TWI532994B

TWI532994B - 用於乳癌篩選的生物標記

Info

Publication number: TWI532994B
Application number: TW099121309A
Authority: TW
Inventors: 詹鴻霖; 周秀專; 賴姿嘉; 陳依玟; 呂平江; 李天仁; 詹欣慈; 沈欣欣; 李偉達; 林思婷; 盧映潔; 吳絜琳
Original assignee: 國立清華大學
Priority date: 2010-04-08
Filing date: 2010-06-29
Publication date: 2016-05-11
Also published as: TW201135230A; US20110251082A1

Description

用於乳癌篩選的生物標記

本發明為與乳癌相關之生物標記。更明確地說，該發明涉及之生物標記可被用於診斷、判斷疾病的嚴重性以及監測乳癌病患之治療反應。該方法以二維差異性電泳(2D-DIGE)之使用為基礎，量化辨識乳癌中之生物標記。

乳癌是全球女性之主要死亡原因之一。當腫瘤侷限於乳房細胞時，乳癌之五年存活率將近97%；但若當診斷時腫瘤已轉移至其他器官，則存活率急劇下降至23%。乳癌早期仍可切除階段之症狀前篩檢，可以大幅降低乳癌相關的死亡率。然而不幸地，只有63%(1992-1999，US)的乳癌在診斷時是局部性的(Jemal,A. et al.(2004) CA Cancer J. Clin. 54:8-29)。當病症小時，即使透過乳房攝影檢查也常不夠明顯或是會被忽略，年輕女性和乳房組織緻密之女性尤其有此狀況。分子標記比影像技術更有可能觀察到這些病灶，因此將實際提供腫瘤侵犯組織前治療的機會。

先前的發明指出，正常乳房細胞的腫瘤形成和轉移，與轉錄和轉譯兩階段之表現改變均有相關(Kulasingam,V. & Diamandis,E. P. Mol. Cell. Proteomics 2007,6,1997)。為了進一步了解腫瘤生成和腫瘤轉移的分子機制，我們需要識別出正常乳房細胞、非侵襲性乳癌細胞以及侵襲性乳癌細胞之間的基因表現和蛋白質表現的識別標記之不同。在轉錄層級，微陣列策略已用於乳房腫瘤之歸類，可將腫瘤歸為高度侵襲性或非侵襲性癌症；在轉譯層級，蛋白質體(proteomic)策略用於分辨非侵襲性即侵襲性乳房細胞中的惡性腫瘤標誌物。Nagaraja等人使用二維電泳(2-DE)，比較正常乳房細胞、非侵襲性乳癌細胞以及侵襲性乳癌細胞之細胞株之間的蛋白質體判別特徵(Nagaraja,G. M.;Othman,M.;Fox,B. P.;Alsaber,R.;Pellegrino,C. M.;Zeng,Y.;Khanna,R.;Tamburini,P.;Swaroop,A.;Kandpal,R. P. Oncogene 2006,25,2328)。雖然他們發現26個潛在的癌症標記點，但這些研究中並沒有統計分析。Pucci-Minafra等人使用二維電泳、銀染以及N端胺基酸定序(N-terminal sequencing)等方法，辨別浸潤性導管癌和非腫瘤性乳腺上皮細胞之細胞株，辨識出58個差異表現之蛋白質(Pucci-Minafra,I.;Fontana,S.;Cancemi,P.;Alaimo,G.;Minafra,S. Ann.N.Y.Acad.Sci. 2002,963,122)。不同於這些細胞株的研究，Pawlik分析在荷瘤(tumor-bearing)乳房和無病乳房之乳頭抽吸液(nipple aspirate fluid)中差異表現之蛋白質(Pawlik,T. M.;Hawke,D. H.;Liu,Y.;Krishnamurthy,S.;Fritsche,H.;Hunt,K. K.;Kuerer,H. M. BMC.Cancer 2006,6,68)。雖然這些被辨識的蛋白質是主要含量之蛋白質，但僅有少數被確認是生物標記。

本發明提供一種乳癌的生物標記庫，以及使用該生物標記庫預測發育中乳癌發展增加之可能性的方法。

生物標記庫

乳癌是全球女性之主要死亡原因之一，早期偵測乳癌可以大幅改善存活率。辨認出細胞目標不僅在侵襲性乳癌上扮演重要角色，也對癌症固有的侵襲性發育生物機制有更佳的認識，並可應用於發展新的乳癌診斷或治療策略。

因此，本發明的目標是發現有最大潛力幫助偵測早期乳癌以及監測乳癌形成的生物標記。許多的蛋白質，包括斑萎蛋白3及小白蛋白(parvalbumin)，在低侵襲性和侵襲性的乳癌細胞都會高度表現，且在本實驗中均證實為乳癌的生物標記。重要的是，在這些辨識出的蛋白中，包括斑萎蛋白3、GRAM域含蛋白2(GRAM domain-containing protein 2)及核分佈蛋白nudE同源物1(nuclear distribution protein nudE homologue 1)，均未在之前的乳癌研究中有報告，也因此表示這些蛋白是有價值的乳癌標記。

