CN117355748A - 结直肠癌的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在受试者中鉴定与晚期结直肠瘤变(ACN)，例如结直肠癌(CRC)的较高风险相关的生物标志物。对生物样品中的这些生物标志物的检测和测量可以用于告知临床医生是否需要另外的侵入性手术，包含结肠镜检查或乙状结肠镜检查，以提供所述受试者的结直肠癌的明确诊断。

Description

结直肠癌的生物标志物
本申请要求于2021年4月20日提交的AU2021901164的优先权，所述申请的全部内容通过引用并入本文。
本文引用或参考的所有文件，以及本文引用的文件连同本文提及的任何产品的任何制造商说明书、说明、产品规范和产品表或通过引用并入本文的任何文件中引用或参考的所有文件都特此通过全文引用的方式并入本文。
序列表的引用
以电子形式提交的序列表的全部内容出于所有目的通过引用以其整体并入。
技术领域
本发明涉及在受试者中与晚期结直肠肿瘤(ACN)，例如结直肠癌(CRC)的较高风险相关的鉴定的生物标志物。生物样品中这些生物标志物的检测和测量结果可以用于告知临床医生是否需要进一步的侵入性手术，包含结肠镜检查或乙状结肠镜检查，以提供受试者结直肠癌的明确诊断。
背景技术
结直肠癌(CRC)，也被称为结肠癌或肠癌，是全球男性癌症的第三大常见病因，也是女性癌症的第二大常见病因。2018年，CRC新增病例超过180万例，其中澳大利亚的年龄标准化率约为每100,000人中37人患病，居世界第十一位。不幸的是，30％至50％的患者在出现时有隐性或显性转移，并且一旦肿瘤发生转移，预后非常差，五年存活率低于10％(Etzioni等人,(2003)《癌症自然评论(Nat Rev Cancer)》3:243-252)。相比之下，在肿瘤仍处于局部状态时，超过90％的患者在5年后仍能存活，并且可以认为已经治愈。因此，结直肠病变的早期检测将显著降低结肠癌的影响。
目前广泛用于诊断结直肠癌的筛查测定是粪便潜血测试(FOBT)、柔性乙状结肠镜检查和结肠镜检查(Lieberman(2010)《胃肠病学(Gastroenterology)》138:2115-2126)。虽然FOBT对结直肠癌的特异性相当高(92％至95％)，但在结肠镜检查中发现患有结直肠癌的FOBT阳性受试者比例较低(约3％至4％)。因此，所有阳性FOBT都必须进行结肠镜检查。采样由个体在家中进行，并且需要至少分析两个连续的粪便样品以达到最佳灵敏度。一些版本的FOBT也要求在采样前限制饮食。FOBT对早期癌性病变也缺乏灵敏度，因为这些病变不像更晚期的癌症那样频繁地在肠道内流血，但治疗最成功的是这些早期病变。
虽然FOBT筛查确实降低了结直肠癌的死亡率，但其依从率较低(30％至40％)，部分原因是测试的不愉快性质限制了其作为筛查工具的实用性。结肠镜检查是目前的金标准，并且具有大于90％的特异性，但其侵入性强且成本高，并发症风险小但有限(每1000次手术2.1次)(Levin,(2004)《胃肠病学》127:1841-1844)。开发一种快速、特异性、廉价的基于血液的测定将克服其它筛查测试中常见的依从性问题，并捕获更多具有CRC风险的受试者。
发明内容
本公开基于与受试者中结直肠癌的较高风险相关的基于血液的生物标志物的鉴定。诸位发明人还鉴定了对男性和女性具有性别特异性的生物标志物组合。本发明涉及生物标志物的特异性组合以及用于诊断和检测结直肠癌的方法，并且涉及用于鉴定具有结直肠癌风险的受试者的方法。
因此，在第一方面，本公开提供了用于诊断结直肠癌和/或鉴定疑似患有或具有患有结直肠癌的较大风险的受试者的方法，所述方法包括：
确定从所述受试者获得的生物样品中的一组生物标志物的测量结果，所述组至少包括脑源性神经营养因子(BDNF)和肿瘤M2-PK；
其中所述测量结果包括测量所述组中的所述生物标志物中的每种生物标志物的水平。
在根据第一方面的一个实例中，确定测量结果包括通过使所述样品与可检测结合剂接触来检测生物样品中的至少BDNF和M2PK(以及一种或多种其它生物标志物)，所述可检测结合剂与所述生物标志物特异性结合。在另外的实例中，所述方法包括使用检测测定检测特异性结合剂与所述生物标志物之间的特异性结合。在一个实例中，所述检测测定是ELISA测定。在另外的实例中，确定测量结果包括测量所述生物样品中的生物标志物的浓度。在另外的实例中，确定测量结果包括执行统计分析。在另一个实例中，所述方法包括将所述生物标志物浓度输入本文所述的算法中。
在根据本文任何方面的一个实例中，所述方法进一步包括确定一种或多种另外的生物标志物的测量结果，所述一种或多种另外的生物标志物选自由以下组成的组：DKK3、TGFβ1、IGFBP2、TIMP1、IL6、IL8、TNFα、IGFII、脂质运载蛋白、M30、M65、Mac2BP、MMP1、MMP7、MIP1B和IL13。在另一个实例中，所述一种或多种另外的生物标志物选自由以下组成的组：DKK3、TGFβ1、IGFBP2、TNFα、TIMP1、IL8、MIP1B和Mac2BP。
在根据第一方面的一个实例中，所述方法包括确定一组至少三种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK。
在另外的实例中，所述至少三种生物标志物包括BDNF和M2PK以及另外的选自由以下组成的组的生物标志物：DKK-3、TNFα、IL-8、MAC2BP和IGFBP2。
在根据第一方面的一个实例中，所述三个生物标志物组包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、DKK-3；ii)BDNF、M2PK、TNFα；iii)BDNF、M2PK、IL-8；iv)BDNF、M2PK、MAC2BP；或v)BDNF、M2PK、IGFBP2。
在根据第一方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少四种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK。在另外的实例中，所述至少四种生物标志物包括BDNF、M2PK以及两种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII和IL-8。
在另外的实例中，所述至少四种生物标志物包括BDNF、M2PK以及两种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、IGFBP2、TIMP1和IL-8。.在另外的实例中，所述至少四种生物标志物包括BDNF、M2PK以及两种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、IGFBP2和TIMP1。在根据第一方面的一个实例中，所述四种生物标志物包括DKK3、M2PK、IGFPB2和BDNF。
在根据第一方面的另一个实例中，所述四种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、IL8、TNFα；ii)BDNF、M2PK、IL8、MIP1B；iii)BDNF、M2PK、IL8、DKK3；iv)BDNF、M2PK、MMP1、DKK3；v)BDNF、M2PK、IL8、IGFBP2；vi)BDNF、M2PK、IL8、TIMP1；vii)BDNF、M2PK、MMP7、TNFα；viii)BDNF、M2PK、IL8、MMP1；ix)BDNF、M2PK、IGFBP2、TNFα；或x)BDNF、M2PK、IL8、IGFII。
在根据第一方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少四种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、IL-8和以及自由以下组成的组的另外的生物标志物：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1和IGFII。
在根据第一方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少五种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK，以及三种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、TGFβ1、脂质运载蛋白、IGFBP2、MAC2BP、MIP1β、MMP7和IL-8。
在一个实例中，所述五个生物标志物组包括以下或由以下组成：
i)BDNF；M2PK；IL8；TNFΑ；MIP1β；ii)BDNF；M2PK；IL8；脂质运载蛋白；DKK3；iii)BDNF；M2PK；IL8；TGFβ1；DKK3；iv)BDNF；M2PK；IL8；TNFΑ；TGFβ1；v)BDNF；M2PK；IGFBP2；TNFΑ；DKK3；vi)BDNF；M2PK；IL8；MMP7；DKK3；vii)BDNF；M2PK；IL8；TNFΑ；DKK3；viii)BDNF；M2PK；IL8；IGFBP2；MIP1β；ix)BDNF；M2PK；IL8；MAC2BP；DKK3；或x)BDNF；M2PK；IL8；TNFΑ；MAC2BP。
在根据第一方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少五种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK，以及三种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：TIMP1、DKK3、TNFα、TGFβ1、脂质运载蛋白、IGFBP2、MAC2BP、MIP1β、MMP7和IL-8。在一个实例中，所述组至少包括BDNF和M2PK以及三种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：TIMP1、DKK3、IGFBP2、MAC2BP、IL13和IL-8。
在一个实例中，所述五个生物标志物组包括PKM2(也称为M2PK)、BDNF、DKK3、IGFBP2和TIMP1。
在一个实例中，所述五个生物标志物组包括DKK3、M2PK、Mac2BP、IGFBP2和BDNF。
在根据第一方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少六种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK，以及四种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、IGFBP2、MIP1β、TGFβ1、MMP1、MAC2BP、IGFII、脂质运载蛋白、IL6、M30和IL-8。
在根据第一方面的一个实例中，所述六个生物标志物组包括以下或由以下组成：
i)BDNF；M2PK；MIP1β；DKK3；IGFBP2；TNFα；ii)BDNF；M2PK；MIP1β；DKK3；IGFBP2；MMP1；iii)BDNF；M2PK；MAC2BP；DKK3；IGFBP2；TNFα；iv)BDNF；M2PK；脂质运载蛋白；DKK3；IGFBP2；TNFα；v)BDNF；M2PK；IL6；DKK3；IGFBP2；TNFα；vi)BDNF；M2PK；IL8；DKK3；脂质运载蛋白；TGFβ1；vii)BDNF；M2PK；IL8；MIP1B；TGFβ1；TNFα；viii)BDNF；M2PK；IL8；MIP1B；IGFII；TNFα；ix)BDNF；M2PK；IL8；M30；TGFβ1；TNFα；或x)BDNF；M2PK；IL8；DKK3；IGFII；TNFα。
在根据第一方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少七种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK，以及五种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、DKK3、MIP1β、IL8、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、M65、TIMP1和TGFβ1。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少七种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK和TNFα，以及四种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、MIP1β、IL8、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、M65、TIMP1和TGFβ1。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少七种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、TNFα和DKK3，以及三种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：MIP1β、IL8、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、M65、TIMP1和TGFβ1。
在根据第一方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少八种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK，以及六种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、MIP1β、IL8、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、M65、TIMP1、TGFβ1和IL13。在一个实例中，所述组包括BDNF、M2PK和DKK3以及五种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、MIP1β、IL8、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、M65、TIMP1、TGFβ1和IL13。在一个实例中，所述组包括BDNF、M2PK、DKK3和IGFBP2以及四种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、MIP1β、IL8、MMP1、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、M65、TIMP1、TGFβ1和IL13。
在根据第一方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少四种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、DKK3和M2PK，以及一种或多种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、MIP1β、IL8、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、M65、TIMP1、TGFβ1和IL13。
在根据第一方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少五种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括DKK3、IGFBP2、BDNF和M2PK，以及一种或多种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、MIP1β、IL8、MMP1、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、M65、TIMP1、TGFβ1和IL13。
在根据第一方面的另一个实例中，所述方法包括确定表7、8、9、10、11、12、13、14或15中呈现的一组生物标志物的测量结果。
在一些实例中，本公开的方法还设想将所述受试者的年龄和/或性别作为生物标志物纳入本文所述的生物标志物组中。
在一些实例中，本公开的方法还设想将所述受试者的年龄作为生物标志物纳入本文所述的生物标志物组中。在一个实例中，受试者的年龄是以年为单位的年龄。在根据第一方面的另一个实例中，所述方法包括确定表16、17、18、19、20、21、22、23或24中呈现的一组生物标志物的测量结果。
在一些实例中，本公开的方法还设想将所述受试者的性别作为生物标志物纳入本文所述的生物标志物组中。通过将样品从男性和女性中分离出来并分别进行分析，可以将性别作为因素纳入所述方法中。可替代地，可以通过为女性赋任意值，并且为男性赋不同的任意值，将性别作为因素纳入逻辑回归算法中。在一个实例中，可以通过为男性和女性赋任意值(例如，女性为1.1，并且男性为1.0)将所述受试者的性别作为因素纳入逻辑回归算法中。
本发明人还确定了与男性和女性特别相关的生物标志物组。
在第二方面，本公开提供了用于诊断结直肠癌和/或鉴定疑似患有或具有患有结直肠癌的较大风险的受试者的方法，其中所述受试者为女性，所述方法包括：
确定从所述受试者获得的生物样品中的一组生物标志物的测量结果，所述组至少包括脑源性神经营养因子(BDNF)和肿瘤M2-PK，
其中所述测量结果包括测量所述组中的所述生物标志物中的每种生物标志物的水平。
在根据第二方面的一个实例中，所述方法包括确定一组至少三种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK以及另外的选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6，优选地选自由以下组成的组：MIP1β、MMP1、脂质运载蛋白、IL13、IL8、MAC2BP和IL6。
在根据第二方面的另一个实例中，所述三个生物标志物组包括以下或由以下组成：
(i)BDNF；M2PK；IL8；ii)BDNF；M2PK；MAC2BP；iii)BDNF；M2PK；MMP1；iv).BDNF；M2PK；脂质运载蛋白；v)BDNF；M2PK；IL13；vi)BDNF；M2PK；MIP1β；或vii)BDNF；M2PK；IL6。
在根据第二方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少四种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK以及两种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6，优选地选自由以下组成的组：TNFα、MIP1β、MMP1、IGFII、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6。
在根据第二方面的另一个实例中，所述四个生物标志物组包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、IL8、MMP1；ii)BDNF、M2PK、IL8、脂质运载蛋白；iii)BDNF、M2PK、IL8、IL6；iv)BDNF、M2PK、IL8、MIP1β；v)BDNF、M2PK、IL8、MAC2BP；vi)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ；vii)BDNF、M2PK、IL8、IL13；viii)BDNF、M2PK、IL8、IGFII；ix)BDNF、M2PK、IL8、TNFα；或x).BDNF、M2PK、TGFβ1、MMP1。
在根据第二方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少五种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK以及三种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6，优选地选自由以下组成的组：TNFα、MIP1β、MMP1、IGFII、IL8、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6。
在根据第二方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少五种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK和IL-8以及两种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6，优选地选自由以下组成的组：TNFα、MIP1β、MMP1、IGFII、脂质运载蛋白、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6。
在根据第二方面的另一个实例中，所述五个生物标志物组包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、TNFα；ii)BDNF、M2PK、IL8、TNFα、MMP1；iii).BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、MMP1；iv)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、MAC2BP；v)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ；vi)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、IL13；vii)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、IGFII；viii)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、MIP1β；ix)BDNF、M2PK、IL8、MMP1、MIP1β；或x)BDNF、M2PK、IL8、MAC2BP、MIP1β。
在根据第二方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少六种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK以及四种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6，优选地选自由以下组成的组：DKK3、TNFα、MIP1β、MMP1、M65、M30、IL8、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6。
