KR20120059894A - 편평상피세포암의 진단용 마커 및 이를 포함한 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 편평상피세포암에 특이적인 진단 마커에 관한 것이다. 또한 상기 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 사용하여 편평상피세포암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

Description

편평상피세포암의 진단용 마커 및 이를 포함한 키트{Diagnostic marker and kit for squamous cell carcinoma}

본 발명은 p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 중 편평상피세포암 진단을 위한 마커 검출용 조성물, 이를 포함한 키트 및 이를 사용하여 편평상피세포암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

세계적으로 암으로 인한 사망이 계속 증가하고 있다. 지난 수년간 암에 대한 집중적인 연구가 이루어졌음에도 불구하고 암은 여전히 전세계적인 주요 사망 원인이며, 그 중 폐암은 전세계적으로 발병율이 높고 사망률도 매우 높은 암이다. 폐암은 병리학적으로 크게 비소세포폐암과 소세포폐암으로 나눌 수 있으며, 다시 비소세포폐암은 선암(30~40%), 편평상피세포암종(20~30%), 대세포암(10%)으로 나눌 수 있다. 이 중 편평상피세포암종(squamous cell carcinoma, 이하 SCC라고도 함)은 주로 큰 기관지에서 발생하여 기관지 내강으로 자라나며, 일반적으로 나이가 든 남성과 흡연양이 많은 사람들에게 나타나며 구역기관지, 엽기관지, 주기관지에서 주로 나타나며 95%는 폐의 중심부에 발생하고, 5% 정도가 폐엽 주변부에 발생한다. 증상은 주로 관지를 막아 나타나게 되며 간혹 공동을 형성한 큰 종괴 형태를 보이기도 한다. 이러한 편평상피세포암을 조기에 발견할 수 있는 편평상피세포암 특유의 종양 표지자는 아직 밝혀진 바 없다.

또한, 선암(adenocarcinoma, 이하 AC라고도 함)은 폐 말초 부위에서 발생되며 여성, 비흡연자에게 잘 나타나고 흡연 습관의 변화, 흡연양의 변화, 식생활의 변화, 환경적 요인에 따라 생기는 것으로 추정된다.

비록 상기 편평상피세포암과 선암이 비소세포폐암의 주요한 조직학적 유형이며, 조직학적 또는 임상적으로 각각의 특징을 나눌 수는 있지만 이의 구별이 용이하지 않고, 또한, 그의 전이나 침습에 대한 정확한 기전에 대해서도 아직 알려진 바가 없다. 편평상피세포암에 대한 정확한 조기 진단이 선행이 되어야 그에 대한 적절한 치료가 가능하므로, 외과 절제술, 방사선 요법, 화학요법 또는 기타 공지된 치료 방법에 의한 적절한 치료 작용을 용이하게 하기 위하여는 상기 암의 초기 진단을 위한 신속하고 간단한 방법이 요구된다. 암의 진단을 위해 X선 촬영, 전산화 단층촬영, 기관지 조영술 등의 방사선학적 검사, 기관지 내시경 검사 등을 사용할 수 있으나, 이런 검사들을 통해서 해부학적 진행 정도를 판단할 수 있으나 세포 생리학적 상태나 분자 유전학적 상태를 정확히 평가하고 예측할 수는 없다.

또한, 상기 편평상피세포암의 치료를 위해 외과적 요법으로서 수술을 받은 이후에는 재발하는 경우가 종종 있으므로, 수술 후에는 3-4개월 간격으로 재발유무나 전이여부를 점검하기 위한 정기검사를 받아야 한다. 이러한 재발의 80%이상은 수술 후 3년 이내에 발견되므로, 수술 후 5년 이내에 재발하지 않는 것이 완치의 기준이 된다. 따라서, 수술 후 재발이나 전이 여부나 침습에 대한 예후 예측을 용이하게 할 수 있는 마커의 개발 또한 필요하다.