本發明的生物標記可用於診斷，包括判斷乳癌病人疾病嚴重程度和監控治療反應。生物標記如下列：斑萎蛋白3、碳酸酐酶2(carbonic anhydrase 2)、動力蛋白重鏈6(dynein heavy chain 6)、外生二磷酸腺苷核糖基轉移酶4(ecto-ADP-ribosyltransferase 4)、GRAM域含蛋白2(GRAM domain-containing protein 2)、干擾素誘導蛋白四聯重複肽重複3(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeat 3)、磷酸甘油酸變位酶1(phosphoglycerate mutase 1)、蛋白酶體α次單元1型(proteasome subunit alpha type-1)、蛋白酶體α次單元3型(proteasome subunit alpha type-3)、rab三磷酸鳥苷酶結合效應子蛋白2(rab GTPase-binding effector protein 2)、Ras基因相關蛋白Rab-2B(Ras-related protein Rab-2B)、硒結合蛋白1(selenium-binding protein 1)、透膜蛋白C14orf180(transmembrane protein C14orf180)、液泡蛋白分揀相關蛋白54(vacuolar protein sorting-associated protein 54)、無剛毛-盾同源物4(achaete-scute homologue 4)、烏頭酸水合酶(aconitate hydratase)、胺肽酶B、膜聯蛋白A3、屏障自整合因子(barrier-to-autointegration factor)、雙功能嘌呤生物合成(bifunctional purine biosynthesis)、鈣腔蛋白(calumenin)、碳酸酐酶2、含螺旋線圈域蛋白質(coiled-coil domain-containing protein)、二林蛋白2(erlin-2)、F-肌動蛋白-加帽蛋白β次單元(F-actin-capping protein subunit beta)、黃素還原酶(flavin reductase)、果糖-1,6-雙磷酸酶1(fructose-1,6-biphosphatase 1)、果糖二磷酸醛縮酶A(fructose-biphosphate ldolase A)、熱休克蛋白75 kDa、異質性核核醣核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1)、白三烯A-4水解酶、類微纖維相關蛋白3(microfibrillar-associated protein 3 like)、微管相關蛋白RP、核分佈蛋白nudE同源物1(nuclear distribution protein nudE homologue 1)、小白蛋白α(parvalbumin alpha)、PDZ和LIM區域蛋白1(PDZ and LIM domain protein 1)、肽脯胺醯異構酶區域和含WD重複蛋白1(peptidylprolyl isomerase domain and WD repeat-containing protein 1)、磷絲氨酸轉胺酶(phosphoserine aminotransferase)、網素-3(plastin-3)、計畫性細胞死亡6-交互作用蛋白(programmed cell death 6-interacting protein)、蛋白酶體活化子複合物次單元1(proteasome activator complex subunit 1)、蛋白酶體活化子複合物次單元2(proteasome activator complex subunit 2)、遮蓋蛋白同源物2(protein canopy homologue 2)、CASC2蛋白、蛋白質二硫鍵異構酶A6(protein disulfide-isomerase A6)、SQH1蛋白、Rab二磷酸鳥苷解離抑制子β(Rab GDP dissociation inhibitor beta)、內質網鈣結合蛋白2(reticulocalbin-2)、Rho三磷酸鳥苷酶活化蛋白25(Rho GTPase-activating protein 25)、Rho三磷酸鳥苷酶活化蛋白5(Rho GTPase-activating protein 5)、核醣核酸酶抑制子(ribonuclease inhibitor)、胞裂蛋白11(septin-11)、胞裂蛋白8(septin-8)、絲胺酸/蘇胺酸-蛋白激酶Nek7(serine/threonine-protein kinase Nek7)、絲胺酸/蘇胺酸-蛋白激酶PCTAIRE-1(serine/threonine-protein kinase PCTAIRE-1)、小泛蛋白相關修飾子3(small ubiquitin-related modifier 3)、應激性磷蛋白1(stress-induced phosphoprotein 1)、含硫氧還蛋白區域蛋白5(thioredoxin domain-containing protein 5)、泛蛋白結合酶E2(ubiquitin-conjugating enzyme E2)、UPF0492蛋白C20或f94、電壓依賴性選擇性陰離子通道蛋白(voltage-dependent anion-selective channel protein)及鋅指蛋白433(zinc finger protein 433)。

預測方法

當用生物標記來診斷時，本發明也提供了一種直接預測個體之發育中乳癌發展增加之可能性的方法，包含下列步驟：

(a)　至少偵測一個經生物測定個體樣本的生物標記表現，生物標記是從前述生物標記庫中所篩選出的；以及

(b)　比較前一步驟的生物標記表現型式和正常組織供參照的生物標記表現型式，和參照相比，生物標記表現型式增加或減少至少一倍以上，就表示罹患乳癌之可能性增加。

該表現型式代表了生物標記的表現量。在較佳實施例中，生物標記的表現比起正常組織增加或減少了1.5倍。

該方法更進一步包含使用軟體比較正常和腫瘤組織的蛋白質表現。

乳癌的發展包含乳房腫瘤的有無、乳癌的分期和乳癌的治療效果。

乳癌的分期包括侵襲及非侵襲腫瘤發展。侵襲性腫瘤另一種說法就是癌症，因為它會侵犯周圍的組織而得名。非侵襲性腫瘤是指本身不會侵犯組織，但在未治療下有潛在變成癌症(變得會侵犯組織)的可能。

腫瘤是指不正常增生的組織。一株細胞生長超出正常細胞，且和周圍的正常組織無法配合協調。儘管生長刺激停止，細胞生長持續過度生長，而經常導致一團腫瘤形成。

本文中所提到的個體係人類或哺乳類，且樣本係選自血液、血清、血漿、小管灌洗液以及乳頭抽吸液。

這裡所使用的生物測定方式包含免疫測定、電泳及質譜儀。

免疫測定係以免疫墨點來測量，特別是基於抗體的測定方式。本文中所使用的抗體測定方式是用來偵測生物標記，包含至少一個可使抗體和生物標記互相作用的血管，以及可和抗體結合並被偵測到的標記。有用的可被偵測標記包括但不限於放射性標記，例如：磷-32(32P)、氫-3(3H)和碳-14(14C)；螢光染料如：異硫氰酸螢光(fluorescein isothiocyanate，FITC)、玫瑰紅(rhodamine)、燐光質鑭系物(lanthanide phosphors)、德州紅(Texas red)及ALEXA Fluor Dyes^TM(Molecular Probes)、CY^TM dyes(Amersham)、Spectrum Dyes(Abbott Labs)；高電子密度試劑，如：黃金；酵素如：辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶，螢光素酶和鹼性磷酸酶；比色標籤，如：膠體金；由DYNABEADS^TM販售的磁性標記；生物素；長葉毛地黃配質(dioxigenin)；或可取得其抗血清或單株抗體的半抗原(haptens)及蛋白質。這些標記可直接混入多核苷酸(polynucleotide)，或是可連接在混雜或結合到多核苷酸的分子上。這些標記可能以各種該領域中熟習技藝之人士已知的方式結合至單獨的多核苷酸。在多種實施例中，單獨的多核苷酸是用切口移位(nick-translation)、PCR或隨機引子延伸(random primer extension)(可參見如Sambrook et al. supra)做標記。偵測標記的方法包括但不限於光譜、光化學、生物化學、免疫化學、物理或化學的技術。

這裡所使用的電泳是二維差異性電泳(2D-DIGE)，可以有效的辨識乳癌細胞生物標記的表現量。

二維電泳(2-DE)是現行研究中，辨識生物樣本中數以千計的蛋白質的關鍵技術，與液相層析質譜儀(LC/MS)基礎蛋白質體分析是互補的角色。然而膠體及膠體間變異之可靠的定量比較始終是二維電泳分析主要的挑戰。二維差異性電泳可在同一個二維電泳中同時偵測大量樣本，顯著改善以膠體為基礎的蛋白質定量及偵測。此方法可將膠體間的變異最小化，並以內在的螢光標準比較不同膠體上的蛋白質相對量；此外，二維差異性電泳技術的優點為較廣的動態範圍、高敏感度及較傳統二維電泳更高的可再現性。這項創新技術是靠電泳前將蛋白樣本事先以螢光染劑標記(Cy2、Cy3及Cy5)。每種螢光染劑有不同的螢光波長，讓多種實驗樣本的螢光標準同時分佈在同一片膠上面。該螢光標準是由等量的實驗蛋白樣本集合而成，有助於精確的標準化資料並增加膠體間相對定量統計可信度。