在根据第二方面的另一个实例中，所述六个生物标志物组包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、IL8、IL13、M65、M30；ii)BDNF、M2PK、IL8、MMP1、TGFβ1、TNFα；iii)BDNF、M2PK、IL8、MAC2BP、TGFβ1、TNFα；iv)BDNF、M2PK、IL8、IL6、TGFβ1、TNFα；v)BDNF、M2PK、IL8、MMP1、MAC2BP、TNFα；vi)BDNF、M2PK、IL8、MMP1、TGFβ1、MAC2BP；vii)BDNF、M2PK、IL8、MMP1、TGFβ1、DKK3；viii)BDNF、M2PK、IL8、IL6、TGFβ1、MAC2BP；ix).BDNF、M2PK、IL8、MMP1、DKK3、MAC2BP；或x)BDNF、M2PK、IL8、IL13、TGFβ1、MIP1β。
在根据第二方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少七种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK，以及五种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：IL8、M65、MMP1、IL13、IGFBP2、TNFΑ、MIP1Β、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、TGFβ1和M30。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少七种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK和IL8，以及四种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：M65、MMP1、IL13、IGFBP2、TNFΑ、MIP1Β、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、TGFβ1和M30。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少七种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、M65和IL8，以及三种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：MMP1、IL13、IGFBP2、TNFΑ、MIP1Β、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、TGFβ1和M30。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少七种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、M65、MMP1和IL8，以及两种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：IL13、IGFBP2、TNFΑ、MIP1Β、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、TGFβ1和M30。
在根据第二方面的一个实例中，所述方法包括确定表28中呈现的一组生物标志物的测量结果。
在根据第二方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少八种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK，以及六种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：IL8、M65、MMP1、TNFΑ、MIP1Β、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、TIMP1、TGFβ1、M30和DKK3。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少八种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK和IL8，以及五种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：M65、MMP1、TNFΑ、MIP1Β、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、TIMP1、TGFβ1、M30和DKK3。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少八种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、IL8和M65，以及四种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：MMP1、TNFΑ、MIP1Β、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、TIMP1、TGFβ1、M30和DKK3。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少八种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、IL8、M65和MMP1，以及三种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFΑ、MIP1Β、脂质运载蛋白、MAC2BP、IL6、MMP7、IGFII、TIMP1、TGFβ1、M30和DKK3。
在根据第二方面的一个实例中，所述方法包括确定表27、26或25中呈现的一组生物标志物的测量结果。
在根据第二方面的另一个实例中，所述方法进一步包括所述受试者年龄作为另外的生物标志物。在一个实例中，所述方法包括确定表34、35、36、37、38、39、40、41或42中呈现的一组生物标志物的测量结果。
在第三方面，本公开提供了用于诊断结直肠癌和/或鉴定疑似患有或具有患有结直肠癌的较大风险的受试者的方法，其中所述受试者为男性，所述方法包括：
确定从所述受试者获得的生物样品中的一组生物标志物的测量结果，所述组至少包括脑源性神经营养因子(BDNF)和肿瘤M2-PK，
其中所述测量结果包括测量所述组中的所述生物标志物中的每种生物标志物的水平。
在根据第三方面的一个实例中，所述方法包括确定一组至少三种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK以及另外的选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFΑ、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1，优选地选自由以下组成的组：TNFΑ、IGFBP2、TIMP1、MMP7、IGFII、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1。
在根据第三方面的另一个实例中，所述三个生物标志物组包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、TNFα；ii)BDNF、M2PK、TIMP1；iii)BDNF、M2PK、IL8；iv)BDNF、M2PK、TGFβ；v)BDNF、M2PK、MMP7；vi)BDNF、M2PK、IL13；vii)BDNF、M2PK、IGFII；viii)BDNF、M2PK、IGFBP2；ix)BDNF、M2PK、MAC2BP；或x)BDNF、M2PK、脂质运载蛋白。
在根据第三方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少四种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK以及两种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1，优选地选自由以下组成的组：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1B、MMP7、M65和IL8。
在根据第三方面的另一个实例中，所述四个生物标志物组包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、DKK3、TIMP1；ii)BDNF、M2PK、IL8、TNFα；iii)BDNF、M2PK、IGFBP2、TNFα；iv)BDNF、M2PK、IL8、IGFBP2；v)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα；vi)BDNF、M2PK、IL8、MMP7；vii)BDNF、M2PK、DKK3、M65；viii)BDNF、M2PK、DKK3、IL8；ix)BDNF、M2PK、DKK3、IGFBP2；或x)BDNF、M2PK、MIP1β、TIMP1。
在根据第三方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少五种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF和M2PK以及三种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1，优选地选自由以下组成的组：DKK3、TNFΑ、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、IGFII、M65、脂质运载蛋白、IL8和MAC2BP。
在根据第三方面的另一个实例中，所述五种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF；M2PK；DKK3；IGFBP2；TNFα；ii)BDNF；M2PK；DKK3；脂质运载蛋白；TIMP1；iii)BDNF；M2PK；DKK3；M65；TNFα；iv)BDNF；M2PK；DKK3；IGFBP2；TIMP1；v)BDNF；M2PK；DKK3；IL8；IGFII；vi)BDNF；M2PK；IL13；IL8；TNFα；vii)BDNF；M2PK；DKK3；MAC2BP；TIMP1；viii)BDNF；M2PK；DKK3；M65；TIMP1；ix)BDNF；M2PK；DKK3；MIP1B；TNFα；或x)BDNF；M2PK；DKK3；MIP1B；TIMP1。
在根据第三方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少五种生物标志物的测量结果，其中所述五种生物标志物包括BDNF、M2PK、DKK-3以及两种选自以下的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP或TGFβ1，优选地选自以下：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、IGFII、M65、脂质运载蛋白、IL8或MAC2BP。
在根据第三方面的一个实例中，所述五种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF；M2PK；DKK3；IGFBP2；TNFα；ii)BDNF；M2PK；DKK3；脂质运载蛋白；TIMP1；iii)BDNF；M2PK；DKK3；M65；TNFα；iv)BDNF；M2PK；DKK3；IGFBP2；TIMP1；v)BDNF；M2PK；DKK3；IL8；IGFII；vi)BDNF；M2PK；DKK3；MAC2BP；TIMP1；vii)BDNF；M2PK；DKK3；M65；TIMP1；viii).BDNF；M2PK；DKK3；MIP1β；TNFα；或ix)BDNF；M2PK；DKK3；MIP1β；TIMP1。
在根据第三方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少六种生物标志物的测量结果，其中所述六种生物标志物包括BDNF和M2PK以及四种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1，优选地选自由以下组成的组：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8和IL13。
在根据第三方面的另一个实例中，所述生物标志物包括BDNF、M2PK、DKK3、TNFα以及两种选自由以下组成的组的生物标志物：IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1，优选地选自由以下组成的组：IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8和IL13。
在根据第三方面的一个实例中，所述六种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、TIMP1、IL8；ii)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、MMP1；iii)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、M30；iv)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、MIP1B、M65；v)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、MMP7；vi)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、M65；vii)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、脂质运载蛋白；viii)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFII、IL8；ix)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、M65、M30；或x)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、IL13。
在根据第三方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少七种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK，以及五种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、MIP1β、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、TIMP1、M30、IGII、IL8、MMP7和M65。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少七种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、DKK3，以及四种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、MIP1β、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、TIMP1、M30、IGII、IL8、MMP7和M65。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少七种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、DKK3、TNFα，以及三种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：MIP1β、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、TIMP1、M30、IGII、IL8、MMP7和M65。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少七种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2，以及两种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：MIP1β、MMP1、脂质运载蛋白、TIMP1、M30、IGII、IL8、MMP7和M65。
在根据第三方面的另一个实例中，所述方法包括确定表46中呈现的一组生物标志物的测量结果。
在根据第三方面的另一个实例中，所述方法包括确定一组至少八种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK，以及六种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、MIP1β、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、TIMP1、TGFβ1、M30、IL13、IGII、IL8、MMP7和IL13。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少八种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、DKK3，以及五种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、MIP1β、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、TIMP1、TGFβ1、M30、IL13、IGII、IL8、MMP7和IL13。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少八种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、DKK3、TNFα，以及四种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：MIP1β、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、TIMP1、TGFβ1、M30、IL13、IGII、IL8、MMP7和IL13。在一个实例中，所述方法包括确定一组至少八种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、MMP7，以及三种或更多种选自由以下组成的组的生物标志物：MIP1β、MMP1、IGFBP2、脂质运载蛋白、TIMP1、TGFβ1、M30、IL13、IGII、IL8和IL13。
在根据第三方面的另一个实例中，所述方法包括确定表45中呈现的一组生物标志物的测量结果。
在根据第三方面的另一个实例中，所述方法包括确定至少九种或至少十种生物标志物的测量结果，其中所述生物标志物至少包括BDNF和M2PK。在一个实例中，所述方法包括确定表44或43中呈现的一组生物标志物的测量结果。
在另外的实例中，所述生物标志物包括PKM2(也称为M2PK)、BDNF、DKK3、IGFBP2和TIMP1。
在根据第三方面的另一个实例中，所述方法进一步包括所述受试者年龄作为另外的生物标志物。在一个实例中，所述方法包括确定表52、53、54、55、56、57、58、59或60中呈现的一组生物标志物的测量结果。
在另外的实例中，本文所述的方法可以使用表7至15、表16至24、表25至33、表34至42、表43至51、表52至60或表61至66中提供的一种或多种或全部生物标志物组合。
在第四方面，提供了表7至15、表16至24、表25至33、表34至42、表43至51、表52至60或表61至66中任一项中所示的生物标志物组合。
应当理解，本公开涵盖本文未具体描述的另外已知的结直肠癌生物标志物。这些另外的生物标志物的实例包含以下中的一种或多种：IGF-I、双调蛋白、VEGFA、VEGFD、MMP2、MMP3、MMP9、TIMP2、ENA-78、MCP-1、IFN-γ、IL10、IL-1β、IL4、OPN、CEACAM6、VEGFα和VEGFpan。
应当理解，除了年龄和/或性别之外，本公开涵盖本文未具体描述的另外的人口统计学或形态测量学术语。这些其它人口统计学或形态测量学术语的实例包含但不限于吸烟史、身体质量指数(BMI)和臀腰比。
在根据本文所述的任何方面的一个实例中，确定测量结果包括测量生物样品中的生物标志物的浓度。在根据任何方面的一个实例中，确定测量结果包括通过使所述样品与可检测结合剂接触来检测生物样品中的生物标志物，所述可检测结合剂与所述生物标志物特异性结合。在根据任何方面的另外的实例中，所述方法包括使用检测测定检测特异性结合剂与所述生物标志物之间的特异性结合。在根据任何方面的另外的实例中，确定测量结果包括执行统计分析。
在根据本文所述的任何方面的一个实例中，所述方法包括捕获抗体。在一个实例中，所述捕获抗体被固定，例如在板上。在一个实例中，所述板是ELISA板。在根据任何方面的一个实例中，所述方法包括用于检测所述生物标志物与所述捕获抗体的结合的标记的抗体。
在根据任何方面的一个实例中，生物标志物组中的至少一种生物标志物的水平相对于参考组中的相同生物标志物水平增加或减少。更具体地，生物标志物的测量结果相对于通过在病例和对照样品上训练的算法在CRC和/或对照样品的已知病例中确定的该生物标志物的参考浓度。
在根据任何方面的一个实例中，本公开的方法包括：
(i)对本文所述的生物标志物组中的每种生物标志物的浓度进行测量，以导出统计值；
(ii)将步骤(i)中获得的值与从对应生物标志物参考组中的相同生物标志物的浓度获得的统计值进行比较；以及
(iii)将步骤(ii)中获得的值进行关联，以导出对受试者的结直肠癌风险具有决定性的值。
在一些实例中，所述生物标志物是蛋白质生物标志物。在一个实例中，所述生物标志物是多核苷酸生物标志物。
在一些实例中，本公开的方法包括使生物样品与与生物标志物蛋白特异性结合的抗体接触。优选地，存在至少一种抗体，所述抗体与在生物样品中寻求检测的每种生物标志物单独结合。优选地，所述抗体与给定生物标志物特异性结合。在一些实例中，多于一种抗体可以与单个生物标志物结合，例如以“夹心”形式。
在一些实例中，所述测量形式是免疫测定。在另一个实例中，所述免疫测定是ELISA，通常会有结合到ELISA板表面的捕获抗体和检测生物标志物与捕获抗体结合的检测抗体。在一个实例中，所述抗体可以被可检测地标记。在一个实例中，捕获抗体可以是与检测抗体相同的抗体或不同的抗体。标记抗体的方法在本领域中是已知的。
在一些实例中，如果生物标志物是多核苷酸，则分析方法可以包括测量与个体生物标志物相对应的基因转录物。此类方法是本领域技术人员熟悉的。
执行模型构建和统计分析的方法将是本领域技术人员已知的。在一些实例中，执行线性或非线性回归。所述方法还可以利用贝氏概率算法。
在一些实例中，生物标志物组的分析可以用于确定受试者的治疗方案。例如，从生物标志物的测量结果中获得的统计值可以用于通知通过结肠镜检查或乙状结肠镜检查进行进一步治疗，以提供对结直肠癌的明确诊断。
在第五方面，提供了一种治疗疑似患有结直肠癌的受试者的方法，所述方法包括：
(i)根据本文所述的方法，确定从所述受试者获得的生物样品中的一组生物标志物的测量结果；以及
(ii)通过结肠镜检查或乙状结肠镜检查来治疗所述受试者。
