JP7325845B2 - 膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍のマーカー - Google Patents

膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍のマーカー Download PDF

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Description

本発明は、膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍に対して高い感度と特異性を示すマーカー、当該マーカーを検出するための膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍の診断キット、並びに、当該マーカーを利用して膵がん細胞の転移を評価するための方法に関するものである。
「腫瘍」とは異常に増殖した細胞を指し、その異常増殖の原因が消失あるいは取り除かれても細胞の増殖が持続する状態をいう。腫瘍の中でも良性腫瘍は腫瘍の増殖が遅く、転移はしない。よって、一般的には切除すれば問題は無く、たとえ切除せずに放置しておいても命に別状はないといえる。一方、悪性腫瘍、即ちがんは、良性腫瘍とは異なり急速に増殖する上に、リンパ節や他の臓器に転移して増殖する。よって、例えば外科的手術により除去しても、僅かにでも残留したがん細胞や、既にリンパ節や他の臓器に転移していたがん細胞が再び増殖を開始することがある。よって、がんはいったん治療が終了した後の予後が悪く、各がんにおいては５年後生存率が調査されており、一般的に、治療により癌が消失したとされてから５年経過後までに再発がない場合がようやく治癒と見なされる。
膵がんは、がんの中で最も予後が悪いといわれている。その原因としては、膵臓が後腹膜臓器であるために早期発見が困難であることに加え、膵がん細胞の運動性がきわめて高いため、例えば２ｃｍ以下の小さながんであっても、周囲の血管、消化管、神経などへすぐに浸潤し、また、近くのリンパ節に転移したり、肝臓などへ遠隔転移したりすることが挙げられる。よって、膵がんの進行を評価することは非常に重要である。
がんを診断するには生体検査が正確であるが、生体検査は患者に苦痛を与える。そこで一般的には、予備的にがんマーカーを用いた検査が行われる。がんマーカーとは、がんにより生体内で特異的に産生される物質であり、その体液中量を測定することによりがんの進行を評価することができる。例えば膵がんマーカーとしては、約３０年前からがん細胞で特異的に発現する異常糖鎖であるＣＡ１９－９が用いられており、未だＣＡ１９－９に勝る膵がんマーカーは実用化されていない。
しかし、特に早期膵がんの診断ではＣＡ１９－９は感度が低く、有用性が低いという問題がある。そこで、より優れたがんマーカーの探索が行われている。例えば特許文献１には、特定のタンパク質からなる膵がんマーカーが開示されている。
特開２０１３－０２７３８７号公報
上述したように、膵がんマーカーとしてはＣＡ１９－９が実際の臨床で用いられているが、ＣＡ１９－９は特に早期膵がんに対する感度が低いため、ＣＡ１９－９にとって代わる膵がんマーカーが求められている。
また、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）という疾患がある。膵管内乳頭粘液性腫瘍は放置しておくと悪性腫瘍化するので、腺腫の段階で外科的に除去する必要があるが、膵管内乳頭粘液性腫瘍に対する血清診断マーカーはなく、ＣＡ１９－９の血清濃度も上昇しないことが多い。このため、膵管内乳頭粘液性腫瘍に対する血清診断マーカーの開発も望まれている。
そこで本発明は、膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍に対して高い感度と特異性を示すマーカーを提供することを目的とする。また、本発明は、当該マーカーを検出する膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍の診断キット、並びに、当該マーカーを利用して膵がんの転移を評価するための方法を提供することも目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、膵がん細胞の浸潤に必須である葉状仮足に集積するタンパク質として糖タンパク質であるセクレトグロビン，ファミリー１Ｄ，メンバー２とポドカリキシン様タンパク質を同定し、これら糖タンパク質が膵がん細胞から細胞外へ放出されることから膵がんのマーカーとして有用であり、また、膵管内乳頭粘液性腫瘍のマーカーとしても有用であることを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。
［１］ セクレトグロビン，ファミリー１Ｄ，メンバー２およびポドカリキシン様タンパク質からなる群より選択される１以上のタンパク質を含むことを特徴とする膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍のマーカー。
［２］ 上記セクレトグロビン，ファミリー１Ｄ，メンバー２が、下記の（１）～（３）の何れかのアミノ酸配列を有する上記［１］に記載の膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍のマーカー。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１以上、５以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［３］ 上記ポドカリキシン様タンパク質が、下記の（４）～（６）の何れかのアミノ酸配列を有する上記［１］または［２］に記載の膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍のマーカー。
（４）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（５）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１以上、２５以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列；
（６）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［４］ さらに、ＣＡ１９－９を含む上記［１］～［３］のいずれかに記載の膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍のマーカー。
［５］ セクレトグロビン，ファミリー１Ｄ，メンバー２およびポドカリキシン様タンパク質からなる群より選択される１以上のタンパク質に対する抗体を含むことを特徴とする膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍の診断キット。
［６］ さらに、ＣＡ１９－９に対する抗体を含む上記［５］に記載の膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍の診断キット。
［７］ 膵がん細胞及び膵管内乳頭粘液性腫瘍細胞の転移を評価するための方法であって、
セクレトグロビン，ファミリー１Ｄ，メンバー２およびポドカリキシン様タンパク質からなる群より選択される１以上のタンパク質の試料中の濃度を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
［８］ 膵がん細胞及び膵管内乳頭粘液性腫瘍細胞を診断するための方法であって、
セクレトグロビン，ファミリー１Ｄ，メンバー２およびポドカリキシン様タンパク質からなる群より選択される１以上のタンパク質の試料中の濃度を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
［９］ 上記セクレトグロビン，ファミリー１Ｄ，メンバー２が、下記の（１）～（３）の何れかのアミノ酸配列を有する上記［８］に記載の方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１以上、５以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［１０］ 上記ポドカリキシン様タンパク質が、下記の（４）～（６）の何れかのアミノ酸配列を有する上記［８］または［９］に記載の方法。
（４）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（５）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１以上、２５以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列；
（６）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［１１］ さらに、ＣＡ１９－９の試料中の濃度を測定する工程を含む上記［８］～［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］ 膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍のマーカーとしての、セクレトグロビン，ファミリー１Ｄ，メンバー２およびポドカリキシン様タンパク質からなる群より選択される１以上のタンパク質の使用。
［１３］ 上記セクレトグロビン，ファミリー１Ｄ，メンバー２が、下記の（１）～（３）の何れかのアミノ酸配列を有する上記［１２］に記載の使用。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１以上、５以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列；
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［１４］ 上記ポドカリキシン様タンパク質が、下記の（４）～（６）の何れかのアミノ酸配列を有する上記［１２］または［１３］に記載の使用。
（４）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（５）配列番号２に記載のアミノ酸配列において１以上、２５以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有するアミノ酸配列；
（６）配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列。
［１５］ さらに、ＣＡ１９－９を併用する上記［１２］～［１４］のいずれかに記載の使用。