한편, 마커를 이용하여 폐암을 진단하기 위한 다양한 시도들이 있었다. 한국 특허 출원 10-1998-0038212에는 폐암의 전이성을 확인하는 방법에 관한 것으로서, 폐암 조직에서 미토젠 활성화 인산화 단백질 탈인산화 효소-1 (mitogen activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)의 발현을 측정하여 국소 전이성 폐암을 진단하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 국제특허 WO04005891는 OE372, ATP5D, B4GALT, Ppase, GRP58, GSTM4, P4HB, TPI, 및 UCHLI 등의 유전자를 폐암 진단 마커로 사용하여 폐암을 진단하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 미국 특허 US6117981은 LCGA을 타겟으로 하는 단클론 항체를 이용한 비소세포성 폐암 및 난소암의 진단 및 치료 방법에 대하여 기술하고 있다. 유럽특허 EP0804451은 폐암 특이적 항원 HCAVIII을 이용하여 폐암을 진단하고 치료하는 방법에 대하여 기술하고 있다. 그 외에도 미국특허 6,759,508, 미국 특허 6,746,846, 미국특허 6,737,514, 유럽특허 EP0621480 등이 폐암 진단 마커 등에 대하여 기술하고 있다.

그러나, 비소세포폐암 중에서도 편평상피세포암을 특이적으로 진단하는 마커에 대해서는 아직까지 연구나 개시된 바가 없다. 또한, 편평상피세포암과 선암을 손쉽게 구별할 수 있는 유용한 표지가 없었으므로 보다 정확하게 편평상피세포암을 진단할 수 없었다.

이에, 본 발명자들은 편평상피세포암을 특이적으로 진단하기 위한 분자 수준의 마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 세포 골격 신호 안에 있어서의 코필린 및 이의 상류에 존재하는 효소인 PAK1과 LIMK의 인산화 정도가 정상 폐 조직 또는 선암과 비교할 때 편평상피세포암 조직 및 세포에서 특이적임을 밝히고, 이를 마커로 이용할 경우, 매우 신뢰도가 높게 편평세포암 발생 여부를 확인할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 중 편평상피세포암 진단을 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 폐암 중 편평세포암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 폐암 중 편평세포암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 폐암 절제 수술의 재발 및 예후 예측을 위해 본 발명의 마커를 사용할 수 있음을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 중 편평상피세포암 진단을 위한 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 조성물은 p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물일 수 있다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 편평상피세포암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, “편평상피세포암(squamous cell carcinoma)”은 편평상피세포암종, 또는 편평세포암으로도 불리우며, 폐에 있는 편평상피세포에 암종이 발생한 것으로서 비소세포폐암의 일종을 말한다. 상기 편평상피세포암종은 주로 큰 기관지에서 발생하여 기관지 내강으로 자라나며 구역기관지, 엽기관지, 주기관지로 95%는 폐의 중심부에 발생하고, 5% 정도가 폐엽 주변부에 발생하는 것을 말한다.

본 발명에서 용어, “진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 편평상피세포암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 편평상피세포암을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 편평상피세포암 진단용 마커는 정상 폐 조직의 세포에 비하여, 편평상피세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는, p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 말하며, 바람직하게는 p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린 단백질을 말한다.

코필린(cofilin)은 섬유상 F-액틴에 결합하여 탈중합하고 pH-의존적 방식으로 단량체성 G-액틴의 중합을 억제하는 널리 분포된 세포내 액틴-조절 단백질이다. 코필린은 액틴-코필린 결합체가 세포질로부터 핵으로 전위되는 데 관여한다. 코필린은 액틴 중합 및 탈중합을 조절하고 액틴 필라멘트를 분리시키는 작은 액틴-결합 단백질이며, 다양한 조직에 널리 분포되어 있다. 코필린의 활성은 인산화를 비롯한 다양한 기작을 통해 조절된다. 상기 코필린은 세포 운동성과 관련된 피막돌기(lamellopodia)에서 액틴 다이나믹을 증가시키는 작용을 하는 세포 운동성에 중요한 단백질이다. 본 발명에서 p-코필린은 인산화된 코필린(phosphorylated cofilin)을 의미한다.

본 발명에서는 Pak1/LIMK1-매개된 코필린의 인산화 수준이 폐암의 편평상피세포암의 진단과 밀접한 관계가 있음을 규명하였다. 또한, Pak1/LIMK1-매개된 코필린의 인산화 수준이 폐암의 편평상피세포암의 이동 및 침윤을 결정하는 인자임을 밝혔으며, 비소세포폐암의 서브타입 중 편평상피세포암과 선암 타입을 구별하는 인자임을 규명하였다.

본 발명에 있어서 Pak1(p21-associated kinase 1)는 p21-관련 키나아제 1을 말한다. Pak1은 액틴 세포골격 및 운동성의 중요한 조절인자로서 Pak1 유전자 증폭 및 증가된 Pak1 단백질 수준이 자궁암 및 유방암과 관련이 있음이 보고된 바 있다. 본 발명에서는 인산화된 Pak1의 발현 정도가 편평상피세포암의 진단과 밀접한 관계가 있으며, 진단 마커가 될 수 있음을 밝혔다.

