KR20240068432A - 혈액 내 단백질 바이오마커를 포함하는 암 진단용 키트 - Google Patents
혈액 내 단백질 바이오마커를 포함하는 암 진단용 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 다양한 암 환자의 혈청에서 바이오마커인 Defensin-1 alpha(DEFA)의 농도를 정량적으로 측정하여 암 발생 여부를 빠르고 간편하게 진단할 수 있는 혈액 내 단백질 바이오마커를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
Description
본 발명은 암 진단용 키트에 관한 것으로, 더 상세하게는 혈액 내 단백질 바이오마커를 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다.
2022년 발표된 국가통계포털 자료에 따르면 2019년 전체 암(C00-C96) 발생자는 254,718명으로(295.8명/10만명)[국가통계포털 KOSIS 참조] 2001~2005년 암환자 발생 586,990명 대비 2015~2019년 암환자 발생은 1,057,524명으로 증가 추세에 있다. 5년 상대 생존율은 2015~2019년 70.7%로 비교적 높지만 (2001~2005년 54.1% 대비), 사망자는 2020년 82,204명으로 (2000년 58,197명 대비) 매해 꾸준한 증가 추세를 나타내고 있다. 따라서 암과 암 주변 조직, 혈액, 소변, 대변, 및 타액 등 다양한 인체 유래물을 이용하여 진단 민감도와 정확도가 높은 암 표적을 도출하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 암 진단은 조직 검사와 같은 침습적인 방법에 의존적이지만 비침습적 방법인 액체 생체검사(Liquid Biopsy)에 의한 검체 확보가 간편하여 암 발생 및 전이 등을 판단하기 위해 이용되고 있다. 이상적인 바이오마커는 질병 진단에 매우 민감하고 특이적이어야 하며 간단히 측정 가능하여 환자에게 위험성이 최소화되는 방법이어야 한다. 또한 바이오마커를 기반으로 치료를 조절할 수 있어야 하며 임상에 적용할 수 있도록 신속 정확한 검사가 가능해야 한다. 종래 암 진단을 위해 사용되는 ctDNA, CTC, 엑소좀, Circulating RNA, miRNA, 및 TEP 등을 이용한 혈액을 검체로 하여 암 바이오마커 개발이 많은 연구 그룹에서 활발히 진행되고 있으나, 혈중 농도와 검출 효율이 낮거나 분석방법 및 데이터 분석법에 대한 검증이 필요한 부분이 많고 특히 이들을 혈액에서 분리하는 과정이 복잡하여 전반적인 진단과정이 복잡해지고 신속 진단이 어렵다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허 제2012-0009903호는 암 진단 키트 및 암 예방 치료용 약제학적 조성물에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술은 암 진단 바이오마커 도출 및 검사 방법 개발은 매우 어렵고 복잡한 과정이므로 간편 진단이 어려운 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 다양한 암 환자의 혈청에서 바이오마커인 Defensin-1 alpha(DEFA)의 농도를 정량적으로 측정하여 암 발생 여부를 빠르고 간편하게 진단할 수 있는 혈액 내 단백질 바이오마커를 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 개체로부터 수득한 시료 내 존재하는 Defensin-1α 단백질 마커 검출용 시약을 유효성분으로 포함하는, 암 진단용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 개체로부터 수득한 혈청 시료로부터 Defensin-1α 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보 제공방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 혈액 내 단백질 바이오마커를 포함하는 암 진단용 키트는 혈청 내 Defensin-1 alpha(DEFA)의 농도가 정상인에 비해 암(간암, 췌장암, 대장암, 전립선암 및 위암) 환자에게서 유의미하게 감소하는 결과를 기반으로 암을 빠르고 간편하게 스크리닝 할 수 있으므로 암 조기 진단 및 예후 모니터링에 활용가능하다. 또한 상기 바이오마커를 이용한 키트를 개발하여 병원에서 대용량 검사 및 현장에서의 신속한 진단에 활용할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 정상인 및 여러 암환자의 혈청을 대상으로 바이오마커인 Defensin 1-alpha의 농도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 정상인 혈청(normal)과 암(간암, 췌장암, 대장암, 전립선암, 위암) 환자의 혈청에서 바이오마커인 Defensin 1-alpha의 농도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 정상인 혈청(normal)과 암(간암, 췌장암, 대장암, 전립선암, 위암) 환자의 혈청에서 바이오마커인 Defensin 1-alpha의 농도를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "Defensin-1 alpha(DEFA)"은 3쌍의 분자내 이황화 결합을 포함하는 2-6kDa의 양이온성 살균 펩타이드로 알파 서브패밀리의 포유동물 디펜신 펩티드 패밀리로 포유류에서는 크립딘이라고도 하며 소장에서 생성된다. 많은 그람 음성 및 그람 양성 박테리아, 진균 및 외피 바이러스에 대해 활성을 나타내고 특히 호중구, 특정 대식세포 개체군 및 소장의 Paneth 세포에 풍부하다.