比較正常細胞株與癌細胞株間的差異是否真實反映了癌症的常見改變；或者可否成功發展出臨床上實用的生物標記等問題，始終充滿爭議。因此，理論上直接比較癌症組織與正常組織是獲得癌症形成過程中蛋白質表現特徵的最佳方法。然而由於腫瘤標本的異質性(heterogeneity)，直接將臨床樣本與正常組織比較會造成偽陽性的增加，進而干擾腫瘤專一標記的辨識。因此以正常及癌症細胞組織建立的良好標準模型細胞株，對癌症蛋白質體研究是較有益的。

在乳癌研究的領域，MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231分別是廣泛用來代表正常管表皮細胞(luminal epithelial cells)、乳小管腔來源非侵襲性乳癌細胞以及同樣來源的侵襲性乳癌細胞。本發明是以二維差異性電泳比較這些細胞標準系統之總細胞蛋白和分泌蛋白的蛋白質體狀態，用以定量區別乳癌的生物標記，其中生物標記反映了腫瘤生成的發育程度。

結果顯示，從胞外分泌蛋白到胞內蛋白，在正常細胞株及轉化的乳房細胞株有不同表現狀態。二維差異性電泳策略足以區別多種乳癌細胞特徵，並提供液相層析質譜儀為基礎的蛋白質體分析的互補角色。雖然在全球，以液相層析質譜儀為基礎來分析混合蛋白，比起二維電泳是來得多，但二維電泳為基礎的分析提供了一些獨特的優勢，像是直接在蛋白質同型異構物(isoform)層級而非胜肽層級做蛋白質定量，以減少分析變異。

以下實例並非作為限制，僅代表本發明的各種面相與特徵。

實例1 化學藥物及試劑

由Sigma-Aldrich(St. Louis，USA)購得通用化學藥品、GE Healthcare(Uppsala，Sweden)購得二維差異性電泳試劑、Abcam(Cambridge，UK)購得所有初級抗體、GE Healthcare(Uppsala，Sweden)購得所有抗鼠、抗羊和抗兔次級抗體。本發明所使用的所有化學及生化藥品均為分析級。

細胞株及細胞培養

乳房表皮細胞株MCF-10A是從台灣國家衛生研究院(National Health Research Institute，Taiwan)獲得，乳癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453和MDA-MB-361是向American Type Culture Collection(ATCC)、Manassas、VA購買。MCF-10A維持在DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium)培養基及F-12培養基(DMEM/F-12)中並加入5%馬血清、L-麩醯胺酸(2 mM)、鏈黴素(100 μg/mL)、青黴素(100 IU/mL)、表皮生長因子(20 ng/ml)(皆來自Gibco-Invitrogen Corp.，UK)、胰島素(10 μg/ml)(Sigma)及氫皮質酮(hydrocortisone)(0.5 μg/ml)(Sigma)。將MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453及MDA-MB-361維持在Dulbecco’s Modified Eagle’s培養基(DMEM)中並加入10%(v/v)胎牛血清(FCS)、L-麩醯胺酸(2 mM)、鏈黴素(100 μg/mL)和青黴素(100 IU/mL)(皆來自Gibco-Invitrogen Corp.，UK)，所有細胞均培養於37℃和5% CO₂之中。

蛋白質體分析樣本製備

細胞在正常培養基中約聚集80%，就收集供蛋白質體分析使用。就總細胞蛋白分析而言，細胞先以冷凍0.5x磷酸緩衝液鹽水(PBS)沖洗，並在4% w/v CHAPS、7M尿素、2M硫脲、10mM Tris-HCl、pH8.3、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的二維電泳溶解液中刮取獲得。將溶解物通過25-gauge細針10次以均質化，以13000 rpm 4℃離心30分鐘分離不可溶的物質，再以Coomassie蛋白質分析試劑(Coomassie Protein Assay Reagent(BioRad))判定蛋白質濃度。分泌蛋白分析時，將各細胞株約1.25 x 10⁸細胞種植於25個175cm²細胞培養盤上，培養兩天後將DMEM或DMEM/F-12培養液丟棄，以磷酸緩衝液鹽水沖洗細胞三次，接著再加入375 ml無血清DMEM或DMEM/F-12培養液放置30小時。之後收集培養液以0.45 μm微濾器過濾移除細胞碎片，再以10-kDa分子量限值濃縮器(molecular mass cutoff concentrators，Millipore)濃縮1000倍。在4單位體積的濃縮培養液中加入1單位體積的100%三氯乙酸(TCA)(-20℃)，並於4℃恆溫放置10分鐘使其沉澱。以13000 rpm離心10分鐘回收沉澱的蛋白質，並將所生成的沉澱物用冰丙酮沖洗兩次。將風乾的沉澱物重新懸浮於二維電泳溶解緩衝液中供蛋白質定量使用。