또한, LIMK(LIM domain kinase)는 LIM 도메인 키나아제를 말하며, 침윤 암종 세포에서 상향조절되며 이들 세포에 가장 빈번하고 우세한 코필린 키나아제이다. LIMK는 Pak1 또는 ROCK(Rho kinase)에 의해 인산화되고 활성화된다. 본 발명에서는 인산화된 LIMK의 발현 정도가 편평상피세포암의 진단과 밀접한 관계가 있으며, 진단 마커가 될 수 있음을 밝혔다.

한편, 종양 세포의 이동은 고형암의 형성에 매우 중요하며 다른 조직으로의 전이에 필수적이다. 이러한 암의 이동과 침윤 과정은 세포골격 신호 경로(cytoskeletal signaling pathways)에서의 변화, 지향적 운동성(directional motility)의 증가, 세포 생존의 증가와 관련이 있다. Pak1은 액틴 세포골격을 조절하는데 중요한 역할을 하며, Pak의 활성하에 LIMK 및 코필린의 인산화 또한 증가한다. 그러나, LIMK 또는 코필린의 발현 상태 단독으로는 종양 세포의 이동, 침윤 상태를 파악하기에 충분하지 않다.

본 발명자는 SCC 및 AC에서의 Pak1/LIMK1/코필린 경로의 관련성 및 이들 간의 메커니즘의 차이, 이동 및 침윤에서의 차이 등에 대해 연구하던 중, p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린은 정상적인 폐 조직에서는 나타나지 않으나, 편평상피세포암 조직 및 세포에서 현저하게 증가함을 밝히고, 이들 단백질이 폐암 중 편평상피세포암을 진단할 수 있는 마커로서 작용할 수 있음을 규명하였다. 또한, p-코필린의 발현 정도가 편평상피세포암과 선암 간에 차이가 있음을 밝혔으며, 이러한 차이는 편평상피세포암과 선암간의 이동 및 침윤에서의 차이와 관련이 있으며, 또한 수술 후 재발, 전이와 같은 예후 예측과도 관련이 있음을 확인하였다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 폐암 환자 중 SCC(n = 27)와 AC(n = 15)를 가지며, 폐암 수술을 받은 총 42명의 환자로부터 종양 샘플 및 인접하는 정상 폐 조직을 채취하여 Pak1/LIMK1/코필린 경로 단백질을 분석한 결과, 인접한 정상 폐 조직과 비교할 때 모든 SCC 종양 샘플에서 p-Pak1, p-LIMK1, p-코필린의 발현이 증가한 것으로 나타났다 (도 2 참조). 그러나, AC 종양 샘플의 경우, p-Pak1 및 p-LIMK1의 발현은 나타나지 않은 것을 알 수 있었다 (도 3 참조). 이러한 결과는 Pak1/LIMK1/코필린 경로가 AC에서는 우세하지 않음을 나타낸 것이며, p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린의 단백질의 발현 수준을 측정함으로써, 정상 조직 및 선암과 구별되게 편평상피세포암을 특이적으로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 폐암 조직과 병행하여 SCC 및 AC 세포주인 SK-MES-1 및 A549 세포주에서 Pak1/LIMK1/코필린 경로 단백질의 발현을 비교한 결과, SK-MES-1(SCC 타입) 세포에서 상기 단백질의 발현이 증가한 것으로 나타났으며, SCC와 AC간의 세포 이동에 대한 차이를 조사하기 위해, 상처-치유 및 이동 어세이를 수행한 결과, A549 세포와 비교할 때 SK-MES-1 세포에서 이동 및 침윤이 현저하게 높은 것을 확인하였다 (도 4 참조).

본 발명에서 “단백질 발현수준 측정”이란 편평상피세포암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 편평상피세포암 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

다른 양태로서, 본 발명은 p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는, 편평상피세포암 진단 마커 조성물을 제공한다.

바람직하게, 상기 조성물은 p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 조성물일 수 있다.

본 발명에서, “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 편평상피세포암 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 편평상피세포암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 상기 편평상피세포암 진단용 조성물을 포함하는 편평상피세포암 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 편평상피세포암 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

바람직하게는, 웨스턴 블랏 또는 조직 면역 염색법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 상기 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 상기 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 편평상피세포암 진단용 조성물 또는 상기 편평상피세포암 진단 키트를 이용하여, 폐암 중 편평상피세포암을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

구체적인 일 양태로서, 본 발명은 편평상피세포암 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린의 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

바람직하게, 상기 단백질 수준을 측정하는 단계는 p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린 단백질에 특이적인 항체를 편평상피세포암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 단백질 수준과 비교하는 단계는 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계일 수 있다.