본 문서에서 사용되는 용어 "항체유사체(antibody mimetic)"는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄가 이종사합체의 4차구조를 형성하여 기능을 발휘하는 통상의 전장 항체와 달리, nanobody, monobody, 가변 림프구 수용체(VLR) 등 비항체 유래의 단백질 스캐폴드로부터 제조되는 항체와 유사한 기능을 담당하는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "진단"은 질병 발생 가능성을 예측하거나 질병 발생 위험도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "바이오마커(biomarker)"는 진단할 수 있는 물질, 즉 생물학적 시료에서 암 발생 여부를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 개체와 암 발생 개체 간에 유의적인 차이를 보이는 폴리펩타이드, 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "조기위암(early gastric cancer, EGC)"은 위에서 발생하는 악성 종양으로, 림프절로의 전이와 관계없이 암세포가 점막 또는 점막하층에 국한된 경우를 말한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "진행성위암(advanced gastric cancer, AGC)"은 암이 위의 점막하층을 지나 근육층 이상을 뚫고 들어간 경우를 의미하는데 이는 암이 위에만 국한되어 있지 않다. 위 주위의 림프절에 퍼져 있거나, 간, 췌장, 횡행결장 및 비장 등의 주변 장기로 전이되거나, 림프절 또는 혈관을 따라서 간, 폐, 뼈 등으로 전이되어 있을 가능성이 높다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 일 관점에 따르면, 개체로부터 수득한 시료 내 존재하는 Defensin-1α 단백질 마커 검출용 시약을 유효성분으로 포함하는, 암 진단용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장 및 혈청으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있고 상기 암은 간암, 췌장암, 대장암, 전립선암 또는 위암으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며 상기 위암은 조기위암(EGC) 또는 진행성위암(AGC)일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 검출용 시약은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편, 항체 유사체, 앱타머, 화합물 또는 질량분석용 시약일 수 있고 상기 항체의 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, sdAb, VHH 또는 VNAR일 수 있으며 상기 항체 유사체는 애필린(Affilin), 애피바디(Affibody), 애피머(Affimer), 애피틴(Affitin), 알파바디(Alphabody), 앤티클린(Anticlin), 아비머(Avimer), 다르핀(DARpin), 피노머(Fynomoer), 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunitz domain peptide), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(VLR), Minibody, Diabody, Tetrabody, Triabody, 또는 Peptabody일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 효소결합면역흡착측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay), 또는 측면유동면역분석법(Lateral-flow immunoassay)의 형태를 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 개체로부터 수득한 혈청 시료로부터 Defensin-1α 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보 제공방법이 제공된다.
상기 제공방법에 있어서, 상기 Defensin-1α 단백질의 농도가 대조군 보다 현저히 낮게 검출되면 암으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때 상기 개체는 인간이거나 인간을 제외한 포유동물일 수 있다.
본 발명의 암 진단용 키트는 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수도 있다.
적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
상기 진단용 키트가 ELISA 키트인 경우, 바람직하게 마커 단백질에 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소(예:항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수도 있다.