實例2 二維差異性螢光電泳與凝膠圖像分析

進行二維差異性螢光電泳前，蛋白樣品會以N-羥基琥珀醯亞胺酯衍生物(N-hydroxy succinimidyl ester-derivatives)的花青染料(Cyanine Dye) Cy2，Cy3和Cy5標定。簡而言之，150 μg之蛋白質樣品最少以375 pmol的Cy3或Cy5染色並以同樣的二維電泳做比對，為了方便影像比對以及凝膠交互分析比對，所有樣本都會備妥並以Cy2標定，以每微克蛋白質比2.5 pmol Cy2之莫耳比作為對所有凝膠的螢光標準。因此，一式三份的樣本和螢光標準就可以在多個二維電泳下進行量化。標定反應會在暗室的冰上進行30分鐘，之後以20倍莫耳比的離胺酸反應10分鐘以停止染色。分別以Cy3和Cy5染色之樣品會與Cy2染色之螢光標準混合，並以二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)進行還原10分鐘。加入pH3-10非線性酸鹼梯度(2%(v/v)，GE Healthcare)之緩衝液，最後以二維電泳溶解緩衝液將體積調整為450 μl並進行再水化(rehydration)，再水化的過程以不流動的非線性酸鹼梯度(IPG)條片(pH3-10，24 cm)進行，此條片之後將被Cy染色標定之樣本在暗室中以室溫下行再水化一整夜(至少12小時)。等電聚焦(Isoelectric focusing)則使用雙向電泳設備(Multiphor II apparatus，GE Healthcare)20℃下62.5 kV-h進行。條片會放入6M尿素、30%〈v/v)甘油、1%SDS(w/v)、100 mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl，pH8.8)、65 mM二硫蘇糖醇內15分鐘進行酸鹼平衡，平衡之IPG條片再轉移到26 x 20-cm 12.5%聚丙烯醯胺膠(polyacrylamide gel)上並放在低螢光玻璃盤之間。將條片0.5%(w/v)與低熔點瓊脂糖膠(Agarose)放到含有溴酚藍的緩衝液中。在每凝膠4瓦特10℃的Ettan Twelve膠槽(GE Healthcare)中跑膠，直到染劑完全從最前端跑到膠體的底端。之後使用螢光差異分析影像儀(Ettan DIGE Imager，GE Healthcare)以二維螢光直接掃描低螢光玻璃盤，此影像儀為電荷賴合裝置(charge-coupled device-based)儀器，可用不同波長掃描Cy2、Cy3以及Cy5染色標定之樣品。膠體分析使用DeCyder二維差異分析軟體v7.0(GE Healthcare)，對蛋白質影像進行共同檢測、標準化和量化蛋白質特性。從非蛋白源偵測到的特徵(如：塵埃粒子和混雜的背景資訊)則會被過濾掉。平均表現量增加或減少≧1.5倍且p值<0.05的點會被選取進行蛋白質辨識。

蛋白染色

膠體考馬斯藍G-250(Coomassie Blue G-250)染色用來將二維電泳之Cy染色標定之蛋白質特徵視覺化。膠體會固定在30% v/v乙醇、2% v/v磷酸一整夜後，以二次水清洗三次(每次30分鐘)，再放入34% v/v甲醇、17% w/v硫酸銨、3% v/v磷酸培養一小時，之後再加上考馬斯藍G-250 0.5g/liter。該膠體會放置染色5-7天且不需要脫色步驟，該染色膠體之後會以影像掃瞄機光密度計(ImageScanner III densitometer，GE Healthcare)顯像。

膠體內水解

被切碎的前染膠塊以50%乙腈洗三次後，置於真空乾燥機(SpeedVac)乾燥20分鐘，再以溶於5mM pH 8.0碳酸氫銨的10mM二硫蘇糖醇在50℃下進行還原45分鐘，再溶於5mM碳酸氫銨的50mM碘乙醯胺於室溫暗室條件下進行一小時的烷化。之後膠塊以50%乙腈洗三次，真空烘乾後再放入以50ng修飾過之胰蛋白酶(Promega)重新膨脹(reswelling)，再將膠塊置於10μl 5mM碳酸氫銨，並於37℃條件下胰蛋白酶化(trypsinized)16小時。接著收集上清液後，進一步在50%乙腈中以5%三氟醋酸抽取兩次胜肽，之後再把上清液收集，將萃取的胜肽真空乾燥後，重新懸浮於5μl二次水並儲存於-20℃直到質譜分析。

實例3 以介質輔助雷射脫附游離飛行式質譜分析(MALDI-TOF)辨識之蛋白質

萃取的蛋白質以蛋白質分解酵素裂解成多個胜肽後，透過胜肽質量指紋(peptide mass fingerprinting，PMF)資料庫搜尋質輔助雷射脫附游離飛行式質譜分析之結果，對蛋白質進行鑑定。簡而言之，經胰蛋白酶消化的蛋白質樣品0.5 μl，先與0.5μl α-氫基-4-羥基桂皮酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，α-CHCA)的混合液混合，再以1 ml乙腈(v/v)/0.1%三氟醋酸(v/v)濃縮為1mg，再點於AnchorChip樣品盤(Bruker Daltonics)並將其乾燥。使用Autoflex III質譜儀(Bruker Daltonics)的反射模式取得胜肽質量指紋。質譜註解所使用的演算法為SNAP(Sophisticated Numerical Annotation Procedure)。該程序使用以下詳細度量：峰值檢測演算法(eak detection algorithm)：SNAP；訊號雜訊閥值：25；相對照度閥值：0%；最小照度閥值：0；最大峰量：50；品質因素閥值：1000；SNAP平均組成：平均(Averaging)；減量基準：中等；平度：0.8；中度(Median level)：0.5。該光譜儀也具有肽校準之標準(Bruker Daltonics)，且內定的校準運作值m/z 842.51及m/z 2211為胰蛋白酶自溶峰(trypsin autolysis peaks)。在m/z 800-3000這個大範圍內的峰值被用來以Mascot v2.2.06軟體搜尋對照擁有513877筆資料的Swiss-Prot/TrEMBL資料庫(v57.12)，以進行胜肽質量指紋分析(Matrix Science，London，UK)。以下參數用於搜索：智人(Homo sapiens)；胰蛋白酶分解且最多容許錯失1個切點(missed cleavage)；半胱氨酸之甲醯甲基化〈carbamidomethylation of cysteine〉；部分蛋白N端乙醯化；部分甲硫胺酸氧化以及部分麩醯胺酸修飾為焦麩氨酸(pyroglutamate)，且質量容許值(mass tolerance)為50 ppm。鑑定符合顯著的MASCOT Mowse數(p<0.05)時才會被接受並進行質譜分析，並以二維電泳比較分子量及等電點(pI)的觀察值與預期值。

實例4 免疫分 析

以免疫墨點分析法驗證差異表現蛋白的質譜鑑定。蛋白質量化前，細胞會溶於酸鹼值pH 7.4之50 mM 4-羥乙基乙磺酸(HEPES)、150 mM氯化鈉、1%NP40、1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)、2 mM正釩酸鈉(sodium orthovanadate)、細胞裂解液、100 μg/mL 4-(2-胺基乙基)苯氟化磺醯(AEBSF)、17 μg/mL牛蛋白(aprotinin)、1 μg/mL蛋白酶抑制劑(leupeptin)、1 μg/mL胃蛋白酶抑制劑(pepstatin)、5 μM芬化利(fenvalerate)、5 μM BpVphen和1 μM岡田井酸(okadaic acid)的細胞溶解液，同時以Coomassie蛋白質分析反應劑(Protein assay reagent)定量(BioRad)。

