KR20170129118A

KR20170129118A - 췌장암을 위한 바이오마커

Info

Publication number: KR20170129118A
Application number: KR1020177024461A
Authority: KR
Inventors: 타티아나 크르노고라크-주르체비크; 토마슈 라돈
Original assignee: 퀸 메리 유니버시티 오브 런던
Priority date: 2015-02-05
Filing date: 2016-02-05
Publication date: 2017-11-24
Also published as: KR102569984B1; SG11201706223VA; US10782301B2; US11977077B2; CN107533062B; HK1247276A1; US20190204323A1; BR112017016808A2; GB201501930D0; EP3254111A1; IL253710B; AU2016214140B2; AU2016214140A1; CL2017001972A1; MX2017009998A; JP6786499B2; CA2974775C; JP2018504609A; WO2016124947A1; IL253710A0

Abstract

본 발명은 췌장암, 및 이러한 병태, 특히 췌장관 선암종의 진단을 위한 생물학적 샘플 내의 바이오마커의 용도에 관한 것이다. 바이오마커 패널은 LYVE1, REG1 및 TFF1을 포함한다. 치료 방법, 뿐만 아니라 췌장관 선암종의 진단 및 치료에 유용한 키트가 또한 제공된다. 본 발명은 초기 병기의 PDAC를 검출하는데 특히 유용하다.

Description

췌장암을 위한 바이오마커

본 발명은 췌장암, 이러한 병태, 특히 췌장관 선암종의 진단을 위한 생물학적 샘플 내의 바이오마커의 용도에 관한 것이다.

췌장관 선암종 (PDAC)은 췌장에서 발생하는 악성 신생물의 80% 초과를 차지하는 가장 통상적인 외분비 췌장 악성종양이다. 이는 서양에서 암-관련 사망의 네 번째로 가장 통상적인 원인이다. 진단되었을 때, 대다수의 환자는 국소적으로 진행된 질환을 나타내거나 또는 전이가 확립되어 있고, 따라서 환자의 10-20%에서만 수술이 가능하다 (Sener et al. (1999) J Am Coll Surg , 189:1-7). 전체 5년 생존율은 5% 미만인 한편, 수술적 절제 및 보조 화학요법 후의 환자의 5년 생존은 30%에 이를 수 있다.

췌장관 선암종 (PDAC)은 지난 수십년 동안 진단 및 치료 접근법에서의 유의한 개선이 이루어지지 않은 희귀암 중 하나이다. 분자 수준에서 질환을 이해하는 것에서의 상당한 진전에도 불구하고, 신규한 발견이 임상에 이르지 않았고, 대다수의 환자가 여전히 5 내지 6개월의 가혹한 평균 생존에 직면한다. 2013년에 PDAC-관련 사망이 미국에서 38,000명을 초과하고, 유럽에서 40,000명을 초과하면서, 이러한 악성종양은 현재 암-관련 사망의 네 번째로 주된 원인이지만, 2030년에는 두 번째가 될 것으로 예상된다.

PDAC는 가장 검출하기 어려운 암 중 하나이다. 췌장의 복막뒤 위치, 다수의 복합적인 기저 분자 이상, 및 특이적 임상 증상의 결여는 대다수의 환자가 진행된 병기에서 나타나는 것을 초래한다. 따라서 환자의 20% 미만이 잠재적으로 치유적인 수술을 받을 수 있는 한편, 나머지는 단지 고식적 치료만 제공받을 수 있다.

I기 PDAC 종양이 <2 cm의 크기로 아직 췌장에 국한될 때 이의 우발적인 진단 후에 70%에 가까운 5년 생존이 보고된 바와 같이, 이들 우려스러운 수치가 조기 검출을 위한 개선된 도구(들)로 유의하게 변화될 것이다. 중요하게, 더 이른 검출에 대해 약 10년의 상당한 기회의 '창'이 존재한다 (Yachida S, et al. (2010) Nature 467(7319):1114-1117). 잠재적으로 치유적인 수술이 더 이상 실현가능하지 않을 때, 전이성 질환에 대한 현재의 요법의 불량한 효능을 고려하여 초기 병기에서의 검출이 또한 중요하다.

그러나, PDAC의 적시적인 검출을 여러 요인이 방해한다: 질환의 초기 병기에서의 특이적인 임상 증상이 결여됨, 현재의 영상화 양식의 감도가 불충분함, 및 집중적인 노력에도 불구하고, 초기 병기의 질환의 정확한 체액-기반 바이오마커가 결여됨 (리뷰를 위해, 문헌 [Kaur et al. (2012) Biomark Med 6(5):597-612] 참조.). 또한, 초기 병기의 PDAC는 췌장의 양성 염증성 질환이고 PDAC에 대한 위험 인자 중 하나인 만성 췌장염 (CP)과 감별하기가 어렵다. 현재 임상에서 광범위하게 사용되는 유일한 PDAC 바이오마커인 혈청 탄수화물 항원 19.9 (CA19.9)는 루이스-음성 유전자형 환자에서의 거짓 음성 결과, 무증상 집단에서의 불량한 양성 예측치, 및 증상 환자에서의 낮은 감수성 (79%-81%)를 겪는다. 초기 질환 (종양 < 2cm)의 사례의 50% 미만에서 CA19-9 수준이 상승되었지만, 다양한 다른 양성 및 악성 췌장 및 간담도 질환 (만성 췌장염 포함), 뿐만 아니라 관련되지 않은 낭성 및 염증성 질환에서 CA19.9 수준이 상승될 수 있다 (리뷰를 위해, 문헌 [Ballehaninna UK, Chamberlain RS, "Serum CA 19-9 as a Biomarker for Pancreatic Cancer-A Comprehensive Review", Indian J Surg Oncol, 2011; 2:88-100] 참조). 또한, 집단의 약 10%에서 루이스 a/b 항원 (Ca19.9가 이를 인식함)이 발현되지 않는다.

프로테옴 기술이 최근에 췌장암 조직, 췌장액 및 혈청/혈장 검체에서의 단백질 발현을 연구하는데 사용되었지만 (예를 들어, 문헌 [Koomen et al. (2005) Clin Cancer Res, 11:1110-1118] 참조), 이들 중 어느 것도 아직까지는 임상 실무에 적합한 바이오마커의 발견을 초래하지 않았다.

최근, 용이하게, 그리고 비-침습적으로 수득되는 생체액이기 때문에 소변이 바이오마커의 잠재적인 공급원으로서 연구되었다 (Pieper et al. (2004) Proteomics, 4:1159-1174). 혈장과 비교하여, 소변 단백질은 덜 복합적이고, 더욱 열-안정적이다. 또한, 가장 통상적인 단백질 (알부민, 유로모듈린)이 소변 프로테옴의 더 적은 부분을 이루어서, 샘플 프로세싱이 더 적은 예비-클리닝/분획화를 필요로 한다. 소변 단백질의 약 49%가 혈장의 사구체 여과의 가용성 생성물이고 (Barrat et al. (2007) Cmaj, 177:361-368), 따라서 소변 내의 상당수의 단백질이 신장외 공급원으로부터 발생한다 (Thongboonkerd et al. (2005) Curr Opin Nephrol Hypertens, 14:133-139).

비뇨기과 암에 더하여, 여러 암-관련 단백질이 폐암, 난소암 및 유방암 환자의 소변에서 확인되었다.

WO2004/102189는 췌장암 진단용 바이오마커를 기재한다. 췌장암 환자로부터의 혈청 샘플을 건강한 도너로부터의 혈청 샘플과 비교하였고, 생성된 바이오마커를 이들의 가중치에 의해 특성화하였다. 유사한 접근법이 WO2004/099432에서 수행되었고, 이는 췌장암을 검출하기 위한 추가 바이오마커를 제공한다. WO2000/34787은 소변 내의 바이오마커의 수준을 측정하는 것을 수반하는 상피암을 진단하는 방법을 기재한다.

현재 췌장 선암종의 조기 진단을 위한 특이적이고 감수성인 바이오마커가 없다. 췌장 선암종이 초기에 (예를 들어, I기에) 검출될 수 있으면, 이러한 환자의 생존이 크기 개선될 수 있기 때문에 (현재, 대부분의 환자가 <5%의 5년 생존율로 III/IV기에 진단됨), 이는 매우 중요하다. 따라서 조기 검출을 위한 고도로 정확한 바이오마커가 환자의 예후에 유의하게 영향을 미칠 것으로 예상된다.

따라서, PDAC의 조기 진단을 가능하게 할 뿐만 아니라, PDAC와 다른 종양, 그리고 또한 PDAC와 만성 췌장염 (CP)을 감별하는 것을 도울 감수성이고 특이적인 마커 패널이 요구된다. 바람직하게는, 수득이 용이하고 비-침습적이며, 질환을 이의 초기 병기 동안 검출하는데 충분히 감수성인 샘플에서 마커가 검출가능할 것이다.

본 발명의 제1 측면에서, LYVE1, REG1 및 TFF1을 포함하는, 췌장관 선암종 (PDAC) 진단에 유용한 바이오마커 패널이 제공된다. 본원에서의 REG1에 대한 언급은 REG1A 및 REG1B를 포함한다. 일부 실시양태에서, 패널은 CA19.9를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 제2 측면에서, 생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 (예를 들어 REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이들의 조합물의 발현 수준 또는 농도를 검출하는 단계를 포함하는, 췌장관 선암종 (PDAC)에 대해 스크리닝 또는 테스트하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 소변 샘플이다.

본 발명의 제3 측면에서, 췌장관 선암종을 진단하는데 사용하기 위한, LYVE1, REG1 (예를 들어 REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이들의 조합물이 제공된다. PDAC를 검출 또는 진단하는 방법에서의 LYVE1, REG1 (예를 들어 REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 용도가 또한 제공된다.

본 발명의 제4 측면에서, 생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 (예를 들어 REG1A 및/또는 REG1B) 또는 TFF1, 또는 이들의 조합물의 발현 수준 또는 농도를 검출하기 위한 수단을 포함하는, 췌장관 선암종에 대해 테스트하기 위한 키트가 제공된다.

본 발명의 추가 측면에서, 소변 샘플 내의 LYVE1, REG1 (예를 들어 REG1A 및/또는 REG1B) 및/또는 TFF1의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하는, PDAC와 만성 췌장염을 구별하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 각각의 단백질의 발현 수준을 참조물과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 추가 측면에서, 생물학적 샘플 내의 바이오마커 패널 단백질 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및/또는 TFF1의 발현 수준 또는 농도를 검출하는 단계를 포함하는, 초기 병기의 PDAC, 예를 들어 I기 또는 II기 PDAC를 검출 또는 진단하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 각각의 정량화된 단백질의 발현 수준 또는 농도를 참조물과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추가 측면에서, 생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 (예를 들어 REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 또는 이들의 조합물의 발현 수준 또는 농도를 검출하는 단계, 임의적으로 대조군/참조물과 발현 수준을 비교하는 단계, 및 PDAC가 진단 또는 의심되면 PDAC에 대한 치료를 진행하는 단계를 포함하는, 환자에서 PDAC를 치료하는 방법이 제공된다. 생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 (예를 들어 REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 발현 수준 또는 농도를 결정하는 단계, 임의적으로 대조군/참조물과 발현 수준을 비교하는 단계, 및 환자에 대한 예후를 결정하는 단계를 포함하는, 예후 방법이 본 발명에 또한 포함된다.

본 발명의 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 바이오마커는 개별적으로 사용될 수 있거나 (즉, LYVE1, REG1 (예를 들어 REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1 중 단지 1종만), 이들은 쌍으로 사용될 수 있거나 (예를 들어, LYVE1 및 REG1 (예를 들어 REG1A 및/또는 REG1B), LYVE1 및 TFF1, 또는 REG1 (예를 들어 REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1), 3종의 바이오마커가 함께 사용될 수 있거나 (LYVE1 및 TFF1 각각, 및 REG1A 또는 REG1B 중 1종), 또는 4종 모두가 사용될 수 있다 (LYVE1, TFF1, REG1A 및 REG1B). 제5 바이오마커인 CA19.9가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, 유전자 발현을 정량화함으로써 (예를 들어, 생물학적 샘플 내의 mRNA를 정량화함으로써), 또는 단백질 발현을 정량화함으로써 (예를 들어, 생물학적 샘플 내의 단백질 농도를 정량화함으로써) LYVE1, REG1 (예를 들어 REG1A 및/또는 REG1B) 및/또는 TFF1의 발현 수준을 결정할 수 있다.