在根据任何方面的另一个实例中，所述方法进一步描述了从受试者获得生物样品。在另外的实例中，所述生物样品为血液样品。在另一个实例中，所述样品为血清或血浆样品。获得生物样品的方法是本领域技术人员已知的。例如，对于血液样品的提取，优选进行静脉抽取。
在第六方面，提供了一种组合物，所述组合物包括与本文所述的生物标志物组中的生物标志物特异性结合的标记的抗体。
在第七方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)与本文所述的生物标志物组中的生物标志物结合的标记的抗体；以及
(ii)用于对所述生物标志物组中的所述生物标志物进行检测的说明书。
在一些实例中，所述试剂盒还包括表面，其上固定有捕获抗体，所述捕获抗体与生物标志物组中的每种生物标志物结合。在一些实例中，所述试剂盒还包括ELISA板，其上固定有捕获抗体，所述捕获抗体与生物标志物组中的每种生物标志物结合。在一些实例中，所述试剂盒还包括珠粒(例如微珠或磁性珠粒)，其上固定有捕获抗体，所述捕获抗体与生物标志物组中的每种生物标志物结合。在一些实例中，所述试剂盒还提供了用于通过计算机生成的算法分析检测到的生物标志物的说明书。在另外的实例中，生成临床报告。
在第八方面，提供了如本文所述的试剂盒以及软件包，所述软件包包括用于基于本文所述的生物标志物组中的生物标志物的测量结果来生成统计值的算法。
在第九方面，提供了一种用于确定疑似患有结直肠癌或具有结直肠癌的较大风险的受试者的系统，包括：
(i)在从受试者获得的生物样品中确定如本文所述的生物标志物组的测量结果，其中所述测量结果是所述组中每种生物标志物的浓度；
(ii)将所述组中的每种生物标志物的浓度输入到包括输入装置的计算机中，所述输入装置可操作地连接到所述计算机以接收所述组中的每种生物标志物的浓度；
(iii)连接到所述计算机以向用户提供信息的输出设备；以及
(iv)由所述计算机执行的算法，其中所述算法是基于由所述输入装置接收的所述数据来执行的，并且其中所述算法计算风险评分。
附图说明
图1-1和1-2(A)示出了每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的前100个十种生物标志物组合中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度范围为85.6％至82.2％。(B)示出了每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的前100个九种生物标志物组合中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度范围为84.7％至81.7％。(C)每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的前100个八种生物标志物组合中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度范围为84.2％至80.6％。(D)每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的前100个七种生物标志物组合中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度范围为83.2％至79.2％。(E)每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的前100个六种生物标志物组合中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度范围为80.4％至77.0％。(F)每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的74个五种生物标志物组合中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度>75％(范围为80.5％至75.0％)。
图2-1和2-2(A)示出了每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的前100个十种生物标志物组合(加上年龄)中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度范围为86.8％至83.5％。(B)示出了每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的前100个九种生物标志物组合(加上年龄)中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度范围为87.0％至82.9％。(C)每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的前100个八种生物标志物组合(加上年龄)中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度范围为85.1％至81.7％。(D)每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的前100个七种生物标志物组合(加上年龄)中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度范围为84.2％至79.9％。(E)每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的前100个六种生物标志物组合(加上年龄)中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度范围为83.2％至77.5％。(F)每种生物标志物出现在区分癌症患者血清和健康对照者血清的73个五种生物标志物组合(加上年龄)中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度>75％(范围为80.0％至75.0％)％。
图3-1和3-2(A)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个十种生物标志物组合中的频率。(B)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个九种生物标志物组合中的频率。(C)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个八种生物标志物组合中的频率。(D)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个七种生物标志物组合中的频率。(E)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个六种生物标志物组合中的频率。(F)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个五种生物标志物组合中的频率。
图4-1和4-2(A)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个十种生物标志物组合(加上年龄)中的频率。(B)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个九种生物标志物组合(加上年龄)中的频率。(C)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个八种生物标志物组合(加上年龄)中的频率。(D)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个七种生物标志物组合(加上年龄)中的频率。(E)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个六种生物标志物组合(加上年龄)中的频率。(F)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个五种生物标志物组合中的频率。
图5-1和5-2(A)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分男性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个十种生物标志物组合中的频率。(B)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分男性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个九种生物标志物组合中的频率。(C)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分男性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个八种生物标志物组合中的频率。(D)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分男性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个七种生物标志物组合中的频率。(E)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分男性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个六种生物标志物组合中的频率。(F)每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前五种生物标志物组合中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度>75％。
图6-1和6-2(A)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分男性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个十种生物标志物组合(加上年龄)中的频率。(B)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分男性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个九种生物标志物组合(加上年龄)中的频率。(C)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分男性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个八种生物标志物组合(加上年龄)中的频率。(D)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分男性癌症患者血清和健康对照者血清的前100七种生物标志物组合(加上年龄)中的频率。(E)在95％特异性下，每种生物标志物出现在区分男性癌症患者血清和健康对照者血清的前100个六种生物标志物组合(加上年龄)中的频率。(F)每种生物标志物出现在区分女性癌症患者血清和健康对照者血清的前五种生物标志物组合(加上年龄)中的频率，其中在95％特异性下，灵敏度>75％。
图7示出了研究9的训练和测试结构。该图表示训练测试组合的一个实例(即队列2也用于训练算法，并且队列1用于测试)。
具体实施方式
一般技术和定义
除非另外特别说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学)的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
除非另有说明，否则本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员众所周知的标准程序。此类技术在以下来源的文献中进行了描述和解释：如J.Perbal,《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》,约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons)(1984)；J.Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》,第3版,冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbour Laboratory Press)(2001)；R.Scopes,《蛋白质纯化——原理与实践(ProteinPurification–Principals and Practice)》,第3版,施普林格出版社(Springer)(1994)；T.A.Brown(编辑),《基本分子生物学：实用方法(Essential Molecular Biology:APractical Approach)》,第1卷和第2卷,IRL出版社(IRL Press)(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach)》,第1-4卷,IRL出版社(1995和1996)；以及F.M.Ausubel等人,(编辑),《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,格林出版协会(Greene Pub.Associates)和威利国际科学出版公司(Wiley-Interscience)(1988，包含迄今为止的所有更新)；EdHarlow和David Lane(编辑)《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室,(1988)；以及J.E.Coligan等人(编辑),《当代免疫学指南(Current Protocolsin Immunology)》,约翰威利父子出版公司(包含迄今为止的所有更新)。
本文所用的“结直肠癌(CRC)”是指始于结肠或直肠的癌症。这些癌症也可以单独称为结肠癌或直肠癌，取决于其起始位置。结肠癌和直肠癌有许多共同特征。95％以上的结直肠癌是被称为腺癌的癌症。这些癌症始于源自腺体的细胞，这些细胞产生粘液来润滑结肠和直肠内部。在大多数情况下，这些细胞首先形成称为腺瘤的结直肠上皮的良性生长，并且超过90％的结直肠癌首先出现在这些良性腺瘤内的高度发育不良组织的小病灶中。其它不太常见的肿瘤也可能始于结肠和直肠。这些包含：类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、淋巴瘤和肉瘤。在优选实例中，所述结直肠癌是腺癌。腺癌的分期有助于指导临床管理。结直肠癌最常用的分期系统是美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM系统(https://www.cancer.org/cancer/colon-rectal-cancer/detection-diagnosis-staging/staged.html)，其基于3条关键信息：
·T-肿瘤大小(水平：0至4)：
ο癌症在结肠或直肠壁中生长了多远：其是否仍然局限于结肠上皮？其是否已经穿透了上皮正下方的薄肌肉层？其是否已经穿透了该薄肌肉层下面的纤维组织？其是否已经穿透了下面较厚的肌肉层？其是否穿透了主要肌肉层下方的结缔组织层？
·N–淋巴结累及水平(水平：0至2)：癌症是否已经扩散到附近的淋巴结？如果是，有多少？
·M–转移扩散水平(水平：0至1)：癌症是否已经扩散到远处的淋巴结或如肝脏或肺等远处器官？
如本文所使用的，术语“生物标志物”是指可以作为生物系统生理状态的指示物进行测量的任何生物化合物。在一些实例中，生物标志物是多核苷酸或核酸。在一些实例中，生物标志物是多肽或蛋白质。生物标志物也可以是本文进一步描述的受试者的年龄、性别和/或BMI。
如本文所使用的，术语“测量结果”是指评估样品中给定物质的存在、不存在、数量或量，包含此类物质的定性或定量浓度水平的推导。术语“测量”是指包含检测样品中存在、不存在生物标志物、量化样品中生物标志物的量和/或鉴定生物标志物类型的方法。测量可以通过本领域已知的方法和本文进一步描述的那些方法来完成，包含但不限于质谱法方法和免疫测定法(例如ELISA)，或者可以使用任何合适的方法来检测和测量本文描述的一种或多种标志物。可以在表2中找到生物标志物序列的参考文件，所述表2中提供了UniProt(uniprot.org)和NCBI/基因库登录号(NCBI.nlm.nih.gov/genbank)。
术语“检测”是指鉴定待检测生物标志物的存在、不存在或量。非限制性实例包含但不限于蛋白质、肽或核酸的检测。
术语“报告”是指由本发明的方法提供给医生的打印结果。报告可以指示病理状况的存在、性质或风险。报告还可以指示什么治疗是最合适的，例如不采取行动、外科手术、进一步测试或施用治疗剂。
如本文所使用的，术语“生物样品”是指来自受试者的细胞或细胞群或一定量的组织或液体。大多数情况下，样品是从受试者身上取出的，但术语“生物样品”也可以指在体内分析的细胞或组织，即未从受试者身上取出。优选地，“生物样品”是指血液、唾液或尿液的非细胞级分。生物样品包含但不限于全血、血浆、血清、淋巴或尿液。
如本文所使用的，术语“对照参考”是指用作研究波动或比较非稳态分子或正常非疾病健康状况的相对标志物，或者也可用于校准或归一化值的已知的稳态分子或非疾病、健康状况。在一些实例中，对照参考值是计算值，如生物标志物浓度的组合或浓度范围的组合。
术语“免疫测定”是使用抗体与抗原(例如，标志物)特异性结合的测定。免疫测定的特征在于使用特定抗体的特异性结合特性对抗原进行分离、靶向和/或定量。
术语“抗体”是指特异性结合和识别表位的实质上由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体。抗体例如以完整的免疫球蛋白或以通过用各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段形式存在。这包含，例如，Fab”和F(ab)”2片段。如本文所使用的，术语“抗体”还包含通过修饰整个抗体产生的或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。抗体还包含多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。抗体的“Fc”部分是指包括一个或多个重链恒定区结构域，但不包含重链可变区的免疫球蛋白重链的部分。
如本文所使用的，术语“受试者”是指任何可能发展为结直肠癌的动物，包含：动物，如哺乳动物，例如，人类；或非人哺乳动物，如猫和狗；实验室动物，如小鼠、大鼠、兔或豚鼠；以及家畜动物。在优选实施例中，受试者是人。
如本文所使用的，术语“样品”或“生物样品”是指从受试者获得的处于健康和/或病理状态的生物流体、组织或细胞的样品。优选地，术语“样品”是血液样品，更优选地是血清样品。
综述
本公开提供了用于使用与可由计算机执行的用于确定指示结直肠癌的生物标志物的算法偶联的测定来分析来自受试者的生物样品的方法。通常，所述方法使用存在于受试者的生物样品中的蛋白质来鉴定生物标志物或生物标志物图谱，并且因此鉴定患有结直肠癌或具有结直肠癌的较高风险并且可能需要进一步筛查如结肠镜检查或乙状结肠镜检查的受试者。
本公开还提供了通常将包含用于检测本文提供的生物标志物的组合物的商业诊断试剂盒。
生物标志物
本公开利用从受试者获得的生物样品中测量的一组生物标志物来鉴定患有或疑似患有结直肠癌的受试者。
如本文所使用的，‘生物标志物”是指可以作为生物系统生理状态的指示物进行测量的任何生物化合物。在一些实例中，所述生物标志物是蛋白质生物标志物。在其它实例中，所述生物标志物是核酸生物标志物。
目前的研究已经证明了脑源性神经营养因子(BDNF)作为一种信息生物标志物在鉴定结直肠癌风险增加的受试者中的特殊作用。已经观察到BDNF在包含结直肠癌在内的实体瘤中升高(Yang X等人,(2013)《实验和治疗医学(Exp Ther Med)》6(6):1475-1481)。此外，当该生物标志物与CRC中的已知标志物M2PK组合时，灵敏度的检测与粪便潜血测试(FOBT)相当或更高。根据澳大利亚癌症委员会的数据，在大约93％的特异性下，FOBT对晚期腺瘤的灵敏度在16％至64％的范围之间(参见https://wiki.cancer.org.au/policy/Bowel_cancer/Screening)。
在一些实例中，生物标志物组可以包含选自由以下组成的组的2种、3种、4种、5种、6种或更多种生物标志物：DKK3、M2PK、TGFβ、IGFBP2、TIMP1、BDNF、IL6、IL8、TNFα、IGFII、脂质运载蛋白、M30、M65、Mac2BP、MMP1、MMP7、MIP1β和IL13。
提及这些生物标志物中的任何生物标志物包含提及本领域技术人员已知的所有多肽和多核苷酸变体，如同种型和转录变体。实例的表1中提供了每种生物标志物的代表性序列的NCBI登录号。
应当理解，在一些实例中，人口统计学或形态测量学术语也可以作为因素纳入到分析，例如，逻辑回归算法中。人口统计学或形态测量学术语，包含但不限于年龄、性别、吸烟史、身体质量指数(BMI)和臀腰比。
在一些实例中，本公开的方法还设想将所述受试者的性别作为生物标志物纳入本文所述的生物标志物组中。不希望受理论束缚，可以通过为女性赋任意值，并且为男性赋不同的任意值，将受试者的性别作为因素纳入逻辑回归算法中。如本领域技术人员所理解的，任意值的数值并不重要，然而重要的是为男性和女性赋不同的任意值。在一个实例中，可以通过为女性赋1并且男性为0的任意值将所述受试者的性别作为因素纳入逻辑回归算法中。在一个实例中，可以通过为女性赋1.1并且男性为1的任意值将所述受试者的性别作为因素纳入逻辑回归算法中。
在一些实例中，本公开的方法还设想将所述受试者的年龄作为生物标志物纳入本文所述的生物标志物组中。
样品制备和处理
在分析生物样品之前，可能需要对样品进行一次或多次样品制备操作。通常，这些样品制备操作可以包含如从细胞或组织中提取和分离细胞内物质，如从样品中提取核酸、蛋白质或其它大分子的操作。
可以与本公开的方法一起使用的样品制备包含但不限于离心、亲和色谱法、磁分离、分级、沉淀及其组合。
样品制备可以进一步包含用合适的溶剂和量进行稀释，以确保通过给定的测定检测到合适的浓度水平范围。
从样品的细胞间空间获取核酸和大分子通常可以通过物理方法、化学方法或两者的组合进行。在所述方法的一些应用中，在分离粗提取物之后，通常需要分离核酸、蛋白质、细胞膜颗粒等。在所述方法的一些实例中，希望保留核酸及其蛋白质和细胞膜颗粒。
在本文提供的方法的一些实例中，可以在使用本公开的方法进行分析之前从生物样品中提取核酸和蛋白质。提取可以通过包含但不限于使用洗涤剂裂解物、超声处理或用玻璃珠粒涡旋的方式进行。
在一些实例中，可以使用本领域中合适的任何技术来分离分子，包含但不限于：使用梯度离心的技术(例如，氯化铯梯度、蔗糖梯度、葡萄糖梯度等)、离心方案、煮沸、纯化试剂盒以及使用液体提取和试剂提取方法，如使用Trizol或DNAzol的方法。
根据所需的检测方法，可以根据标准生物样品制备来制备样品。例如，对于质谱法检测，可以对从患者获得的生物样品进行离心、过滤、通过免疫亲和柱处理、分离成级分、部分消化及其组合。可以将各种级分重新悬浮在适当的载体，如缓冲液或用于检测和分析的其它类型的负载溶液，包含LCMS负载缓冲液中。