30 μg的蛋白質樣本會以Laemmli緩衝液稀釋(最終成分：50 mM Tris緩衝液，酸鹼值pH 6.8，10%(v/v)甘油、2% SDS(w/v)、0.01%(w/v)溴酚藍)並以一維膠體電泳(1D-SDS-PAGE)標準程序分離。在將分離的蛋白質電轉印(electroblotting)至0.45 μm Immobilon P膜(Millipore)上後，將膜以在TBST(50 mM Tris pH8.0，150 mM氯化鈉和0.1% Tween-20(v/v))中的5% w/v脫脂牛奶阻塞(block)1小時。接著將膜在含有0.02%(w/v)疊氮化鈉(sodium azide)的TBST中以一次抗體(primary antibody)培養2小時。之後以TBST沖洗(3分鐘，10次)並以適當的山葵過氧化酵素〈horseradish peroxidase，HRP)二抗探測(GE Healthcare)。在進一步以TBST清洗後，使用增強化學發光法(Visual Protein Co.)使免疫探測到的蛋白能被看見。

將細胞放在蓋波片上(VWR international)培養一整夜以進行免疫螢光染色。細胞以含有4%(v/v)三聚甲醛(Paraformaldehyde)之PBS固定25分鐘，以PBS緩衝液清洗三次，再浸泡於含有0.2%(v/v) Triton X-100的PBS中10分鐘。接著在含有5%(w/v) BSA的PBS中沖洗並阻塞蓋玻片10分鐘，再以稀釋於2.5% BSA/PBS中的初級抗體培養1小時。以PBS清洗三次後，將樣品與稀釋於2.5% BSA/PB中經適當螢光標記的次級抗體一同培養1小時。之後蓋玻片再以PBS緩衝液清洗三次，並至少以二次水清洗兩次，之後再以Vectashield封固基(Vectashield mounting medium，Vector Lab)固著。蓋玻片之邊緣會以指甲油密封於載玻片上(BDH)並在黑暗中以4℃乾燥。影像分析使用蔡司(Zeiss) Axiovert 200螢光顯微鏡(Carl Zeiss Inc.，Germany)。使用同樣的雷射強度檢測來自不同細胞株的同一免疫染色標記，且用來捕捉影像的雷射強度均不為飽和的。

實例5 蛋白分泌分析的細胞條件最佳化

為了進行分泌分析，先以培養皿培養MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231細胞株，並檢查確保沒有其他外源蛋白的存在後再以無血清培養皿培養匯合(confluence)的細胞。為了減少飢餓誘導細胞自溶，並增加蛋白分泌濃度，每個細胞株的飢餓時間皆進行了優化，透過免疫墨點法，在1000倍濃度之無血清培養基中，LDH和β微管蛋白(β-tubulin)分別在48～60小時以及60～72小時被檢測到。乳酸脫氫酵素和β微管蛋白皆是細胞蛋白質且在培養基中的表現量即代表了細胞培養基中細胞死亡的數量。因此基於分泌分析，30小時被選作進一步以二維螢光差異性電泳分析的飢餓時間。

實例6 MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231細胞間之螢光差異蛋白表現分析和介質輔助雷射脫附游離飛行式質譜分析

被CyDyes標示之無血清培養基內之各細胞型分泌出之蛋白質被取來進行二維差異性電泳分析。MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231的分泌分析以螢光掃描儀將之視覺化並使用ImageQuant將圖像重疊(圖2)。為了調查人類乳癌中與腫瘤發生及轉移潛在相關的分泌蛋白，在確認蛋白點的表現差異前，會先以生物變異檢定差異是否大於1.5倍且t檢定p值是否小於0.05。介質輔助雷射脫附游離飛行式質譜分析發現在MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231細胞株中有50個獨特的差異表現蛋白(表1)，在這之中有42個蛋白質在MCF-7/MCF-10A之間表現有差異，44個在MDA-MB-231/MCF-10A之間有差異，37個在MDA-MB-231/MCF-7之間有差異。在這三個細胞株實驗中，所有蛋白質中有39%為胞外蛋白或是細胞膜嵌定(plasma membrane-anchored)蛋白(圖3A)，且大部分被辨識的蛋白質與訊號轉導、氧化還原調節和代謝有關(圖3B)。就我們所知，當中包括干擾素誘導蛋白3等14個蛋白質，都未被發現與乳癌有關，因此這些蛋白都有成為乳癌標記物的潛力。如同預期，二維螢光差異性電泳實驗同樣可以辨識多種以被發表的乳癌標記物，如：細胞自溶酵素D(Zhang,Y. G.;DU,J.;Tian,X. X.;Zhong,Y. F.;Fang,W. G. Chin Med.J.(Engl.) 2007,120,1597) and IGFBP4(Mita,K.;Zhang,Z.;Ando,Y.;Toyama,T.;Hamaguchi,M.;Kobayashi,S.;Hayashi,S.;Fujii,Y.;Iwase,H.;Yamashita,H. Jpn.J.Clin.Oncol. 2007,37,575)。

Kulasingam和Diamandis使用液相串聯質譜儀鑑定(LC-MS/MS)，利用有條件之培養基，分析比較乳癌細胞與正常細胞的細胞外蛋白與外膜結合蛋白，且這些細胞株分別分離自癌症第二期與第四期之病患(Kulasingam,V.;Diamandis,E. P. Mol.Cell Proteomics. 2007,6,1997)。Kulasingam的實驗從這些細胞株中發現1062個表現差異蛋白，比較Kulasingam與本研究中二維螢光差異性電泳之50個蛋白質結果，發現當中有25個蛋白質與Kulasingam的研究結果一致，此結果顯示液相串聯質譜儀鑑定(LC-MS/MS)和二維螢光差異性電泳都是可以找尋乳癌標記物的有效工具。且重要的是，其他25個被辨識的蛋白質在Kulasingam或任何其他研究中都沒被發表過，這顯示出尋找生物標記的方法中，二維螢光差異性電泳相較起來是較有力的(表1a和1b)。

#二維差異性電泳分析MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231之表現差異(p<0.05)蛋白之平均比率，共使用三次凝膠來分析。

##被辨認的蛋白若在其他癌症研究中未被報發表過，則標示『A』；若是在其他癌症研究中被發表過但並未在乳癌相關研究中被發表，則標示『B』。

###列表中之蛋白質於Kulasing等人之實驗有被發表過。

*所辨識之蛋白質的所屬胞器和功能分群係取自Uniprot網站。

實例7 MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231細胞中總細胞蛋白質之螢光差異蛋白表現分析(DIGE)和介質輔助雷射脫附游離飛行式質譜分析