하기와 같은 다수의 도면을 참조한다:
도 1: 후보 단백질 바이오마커의 소변 농도. A, 건강한 환자, 만성 췌장염 (CP) 환자 및 췌장 선암종 (PDAC) 환자의 소변 내의 ELISA로 분석된 LYVE1, REG1A, REG1B 및 TFF1 단백질 농도 (크레아티닌-정규화)의 산점도. 상부 막대: 크루스칼-왈리스/던 사후 검정, ***: P<0.001; B, 통계적 요약 - 샘플 군에 따라 바이오마커에 대한 원시/크레아티닌-정규화 데이터의 중앙값 및 사분위간 범위 (IQR), 소변 크레아티닌 (mmol/L)의 중앙값 및 IQR, 뿐만 아니라 혈장 CA19.9가 제시된다.
도 2 - 췌장 선암종 환자를 건강한 대조군으로부터 구별하는 것에서의 소변 바이오마커의 진단 성능. A, 트레이닝 세트 (데이터의 70%)에서의 개별적인 크레아티닌-정규화 소변 바이오마커에 대한 PDAC 대상체 (n=143) 대 건강한 대상체 (n=59)의 ROC 곡선; B, 트레이닝 세트 및 독립적인 검증 세트 (데이터의 30%: PDAC n=49, 건강함 n=28)에서의 패널에 대한 PDAC 대 건강함의 ROC 곡선; C, 요약표. AUC: 곡선하 면적, SN: 감수성, SP: 특이성, 상응하는 95% 신뢰 구간 (CI)으로. 검증 세트에서의 SN 및 SP는 트레이닝 데이터세트에서 결정된 최적 컷 포인트에 대해 유도된다. cnorm: 크레아티닌-정규화, creat: 크레아티닌.
도 3 - 상이한 췌장 선암종 병기에서의 3가지 바이오마커의 소변 농도. 건강함 (n=87) 및 상이한 질환 발달 병기에 있는 췌장 선암종 환자 (I-IIA n=16, I-II n=71, III-IV n=77)의 소변 내의 소변 LYVE1, REG1A, TFF1 단백질 농도 (크레아티닌-정규화)의 산점도. 막대는 중앙값 및 IQR 값을 가리킨다. 상부 막대: 크루스칼-왈리스/던 사후 검정, *: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001.
도 4 - 초기 췌장 선암종 환자를 건강한 개체로부터 구별하는 것에서의 소변 바이오마커의 진단 성능. A, 트레이닝 세트 (데이터의 70%)에서의 개별적인 소변 바이오마커에 대한 I-II기 PDAC 대상체 (n=56) 대 건강한 대상체 (n=61)의 ROC 곡선; B, 트레이닝 세트 및 독립적인 검증 세트 (데이터의 30%: PDAC n=15, 건강함 n=26)에서의 패널에 대한 I-II기 PDAC 대 건강함의 ROC 곡선; C, 요약표. AUC: 곡선하 면적, SN: 감수성, SP: 특이성, 상응하는 95% 신뢰 구간 (CI)으로. 검증 세트에서의 SN 및 SP는 트레이닝 데이터세트에서 결정된 최적 컷포인트에 대해 유도된다. cnorm: 크레아티닌-정규화, creat: 크레아티닌.
도 5 - 초기 췌장 선암종 환자를 건강한 개체로부터 구별하는 것에서의 소변 바이오마커 패널 및 CA19.9의 진단 성능. A, 건강함의 소변 (n=28), 및 PDAC I-II기로부터의 소변 (n=71) 및 I-IIA기로부터의 소변 (n=16) (B)을 비교하는, 바이오마커 패널과 상응하는 혈장 CA19.9 단독 및 조합의 ROC 곡선. C, 요약표. AUC: 곡선하 면적, SN: 감수성, SP: 특이성, 95% 신뢰 구간 (CI)으로. 검증 세트에서의 SN 및 SP는 트레이닝 데이터세트에서 결정된 최적 컷포인트에 대해 유도되었다.
도 5C의 범례
^ CA19.9에 대한 최적 컷포인트는 37U/mL이다.
+ 소변 패널이 이분성 바이오마커로서 사용된 혈장 CA19.9 단독과 비교하여 유의하게 더 큰 AUC를 제공하는지 여부 (0.973 대 0.880)를 평가하기 위한 상관된/쌍을 이룬 AUC에 대한 드롱의 단측 검정, p=0.005.
$ 이분성 바이오마커로서 사용된 혈장 CA19.9의 추가가 소변 패널 단독에 비해 AUC를 유의하게 증가시키는지 여부 (0.991 대 0.973)를 평가하기 위한 상관된/쌍을 이룬 AUC에 대한 드롱의 단측 검정, p=0.04.
++ 소변 패널이 이분성 바이오마커로서 사용된 혈장 CA19.9 단독과 비교하여 유의하게 더 큰 AUC를 제공하는지 여부 (0.971 대 0.839)를 평가하기 위한 상관된/쌍을 이룬 AUC에 대한 드롱의 단측 검정, p=0.006.
$$ 이분성 바이오마커로서 사용된 혈장 CA19.9의 추가가 소변 패널 단독에 비해 AUC를 유의하게 증가시키는지 여부 (0.969 대 0.971)를 평가하기 위한 상관된/쌍을 이룬 AUC에 대한 드롱의 단측 검정, p=0.7.
도 6 - 소변 프로테옴 분석. A, 연구 개략도; B, 세포하 위치에 따른 확인된 총 단백질의 분류; 및 C, 인저뉴어티 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis)에 의해 결정된 기능적 활성. H: 건강함, CP: 만성 췌장염, PDAC: 췌장관 선암종, GeLC/MS/MS: SDS-PAGE-액체 크로마토그래피-종렬식 질량 분광측정.
도 7 - 3개의 소변 바이오마커 및 혈장 CA19.9 (CA19.9p)의 상관관계. A, 상관도 (짙은 남색/가장 진함: 건강함; 청록색/가장 밝음: 만성 췌장염 (CP); 자주색/중간: 췌장 선암종 (PDAC). B, 피어슨(Pearson) 상관 계수 및 상응하는 유의성 (NS: 유의하지 않음, *: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001).
도 8 - 모든 병기 (A-C) 및 I-II기 (D-F)의 췌장 선암종을 만성 췌장염 환자로부터 구별하는 것에서의 소변 바이오마커의 진단 성능. A , 트레이닝 세트 (데이터의 70%)에서의 개별적인 소변 바이오마커에 대한 PDAC (n=143) 대 CP (n=62) 환자의 ROC 곡선. B, 트레이닝 세트 및 독립적인 검증 세트 (데이터의 30%, PDAC n=49, CP n=30)에서의 패널에 대한 PDAC 대 CP 환자의 ROC 곡선. C, 요약표. D, 트레이닝 데이터세트 (70%, PDAC n= 56, CP=66)에서의 개별적인 소변 바이오마커의 ROC 곡선. E, 트레이닝 데이터세트 및 검증 데이터세트 (PDAC n=15, CP n=26)에서의 패널의 ROC 곡선. F, 요약표. Cnorm, 크레아티닌-정규화, creat, 크레아티닌, AUC: 곡선하 면적, SN: 감수성, SP: 특이성, 95% 신뢰 구간 (CI)으로. 검증 세트에서의 SN 및 SP는 트레이닝 데이터세트에서 결정된 최적 컷포인트에 대해 유도되었다.
도 9 - 초기 췌장 선암종을 만성 췌장염 환자로부터 구별하는 것에서의 혈장 CA19.9 및 소변 바이오마커 패널의 탐색적 비교. A, CP 소변 (n=50), 및 PDAC I-II기 (n=71) 및 I-IIA기 (n=16) (B)로부터의 소변을 비교하는, 바이오마커 패널과 상응하는 혈장 CA19.9 단독 및 조합의 ROC 곡선. C, 요약표. AUC: 곡선하 면적, SN: 감수성, SP: 특이성, 95% 신뢰 구간 (CI)으로. 검증 세트에서의 SN 및 SP는 트레이닝 데이터세트에서 결정된 최적 컷포인트에 대해 유도되었다.
도 9C에 대한 범례:
^ CA19.9에 대한 최적 컷포인트는 37U/mL이다.
+ 소변 패널이 이분성 바이오마커로서 사용된 혈장 CA19.9 단독과 비교하여 유의하게 더 큰 AUC를 제공하는지 여부 (0.830 대 0.775)를 평가하기 위한 상관된/쌍을 이룬 AUC에 대한 드롱의 단측 검정, p = 0.1.
$ 이분성 바이오마커로서 사용된 혈장 CA19.9의 추가가 소변 패널 단독에 비해 AUC를 유의하게 증가시키는지 여부 (0.885 대 0.830)를 평가하기 위한 상관된/쌍을 이룬 AUC에 대한 드롱의 단측 검정, p = 0.01.
++ 소변 패널이 이분성 바이오마커로서 사용된 혈장 CA19.9 단독과 비교하여 유의하게 더 큰 AUC를 제공하는지 여부 (0.871 대 0.735)를 평가하기 위한 상관된/쌍을 이룬 AUC에 대한 드롱의 단측 검정, p = 0.004.
$$ 이분성 바이오마커로서 사용된 혈장 CA19.9의 추가가 소변 패널 단독에 비해 AUC를 유의하게 증가시키는지 여부 (0.866 대 0.871)를 평가하기 위한 상관된/쌍을 이룬 AUC에 대한 드롱의 단측 검정, p = 0.6
도 10 - 상이한 종양에서의 소변 바이오마커 농도. A, 인구통계학 상세사항. B, 여러가지의 간담도 병리 및 초기 병기의 췌장 선암종 (I-IIA (n=16), 및 I-II (n=71))에서의 소변 LYVE1, REG1A 및 혈장 CA19.9의 산점도. 이러한 분석 시에 공급사에 의한 원래의 ELISA 검정법에 이루어진 실질적인 변형으로 인해 TFF1 단백질의 수준은 이러한 샘플에서 측정되지 않았다. IPMN (n=33): 관내 유두상 점액 종양, AMP (n=26): 팽대부암, NET (n=18): 신경내분비 종양, CHL (n=24): 담관암종, DuCA (n=16): 십이지장암. 막대는 중앙값 및 IQR 값을 가리킨다. 상부 막대: 크루스칼-왈리스/던 사후 검정, *: P<0.5, **: P<0.01, ***: P<0.001; 제시되지 않은 경우에, 차이가 통계적으로 유의하지 않음.
도 11 - 췌장암 조직에서의 바이오마커 패널 단백질의 발현. A, REG1A의 면역조직화학 분석: i) 불량하게 분화된 PDAC에서의 REG1A, ii) 악성 샘 내의 관강내 REG1A. B, TFF1: i) 암에서의 이질성 발현, ii) 악성 샘 내의 관강내 TFF1. C, i) 근육층 및 ii) 악성 샘 주변의 기질 내의 산재성 림프관에서의 LYVE1 발현. D, 췌장 선암종 환자 모니터링 동안의 바이오마커 수준: LYVE1, REG1A 및 TFF1을 수술 전 및 환자 추적 동안 수집된 소변 샘플에서 ELISA를 사용하여 측정하였다. 각각의 포인트는 특정한 시간 포인트 (x축)에서의 로그-변환 ELISA 값을 나타낸다.

바이오마커 패널

본 발명은 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1을 포함하는, 췌장관 선암종 (PDAC) 진단에 유용한 바이오마커 패널을 제공한다. 특히, 본 발명은 생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 또는 단백질 또는 이들의 조합물의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하는, 췌장관 선암종 (PDAC)에 대해 진단, 스크리닝 또는 테스트하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, LYVEI, REG1 및 TFF1 중 적어도 2종이 사용된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 3종 모두가 사용된다.

LYVE1은 림프관 내피 히알루로난 수용체 및 세포외 연결 도메인 함유 1 (XLKD1)로 또한 알려져 있고, I형 내재성 막 당단백질이다. 코딩되는 단백질은 수용체로서 작용하고, 가용성 히알루로난 및 고정된 히알루로난 둘 다에 결합한다. LYVE에 대한 언급은 NCBI (진뱅크(GenBank)) 기준 서열 전사체 NM_006691.3 (GI:15130120), NCBI 단백질 ID NP_006682.2 (GI:40549451), 유전자 ID:10894, 및 HGNC (HUGO (인간 유전자 기구(Human Gene Organisation)) 유전자 명명 위원회(Gene Nomenclature Committee) 유전자 ID):14687을 포함한다. 이러한 유전자는 4종의 스플라이스 변이체가 있다; 2종은 단백질을 코딩한다 (전장 단백질은 아미노산 322개를 갖고, 두 번째 것은 218개 아미노산을 가짐). 이러한 단백질의 전장 서열은 하기와 같다:

REG1A는 췌장 선방 세포에서 발현되고 자가분비 및 측분비 성장 인자 둘 다로서 작용하는 REG (재생성) 당단백질의 패밀리에 속하는 재생성 섬-유래 단백질 1을 지칭한다. Reg 유전자 패밀리는 I형, II형, III형 및 IV형의 4종의 서브클래스로 분류되는 다중유전자 패밀리이다; REG1A 유전자는 I형 서브클래스 구성원이다. 다른 패밀리 구성원인 REG1B, REGL, PAP, 및 이러한 유전자는 염색체 2p12에 종렬식으로 클러스터링되고, 유전자 중복에 의해 동일한 선조 유전자로부터 발생했을 수 있다. REG1A는 외분비 췌장이 분비하는 단백질을 코딩한다. 본원에서의 REG1에 대한 언급은 2종의 통상적으로 기재된 유전자, 즉 REG1A 및 REG1B를 포함하고, 이들의 생성물은 단백질 수준에서 80% 초과로 동일하고, 구별하기가 어렵다. 따라서, 본 발명에서, 방법이 REG1A 및 REG1B 중 1종만의 발현 또는 농도를 정량화할 수 있다. 본 발명의 대안적 실시양태에서, REG1A 및 REG1B 둘 다의 발현 또는 농도를 별개로 정량화할 수 있다. 본 발명의 추가 실시양태에서, REG1A 및 REG1B가 구별될 수 없고 따라서 이들이 함께 정량화될 수 있는 정량화 방법을 사용할 수 있다.

REG1A에 대한 언급은 NCBI (진뱅크) 기준 서열 전사체 전사체 NM_002909.4 (GI:189491780), NCBI 단백질 ID NP_002900.2 (GI:29725633), 유전자 ID:5967 및 HGNC:9951을 포함한다. 이러한 유전자는 4종의 스플라이스 변이체가 있지만 (인트론을 유지함), 단지 1종만이 단백질을 코딩한다 (166개 아미노산).

REG1B에 대한 언급은 NCBI (진뱅크) 기준 서열 전사체 NM_006507.3 (GI:189491779), NCBI 단백질 ID NP_006498.1, 유전자 ID:5968 및 HGNC:9952 NCBI를 포함한다. 이러한 유전자의 5종의 스플라이스 변이체가 있지만 (인트론을 유지함), 단지 2종만이 166개 아미노산 및 149개 아미노산의 단백질을 코딩한다.

일반적으로 어느 한쪽을 사용할 수 있기 때문에, 본원에서의 "REG1"에 대한 언급은 REG1A 및 REG1B 둘 다를 지칭한다는 것을 주지한다. 그러나, 일부 실시양태에서, REG1A 및 REG1B 둘 다를 사용할 수 있다.

TFF1은 트레포일 인자 1을 지칭한다. TFF1은 뮤신과 상호작용하고 점막 손상의 재구성 및 복구 동안 증가된 수준으로 발현되는 위장 분비 펩티드의 패밀리에 속한다. 이들은 아폽토시스 사멸로부터 상피 세포를 보호하고, 이의 운동성을 증가시키지만, 암 세포에서도 유사한 중추적 역할을 하고, 따라서 다양한 암 유형의 발달 및 진행에서 수반된다. TFF1에 대한 언급은 NCBI (진뱅크) 기준 서열 전사체 NM_003225.2 (GI:48928023), NCBI 단백질 NP_003216.1 (GI:4507451), 유전자 ID:7031 및 HGNC:11755를 포함한다.

본 발명의 방법은 샘플 내의 암 마커 단백질의 존재 또는 부재를 결정하는 정성적 양식으로 수행될 수 있지만, 바람직하게는, 샘플 내에 존재하는 암 마커 단백질의 양을 측정하는 것을 추가로 제공하는 정량적 양식으로 수행될 수 있다. 샘플 내에 존재하는 마커 단백질의 양을 상기 기재된 기술 중 임의의 것을 사용하여 계산할 수 있다. 이러한 경우에, 검정법을 수행하기 전에, 공지된 농도의 암 마커 단백질을 함유하는 일련의 표준 샘플로부터 검정법에 사용될 동일한 검출 반응을 사용하여 수득되는 신호를 측정함으로써 표준 곡선을 작성하는 것이 필요할 수 있다. 그 후, 스크리닝될 샘플 내에 존재하는 암 마커의 양을 표준 곡선으로부터 외삽할 수 있다.

일반적으로, 건강한 환자로부터의 대조군 샘플에 비교하여 테스트 샘플에서 바이오마커 중 1종 이상이 증가되는 것은 만성 췌장염 및/또는 PDAC의 존재를 지시한다. 각각의 바이오마커의 역치 농도는 환자마다 또는 집단마다 상이할 수 있다. 미가공 ("원시" 또는 "미정제") 소변 샘플로부터의 지시성 단백질 농도가 하기에서 제시된다:

예를 들어, 샘플이 2 내지 10 ng/ml의 LYVE1, 120 내지 500 ng/ml의 REG1A, 40 내지 100 ng/ml의 REG1B 및/또는 2.5 내지 5 ng/ml의 TFF1을 함유하면, 만성 췌장염이 의심될 수 있다. 그러나, 이러한 범위는 지시적이고, 통상의 기술자는 각각의 단백질의 농도가 상황에 맞게, 예를 들어 샘플의 출처 및 일어났을 수 있는 이러한 샘플의 임의의 사전-가공에 따라 고려될 필요가 있을 것임을 인지할 것이다. 관련된 농도 역치 내에 있는 바이오마커가 많을수록, 환자가 건강하거나, CP이 있거나 또는 PDAC가 있을 가능성이 더 높다.