本発明に係る膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍のマーカーは、膵がん細胞に特徴的な葉状仮足に集積する特定の糖タンパク質を含む。本発明者は、当該糖タンパク質が膵がん細胞の運動性や浸潤にも直接関与していることと、細胞外に分泌されることを実験的に見出している。膵がんは早期から浸潤・転移傾向が強いため、膵がん細胞の運動性や浸潤性に関与する本発明に係るタンパク質は、早期の膵がんも検出できる可能性がある。また、本発明者は、当該糖タンパク質が膵管内乳頭粘液性腫瘍の診断にも有効であることを見出した。よって、本発明に係る膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍のマーカーは、高い感度と特異性をもって膵がんの進行や膵管内乳頭粘液性腫瘍の有無を評価できることから、ＣＡ１９－９など従来の腫瘍マーカーにとって代わり得るものであるといえる。
図１は、Ｓ２－０１３細胞のＳＣＧＢ１Ｄ２、ＰＯＤＸＬおよびアクチンを免疫染色した結果を示す写真である。 図２は、Ｓ２－０１３細胞の培養液とライセートにおけるＳＣＧＢ１Ｄ２、ＰＯＤＸＬ、ＣＤ６３およびＧＡＰＤＨをウェスタンブロット法で検出した結果を示す電気泳動写真である。 図３は、膵がん患者群とコントロール群の血清試料中のＳＣＧＢ１Ｄ２濃度の測定結果を示すグラフである。 図４は、膵がん患者群とコントロール群の血清試料中のＰＯＤＸＬ濃度の測定結果を示すグラフである。 図５は、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）患者群および膵がんステージ別の血清試料中のＳＣＧＢ１Ｄ２濃度の測定結果を示すグラフである。 図６は、ＩＰＭＮ患者群および膵がんステージ別の血清試料中のＰＯＤＸＬ濃度の測定結果を示すグラフである。 図７は、膵がん患者群とコントロール群間でのＳＣＧＢ１Ｄ２およびＣＡ１９－９の測定値の感度－特異度グラフである。 図８は、膵がん患者群とコントロール群間でのＰＯＤＸＬおよびＣＡ１９－９の測定値の感度－特異度グラフである。 図９は、膵がん患者群＋ＩＰＭＮ患者群とコントロール群間でのＳＣＧＢ１Ｄ２およびＣＡ１９－９の測定値の感度－特異度グラフである。 図１０は、膵がん患者群＋ＩＰＭＮ患者群とコントロール群間でのＰＯＤＸＬおよびＣＡ１９－９の測定値の感度－特異度グラフである。 図１１は、膵がん患者群とコントロール群間でのＳＣＧＢ１Ｄ２＋ＰＯＤＸＬおよびＣＡ１９－９単独の測定値の感度－特異度グラフである。 図１２は、膵がん患者群とコントロール群間でのＳＣＧＢ１Ｄ２＋ＰＯＤＸＬ＋ＣＡ１９－９およびＣＡ１９－９単独の測定値の感度－特異度グラフである。 図１３は、膵がん患者群＋ＩＰＭＮ患者群とコントロール群間でのＳＣＧＢ１Ｄ２＋ＰＯＤＸＬおよびＣＡ１９－９単独の測定値の感度－特異度グラフである。 図１４は、膵がん患者群＋ＩＰＭＮ患者群とコントロール群間でのＳＣＧＢ１Ｄ２＋ＰＯＤＸＬ＋ＣＡ１９－９およびＣＡ１９－９単独の測定値の感度－特異度グラフである。
１． 膵がん及びＩＰＭＮのマーカー
本発明に係る膵がん及びＩＰＭＮのマーカーは、セクレトグロビン，ファミリー１Ｄ，メンバー２（ｓｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ，ｆａｍｉｌｙ １Ｄ，ｍｅｍｂｅｒ ２，以下、「ＳＣＧＢ１Ｄ２」と略記する）およびポドカリキシン様タンパク質（ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，以下、「ＰＯＤＸＬ」と略記する）からなる群より選択される１以上のタンパク質である。当該タンパク質を検出対象とすることにより、高い感度と特異性をもって膵がんの進行やＩＰＭＮの有無を評価することができる。
本発明において上記「感度」とは、膵がん及びＩＰＭＮに対する感度であって、例えば、上記タンパク質を検出対象とした場合に膵がん患者およびＩＰＭＮ患者が陰性と判断される確率が低いことをいう。また、本発明において上記「特異性」とは、膵がん及びＩＰＭＮに対する特異性であって、上記タンパク質の量と膵がん及びＩＰＭＮの有無との間に強い相関性がある一方で、上記タンパク質の量が、良性疾患や、膵がん及びＩＰＭＮ以外のがんとの相関性が無いか或いは低いことをいう。
本発明マーカーは膵がんを対象とする。膵がんのステージ分類には日本膵臓学会の膵癌取扱い規約と国際的なＵＩＣＣ分類といった２つの分類法がある。本発明では、日本で一般的に用いられている以下の膵癌取扱い規約による分類法を用いる。
Figure 0007325845000001
本発明では、「膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）」も検出対象とする。ＩＰＭＮは、膵管内乳頭腺腫ともいい、前がん病変であり、ＩＰＭＮががん化した腫瘍は膵がんとは別のがんと定義されることもある。しかし、ＩＰＭＮは放置しておくとがん化し、膵管外に浸潤した場合には５年後生存率は著しく低下することから、早期の発見と切除が必要である。一方、ＩＰＭＮの検出は従来の膵がんマーカーであるＣＡ１９－９では非常に難しい。そこで本発明では、便宜上、ＩＰＭＮ、およびＩＰＭＮから進行した悪性腫瘍である膵管内乳頭腺がんも膵がんの定義に含め、検出対象とする。
ＳＣＧＢ１Ｄ２は、ウテログロビンスーパーファミリーに含まれるリポフィリンサブファミリーに含まれるものであり、ラット前立腺由来の主要な分泌性糖タンパク質であるプロスタテインの相同分子種である。ヒトリポフィリンはプロスタテインと機能的に同等のものであることから、ステロイドホルモンにより転写制御されていると考えられる。