為了分辨蛋白質豐度的改變並與乳癌腫瘤的生成之間的關係，我們對MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231進行蛋白質體分析。三個不同細胞的細胞均質液被分作一式三份來進行二維電泳分析，以取得乳癌腫瘤形成的概觀。用來進行影像分析的DeCyder v7.0可清楚辨認超過2500個蛋白質點(圖4)，為了減少來自蛋白質樣品內在的變異和凝膠之間的差異，只有那些出現在所有一式三份的凝膠中的蛋白點進行統計分析。此外，顯示表現變化大於1.5倍且t檢定分數小於0.05的點在進行生物變異分析時，先以目測確認，再確認其變化以進行蛋白質鑑定。介質輔助雷射脫附游離飛行式質譜分析於MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231辨識出133個獨特表現差異的蛋白質(表2)，其中107個在MCF-7/MCF-10A之間的表現有差異，63個在MDA-MB-231/MCF-10A之間有差異96個在MDA-MB-231/MCF-7之間有差異。在乳房細胞中辨識出的所有蛋白質的幾乎一半以上都是細胞質蛋白質(圖5A)。多數被辨識的蛋白質都與信號轉導、代謝、蛋白質折疊與細胞運動有關(圖5B)。根據對照表，當中包括鈣腔蛋白的51個辨識點，在乳癌相關研究的報告中都尚未被發表，因此這些蛋白質都有成為乳癌標記物的潛力。如同預期地，有些知名的乳癌標記物，如：14-3-3蛋白質、膜聯蛋白(annexin)、攜鈣蛋白(calmodulin)、AGR-2、半乳糖结合蛋白-1〈Galectin-1〉和Rho關連含捲曲螺旋蛋白激酶2〈ROCK2〉，以二維差異性電泳都能辨識，證明早期生物標記可透過此實驗策略來確認。在先前的實驗，Nagaraja等人搭配前置染色(銀染以及考馬斯藍染)使用傳統的二維電泳，揭示了不同侵入程度的轉化乳癌細胞和正常細胞之間26個差異表現蛋白質，這些細胞株於本研究使用的是相同的(Nagaraja,G. M.;Othman,M.;Fox,B. P.;Alsaber,R.;Pellegrino,C. M.;Zeng,Y.;Khanna,R.;Tamburini,P.;Swaroop,A.;Kandpal,R. P. Oncogene 2006,25,2328)。

他們的研究無法敏銳地顯示出可視化蛋白點(visualizing protein spots)，而且因為沒有更廣的線性範圍方法和統計分析，因此蛋白表現的變化無法量化。此研究中僅從26個蛋白質中選出6個以二維差異性電泳法統計，這意味人工變異所造成的差異及無統計分析根據的結果有可能被釐清(表2)。

#經二維差異性電泳分析MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231表現差異(p<0.05)蛋白質之平均比率，共使用三次凝膠來分析。

##被辨認的蛋白質若是在其他癌症研究中未被發表過，則標示”A”；若是在其他癌症研究中被發表過但並未在乳癌相關研究中被發表，則標示”B”。

###列表中之蛋白質於Nagaraja等人之實驗有被發表過。

*所辨識之蛋白質的所屬胞器和功能分群係取自Uniprot網站。

實例8 透 過免疫墨點法和免疫螢光法，驗證相關蛋白質之乳癌特徵

本發明中之分泌實驗，鑑定出一些特定乳癌細胞中的細胞質蛋白質，如：培養基中的親環蛋白A、14-3-3δ和過氧化物氧化還原酶2。透過各自獨立的實驗來驗證這些細胞內蛋白質的程度是必要的，為此，取自MDA-MB-231、MCF-7和MCF-10A的親環蛋白A、14-3-3δ和過氧化物氧化還原酶2以免疫墨點法進行驗證。該結果顯示，無論是蛋白質體法或免疫墨點法，都顯示相較於MCF-10A內的表現程度，親環蛋白A和14-3-3δ在MCF-7內都是下降的；相反地，相較於過氧化物氧化還原酶2在MCF-10A內的表現程度，在MCF-7內則是上升的。比較分泌蛋白在MCF-10A和MDA-MB-231中的表現程度，發現過氧化物氧化還原酶和14-3-3δ在MCF-10A和MDA-MB-231中表現是提升的(up-regulated)，反之親環蛋白A的表現則沒有顯著差異(圖6A~C)。此觀察證實，親環蛋白A、14-3-3δ和過氧化物氧化還原酶2在乳房細胞中的分泌是有差異的。以免疫墨點和免疫螢光分析法進一步確認總細胞蛋白中不同蛋白的表現量前纖維蛋白、細胞自溶酵素D、膜聯蛋白2、蛋白質二硫鍵異構酶A1(protein disulfide isomerase A1)和HDAC1在MDA-MB-231、MCF-7和MCF-10A的表現(圖6D~H)。根據發表，這些蛋白質在腫瘤生成時，對細胞骨架調控、蛋白質分解、鈣調控、蛋白質二硫鍵重排和染色質組裝等都有重要影響。免疫墨點法的結果指出，相較於MCF-10A細胞，細胞自溶酵素D和蛋白質二硫鍵異構酶在MCF-7細胞中有增加的現象，但在MDA-MB-231細胞中則有減少的現象。相較於MCF-10A細胞，前纖維蛋白和膜聯蛋白2的表現程度在MCF-7中是減少的，但在MDA-MB-231中並無顯著差異。這些免疫墨點法的結果與二維電泳的結果為正相關性的(圖6D~G)。除了免疫墨點法外，也以免疫螢光法進行驗證。圖6H顯示，大部分HDAC1訊號散佈在細胞核中，這與HDAC1在所屬胞器的結果一致。如預期般，HDAC1的螢光強度相較於在MCF-7，同樣地在MCF-7和MDA-MB-231中表現是增加的。總體而言，免疫墨點和免疫螢光法的結果與二維電泳之結果一致。