예를 들어, 미가공 소변 샘플이 하기 기준 중 적어도 1종 (임의적으로, 하기 기준 중 적어도 2, 3 또는 4종)를 충족시키면, 만성 췌장염이 의심될 수 있다:

a) 2 내지 10 ng/ml의 LYVE1

b) 120 내지 500 ng/ml의 REG1A

c) 40 내지 100 ng/ml의 REG1B 및/또는

d) 2.5 내지 5 ng/ml의 TFF1

미가공 소변 샘플이 하기 기준 중 적어도 1종 (임의적으로, 하기 기준 중 적어도 2, 3 또는 4종)를 충족시키면, PDAC가 의심될 수 있다:

a) 10 ng/ml 초과의 LYVE1

b) 500 ng/ml 초과의 REG1A

c) 100 ng/ml REG1B 초과의 및/또는

d) 5 ng/ml 초과의 TFF1

물론, 예를 들어, PDAC의 존재에 대해 생검을 테스트하고/하거나 추가적인 바이오마커 (예컨대 CA19.9)를 사용함으로써, 본 발명의 바이오마커 패널을 사용하는 진단 방법을 추가로 입증할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 방법은 소변 샘플 내의 LYVE1, REG1 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 또는 이들의 조합물의 발현 수준 또는 농도를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 방법은 소변 샘플 내의 LYVE1, REG1 및 TFF1 중 단지 1종만의 발현 수준 또는 농도를 정량화하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 방법은 LYVE1, REG1 및 TFF1 중 임의의 2종, 예를 들어 LYVE1 및 REG1 (REG1A 및/또는 REG1B), LYVE1 및 TFF1, 또는 REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1의 발현 수준 또는 농도를 정량화하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 방법은 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1 모두의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서 CA19.9를 또한 정량화할 수 있다.

췌장암의 유형

본 발명은 PDAC 진단에서 유용하다. PDAC는 초기 병기의 PDAC, 예를 들어 I기 또는 II기 PDAC일 수 있거나, 또는 후기 병기의 PDAC, 예를 들어 III기 또는 IV기 PDAC일 수 있다. 그러나, 본 발명은 초기 병기의 PDAC, 특히 I기 내지 IIA기 PDAC를 검출하는데 특히 유용하다.

따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 소변 샘플 내의 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및/또는 TFF1의 발현 수준 또는 농도를 검출하는 단계 및 각각의 검출된 발현 수준을 참조물 또는 참조물들과 비교하는 단계를 포함하는, I기 또는 II기 PDAC를 진단 또는 검출하는 방법이 제공된다. 특히 이러한 방법은 I기 및/또는 II기 PDAC의 존재를 결정할 수 있고, 이를 건강함의 샘플, CP가 있는 환자 및 IPMN이 있는 환자로부터 구별할 수 있다.

미국 암 연합 위원회(The American Joint Committee on Cancer) (AJCC)의 종양-림프절-전이 (TNM) 병기 결정 시스템에 따라 PDAC를 분류할 수 있다. T 점수는 주요 (원발성) 종양의 크기 및 종양이 췌장 밖으로, 그리고 가까운 장기 내로 성장하였는지 여부를 기재한다. N 점수는 가까운 (국소) 림프절로의 확산을 기재한다. M 점수는 암이 신체의 다른 장기로 전이 (확산)되었는지 여부를 지시한다:

Tx, T0, Tis: TNM 시스템 참조

T1: 종양의 최대 치수 <2 cm이고, 췌장에 국한됨

T2: 종양의 최대 치수 >2 cm이고, 췌장에 국한됨

T3: 췌장 너머로 확장되고, SMA 또는 복강축을 수반하지 않음

T4: SMA 또는 복강축을 수반함

국소 림프절 (N)

Nx: 림프절을 평가할 수 없음

N0: 림프절이 수반되는 증거가 없음

N1: 국소 림프절 전이가 존재함

전이 (M)

Mx: 전이의 존재를 평가할 수 없음

M0: 전이 증거가 없음

M1: 원격 전이가 존재함

I기 PDAC는 암이 췌장에 국한되고 림프절에 암이 없는 가장 초기의 병기이다. II기에는, 암이 국소적으로 침습성이다. 이러한 병기 둘 다의 암은 여전히 절제가 가능하다; 현재, 췌장암 5명 중 1명 미만 (<20%)이 I/II기에 진단된다. 본원에서의 II기 PDAC에 대한 언급은 IIA 및 IIB기를 포함한다. III기에는, 암이 췌장 너머로 확산되어 있고 대혈관에 있어서, 절제가 불가능하다. IV기 암은 원격 부위로 전이되어 있다 (그리고, 마찬가지로 수술에 의해 치료될 수 없음). 본원에서 PDAC를 검출 또는 진단하는 것에 대한 언급은 각각의 병기의 PDAC, 특히 I기 또는 II기 PDAC를 검출 또는 진단하는 것을 일반적으로 지칭한다. 이러한 방법은 이러한 병기에 암이 절제에 의해 아직 치료가능하고 생존율이 크게 개선된다는 것을 고려하여 특히 유용하다.

TNM 점수를 참조로, 병기 군 분류는 하기와 같다:

- 0기: Tis N0 M0

- Ia기: T1 N0 M0

- Ib기: T2 N0 M0

- IIa기: T3 N0 M0

- IIb기: T1, T2 또는 T3와 N1 M0

- III기: T4 및 M0 (임의의 N)

- IV기: M1 (임의의 T, 임의의 N)

생물학적 샘플

생물학적 샘플은 소변 샘플, 전혈 샘플, 혈청 샘플 또는 생검체 (예컨대 췌장 조직 샘플)일 수 있지만, 소변 샘플이 특히 유용하다. 방법이 생물학적 샘플을 수득하거나 제공하는 단계를 포함할 수 있거나, 또는 대안적으로, 예를 들어 생체외 방법에서, 샘플이 환자로부터 이미 수득되어 있을 수 있다 .

환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 필요할 때까지 보관할 수 있다. 적합한 보관 방법은 수집으로부터 2시간 이내에 냉동하는 것을 포함한다. -80℃에서 유지시키는 것을 장기 보관에 사용할 수 있다.

유전자(들)/단백질(들)의 발현 수준을 결정하기 전에 샘플을 가공할 수 있다. 샘플을 강화 (예를 들어, 정량화되는 바이오마커의 농도를 증가시키기 위해), 원심분리 또는 희석에 적용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 샘플에 어떠한 사전-가공도 하지 않고, 미가공 상태로 샘플을 사용한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 검출 및 정량화 (즉, 측정) 전에 생물학적 샘플을 단백질 바이오마커에 대해 강화시킬 수 있다. 강화 단계는 샘플 내의 단백질의 농도를 증가시키기 위한 임의의 적합한 사전-가공 방법 단계일 수 있다. 예를 들어, 강화 단계는 샘플로부터 세포 또는 원치 않는 분석물을 제거하기 위한 원심분리 및/또는 여과를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 환자로부터의 1개의 테스트 샘플에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 복수의 테스트 샘플, 예를 들어 2, 3, 4 또는 5개의 샘플을 환자로부터 취할 수 있다. 각각의 샘플을 단일 검정법에 적용하여 바이오마커 패널 구성원 중 1종을 정량화할 수 있거나, 또는 대안적으로 정량화되는 바이오마커 모두에 대해 샘플을 테스트할 수 있다.

본 발명의 방법 및 용도

본 발명은 PDAC를 검출하는데, 특히 초기 병기의 PDAC를 후기 병기의 PDAC, CP 및 췌장염으로부터 감별 진단하는데 유용한 바이오마커 패널을 제공한다:

본 발명의 한 실시양태에서, 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 관심 바이오마커, 특히 단백질을 검출하는 단계; 및

b) 각각의 바이오마커의 발현 수준 또는 농도를 정량화하는 단계.

바이오마커는 본 발명의 바이오마커 패널에 속한다. 따라서, 검출/정량화는 하기 바이오마커 중 1종 이상의 검출/정량화를 포함한다:

1) LYVE1

2) REG1 (REG1A 및/또는 REG1B)

3) TFF1

4) CA19.9

한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 바이오마커 CA19.9와 조합된, LYVE1, REG1 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 바이오마커의 분석을 포함한다.

유전자 또는 단백질의 발현 수준을 다수의 방식으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 샘플 (예컨대 소변 샘플) 내의 단백질의 농도를 결정함으로써 바이오마커를 정량화하는 것에 의해 발현 수준을 결정할 수 있다. 대안적으로, 샘플 (예컨대 조직 샘플) 내의 mRNA의 양을 결정할 수 있다. 발현 수준 또는 농도가 결정되었으면, 이러한 수준을 이전에 측정된 발현 수준 또는 농도 (동일한 대상체로부터 시간의 상이한 포인트에서 수득된 샘플, 또는 상이한 대상체, 예를 들어 건강한 대상체로부터의 샘플, 즉 대조군 또는 기준 샘플에서의 것)와 비교하여, 분석되는 샘플에서 발현 수준 또는 단백질 농도가 더 높은지 또는 더 낮은지 여부를 결정할 수 있다.

본 발명에서, LYVE1, REG1 및/또는 TFF1 중 1종 또는 모두가 건강한 환자에 비교하여 발현 (따라서 단백질 농도)이 증가되는 것은 PDAC 또는 CP를 지시한다. 이러한 패널은 초기 병기의 PDAC를 정확하게 진단하는데 특히 유용하다. 모든 패널 구성원을 함께 사용함으로써 거짓 음성 및 거짓 양성이 또한 최소화될 수 있다. 거짓 양성 또는 거짓 음성의 발생을 추가로 감소시키도록 CA19.9가 바이오마커 패널에 또한 포함될 수 있다.

단백질 발현 수준을 검출하는 방법은 관련 분야에 공지된 임의의 방법을 포함한다. 예를 들어, DNA 또는 mRNA 어레이를 사용하여 간접적으로 단백질 수준을 측정할 수 있다. 대안적으로, 단백질 합성 수준을 측정하거나 단백질 농도를 측정함으로써 직접적으로 단백질 수준을 측정할 수 있다.

DNA 및 mRNA 어레이 (마이크로어레이)는 상보적 핵산 분자에 결합할 수 있는 뉴클레오티드의 독특한 서열을 각각 갖는, DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드의 일련의 미시적인 스팟을 포함한다. 이러한 방식으로, 올리고뉴클레오티드가 고도로 엄격한 조건 하에 단지 정확한 표적 서열만이 이에 혼성화하는 프로브로서 사용된다. 본 발명에서, 표적 서열은 발현이 검출되는 단백질에 상응하는 코딩 DNA 서열 또는 이의 독특한 섹션이거나, 또는 표적 서열은 발현이 검출되는 단백질에 상응하는 전사된 mRNA 서열 또는 이의 독특한 섹션이다.

소정의 샘플에서 직접적으로 단백질 발현을 측정하고 발현되는 단백질을 확인하는 것은 관련 분야에 공지된 다수의 방법 중 임의의 것으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 전통적으로 2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (2D-PAGE)이 복합적인 단백질 혼합물을 해상하고 정상 조직과 질환 조직 사이의 단백질 발현 패턴 차이를 검출하기 위해 선택되는 도구였다. 정상 샘플과 종양 샘플 사이에서 관찰되는 차등적으로 발현된 단백질이 2D-PAGE에 의해 분리되고, 단백질 염색 및 차등적 패턴 분석에 의해 검출된다. 대안적으로, 2D 전기영동 전에 상이한 단백질 샘플이 형광 염료로 표지되는 2차원 차등 겔 전기영동 (2D-DIGE)을 사용할 수 있다. 전기영동이 일어난 후, 겔을 각각의 염료의 여기 파장으로 차례로 스캐닝한다. 이러한 기술은 단백질 존재도의 변화를 검출하는데, 예를 들어 건강한 대상체로부터의 샘플 및 질환 대상체로부터의 샘플을 비교할 때 특히 유용하다.

통상적으로, 전기영동에 적용되는 단백질이 질량 분광측정 방법에 의해 또한 추가로 특성화된다. 이러한 질량 분광측정 방법은 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 (MALDI-TOF)을 포함할 수 있다.

MALDI-TOF는 더욱 통상적인 이온화 방법에 의해 이온화되는 경우에 취약하고 단편화되는 경향이 있는 생체분자 (예컨대 단백질, 펩티드 및 당)의 분석을 허용하는 이온화 기술이다. 레이저 빔 (예를 들어, 질소 레이저)에 의해 이온화가 유발되고, 직접적인 레이저 빔 노출에 의해 파괴되는 것으로부터 생체분자를 보호하고 기화 및 이온화를 용이하게 하도록 매트릭스가 사용된다. 샘플을 용액 내의 매트릭스 분자와 혼합하고, 소량의 혼합물을 표면에 침착시키고, 건조되게 한다. 용매가 증발함에 따라 샘플 및 매트릭스가 공동-결정화된다.

단백질 마이크로어레이를 단백질 발현을 직접적으로 검출하는데 또한 사용할 수 있다. 이들은 고체 표면에 고정된 포착 분자를 포함한다는 점에서 DNA 및 mRNA 마이크로어레이와 유사하다. 가장 통상적으로 포착 분자는 검출되는 단백질에 특이적인 항체이지만, 혈청에서 항체가 검출되는 경우에 항원을 사용할 수 있다. 추가적인 포착 분자는 검출되는 단백질에 대해 상업적인 항체가 입수가능하지 않으면 바람직할 수 있는, 단백질, 압타머, 핵산, 수용체 및 효소를 포함한다. 단백질 어레이 상에서 사용하기 위한 포착 분자는 외부에서 합성되고, 정제되어, 어레이에 부착될 수 있다. 대안적으로, 이들은 계내 합성되어 직접적으로 어레이에 부착될 수 있다. 포착 분자는 생합성, 무세포 DNA 발현 또는 화학적 합성을 통해 합성될 수 있다. 후자의 2가지 방법으로 계내 합성이 가능하다. 따라서, 고체 지지체 상에 고정된, 정량화될 각각의 바이오마커에 대해 특이적인 포착 분자 (예컨대 항체)를 포함하는 단백질 마이크로어레이가 제공된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 마이크로어레이는 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1 단백질 각각에 대해 특이적인 포착 분자를 포함한다.

마이크로어레이 상에 포착되었으면, 검출 방법은 관련 분야에 공지된 것 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 형광 검출을 사용할 수 있다. 이는 안전하고, 감수성이며, 해상도가 높을 수 있다. 다른 검출 방법은 다른 광학적 방법 (예를 들어, 비색 분석, 화학발광, 무표지 표면 플라즈몬 공명 분석, 현미경, 반사율 등), 질량 분광측정, 전기화학식 방법 (예를 들어, 전압전류법 및 전류법) 및 고주파 방법 (예를 들어, 다극 공명 분광법)을 포함한다.

단백질 농도를 결정하는 추가적인 방법은 질량 분광측정 및/또는 액체 크로마토그래피, 예컨대 LC-MS, UPLC, 또는 종렬식 UPLC-MS/MS 시스템을 포함한다.