生物标志物测量
生物标志物组的测量涉及多种生物标志物的定量测量。本公开提供了用于检测生物样品中的生物标志物的方法。生物标志物可以包含但不限于蛋白质、DNA分子和RNA分子。更具体地，本公开基于在具有增加的获得结直肠癌的风险或患有结直肠癌的受试者中差异表达的蛋白质生物标志物的发现。因此，在生物样品中检测这些差异表达的生物标志物中的一种或多种提供了有用的信息，即受试者是否具有结直肠癌的风险或罹患结直肠癌，以及所述病状的性质或状态是什么类型。本领域技术人员已知的任何合适的方法都可以用于检测本文所述的一种或多种生物标志物。
可以用于本公开的有用的分析物捕获剂包含但不限于：抗体，如含有抗体的粗血清、纯化的抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、抗体片段(例如，Fab片段)；抗体相互作用剂，如蛋白质A、碳水化合物结合蛋白和其它相互作用剂；蛋白质相互作用剂(例如抗生物素及其衍生物)；肽；以及小型化学实体，如酶底物、辅因子、金属离子/螯合物和半抗原。抗体可以被修饰或化学处理以优化与靶标或固体表面(例如生物芯片和柱)的结合。
在本公开的一个特定实例中，可以使用免疫测定法在生物样品中检测生物标志物。免疫测定是使用与抗原(例如蛋白质或肽上的位点、生物标志物靶标)特异性结合或识别的抗体的测定。所述方法包含使生物样品与抗体接触并使抗体与样品中的抗原形成复合物、洗涤样品并用检测试剂检测抗体-抗原复合物的步骤。在一个实例中，识别生物标志物的抗体可以是可商购获得的。在另一个实例中，识别生物标志物的抗体可以通过已知的抗体生产方法产生。
可替代地，可以使用间接测定法检测样品中的标志物，其中，例如，使用第二标记的抗体来检测结合的标志物特异性抗体。示例性可检测标记包含磁性珠粒(例如，DYNABEADSTM)、荧光染料、放射性标记、酶(例如，辣根过氧化物、碱性磷酸酶和其它常用的)，以及比色标记如胶体金或有色玻璃或塑料珠。样品中的标志物可以使用和/或在竞争或抑制测定中检测，其中，例如，与标志物的不同表位结合的单克隆抗体与混合物同时温育。
使用免疫测定法检测抗原的条件将取决于所使用的特定抗体。此外，温育时间将取决于测定形式、标志物、溶液体积、浓度等。通常，免疫测定将在室温下进行，尽管其可以在一系列温度下进行，例如10摄氏度至40摄氏度，这取决于所使用的抗体。
本领域已知有各种类型的免疫测定法，作为起始基础，其可以用于定制用于检测本公开的生物标志物的测定法。有用的测定可以包含，例如，酶免疫测定(EIA)，如酶联免疫吸附测定(ELISA)，包含夹心ELISA。这些方法有很多变体，但那些都是基于类似的想法。例如，如果抗原可以与固体支撑物或表面结合，则可以通过使其与特异性抗体反应来检测，并且可以通过将其与次级抗体反应或通过将标志物直接结合到初级抗体中来对抗体进行定量。可替代地，可以将抗体结合到固体表面并添加抗原。然后可以添加并检测识别抗原上不同表位的第二抗体。这通常被称为“夹心测定”，并且可以经常用于避免高背景或非特异性反应的问题。这些类型的测定足够灵敏且可重复足以测量生物样品中的低浓度抗原。
免疫测定可以用于确定样品中标志物的存在或不存在以及样品中标志物的数量。用于测量抗体-标志物复合物的量或存在的方法包含但不限于：荧光、发光、化学发光、吸光度、反射率、透射率、双折射率或折射指数(例如，表面等离子体共振、椭圆光度法、共振镜法、光栅耦合器波导法或干涉测量法)。通常，这些试剂与光学检测方法，如各种形式的显微镜、成像方法和非成像方法一起使用。电化学方法包含伏安法、电流分析法和电化学发光方法。射频方法包含多极共振波谱法。
在一个实例中，本公开可以使用抗体来检测生物标志物。可以制备与本测定的生物标志物特异性结合的抗体，可以使用本领域已知的标准方法制备。例如，多克隆抗体可以通过将抗原注射到哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊或马中以获得大量抗体而产生。从这些动物身上分离出的血液含有多克隆抗体——与同一抗原结合的多种抗体。可替代地，多克隆抗体可以通过将抗原注射到鸡中以在蛋黄中产生多克隆抗体来产生。此外，可以制备特异性识别生物标志物修饰形式的抗体，如生物标志物的磷酸化形式，也就是说，其将在磷酸化后识别酪氨酸或丝氨酸，但在不存在磷酸盐的情况下不会识别。以这种方式，抗体可以用于确定特定生物标志物的磷酸化状态。
抗体可以商业获得或使用公认的方法生产。为了获得对抗原的单个表位具有特异性的抗体，从动物中分离抗体分泌淋巴细胞，并通过将其与癌细胞系融合而永生化。融合的细胞被称为杂交瘤，并且在培养中会不断生长和分泌抗体。通过稀释克隆分离单个杂交瘤细胞以产生全部产生相同抗体的细胞克隆；这些抗体被称为单克隆抗体。
多克隆抗体和单克隆抗体可以通过若干种方式纯化。例如，可以使用抗原亲和色谱法分离抗体，所述抗原亲和色谱法与细菌蛋白如蛋白A、蛋白G、蛋白L或重组融合蛋白A/G偶联，随后通过280nm吸光度的UV光检测洗脱液级分，以确定哪些级分含有抗体。蛋白A/G与人IgG的所有亚类结合，使其可用于纯化亚类尚未确定的多克隆或单克隆IgG抗体。此外，其与IgA、IgE、IgM和(在较小程度上)IgD结合。蛋白A/G也与小鼠IgG的所有亚类结合，但不与小鼠IgA、IgM或血清白蛋白结合。这一特征允许蛋白A/G用于纯化和检测小鼠单克隆IgG抗体，而不受IgA、IgM和血清白蛋白的干扰。
抗体可以衍生自不同类别或同种型的分子，例如，IgA、IgA IgD、IgE、IgM和IgG。在生物学研究中最有用的抗体是IgG类，这是制造和分泌的蛋白质分子，并且可以识别特定抗原。IgG由两个亚基构成，包含两条“重”链和两条“轻”链。这些以对称结构组装，并且每个IgG具有两个相同的抗原识别结构域。抗原识别结构域是来自重链和轻链两者的氨基酸的组合。分子的形状大致像“Y”，并且分子的臂/尖端包括抗原识别区或Fab(片段，抗原结合)区，而Fc(片段，可结晶)区的茎不参与识别，并且相当恒定。恒定区在相同同种型的所有抗体中是相同的，但在不同同种型的抗体中不同。
还可以使用抗体通过蛋白质印迹分级后检测蛋白质。在一个实例中，本公开可以使用蛋白质印迹来检测生物标志物。蛋白质印迹(蛋白质免疫印迹)是用于检测给定样品或样品蛋白质提取物中的特定蛋白质的分析技术。其使用凝胶电泳、SDS-PAGE通过其3维结构分离天然蛋白质，或者可以在变性条件下运行通过其长度分离蛋白质。通过凝胶电泳分离后，然后将蛋白质转移到膜(通常为硝化纤维素或PVDF)上。然后，可以将从SDS-PAGE转移到膜上的蛋白质与特定抗体在温和搅拌下温育，冲洗以去除非特异性结合，并且可以使用一步或两步检测方法检测与印迹结合的蛋白质-抗体复合物。一步方法包含探针抗体，其既识别所关注的蛋白质又含有可检测的标记，探针通常可用于已知的蛋白质标签。两步检测方法涉及具有与其结合的报告基因酶或报告基因的次级抗体。通过适当的参考对照，这种方法可以用于测量蛋白质的丰度。
在一个实例中，本公开的方法可以使用流式细胞术。流式细胞术是可以用于生物标志物检测、定量(细胞计数)和细胞分离的基于激光的生物物理技术。这项技术通常用于诊断健康病症，尤其是血癌。通常，流式细胞术的工作原理是将单个细胞悬浮在流体流中，将单个波长的光束(通常是激光)引导到液体流上，并通过电子检测设备检测由经过的细胞引起的散射光。荧光激活的细胞分选(FACS)是通常使用荧光标记的抗体来检测所关注的细胞上的抗原的特殊类型的流式细胞术。在FACS中使用抗体标记的该另外的特征提供了基于每个细胞荧光标记的细胞的特异性光散射和荧光特性的同时多参数分析和定量，并且其提供了所关注的细胞群的物理分离，如传统流式细胞术一样。
在另一个实例中，流式细胞术与珠系统相结合，其中靶抗原连接在珠上。此类系统是本领域的技术人员已知的。
大量荧光团可以用作流式细胞术中的标记。荧光团通常连接在识别细胞上或细胞内靶特征的抗体上。合适的荧光标记的实例包含但不限于：荧光素(FITC)、5,6-羧甲基荧光素、得克萨斯红、硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑-4-基(NBD)和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。其它荧光标签如Alexa染料、DNA含量染料如DAPI、Hoechst染料在本领域中是众所周知的，并且所有都可以容易地从各种商业来源获得。每个荧光团都具有特征性的峰值激发和发射波长，并且发射光谱经常重叠。这些荧光体的吸收和发射最大值分别为：FITC(490nm；520nm)、Cy3(554nm；568nm)、Cy3.5(581nm；588nm)、Cy5(652nm；672nm)、Cy5.5(682nm；703nm)和Cy7(755nm；778nm)，因此选择一个不具有大量光谱重叠的光谱可以同时检测它们。荧光标记可以从各种商业来源获得。可区分荧光标记的最大数量被认为是大约17个或18个不同的荧光标记。这种复杂的读出水平需要费力的优化来限制伪影，以及复杂的去卷积算法来分离重叠的光谱。因为其发射峰较窄，量子点有时被用来代替传统的荧光团。可以用于检测的其它方法包含同位素标记的抗体，如镧系元素同位素。然而，这项技术最终会破坏细胞，使其无法回收进行进一步分析。
在一个实例中，本公开的方法可以使用免疫组织化学来检测本公开的生物标志物的表达水平。因此，每种标志物的特异性抗体用于检测生物样品中所声称的生物标志物的表达。可以通过直接标记抗体本身来检测抗体，例如用放射性标记、荧光标记、半抗原标记(如生物素)或酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)进行标记。可替代地，将未标记的初级抗体与经标记的次级抗体联合使用，该次级抗体包括抗血清、多克隆抗血清或对初级抗体具有特异性的单克隆抗体。免疫组织化学方案在本领域中是众所周知的，并且方案和抗体是可商购获得的。可替代地，可以制备如本文公开的将有助于确定生物样品中的表达水平的针对生物标志物或生物标志物的修饰版本或结合伴侣的抗体。
在一个实例中，本公开的方法可以使用生物芯片。生物芯片可以用来筛查大量的大分子。在这项技术中，大分子以有序阵列的形式连接在生物芯片的表面。测试区的网格图案允许通过成像软件进行分析，以快速且同时地量化在其预定位置(地址)处的单个分析物。CCD相机是一种灵敏且高分辨率的传感器，能够准确地检测和量化芯片上非常低的光照水平。
生物芯片可以用固定的核酸分子、全长蛋白质、抗体、亲和体(工程化成模拟单克隆抗体的小分子)、适体(基于核酸的配体)或化合物来设计。芯片可以设计成在一个芯片上检测多种大分子类型。例如，芯片可以设计成在一个芯片上检测核酸分子、蛋白质和代谢物。生物芯片用于和设计成同时分析单个样品中的一组生物标志物，产生这些生物标志物的受试者档案。生物芯片的使用允许进行多次分析，从而减少了总体处理时间和所需的样本量。
蛋白质微阵列是可以用于本公开的特定类型的生物芯片。芯片由支撑表面，如载玻片、硝化纤维膜、珠或微量滴定板组成，捕获蛋白阵列以阵列形式结合到固体表面上。蛋白质阵列检测方法必须给出高信号和低背景。通常用荧光染料标记的检测探针分子被添加到阵列中。探针和固定的蛋白质之间的任何反应都会发出可由激光扫描仪读取的荧光信号。此类蛋白质微阵列是快速的，可以自动化，并为诊断测试提供高灵敏度的蛋白质生物标志物读出。然而，本领域技术人员将立即意识到，存在可以与该技术一起使用的各种检测方法。
目前至少有三种类型的蛋白质微阵列用于研究蛋白质的生物化学活性。例如，分析微阵列(也称为捕获阵列)、功能性蛋白质微阵列(也称靶蛋白阵列)和反相蛋白微阵列(RPA)。
本公开提供了使用分析蛋白质微阵列(如Luminex xMAP技术)用于生物标志物的检测。分析蛋白质微阵列是使用抗体、适体或亲和体的文库构建的。该阵列用复杂的蛋白质溶液，如血液、血清或细胞裂解物探测，其功能是捕获与其特异性结合的蛋白质分子。使用各种检测系统对所得结合反应的分析可以提供关于样品中特定蛋白质的表达水平的信息以及结合亲和力和特异性的测量结果。这种类型的蛋白质微阵列在比较不同样品中的蛋白质表达方面特别有用。
在一个实例中，本公开的方法可以使用功能性蛋白质微阵列。这些是通过固定大量纯化的全长功能性蛋白质或蛋白质结构域构建的，并且用于鉴定蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、蛋白质-磷脂和蛋白质-小分子相互作用以测定酶活性，并检测抗体并证明其特异性。这些蛋白质微阵列生物芯片可以用于研究样品中整个蛋白质组的生物化学活性。
在一个实例中，本公开的方法可以使用反相蛋白微阵列(RPA)。反相蛋白微阵列由排列在微阵列上的组织和细胞裂解物构建，并用针对所关注的靶蛋白的抗体探测。这些抗体通常用化学发光、荧光或比色测定法检测。除了裂解物中的蛋白质外，将参考对照肽印刷在载玻片上以允许蛋白质定量。RPAs允许确定改变的蛋白质或其它药剂的存在，这些蛋白质或药剂可能是疾病的结果并存在于患病细胞中。
在一些实例中，生物标志物的检测利用ARCHITECT系统(雅培公司(Abbott))。
本公开提供了使用质谱法(可替代地称为质谱法)用于生物标志物的检测。质谱(MS)是一种测量带电粒子质荷比的分析技术。其主要用于确定样品或分子的元素组成，并用于阐明分子如肽和其它化合物的化学结构。MS的工作原理是电离化学化合物产生带电分子或分子碎片，并测量其质荷比。MS仪器通常由三个模块组成：(1)离子源，其可以将气相样品分子转化为离子(或者，在电喷雾电离的情况下，将溶液中存在的离子移动到气相中)；(2)质量分析仪，其通过施加电磁场按离子质量对离子进行分类；以及(3)检测器，其测量指示量的值，并且因此提供用于计算存在的每个离子的丰度的数据。
用于本公开的合适的质谱方法包含但不限于以下中的一个或多个：电喷雾电离质谱法(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱法(SELDI-TOF-MS)、串联液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)质谱法、硅上解吸/电离法(DIOS)、二次离子质谱法(SIMS)、四极飞行时间法(Q-TOF)、大气压化学电离质谱法(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)、大气压光致电离质谱法(APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS)n、四极质谱法、傅立叶变换质谱法(FTMS)和离子阱质谱法，其中n是大于零的整数。
为了深入了解样品的潜在蛋白质组学，LC-MS通常用于解析复杂混合物的组分。LC-MS方法通常涉及蛋白酶消化和变性(通常涉及蛋白酶，如胰蛋白酶和变性剂，如尿素，使三级结构变性和碘乙酰胺，使半胱氨酸残基封端)，随后是具有肽质量指纹图谱的LC-MS或LC-MS/MS(串联MS)，以导出单个肽的序列。LC-MS/MS最常用于复杂样品的蛋白质组学分析，即使使用高分辨率质谱仪，肽质量也可能重叠。可以首先在SDS-PAGE凝胶或HPLC-SCX上分离复杂生物流体(如人血清)的样品，并且然后在LC-MS/MS中运行，从而鉴定1000多种蛋白质。
虽然多种质谱方法可以与本文所提供的本公开的方法一起使用，但在一些应用中，可能希望对来自所关注的蛋白质的选定子集的生物样品中的蛋白质进行量化。可以与本公开一起使用的一种此类MS技术是多重反应监测质谱法(MRM-MS)，或者可替代地称为选择性反应监测质谱术(SRM-MS)。
MRM-MS技术使用三重四极(QQQ)质谱仪从所关注的肽中选择带正电的离子，将带正电离子片段化，并且然后测量所选带正电片段离子的丰度。这种测量通常被称为转换。
在一些应用中，MRM-MS与高压液相色谱法(HPLC)以及最近的超高压液相色谱仪(UHPLC)偶联。在其它应用中，MRM-MS与具有QQQ质谱仪的UHPLC偶联以对所有所关注的肽和蛋白质进行所需的LC-MS转换测量。
在一些应用中，可以利用四极飞行时间(qTOF)质谱仪、飞行时间(TOF-TOF)质谱仪、轨道阱质谱仪、四级轨道阱质谱仪或任何四极离子阱质谱仪来从一种或多种所关注的蛋白质中选择带正电的离子。然后可以测量片段化的带正电的离子以确定带正电离子的丰度，用于所关注的肽或蛋白质的定量。
在一些应用中，可以利用飞行时间(TOF)、四极飞行时间(qTOF)质谱仪、飞行时间(TOF-TOF)质谱仪、轨道阱质谱仪或四极轨道阱质谱仪测量来自所关注的蛋白质的带正电肽离子的质量和丰度，而无需片段化用于定量。在该应用中，分析物质量测量结果的准确性可以用作测定的选择标准。已知组成和浓度的同位素标记的内标可以用作质谱定量方法的一部分。
在一些应用中，飞行时间(TOF)、四极飞行时间(qTOF)质谱仪、飞行时间(TOF-TOF)质谱仪、轨道阱质谱仪或四极轨道阱质谱仪可以用来测量所关注的蛋白质的质量和丰度用于定量。在该应用中，分析物质量测量结果的准确性可以用作测定的选择标准。任选地，该应用可以在通过质谱法分析之前使用蛋白质的蛋白水解消化。已知组成和浓度的同位素标记的内标可以用作质谱定量方法的一部分。
在一些应用中，各种电离技术可以偶联到本文提供的质谱仪，以产生所需信息。可以与本公开一起使用的非限制性示例性电离技术包含但不限于：基质辅助激光解吸电离(MALDI)、解吸电喷雾电离(DESI)、直接辅助实时(DART)、表面辅助激光解吸电离(SALDI)或电喷雾电离(ESI)。
在一些应用中，HPLC和UHPLC可以偶联到质谱仪，在质谱分析之前可以进行许多其它蛋白质分离技术。可以用于从基质背景中分离所需分析物(例如，肽或蛋白质)的一些示例性分离技术包含但不限于：蛋白质或肽的反相液相色谱法(RP-LC)、MALDI之前的离线液相色谱(LC)、1维凝胶分离、2维凝胶分离、强阳离子交换(SCX)色谱、强阴离子交换(SAX)色谱、弱阳离子交换(WCX)和弱阴离子交换(WAX)。上述技术中的一种或多种可以在质谱分析之前使用。
在本公开的一个实例中，可以使用微阵列在生物样品中检测生物标志物。差异基因表达也可以通过微阵列技术进行鉴定或确认。因此，可以使用微阵列技术在新鲜或固定组织中测量表达谱生物标志物。在此方法中，所关注多核苷酸序列(包含cDNA和寡核苷酸)被铺板或排列在微芯片底物上。然后将排列的序列与来自所关注细胞或组织的特异性DNA探针杂交。mRNA的来源通常是从生物样品中分离的总RNA，并且对应的正常组织或细胞系可以用于确定差异表达。
在微阵列技术的具体实施例中，PCR扩增的cDNA克隆插入物施加于密集阵列中的底物。优选地，将至少10,000个核苷酸序列施加于底物。以各自10,000个元素固定在微芯片上的微阵列基因，适合在严格条件下进行杂交。通过逆转录从所关注组织中提取的RNA，可以通过掺入荧光核苷酸来产生荧光标记的cDNA探针。施加到芯片上的标记的cDNA探针与阵列上的每个DNA点进行特异性杂交。经过严格的清洗以去除非特定结合的探针之后，用设备如共聚焦激光显微镜或另一种检测方法(如CCD相机)扫描微阵列芯片。对每个排列的元素的杂交的定量允许评估对应的mRNA丰度。利用双色荧光，从两个来源的RNA产生的单独标记的cDNA探针与阵列成对杂交。因此，同时确定了对应于每个特定基因的来自两个来源的转录物的相对丰度。微阵列分析可以通过可商购获得的设备按照制造商的协议进行。
在本公开的一个实例中，可以使用qRT-PCR在生物样品中检测生物标志物，所述qRT-PCR可以用于比较不同样品群体、正常组织和肿瘤组织中的mRNA水平，无论是否进行药物治疗，以表征基因表达模式，区分密切相关的mRNA，并分析RNA结构。通过RT-PCR进行基因表达谱分析的第一步是从生物样品中提取RNA，随后将RNA模板逆转录为cDNA，并通过PCR反应进行扩增。逆转录反应步骤通常使用特异性引物、随机六聚体或寡核苷酸dT引物引发，这取决于表达谱分析的目标。两种常用的逆转录酶是成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MLV-RT)。
尽管PCR步骤可以使用多种热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶，但该步骤通常采用TaqDNA聚合酶，该聚合酶具有5'-3'核酸酶活性，但缺乏3'-5'校对核酸内切酶活性。因此，TaqManTMPCR通常利用Taq或Tth聚合酶的5'-核酸酶活性来水解与其靶扩增子结合的杂交探针，但是可以使用具有同等5'核酸酶活性的任何酶。两个寡核苷酸引物用于产生PCR反应的典型扩增子。第三种寡核苷酸或探针被设计为检测定位于两个PCR引物之间的核苷酸序列。探针不可被Taq DNA聚合酶延伸，并且用报告基因荧光染料和淬灭荧光染料标记。当两种染料被定位成在探针上靠得很近时，来自报告基因染料的任何激光诱导的发射被淬灭染料淬灭。在扩增反应期间，Taq DNA聚合酶以模板依赖性方式切割探针。所得探针片段在溶液中解离，并且来自释放的报告基因染料的信号不受第二荧光团的淬灭效应的影响。每合成一个新分子就释放一个报告基因染料分子，并且检测未淬灭的报告基因染料为数据的定量解释提供了基础。
TaqManTMRT-PCR可以使用可商购获得的设备进行，如例如ABIPRISM 7700SequenceDetection SystemTM(美国加利福尼亚州福斯特城的珀金-埃尔默-应用生物系统公司(Perkin-Elmer-Applied Biosystems,Foster City,Calif.,USA))或Lightcycler(德国曼海姆的罗氏分子生化公司(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim,Germany))。在优选实施例中，5'核酸酶程序在实时定量PCR装置如ABIPRISM 7700TMSequence DetectionSystemTM上运行。该系统由热循环仪、激光器、电荷耦合装置(CCD)、相机和计算机组成。该系统包含用于运行仪器和用于分析数据的软件。5'核酸酶测定数据最初表示为Ct，或阈值循环。如上文所讨论，荧光值在每个循环期间被记录，并且表示扩增反应中扩增到该点的产物量。荧光信号第一次被记录为具有统计学意义的点是阈值循环(Ct)。
为了最小化误差和样品间差异的影响，RT-PCR通常使用内标物进行。理想的内标物在不同的组织中以恒定的水平表达，并且不受实验处理的影响。最常用于使基因表达模式归一化的RNA是看家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和β肌动蛋白的mRNA。
RT-PCR技术的更新的变体是实时定量PCR，其通过双标记荧光探针(即，TaqManTM探针)测量PCR产物的积累。实时PCR既与定量竞争性PCR兼容，其中每个靶序列的内部竞争物用于归一化；也与定量比较PCR兼容，该定量比较PCR使用包含在样品中的归一化基因或用于RT-PCR的看家基因。进一步的细节参见例如Held等人,《基因组研究(GenomeResearch)》,6:986-994(1996)。其它定量方法包含数字液滴PCR。
通常，在本公开中进行的生物标志物的量化将包含参考对照样品。在一些实例中，对照参考是根据来自健康个体群体的对应生物标志物组中的生物标志物的测量结果来确定的。如本文所使用的，术语“健康个体”是指已知未患有结直肠癌的人或人群，此类知识来源于可以通过结肠镜检查或乙状结肠镜检查确定的个体的临床数据。在一些实例中，对照参考是根据“典型群体”中对应生物标志物的测量结果来确定的。优选地，“典型群体”将在疾病进展的不同阶段展现出一系列结直肠癌。特别优选的，“典型群体”展现出本文所述的受试者队列的表达特性。
在另一个实例中，对照参考可以从建立的数据集导出，所述数据集包含以下中的一个或多个：