본 발명에서 용어 “생물학적 시료”란 편평상피세포암 발병에 의해 편평상피세포암 마커의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 편평상피세포암 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 편평상피세포암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 편평상피세포암 의심 환자의 실제 편평상피세포암 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 편평상피세포암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)₈ , [Os(bpy) ₃ ] ²⁺ ,[RU(bpy) ₃ ] ²⁺, [MO(CN) ₈ ] ^4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I , ¹⁸⁶Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

바람직하게, 상기 단백질 발현수준 측정은 상기 편평상피세포암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 편평상피세포암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 단백질의 발현량과 편평상피세포암이 발병한 세포에서의 마커 단백질의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다. 또한, 바람직하게는, 상기 편평상피세포암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 폐 상피 조직 및 편평상피세포암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 um 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또다른 양태로서, 본 발명은 폐암 절제 수술의 재발 및 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 폐암 절제 수술을 받은 환자의 생물학적 시료로부터 p-코필린의 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 p-코필린을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "예후 예측을 위한 마커(prognostic marker)"란 편평상피세포암 절제 수술 등 폐암 치료 후에 병의 경과, 생존 여부 또는 완치 여부를 확인할 수 있는 물질로, 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 편평상피세포암 예후 예측용 마커는 p-코필린 단백질이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 43명의 비소세포폐암 환자로부터 채취한 종양 세포의 면역조직화학 분석을 하고, 수술받은 환자를 3년간 추적한 결과, SCC 환자의 40.7% (n=12)가 국소 침윤(n = 10) 또는 간, 뇌, 및 뼈로 원격 전이(n = 3)가 나타난 반면에, AC 환자의 6.7%만이 재발한 것으로 나타났다. 이들 간의 차이는 p코필린의 발현 차이와 밀접하게 관련이 있는 것으로 나타났다 (도 5 참조). 따라서, p-코필린의 발현 수준을 측정하여 이를 폐암 절제 수술을 받은 환자의 재발, 전이, 침윤과 같은 예후 예측을 위한 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