발현 수준 또는 농도가 결정되었으면, 이러한 수준을 이전에 측정된 발현 수준 또는 농도 (동일한 대상체로부터 상이한 시점에 수득된 샘플, 또는 상이한 대상체, 예를 들어 건강한 대상체로부터의 샘플, 즉 대조군 또는 기준 샘플에서의 것)와 비교하여, 분석되는 샘플에서 발현 수준 또는 농도가 더 높은지 또는 더 낮은지 여부를 결정할 수 있다. 본 발명의 방법은 상기 검출 또는 정량화를 대조군 또는 참조물과 상관시켜 PDAC가 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 상관 단계는 또한 특정한 유형 PDAC의 존재를 검출할 수 있고, 이러한 환자를 PDAC 또는 췌장암이 존재하지 않는 건강한 환자 또는 CP 또는 관내 유두상 점액 종양 (IPMN)을 앓고 있는 환자로부터 구별할 수 있다. 예를 들어, 방법은 초기 병기의 PDAC, 특히 I기 및/또는 II기 PDAC를 검출할 수 있다. 상기 상관 단계는 패널 바이오마커 중 1, 2, 3, 4종 또는 그 초과의 양을 기준 샘플, 예를 들어 건강한 환자로부터 취한 생물학적 샘플 내의 상응하는 바이오마커(들)의 양과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, 방법은 기준 샘플 내의 상응하는 바이오마커의 양을 결정하는 단계를 포함하지 않고, 대신 이러한 값은 이전에 결정되었을 것이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대조군으로서 이용되는 건강한 환자로부터의 방법 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 방법은 동일한 환자로부터의 샘플로부터 이전 시간 포인트에서 수득된 기준 데이터를 사용할 수 있다. 이러한 방식으로, 임의의 치료의 유효성을 평가할 수 있고, 환자에 대한 예후를 결정할 수 있다.

내부 대조군을 또한 사용할 수 있고, 예를 들어, 바이오마커 패널의 일부가 아닌 1종 이상의 상이한 바이오마커를 정량화할 수 있다. 이는 샘플 내의 바이오마커의 상대적인 양에 관한 유용한 정보를 제공할 수 있어, 상이한 집단, 또는 샘플 수집, 가공 또는 보관 방법에 따라 도입되는 변화에 따른 임의의 변동에 대해 결과가 조정되게 한다.

관련 분야의 기술자에게 명백할 바와 같이, 사용되는 테스트 샘플의 유형 및/또는 분석 전에 발생한 테스트 샘플의 가공을 고려하도록 분석물 농도 또는 발현의 임의의 측정치를 정규화할 필요가 있을 수 있다. 또한 데이터 정규화는 생물학적으로 관련된 결과를 확인하는 것을 돕는다. 불변 바이오마커를 사용하여 샘플의 적절한 가공을 결정할 수 있다. 또한 차등적 발현 계산을 상이한 샘플들 사이에서 수행하여 통계적 유의성을 결정할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다:

a) 생물학적 샘플, 예컨대 소변 샘플을 제공하는 단계;

b) 임의적으로, 예를 들어 샘플을 miRNA에 대해 강화하도록, 샘플을 가공하는 단계; 및

c) 바이오마커를 정량화하는 단계.

방법은 추가로 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다:

d) 단계 d)로부터의 단백질 발현 수준을 대조군 또는 기준 샘플과 비교하는 단계.

본 발명의 일부 실시양태에서, 정량화 단계는 하기 단계를 포함할 수 있다:

a) 샘플을 관심 바이오마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너와 접촉시키는 단계

b) 바이오마커-결합 파트너의 양을 정량화하여, 원래의 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 양을 결정하는 단계.

따라서 본 발명은 관심 대상인 단백질 바이오마커, 또는 관심 대상인 단백질 바이오마커를 함유하는 생물학적 샘플 (예컨대 소변 샘플)을 포함하는 반응 혼합물을 제공하고, 여기서 관심 대상인 단백질 바이오마커가 단백질 바이오마커에 대해 특이적인 각각의 결합 파트너에 결합된다. 결합 파트너는, 예를 들어, 관심 대상인 단백질 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 한 실시양태에서, 반응 혼합물은 각각의 선택적 결합 분자, 예컨대 항체에 결합된 LYVE1, REG1 및 TFF1 단백질을 포함한다. 선택적 결합 분자는 외인성이다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 방법은 측정된 바이오마커를 PDAC, 특히 I기 또는 II기 PDAC와 상관시키는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명은 생물학적 샘플 (예컨대 소변 샘플) 내의 1종 이상의 관련된 바이오마커의 존재도를 측정하는 단계 및 측정된 바이오마커를 질환의 병기와 상관시키는 단계를 포함하는, 환자에서의 췌장 질환을 한정하거나 또는 췌장 질환의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 질환의 병기는 만성 췌장염, I기 PDAC, 또는 후기 병기의 PDAC일 수 있다. 대안적으로, 환자가 건강한 것으로, 즉 췌장 질환이 없는 것으로 결정될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법은 검출되는 단백질 또는 단백질들에 대해 특이적인 외인성 결합 분자 또는 시약을 사용하여 수행될 수 있다. "외인성"은 결합 분자 또는 시약이 분석받는 샘플에 첨가되었다는 사실을 지칭한다. 결합 분자 및 시약은 이들이 관련 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출할 수 있는 결합 분자/시약-단백질 복합체를 형성할 수 있도록 검출되는 단백질 또는 단백질들에 대한 친화성을 갖는 분자이다. 본 발명의 결합 분자는 항체, 항체 단편, 단백질 또는 압타머 또는 분자적으로 각인된 중합체 구조물일 수 있다. 본 발명의 방법은 생물학적 샘플을 적절한 결합 분자 또는 분자들과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 결합 분자는 본 발명의 키트의 일부를 형성할 수 있고, 특히 이들은 본 발명의 바이오센서의 일부를 형성할 수 있다.

항체는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 둘 다를 포함할 수 있고, 관련 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 특정한 단백질에 결합하는 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 생산하는 기술이 현재 관련 분야에서 잘 개발되어 있다. 이들은 표준 면역학 교재, 예를 들어 문헌 [Roitt et al., Immunology, second edition (1989), Churchill Livingstone, London]에 논의되어 있다. 폴리클로날 항체는 적합한 동물 숙주 (예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그, 토끼, 양, 닭, 염소 또는 원숭이)에서 항원을 동물 내로 주사하였을 때 이의 생산을 자극함으로써 생성시킬 수 있다. 필요하다면, 아주반트를 항원과 함께 투여할 수 있다. 그 후, 항체가 항원에 결합하는 것에 의해 또는 하기에 추가로 기재된 바와 같이 항체를 정제할 수 있다. 모노클로날 항체는 하이브리도마로부터 생산할 수 있다. 이는 불멸 세포주를 형성시키기 위해 골수종 세포 및 원하는 항체를 생산하는 B-림프구 세포를 융합시킴으로써 형성될 수 있다. 이는 널리 공지된 쾰러 & 밀스타인 기술이다 (Kohler & Milstein (1975) Nature, 256:52-55). 항체는 인간 또는 인간화 항체일 수 있거나, 또는 다른 종으로부터의 것일 수 있다.

적합한 항체의 제조 후, 이를 통상적으로 이용가능한 여러 기술 (예를 들어, 문헌 [Harlow & Lane eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재된 바와 같음) 중 1종에 의해 단리 또는 정제할 수 있다. 일반적으로, 적합한 기술은 펩티드 또는 단백질 친화성 칼럼, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 역상 HPLC (RP-HPLC), 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 상에서의 정제, 또는 이러한 기술의 조합을 포함한다. 재조합 및 키메라 항체를 표준 방법에 따라 제조할 수 있고, ELISA, ABC, 도트-블롯 검정법을 포함하는 일반적으로 이용가능한 절차를 사용하여 특이성에 대해 검정할 수 있다.

본 발명은 항원에 결합할 수 있는 항체 유도체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 항체 단편 및 합성 구축물을 포함한다. 항체 단편 및 합성 구축물의 예가 문헌 [Dougall et al. (1994) Trends Biotechnol, 12:372-379]에서 제공된다.

항체 단편 또는 유도체, 예컨대 Fab, F(ab')₂ 또는 Fv를 사용할 수 있고, 단일쇄 항체 (scAb) (예컨대 문헌 [Huston et al. (993) Int Rev Immunol, 10:195-217]에 기재됨), 도메인 항체 (dAb), 예를 들어 단일 도메인 항체, 또는 항체-유사 단일 도메인 항원-결합 수용체도 사용할 수 있다. 추가적으로, 항체 단편 및 면역글로불린-유사 분자, 펩티드모방체 또는 비-펩티드 모방체를 항체의 결합 활성을 모방하도록 디자인할 수 있다. Fv 단편을 변형시켜 단일쇄 Fv (scFv) 분자로 알려진 합성 구축물을 생산할 수 있다. 이는 분자의 안정성에 기여하는 VH 및 VL 영역을 공유결합으로 연결하는 펩티드 링커를 포함한다. 따라서 본 발명은 단일쇄 항체 또는 scAb로 또한 확장된다.

다른 합성 구축물은 CDR 펩티드를 포함한다. 이는 항원 결합 결정인자를 포함하는 합성 펩티드이다. 일반적으로 이러한 분자는 CDR 루프의 구조를 모방하고 항원-상호작용 측쇄를 포함하는, 형상적으로 제한된 유기 고리이다. 합성 구축물은 키메라 분자를 또한 포함한다. 따라서, 예를 들어, 인간화 (또는 영장류화) 항체 또는 이의 유도체가 본 발명의 범주 내에 있다. 인간화 항체의 예는 인간 프레임워크 영역이 있지만 초가변 영역은 설치류의 것인 항체이다. 합성 구축물은 항원 결합에 더하여 일부 바람직한 성질을 분자에 제공하는 공유결합으로 연결된 모이어티를 포함하는 분자를 또한 포함한다. 예를 들어, 이러한 모이어티는 표지 (예를 들어, 검출가능한 표지, 예컨대 형광 또는 방사성 표지) 또는 제약상 활성인 작용제일 수 있다.

결합 분자가 항체 또는 항체 단편인 본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 방법은 관련 분야에 공지된 임의의 면역학적 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, ELISA, 방사성 면역검정법 또는 유사한 기술을 이용할 수 있다. 일반적으로, 적절한 자가항체를 고체 지지체 상에 고정하고, 테스트할 샘플을 자가항체와 접촉시킨다. 자가항체가 인식하는 암 마커 단백질이 샘플 내에 존재하면, 항체-마커 복합체가 형성된다. 그 후, 예를 들어, 마커 단백질의 에피토프를 특이적으로 인식하는 표지된 2차 항체를 사용하여, 복합체가 지시되거나 또는 정량적으로 측정될 수 있다. 2차 항체는 생화학적 마커, 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 또는 알칼리성 포스파타제 (AP)로 표지될 수 있고, 비색, 화학발광 또는 형광 생성물을 생성시키는 효소에 대한 기질을 첨가함으로써 복합체 검출을 달성할 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 표지, 예를 들어, 적절한 효소로 표지된 마커 단백질을 첨가함으로써 복합체의 존재를 결정할 수 있다. 이러한 경우에, 측정된 효소 활성의 양이 형성된 복합체의 양에 반비례하고, 샘플 내의 항원의 존재를 결정하는 것에 대한 참조물로서 음성 대조군이 요구된다. 복합체를 검출하는 또 다른 방법은 방사성 동위원소로 표지된 항체 또는 항원을 이용한 후 방사성을 측정할 수 있다. 항원에 대한 방사성 표지의 예는 ³H, ¹⁴C 및 ¹²⁵I를 포함한다.

압타머는 특이적인 표적 분자에 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 분자이다. 올리고뉴클레오티드 압타머는 DNA 압타머 및 RNA 압타머를 포함한다. 압타머는 무작위 서열 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드의 풀로부터의 시험관 내 선별 공정에 의해 생성될 수 있다. 임의적으로 압타머는 이의 표적 분자의 존재 하에 자가-절단되도록 리보자임과 조합될 수 있다.

관련 분야에 공지된 임의의 공정에 의해 압타머를 제조할 수 있다. 예를 들어, 압타머를 확인할 수 있는 공정은 기하급수적 강화에 의한 리간드의 체계적 진화 (SELEX: systematic evolution of ligands by exponential enrichment)이다. 이는 표적 분자에 대한 선택적 결합을 기초로 하는 분할에 의해 분자 라이브러리의 복잡도를 반복적으로 감소시킨 후 재증폭시키는 것을 수반한다. 잠재적인 압타머들의 라이브러리를 표적 단백질과 함께 인큐베이션한 후, 결합되지 않은 구성원을 결합된 구성원으로부터 분할한다. 복잡도가 감소된 라이브러리 (강화 풀)을 생산하기 위해, 결합된 구성원을 회수하고 증폭시킨다 (예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해). 강화 풀을 사용하여 제2 SELEX 사이클을 시작한다. 표적 단백질에 대한 후속 강화 풀의 결합을 사이클마다 모니터링한다. 결합 분자의 비율이 충분한 수준으로 상승된 것으로 판단되면 강화 풀을 클로닝한다. 그 후, 결합 분자를 개별적으로 분석한다. 문헌 [Fitzwater & Polisky (1996) Methods Enzymol, 267:275-301]에 SELEX가 리뷰되어 있다.

따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 환자로부터의 생물학적 샘플 (예컨대 소변 샘플)을 정량화되는 바이오마커 단백질에 대해 특이적인 시약 또는 결합 분자와 접촉시키는 단계, 및 단백질-시약 또는 단백질-결합 분자 복합체의 존재도를 측정하는 단계, 및 단백질-시약 또는 단백질-결합 분자 복합체의 존재도를 생물학적 샘플 내의 관련 단백질의 농도와 상관시키는 단계를 포함하는, PDAC 또는 CP를 진단하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 생물학적 샘플 (예컨대 소변 샘플)을 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1 중 1종 이상에 대해 특이적인 시약 또는 결합 분자와 접촉시키는 단계;

b) LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1 중 1종 이상에 대한 단백질-시약 또는 단백질-결합 분자 복합체의 존재도를 정량화하는 단계; 및

c) 단백질-시약 또는 단백질-결합 분자 복합체의 존재도를 생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1 단백질 중 1종 이상의 농도와 상관시키는 단계.

방법은 d) 단계 c)에서의 단백질 농도를 참조물과 비교하여 PDAC 또는 CP의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 그 후, 환자를 이에 따라 치료할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플을 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1 중 1, 2 또는 3종, 일부 실시양태에서는 패널 바이오마커 모두에 대해 특이적인 시약 또는 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 추가 실시양태에서, 추가적으로 생물학적 샘플을 CA19.9에 대해 특이적인 시약 또는 결합 분자와 접촉시키는 것에 의해 CA19.9가 포함될 수 있다. 적합한 시약 또는 결합 분자는 항체 또는 항체 단편, 효소, 핵산, 세포 기관, 세포, 생물학적 조직, 각인된 분자 또는 소형 분자를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 본 발명의 키트 또는 바이오센서를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명은 생물학적 샘플, 특히 소변 샘플 내의 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이들의 조합물의 발현 수준 또는 농도를 검출하는 단계를 포함하는, 췌장관 선암종의 진단 방법을 또한 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플, 특히 소변 샘플 내의 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 단백질의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플, 특히 소변 내의 LYVE1, TFF1, 및 REG1A 및 REG1B 중 어느 1종 또는 둘 다의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 바이오마커 패널이 만성 췌장염을 또한 검출할 수 있기 때문에, CP의 유사한 진단 방법이 또한 제공된다.