實例9 未發表之推測辨識腫瘤標誌物，透過免疫墨點與免疫螢光法驗證。

由細胞蛋白質體分析和分泌分析顯示，有些可被辨識的蛋白質可能是乳癌標記物(表1和2)。為了驗證此觀察，免疫墨點與免疫螢光法被用來驗證這些差異表現的蛋白質，其中包括斑萎蛋白3、MPP2、小白蛋白、PdLIM1、干擾素誘導蛋白3和BANF1這些未發表之蛋白質於MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231細胞株，表現都有顯著改變(>3倍)。濃縮的無血清培養基經免疫墨點分析後，顯示細胞株MCF-7和MD-MB-231分泌之斑萎蛋白3多於MCF-10A，而MPP2僅在MDA-MB-231中被偵測到。值得注意的是，斑萎蛋白3的墨點分析與二維差異性電泳之結果並未一致，在二維差異性電泳的結果中，斑萎蛋白3在MCF-7的表現程度比MB-231來得高(圖7A)。使用免疫螢光染色法後首度發現，相較於MCF-10A，在MCF-7和MDA-MB-231細胞中小白蛋白的訊號強力增長。小白蛋白主要侷限在細胞核中，這與DAPI染色之細胞核一致。進一步研究其他乳癌細胞株中小白蛋白的表現，顯示小白蛋白在非侵襲性乳癌細胞之細胞株MDA-MB-453中有過度表現的現象；而在有轉移能力之乳癌細胞MDA-MB-361中，則是稍微表現上升(up-regulated)(圖7B)。這些結果指出，小白蛋白有可能成為乳癌的標記物；相比之下，細胞質蛋白PdLIM1，在所有乳癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453和MDA-MB-361當中，表現都被抑制(down-regulated)。此外，細胞膜蛋白干擾素誘導蛋白3在轉型細胞中被抑制，尤其在MCF-7和MDA-MB-231中，其蛋白質體結果與二維電泳之結果一致(圖7B)。有趣的是，一個重要的核心定位蛋白BANF1分佈在MCF-10A乳癌細胞的細胞質中，但在MCF-7、MDA-MB-231和MDA-MB-453細胞中只侷限分佈於細胞核中，而在MDA-MB-361細胞中則分佈於細胞質與細胞核中(圖7B)。此結果顯示，BANF1的表現程度在正常細胞與乳癌細胞中並不同，同時蛋白質的所屬胞器也許與腫瘤形成有關。

以Swiss-Prot蛋白質資料庫搜尋以及京都基因與基因組百科全書〈KEGG〉路徑(pathway)分析為基礎，很多潛在有生物學功能的已被鑑定之蛋白質，都在MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231細胞株中進行了測定。這些資訊對於研究腫瘤發生和乳腺癌轉移的機制應該是有助益的。

圖8比較三個細胞株中被辨識之差異表現蛋白的表現圖譜(expression profiles)。調節細胞週期之蛋白質已被發現在MCF-7和MDA-MB-231中皆有表現(圖8A)，且與促進腫瘤形成有關。此外，與MCF-10A的表現程度相較，蛋白質的表現與氧化還原調控在MCF-7中有所增加(圖8A)。這些蛋白質的誘發表現也許可以說明癌症的形成與發育。蛋白質體分析也顯示，參與碳水化合物代謝之蛋白質在MCF-7細胞中有過度表現的現象(圖8C)。此結果顯示，在有足夠的氧氣含量下，癌細胞的增殖和腫瘤形成都相當依賴糖酵解來獲得ATP，此機制已在許多癌症療法中被暗示。

圖8D到8F顯示在MCF-7和MDA-MB-231細胞中蛋白質的抑制圖譜。這些蛋白質涉及鈣質調控、血管傳輸與蛋白酶抑制，如：膜聯蛋白1，其功能是由雌激素受體調控，且已有報告顯示受體表現下降與乳癌生成及發展有關。S100蛋白質家族是一群負責調節蛋白磷酸化、細胞內鈣衡定、細胞骨架組成動力和細胞增殖的低分子量鈣結合蛋白。S100A14在MCF-7和MDA-MB-231細胞內是被認為是抑制表現的(down-regulated)，這也讓我們認為其在乳癌中有潛在作用。然而，rab三磷酸鳥苷酶結合效應子蛋白和液泡蛋白分揀相關蛋白54在MCF-7和MDA-MB-231細胞內，表現也是降低的(圖8E)，這也許可以以先前的報告來解釋。先前報告指出，Rab5 GDP/GTP交換因子會增加酪胺酸酶受體的訊號，同時也會促進使腫瘤細胞轉移的生長因子(Hu,H.；Milstein,M.；Bliss,J.M.；Thai,M.；Malhotra,G.；Huynh,L.C.；Colicelli,J.Mol.CellBiol. 2008,28,1573)，但很少有研究探討rab三磷酸鳥苷酶結合效應子蛋白2和液泡蛋白分揀相關蛋白54在腫瘤形成過程的角色。絲氨酸蛋白酶抑製劑(Serpin)是一群可能會抑制乳癌細胞中之蛋白酶的蛋白質，此蛋白質還有阻止腫瘤生長與侵入的功能，因此絲氨酸蛋白酶抑製劑家族的功能在癌症研究中，扮演腫瘤抑制的角色，絲氨酸蛋白酶抑製劑的抑制表現與乳癌形成以及在MCF-7和MDA-MB-231細胞內的觀察，都有良好的相關性(圖8F)。

其他在MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231中有表現差異的蛋白質，包括細胞自溶酵素D(Cathepsin D)、斑萎蛋白3和含三十四肽重複之干擾素誘導蛋白3。細胞自溶酵素D是溶酶體天冬氨酸蛋白酶，在雌激素受體陽性之乳癌細胞中呈過度表現，與雌激素受體陰性乳癌的臨床研究比較，通常有良好的預後價值。先前就指出，不論是總細胞蛋白或分泌蛋白，細胞自溶酵素D在MCF-7有高度表現；反之，細胞自溶酵素D在MDA-MB-231中比在MCF-7中明顯呈抑制表現。

蛋白質體實驗的結果與分泌實驗的結果有良好的相關性。

斑萎蛋白3是一cGMP依賴性鈣激活氯離子通道，且先前沒有被發現與癌症有關，也未在MCF-7和MDA-MB-231中有抑制表現的現象，然而與斑萎蛋白-1相關之研究顯示，該蛋白質提高了細胞內鈣離子訊號，在結腸癌細胞內會增加細胞的生長速度，而細胞的增殖會顯著地被斑萎蛋白-1RNA干擾治療所抑制(Spitzner,M.；Martins,J.R.；Soria,R.B.；Ousingsawat,J.；Scheidt,K.；Schreiber,R.；Kunzelmann,K.J.Biol.Chem. 2008,283,7421)。這些結果顯示，斑萎蛋白-1在乳癌中可能可以是一個治療目標。通過誘導表現的細胞週期抑製劑p21和p27蛋白質實驗，發現干擾素誘導蛋白3在與干擾素相關之信號通路的抗增殖活性中扮演要角。(Xiao,S.；Li,D.；Zhu,H.Q.；Song,M.G.；Pan,X.R.；Jia,P.M.；Peng,L.L.；Dou,A.X.；Chen,G.Q.；Chen,S.J.；Chen,Z.；Tong,J.H.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2006,103,16448)。此研究中的二維差異性電泳顯示干擾素誘導蛋白3在MCF-7和MDA-MB-231細胞中都呈抑制表現，這意味乳癌細胞可能藉由抑制干擾素誘導蛋白3的表現來維持較高度的增殖活性，基於這些數據，可推斷由生物標記庫選出之蛋白質在控制乳癌扮演關鍵角色。綜合二維電泳與免疫分析的結果，相較於正常組織內的表現，生物標記的增加或減少與乳癌的生成是有相關的。