상기에서 상세히 설명한 바와 같이, 세포 골격 신호 안에 있어서의 코필린 및 이의 상류에 존재하는 효소인 Pak1과 LIMK1의 인산화 정도가 정상 폐 조직 또는 선암과 비교할 때 편평상피세포암 조직 및 세포에서 특이적이므로, 이를 편평상피세포암 마커로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 SCC 또는 AC를 가진 환자로부터 획득한 폐 절개 조직에서의 H&E 염색 및 p-코필린 면역염색의 대표적 이미지를 나타낸 것이다. (A)는 SCC 및 AC에서의 H&E 염색의 비교이고, (B)는 항-p-코필린 항체를 이용한 SCC 및 AC 샘플의 면역조직화학적 분석을 나타낸 것이다 (Scale bars = 100 μm).
도 2는 10개의 대표적인 인간 정상 폐 조직 (N)과 SCC (T) 쌍에서 Pak1/LIMK1/코필린 신호 경로 단백질의 발현을 나타낸 것이다. ROCK1, p-Pak1, 전체 Pak1, p-LIMK1, 전체 LIMK1, p-코필린, 및 전체 코필린을 웨스턴 블랏 분석법에 의해 조사하였다. β-액틴을 로딩 대조구로 사용하였다. 샘플을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 트랜스블랏된 단백질을 각각의 항체를 이용하여 프로브하였다.
도 3은 9개의 대표적인 인간 정상 폐 조직 (N)과 AC (T) 쌍에서 Pak1/LIMK1/코필린 신호 경로 단백질의 발현을 나타낸 것이다. ROCK1, p-Pak1, 전체 Pak1, p-LIMK1, 전체 LIMK1, p-코필린, 및 전체 코필린을 웨스턴 블랏 분석법에 의해 조사하였다. β-액틴을 로딩 대조구로 사용하였다. 샘플을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 트랜스블랏된 단백질을 각각의 항체를 이용하여 프로브하였다.
도 4는 SK-MES-1 및 A549 세포에서 Pak1/LIMK1/코필린 신호 단백질의 발현 결과와이동 및 침윤의 in vitro 어세이를 나타낸 것이다. 도 4a는 SCC (SK-MES-1) 및 AC (A549) 세포주에서 Pak1/LIMK1/코필린 신호 경로의 웨스턴 블랏 분석결과이고, 도 4b는 2차원 세포 이동 어세이 시스템에서 인간 폐암 세포의 이동을 나타낸 것으로서, 상단은 SK-MES-1 및 A549 monolayer의 상처 후 0, 9 및 24시간이 지난 후 상처 부위의 상-대조 이미지를 나타낸 것이며, 하단은 상처-치유 퍼센티지를 나타낸 것이다. 각 바는 세 번의 독립적인 실험 평균 ± SEM 을 나타내며, 별표는 초기치와 유의미한 차이를 지시하는 것이다 (P < 0.05). 도 4c는 3차원 세포 이동 어세이 시스템에서의 폐암 세포의 이동을 나타낸 것으로서, 상단은 이동 세포의 대표적인 현미경 이미지를 나타내며, SK-MES-1 및 A549 세포 (15,000 cells/well)를 트랜스웰 배양 인서트에 시딩하고 6시간 동안 37℃에서 배양한 것을 나타낸 것이며, 하단은 이동 퍼센티지를 나타낸 것이다. 각 바는 네 번의 독립적인 실험 평균 ± SEM 을 나타내며, 별표는 A549 세포와 유의미한 차이를 지시하는 것이다 (P < 0.05). 또한 도 4d는 SK-MES-1 및 A549 세포 침윤 어세이를 나타낸 것이다. 맴브레인의 바닥에 침윤된 세포를 염색하였다. 각 바는 세 번의 독립적인 실험 평균 ± SEM 을 나타내며, 별표는 A549 세포와 유의미한 차이를 지시하는 것이다 (P < 0.05).
도 5는 SCC를 가진 환자로부터 획득한 폐 절개 조직에서의 p-코필린 면역염색의 대표적 이미지를 나타낸 것이다. (A)는 SCC I, II, III, 및 IV기에서의 SCC에서의 p-코필린의 발현을 나타낸 것이고, (B)는 절개 후 3년 이내에 종양 재발이 AC를 가진 환자보다 SCC를 가진 환자에서 더 높은 결과를 나타낸 것이다. 종양 재발은 국소 침윤 및 원격 전이로 나타났다(Scale bars = 200 μm).

이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험재료 및 실험방법

환자 및 조직 샘플

모든 환자는 국립 경상대학교 병원(대한민국 진주 소재)에 계속하여 내원한 환자로서 2005년 5월부터 2009년 6월 사이에 동일한 외과의사(Jang I)로부터 수술받은 환자이었다. SCC(n = 27)와 AC(n = 15)를 가진 총 42명의 수술받은 환자로부터 종양 샘플을 얻어, -80℃에서 냉동 및 저장하였다. 진단은 조직 샘플의 병리학적 검사에 기초하여 이루어졌다. 종양 샘플의 특징은 하기 표 1에 상세히 정리하였다. 환자는 38세에서 69세의 연령 범위였고 7명은 여자이고 35명은 남자였다. 웨스턴 블랏 분석법을 위하여, 종양 조직 및 인접하는 정상 폐조직을 선별된 SCC (n = 10) 및 AC (n = 9) 샘플로부터 랜덤하게 수거하였다. 인간 조직 샘플의 이용 및 하기에서 기술되는 실험 과정은 모두 경상대학교 병원의 윤리위원회의 감독 및 승인을 받아 이루어졌다.

세포배양

폐암 세포주(SK-MES-1 및 A549)를 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)으로부터 구입하였다. SK-MES-1 세포를 5%-10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 (Sigma, St. Louis, MO, USA)으로 보충된 EMEM에서 배양하고, A549 세포를 5%-10% FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 (Sigma, St. Louis, MO, USA)으로 보충된 DMEM에서 배양하였다.

항체

본 실시예에서는 하기 일차 항체를 사용하였다: 래비트 항-ROCK1 (160 kDa; Cell Signaling Technology, MA, USA), 래비트 항-포스포 (p)-Pak1 (ser144, 61-67 kDa; Cell Signaling Technology), 래비트 항-Pak1 (70 kDa; Cell Signaling Technology), 래비트 항-p-LIMK1 (72 kDa; Cell Signaling Technology), 래비트 항-LIMK1 (70 kDa; Cell Signaling Technology), 래비트 항-p-cofilin (19-21 kDa; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 및 고오트 항-cofilin (19 kDa; Santa Cruz Biotechnology).