건강한 대조군 대상체로부터 취해진 샘플 내의 상응하는 유전자 또는 단백질의 발현 수준 또는 단백질 농도와 비교했을 때의 유전자 발현 또는 단백질 농도의 증가를 검출함으로써 췌장관 선암종의 존재를 결정할 수 있다. 추가적으로, 발현 수준 또는 농도를 PDAC와 CP를 구별하는데 사용할 수 있다. 이는 테스트 샘플에서 확인되는 발현 수준 또는 농도를 CP를 나타내는 환자에서 보이는 것과 (또는 참조물에) 비교함으로써 달성될 수 있다. 또한, 바이오마커를 PDAC와 관내 유두상 점액 종양 (IPMN)을 구별하는데 사용할 수 있다. 이는 테스트 샘플에서 확인되는 발현 수준 또는 농도를 IPMN을 나타내는 환자에서 보이는 것과 (또는 참조물에) 비교함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 췌장관 선암종 (PDAC) 또는 CP를 진단하는데 사용하기 위한, LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 또는 이들의 조합물이 제공된다. 본 발명의 한 실시양태에서, PDAC 또는 CP 진단에서 사용하기 위한, LYVE1, REG1 및 TFF1 중 2종의 조합물 (예를 들어 LYVE1 및 REG1 (REG1A 및/또는 REG1B), LYVE1 및 TFF1, 또는 REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1)이 제공된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, PDAC 또는 CP 진단에서 사용하기 위한, LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1 중 3종의 조합물이 제공된다. PDAC 또는 CP 진단에서 사용하기 위한, LYVE1, REG1A, REG1B 및 TFF1 4종 모두의 조합물이 또한 제공된다. 본 발명의 일부 실시양태에서 이러한 바이오마커 패널이 추가적으로 CA19.9와 조합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 (특히 소변 샘플) 내의 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 바이오마커를 정량화하는 단계, 이러한 값을 각각의 정량화된 바이오마커에 대한 참조물과 비교하는 단계, 및 검출된 값이 참조물보다 크면 (또는 PDAC가 진단 또는 의심되면) PDAC에 대한 치료를 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 PDAC를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. PDAC를 치료하는 방법은 췌장 종양을 절제하고/하거나 화학요법 및/또는 방사선요법을 환자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 유전자 발현 수준을 결정함으로써 (예를 들어, mRNA 농도를 결정함으로써) 또는 단백질 농도를 결정함으로써 바이오마커를 정량화할 수 있다. 일부 실시양태에서, LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1 각각을 정량화할 수 있다. 이러한 방법에서 CA19.9를 또한 정량화할 수 있다.

본 발명의 PDAC 치료 방법은 초기 병기의 PDAC의 치료에서 특히 유용하다. PDAC 예방 방법은 후기 병기의 PDAC의 예방에서 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플 내에 특정한 농도의 바이오마커 단백질이 있는 것으로 확인된 환자에서 치료 방법이 수행된다. 상기 농도는 PDAC를 지시하는 농도이다. 따라서, 본 발명의 방법을 사용하여 PDAC 또는 CP가 진단된 환자에서 임의의 췌장 종양을 절제하고/하거나 화학요법 및/또는 방사선요법을 투여하는 것을 포함하는, PDAC 또는 CP 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 소변 샘플 내의 LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이들의 조합물의 발현 수준을 검출하는 단계, 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계, 및 PDAC 또는 CP가 진단 또는 의심되면 PDAC 또는 CP에 대한 치료를 진행할지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, PDAC 또는 CP에 대한 치료에 대한 환자의 적합성을 결정하는 방법이 제공된다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 방법은 PDAC 또는 CP가 검출 또는 의심되면 PDAC 또는 CP에 대해 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 소변, 혈액 또는 혈청 샘플의 분석을 기초로 PDAC 또는 CP가 검출 또는 의심되면, 예를 들어, 췌장 조직 샘플 내의 바이오마커의 존재 및/또는 양을 검출하는 것에 의해, PDAC 또는 CP의 존재를 입증할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 췌장 조직 샘플 내의 바이오마커의의 양을 검출 또는 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 췌장 조직 샘플은 이전에 환자로부터 수득되었을 수 있거나, 또는 방법이 상기 췌장 조직 샘플을 수득하거나 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 췌장 조직 샘플의 분석은 조직학적 분석을 또한 포함할 수 있다.

가능하다면, PDAC (특히 I기 및 II기 PDAC)에 대한 치료는 종양 절제를 수반한다. 치료는 대안적으로 또는 추가적으로 화학요법 및/또는 방사선요법에 의한 치료를 수반할 수 있다. 화학요법에 의한 치료는 젬시타빈 및/또는 폴피리녹스의 투여를 포함할 수 있다. 폴피리녹스는 플루오로우라실 (5-FU), 이리노테칸, 옥살리플라틴 및 폴린산 (류코보린)의 조합물이다. 폴피리녹스를 수반하는 치료 체계는 옥살리플라틴, 그 후 폴린산, 그 후 이리노테칸 (대안적으로, 이리노테칸을 폴린산과 동시에 투여할 수 있음), 그 후 5-FU를 투여하는 것을 포함할 수 있다.

이전에 PDAC에 대한 요법 (예를 들어, 화학요법 및/또는 방사선요법)이 제공된 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 관심 바이오마커 중 적어도 1종의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 요법에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 방법이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 이러한 발현 수준을 요법이 제공되기 전에 환자로부터 수득된 샘플 내의 동일한 바이오마커 또는 바이오마커들에 대한 발현 수준과 비교한다. 그 후, 발현 수준의 비교를 기초로 요법을 계속할지 또는 대안 요법을 시도할지 여부에 대한 결정을 내릴 수 있다

한 실시양태에서, 따라서 하기 단계를 포함하는 방법이 제공된다:

a) 이전에 췌장암 또는 PDAC에 대한 요법을 받은 바 있는 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 적어도 1종의 관심 바이오마커 또는 이들의 조합물의 발현 수준을 결정하는 단계;

b) 단계 a)에서 결정된 바이오마커 또는 바이오마커들의 발현 수준을 동일한 바이오마커 또는 바이오마커들의 이전에 결정된 (즉, 췌장암 또는 PDAC에 대한 치료 전에 결정된) 발현 수준과 비교하는 단계; 및

c) 췌장암 또는 PDAC에 대한 요법을 유지하거나, 변화시키거나 또는 중단하는 단계.

방법은 환자에게 췌장암 또는 PDAC에 대한 요법을 투여하는 사전 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 방법은 요법 투여 전에 동일한 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 적어도 1종의 관심 바이오마커 또는 이들의 조합물의 발현 수준을 결정하는 전단계를 또한 포함할 수 있다. 단계 c)에서, 바이오마커 또는 바이오마커들의 발현 수준(들)에서의 적절한 조정이 결정되면 췌장암 또는 PDAC에 대한 요법이 유지될 수 있다. 예를 들어, 췌장암 또는 PDAC에서 상향조절되는 것으로 확인된 바이오마커 중 1종 이상의 발현이 감소되면, 치료를 유지할 수 있다. 발현 수준이 충분히 변경되었으면, 예를 들어 건강한 수준 또는 낮은 위험 수준으로 간주될 수 있는 것으로 돌아갔으면, 췌장암 또는 PDAC에 대한 치료를 중단할 수 있다. 발현 수준이 변경되지 않았거나 악화되었으면 (예를 들어, 췌장암 또는 PDAC에서 상향조절되는 것으로 확인된 바이오마커 중 1종 이상의 발현이 증가됨), 이는 환자 상태의 악화를 지시할 수 있고, 따라서 췌장암 또는 PDAC에 대한 대안 요법을 시도할 수 있다. 이러한 방식으로, 췌장암 또는 PDAC (특히 초기 병기의 PDAC)의 치료에서 유용한 약물 후보를 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는, PDAC 치료에 유용한 약물을 확인하는 방법이 제공된다:

(a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 발현 또는 농도를 정량화하는 단계;

(b) 환자에게 후보 약물을 투여하는 단계;

(c) 동일한 환자로부터 후보 약물의 투여 후의 시점에 수득된 생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 발현 또는 농도를 정량화하는 단계; 및

(d) 단계 (a)에서 결정된 값을 단계 (c)에서 결정된 값과 비교하고, 여기서 2개의 샘플 사이에서 단백질 중 1종 이상의 발현 수준 또는 농도가 감소되는 것으로 약물 후보가 PDAC에 대한 가능한 치료로서 확인되는 단계. 일부 실시양태에서, 방법은 패널 바이오마커 단백질 모두를 사용하고, 즉 LYVE1, REG1 및 TFF1 모두가 단계 (a) 및 단계 (c)에서 정량화되어야 한다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 소변 샘플이다. 일부 실시양태에서, 약물은 화합물, 항체 또는 항체 단편이다.

키트 및 바이오센서

본 발명의 추가 실시양태에서, LYVE1, REG1 (REG1A 및/또는 REG1B) 또는 TFF1, 또는 이의 조합물의 발현 또는 농도를 정량화하기 위한 수단을 포함하는, 췌장관 선암종에 대해 테스트하기 위한 부분들의 키트가 제공된다. 이러한 수단은 임의의 적합한 검출 수단일 수 있다.

예를 들어, 수단은 바이오센서일 수 있다. 일부 실시양태에서, 수단은 제1 섹션 상의 검출되는 단백질에 대한 특이적 친화성을 갖는 비표지된 결합 분자 (예컨대 항체 또는 항체 단편)에 결합된 막으로 코팅된 딥스틱을 포함할 수 있다. 막은 비-반응성 단백질로 차단되어 있는 섹션을 또한 가질 수 있어, 막의 이러한 부분에 임의의 분자가 결합하는 것을 방지한다. 막은 샘플 내의 검출되는 단백질이 결합되어 있는 섹션을 또한 가질 수 있다. 본 발명의 상이한 단백질의 검출에 전용되는 상이한 섹션이 있는 것에 의해 단일 검정법에서 1종을 초과하는 단백질을 검출하도록 딥스틱이 설비될 수 있어, 검출될 각각의 추가 단백질이 딥스틱의 하나의 섹션 상에 결합된 이러한 추가 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 상응하는 항체를 갖고, 임의적으로, 검출될 추가 단백질이 딥스틱의 또 다른 섹션 상에 결합된다. 키트는 샘플 또는 샘플들을 위한 용기 및/또는 생물학적 샘플로부터 바이오마커를 추출하기 위한 용매를 또한 포함할 수 있다. 키트는 사용 설명서를 또한 포함할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, LYVE1, REG1 및 TFF1 중 적어도 2종의 발현 또는 농도를 검출하기 위한 수단을 포함하는, 췌장관 선암종 또는 CP를 진단하기 위한 부분들의 키트가 제공된다. 본 발명의 추가 실시양태에서, LYVE1, REG1 및 TFF1 3종 모두의 발현 또는 농도를 검출하기 위한 수단을 포함하는, 췌장관 선암종 또는 CP를 진단하기 위한 부분들의 키트가 제공된다. 바이오마커를 검출하기 위한 수단은 특이적으로 정량화되는 바이오마커에 결합하거나 또는 이와 반응하는 시약일 수 있다.

본 발명의 부분들의 키트는 바이오센서일 수 있다. 바이오센서에는 생물학적 센싱 요소가 혼입되고, 바이오센서는 생물학적 샘플에 대한 정보, 예를 들어 분석물의 존재 (또는 부재) 또는 농도를 제공한다. 구체적으로, 이들은 생물인식 성분 (생물수용체)을 분석물 (예컨대 단백질)의 검출 및/또는 정량화를 위한 물리화학적 검출기와 조합시킨다.

생물수용체는 특이적으로 관심 분석물과 상호작용하거나 또는 이에 결합하고, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편, 효소, 핵산, 세포 기관, 세포, 생물학적 조직, 각인된 분자 또는 소형 분자일 수 있다. 생물수용체는 지지체, 예를 들어 금속, 유리 또는 중합체 지지체, 또는 3차원 격자 지지체, 예컨대 히드로겔 지지체 상에 고정될 수 있다.

바이오센서는 종종 존재하는 생물변환기의 유형에 따라 분류된다. 예를 들어, 바이오센서는 전기화학식 (예컨대 전위측정식), 전자식, 압전식, 중량측정식, 초전형 바이오센서 또는 이온 채널 스위치 바이오센서일 수 있다. 변환기는 존재하는 분석물의 양을 정확하게 결정할 수 있도록 관심 분석물과 생물수용체 사이의 상호작용을 정량화가능한 신호로 번역한다. 광학적 바이오센서는 생물수용체와 관심 분석물 사이의 상호작용으로부터 초래되는 표면 플라즈몬 공명에 의존할 수 있다. 따라서 SPR을 테스트 샘플 내의 분석물의 양을 정량화하는데 사용할 수 있다. 다른 유형의 바이오센서는 소산파 바이오센서, 나노바이오센서 및 생물학적 바이오센서 (예를 들어 효소, 핵산 (예컨대 DNA), 항체, 후성물질, 세포 기관, 세포, 조직 또는 미생물 바이오센서)를 포함한다.

딥스틱은 바이오센서의 또 다른 예이다. 본 발명의 딥스틱은 막을 포함할 수 있다. 딥스틱은 발현이 검출되는 단백질에 대한 특이적 친화성을 갖는 비표지된 항체가 결합되어 있는 제1 섹션, 비-반응성 단백질로 차단되어 있는 제2 섹션, 및 발현이 검출되는 단백질이 결합되어 있는 제3 섹션을 추가로 포함할 수 있다.

관련 분야에 공지된 딥스틱 기술을 사용하여 본 발명의 방법을 신속하게 효과적으로 수행할 수 있다. 딥스틱 기술은 하기를 포함한다. 검출되는 단백질 (항원)에 대한 특이적 친화성을 갖는 표지된 항체, 예를 들어 포르마잔으로 표지된 항체를 테스트액의 샘플에 용해시킨다. 니트로셀룰로스 막이 장착된 딥스틱을 반응 혼합물에 함침시킨다. 막은 이러한 항원에 대한 특이적 친화성을 갖는 비표지된 항체가 결합되어 있는 하나의 섹션을 갖는다. 제2 섹션은 항체를 함유하지 않고, 비-반응성 단백질로 차단되어 표지된 항체가 막에 결합하는 것을 방지한다. 항원이 결합되어 있는 딥스틱의 제3 섹션이 제공된다. 테스트액 내의 유리 항원과 막에 결합된 비표지된 항체 사이의 반응, 뿐만 아니라 유리 항원과 샘플에 첨가된 표지된 항체 사이의 반응이 일어난다. 이는 막의 제1 섹션에서 결합된 비표지된 항체/항원/표지된 항체의 샌드위치를 초래한다. 표지된 항체와 결합된 항원 사이의 반응이 제3 섹션 에서 또한 일어난다. 막의 제2 섹션에서는 반응이 일어나지 않는다.

정해진 기간 동안 또는 완료가 시각적으로 결정될 때까지 반응을 진행시킨다. 포르마잔은 진한 색의 염료이기 때문에, 반응된 포르마잔-표지된 항체가 제3 섹션에 색을 부여하고, 테스트액 내에 항원이 존재하면, 제1 섹션에도 색을 부여한다. 제2 섹션에서는 반응이 일어나지 않기 때문에, 이러한 섹션에서는 색이 발색되지 않는다. 따라서 제2 섹션은 음성 대조군으로서 작용한다. 미반응 포르마잔 입자가 흡수되고 소소한 정도로 미반응 포르마잔-표지된 항체가 흡수되는 것으로 인해 제2 섹션을 포함하여 전체 막에 걸쳐 색이 부여되는 경우에, 막의 제1 섹션과 제2 섹션 사이의 색 차이에 의해 항원의 존재가 지시된다. 적절한 반응이 실제로 일어나고 있다는 것을 실연하는 것에 의해 제3 섹션은 양성 대조군으로서 제공된다.