상기 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 같은 다양한 분자와 결합하여 변형될 수 있다. 변형된 항체는 화학적으로 항체를 변형하여 수득할 수 있다. 이러한 변형 방법은 당업계에서 통상적으로 사용된다. 또한, 상기 항체는 비인간 항체로부터 유래한 변형 부위(variable region)와 인간 항체로부터 유래한 불변 부위(constant region)가 결합된 키메라 항체(chimeric antibody)로 수득되거나, 또는 인간이 아닌 항체로부터 유도된 상보성 결정 부위를 포함하여 인간 항체로부터 유도된 구조 부위(frame work region, FR)와 불변부위가 결합된 인간화 항체(humanized antibody)로 수득될 수 있다. 이러한 항체는 당업계에 알려져 있는 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
오믹스(omics) 기술의 보급으로 바이오마커 개발을 위한 스크리닝이 용이하여 관련 진단마커 개발을 위한 연구가 활발해지고, 신약개발 프로세스 중 평가과정에도 진단마커가 활용되고 있다. 현재 임상에 활용 중인 바이오마커로는 당뇨의 진단에 쓰이는 혈중포도당, 고지혈증의 진단에 쓰이는 혈중콜레스테롤이 대표적이고, 암 진단용으로는 전립선암 지표 Prostate-Specific Antigen(PSA), 대장암용 Carcinoembryonic Antigen(CEA), 고환암과 간암 지표 Alphafetoprotein (AFP) 등이 있다. 바이오마커는 특성 및 용도에 따라 Screening biomarker, Prognostic biomarker, Stratification biomarker, Efficacy biomarker, Mechanism of action biomarker, Toxicity biomarker, Translation biomarker, Disease biomarker, Staging biomarker, Surrogate biomarker, 및 Target biomarker 등으로 구분된다. 그러나 다양한 암종의 특성과 용도에 따른 바이오마커들이 개발되고 있으나 제품화에 대한 안정성이 미흡한 실정이다. 같은 암종이라도 환자마다 종양의 유전적 특성이 다양하고 동일 종양 생검에서도 tumor center와 invasive front 부위의 유전자 발현 특성이 다르며, 원발부위와 원격전이 부위의 암 특성도 달라서 조직을 이용해 민감도와 정확도가 높은 표적마커를 도출하기 매우 어려운 실정이다. 반면 혈액 등 액체 생검은 비교적 일관된 암 환경을 반영하고 있고, 일반적인 진단 목적의 임상병리 검사 과정에서 시료를 간편하게 수집할 수 있는 장점이 있다. 예컨대, 혈류 순환 종양 DNA (Circulating Tumour DNA, ctDNA), 순환종양세포(CTC, Circulating Tumor Cells), 미소낭포 및 엑소좀(Exosome), Circulating RNA와 micro RNA (miRNA), Tumor educated platelets(TEP) 등은 암 바이오마커를 개발하기 위해 사용되는 대표적인 혈중 표적이다. ctDNA와 CTC는 혈중 농도와 검출 효율이 낮은 단점이 있고 미소낭포 및 엑소좀은 서로 구분이 어려우며 혈중 검출 방법에 제한점이 있다. 또한 miRNA는 분리 및 정량화에 사용되는 분석방법, 데이터 분석법에 대한 추가 검증이 필요하므로, 진단과정이 복잡하고 신속하지 못하다. 따라서 채혈 시료를 간단한 처리 후 직접 사용하여 암 진단에 적용할 수 있는 암 표적 개발이 필요하다. 바이오마커인 Defensin-1 alpha(DEFA)를 혈중 암 진단마커로 제시한 문헌은 는 확인되지 않았으나 이를 포함하는 일부 암종 및 인간 질환과의 연관성이 보고된 문헌을 확인하였다(예컨대, Daniel A Holterman et al., Urol Oncol. Mar-Apr;24(2):97-108. 2006). 이에 본 발명자들은 혈청에서 암을 진단할 수 있는 표적 마커를 도출하고자, 혈청 분석 후 도출된 표적 단백질의 암 종별 진단 민감도와 정확도를 검증함으로써 혈청을 이용한 혈액 내 단백질 바이오마커를 포함하는 암 진단용 키트를 개발하였다. 본 발명자들은 채혈 시료의 처리 과정을 간소화하여 검체로 사용함으로써 상기 키트를 이용하여 혈청 내 Defensin-1 alpha(DEFA)의 농도를 측정하였고 상기 농도의 정량을 통해 대조군(정상인)에 비해 간암, 췌장암, 대장암, 전립선암 및 위암 환자에게서 유의미하게 감소하는 결과를 도출하였다. 따라서 본 발명의 키트는 혈청을 검체로 ELISA 및 LFA 진단키트에 적용하여 건강검진 시 시행되는 혈액 채취만으로 암 발생 유무를 신속하게 판단할 수 있고 혈청 채취만으로 암을 빠르게 스크리닝 할 수 있으므로 암의 조기 치료 및 예후 모니터링에 적용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예1: 혈청 시료 수집
본 발명자들은 정상인 및 암환자 249명을 대상으로 혈청 시료를 하기와 같이 수집하였다. 피채혈자의 팔에 압박대(tourniquet)를 묶고 SST(serum separating tube)를 이용하여 5 mL의 채혈을 진행한 후 전도 혼합을 통해 응고 및 원심분리하여 수집하였다. 상기 수집된 혈청은 사용 전까지 -80℃ 초저온냉동고에 보관하였다. 최종적으로 상기 혈청 시료는 정상 50개, 간암 20개, 유방암 20개, 췌장암 20개, 대장암 20개, 난소암 20개, 전립선암 20개, 폐암 20개, 조기위암 24개, 및 진행성위암 35개를 수집하였다.