이동 어세이

2차원 이동 상처-치유 어세이를 위하여, 세포를 1X10⁵ cells/well의 밀도로 6-웰 배양 디쉬에 시딩하였다. 컨플루언스에 도달한 후, 세포를 멸균 피펫 팁으로 스크래치하여 단일막에 600-μm wide defect를 형성시켰다. 그런 다음, 세포를 PBS로 세척하고 새로운 배지에서 배양시켰다. 지시된 기간 동안 배양 후에 광학현미경으로 찍었다. 상대적인 세포 이동 거리(상처 클로저)를 상처 너비를 현미경(Axiovert 40C, Carlzeiss MicroImaging, Gottingen, Germany) 하에 측정하여 조사하였고, 초기수치(initial wound width at 0 h)에서 상기 값을 차감하였다. 각 웰에서 세 번의 스크래치를 통해 얻은 상기 데이터를 상처 클로저의 퍼센티지로 변환하였다.

트랜스웰 이동 어세이

3 차원 세포 이동을 폴리카보네이트 맴브레인 인서트 (8-μm pore membrane; Cell Biolabs, Inc., CA, USA)를 포함한 CytoSelect^TM Cell Migration Assay Kit를 이용하여 제조자의 지시대로 분석하였다. 간단히 설명하면, 0.5 x 10⁵ cells/ml을 포함하는 세포 현탁액을 무혈청 배지내에 제조하고, 각 인서트의 상층 챔버에 첨가하였다. 하층 챔버는 10% FBS (chemotactic stimulus)를 포함하였으며, 트랜스웰 배양 인서트의 하층 페이스를 향한 세포 이동을 하도록 두었다. 상기 세포는 습윤한 5% CO2/95% 대기 환경에서 6시간 동안 37℃에서 배양하였다. 트랜스웰 배양 인서트의 내부 면에 이동하지 않은 세포를 부드럽게 면봉으로 문질러 제거하였다. 바닥 면에 남아있는 이동한 세포를 0.5% crystal violet으로 10분간 실온에서 염색하였다. 각 인서트당 microscope (Axiovert 40C)를 사용하여 5개의 개별 필드의 현미경 사진을 찍었으며, 상기 세포 수를 세어서 이동한 세포의 평균 수를 계산하였다. 상기 염색된 인서트를 세척한 후 추출 용액(1% Triton X-100)에 10분 동안 배양하여 용해시켰다. 각각의 샘플을 96-웰 마이크로티터 플레이트에 옮기고 흡광도 560nm에서 플레이크 리더(Infinite® F200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)로 측정하였다.

침윤 어세이

SK-MES-1 및 A549 세포의 침윤정도를 제조사의 지시에 따라 quantitative CytoSelectTM 96-well Cell Invasion Assay (Cell Biolabs)를 사용하여 조사하였다. 실험 기구 및 어세이 프로토콜은 트랜스웰 이동 어세이에서 사용된 것과 기본적으로 유사하다. 간단히 설명하면, 무혈청 배지에 0.5X10⁵ cells/ml의 밀도로 부유된 SK-MES-1 및 A549 세포를 배양 인서트(coating of a uniform layer of dried basement membrane matrix solution 포함)에 시딩하였고, 상기 세포를 24시간 동안 베이스먼트 멤브레인막을 침투하도록 방치하였다. 상기 멤브레인을 통해 침투된 세포를 0.5% crystal violet으로 염색하였고, 면봉으로 문질러 막의 상층 표면에 있는 침윤되지 않은 세포를 제거한 후 현미경으로 관찰하였다. 침윤정도를 침윤한 세포수를 카운트하고 평균을 계산하여 정량하였다.

웨스턴 블랏 분석법

조직으로부터 단백질을 추출하기 위하여, 냉동 폐 조직을 형질전환된 세포를 200 μL 의 lysis buffer (15 mM HEPES pH 7.9, 0.25 M sucrose, 60 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride, and 2 mM NaF)를 포함하는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 트랜스퍼하였다. 균질화된 조직을 아이스에서 10분 동안 배양한 후 초음파 처리하였다. 그런 다음, 샘플을 14,240 x g 에서 4℃에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 새 바이알에 트랜스퍼하였다. 세포로부터 단백질 추출을 위하여, 세포를 PBS로 두 번 세척한 후 용해 버퍼로 용해시켰다. 조직 및 세포 용해물에서 단백질 농도를 Bio-Rad protein assay (Bio-Rad, USA)를 사용하여 정량하고, 샘플을 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. 각각의 단백질 분석을 위해, 폐 용해물(30 μg per lane)을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리한 후,polyvinylidene difluoride membrane (Millipore, MA, USA)위에 전기영동하여 트랜스퍼하였다. 상기 membranes을 각각의 항체로 프로브하였고 enhanced chemiluminescence substrate (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 시각화하였다. 상기 membrane을 동등한 단백질 로딩에 대한 대조구로서 항β-actin 항체로 재프로브하였다.