딥스틱이 혼합물 내에 함침되는 시간의 길이는 항원이 존재한다면 막의 제1 섹션과 제2 섹션 사이에서 색 강도의 차이가 발달하게 하는 것이다. 대부분의 항체-항원 반응에 대해, 발색은 본질적으로 30 내지 60분 이내에 완료된다. 원한다면, 간단하게 딥스틱을 제거하고, 막의 제1 섹션에 걸친 색 강도를 시각적으로 점검한 후, 필요하다면 딥스틱을 다시 함침시킴으로써 딥스틱의 발색을 모니터링할 수 있다. 색 강도의 추가 변화가 보이지 않을 때, 반응이 완료된 것으로 간주될 수 있다.

관련 분야에 공지된 임의의 통상적인 방법에 의해 딥스틱을 제조할 수 있다. 예를 들어, 니트로셀룰로스 막을 딥스틱의 아래쪽 단부에 장착한다. 비표지된 1차 항체를 함유하는 용액을 막의 하나의 섹션에 적용하여, 1차 항체를 막에 결합시킨다. 차단제 (예를 들어, 1% 혈청 알부민)를 함유하는 용액을 막의 또 다른 섹션에 적용하여 막에 대한 1차 단백질의 후속 결합을 방지한다.

검출되는 추가 단백질 또는 단백질들에 대한 특이적 친화성을 갖는 비표지된 항체가 결합된 추가 섹션, 및 임의적인, 검출되는 단백질이 결합되어 있는 섹션을 포함하는 것에 의해, 1종을 초과하는 단백질을 한 번에 검출하기 위해 딥스틱이 설비될 수 있다. 이러한 경우에, 검출되는 단백질에 대한 특이적 친화성을 갖는 표지된 항체가 딥스틱의 추가 섹션에 대한 이의 결합, 따라서 샘플 내의 이의 존재를 검출하도록 샘플에 첨가될 수 있다. 항체는 동일한 염료 또는 상이한 염료로 표지될 수 있다. 포르마잔 이외의 적합한 염료는 산 염료 (예를 들어 안트라퀴논 또는 트리페닐메탄), 아조 염료 (예를 들어 메틸 오렌지 또는 디스퍼스 오렌지 1), 형광 염료 (예를 들어 플루오레세인 또는 로다민) 또는 관련 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 염료 예컨대 쿠마시 블루, 아미도 블랙, 톨루이딘 블루, 패스트 그린, 인디언 잉크, 실버 니트레이트 및 실버 락테이트를 포함한다. 미리 표지된 제1 단백질 반응물이 항체에 제한되는 것이 아니라, 샘플 내의 검출될 제2 단백질에 대한 특이적 친화성을 갖는 임의의 단백질 또는 다른 분자를 포함할 수 있다는 것이 또한 명백하다.

본 발명은 포착 분자가 고체 지지체 상에 고정되어 있는, 정량화될 각각의 바이오마커에 대해 특이적인 포착 분자 (예컨대 항체)를 포함하는 단백질 마이크로어레이 (단백질 칩으로 또한 알려짐)를 또한 제공한다. 고체 지지체는 슬라이드, 막, 비드 또는 미량역가 플레이트일 수 있다. 슬라이드는 유리 슬라이드일 수 있다. 막은 니트로셀룰로스 막일 수 있다. 어레이는 정량적 멀티플렉스 ELISA 어레이일 수 있다. 마이크로어레이가 본 발명의 방법에서 유용하다.

특히, 본 발명은 각각의 결합 분자가 상이한 표적 분석물에 특이적으로 결합하는, 결합 분자의 조합물을 제공하고, 결합 분자가 특이적으로 결합하는 분석물의 조합물은 LYVE1, REG1 또는 TFF1, 또는 이들의 조합물, 및 임의적으로 CA19.9이다.

결합 분자는 고체 기판, 예컨대 어레이 상에 존재할 수 있다. 결합 분자 모두가 동일한 고체 기판 상에 존재할 수 있다. 대안적으로, 결합 분자가 상이한 기판 상에 존재할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 결합 분자는 용액 내에 존재한다.

이러한 키트는 추가적인 성분, 예컨대 완충제 용액을 추가로 포함할 수 있다. 다른 성분은 결합된 단백질의 검출을 위한 프로브 또는 표지화 분자, 및 이에 따른 표지화를 수행하기 위한 필요한 시약 (즉, 효소, 완충제 등); 결합 완충제; 모든 결합되지 않은 또는 비-특이적으로 결합된 miRNA를 제거하기 위한 세정 용액을 포함할 수 있다. 결합 분자가 표적 분석물에 결합하는 것은 표준 조건 또는 실험적으로 결정된 조건 하에 발생할 수 있다. 관련 분야의 기술자는 측정되는 바이오마커에 따라 어떤 엄격한 조건이 요구되는지를 이해할 것이다. 엄격한 조건은 비-특이적 결합을 감소시키기에 충분히 높은 온도를 포함할 수 있다.

사용되는 단백질 어레이는 분석되는 바이오마커의 존재 및/또는 농도를 결정하기 위해 형광 표지화를 사용할 수 있지만, 다른 표지가 사용될 수 있다 (친화성 태그, 광화학 태그 또는 방사성 동위원소 태그). 무표지 검출 방법, 예컨대 표면 플라즈마 공명 (SRR), 탄소 나노튜브, 탄소 나노와이어 센서 및 미세전기기계 (MEMS) 캔틸레버를 또한 사용할 수 있다. 특히 니트로셀룰로스-코팅 유리 슬라이드를 사용하여, 근적외선 형광 검출이 정량적 검출에 특히 유용할 수 있다.

항체 어레이를 사용하는 정량적 단백질 분석은 신호 증폭, 다색 검출, 및 경쟁적 교체 기술을 포함할 수 있다. 다른 기술은 단백질 칩 분석용 주사 전자 현미경 (SEMPC)을 포함하고, 이는 후방산란 전자 검출을 이용함으로써 유리 슬라이드 상에 정렬된 리간드 또는 단백질과 특이적으로 상호작용하는 표적-코팅 금 입자를 카운팅하는 것을 수반한다. 따라서, 본 발명의 방법은 바이오마커 단백질과 이의 각각의 특이적 결합 분자 사이의 상호작용을 카운팅하여 테스트 샘플의 정량적 분석을 달성하는 것을 포함할 수 있다. 정량적 단백질 검출 및 분석이, 예를 들어, 문헌 [Barry & Solovier, "Quantitative protein profiling using antibody arrays", Proteomics, 2004, 4(12):3717-3726]에 추가로 논의되어 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 소변 샘플 내의 LYVE1, REG1 및 TFF1 단백질 각각의 농도를 결정하는 단계 및 이렇게 결정된 값을 참조물에 비교하는 단계를 포함하는, 초기 병기의 췌장관 선암종 (PDAC)을 진단하는 방법이 제공된다. 각각의 단백질의 농도가 기준값보다 더 크면, 초기 병기의 PDAC가 존재할 수 있고, 이에 따라 환자를 치료할 수 있다.

본 발명의 제2 측면 및 후속 측면의 특색은 필요한 변경을 가하여 본 발명의 제1 측면에 대한 것과 같다.

이제 본 발명이 하기의 실시예를 참조로 추가로 기재될 것이고, 이는 단지 예시를 목적으로 존재하고, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

임상 검체

발견 단계를 위해 로열 런던 병원(Royal London Hospital) (RLH)로부터 (n=18), 그리고 검증 목적을 위해 RLH 및 유니버시티 칼리지 런던(University College London) (이후 함께 'LON'으로 지칭됨), 리버풀 대학교(Liverpool University)의 외과 ('LIV'), 및 스페인 마드리드의 CNIO ('SPA')로부터 (총 371개의 소변), 건강함, CP 및 PDAC의 소변 검체를 수득하였다. 다른 양성 및 악성 간담도 병리가 있는 환자에 대한 소변 샘플 (n=117)을 LIV로부터 수득하였다. 모든 샘플은 관련 센터로부터의 충분한 윤리적 승인 및 소변 샘플을 기부한 모든 개체로부터의 사전 동의 하에 수집되었다. 모든 참여 센터에서의 검체를 동일한 표준 작업 절차를 사용하여 수집하였다: 청결-채취, 중간뇨를 수집하고, 수집으로부터 2시간 이내에 냉동시키고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 중요하게, 모든 샘플이 신장 질환 병력이 없는 환자로부터 유래되었다; 딥스틱 테스트 분석 (바이엘(Bayer)의 멀티스틱스 SG 08935414)을 또한 수행하여 잠재적인 빌리루빈혈증, 단백뇨, 박테리아 오염 및 혈뇨를 배제하였다. 수술 또는 화학요법 치료 전에 샘플을 수집하였다. CA19.9를 측정하기 위한 매칭되는 혈장 샘플이 RLH 및 LIV로부터 입수가능하였다.

소변 프로테옴의 GeLC -MS/MS 분석

각각의 군 (H, CP 및 PDAC)에 대한 6개의 소변 샘플 (남성 3명 및 여성 3명) (총 18개의 샘플)을 사용하였다: H 남성/여성의 연령 - 45세,50세,60세/44세,45세,54세; CP 남성/여성의 연령 - 46세,48세,51세/47세,69세,74세; PDAC 남성/여성의 연령 - 44세,74세,84세/71세,73세,77세; 남성의 PDAC 병기 - 모두 IIB기/여성 - IB기 2명, IIA기 1명. 이전에 기재된 바와 같이 모든 소변 샘플을 탈염시키고 농축하였다 (Weeks ME et al. "Analysis of the urine proteome in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma", Proteomics Clinical Applications 2008; 2:1047-57). 군당 3개의 샘플의 각각의 사전-가공 풀 20 μg을 4-12% 미니-겔 (인비트로젠(Invitrogen)) 상에서 이중으로 분리하였다; 여성 및 남성 소변을 별개로 분석하였다. 겔을 콜로이달 쿠마시로 염색하고, 각각의 샘플 레인을 그리드를 사용하여 40개의 같은 크기의 조각으로 절단하였다. 겔 조각을 로봇으로 트립신으로 소화시키고, 생성된 펩티드를 LTQ 오비트랩 XL 종렬식 질량 분광계 (써모피셔(ThermoFisher))에 인터페이스로 연결된 나노액퀴티 (워터스(Waters))를 사용하여 나노 LC/MS/MS에 의해 분석하였다. 생성물 이온 데이터를 마스코트를 사용하여 인간 IPI 단백질 데이터베이스에 대해 검색하고, 이어서 비-풍부 단백질 목록 내로의 콜레이션을 위해 스캐폴드 소프트웨어 (프로테옴 소프트웨어) 내로 파싱하였다. 데이터베이스 역검색을 사용하여 거짓 발견율을 평가하였고, 표적 단백질 FDR은 샘플당 <0.5%이다. PDAC, CP 및 건강함의 샘플 사이의 상대적인 단백질 존재도의 반정량적 평가를 스펙트럼 카운팅 접근법을 사용함으로써 수득하였다 (Liu H et al., "A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics", Analytical Chemistry, 2004; 76:4193-201).

소변 바이오마커 및 CA19.9 측정

소변 내의 총 단백질 농도를 브래드포드 검정법 (쿠마시 단백질 검정 시약(Coomassie Protein Assay Reagent), 피어스(Pierce))으로 결정하였다. 인간 LYVE-1 (카탈로그# SEB049Hu, 유에스씨엔 라이프 사이언스 인크.(Uscn Life Science Inc.)) 및 인간 TFF1 (카탈로그# ELH-LYVE1-001, 레이바이오텍 인크.(RayBiotech, Inc.))의 정량적 결정을 제조사의 설명서에 따라 수행하였다; 먼저 본 발명자들의 실험실에서, 그리고 나중에 바이오벤더 애널리티컬 테스팅 서비스(BioVendor Analytical Testing Service) (바이오벤더 - 라보라토르니 메디치나 에이.에스(BioVendor - Laboratorni medicina a.s))에 의해 인간 ReG1A 수준을 평가하였다. 평가된 각각의 단백질에 대한 정제된 표준물을 사용하여 검정 곡선을 만들었다. 제조사의 설명서에 따라 4-파라미터 로지스틱 회귀에 의해 곡선 피팅을 달성하였다. 각각의 ELISA에 대한 검출 한계 및 변동 계수 (CV)는 하기와 같았다: LYVE-1 - 8.19 pg/ml, 검정법내 CV - 9%, 검정법간 CV - 12%, TFF1 - 0.037 ng/ml, 검정법내 CV -9%, 검정법간 CV - 12%. REG1A - 0.094 ng/ml, 검정법내 CV - 9%, 검정법간 CV 20%; REG1B- 3.13 pg/ml, 검정법내 CV - 3.9%, 검정법간 CV - 2.7%. RLH의 임상 생화학 실험실 (영국 런던)에서 로슈 코바스 8000 시스템 (로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics), 독일 만하임)을 사용하여 자페(Jaffe) 방법에 의해 소변 크레아티닌을 측정하였다. 일상적인 프로토콜에 따라 로슈 모듈라 E170 기기를 사용하여 RLH의 임상 생화학 실험실에서 혈장 및 소변 내의 Ca19.9의 수준을 측정하였다.

조직 마이크로어레이 및 면역조직화학 (IHC)

바이오마커의 발현을 평가하는데 사용된 조직 마이크로어레이 및 채점 절차의 상세사항이 이전에 기재되었다 (Ene-Obong A et al., "Activated pancreatic stellate cells sequester CD8+ T cells to reduce their infiltration of the juxtatumoral compartment of pancreatic ductal adenocarcinoma", Gastroenterology, 2013; 145:1121-32). 표준 프로토콜 (sCC1, 1h 인큐베이션)에 따라 벤타나 디스커버리 시스템을 사용하여 항-REG1A (압캠(Abcam), 토끼 폴리클로날, ab47099, 1:100 희석), 항-TFF1 (압캠, 토끼 폴리클로날, ab50806, 1:100 희석), 및 항-LYVE1 (아크리스(Acris), 토끼 폴리클로날, DP3500PS, 1:100 희석) 항체로 IHC를 수행하였다.

통계 분석

MS 데이터로부터 잠재적 소변 바이오마커를 확인하기 위해, 정규화된 데이터 (스펙트럼 카운트/샘플의 합계를 기초로 함) 상에서 어레이트랙 소프트웨어 (http;edkb.fda.go/webstart/arraytrack) 및 t-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 임의의 2개의 샘플 군 사이의 배수 변화 및 p 값 둘 다에 따라 데이터를 추가로 필터링하였다.

이어서, 선택된 단백질 (LYVE1, REG1A 및 TFF1)의 농도를 ELISA 검정법을 사용하여 조사하고, 수득된 결과를 그래프패드프리즘으로 비-파라미터 크루스칼-왈리스 검정 후의 던 사후 검정을 사용하여 분석하였다. 3종의 바이오마커 사이의 상관관계를 피어슨 상관 계수를 사용하여 평가하였다.