1.包括已知患有结直肠癌的受试者群体的生物标志物的测量结果的数据集；
2.包括被测试的受试者的生物标志物的测量结果的数据集，其中所述测量是先前进行的，例如，当已知受试者健康时，或者，在患有结直肠癌的受试者的病例中，当诊断受试者时或者在疾病进展的早期阶段；和/或
3.包括健康个体或健康个体群体的生物标志物的测量结果的数据集。
数据分析
在一些实例中，确定受试者是否患有结直肠癌或以其它方式具有增加的罹患结直肠癌的风险的方法基于与可以结合统计分析进行的参考概况相比的生物标志物组测量。
定量评分可以通过应用特定算法来确定。在本文公开的方法中用于计算定量评分的算法可以对一种生物标志物或一组生物标志物的表达水平值进行分组。此外，一组特定生物标志物的形成可以促进生物标志物或生物标志物子集(例如分类器)的各种表达水平对定量评分的贡献的数学加权。
在一些实例中，SPSS软件可以用于统计分析。在一些实例中，二元逻辑回归分析可以用于预测所选生物标志物的诊断效率。在一些实例中，可以使用与计算机一起使用以实施统计算法的统计算法。在一些实例中，统计算法是学习统计分类器系统。此类系统的实例包含随机森林、交互式树、分类和回归树分类或神经网络。
对测试的公平评估需要使用“样本外”受试者进行评估，即未包含在初始预测模型构建中的受试者。这是通过使用n倍交叉验证来评估测试性能来实现的。
统计显著性检验包含线性和非线性回归，包含ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和优势比、贝叶斯概率算法。然而，随着测量的生物标志物数量的增加，使用更复杂的技术如随机森林、简单逻辑或贝叶斯网络等通常可以更方便。
在一些实例中，可以采用贝叶斯概率。在这种情况下，可以使用10倍交叉验证来估计所讨论模型的“样本外”性能。对于所考虑的每种生物标志物组合，数据可以随机分为10个子样本，每个样本的健康受试者和疾病各个阶段的受试者比例相似。进而，可以排除每个子样本，并使用剩余90％的受试者建立逻辑模型。然后该模型可以用于估计被排除子样本的癌症概率，从而提供“样本外”性能的估计。通过对其余9个子样本重复此操作，可以根据研究数据本身估计“样本外”性能。然后，可以将这些“样本外”预测概率与受试者的实际疾病状态进行比较，以创建受试者操作特性(ROC)曲线，根据该曲线可以估计给定特异性(例如95％特异性)下的交叉验证灵敏度。
使用交叉验证(或任何其它方法)对“样本外”性能的每一次估计，虽然没有偏见，但都有可变性的因素。因此，模型的排名(基于生物标志物组合)可以仅指示此类模型的相对性能。然而，正如通过“样本外”性能评估所证明的那样，一组能够在大量组合中使用以生成诊断测试的生物标志物，几乎可以肯定的是，其本身含有能够承受重复评估的生物标志物组合。
在一个实例中，使用以下算法测量生物标志物：
其中p表示一个人患有结直肠癌的概率。每个CBMi是受试队列中一名受试者的血浆(或血清)中第i种生物标志物浓度的对数。每个β(βBM)是一个系数，以测量的浓度单位应用于该生物标志物——β0是“偏移”或“截距”。这种线性逻辑模型对于本文中提出的所有结果是常见的，但远不是可以对生物标志物浓度的组合进行建模以预测癌症概率的唯一方式。如本领域技术人员所理解的，虽然本文例示了生物标志物浓度的以10为底的对数，但也可以使用其它对数，例如以2为底的对数。
同样适用的其它非线性或线性逻辑算法包含随机森林、微阵列数据的线性模型(LIMMA)和/或微阵列数据的显著性分析(SAM)、最佳优先、贪婪逐步、朴素贝叶斯、线性前向选择、分散搜索、线性判别分析(LDA)、逐步逻辑回归、接收器操作特性和分类树(CT)。
本领域技术人员将熟悉在回归算法中确定协同有效值。
本文描述的算法可以用于导出癌症可能性评分。在一些实例中，导出的定量评分可能指示不良临床结果、良好临床结果、CRC高风险或CRC低风险的可能性增加。然后评分可以通知治疗管理。
在一些实例中，生物标志物组能够以与FOBT相当或更好的灵敏度和特异性检测CRC。本领域技术人员将知道，灵敏度是指诊断测试中被正确鉴定为患有结直肠癌的实际阳性的比例。特异性测量被正确鉴定为未患有结直肠癌的阴性的比例。
在一些实例中，生物标志物组具有至少50％、60％或65％，或至少70％、80％、83％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、93％或至少95％的灵敏度。
在一些实例中，生物标志物组具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％或至少95％的特异性。
数据处理
从本文的讨论中将显而易见，用于实施算法的基于知识的计算机软件和硬件也形成本公开的一部分。此类计算机软件和/或硬件可用于执行根据本公开的检测结直肠癌的方法。
本文所述测定的值可以手动计算和存储。可替代地，统计分析步骤可以完全或部分地由计算机程序产品执行。因此，本公开提供了包含计算机可读存储介质的计算机程序产品，所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序。当由计算机读取程序时，基于从来自受试者的一个或多个生物样品的分析中获得的值执行相关计算(例如，基因或蛋白质表达水平、归一化、标准化、阈值转换和将值从测定转换为临床结果评分和/或临床状态或阶段的文本或图形描述以及相关信息)。计算机程序产品在其中存储有用于执行计算的计算机程序。
本公开还提供了用于执行上述数据收集和处理或计算软件程序的系统，该系统通常包含：a)中央计算环境；b)输入装置，可操作地连接到所述计算环境以接收患者数据，其中所述患者数据可以包含例如基因或蛋白质表达水平或从使用来自所述受试者的生物样品的测定获得的其它值，或质量规格数据或由本公开提供的任何测定的数据；c)输出设备，连接到所述计算环境以向用户(例如，医务人员)提供信息；以及d)由所述中央计算环境(例如，处理器)执行的算法，其中所述算法是基于所述输入装置接收的所述数据执行的，并且其中所述算法计算表达评分、阈值转换或本文所述的其它函数。本公开提供的方法也可以全部或部分自动化。在一些实例中，所述方法包括基于实验室的方法和基于计算机的方法的组合。
在一个实例中，本公开的方法可以在现有的基于知识的架构或与病理学服务相关联的平台中使用。例如，来自本文所述的方法的结果通过通信网络(例如互联网)传输到处理系统，在所述处理系统中存储算法并用于生成预测的后验概率值，所述预测的后验概率值转换为疾病概率的评分，然后以诊断或预测报告的形式转发给最终用户。
因此，本公开的方法可以呈试剂盒或基于计算机的系统的形式，所述试剂盒或基于计算机的系统包括检测生物标志物的浓度所需的试剂和计算机硬件和/或软件，所述计算机硬件和/或软件便于确定报告并且将报告传递给临床医师。
本文所述的测定可以集成到现有的或新开发的病理学架构或平台系统中。例如，本公开设想了允许用户确定受试者关于结直肠癌的风险的方法，所述方法包含：
(a)接收通过确定本文所述的生物标志物组中的每种生物标志物的测量结果而获得的受试者数据；
(b)通过多变量分析(例如，回归分析)处理数据以提供疾病评分；
(c)根据与预定值相比较的疾病评分的结果来确定受试者的状态；以及
(d)通过通信网络参考所述多变量分析将所述受试者的状态的指示传送给所述用户，所述多变量分析包含执行所述多变量分析功能的算法。
试剂盒
本发明提供了用于检测生物标志物的试剂盒。此类试剂盒可以适用于核酸种类的检测，或者可替代地可以用于蛋白质或多肽的检测。
对于多肽的检测，抗体将最典型地用作试剂盒的组分。然而，任何能够与生物标志物基因产物特异性结合的试剂都是有用的。试剂盒的其它组分通常包含标记、二次抗体、抑制剂、辅因子和对照基因或蛋白质产品制剂以允许用户定量表达水平和/或评估测量是否正确。基于酶联免疫吸附测定法(ELISA)的测试和竞争性ELISA测试是本领域技术人员可以使用试剂盒组分容易地进行的特别合适的测定。
在一些实例中，所述试剂盒可以包括微量滴定板，其上固定有对应于被测量的生物标志物的捕获抗体。
在一些实例中，所述试剂盒包括珠粒，其上固定有对应于被测量的生物标志物的捕获抗体。
任选地，所述试剂盒进一步包括用于检测抗体与生物标志物多肽结合的方式。此类方式包含报告基因分子，例如酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、染料、放射性核苷酸、发光基团、化学发光基团、荧光基团、生物素或胶体颗粒，如胶体金或硒。优选地，此类报告基因分子与抗体直接连接。
在一个实例中，试剂盒可以另外地包括参考样品。在一个实施例中，参考样品包括由抗体检测的多肽。优选地，所述多肽具有已知浓度。此类多肽作为标准具有特定用途。因此，可以使用本文所述的诊断测定法来检测此类多肽的各种已知浓度。
针对检测核酸，此类试剂盒可以含有第一容器，如小瓶或塑料管或含有寡核苷酸探针的微量滴定板。试剂盒可以任选地含有容纳引物的第二容器。探针可以与表达改变与结直肠癌相关的DNA杂交，并且引物可用于扩增该DNA。含有固定在固体支撑物上的寡核苷酸探针的试剂盒也可以例如，使用阵列开发(参见第21期(1)《自然遗传学(NatureGenetics)》的增刊,1999)。
对于核酸的PCR扩增，试剂盒中可以包含与本文所述的生物标志物基因的至少一部分互补的核酸引物。引物组通常包含能够特异性扩增DNA的至少两个寡核苷酸，优选地四个寡核苷酸。可以包含允许定量PCR测定的荧光标记的寡核苷酸(例如TaqMan化学、分子信标)。还将包含用于扩增DNA的合适的酶。
为了比较或验证的目的，可以包含对照核酸。此类对照可以是从健康组织或健康个体分离的RNA/DNA，或可以是mRNA水平不受结直肠癌影响的看家基因，如β肌动蛋白或GAPDH。
本领域的技术人员应了解，在不脱离本公开的一般宽范围的情况下，可以对上述实施例作出许多变化和/或修改。因此，本发明的实施例应被视为在所有方面都是说明性而非限制性的。
实例
材料与方法
伦理
本研究中使用的所有研究方案均经相关人类研究伦理委员会批准。在血液样品收集之前，获得每位参与者的书面知情同意书。
参与者样品
从九十六名在若干家医院接受治疗的结直肠癌患者(杜克氏I-IV期)中采集并处理血浆和血清样品。样品来自维多利亚癌症生物银行(Victorian Cancer Biobank)。
从50岁以上和年龄介于50岁至85岁之间的约50名健康志愿者(对照)中采集和处理血液。
已接受化疗和/或放疗的受试者被排除在分析之外。下表1中总结了受试者的特性。
表1患者特性(研究3)
血液采集和处理
使用前面描述的标准操作程序采集受试者的血清样品(Brierley GV等人(2013)《癌症生物标志物(Cancer Biomark)》.13:67–73)。将血液收集到血清凝胶管(美国科学专业公司(Scientific Specialties Inc.,USA))中，并在离心前将每个样品在室温下静置至少30分钟(1,200g，10分钟，室温)。然后将血清级分转移到干净的15mL试管中，并再次离心(1,800g，10分钟，室温)，然后等分(250μL)并储存(-80℃)。所有样品均在采集后2小时内进行处理和储存。血清样品在使用前仅解冻一次。
血液生物标志物和生物标志物分析
共评估了18种生物标志物。下表2中评估了标志物。
表2分析的生物标志物
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血液生物标志物分析
使用标准方案，使用夹心ELISA分析来量化患者血清样品中的生物标志物的水平。生物标志物的分析是用商业试剂盒和来源的抗体进行的。评估的生物标志物和使用的抗体/ELISA试剂盒的细节如表3所示。
表3研究中使用的抗体来源
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对于每种测定，样品一式两份进行测量，并包含内部质量控制(QC)样品。QC样品由合并的正常和合并的CRC患者血清样品组成。
对于标准ELISA，使用Wallac Victor3 1420多标记计数器(美国珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,USA))检测吸光度或荧光信号。使用WorkOut软件(德国希尔登的凯杰公司(Qiagen,Hilden Germany))从相应的标准曲线中得出生物标志物浓度。
灵敏度和特异性测定
任何给定测试的诊断潜力通常以其对特定疾病的灵敏度和特异性来表示。给定病例/对照实验的结果可以分配到表4中所示的四个象限之一。
表4根据灵敏度和特异性分析结果所需的类别
结肠镜检查存在的病状(+) 结肠镜检查不存在的病状(-)
测试阳性 真阳性(TP) 假阳性(FP)
测试阴性 假阴性(FN) 真阴性(TN)
TP+FN FP+TN
灵敏度是使用来自结肠镜检查和组织病理学的诊断作为参考来准确检测患有结直肠癌的那些人的测试能力的量度，并且由以下等式确定：
测试灵敏度(％)＝100％×TP/(TP+FN)
特异性是使用结肠镜检查/组织病理学结果作为参考来准确检测未患有结直肠癌的那些人的测试能力的量度，并且由以下等式确定：
测试特异性(％)＝100％×TN/(FP+TN)
需要选择给定生物标志物的阈值浓度(生物标志物蛋白的ELISA确定的血清浓度)，以便根据ELISA测试确定哪些患者结果被认为是阳性或阴性。可以在实验中观察到的整个浓度范围内的任何阈值浓度值下确定测试的灵敏度和特异性。灵敏度和特异性之间存在反比关系。
统计评估和建模
为了找到能最好地区分对照和结直肠癌患者的生物标志物的组合，使用了基于以下等式的逻辑回归，如以下等式所示：
Yi＝βo+β1[M1]+β2[M2]………+εi
其中：
·Yi是CRC存在或不存在的二元指标，如通过实验队列中的结肠镜检查所确定的。
·βo是回归截距值。
·M1等是生物标志物1浓度的以10为底的对数，如以特定单位测量的。M2、M3等表示每个单独的生物标志物。
·β1等是乘以记录的生物标志物浓度的系数。
·εi是与模型相关联的误差项。
为了找到能最好地区分对照和结直肠癌患者的生物标志物加上年龄的组合，使用了基于以下等式的逻辑回归，如以下等式所示：
Yi＝βo+β1[M1]+β2[M2]………+β年龄(年龄)+εi
其中：
·Yi是CRC存在或不存在的二元指标，如通过实验队列中的结肠镜检查所确定的。
·βo是回归截距值。
·M1等是生物标志物1浓度的以10为底的对数，如以特定单位测量的。M2、M3等表示每个单独的生物标志物。
·β1等是乘以记录的生物标志物浓度的系数。
·年龄是以年为单位的受试者年龄。
·β年龄是乘以以年为单位的受试者年龄的系数。
·εi是与模型相关联的误差项。
使用生物标志物的不同组合和相关β0-10系数的不同值建立模型，可以为不同大小的生物标志物组确定最接近真实值Yi的模型。
为了解决统计和机器学习过程中经常遇到的过拟合或选择偏差等问题，并深入了解任何给定模型将如何推广到独立的数据集，使用10倍交叉验证对每个标志物的数据进行了重新分析。简言之，将任何标志物的完整数据集划分为10个大小相等的子样本。一个子样本被保留为验证数据集，并且其余9个子样本被用作训练数据。该过程重复10次，其中每个子样本仅使用一次作为验证数据。下表中的呈现数据是使用这种交叉验证程序获得的。
使用统计软件包Prism和“R”分析每个测定的结果。使用非参数曼-惠特尼(Mann-Whitney)t检验评估标志物的个体性能，并生成单独的受试者操作员特性(ROC)曲线。
实例1单个生物标志物的分析
本研究中分析的受试者的临床特性如表1所示。对总计95名通过结肠镜检查确诊为结直肠癌(CRC)的受试者和50名健康对照者进行了分析。CRC受试者的中值年龄为67岁。男女比例大致相等。
通过ELISA测定评估个体生物标志物，并使用曼-惠特尼双尾T检验评估每种生物标志物的病例和对照的中位数之间的统计差异。在p<0.05的结直肠癌受试者和对照受试者之间单独区分的生物标志物为BDNF、TIMP1、TNFα、MAC2BP、MMP1、MMP7、IGFII、M65、TGFβ1、IL6、IL8、VEGFA、IGFBP2、DKK3和M2PK。
根据表5，生物标志物M2PK、TIMP1、IGFBP2、BDNF、IL6和IL8似乎在结直肠癌受试者和对照之间提供了最大的区分。
研究了每种生物标志物(有年龄和无年龄)在所有个体中以及当数据基于男性/女性进行分离时区分结直肠癌受试者和对照受试者的能力。每个个体生物标志物(有年龄和无年龄)的交叉验证灵敏度如表5所示。交叉验证灵敏度来源于对单独考虑的每种生物标志物的浓度值应用逻辑回归，并通过对特定生物标志物和应用于所有病例和对照样品的对数浓度值进行差异加权，表示在95％特异性下可实现的最佳灵敏度。
表5交叉验证了个体生物标志物在95％特异性下的灵敏度(％)，研究了其区分结直肠癌受试者和对照受试者的能力。
单独考虑，具有最大诊断潜力的生物标志物结合了用于检测具有高特异性的给定疾病的高灵敏度。癌症和正常对照之间没有单独或与年龄组合的个体生物标志物，其中在95％特异性下，灵敏度足以作为筛查应用的独立的生物标志物。
实例2生物标志物组合的分析
为了鉴定为结直肠癌检测提供最佳性能的生物标志物的组合，诸位发明人测量了来自具有表6中所述性质的新受试者队列的血清样品中的十八种主要生物标志物(如表3中所鉴定)的水平。
表6评估生物标志物的队列的受试者概况(研究3和4组合)
表6中提及的受试者的血清样品从维多利亚癌症生物库获得。样品是根据严格的标准操作方案制备的，如https://viccancerbiobank.org.au/for-researchers/quality-assurance/)中所描述的。使用如上表3所述的可商购获得的ELISA试剂盒测量每个血清样品中的生物标志物的浓度。
如上所述，使用逻辑回归来鉴定两种至十种生物标志物的组合，这些生物标志物被差异加权，以在每个组合的病例和对照样品之间提供可能的最佳分辨率。下表7至15中的灵敏度值经过十倍交叉验证。下表7至15示出了两种至十种生物标志物组合的前十种表现生物标志物。
表7在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的十种生物标志物组合。
表8在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的九种生物标志物组合。
表9在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的八种生物标志物组合。
表10在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的七种生物标志物组合。
表11在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的六种生物标志物组合。
表12在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的五种生物标志物组合。
表13在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的四种生物标志物组合。
表14在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的三种生物标志物组合。
BM1 BM2 BM3 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK IL8 74.6
BDNF M2PK TNFα 72.4
BDNF M2PK DKK3 71.4
BDNF M2PK IGFBP2 68.5
BDNF M2PK MAC2BP 68.1
表15在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的两种生物标志物组合。
BM1 BM2 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK 63.8
从表7至15中可以明显看出，当更多的生物标志物被包含在组中时，获得了最高的灵敏度。对于四个至十个生物标志物组大小类别内的组，在任何特定生物标志物组数字类别的前十个模型中观察到的灵敏度下降非常适度，范围为从8个生物标志物组的1.2％至4个生物标志物组的3.8％。对于包括七种至十种生物标志物和四种至六种生物标志物的生物标志物组，观察到前十组的灵敏度值范围在相邻的生物标志物组大小类别之间重叠。对于包括BDNF、M2PK、DKK3、TGFβ、IGFBP2、脂质运载蛋白、TNFα、MIP1β、M65和IGFII的十个生物标志物组，在95％特异性下记录的最高灵敏度(对于男性和女性性别的混合)为85.6％。
BDNF和M2PK存在于每个生物标志物组大小类别中表现最好的组中。在前十个六个至十个生物标志物组大小类别中，其它显著观察到的生物标志物包含IGFBP2、DKK3和TNFα。在四种至八种生物标志物之间，IL8似乎在前十模型中也有很好的代表性。
为了鉴定在更广泛的一组生物标志物组中最常见的生物标志物，这些生物标志物显示来自患有和不患有晚期结直肠肿瘤的人(男性和女性组合)的血清之间的强分辨率，分别绘制了十种至三种生物标志物组的前100个模型(或在95％特异性下产生≥75％灵敏度的前模型)中单个生物标志物的表现频率。
在建模中未包含年龄项的情况下，获得的两个性别组合的结果如图1-1和1-2所示。对于所有生物标志物组，均存在M2PK和BDNF。
对于八种至十种生物标志物组，其它生物标志物(在更广泛的高性能组选择中占>50％)包含DKK3、IGFBP2和TNFα。对于四个至七个生物标志物组，随着TNFα和IGFBP2开始减弱，IL8成为一个突出的标志物，同时仍对高性能生物标志物组的相当大比例做出贡献。
不希望受理论束缚，诸位发明人已经发现，与先前公开的生物标志物组合相比，将BDNF包含在生物标志物组中在95％特异性下的测试灵敏度和/或在95％特异性下的交叉验证的灵敏度方面提供了出乎意料的改进。例如，WO 2012/006681公开了用于诊断或检测受试者的结直肠癌的方法。在该应用中，排名最高的三种生物标志物组合是DKK3、M2PK和IGFBP2，其测试灵敏度为72.9％，并且交叉验证的灵敏度为70.8％，两者都在95％特异性下。诸位发明人已经证明，将BDNF包含在该生物标志物组(即BDNF、DKK3、M2PK和IGFBP2)中将测试灵敏度和交叉验证的灵敏度在95％特异性下分别提高到73.9％和74.5％。类似地，WO 2012/006681中排名最高的四种生物标志物组合是DKK3、M2PK、IGFBP2和Mac2BP，其测试灵敏度为68.8％，并且交叉验证的灵敏度为69.8％，两者都在95％特异性下。诸位发明人已经证明，将BDNF包含在该生物标志物组(BDNF、DKK3、M2PK、IGFBP2和Mac2BP)中将测试灵敏度和交叉验证的灵敏度在95％特异性下分别提高到77.7％和76.6％。最后，在WO2012/006681中，四种生物标志物组合DKK3、M2PK、IGFBP2和TIMP1的测试灵敏度为61.5％，并且交叉验证的灵敏度为53.1％，两者都在95％特异性下。诸位发明人已经证明，将BDNF包含在该生物标志物组(即BDNF、DKK3、M2PK、IGFBP2和TIMP1)中将测试灵敏度和交叉验证的灵敏度在95％特异性下分别显著提高到77％和76％。