면역조직화학법

면역조직화학적 분석을 위하여, 파라핀-임베딩 폐 조직을 5μm두께 절편으로 절개하고 절편을 젤라틴-도포 슬라이드에 부착하였다. 절편을 탈파라핀화하고, 그래이드 알콜로 리하이드레이트하였고 아비딘-비오틴 면역퍼옥시다제법을 이용하여 프로세스하였다. 간단하게, 샘플 슬라이드를 래비트 항-p-코필린 항체(diluted 1:500; Santa Cruz Biotechnology)로 4℃에서 밤새 배양하였다. 0.1 M PBS로 세 번 세척한 후 절편을 이차 비오틴화 항체(1:200)로 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 0.1 M PBS로 추가로 세 번 세척한 후, 절편을 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합 용액(ABC solution, Vector Laboratories, CA, USA)으로 배양한 후, 0.05% H₂O₂를 포함한0.05% diaminobenzidine (DAB, Sigma)로 디밸럽시켰다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 대조염색한 후 그래이드 알콜로 디하이드레이트하고, 크실렌으로 클리어하였다. 그런 다음, Permount (Sigma)로 커버슬립-마운트시켰다. 상기 절편을 BX51 light microscope (Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 시각화하였으며, 디지탈 이미지를 캡쳐하여 기록하였다.

통계

SCC와 AC 종양 조직 또는 세포주간 차이를 two-tailed unpaired Student t-tests를 사용하여 조사하였다. 수치는 평균값 ± 표준편차(SEM)으로 표시하였다. P값 < 0.05인 경우 통계학적으로 유의미한 것으로 간주하였다.

실험결과

SCC 또는 AC에 대해 수술한 환자 42명의 임상병리학적 특징은 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

1. SCC 에서 p- 코필린 면역염색이 증가하였으나 AC 에서는 증가하지 않음.

도 1의 (A)는 케라틴화된 특징을 가지는 편평세포 분화를 보이는 SCC 폐 조직과, 분비선 유사 구조를 가지는 저분화된 선암 특성을 보이는 AC 조직을 나타낸 것이다. p-코필린에 대한 양성 염색은 SCC로부터 얻은 조직 절편에서 종양 세포에 배타적으로 제한되어 나타났으며, 세포질에 국한되었다; AC 조직에서는 p-코필린 면역염색이 탐지되지 않았다 (도 1의 (B)).

2. 정상 폐 조직 및 SCC 에서의 Pak1 / LIMK1 / 코필린 경로 단백질의 발현조사

코필린의 상류를 평가하기 위해, 수술로 절개한 폐 SCC의 27개의 매치된 쌍으로부터 10개의 대표적인 폐 조직 샘플을 조사하여, SCC 폐 조직에서의 Pak1/LIMK1/코필린 경로 단백질을 분석하였다 (도 2 참조). 모든 종양 샘플에서 Pak1/LIMK1/코필린 경로 단백질의 발현은 대응되는 인접한 정상 폐 조직의 샘플과 비교할 때 증가한 것으로 나타났다. ROCK1의 경우, 10개의 샘플 쌍 중에서 3개 (T3, T4, 및 T10)에서 과발현되었으나, 전체 ROCK1 발현은 정상 폐 조직과 SCC간에 별 차이가 없었다. 또한, 다른 종양 단계간 p-코필린 발현 차이는 나타나지 않았다.

3. 정상 폐 조직과 AC 에서의 Pak1 / LIMK1 / 코필린 경로 단백질의 발현조사

웨스턴 블랏 결과, Pak1/LIMK1/코필린 경로 단백질이 모든 AC 폐 조직에서 과발현된 것은 아님을 알 수 있었다 (도 3). p-Pak1은 한 개의 샘플 (T3)을 제외하고 AC 종양 조직에서 발현되지 않았다. 모든 정상 조직 및 AC 종양 샘플에서 p-LIMK1의 발현은 나타나지 않았다. 전체 LIMK 단백질 및 p-코필린의 수준이 9개의 샘플 쌍 중 각각 3개 및 4개에서 AC 조직에서 현저히 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Pak1/LIMK1/코필린 경로가 AC에서 우세하지 않음을 나타내며, 정상 폐 조직과 AC 조직간에 ROCK1 발현 차이는 크지 않은 것을 알 수 있다.