ＰＯＤＸＬは、ＣＤ３４関連ファミリーに属し、血液細胞の発育や分化、細胞の接着や形態形成の他、がん化の制御に関与する糖タンパク質である。ポドカリキシンは乳がん細胞や前立腺がん細胞の悪性表現型を増加させるとの報告もあり、がんの進行性マーカーとして用い得るとの報告もあるが、本発明者が把握している限り、膵がん及びＩＰＭＮのマーカーとして有用であることが実験により証明されたことはない。
膵がん細胞は運動性が高く転移し易いという特徴を有しており、葉状仮足（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）という細胞の運動性に関与する突起部位を有する。本発明に係るＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬは、膵がん細胞の葉状仮足に集積しているタンパク質である。また、ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬは、膵がん細胞外へ放出されることが本発明者により見出されている。膵がん細胞は早期から運動性や浸潤性を示し、葉状仮足を有するため、本発明に係る膵がんマーカーは、進行膵がんのみならず、早期の膵がんや転移直後の膵がんなども高い感度と特異性をもって評価することが可能であり得る。
本発明に係るＳＣＧＢ１Ｄ２は配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＰＯＤＸＬは配列番号２のアミノ酸配列を有する。
上記ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬは、ヒトによっては一塩基多型といわれる変異を有する場合があり、かかる変異タンパク質も、膵がん及びＩＰＭＮのマーカーとして有用である。即ち、本発明範囲には、マーカーが以下のアミノ酸配列を有する場合が含まれるものとする。
アミノ酸配列（１）： 配列番号１に記載のアミノ酸配列；
アミノ酸配列（２）： 配列番号１に記載のアミノ酸配列において１以上、５以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、膵がん患者およびＩＰＭＮ患者の体液中に見出されるタンパク質のアミノ酸配列；
アミノ酸配列（３）： 配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つ、膵がん患者およびＩＰＭＮ患者の体液中に見出されるタンパク質のアミノ酸配列；
アミノ酸配列（４）： 配列番号２に記載のアミノ酸配列；
アミノ酸配列（５）： 配列番号２に記載のアミノ酸配列において１以上、２５以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、膵がん患者およびＩＰＭＮ患者の体液中に見出されるタンパク質のアミノ酸配列；
アミノ酸配列（６）： 配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９５％以上の相同性を有し、且つ、膵がん患者およびＩＰＭＮ患者の体液中に見出されるタンパク質のアミノ酸配列。
上記アミノ酸配列（２）において、欠失、置換および／または付加の数としては、４以下または３以下が好ましく、１または２がより好ましく、１がよりさらに好ましい。上記アミノ酸配列（５）において、欠失、置換および／または付加の数としては、２０以下、１５以下または１０以下が好ましく、８以下、６以下、５以下または４以下がより好ましく、１または２がよりさらに好ましい。
上記アミノ酸配列（３）における配列同一性としては、９６％以上または９７％以上が好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。上記アミノ酸配列（６）における配列同一性としては、９６％以上または９８％以上が好ましく、９９．０％以上、９９．２％以上または９９．５％以上がより好ましく、９９．６％以上または９９．８以上がよりさらに好ましい。
上記アミノ酸配列（２）、（３）、（５）および（６）において、欠失、置換および／または付加の有無や位置、並びに配列同一性は、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
但し、膵がん細胞の葉状仮足に集積するタンパク質に関する研究例は少なく、これまで本発明に係るＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬがそれぞれ配列番号１と配列番号２のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有するとの報告は無いので、本発明に係るＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬのアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１のアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列からなることが好ましい。