圖1：分泌分析的飢餓時間最佳化。藉由測定在細胞培養盤上MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231等細胞株釋放到無血清培養基中的細胞質蛋白、乳酸脫氫酶及β-微管蛋白，確認飢餓導致的細胞自解。在免疫墨點染色分析前，於指示的飢餓期間收集無血清培養基並濃縮1000倍。

圖2：此圖為一彩色示意圖。以二維差異性電泳比較MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231細胞株的分泌。從無血清培養基得到富含蛋白質的樣本(每個50μg)後，以花青染料標記並用24cm、pH 3-10非線性IPG膠條分離。再以ImageQuant Tool(GE Healthcare)進行假色彩處理及重疊覆蓋，得到適當的激發及放射波長下分別為(2A)MCF-7細胞分泌蛋白(紅色)與MCF-10A細胞分泌蛋白(綠色)、(2B)MDA-231細胞分泌蛋白(紅色)與MCF-10A細胞分泌蛋白(綠色)、及(2C)MDA-231細胞分泌蛋白(紅色)與MCF-7細胞分泌蛋白(綠色)之螢光二維差異性電泳影像。

圖3：根據所屬胞器(subcellular location)(A)及其生物功能(B)，以二維差異性電泳/基質輔助雷射脫附游離飛行式質譜儀(MALDI-TOF MS)分析MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231細胞株在無血清基質中分泌的蛋白質百分比。

圖4：此圖為一彩色示意圖。以二維差異性電泳做MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231細胞株的蛋白質體比較。從全細胞溶解產物純化得到蛋白質樣本(每個150μg)後，以花青染料標記並用24cm、pH 3-10非線性IPG膠條分離。再以ImageQuant Tool(GE Healthcare)進行假色彩處理及重疊覆蓋，得到適當的激發及放射波長下分別為(4A)MCF-7細胞分泌蛋白(紅色)與MCF-10A細胞分泌蛋白(綠色)、(4B)MDA-231細胞分泌蛋白(紅色)與MCF-10A細胞分泌蛋白(綠色)、及(4C)MDA-231細胞分泌蛋白(紅色)與MCF-7細胞分泌蛋白(綠色)之螢光二維差異性電泳影像。

圖5：根據所屬胞器(A)及其生物功能(B)，以二維差異性電泳/基質輔助雷射脫附游離飛行式質譜儀分析MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231細胞株在無血清基質中分泌的蛋白質百分比。

圖6：此圖為一彩色示意圖。經蛋白質體分析篩選出MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231細胞株差異表現之蛋白質，再由免疫墨點及免疫螢光分析之代表。在無血清基質中辨識出的蛋白質程度，(A)親環蛋白A(Cyclophilin A)、(B)14-3-3 δ蛋白及(C)過氧化物還原酶2(Peroxiredoxin 2)及總細胞蛋白、(D)前纖維蛋白(profilin)、(E)細胞自溶酵素D(Cathepsin D)、(F)膜聯蛋白2(膜聯蛋白2)及(G)由免疫墨點(左上角)、非特異分泌蛋白質帶及β-微管蛋白當作負載控制(loading control)標準化的密度計結果(左下角)、蛋白質表現地圖 (右上角)及三維點狀影像(右下角)四種方式驗證MDA-MB-231及MCF-7中的蛋白質二硫鍵異構酶A1(Protein disulfide isomerase A1)比上MCF-10A的結果。(H)MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231細胞以抗-HDAC抗體固定培養，並以德州紅(Texas Red)結合次級抗體(secondary antibody)染色(紅)。細胞核是以DAPI染色(藍)。每組的三種視野均以相同的暴露攝影，影像代表三種不同的視野。比例尺=20μm。

圖7：此圖為一彩色示意圖。在MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453及MDA-MB-361細胞株上，對新辨識出推定的乳癌標記之表現和蛋白質定位改變所做的免疫墨點及免疫螢光分析。(A)在MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453及MDA-MB-361細胞株上分泌蛋白質體的改變。來自細胞株的無血清基質經濃縮後，取全部的蛋白質10μg，以SDS-膠體電泳(SDS-PAGE)解析並進行免疫墨點法檢測MPP2及斑萎蛋白3(bestrophin 3)。NS代表用來顯示等量負載(loading)分泌蛋白的一非特異條帶。

(B)將5x10⁴ MCF-10A、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453及MDA-MB-361的細胞植於蓋玻片上後，加以固定並將小白蛋白〈Parvabumin〉、BANF1、PdLIM1及IFIT3染色。每組的三種視野均以相同的曝光攝影。影像代表三種不同的視野，比例尺=20μm。

圖8：有潛力促進下列各項的蛋白質表現圖譜：(A)細胞週期(B)氧化還原控制(C)碳水化合物代謝(D)鈣離子調控(E)血管運輸(F)比較MCF-7、MDA-MB-231及MCF-10A之間的蛋白酶抑制。白色條代表MDA-MB-231比上MCF-10A蛋白質表現的倍數變化。黑色條代表MCF-7比上MCF-10A蛋白質表現的倍數變化。水平軸為蛋白質表現變化的倍數。

Claims

一種預測個體之發育中乳癌發展增加之可能性的方法，包含：(a)從來自一個體的檢體中以生物測定的方法檢測GRAM域含蛋白2(GRAM domain-containing protein 2)；及(b)比較(a)的GRAM域含蛋白2(GRAM domain-containing protein 2)與參照之正常組織的之GRAM域含蛋白2(GRAM domain-containing protein 2)的表現模式，其中相較於參照的正常組織，該GRAM域含蛋白2(GRAM domain-containing protein 2)的表現至少有1倍的增加或減少時，表示乳癌發育的可能性增加。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該乳癌發展包括乳癌腫瘤的存在與否、乳癌階段和乳癌的治療效果。
如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該乳癌階段，包括非侵襲性和侵襲性腫瘤之發展。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該個體為人類或哺乳類。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該檢體係選自血液、血清、血漿、乳腺導管沖洗液、乳頭吸入流體。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生物測定的方法包含免疫測定、電泳和質譜法。
如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該免疫測定係使用免疫墨點法做測定。
如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該免疫墨點法係一基於抗體之測定法。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包含比較正常組織和腫瘤組織之蛋白質表現的應用軟體。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該表現模式係指生物標記之表現量。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中相較於正常組織，生物標記的表現有1.5倍的增加或減少。