimental

Las muestras de suero en las que se había eliminado la HSA se diluyeron en un tampón que contenía urea 9 M, tiourea 2 M y DTT 65 mM así como biolitos (Bio-Rad) para desnaturalizar y reducir las proteínas. Se cargaron las

5 muestras en urea en Readystrips (Bio-Rad) que variaban entre pI 5 y pI 8 (primera dimensión, isoelectroenfoque o separación dependiente del punto isoeléctrico). El isoelectroenfoque se llevó a cabo usando el siguiente gradiente de voltaje:

S1 300V 0,01H

10 S2 300V 3H (lineal) S3 600V 6H (lineal) S4 600V 3H S5 2000V 7H (lineal) S6 2000V 3H

15 S7 3500V 7H (lineal) S8 3500V Mantenido

Después de equilibrar las tiras de forma secuencial en tampón que contenía ditiotreitol (reducción) y yodoacetamida (alquilación), se colocaron en la parte superior de un gel de poliacrilamida al 12,5% de 18 x 20 cm para la segunda

20 dimensión o SDS-PAGE (separación dependiente del tamaño). Los geles se corrieron durante la noche a 80-85 V y después de detener la electroforesis, se fijaron (etanol al 10%, ácido acético al 7%) y se tiñeron durante la noche usando colorante fluorescente SYRO RUBY. Se recogieron las imágenes de los geles en un escáner láser UV-visible Typhoon TRIO con una resolución e intensidad adecuadas para posterior análisis de las imágenes. La figura 2 muestra algunos ejemplos de imágenes de geles 2D.

25 De más 100 imágenes de geles 2D, se seleccionaron las siguientes series para el análisis de las imágenes:

Muestra del sujeto

Nº de imágenes

Control

13 imágenes

esteatosis

13 imágenes

EHNA

13 imágenes

Hepatitis C

8 imágenes

Hepatitis B

2 imágenes

cirrosis biliar primaria

3 imágenes

hepatitis autoinmune

2 imágenes

síndrome Wilson

1 imagen

Una vez que se completó el análisis usando el software PDQuest (Bio-Rad), 465 manchas coincidían para todos los

30 miembros de las imágenes de gel seleccionadas y se hizo la media de los valores de volumen (intensidad x altura) para cada mancha en cada grupo. El análisis estadístico de los datos permitió la identificación de las manchas variables más significativas en cada grupo y la razón de la variación de volumen.

Se obtuvo una lista preliminar de 57 manchas que variaban en muestras de esteatosis y/o EHNA con respecto a los

35 controles por encima de 1,5 veces (0,67>R>1,5). Algunas de las manchas eran además significativas según la prueba de la t de Student con un intervalo de confianza del 95% (p<0,05). Se identificaron las 57 manchas usando un espectrómetro de masas QtoFPremier (MALDI-TOF) (Waters) y se dedujo la lista de las proteínas reguladas por descenso o por aumento para esteatosis y/o EHNA. La figura 3 muestra las 57 manchas seleccionadas con los valores de volumen de manchas de esteatosis y EHNA relativos a las manchas control (razón) y las manchas

40 estadísticamente significativas (intervalo de confianza>95%, 20 manchas dentro de cajas). La tabla 2 muestra las razones para todas las enfermedades analizadas así como los nombres de las proteínas identificadas para cada mancha (estadísticamente significativa, prueba de la t de Student IC>95%, los nombres de proteínas que muestran expresión diferencial se muestran en negrita y cursiva).

Tabla 2

5 En un segundo paso, se compararon los valores de volumen de las manchas variables en los geles de esteatosis y EHNA con los valores para las mismas manchas en el resto de los grupos analizados mediante electroforesis en 2D (hepatitis C y B, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune y síndrome de Wilson). Se eligieron las manchas que mostraban diferencias en intensidad con respecto al resto de los grupos para una siguiente ronda de selección. Se detectaron 11 manchas que mostraban una tendencia cuantitativamente diferente en esteatosis y/o EHNA cuando

10 se comparaban con el resto de los grupos. Las 11 manchas y sus cambios en expresión (disminuida N y disminuida S significa que la proteína disminuye sólo en EHNA o sólo en estatosis cuando se compara con el control) se indican en la tabla 3.

Tabla 3: proteínas que muestran una expresión diferencial en muestras de esteatosis frente a control y en muestras de EHNA frente a control (columna izquierda) con indicación de su cambio relativo en expresión (aumentada o disminuida) (columna derecha).

Control/esteatosis y Control/EHNA Diferencial

Antitrombina III

Disminuida

Factor citosólico 2 de neutrófilos

Disminuida

Glutatión peroxidasa 3

Aumentada

Apolipoproteína AI

Disminuida S

Alfa 2 Haptoglobina ácida

Aumentada

Haptoglobina beta

Aumentada

Peroxirredoxina-2

Aumentada

Fibrinógeno gamma

Disminuida N

Factor I del complemento

Aumentada

Alfa 1Haptoglobina básica

Aumentada

Hemoglobina gamma

Aumentada

10 Validación

La validación de las proteínas seleccionadas como biomarcadores de EHNA se llevó a cabo usando la técnica de western blot, un procedimiento basado en afinidad que combina la separación electroforética de proteínas con la detección específica por medio de anticuerpos generados contra proteínas específicas.