本発明の膵がん及びＩＰＭＮのマーカーとしては、ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬの両方を含むものが好ましい。これらタンパク質をマーカーとすることにより、各タンパク質をそれぞれ単独でマーカーとする場合に比べて、感度や特異性がより一層向上する。また、本発明の膵がん及びＩＰＭＮのマーカーとしては、ＳＣＧＢ１Ｄ２またはＰＯＤＸＬとＣＡ１９－９、さらに、ＳＣＧＢ１Ｄ２、ＰＯＤＸＬおよびＣＡ１９－９を含むものがより好ましい。かかる併用により、感度や特異性がより一層向上する。
２． 膵がん及びＩＰＭＮの診断方法
次に、上記膵がん及びＩＰＭＮのマーカーを検出対象とする膵がん及びＩＰＭＮの診断方法を、工程毎に説明する。なお、膵臓から転移した膵がん細胞は運動性や浸潤性に富み、かかる運動性や浸潤性に必須である葉状仮足を有し、ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬを分泌すると考えられる。よって本発明に係る膵がんの診断方法は、膵がん細胞の転移を評価する方法としても有効である。例えば、膵がんを切除する外科的手術の後、既に転移している膵がん細胞を、たとえその組織が従来の膵がんマーカーでは検出できないほど小さなものであっても、本発明方法により検出できる可能性がある。
（１） 試料の取得工程
本工程では、被験者から試料を取得する。ここでの試料とは、血液、リンパ液、尿など被験者の体液に加えて、血清や血漿など、採取した体液を処理したものをいう。
本工程で用いる試料としては、血液試料が好ましい。血液試料は、上記の血液自体、血清または血漿をいう。
（２） ＳＣＧＢ１Ｄ２および／またはＰＯＤＸＬの測定工程
本工程では、ＳＣＧＢ１Ｄ２およびＰＯＤＸＬからなる群より選択される１以上のタンパク質の試料中の濃度を測定する。
測定する量としては、所定量の試料中におけるＳＣＧＢ１Ｄ２および／またはＰＯＤＸＬの絶対量のみならず、試料中におけるＳＣＧＢ１Ｄ２および／またはＰＯＤＸＬの濃度であってもよい。
測定手段としては、試料中のＳＣＧＢ１Ｄ２および／またはＰＯＤＸＬの量を測定できるものであれば特に制限されない。例えば、紫外吸収法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、Ｌｏｗｒｙ法、ＢＣＡ法といった分光光度分析法も用い得る。しかし、これら分光光度分析法は、試料に含まれる他成分の影響を受けるおそれがあるため、ＳＣＧＢ１Ｄ２および／またはＰＯＤＸＬに特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を用いることが好ましい。
（３） 判断工程
上記工程で得られた標的タンパク質量から、膵がん及びＩＰＭＮの有無を評価する。実際には、膵がん患者、ＩＰＭＮ患者および非膵がん患者、さらには様々な進行度の膵がん患者から試料を得、同一条件で試料に含まれるＳＣＧＢ１Ｄ２および／またはＰＯＤＸＬの量を測定しておき、データを蓄積しておく。かかる蓄積データと測定結果を照らし合わせ、被験者における膵がん及びＩＰＭＮの有無、進行度、転移の有無などを判断する。
なお、上記測定工程（２）においてＣＡ１９－９の試料中の量や濃度も合わせて測定し、その測定値も合わせて考慮することにより、膵がん及びＩＰＭＮの診断などの感度や特異性をより一層向上させることも可能である。
３． 膵がん及びＩＰＭＮの診断キット
本発明に係る膵がん及びＩＰＭＮの診断キットは、ＳＣＧＢ１Ｄ２およびＰＯＤＸＬからなる群より選択される１以上のタンパク質に対する抗体を含む。当該キットは、ＥＬＩＳＡ法を用いた上記本発明方法で用いることができる。より詳しくは、例えば、抗ＳＣＧＢ１Ｄ２抗体および／または抗ＰＯＤＸＬ抗体を結合させたプレートに被験者から得た試料を添加し、洗浄することにより、試料中に含まれるＳＣＧＢ１Ｄ２および／またはＰＯＤＸＬを特異的に結合させる。次いで、プレートに結合させたＳＣＧＢ１Ｄ２および／またはＰＯＤＸＬを、標識基を結合させた二次抗体などで検出し、当該標識基に応じた発色の強度などでＳＣＧＢ１Ｄ２および／またはＰＯＤＸＬの試料中の量を測定することができる。
本発明に係る膵がん及びＩＰＭＮのキットは、さらに、ＣＡ１９－９に対する抗体を含んでいてもよい。かかるキットは、ＳＣＧＢ１Ｄ２および／またはＰＯＤＸＬに加えてＣＡ１９－９の測定も可能になるため、より高感度で且つ高特異性の判断が可能になる。
本願は、２０１５年１２月１１日に出願された日本国特許出願第２０１５－２４２６７９号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１５年１２月１１日に出願された日本国特許出願第２０１５－２４２６７９号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
実施例１： 膵がんマーカーとして用い得る膵がん細胞タンパク質の同定
本発明者は、膵がん細胞の浸潤・転移機構の解明を目的とした研究を行っており、インスリン様成長因子２ＭＲＮＡ結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３）が、特定のｍＲＮＡと結合することにより、細胞膜突起である葉状仮足（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａ）におけるそれらｍＲＮＡの局所翻訳に関与していることを明らかにした（Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，５，ｐｐ．６８３２－４５（２０１４）にて報告済み）。これらのｍＲＮＡの中に、ＳＣＧＢ１Ｄ２およびＰＯＤＸＬのｍＲＮＡも含まれていた（未発表）。そこで、ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬの機能解析を行った。