각각의 개별적인 바이오마커 및 패널을 PDAC 환자 (모든 병기 또는 초기의 I-II기)와 대조군 샘플 (건강함 및 CP)을 구별하는 이들의 능력에 대해 ROC 분석 및 홀드-아웃 접근법을 사용하여 조사하였다. 각각의 비교를 위해, 환자 및 대조군 데이터세트 내의 대상체의 70%를 무작위로 선택하여 트레이닝 데이터세트 내에 포함시켰다. 그 후, 로지스틱 회귀를 적용하였다. 회귀 분석 전에, 모든 단백질 농도 데이터를 자연 로그 변환시키고 평균-중심화하였다. 개별적인 바이오마커 분석에서, 크레아티닌-정규화 데이터를 사용하여 소변 희석 인자에 대해 수정하였다; 패널 분석의 경우에, 모델이 3종의 바이오마커 (크레아티닌 정규화 전)를 포함하였고, 크레아티닌 및 연령에 대해 조정되었으며 (PDAC 환자의 중앙값 연령이 건강한 개체 및 CP 개체의 것보다 더 높았기 때문 (표 1)), 즉 5-파라미터 모델이었다. 모든 병기의 PDAC 대 건강함, I-II기 PDAC 대 건강함, 모든 병기의 PDAC 대 CP, 및 I-II기 PDAC 대 CP의 비교를 위해 트레이닝 데이터세트에 별개의 모델을 적용하였다. 상기 회귀 모델 각각에 대해 ROC 곡선을 생성시켰다; 곡선하 면적 (AUC), 및 군들 사이의 구별을 위한 '최적' 컷-포인트에서의 감수성 (SN) 및 특이성 (SP)를 수득하였다. 최적 컷-포인트는 R 'pROC' 패키지의 'ci.threshold' 절차 (Robin X et al., "pROC: an open-source package for R and S+ to analyse and compare ROC curves", BMC Bioinformatics , 2011; 12:77)에 따라 계산된 바와 같은 하기 기준에 따라 최적의 SN 및 SP로 ROC 평면 내의 플롯의 상단-좌측 부분 (좌표 0,1)에 가장 가까운 포인트에 상응하였다:

min((1 - 감수성)² + (1 - 특이성)²).

이러한 접근법은 바이오마커의 최적 컷-포인트의 추정에서 성능이 양호한 것으로 나타났다.

나머지 대상체 (30%)는 모델 검증에 사용된 독립적인 데이터세트를 형성하였다. 1차 분석 (모든 PDAC 대 건강함)을 위해, 49개의 PDAC 샘플 및 28개의 건강함의 샘플이 단측 검정을 사용하여 1.0의 표준화 차이 (즉, 적어도 1의 표준 편차의 PDAC 샘플과 건강함의 샘플 사이의 차이)를 검출하는 90% 초과의 능력을 제공한다.

검증 데이터세트 내의 각각의 샘플을 트레이닝 데이터세트를 기초로 개발된 로지스틱 회귀 모델에 따라 분류하고, 이러한 분류를 실제 진단과 비교하고, 따라서 새로운 ROC 곡선을 유도함으로써, 검증을 수행하였다. 트레이닝 세트에 대해 컴퓨터로 계산된 최적 컷-포인트를 사용하여 검증 데이터세트의 SN 및 SP를 유도하였다. AUC의 불확실성을 평가하기 위한 드롱의 점근적으로 정확한 방법 (DeLong ER et al., "Comparing the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: a nonparametric approach", Biometrics, 1988; 44:837-45).)을 기초로 AUC에 대한 신뢰 구간 (CI, 95%)이 유도되었다; 문헌 [Carpenter J & Bithell J., "Bootstrap confidence intervals: when, which, what? A practical guide for medical statisticians", Stat Med, 2000; 19:1141-64]에 기재된 바와 같은 백분위수 방법 (2,000개의 부트스트랩 사본)으로 비-파라미터 계층화 리샘플링(resampling)을 사용하여 SN 및 SP, 95% CI가 유도되었다. 상관된/쌍을 이룬 AUC에 대해 드롱의 단측 검정을 사용하여 AUC를 비교하였다.

탐색적 분석의 경우에, 모든 입수가능한 샘플을 사용하는 로지스틱 회귀 모델링을 기초로 I-IIA기 PDAC 대 건강함 또는 CP를 비교하기 위해 ROC 곡선이 유도되었다.

Epi, pROC http://CRAN.R-project.org/package=Epi 및 ROCR (Sing T et al., "ROCR: visualizing classifier performance in R.", Bioinformatics, 2005; 21:3940-1) 패키지로부터의 절차를 사용하여 R 버전 2.13.0 (The R Foundation for Statistical Computing, http://www.r-project.org/foundation)에서 ROC 곡선 분석을 수행하였다.

소변 프로테옴

PDAC 개체, CP 개체 및 건강한 개체 (H) (군당 6명, 남성 3명, 여성 3명)로부터 유래된 18개의 소변 검체의 GeLC/MS/MS에 의한 심층 프로테오믹스 분석 (도 6A)에 착수하였다. 이러한 분석의 결과로 약 1,500종 (남성 소변에서 1,198종 및 여성 소변에서 1,061종)의 비-풍부 단백질이 확인되었다. 이러한 단백질은 모든 세포 구획으로부터 유래되었고, IPA (인저뉴어티 경로 분석, http://www.ingenuity.com/)를 사용하여 다수의 세포 기능 및 질환에 대해 지도로 만들어져서, 소변이 다양한 단백질의 기원 및 기능적 역할과 관련하여 이들의 풍부한 공급원을 제공한다는 것을 입증한다.

남성 및 여성 대상체로부터의 소변 샘플에 대해 MS 분석을 별개로 수행하였다. 상당한 성별-특이적 차이가 주목되었다: 건강함의 소변 샘플에서 확인된 997종의 단백질 중에서, 398종 (40%)이 남성 소변에 독특하였고, 118종 (12%)이 여성에서 독특하였으며, 481종 (48%)이 둘 다에 공통이었다.

3종의 실험 군 (PDAC, CP, H) 사이에서 차등적으로 발현된 약 200개 중에서, 남성 및 여성 둘 다에서 공통적으로 탈조절된 3종의 단백질인 LYVE1, REG1A 및 TFF1을 통계 (p-값, 배수 변화), 잠재적 후보에 대한 사전 지식을 위한 췌장 발현 데이터베이스 (PED) (http://www.pancreasexpression.org/) 및 추가적인 문헌 검색 둘 다의 질의, 그리고 또한 시판 ELISA 검정법의 입수가능성을 기초로 추가 평가를 위해 선택하였다. 프로테오믹스 데이터 내의 REG1B가 약간 더 양호한 후보인 것으로 보였지만, 당시에 단지 REG1A ELISA 검정법만 상업적으로 입수가능하였다. 그러나, REG1B ELISA가 입수가능해졌을 때, 소변 샘플의 서브세트를 테스트하였고, 유사한 결과가 수득되었다 (하기 참조). 소변 검체 내의 전체 크기의 단백질 (LYVE1의 경우에 35 kDa, REG1A의 경우에 19 kDa, TFF1의 경우에 9 kDa)로서의 3종의 선택된 바이오마커의 존재를 웨스턴 블롯 검사로 확인하였다 (데이터는 제시되지 않음).

PDAC 검출에서의 바이오마커 패널

이어서, 선택된 바이오마커를 3개의 센터 (영국의 런던 및 리버풀, 및 스페인의 마드리드)에서 수집된 371개의 소변 샘플에서 ELISA 검정법을 사용하여 평가하였다. 연구에 포함된 환자 및 건강한 참여자의 인구통계학 및 임상 특성이 표 1 (뒷면)에서 제시된다.

표 1 - 건강한 참여자 및 환자 코호트의 인구통계학 및 임상 특성

I-IV기 PDAC 대 건강함

ELISA 분석은 건강함의 샘플 (n = 87)과 비교했을 때 PDAC 환자 (n = 192)의 소변에서 각각의 후보 바이오마커의 유의하게 더 높은 소변 농도를 나타냈다 (모두 p<0.0001, 도 1). 중요하게, REG1B 및 REG1A ELISA 검정법에서 유사한 결과가 생성되었다 (도 1).

PDAC에서는, LYVE1, REG1A 및 TFF1이 양성으로 서로 상관된 한편, 건강함의 샘플에서는, 단지 LYVE1 및 REG1A만이 상관되었다 (도 7). 수용자 조작 특성 (ROC) 곡선 분석을 사용하여 LYVE1, REG1A 및 TFF1의 진단 성능이 확립되었다 (도 2). I-IV기 PDAC와 건강함의 소변을 구별하는 것에서의 이들의 개별적인 성능을 먼저 트레이닝 데이터세트에서 평가하였다 (샘플의 70%, 각각 n = 143 및 n = 59). 개별적인 (크레아티닌-정규화) 소변 바이오마커가 LYVE1의 경우에 0.851 (95% CI 0.801-0.902), REG1의 경우에 0.823 (95% CI 0.766-0.879) 및 TFF1의 경우에 0.686 (95% CI 0.606-0.765)의 AUC 값으로 2개의 군을 구별할 수 있었고, 이때 각각의 SN은 76.9% (95% CI 69.3-83.2), 62.2% (95% CI 53.8-69.9) 및 72.7% (95% CI 65.0- 79.7)였고, 각각의 SP는 88.1% (95% CI 79.6-96.6), 94.9% (95% CI 88.1-100.0), 및 59.3% (95% CI 47.5-71.2)였다 (도 2A, C). 그 후, 3종의 바이오마커를 크레아티닌 및 연령에 대해 조정된 패널로 조합하였다 (도 2B). 트레이닝 데이터세트 및 검증 데이터세트 (샘플의 30%, PDAC n = 49, 건강함 n = 28)에서의 ROC 분석의 기초가 되는 로지스틱 회귀 모델의 결과가 도 2B 및 C에서 제시된다. 패널은 트레이닝 및 검증 데이터세트에서 각각 0.891 (95% CI 0.847-0.935) 및 0.921 (95% CI 0.863-0.978)의 AUC에 대해 SN >75% 및 SP >85%를 달성하였고, 따라서 임의의 개별적인 바이오마커보다 더 양호한 성능을 나타낸다.

초기 병기의 PDAC 대 건강함

다음으로, 초기 병기의 암을 건강한 개체로부터 구별하는 것에서의 바이오마커의 성능을 평가하였다. PDAC 환자 중 148명 (77%)에 대해 종양 병기 정보가 입수가능하였다. 각각의 바이오마커의 농도가 건강한 사람 (n = 87)과 비교하여 후기 병기 (III-IV기, n = 77, 모두 p<0.001), I-II기 (n = 71, 모두 p<0.001) 및 I-IIA기 (림프절 전이가 없는 국소적으로 침습성인 질환, n=16, p<0.05)에서 유의하게 증가되었다 (도 3). LYVE1 및 TFF1의 농도가 I기 암에서 또한 더 높았다 (각각 p<0.001 및 p<0.05; 데이터는 제시되지 않음). 제한된 수의 I기 소변 샘플이 입수가능하였기 때문에 (n = 7), 조합된 I-II기 PDAC 데이터에 대한 소변 마커의 진단 정확도를 평가하였다. I-II기 PDAC와 건강함의 소변을 구별하는 것에서의 개별적인 마커 및 패널의 성능을 먼저 새로운 트레이닝 데이터세트 (샘플의 70%; 각각 I-II기 PDAC n = 56 및 건강함 n = 61)에서 평가하였다. 이러한 트레이닝 데이터세르를 사용하여 새로운 5-파라미터 모델을 세우고, 나머지 데이터 (샘플의 30%; I-II기 PDAC n = 15, 건강함 n = 26)를 사용하여 검증하였다 (도 4A, B). 패널은 트레이닝 및 검증 데이터세트에서 각각 0.900 (95% CI 0.843-0.957) 및 0.926 (95% CI 0.843-1.000)의 AUC를 달성하였다 (도 4C). 따라서, 소변 바이오마커 패널이 높은 정확도로 초기 PDAC를 건강함의 샘플로부터 구별할 수 있다.

탐색적 분석으로서, CA19.9 값을 수득할 수 있도록, 매칭되는 혈장 샘플이 입수가능한 개체로부터의 소변 샘플을 선택하였다. 혈장 CA19.9 (37 U/mL의 임상적으로 확립된 역치의 차단값이 있는 범주형 변수), 패널, 및 패널 및 CA19.9의 조합에 대해 ROC 곡선이 유도되었다. I-II기 PDAC (n=71) 대 건강함 (n=28)의 샘플의 비교에 대해, CA19.9의 경우는 0.880 (95% CI 0.947-0.999)의 AUC가 수득되었고, 패널의 경우는 0.973 (95% CI 0.947-0.999)의 AUC가 수득되었으며, 이는 혈장 CA19.9 단독보다 유의하게 더 컸다 (p=0.005). 혈장 CA19.9를 패널에 추가했을 때 AUC가 0.991로 유의하게 증가하였다 (95% CI 0.979-1.000, p=0.04, 도 5A/C). I-IIA기 PDAC (n=16)를 건강함의 샘플에 비교했을 때, AUC는 CA19.9의 경우는 0.839 (95% CI 0.719-0.959), 패널의 경우는 0.971 (95% CI 0.929-1.000)였다 (p=0.006). 혈장 CA19.9를 패널에 추가했을 때 어떠한 개선도 초래되지 않았다 (AUC=0.969, 95% CI 0.924-1.000, p=0.7, 도 5B/C).

PDAC를 CP로부터 감별하는 것에서의 바이오마커 패널

PDAC를 CP로부터 감별하는 것에서의 바이오마커 패널의 능력을 평가하였다.

I-IV기 PDAC 대 CP

3종의 바이오마커 모두에 대한 소변 농도가 모두 p<0.001로 CP 샘플 (n = 92)에 비교하여 PDAC (n = 192) 샘플에서 더 높았고 (도 1), PDAC의 경우와 같이, 바이오마커 농도가 CP 데이터에서 서로 양성으로 상관되었다 (도 7). 트레이닝 데이터세트 (PDAC n = 143, CP n = 62)에서, LYVE1 및 REG1이 77-78%의 SN 및 66-69%의 SP로 2개의 군을 구별할 수 있는 한편 (0.775 (95% CI 0.704 - 0.846) 및 0.722 (95% CI 0.643 - 0.801)의 각각의 AUC 값, 도 8), TFF1의 SP는 비슷한 SN에 대해 단지 50%에 도달할 뿐이었다. 3종의 바이오마커를 패널로 조합하는 것은 트레이닝 (AUC=0.815, 95% CI 0.752-0.878) 및 검증 (PDAC n = 49, CP n =30, AUC=0.839, 95% CI 0.751-0.928) 데이터세트에서 평가했을 때 LYVE1 및 REG1 단독의 성능을 단지 근소하게 개선시킬 뿐이었다.

초기 병기의 PDAC 대 CP

바이오마커 소변 농도가 3종의 바이오마커 각각에 대해 p<0.001으로 CP (n = 87)에 비교하여 I-II기 PDAC (n = 71)에서 유의하게 증가하였다 (데이터는 제시되지 않음). 패널은 트레이닝 (I-II기 PDAC n = 56, CP n = 66) 및 검증 (I-II기 PDAC n = 15, CP n = 26) 데이터세트 둘 다에서 높은 SN (>85%)을 달성하였지만, 개별적인 바이오마커에 대해 관찰된 SP와 유사하게 비교적 낮은 SP (66.7% 및 50%)를 달성하였고, 이때 각각의 AUC는 0.831 (95% CI 0.762-0.901) 및 0.846 (95% CI 0.730-0.963)였다 (도 8D-F).