当在各个生物标志物组中考虑表现最好的生物标志物组合时，观察到由于包含BDNF而导致的WO 2012/006681中所述的生物标志物组合的性能增强。例如，当BDNF被包含在建模过程中时鉴定的表现最好的七个标志物组含有BDNF，并且在95％特异性下，对全期CRC(不包含年龄和/或性别)显示出83.2％的内部交叉验证的灵敏度，相比之下，表现最好的、内部交叉验证的WO 2012/006681中描述的七个生物标志物组模型的灵敏度为69％，其中不包含BDNF。类似地，对于包含BDNF在内的三个、四个和五个生物标志物组，在95％特异性下，每类表现最好的模型分别显示出74.6％、77.8％和80.5％的灵敏度，相比之下，表现最好的模型的灵敏度分别为70.8％、69.8％和70.8％，其中不包含BDNF。事实上，令人惊讶的是，在基于5种至10种生物标志物组的前100个表现最好的模型(或在95％特异性下产生>75％的灵敏度的模型)中，BDNF被包含在所有或绝大多数中(参见图2-1和2-2)。
实例3添加人口统计学数据的影响——年龄
年龄是CRC的最高风险因素。从50岁起，患结直肠癌的风险急剧增加。因此，诸位发明人使用逻辑回归分析评估了将年龄与多种生物标志物组合结合是否可以改变用生物标志物组合实现的CRC检测的灵敏度。下表16至24显示了当将以年为单位的加权年龄作为另外的生物标志物添加到分析中时，前十个执行两个至十个生物标志物组在95％特异性下的灵敏度。表16至24中显示了前十种执行两种至十种生物标志物组合加上年龄的实例。
表16在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的十种生物标志物组合加上年龄。
表17在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的九种生物标志物组合加上年龄。
表18在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的八种生物标志物组合加上年龄。
表19在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的七种生物标志物组合加上年龄。
表20在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的六种生物标志物组合加上年龄。
表21在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的五种生物标志物组合加上年龄。
表22在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的四种生物标志物组合加上年龄。
表23在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的三种生物标志物组合加上年龄。
BM1 BM2 BM3 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK IL8 72.4
BDNF M2PK DKK3 71.4
BDNF M2PK TNFα 65.9
表24在95％特异性下区分结直肠癌受试者(两种性别)和对照的两种生物标志物组合加上年龄。
BM1 BM2 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK 56.8
类似于在没有年龄的情况下的生物标志物组合，当包含年龄时，当组中有更多生物标志物时，获得最高的灵敏度。在前十个四个至十个生物标志物组加上年龄内，在任何特定的生物标志物组大小类别中观察到的灵敏度下降都是适度的，范围为从10个生物标志物组大小类别的1.2％至4个和6个生物标志物组大小类别的3.3％。对于四个至十个生物标志物组加上年龄，观察到的前十个生物标志物组的灵敏度值的范围在相邻的组大小类别之间重叠。在九个生物标志物组中，在95％特异性下，生物标志物加上年龄(两种性别)的最高灵敏度为87％。
对于六种至十种生物标志物组，包含年龄的前模型显示出的灵敏度值略高于其不包含年龄的同类模型。每个生物标志物组大小类别中表现最好的小组的生物标志物组成在包含和不包含年龄的模型之间有所不同，五个生物标志物组除外。然而，重要的是，在没有年龄的情况下，那些在前十个生物标志物组大小类别中最突出的生物标志物在包含年龄的同等小组中是保守的。特别地，BDNF和M2PK(肿瘤形式)存在于所有模型中。DKK3和IGFBP2是突出的，特别是在六个至十个生物标志物组大小类别中。
IL8、TNFα和MMP1也经常出现在许多前生物标志物组中。IGFBP2和MMP1在六个至十个生物标志物的组中更常见，但IL8和TNFα在所有生物标志物组中都很突出。MIP1β在八个至十个生物标志物组的前模型中有很强的代表性，但在包括六种或更少种生物标志物的前模型中其频率有所下降。
图2-1和2-2示出了十个至五个生物标志物组的前100个生物标志物模型(或在95％特异性下产生≥75％灵敏度的前模型)中单个生物标志物的频率，这些生物标志物组分别基于建模中包含年龄的两种性别的数据。对于几乎所有的生物标志物组，在包含年龄的情况下，在这一更广泛的表现最好的模型选择中，M2PK和BDNF存在于所有组中。例外的是五个生物标志物组，其中前100个模型中有8％不含BDNF。对于八个至十个生物标志物组，其它突出的生物标志物(在这一更广泛的高性能模型选择中，存在>50％)包含DKK3、IGFBP2、MMP1和TNFα。对于四个至七个生物标志物组，IL8仍然显著，尽管低于M2PK和BDNF。TNFα、DKK3、MMP1和IGFBP2在这些组中的组包含率降至50％以下，但在表现优异的面板中，其包含率仍高于其它生物标志物。
本领域技术人员将理解，在灵敏度和特异性之间存在相反的关系。因此，当特异性降低时，测试的灵敏度通常会增加。在操作上，可能需要更高的灵敏度，并且较低的特异性是可以接受的。例如，虽然没有两个标志物组加上年龄在95％特异性下以>75％灵敏度区分癌症和对照血清样品，但如果特异性降低到90％，则包括M2PK、BDNF和年龄的模型产生77.8％的交叉验证的灵敏度。
实例4性别的影响(单独分析男性和女性)
已知男性更容易罹患和死于结直肠癌。2015年，在澳大利亚诊断的15,604例新的结直肠癌病例中，7,031例为女性，而8,573例为男性。2019年，在当年估计的5,597例由结直肠癌导致死亡的病例中，2,588例为女性，而3009例为男性。同样在2019年，据估计，澳大利亚人在85岁生日前被诊断为结直肠癌的风险为每14人中有1人(男性每12人中有1人，并且女性每17人中有1人)(https://bowel-cancer.canceraustralia.gov.au/statistics)。澳大利亚国家肠癌筛查计划的FIT根据2017年的数据进行评估时，结直肠癌风险统计中的这些性别偏见也反映在按性别划分的阳性率中(男性8.8％，女性7.1％)(澳大利亚卫生与福利研究所(Australian Institute of Health and Welfare)2019.国家肠癌筛查计划：监测报告2019(National Bowel Cancer Screening Program:monitoring report 2019).癌症序列号125.目录号CAN 125.堪培拉：AIHW(Canberra:AIHW))。虽然这些男性结直肠癌发病率相对于女性增加的模式也反映在一项新的结直肠癌甲基化诊断测试的研究中，但性别本身并不是该测试阳性的预测因素(Pedersen等人血浆中甲基化的BCAT1和IKZF1测定在结直肠肿瘤检测中的评价(Evaluation of an assay for methylated BCAT1 and IKZF1 inplasma for detection of colorectal neoplasia).《BMC癌症(BMC Cancer)》(2015)15:654 DOI 10.1186/s12885-015-1674-2)。
在95％特异性下，表现最好的10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个和2个生物标志物组(包含BDNF，但不包含两个性别的年龄)如表7至15所示，最高观察灵敏度分别为85.6％、84.7％、84.2％、83.2％、80.4％、80.5％、77.8％、74.6％和63.8％。
为了了解这些组是否对两种性别同样有效，将193个结直肠癌、149个健康对照队列的相同核心生物标志物浓度数据分为仅男性和仅女性病例/对照队列。下表25至60示出了表现最好的两个至十个生物标志物组，通过对来自这些女性或男性队列的生物标志物数据独立进行的逻辑回归和10倍交叉验证来鉴定。
表25至33示出了两个至十个包含BDNF的女性生物标志物组的实例。表34至42示出了两个至十个包含BDNF同时也考虑了年龄的女性生物标志物组的实例。下面每个表示出了前十种生物标志物组合。
表25在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的十种生物标志物组合。
表26在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的九种生物标志物组合。
表27在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的八种生物标志物组合。
表28在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的七种生物标志物组合。
表29在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的六种生物标志物组合。
表30在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的五种生物标志物组合。
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表31在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的四种生物标志物组合。
BM1 BM2 BM3 BM4 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK IL8 MMP1 89.7
BDNF M2PK IL8 脂质运载蛋白 88.5
BDNF M2PK IL8 IL6 88.5
BDNF M2PK IL8 MIP1B 87.2
BDNF M2PK IL8 MAC2BP 87.2
BDNF M2PK IL8 TGFβ1 85.9
BDNF M2PK IL8 IL13 85.7
BDNF M2PK IL8 IGFII 85.7
BDNF M2PK IL8 TNFα 84.6
BDNF M2PK TGFβ1 MMP1 84.6
表32在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的三种生物标志物组合。
BM1 BM2 BM3 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK IL8 85.9
BDNF M2PK MAC2BP 79.5
BDNF M2PK MMP1 78.2
BDNF M2PK 脂质运载蛋白 78.2
BDNF M2PK IL13 77.9
BDNF M2PK MIP1B 76.9
BDNF M2PK IL6 76.9
BDNF M2PK TIMP1 76.6
BDNF M2PK DKK3 75.6
BDNF M2PK TNFα 74.4
表33在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的两种生物标志物组合。
BM1 BM2 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK 75.6
表34在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的十种生物标志物组合加上年龄。
表35在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的九种生物标志物组合加上年龄。
表36在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的八种生物标志物组合加上年龄。
表37在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的七种生物标志物组合加上年龄。
表38在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的六种生物标志物组合加上年龄。
表39在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的五种生物标志物组合加上年龄。
表40在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的四种生物标志物组合加上年龄。
表41在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的三种生物标志物组合加上年龄。
BM1 BM2 BM3 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK IL8 83.3
BDNF M2PK MAC2BP 79.5
BDNF M2PK MMP1 79.5
BDNF M2PK MIP1B 76.9
BDNF M2PK IL6 76.9
BDNF M2PK M30 75.6
BDNF M2PK IL13 75.3
BDNF M2PK TIMP1 75.3
BDNF M2PK 脂质运载蛋白 74.4
BDNF M2PK DKK3 74.4
表42在95％特异性下区分结直肠癌受试者(女性)和对照的两种生物标志物组合加上年龄。
BM1 BM2 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK 78.2
考虑到上表25至33和34至42，通常表明，无论年龄是否包含在算法中，当组含有越来越多的生物标志物时，从仅女性参与者开发的表现最好的生物标志物组在95％特异性下实现了更高的灵敏度。对于六个至九个的生物标志物组，当模型中包含年龄时，仅用女性数据观察到的最大灵敏度略有增加。
将表7至15(性别组合，仅生物标志物)与表25至33(女性，仅生物标志物)进行比较，令人惊讶的是，当单独基于女性数据建模时，发现在95％特异性下交叉验证模型的灵敏度明显高于基于两种性别组合数据建模时的灵敏度。在所有生物标志物组大小类别中都观察到高达10％的差异，并且无论建模中是否包含年龄，都会观察到差异(将表16至24与表34至42中包含年龄的建模进行比较)。
至于建立在男性和女性数据组合基础上的模型，对于仅由女性开发的模型，每个生物标志物组中表现最好的组的生物标志物组成在包含和不包含年龄的模型之间有所不同(例外是三个和四个生物标志物组大小类别，其中每个类别中的前模型在存在和不存在年龄的情况下具有相同的生物标志物组成)。然而，在不存在年龄的情况下，每个生物标志物数字类别的前模型中突出的生物标志物在包含年龄的等效模型中是保守的。特别地，BDNF和M2PK存在于所有模型中。IL8和MMP1在许多类别中都很突出。虽然在没有年龄的情况下，IGFBP2和脂质运载蛋白没有出现在任何来自仅女性数据的生物标志物组的任何前模型中，但当年龄包含在分析中时，这两个标志物在六个至十个生物标志物组中都很突出。
图3-1和3-2示出了描绘单个生物标志物(当不考虑年龄时)在前100个模型(或在95％特异性下产生≥75％灵敏度的前模型)中出现的频率的图表，这些模型是基于含有五种至十种生物标志物的生物标志物组的仅女性数据开发的。图4-1和4-2示出了描绘单个生物标志物(当考虑年龄时)在前100个模型(或在95％特异性下产生≥75％灵敏度的前模型)中表示的频率的图表，这些模型是基于含有五种至十种生物标志物的生物标志物组的仅女性数据开发的。
对于仅基于女性数据的模型，无论年龄是否包含在内，M2PK都存在于所有数字类别的所有高性能模型中。BDNF存在于五种至十种生物标志物组合中≥80％的高性能生物标志物组中，无论建模中是否包含年龄。在三个和四个生物标志物组中，不考虑年龄，BDNF仍然是第二常见的生物标志物。对于八种至十种生物标志物的仅女性生物标志物组合，包含MMP1、M65和IL8的独立于年龄的其它突出生物标志物(在这一更广泛的高性能模型选择中存在>50％)。当包含年龄项时，脂质运载蛋白和IGFBP2也表示在这些高性能组的50％中。对于四个至七个生物标志物组，IL8仍然很突出。MMP1也是更常见的生物标志物之一，尽管在三种至五种生物标志物组中其频率降至50％以下。在三个和四个生物标志物组中，IL6在≥20％的高性能组中表示出来，无论建模中是否包含年龄。
表43至51示出了基于仅男性数据开发的两种至十种生物标志物的前十种生物标志物组合的实例。表52至60示出了当也考虑年龄时基于仅男性数据开发的两种至十种生物标志物的前十种生物标志物组合的实例。
表43在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的十种生物标志物组合。
表44在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的九种生物标志物组合。
表45在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的八种生物标志物组合。
表46在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的七种生物标志物组合。
表47在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的六种生物标志物组合。
表48在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的五种生物标志物组合。
表49在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的四种生物标志物组合。
BM1 BM2 BM3 BM4 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK DKK3 TIMP1 76.6
BDNF M2PK IL8 TNFα 73.8
BDNF M2PK IGFBP2 TNFα 72
BDNF M2PK IL8 IGFBP2 72
BDNF M2PK DKK3 TNFα 71
BDNF M2PK IL8 MMP7 70.8
BDNF M2PK DKK3 M65 70.8
BDNF M2PK DKK3 IL8 70.1
BDNF M2PK DKK3 IGFBP2 70.1
BDNF M2PK MIP1B TIMP1 69.2
表50在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的三种生物标志物组合。
BM1 BM2 BM3 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK TNFα 69.2
BDNF M2PK TIMP1 69.2
BDNF M2PK IL8 68.2
BDNF M2PK TGFβ1 62.3
BDNF M2PK MMP7 62.3
BDNF M2PK IL13 58.9
BDNF M2PK IGFII 58.9
BDNF M2PK IGFBP2 58.9
BDNF M2PK MAC2BP 57.9
BDNF M2PK 脂质运载蛋白 57.9
表51在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的两种生物标志物组合。
BM1 BM2 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK 52.3
表52在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的十种生物标志物组合加上年龄。
表53在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的九种生物标志物组合加上年龄。
表54在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的八种生物标志物组合加上年龄。
表55在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的七种生物标志物组合加上年龄。
表56在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的六种生物标志物组合加上年龄。
表57在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的五种生物标志物组合加上年龄。
BM1 BM2 BM3 BM4 BM5 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK DKK3 M65 TNFα 79.2
BDNF M2PK DKK3 TIMP1 MMP7 77.4
BDNF M2PK DKK3 M65 MMP7 77.1
BDNF M2PK IL8 IL13 TNFα 76.6
BDNF M2PK DKK3 IGFBP2 TNFα 76.6
BDNF M2PK DKK3 TIMP1 MAC2BP 76.6
BDNF M2PK DKK3 TIMP1 IGFII 76.6
BDNF M2PK DKK3 MIP1B TNFα 75.7
BDNF M2PK DKK3 TIMP1 MIP1B 75.7
BDNF M2PK DKK3 TIMP1 IL13 75.7
表58在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的四种生物标志物组合加上年龄。
BM1 BM2 BM3 BM4 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK TNFα IGFBP2 75.7
BDNF M2PK TIMP1 DKK3 75.7
BDNF M2PK TNFα IL8 74.8
BDNF M2PK IL8 DKK3 72
BDNF M2PK TNFα DKK3 71
BDNF M2PK IL8 TIMP1 71
BDNF M2PK IGFII IGFBP2 71
BDNF M2PK IL8 MMP7 70.8
BDNF M2PK M65 DKK3 69.8
BDNF M2PK TNFα MIP1B 69.2
表59在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的三种生物标志物组合加上年龄。
BM1 BM2 BM3 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK IL8 68.2
表60在95％特异性下包含BDNF并区分结直肠癌受试者(男性)和对照的两种生物标志物组合加上年龄。
BM1 BM2 交叉验证的灵敏度(％)
BDNF M2PK 57.9
将表7至15(性别组合，仅生物标志物)与表43至51(男性，仅生物标志物)进行比较，基于性别组合数据开发的模型与基于仅男性数据开发的模型两者的性能差异最小。在建模包含年龄的情况下也观察到了这种模式(表16至24与表52至60相比)。男性的这些结果与仅基于女性数据建立的模型获得的类似结果形成了显著对比。
对表43至51和52至60的考虑表明，通常，无论年龄是否包含在计算中，当组含有更高数量的生物标志物时，基于仅男性受试者的数据开发的表现最好的模型组在95％特异性下实现了更高的灵敏度值。正如针对性别组合所观察到的，在使用仅男性数据获得的范围为从两种至十种相邻生物标志物大小类别之间，使用表现最好的模型实现的灵敏度存在重叠。当在仅使用男性数据进行的建模中包含年龄项时，没有观察到灵敏度的改善。