실시예 2: 진단마커의 발현 수준 분석
본 발명자들은 상기 수집한 시료를 대상으로 정상 혈청(normal)과 암(간암, 췌장암, 대장암, 전립선암, 위암) 환자의 defensin-1α 단백질 수준을 Human α-defensin 1 ELISA kit(Cat no. DY8198-05, R&D systems)를 이용하여 정량적으로 분석하였다. 그 결과, 정상인의 혈청에 비해 특정 암(간암, 췌장암, 대장암, 전립선암, 위암)에서 human defensin-1α의 농도가 유의미하게 감소함을 확인하였다(도 1). 이는 상기 암종 중에서 간암, 대장암, 전립선암, 위암에서 현저하였고 특히 위암의 경우는 조기위암(EGC)과 진행성 위암(AGC) 모두 정상에 비해 유의하게 낮게 나타났다(도 2). 상기 결과는 본 발명의 defensin-1α가 다양한 암종을 신속하고 정확하게 진단하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다. 상기 분석한 표준곡선을 통한 농도 정량화 시 defensin-1α의 혈청 내 농도는 하기 표 1에 요약하였다.
| 분류 | 혈청 내 농도 | |
| 평균(ng/ml) | 표준편차 | |
| 정상 | 23.76 | ± 4.11 |
| 위암(EGC) | 16.94 | ± 5.97 |
| 위암(AGC) | 12.77 | ± 3.67 |
| 간암 | 12.24 | ± 3.24 |
| 췌장암 | 13.83 | ± 5.50 |
| 대장암 | 10.49 | ± 4.71 |
| 전립선암 | 9.06 | ± 4.37 |
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
Claims (10)
- 개체로부터 수득한 시료 내 존재하는 Defensin-1α 단백질 마커 검출용 시약을 유효성분으로 포함하는, 암 진단용 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 시료는 혈액, 혈장 및 혈청으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 키트. - 제1항에 있어서,
상기 암은 간암, 췌장암, 대장암, 전립선암 또는 위암으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 키트. - 제3항에 있어서,
상기 위암은 조기위암(EGC) 또는 진행성위암(AGC)인, 키트. - 제1항에 있어서,
상기 검출용 시약은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 기능성 단편, 항체 유사체, 앱타머, 화합물 또는 질량분석용 시약인, 키트. - 제5항에 있어서,
상기 항체의 기능성 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', scFv, di-scFv, sdAb, VHH 또는 VNAR인, 키트. - 제5항에 있어서,
상기 항체 유사체는 애필린(Affilin), 애피바디(Affibody), 애피머(Affimer), 애피틴(Affitin), 알파바디(Alphabody), 앤티클린(Anticlin), 아비머(Avimer), 다르핀(DARpin), 피노머(Fynomoer), 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunitz domain peptide), 모노바디(monobody), 가변 림프구 수용체(VLR), Minibody, Diabody, Tetrabody, Triabody, 또는 Peptabody인, 키트. - 제1항에 있어서,
효소결합면역흡착측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay), 또는 측면유동면역분석법(Lateral-flow immunoassay)의 형태를 특징으로 하는, 키트. - 개체로부터 수득한 혈청 시료로부터 Defensin-1α 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보 제공방법.
- 제9항에 있어서,
상기 Defensin-1α 단백질의 농도가 대조군 보다 현저히 낮게 검출되면 암으로 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2023/017778 WO2024101853A1 (ko) | 2022-11-10 | 2023-11-07 | 혈액 내 단백질 바이오마커를 포함하는 암 진단용 키트 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240068432A true KR20240068432A (ko) | 2024-05-17 |
Family
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