4. A549 세포와 비교하여 SK - MES -1 세포에서 Pak1 / LIMK1 / 코필린 경로가 상향조절됨

인간의 폐암 조직에 대한 실험과 병행하여, 본 발명자는 대응하는 SCC 및 AC 세포주에서 Pak1/LIMK1/코필린 경로 단백질의 발현을 웨스턴 블랏 분석법을 이용하여 조사하였다 (도 4a 참조). 인간의 17개의 폐 조직에서의 결과와 마찬가지로, A549 (AC 타입) 세포와 비교할 때 SK-MES-1 (SCC 타입) 세포에서 Pak1/LIMK1/코필린 경로 단백질의 발현이 증가한 것으로 나타났다. 인간 SCC 및 AC 조직에서와 마찬가지로 ROCK1 발현은 양 세포주간에 별 차이가 없었다.

5. A549 세포에서보다 SK - MES -1 세포에서 이동 및 침윤이 증가함.

SCC와 AC 세포 타입 사이의 세포 이동에 대한 차이를 조사하기 위해, 상처-치유 및 트랜스웰 이동 어세이를 수행하였다 (도 4b 및 4c 참조). 도 4b에서 보듯이, 24시간째에 상처 클로저(wound closure)는 A549 세포 (22.8% ± 9.3%)에서보다 SK-MES-1 세포에서 현저하게 보다 확고해졌다 (65.5% ± 8.6%; P < 0.05). 상처 치유는 세포 이동 및 증식을 포함하여 많은 세포 활성과 관련된 복잡한 프로세프이기 때문에, 본 발명자는 3차원적 이동 어세이를 수행하여 SK-MES-1 세포의 더 큰 이동 능력을 확인하고자 하였다. 상기 실험재료 및 실험방법에서 기술하였듯이, chemotactic stimulus (10% FBS)를 향한 세포 이동을 모니터하기 위해, 트랜스웰 어세이를 수행하였다. 그 결과, 이동한 세포의 퍼센티지가 A549 세포(0.06% ±0.02%)보다 SK-MES-1 세포(20.3% ± 6.6%)에서 현저하게 높은 것을 확인하였다. SK-MES-1 세포의 침윤성 또한 A549 세포와 비교할 때 약 50% 정도 증가하였다 (도 4d 참조).

6. 국소 침윤 또는 원격 전이가 나타난 환자 수가 AC 조직보다 SCC 폐 조직에서 더 높음.

42 NSCLC 환자 모두로부터 획득한 종양 세포의 면역조직화학 분석을 수행하였다. 웨스턴 블랏 분석 결과, p-코필린 수준의 변화는 그리 크지 않은 것으로 나타났으나, p-코필린 발현은 SCC 환자의 조직학적 단계와 관련이 있는 것으로 나타났다. SCC 의 III기 및 IV기 조직에서 p-코필린 면역염색이 I기 및 II기보다 더 강한 것으로 나타났다 (도 5a 참조). 또한, 처음 진단 및 수술받은 43명의 환자를 3년 동안 추적한 결과, 이들 중 SCC 환자의 40.7% (n=12)가 국소 침윤(n = 10) 또는 간, 뇌, 및 뼈로 원격 전이(n = 3)가 나타났다. 이와 대조적으로, AC 환자의 6.7%만이 재발하였고, 한 명의 AC 환자만이 뇌로 원격 전이된 것으로 나타났다.

Claims (8)

1. p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 폐암 중 편평상피세포암 진단을 위한 마커 검출용 조성물.
2. 제1항에 있어서, p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 폐암 중 편평상피세포암 진단용 키트.
5. 편평상피세포암 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 p-Pak1, p-LIMK1, 및 p-코필린의 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
   상기 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 폐암 중 편평상피세포암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 단백질 수준은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것인 편평상피세포암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 편평상피세포암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
8. 폐암 절제 수술의 재발 및 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 폐암 절제 수술을 받은 환자의 생물학적 시료로부터 p-코필린의 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 p-코필린을 검출하는 방법.

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