15 Las pruebas de afinidad permiten decidir usar anticuerpos comercialmente disponibles para probar su avidez y especificidad como un paso previo para el uso de aquellos anticuerpos en una técnica más sensible y cuantitativa denominada ELISA (Enzimoinmunoanálisis de absorción).

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método in vitro para discriminar entre pacientes que padecen EHNA o esteatosis y pacientes que padecen otros tipos de enfermedades hepáticas, que comprende:

   a) detectar y cuantificar en una muestra de dicho sujeto los niveles de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y

   b) comparar los resultados obtenidos en el paso a) con valores de referencia de los niveles de dichas proteínas o de los genes que codifican dichas proteínas,

   en donde,

   (i)

   si los niveles de las proteínas antitrombina III y factor citosólico 2 de neutrófilos o de los genes que codifican dichas proteínas son menores que los valores de referencia para cada una de dicha proteína, o gen y

   (ii)

   si los niveles de las proteínas glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y variantes son mayores que los valores de referencia para cada una de dichas proteínas, o genes

   entonces el sujeto padece EHNA o esteatosis.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1 que comprende además detectar y cuantificar en el paso (i) los niveles de apolipoproteína AI o del gen que codifica dicha proteína, en donde si dichos niveles son menores que los valores de referencia, entonces el sujeto padece, o tiene predisposición a desarrollar esteatosis.

3. 3.

   Método según la reivindicación 1 que comprende además detectar y cuantificar en el paso (i) los niveles de fibrinógeno gamma o del gen que codifica dicha proteína, en donde si dichos niveles son menores que los valores de referencia, entonces el sujeto padece, o tiene predisposición a desarrollar EHNA.

4. 4.

   Un método in vitro para seguir el efecto de la terapia administrada a un sujeto que padece EHNA o esteatosis, que comprende:

   a) detectar y cuantificar los niveles de antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas y

   b) comparar los resultados obtenidos en el paso (a) con valores de referencia de los niveles de dichas proteínas o de los genes que codifican dichas proteínas o,

   en donde,

   (i)

   si los niveles de las proteínas antitrombina III y factor citosólico 2 de neutrófilos o de los genes que codifican dichas proteínas son mayores que los valores de referencia y

   (ii)

   si los niveles de las proteínas glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o de los genes que codifican dichas proteínas son menores que los valores de referencia entonces

   la terapia administrada a dicho sujeto ha sido eficaz o está siendo eficaz.

5. 5.

   Método según la reivindicación 4, que comprende además detectar los niveles de la proteína apolipoproteína A1 o del gen que codifica dicha proteína en donde si dichos niveles son menores que un valor de referencia, entonces la terapia administrada a dicho sujeto no ha sido eficaz o no está siendo eficaz para el tratamiento de esteatosis.

6. 6.

   Método según la reivindicación 4 que comprende además detectar los niveles de fibrinógeno gamma o del gen que codifica dicha proteína en donde si dichos niveles son menores que un valor de referencia, entonces la terapia administrada a dicho sujeto no ha sido eficaz o no está siendo eficaz para el tratamiento de EHNA.

7. 7.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la muestra es suero, plasma o suero o plasma donde se ha eliminado HSA.

8. 8.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde los niveles de las proteínas se determinan mediante western blot, ELISA o electroforesis bidimensional y tinción.

   5 9. Un kit que comprende un conjunto de reactivos, en donde dicho conjunto consiste en reactivos para detectar las proteínas antitrombina III, factor citosólico 2 de neutrófilos, glutatión peroxidasa 3, alfa 2 haptoglobina ácida, haptoglobina beta, peroxirredoxina-2, factor I del complemento, alfa 1 haptoglobina básica y hemoglobina gamma o los genes que codifican dichas proteínas y, opcionalmente, un reactivo para detectar una proteína de mantenimiento o el gen que codifica dicha proteína de mantenimiento.
9. 10. Kit según la reivindicación 9 que comprende además un reactivo para detectar la proteína apolipoproteína A1

   o para detectar el gen que codifica dicha proteína.
10. 11. Kit según la reivindicación 9 que comprende además un reactivo para detectar la proteína fibrinógeno gamma 15 o el gen que codifica dicha proteína.
11. 12. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el conjunto de reactivos se selecciona del grupo de:

    20 a) Un conjunto de ácidos nucleicos capaces de hibridar específicamente con los genes que codifican dichas proteínas y b) Un conjunto de anticuerpos, o fragmentos de los mismos capaces de unirse específicamente a dichas proteínas.

    WESTERN BLOT