先ず、局所翻訳されてタンパク質になったＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬが膵がん細胞の葉状仮足に局在しているかを検討するために、ヒト膵がん細胞株Ｓ２－０１３を用いて免疫細胞染色を行った。結果を図１に示す。図１のとおり、ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬは、内部にアクチンが重合している葉状仮足に強く発現していた。
これら２つのタンパク質は糖タンパク質であり、糖タンパク質は分泌タンパク質であるか、もしくは細胞膜に局在することが多い傾向がある。そこで、これらタンパク質が膵がん細胞株Ｓ２－０１３から培養液中に分泌されているか否か、ＷＥＳＴＥＲＮ ＢＬＯＴ法により試験した。具体的には、Ｓ２－０１３細胞の培養上清を回収後、遠心分離により細胞成分を除去し、濃縮したサンプルから抗ＳＣＧＢ１Ｄ２抗体および抗ＰＯＤＸＬ抗体を使ったウェスタンブロットにより解析した。Ｓ２－０１３細胞ライセートも同様に解析した。また、分泌タンパク質であるＣＤ６３および分泌されない細胞内タンパク質であるＧＡＰＤＨに対する抗体を用いたウェスタンブロットも行った。結果を図２に示す。図２のとおり、ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬは、分泌タンパク質であるＣＤ６３と同様に細胞外に分泌されていることが確認された。また、ＧＡＰＤＨのバンドを培養上清中に認めなかったことからＳ２－０１３細胞の培養上清は正確に回収できたことを確認できた。
これらの結果から、葉状仮足に集まったＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬは、膵がん細胞から分泌されていることが明らかとなった。本発明者は、ヒト膵がん組織内の葉状仮足を有する膵がん細胞からＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬが腫瘍組織の間質に放出され、腫瘍内血管に侵入している仮説をたてた。この仮説を証明するために、膵がん症例の血清を用いてＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬの定量測定を行う臨床試験を実施した。
実施例２： 診断試験
（１） 被験者の選定
高知大医学部付属病院消化器内科において診断された膵がん２３症例（ステージＩ膵がん１例，ステージＩＩＩ膵がん５例，ステージＩＶ進行膵がん１７例）と、良性腫瘍であるＩＰＭＮ（膵管内乳頭粘液性腫瘍）症例１１例を対象として実施した。ＩＰＭＮ症例は、がんの既往がなく手術の行われていない患者を対象とした。コントロールとしては、高知大医学部付属病院消化器内科に通院中の膵臓疾患のない慢性肝炎、大腸ポリープ、胃ポリープの計５１症例とした。高知大学医学部治験審査委員会の承認を得た説明文書を用いて、本発明者とともに膵臓病診療を行っている日本消化器病学会指導医２名が説明を行い、患者本人から文書による同意を得てから症例登録を行った。各被験者から採血後、速やかに血清を分離し、０．２ｍＬずつ１．５ｍＬ容器に分注し、専用の冷凍庫に－２０℃で保存し、測定まで厳重に管理した。
膵がん症例被験者の平均年齢は７１．７０歳、標準偏差は８．９１であり、コントロール被験者の平均年齢は６５．６６歳、標準偏差は１３．３５であった。膵がんは高齢者に多いがんであり、今回の臨床試験においても膵がん症例の平均年齢は高い傾向はあったが、スチューデントのｔ検定でＰ＝０．０５２で両群に有意差はなかった。また、膵がん症例被験者のうち女性は１２名、男性は１１名であり、コントロール被験者のうち女性は３１名、男性は２０名であった。性別につきχ2検定を行ったところ、Ｐ＝０．２４で両群に有意差はなかった。ＩＰＭＮ症例被験者の平均年齢は６５．８５歳、標準偏差は７．８８であり、コントロール被験者と比較した場合、スチューデントのｔ検定でＰ＝０．０５５で両群に有意差はなかった。また、ＩＰＭＮ症例被験者のうち女性は４名、男性は７名であり、コントロール被験者と比較した場合、χ2検定でＰ＝０．１５８で両群に有意差はなかった。
（２） 血清中のＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬの濃度の測定
市販のサンドイッチＥＬＩＳＡキット（ＣＵＳＡＢＩＯ社製「ＳＣＧＢ１Ｄ２ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，ＣＳＢ－ＥＬＯ２０８１４ＨＵ」およびＣＬＯＵＤ－ＣＬＯＮＥ社製「ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ ｆｏｒ ＰＯＤＸＬ，ＳＥＡ７６８Ｈｕ」）を用い、被験者血清におけるＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬの濃度を測定した。