对于建立在男性和女性组合数据基础上的模型，对于仅由男性开发的模型，每个生物标志物数字类别中表现最好的组的生物标志物组成在包含和不包含年龄的模型之间有所不同。唯一的例外是五个生物标志物组，其中前模型在存在和不存在年龄的情况下具有相同的生物标志物组成。然而，在每个生物标志物数字类别中，在加上和减去年龄的表现最好的模型中，关键生物标志物仍然具有很强的保守性。特别地，BDNF和M2PK存在于所有前模型中。DKK3和TNFα在大多数生物标志物组合中都很突出，而IL8和TIMP1也很常见。IGFBP2仅在五种生物标志物组合中的仅生物标志物的前模型中表示，但在包含四种、七种、九种和十种生物标志物组合的年龄的前模型中出现。
图5-1和5-2示出了描绘单个生物标志物在前100个模型(或在95％特异性下产生≥75％灵敏度的前模型)中表示的频率的图表，这些模型是基于五种至十种生物标志物的组的仅男性数据开发的。图6-1和6-2示出了描绘单个生物标志物(当考虑年龄时)在前100个模型(或在95％特异性下产生≥75％灵敏度的前模型)中表示的频率的图表，这些模型是基于含有五种至十种生物标志物的生物标志物组的仅男性数据开发的。
对于仅男性数据的模型，无论年龄是否包含在内，M2PK都存在于所有生物标志物数字类别的所有高性能模型中。与建立在类似性别组合和仅女性数据集上的模型不同，在仅男性的模型中，DKK3是第二个最普遍的标志物，在这一更广泛的高性能模型选择中，在七种至十种生物标志物组合的所有组中都存在，并且在所有模型的80％以上都存在四种至六种生物标志物组合，无论其是否包含年龄。BDNF以八种至十种生物标志物组合存在于所有模型中，在高性能的七个生物标志物组中超过90％，并且在六个生物标志物组合中超过50％。尽管在四种和五种生物标志物组合中，BDNF的频率降至50％以下，但BDNF仍稳定在第二级生物标志物频率内。TNFα在高性能的六种至十种生物标志物组合中普遍存在，并且在五种生物标志物组合中仍然是一种可靠的二级标志物。IGFBP2在七种至十种生物标志物组合的高性能模型中也很普遍，但在三种至六种生物标志物组合中其代表性显著下降。相比之下，TGFβ1是七个至十个生物标志物组中表现最好的模型的次要贡献者，成为四个至六个高性能生物标志物组的主要贡献者，成为四个至五个生物标志物组中第三个最常出现的标志物。
对于男性，没有两种生物标志物组合(有或没有年龄)可以区分来自男性的病例和对照血清，其中在95％特异性下灵敏度>75％。对于男性来说，包含BDNF(当不考虑年龄时)在内的最佳配对组合是M2PK+BDNF——灵敏度52.3％。对于男性来说，包含BDNF(当包含年龄时)在内的最佳配对组合是M2PK+BDNF——灵敏度57.9％。
实例5其它高性能生物标志物组合
本文描述的方法、用途等也可以使用表61至66中提供的一种或多种或所有生物标志物组合。在这些表格中，灵敏度＝平均交叉验证的灵敏度。
表61在95％特异性下可以用于区分结直肠癌受试者(两种性别，年龄未考虑)和对照的前20、7种至3种生物标志物组合。
/>
表62在95％特异性下可以用于区分结直肠癌受试者(两种性别，年龄也包含在分析中)和对照的前20、7种至3种生物标志物组合。
/>
表63在95％特异性下可以用于区分结直肠癌受试者(仅女性，年龄未考虑)和对照的前20、7种至3种生物标志物组合。
/>
表64在95％特异性下可以用于区分结直肠癌受试者(仅女性，年龄也包含在分析中)和对照的前20、7种至3种生物标志物组合。
/>
/>
表65在95％特异性下可以用于区分结直肠癌受试者(仅男性，年龄未考虑)和对照的前20、7种至3种生物标志物组合。
/>
表66在95％特异性下可以用于区分结直肠癌受试者(仅男性，年龄也包含在分析中)和对照的前20、7种至3种生物标志物组合。
/>
/>
实例6五个生物标志物组的性能(研究9)
为了检验基于血液的五个生物标志物组在CRC早期检测中的潜在效用，并检验其在CRC筛查中对患有CRC的正常风险的无症状人群的潜在应用，首先进行了一项病例/对照研究，以确定包括M2PK、BDNF、IGFBP2、TIMP1和DKK3的示例性五个生物标志物组的性能特性。
此类组在许多情况下可能是有用的：作为当前FIT或结肠镜检查筛选的辅助手段，为无法或不愿使用粪便测试进行结直肠癌测试的人提供替代测试；作为另外的的测试，以便于对FIT结果呈阳性的人进行结肠镜检查的分诊，或者可能作为一线CRC筛选应用中FIT的替代。因此，将五个生物标志物组的性能与FIT的性能进行比较是重要的，特别是当应用于无症状、正常风险的筛查人群时，测试的相对阳性和阴性预测值。
方法
研究群体
表67队列1和队列2的研究群体。
CRC＝结直肠癌
队列1由349个样品构成，并且队列2包括94个样品。*三个样品是0期癌症并且不包含在TMN分期计数中。
样品和量化
本研究在2018年至2021年期间采集的血清样品来源于维多利亚癌症生物库，或商业来源于ProteoGenex公司(ProteoGenex)(美国加利福尼亚州英格尔伍德(Inglewood,CA,USA)ProteoGenex公司)。研究方案由癌症理事会维多利亚人类研究伦理委员会(CancerCouncil Victoria Human Research Ethics Committee)(HREC-1803)和俄罗斯肿瘤研究中心伦理委员会(Russian Oncological Research Center Ethics Committee)(IRB PG-ONC 2003/1)通过ProteoGenex公司批准。
M2PK、BDNF、IGFBP2、TIMP1和DKK3的浓度在来自两个独立的CRC病例/健康正常对照队列的血清样品中进行定量，其特性如表67所述。ELISA用于测量生物标志物的浓度。通过本文所述的算法将生物标志物浓度与年龄、性别或BMI数据相结合，以提供结直肠癌可能性评分。在本实例中，女性被赋1.1的任意值，并且男性被赋1的任意值。预计评分超过规定阈值的人将由其医疗专业人员建议进行结肠镜检查，以获得最终诊断。评分低于阈值的人将被建议在两年时间后再次进行筛查。
生物标志物组培训和测试
在基于逻辑回归的算法的训练和测试中，使用了两个队列的样品浓度，其中添加了年龄和性别。在推导这些方程时，蛋白质生物标志物浓度被对数10转换。为女性分配的生物标志物值为1.0，并且男性的值为1.1。年龄是用年来表示的。身体质量指数值是根据参与者的身高和体重测量结构计算得出的，推导出包含BMI在内的算法。对具有100次重采样和1000次迭代的经过置乱的数据应用训练测试分流(分流比为60:40、70:30、80:20、90:10和100:100)和K倍交叉验证(K＝5、10)方法，以生成包括所考虑的五种至八种参数组的算法。培训、测试和验证方法应用于两种不同的方法(图7)。
·一个队列使用训练测试分流或k倍交叉验证进行分流，以创建训练和测试子集。然后在第二个队列中验证得到的算法。
·一个队列以其整体被用来训练算法，然后在第二个队列上对所述算法进行测试。
使用基于python的集成开发环境PyCharm(X版，JetBrains，Prague 4，捷克共和国布拉格(Prague,Czech Republic))和数字计算环境MATLAB(2021b版，MathWorks，美国马萨诸塞州纳蒂克(Natick,MA,USA))对数据进行逻辑回归和模糊逻辑分析。
算法选择
在队列1中训练和样本测试的算法在队列2中测试。基于性能(在95％特异性下训练和测试灵敏度高于73％的性能目标)、性能置信度、稳健性(数据集之间的可转移性)和训练数据集大小来选择表现最好的算法。对于表现最好的算法灵敏度，手动计算置信度为95％的Wilson评分区间，其中真阳性数(灵敏度)表示为二项式分布((E.B.Wilson,“概率推理、继承定律和统计推理(Probable inference,the law of succession,andstatistical inference),”《美国统计协会杂志(Journal of the American StatisticalAssociation)》,第22卷,第158期,第209–212页,1927)。73％的性能目标是使用20ug Hb/g的截止值基于对FIT的元分析选择的(K.Selby等人,“性别、年龄和阳性阈值对粪便免疫化学试验准确性的影响：系统综述和元分析(Effect of sex,age,and positivitythreshold on fecal immunochemical test accuracy:a systematic review and meta-analysis),”《胃肠病学》,第157卷,第6期,第1494–1505页,2019)。表现最好的算法的结果如下所示。
结果
结直肠癌(CRC)和对照患者血清中测量的单个生物标志物的性能
单独考虑，队列1中CRC和对照血清样品中五种生物标志物的水平均存在显著差异(表68)。CRC患者血清中M2PK、IGFBP2和TIMP1的水平相对于对照升高，而BDNF和DKK3的水平相对于对照降低。在较小的队列2中，观察到癌症和对照血清中M2PK、IGFBP2和TIMP1生物标志物浓度的显著差异，而DKK3接近显著性。
表68癌症和对照患者血清中测量的单个蛋白质生物标志物的浓度(中值和范围)。
使用非参数Wilcoxon秩和检验确定的P值。
当单独考虑时，M2PK在癌症和对照之间的区分最好，其中在队列1和2中的最小P值分别为8.30e-06和5.46e-009。IGFBP2是第二好的，其中在队列1和2中的P值分别为4.68e-023和1.03e-006。病例和对照之间的DKK3在队列1中的差异最低(P＝0.0049)，而BDNF在队列2中的差异最低(P＝0.3041)，这可能是该队列规模较小的结果。然而，基于ROC分析，这些标志物在病例和对照之间没有单独区分，具有足够的准确性以用于CRC的临床早期检测。
生物标志物组性能
为了确定这五种(M2PK、DKK3、IGFBP2、TIMP1和BDNF)生物标志物在与年龄、性别或身体质量指数(BMI)结合时是否可以有效地区分CRC患者和对照的样品，诸位发明人应用了逻辑回归和接受者-操作者特性(ROC)曲线分析。
如本文所述，在来自队列1的数据进行训练的将生物标志物浓度与年龄和性别的另外的术语组合的高性能算法，以高灵敏度和特异性区分病例和对照样品。然后，使用80/20分流、训练/测试方法的多次迭代，在样品中对领先算法进行交叉验证。选择并锁定在ROC分析中产生最高交叉验证的灵敏度和特异性的算法(ROC平面中最接近-(0,1)角的点)。包含在这些锁定参数中的是阈值，超过该阈值测试结果被认为是阳性，并且低于该阈值测试被评分为阴性。然后在完全独立的数据集上测试该算法(队列2)。对于每个分析，确定ROC曲线下的面积。确定锁定阈值下的灵敏度和特异性值，以及阳性和阴性预测值。
结果如下：
在这些不同的训练和测试操作中，灵敏度值的微小明显变化在统计学上并不显著。此外，灵敏度和特异性值与澳大利亚NBCSP试点研究中观察到的FIT值具有高度竞争力，该研究在50岁至69岁的无症状的正常CRC风险人群中进行。
将上述五种蛋白质加上年龄和性别分类器的灵敏度和特异性值映射到一百万CRC患病率为0.00264的参与者的理论正常CRC风险筛查人群(澳大利亚卫生与福利研究所2014)。国家肠癌筛查计划的肠癌结果分析目录号CAN 87.堪培拉:AIHW)允许计算筛查人群中预期的理论阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。表69示出了这些值与澳大利亚国家肠癌筛查计划FIT人群筛查中观察到的等效值的比较。
表69FIT和预测ColoSTAT性能在CRC人群筛查中的比较
*根据病例/对照研究确定的值。
表69中的结果显示，包含BDNF、M2PK、IGFBP2、TIMP1和DKK3的五个生物标志物组的性能参数，加上年龄和性别，与FIT相比有显著改善，这表明应用于无症状的正常CRC风险筛查人群时具有很强的潜在效用。
如本领域技术人员所理解的，虽然本实例是通过五个蛋白质生物标志物组(M2PK、BDNF、IGFBP2、TIMP1和IGFBP2)加上年龄和性别的人口统计学指标的量化来实现的，但是单独使用五个蛋白质生物标志物组、仅结合年龄和仅结合性别也可以预期类似的强性能。此外，本领域技术人员将理解，将一个或多个人口统计学术语添加或替换为其它人口统计学或形态测量学术语，包含但不限于吸烟史、身体质量指数(BMI)和臀腰比，也有望提供与FIT高度竞争的强性能测试。
下面的结果表支持这一理解。描述了5种蛋白质生物标志物的灵敏度和特异性数据，包括单独的BDNF、M2PK、IGFBP2、TIMP1和DKK3，以及其它人口统计学和形态测量学生物标志物，包含受试者的年龄、性别和BMI(身体质量指数值根据参与者的身高和体重测量结果计算)。出于性别考虑，女性被赋1.1的任意值，并且男性被赋1的任意值。
参考下表，BM1是指PKM2肿瘤形式；BM2＝TIMP1；BM3＝IGFBP2；BM4＝DKK3并且BM5＝BDNF。
表70每个模型的平均性能。
[Std]表示平均值的标准偏差。
所有“测试”结果均考虑所有样品(即不排除任何样品)。第二和第三列中的灵敏度和特异性值是在ROC曲线和(0,1)点之间的欧几里得距离最小的点处测量的。第四、第五和第六列中表示的灵敏度已在阈值下确定，导致95％的特异性。
综述
所检查的所有生物标志物组类别都表现出强烈的癌症/健康对照区分性能。将5种蛋白质生物标志物与BMI组合似乎在平均特异性方面表现最好。然而，从统计学上讲，包括单独的5种蛋白质生物标志物、5种蛋白质生物标志物标志物加上年龄、5种蛋白质生物标志物加上性别、5种蛋白质生物标志物加上年龄加上性别、5种蛋白质生物标志物加上年龄加上性别加上BMI和5种蛋白质生物标志物加上BMI的组似乎是相当的。
应该注意的是，在这项特定的研究中，年龄和性别的影响可能被低估了。在这些队列中，病例和对照样品的匹配度比预期的更高，无论是在前瞻性招募的有临床症状的患者中，还是在50岁至74岁的无症状的正常风险的CRC筛查人群中。然而，重要的是，这些结果指示，可以单独或与一系列另外的人口统计学和/或形态测量学参数组合使用这种五蛋白生物标志物组来开发有用的生物标志物组和算法。
本领域的技术人员将理解的是，在不脱离广泛描述的本发明的范围的情况下，可以对如在特定实施例中示出的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本发明的实施例应被视为在所有方面都是说明性而非限制性的。
本文所讨论和/或引用的所有公开以其整体并入本文。
关于已包含在本说明书中的文件、法令、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是出于为本发明提供上下文的目的。这不应视为承认任何或所有这些事项形成现有技术基础的一部分，或者是与本发明相关的领域中的公知常识，因为其在本申请的每个权利要求的优先权日期之前就已经存在。
序列表
<110> 视觉技术生物有限公司（VisionTech Bio Pty Ltd）
<120> 结直肠癌的生物标志物
<130> 532236PCT
<150> AU 2021901164
<151> 2021-04-20
<160> 21
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
<211> 99
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
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Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe
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Leu Leu Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ser Gly
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Gly Gly Gly Gly Ala Arg Ala Glu Val Leu Phe Arg Cys Pro Pro Cys
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Met Ser Lys Pro His Ser Glu Ala Gly Thr Ala Phe Ile Gln Thr Gln
1 5 10 15
Gln Leu His Ala Ala Met Ala Asp Thr Phe Leu Glu His Met Cys Arg
20 25 30
Leu Asp Ile Asp Ser Pro Pro Ile Thr Ala Arg Asn Thr Gly Ile Ile
35 40 45
Cys Thr Ile Gly Pro Ala Ser Arg Ser Val Glu Thr Leu Lys Glu Met
50 55 60
Ile Lys Ser Gly Met Asn Val Ala Arg Leu Asn Phe Ser His Gly Thr
65 70 75 80
His Glu Tyr His Ala Glu Thr Ile Lys Asn Val Arg Thr Ala Thr Glu
85 90 95
Ser Phe Ala Ser Asp Pro Ile Leu Tyr Arg Pro Val Ala Val Ala Leu
100 105 110
Asp Thr Lys Gly Pro Glu Ile Arg Thr Gly Leu Ile Lys Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Glu Val Glu Leu Lys Lys Gly Ala Thr Leu Lys Ile Thr Leu
130 135 140
Asp Asn Ala Tyr Met Glu Lys Cys Asp Glu Asn Ile Leu Trp Leu Asp
145 150 155 160
Tyr Lys Asn Ile Cys Lys Val Val Glu Val Gly Ser Lys Ile Tyr Val
165 170 175
Asp Asp Gly Leu Ile Ser Leu Gln Val Lys Gln Lys Gly Ala Asp Phe
180 185 190
Leu Val Thr Glu Val Glu Asn Gly Gly Ser Leu Gly Ser Lys Lys Gly
195 200 205
Val Asn Leu Pro Gly Ala Ala Val Asp Leu Pro Ala Val Ser Glu Lys
210 215 220
Asp Ile Gln Asp Leu Lys Phe Gly Val Glu Gln Asp Val Asp Met Val
225 230 235 240
Phe Ala Ser Phe Ile Arg Lys Ala Ser Asp Val His Glu Val Arg Lys
245 250 255
Val Leu Gly Glu Lys Gly Lys Asn Ile Lys Ile Ile Ser Lys Ile Glu
260 265 270
Asn His Glu Gly Val Arg Arg Phe Asp Glu Ile Leu Glu Ala Ser Asp
275 280 285
Gly Ile Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Ile Glu Ile Pro Ala Glu
290 295 300
Lys Val Phe Leu Ala Gln Lys Met Met Ile Gly Arg Cys Asn Arg Ala
305 310 315 320
Gly Lys Pro Val Ile Cys Ala Thr Gln Met Leu Glu Ser Met Ile Lys
325 330 335
Lys Pro Arg Pro Thr Arg Ala Glu Gly Ser Asp Val Ala Asn Ala Val
340 345 350
Leu Asp Gly Ala Asp Cys Ile Met Leu Ser Gly Glu Thr Ala Lys Gly
355 360 365
Asp Tyr Pro Leu Glu Ala Val Arg Met Gln His Leu Ile Ala Arg Glu
370 375 380
Ala Glu Ala Ala Met Phe His Arg Lys Leu Phe Glu Glu Leu Val Arg
385 390 395 400
Ala Ser Ser His Ser Thr Asp Leu Met Glu Ala Met Ala Met Gly Ser
405 410 415
Val Glu Ala Ser Tyr Lys Cys Leu Ala Ala Ala Leu Ile Val Leu Thr
420 425 430
Glu Ser Gly Arg Ser Ala His Gln Val Ala Arg Tyr Arg Pro Arg Ala
435 440 445
Pro Ile Ile Ala Val Thr Arg Asn Pro Gln Thr Ala Arg Gln Ala His
450 455 460
Leu Tyr Arg Gly Ile Phe Pro Val Leu Cys Lys Asp Pro Val Gln Glu
465 470 475 480
Ala Trp Ala Glu Asp Val Asp Leu Arg Val Asn Phe Ala Met Asn Val
485 490 495
Gly Lys Ala Arg Gly Phe Phe Lys Lys Gly Asp Val Val Ile Val Leu
500 505 510
Thr Gly Trp Arg Pro Gly Ser Gly Phe Thr Asn Thr Met Arg Val Val
515 520 525
Pro Val Pro
530
<210> 6
<211> 531
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Met Ser Lys Pro His Ser Glu Ala Gly Thr Ala Phe Ile Gln Thr Gln
1 5 10 15
Gln Leu His Ala Ala Met Ala Asp Thr Phe Leu Glu His Met Cys Arg
20 25 30
Leu Asp Ile Asp Ser Pro Pro Ile Thr Ala Arg Asn Thr Gly Ile Ile
35 40 45
Cys Thr Ile Gly Pro Ala Ser Arg Ser Val Glu Thr Leu Lys Glu Met
50 55 60
Ile Lys Ser Gly Met Asn Val Ala Arg Leu Asn Phe Ser His Gly Thr
65 70 75 80
His Glu Tyr His Ala Glu Thr Ile Lys Asn Val Arg Thr Ala Thr Glu
85 90 95