이전과 같이, 패널을 혈장 CA19.9와 조합하여 조사하였다. I-II기 PDAC (n=71) 대 CP (n=50) 샘플의 비교에 대해, ROC 곡선이 CA19.9의 경우는 0.775 (95% CI 0.699-0.852), 패널의 경우는 0.830 (95% CI 0.759-0.902) (p=0.1), CA19.9와 조합된 패널의 경우는 0.885 (95% CI 0.825-0.945) (패널 단독에 대한 우수성에 대해 p=0.01)의 AUC를 나타냈다 (도 9A/C). I-IIA기 PDAC (n = 16) 대 CP의 비교에서, ROC 곡선이 CA19.9의 경우는 0.735 (95% CI 0.609-0.861), 패널의 경우는 0.871 (95% CI 0.770-0.972) (혈장 CA19.9에 대한 우수성에 대해 p=0.004), 조합의 경우는 0.866 (95% CI 0.749-0.984) (p=0.6)의 AUC를 나타냈다 (도 9B/C). 따라서, I-IIA기를 CP로부터 감별하는 것에서 패널이 CA19.9보다 성능이 더 양호하였다.

다른 간담도 병리의 소변에서의 바이오마커 발현

마지막으로, 여러 다른 양성 또는 악성 간담도 병리가 있는 환자로부터 수집된 소변 검체에서의 바이오마커의 발현을 조사하고, 초기 병기의 PDAC가 있는 환자에서의 발현에 비교하였다 (도 10). I-II기 PDAC 샘플에서의 LYVE1의 소변 수준이 IPMN, AMP 및 췌장 NET 검체에서보다 더 높았고, REG1A 수준이 단지 IPMN에 비교해서만 초기 병기의 PDAC에서 유의하게 더 높았다. 혈장 CA19.9 수준이 췌장 NET 및 DuCA 샘플에 비교하여 I-II기 PDAC에서 유의하게 더 높았다. 이는 다른 양성 또는 악성 간담도 병리를 초기 병기의 PDAC로부터 감별하는 것에서의 LYVE1 및 REG1A에 대한 잠재적 유용성을 시사할 수 있다.

3종의 바이오마커의 조직 기원

초기 암 환자를 건강한 개체로부터 감별하는 것에서의 패널의 양호한 성능이 실연되었으면, 다음으로 췌장 조직에서의 바이오마커의 발현을 확립하려고 노력하였다. 사내에서 구축된 PDAC 조직 마이크로어레이를 사용하여 면역조직화학 (IHC)을 수행하였다. REG1A의 강한 발현이 조직학적으로 정상인 인접한 선방 세포에서 나타났지만, 44/60개의 종양 (73%)에서 염색이 또한 나타났다 (도 11A). TFF1은 정상 췌장에서 부재하였지만, 43/60개 (72%)의 PDAC에서 발현되었다 (도 11B). LYVE1 발현은 어떠한 암 세포에서도 나타나지 않았지만, 8개의 PDAC 조직에서 희귀 림프관에서 나타났다 (도 11C). 다음으로, 수술 전 및 후에 샘플이 수집된 7명의 PDAC 환자로부터의 소변에서 3종 모두의 바이오마커의 수준을 측정하였다 (도 11D). 모든 환자에서, LYVE1 및 REG1A의 수준이 수술 후에 감소하였고, 또한 TFF1의 경우에 7명 환자 중 6명에서 이를 볼 수 있었으며 (첫 번째 수술후 소변 샘플이 시술 4개월 후에 수집된 환자 1은 제외), 이는 아마도 수술 후의 종양 덩어리의 실질적인 상실에 기인할 것이다.

마지막으로, 여러 보고서가 CA19.9가 소변에 또한 존재하고 암 진단에 사용될 수 있으며, 일부 경우에 혈액 CA19.9보다 더 우수하였음을 가리켰기 때문에, 소변 샘플 내의 Ca19.9 수준을 측정하고, 이를 매칭되는 혈장 CA19.9에 비교하였다. 이러한 경우에 소변 CA19.9는 PDAC를 CP 및 건강함의 소변으로부터 감별하는 것에서 유용한 것으로 증명되지 않았다 (데이터는 제시되지 않음).

PDAC는 가장 검출하기 어려운 암 중 하나이다; 따라서 대다수의 환자가 진행된 질환 병기에 나타난다. 그러므로, PDAC 환자의 20% 미만이 잠재적으로 치유적인 수술을 받는 한편, 나머지는 단지 고식적 치료만 제공받을 수 있다. 본원에서, 초기 병기의 PDAC 환자를 건강한 대상체로부터 높은 정확도로 구별하는 3-바이오마커 소변 패널이 기재된다. 소변 검체를 기초로 하는 진단 테스트가 개발되었는데, 이러한 체액이 혈액에 비해 여러 장점이 있기 때문이다: 이는 훨씬 덜 복합적이고, '불활성'이고 안정적인 분석용 매트릭스를 제공하며, 충분한 부피로 반복적 및 비-침습적으로 샘플을 취할 수 있다. 현재까지, 2,300개를 초과하는 단백질이 소변에서 검출되었고, 이 중 적어도 1/3이 전신에서 유래된다. 혈액의 초여과액으로서, 바이오마커의 적어도 일부가 혈액에서보다 소변에서 더 높은 농도로 발견될 것으로 예상할 수 있다.

조합될 때, REG1A 및 TFF1, LYVE1이 I-II기 PDAC가 있는 환자를 90%를 초과하는 정확도로 검출할 수 있는 강력한 소변 패널을 형성한다. CA19.9와 조합될 때 정확도가 증가될 있다는 것을 탐색적 분석이 시사한다. 추가적으로, 패널이 I-IIA기 환자를 건강한 환자로부터 구별하는데 유용한 것으로 증명될 수 있다.

완전히 비-침습적이고 저렴하면서, 이러한 소변 스크리닝 테스트는, 적시적인 수술 시술과 커플링될 때, 췌장 선암종이 발달될 위험이 높은 환자에서 훨씬 개선된 결과에 이를 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Queen Mary University of London <120> Biomarkers for Pancreatic Cancer <130> P60649WO/TCL <150> GB1501930.0 <151> 2015-02-05 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 322 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Arg Cys Phe Ser Leu Val Leu Leu Leu Thr Ser Ile Trp Thr 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Val Gln Gly Ser Leu Arg Ala Glu Glu Leu Ser Ile 20 25 30 Gln Val Ser Cys Arg Ile Met Gly Ile Thr Leu Val Ser Lys Lys Ala 35 40 45 Asn Gln Gln Leu Asn Phe Thr Glu Ala Lys Glu Ala Cys Arg Leu Leu 50 55 60 Gly Leu Ser Leu Ala Gly Lys Asp Gln Val Glu Thr Ala Leu Lys Ala 65 70 75 80 Ser Phe Glu Thr Cys Ser Tyr Gly Trp Val Gly Asp Gly Phe Val Val 85 90 95 Ile Ser Arg Ile Ser Pro Asn Pro Lys Cys Gly Lys Asn Gly Val Gly 100 105 110 Val Leu Ile Trp Lys Val Pro Val Ser Arg Gln Phe Ala Ala Tyr Cys 115 120 125 Tyr Asn Ser Ser Asp Thr Trp Thr Asn Ser Cys Ile Pro Glu Ile Ile 130 135 140 Thr Thr Lys Asp Pro Ile Phe Asn Thr Gln Thr Ala Thr Gln Thr Thr 145 150 155 160 Glu Phe Ile Val Ser Asp Ser Thr Tyr Ser Val Ala Ser Pro Tyr Ser 165 170 175 Thr Ile Pro Ala Pro Thr Thr Thr Pro Pro Ala Pro Ala Ser Thr Ser 180 185 190 Ile Pro Arg Arg Lys Lys Leu Ile Cys Val Thr Glu Val Phe Met Glu 195 200 205 Thr Ser Thr Met Ser Thr Glu Thr Glu Pro Phe Val Glu Asn Lys Ala 210 215 220 Ala Phe Lys Asn Glu Ala Ala Gly Phe Gly Gly Val Pro Thr Ala Leu 225 230 235 240 Leu Val Leu Ala Leu Leu Phe Phe Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly Phe 245 250 255 Cys Tyr Val Lys Arg Tyr Val Lys Ala Phe Pro Phe Thr Asn Lys Asn 260 265 270 Gln Gln Lys Glu Met Ile Glu Thr Lys Val Val Lys Glu Glu Lys Ala 275 280 285 Asn Asp Ser Asn Pro Asn Glu Glu Ser Lys Lys Thr Asp Lys Asn Pro 290 295 300 Glu Glu Ser Lys Ser Pro Ser Lys Thr Thr Val Arg Cys Leu Glu Ala 305 310 315 320 Glu Val <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Gln Thr Ser Ser Tyr Phe Met Leu Ile Ser Cys Leu Met Phe 1 5 10 15 Leu Ser Gln Ser Gln Gly Gln Glu Ala Gln Thr Glu Leu Pro Gln Ala 20 25 30 Arg Ile Ser Cys Pro Glu Gly Thr Asn Ala Tyr Arg Ser Tyr Cys Tyr 35 40 45 Tyr Phe Asn Glu Asp Arg Glu Thr Trp Val Asp Ala Asp Leu Tyr Cys 50 55 60 Gln Asn Met Asn Ser Gly Asn Leu Val Ser Val Leu Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Gly Ala Phe Val Ala Ser Leu Ile Lys Glu Ser Gly Thr Asp Asp Phe 85 90 95 Asn Val Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Lys Lys Asn Arg Arg Trp His 100 105 110 Trp Ser Ser Gly Ser Leu Val Ser Tyr Lys Ser Trp Gly Ile Gly Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Val Asn Pro Gly Tyr Cys Val Ser Leu Thr Ser Ser Thr 130 135 140 Gly Phe Gln Lys Trp Lys Asp Val Pro Cys Glu Asp Lys Phe Ser Phe 145 150 155 160 Val Cys Lys Phe Lys Asn 165 <210> 3 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Gln Thr Asn Ser Phe Phe Met Leu Ile Ser Ser Leu Met Phe 1 5 10 15 Leu Ser Leu Ser Gln Gly Gln Glu Ser Gln Thr Glu Leu Pro Asn Pro 20 25 30 Arg Ile Ser Cys Pro Glu Gly Thr Asn Ala Tyr Arg Ser Tyr Cys Tyr 35 40 45 Tyr Phe Asn Glu Asp Pro Glu Thr Trp Val Asp Ala Asp Leu Tyr Cys 50 55 60 Gln Asn Met Asn Ser Gly Asn Leu Val Ser Val Leu Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80 Gly Ala Phe Val Ala Ser Leu Ile Lys Glu Ser Ser Thr Asp Asp Ser 85 90 95 Asn Val Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Lys Lys Asn Arg Arg Trp His 100 105 110 Trp Ser Ser Gly Ser Leu Val Ser Tyr Lys Ser Trp Asp Thr Gly Ser 115 120 125 Pro Ser Ser Ala Asn Ala Gly Tyr Cys Ala Ser Leu Thr Ser Cys Ser 130 135 140 Gly Phe Lys Lys Trp Lys Asp Glu Ser Cys Glu Lys Lys Phe Ser Phe 145 150 155 160 Val Cys Lys Phe Lys Asn 165 <210> 4 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Thr Met Glu Asn Lys Val Ile Cys Ala Leu Val Leu Val Ser 1 5 10 15 Met Leu Ala Leu Gly Thr Leu Ala Glu Ala Gln Thr Glu Thr Cys Thr 20 25 30 Val Ala Pro Arg Glu Arg Gln Asn Cys Gly Phe Pro Gly Val Thr Pro 35 40 45 Ser Gln Cys Ala Asn Lys Gly Cys Cys Phe Asp Asp Thr Val Arg Gly 50 55 60 Val Pro Trp Cys Phe Tyr Pro Asn Thr Ile Asp Val Pro Pro Glu Glu 65 70 75 80 Glu Cys Glu Phe

Claims

생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이들의 조합물의 발현 수준 또는 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 췌장관 선암종에 대해 테스트하는 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 단백질의 발현 수준 또는 농도를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 및 TFF1 각각의 발현 수준 또는 농도를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, REG1 단백질이 REG1A 및/또는 REG1B인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 결정 단계가, 발현 수준 또는 농도가 결정되는 단백질 또는 단백질들에 대해 특이적인 결합 분자 또는 결합 분자들을 사용하여 수행되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 결합 분자가 항체 또는 항체 단편, 단백질, 또는 압타머인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 소변, 전혈, 혈청 또는 췌장 조직 샘플인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 인간으로부터의 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 췌장관 선암종이 I기 또는 II기 췌장관 선암종인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, I기 PDAC와 건강한 환자, I기 PDAC와 만성 췌장염 (CP), 또는 I기 PDAC와 후기 병기의 PDAC를 구별하는 감별 진단을 제공하는 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 miRNA의 발현 수준 또는 농도를 참조물과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 참조물이 건강한 환자로부터의 생물학적 샘플인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 PDAC를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 환자로부터의 것인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, CA19.9 단백질의 발현 수준 또는 농도를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
췌장관 선암종을 진단하는데 사용하기 위한, LYVE1, REG1 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 이들의 조합물.
췌장관 선암종을 진단하는데 사용하기 위한, LYVE1, REG1 및 TFF1로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 단백질의 조합물.
췌장관 선암종을 진단하는데 사용하기 위한, LYVE1, REG1 및 TFF1 단백질 각각의 조합물.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, REG1 단백질이 REG1A 및/또는 REG1B인 단백질 또는 단백질 조합물.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 소변 단백질인 단백질 또는 단백질 조합물.
제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 수준 또는 농도가, 분석되는 단백질 또는 단백질들에 대해 특이적인 결합 분자 또는 결합 분자들을 사용하여 측정되는 것인 단백질 또는 단백질 조합물.
제20항에 있어서, 결합 분자가 항체 또는 항체 단편, 단백질, 또는 압타머인 단백질 또는 단백질 조합물.
제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 췌장관 선암종이 I기 또는 II기 췌장관 선암종인 단백질 또는 단백질 조합물.
생물학적 샘플 내의 LYVE1, REG1 또는 TFF1, 또는 이들의 조합물의 발현 또는 농도를 측정하기 위한 수단을 포함하는, 췌장관 선암종에 대해 테스트하기 위한 키트.
제23항에 있어서, LYVE1, REG1 또는 TFF1 중 2종의 발현 또는 농도를 측정하기 위한 수단을 포함하는, 췌장관 선암종에 대해 테스트하기 위한 키트.
제23항에 있어서, LYVE1, REG1 또는 TFF1 각각의 발현 또는 농도를 측정하기 위한 수단을 포함하는, 췌장관 선암종에 대해 테스트하기 위한 키트.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, REG1 단백질이 REG1A 및/또는 REG1B인, 췌장관 선암종에 대해 테스트하기 위한 키트.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 측정하기 위한 수단이 바이오센서인 키트.
제27항에 있어서, 바이오센서가 전기화학적, 전자식, 압전식, 중량측정식, 초전형 바이오센서, 이온 채널 스위치, 소산파, 표면 플라즈몬 공명 또는 생물학적 바이오센서인 키트.
제27항에 있어서, 검출하기 위한 수단이 막으로 코팅된 딥스틱을 포함하며, 여기서 딥스틱은
(a) 발현 또는 농도가 측정되는 단백질에 대한 특이적 친화성을 갖는 비표지된 결합 분자가 결합되어 있는 제1 섹션;
(b) 비-반응성 단백질로 차단되어 있는 제2 섹션; 및
(c) 발현 또는 농도가 측정되는 단백질이 결합되어 있는 제3 섹션
을 포함하는 키트.
제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플을 수용하기 위한 1개 이상의 용기를 추가로 포함하는 키트.
제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플로부터 LYVE1, REG1 및/또는 TFF1 단백질을 추출하기 위한 1종 이상의 용매를 추가로 포함하는 키트.
제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 바이오마커의 발현량 또는 농도를 검출하기 위한 수단이 마이크로어레이인 키트.