具体的には、ＳＣＧＢ１Ｄ２の場合、キットのマイクロタイタープレートの各ウェルに被験者の血清を１００μＬずつ加え、３７℃で２時間反応させた後、各ウェルにビオチン付加抗体を１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。次いで、各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。さらに、標識酵素としてＨＲＰ－アビジンを各ウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた後、ＰＢＳで５回洗浄した。各ウェルに発色剤としてＴＭＢ溶液を９０μＬずつ加え、室温で１５分間反応させた。反応停止溶液を５０μＬずつ加えて反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定し、検量線と照合することにより血清中のＳＣＧＢ１Ｄ２の濃度を求めた。
ＰＯＤＸＬの場合、キットのマイクロタイタープレートの各ウェルに被験者の血清を１００μＬずつ加え、３７℃で２時間反応させた後、各ウェルにＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａを１００μＬずつ加え、３７℃で１時間反応させた。次いで、各ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。さらに、標識酵素としてＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂを各ウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で３０分間反応させた後、ＰＢＳで５回洗浄した。各ウェルに発色剤としてＳｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ溶液を９０μＬずつ加え、室温で１５分間反応させた。反応停止溶液を５０μＬずつ加えて反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定し、検量線と照合することにより血清中のＰＯＤＸＬの濃度を求めた。
また、比較のために、従来の膵がんマーカーであるＣＡ１９－９の血清中濃度も、市販のＥＬＩＳＡキット（ＤＲＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製「ＴＭ－ＣＡ １９－９ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ，ＥＩＡ５０６９」）を用いて同様に測定した。
（３） 測定結果の考察
ＳＣＧＢ１Ｄ２の結果を図３に、ＰＯＤＸＬの結果を図４に示す。膵がん被験者群血清におけるＳＣＧＢ１Ｄ２濃度の中央値は２３８．８７２ｎｇ／ｍＬ（四分位範囲５９９．６０２）、コントロール被験者群血清の同値は７１．０９１ｎｇ／ｍＬ（四分位範囲９１．４３４）であり、また、膵がん被験者群血清におけるＰＯＤＸＬ濃度の中央値は８．７３８ｎｇ／ｍＬ（四分位範囲６．２８４）、コントロール被験者群血清の同値は０．０９３ｎｇ／ｍＬ（四分位範囲０．７０５）であった。ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬそれぞれの濃度について、膵がん被験者群とコントロール被験者群との間でマン・ホイットニＵ検定を行ったところ、共にＰ＜０．００１で有意差が認められた。
膵がんステージ別およびＩＰＭＮ（膵管内乳頭粘液性腫瘍）群の測定結果については、ＳＣＧＢ１Ｄ２の結果を図５に、ＰＯＤＸＬの結果を図６に示す。ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬは、膵がんステージＩ、ＩＩＩ、ＩＶのいずれにおいても、コントロール症例に比較して上昇傾向を認めた。また、ＩＰＭＮ群血清におけるＳＣＧＢ１Ｄ２濃度の中央値は１３２．５５４ｎｇ／ｍＬ（四分位範囲１９９．５４４）、ＰＯＤＸＬ濃度の中央値は９．１９９ｎｇ／ｍＬ（四分位範囲４．８７２）であり、ＩＰＭＮ群血清におけるＳＣＧＢ１Ｄ２およびＰＯＤＸＬは、コントロール被験者群血清の同値に比較して上昇傾向を認めた。
ＳＣＧＢ１Ｄ２およびＰＯＤＸＬの測定値の感度－特異度グラフを、それぞれ図７と図８に示す。感度－特異度グラフにおいては、グラフが左上に位置するほど、即ちグラフの曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど、感度と特異度の両方に優れ、膵がんマーカーとして優秀であることを示される。そこで、各グラフの膵がん症例とコントロール間のＡＵＣを求めたところ、ＳＣＧＢ１Ｄ２のＡＵＣ値は０．７６（９５％ＣＩ ０．６０９－０．９１）、ＰＯＤＸＬは０．９７３（９５％ＣＩ ０．９４３－１）、ＣＡ１９－９は０．８０２（９５％ＣＩ ０．６９３－０．９１２）と、ＳＣＧＢ１Ｄ２のＡＵＣ値はＣＡ１９－９と同等であり、ＰＯＤＸＬはＣＡ１９－９にＰ＝０．００４０５で有意に勝っていた。従って、ＰＯＤＸＬの膵がん診断能力はＣＡ１９－９に対して感度・特異度共に有意に高く、ＳＣＧＢ１Ｄ２はＣＡ１９－９と同等の診断能を有することが示された。
上記結果により、ＳＣＧＢ１Ｄ２およびＰＯＤＸＬが膵がんとＩＰＭＮの両方の診断マーカーになり得ることが示されたので、膵がん症例とコントロール群間の比較に加えて、膵がん症例＋ＩＰＭＮ症例とコントロール間の比較を行う必要がある。膵がん症例＋ＩＰＭＮ症例とコントロール間の比較を行った場合の感度－特異度グラフを、それぞれ図９と図１０に示す。各グラフの膵がん症例＋ＩＰＭＮ症例とコントロール間のＡＵＣを求めたところ、ＳＣＧＢ１Ｄ２のＡＵＣ値は０．７４８（９５％ＣＩ ０．５９９－０．８９６）、ＰＯＤＸＬは０．８８９（９５％ＣＩ ０．８２３－０．９５６）、ＣＡ１９－９は０．７９９（９５％ＣＩ ０．６８９－０．９０９）と、ＳＣＧＢ１Ｄ２のＡＵＣ値はＣＡ１９－９と同等であり、ＰＯＤＸＬはＣＡ１９－９にＰ＝０．１７８で統計上有意差はなかったが、診断能がＣＡ１９－９より高い可能性があるとの結果が得られた。ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬのカットオフ値をそれぞれ１８５．５８、２．６８と設定した場合、ＳＣＧＢ１Ｄ２の膵がん＋ＩＰＭＮの診断感度は６５．２％、特異度は９０．３％であり、ＰＯＤＸＬの膵がん＋ＩＰＭＮの診断感度は１００％、特異度は７２．６％であった。従って、ＰＯＤＸＬの膵がん＋ＩＰＭＮに対する診断能力はＣＡ１９－９より高い可能性があり、ＳＣＧＢ１Ｄ２はＣＡ１９－９と同等の診断能を有することが示された。
さらに、ＳＣＧＢ１Ｄ２とＣＡ１９－９との組み合わせと、ＰＯＤＸＬとＣＡ１９－９との組み合わせにつき、スピアマン順位相関係数検定により解析し、各組み合わせにおける関連性を検定した。その結果、ＳＣＧＢ１Ｄ２とＣＡ１９－９との組み合わせではｒ＝０．２１２、Ｐ＝０．３１９、ＰＯＤＸＬとＣＡ１９－９との組み合わせではｒ＝０．１４４，Ｐ＝０．４９８と、ＳＣＧＢ１Ｄ２およびＰＯＤＸＬの血清中濃度はＣＡ１９－９の血清中濃度との間に関連性は認められなかった。このようにＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬはＣＡ１９－９と関連性がないことから、ＣＡ１９－９と組み合わせることにより、ＣＡ１９－９単独の膵がん診断の感度・特異度を高める可能性がある。膵がん診断に対するＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬの併用効果を、感度－特異度グラフのＡＵＣ値を求めることにより検討した。ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬを組み合わせたＡＵＣは０．９８２（９５％ＣＩ ０．８４５－０．９６３）であり、ＣＡ１９－９単独に比較して有意に感度・特異度ともに優れていた（Ｐ＝０．００１７，図１１）。ＰＯＤＸＬは単独で用いても膵がんの診断能が非常に高いことは前述したが、ＳＣＧＢ１Ｄ２を組み合わせることにより、さらにＡＵＣは増加した。さらに、ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬにＣＡ１９－９を組み合わせたＡＵＣは０．９８３（９５％ＣＩ ０．９６２－１）であり、ＣＡ１９－９単独に比較して有意に感度・特異度ともに優れていた（Ｐ＝０．００１３，図１２）。しかし、ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬの組み合わせと比較すると、診断能の向上はほとんどなかったことから、ＰＯＤＸＬ単独もしくはＰＯＤＸＬとＳＣＧＢ１Ｄ２の組み合わせが膵がんを診断するためには有用である。
次に、膵がん＋ＩＰＭＮ診断に対するＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬの併用効果を、感度－特異度グラフのＡＵＣ値を求めることにより検討した。ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬを組み合わせたＡＵＣは０．９１０（９５％ＣＩ ０．８５１－０．９６９）であり、ＣＡ１９－９単独に比較して感度・特異度ともに優れた傾向があった（Ｐ＝０．０７３，図１３）。ＰＯＤＸＬは単独で用いても膵がん＋ＩＰＭＮの診断能が高いことは前述したが、ＳＣＧＢ１Ｄ２を組み合わせることにより、さらにＡＵＣは増加した。さらに、ＳＣＧＢ１Ｄ２とＰＯＤＸＬにＣＡ１９－９を組み合わせたＡＵＣは０．９２２（９５％ＣＩ ０．８６８－０．９７６）であり、ＣＡ１９－９単独に比較して有意に感度・特異度ともに優れていた（Ｐ＝０．０２９，図１４）。従って、ＰＯＤＸＬおよびＳＣＧＢ１Ｄ２は、ＣＡ１９－９と組み合わせることによって、膵がん＋ＩＰＭＮを高い感度・特異度で診断できる血清マーカーである。

Claims (6)

  1. ポドカリキシン様タンパク質に対する抗体を含む、血液試料を用いて膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍を診断するためのキット。
  2. さらに、ＣＡ１９－９に対する抗体を含む、請求項１記載のキット。
  3. 血液試料が血清試料である、請求項１又は２記載のキット。
  4. 膵がん及び膵管内乳頭粘液性腫瘍を評価することを補助するための方法であって、
    ポドカリキシン様タンパク質の血液試料中の濃度を測定する工程を含み、
    非膵がん患者の血液試料中の濃度と比較して、測定したポドカリキシン様タンパク質の濃度が高いことが、膵がん又は膵管内乳頭粘液性腫瘍を有することを示す、
    前記方法。
  5. さらに、ＣＡ１９－９の血液試料中の濃度を測定する工程を含み、
    非膵がん患者の血液試料中の濃度と比較して、測定したＣＡ１９－９の濃度が高いことが、膵がん又は膵管内乳頭粘液性腫瘍を有することを示す、
    請求項４記載の方法。
  6. 血液試料が血清試料である、請求項４又は５記載の方法。
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