Ser Phe Ala Ser Asp Pro Ile Leu Tyr Arg Pro Val Ala Val Ala Leu
100 105 110
Asp Thr Lys Gly Pro Glu Ile Arg Thr Gly Leu Ile Lys Gly Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Glu Val Glu Leu Lys Lys Gly Ala Thr Leu Lys Ile Thr Leu
130 135 140
Asp Asn Ala Tyr Met Glu Lys Cys Asp Glu Asn Ile Leu Trp Leu Asp
145 150 155 160
Tyr Lys Asn Ile Cys Lys Val Val Glu Val Gly Ser Lys Ile Tyr Val
165 170 175
Asp Asp Gly Leu Ile Ser Leu Gln Val Lys Gln Lys Gly Ala Asp Phe
180 185 190
Leu Val Thr Glu Val Glu Asn Gly Gly Ser Leu Gly Ser Lys Lys Gly
195 200 205
Val Asn Leu Pro Gly Ala Ala Val Asp Leu Pro Ala Val Ser Glu Lys
210 215 220
Asp Ile Gln Asp Leu Lys Phe Gly Val Glu Gln Asp Val Asp Met Val
225 230 235 240
Phe Ala Ser Phe Ile Arg Lys Ala Ser Asp Val His Glu Val Arg Lys
245 250 255
Val Leu Gly Glu Lys Gly Lys Asn Ile Lys Ile Ile Ser Lys Ile Glu
260 265 270
Asn His Glu Gly Val Arg Arg Phe Asp Glu Ile Leu Glu Ala Ser Asp
275 280 285
Gly Ile Met Val Ala Arg Gly Asp Leu Gly Ile Glu Ile Pro Ala Glu
290 295 300
Lys Val Phe Leu Ala Gln Lys Met Met Ile Gly Arg Cys Asn Arg Ala
305 310 315 320
Gly Lys Pro Val Ile Cys Ala Thr Gln Met Leu Glu Ser Met Ile Lys
325 330 335
Lys Pro Arg Pro Thr Arg Ala Glu Gly Ser Asp Val Ala Asn Ala Val
340 345 350
Leu Asp Gly Ala Asp Cys Ile Met Leu Ser Gly Glu Thr Ala Lys Gly
355 360 365
Asp Tyr Pro Leu Glu Ala Val Arg Met Gln His Leu Ile Ala Arg Glu
370 375 380
Ala Glu Ala Ala Met Phe His Arg Lys Leu Phe Glu Glu Leu Val Arg
385 390 395 400
Ala Ser Ser His Ser Thr Asp Leu Met Glu Ala Met Ala Met Gly Ser
405 410 415
Val Glu Ala Ser Tyr Lys Cys Leu Ala Ala Ala Leu Ile Val Leu Thr
420 425 430
Glu Ser Gly Arg Ser Ala His Gln Val Ala Arg Tyr Arg Pro Arg Ala
435 440 445
Pro Ile Ile Ala Val Thr Arg Asn Pro Gln Thr Ala Arg Gln Ala His
450 455 460
Leu Tyr Arg Gly Ile Phe Pro Val Leu Cys Lys Asp Pro Val Gln Glu
465 470 475 480
Ala Trp Ala Glu Asp Val Asp Leu Arg Val Asn Phe Ala Met Asn Val
485 490 495
Gly Lys Ala Arg Gly Phe Phe Lys Lys Gly Asp Val Val Ile Val Leu
500 505 510
Thr Gly Trp Arg Pro Gly Ser Gly Phe Thr Asn Thr Met Arg Val Val
515 520 525
Pro Val Pro
530
<210> 7
<211> 146
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
Met His Pro Leu Leu Asn Pro Leu Leu Leu Ala Leu Gly Leu Met Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly Phe Ala
20 25 30
Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu
35 40 45
Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly
50 55 60
Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala
65 70 75 80
Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr
85 90 95
Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln
100 105 110
Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe
115 120 125
Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Gln
130 135 140
Phe Asn
145
<210> 8
<211> 350
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val
20 25 30
Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn
35 40 45
Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Met Glu Asp Thr Gln His Lys
50 55 60
Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn
85 90 95
Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His
100 105 110
Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Thr Gly Gln Met Val Phe
115 120 125
Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser
130 135 140
His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln
145 150 155 160
Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met
165 170 175
Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp
180 185 190
Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys
195 200 205
Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg
210 215 220
Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu
225 230 235 240
Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu
245 250 255
Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu
260 265 270
Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe
275 280 285
Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val
290 295 300
Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu
305 310 315 320
Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Arg Glu
325 330 335
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile
340 345 350
<210> 9
<211> 350
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val
20 25 30
Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn
35 40 45
Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Met Glu Asp Thr Gln His Lys
50 55 60
Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn
85 90 95
Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His
100 105 110
Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Thr Gly Gln Met Val Phe
115 120 125
Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser
130 135 140
His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln
145 150 155 160
Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met
165 170 175
Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp
180 185 190
Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys
195 200 205
Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg
210 215 220
Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu
225 230 235 240
Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu
245 250 255
Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu
260 265 270
Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe
275 280 285
Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val
290 295 300
Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu
305 310 315 320
Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Arg Glu
325 330 335
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile
340 345 350
<210> 10
<211> 350
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1 5 10 15
Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val
20 25 30
Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn
35 40 45
Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Met Glu Asp Thr Gln His Lys
50 55 60
Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys
65 70 75 80
Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn
85 90 95
Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His
100 105 110
Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Thr Gly Gln Met Val Phe
115 120 125
Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser
130 135 140
His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln
145 150 155 160
Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met
165 170 175
Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp
180 185 190
Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys
195 200 205
Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg
210 215 220
Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu
225 230 235 240
Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu
245 250 255
Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu
260 265 270
Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe
275 280 285
Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val
290 295 300
Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu
305 310 315 320
Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Arg Glu
325 330 335
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile
340 345 350
<210> 11
<211> 92
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Met Lys Leu Cys Val Thr Val Leu Ser Leu Leu Met Leu Val Ala Ala
1 5 10 15
Phe Cys Ser Pro Ala Leu Ser Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr
20 25 30
Ala Cys Cys Phe Ser Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val
35 40 45
Val Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val
50 55 60
Phe Gln Thr Lys Arg Ser Lys Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu Ser
65 70 75 80
Trp Val Gln Glu Tyr Val Tyr Asp Leu Glu Leu Asn
85 90
<210> 12
<211> 390
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr
20 25 30
Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala
35 40 45
Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser
50 55 60
Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu
85 90 95
Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu
100 105 110
Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr
115 120 125
His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val
130 135 140
Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu
145 150 155 160
Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn
165 170 175
Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser
180 185 190
Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu
195 200 205
Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser
210 215 220
Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr
225 230 235 240
Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro
245 250 255
Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln
260 265 270
Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser
275 280 285
Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys
290 295 300
Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn
305 310 315 320
Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr
325 330 335
Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala
340 345 350
Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr
355 360 365
Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val
370 375 380
Arg Ser Cys Lys Cys Ser
385 390
<210> 13
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Met Ala Pro Phe Glu Pro Leu Ala Ser Gly Ile Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Ile Ala Pro Ser Arg Ala Cys Thr Cys Val Pro Pro His Pro Gln
20 25 30
Thr Ala Phe Cys Asn Ser Asp Leu Val Ile Arg Ala Lys Phe Val Gly
35 40 45
Thr Pro Glu Val Asn Gln Thr Thr Leu Tyr Gln Arg Tyr Glu Ile Lys
50 55 60
Met Thr Lys Met Tyr Lys Gly Phe Gln Ala Leu Gly Asp Ala Ala Asp
65 70 75 80
Ile Arg Phe Val Tyr Thr Pro Ala Met Glu Ser Val Cys Gly Tyr Phe
85 90 95
His Arg Ser His Asn Arg Ser Glu Glu Phe Leu Ile Ala Gly Lys Leu
100 105 110
Gln Asp Gly Leu Leu His Ile Thr Thr Cys Ser Phe Val Ala Pro Trp
115 120 125
Asn Ser Leu Ser Leu Ala Gln Arg Arg Gly Phe Thr Lys Thr Tyr Thr
130 135 140
Val Gly Cys Glu Glu Cys Thr Val Phe Pro Cys Leu Ser Ile Pro Cys
145 150 155 160
Lys Leu Gln Ser Gly Thr His Cys Leu Trp Thr Asp Gln Leu Leu Gln
165 170 175
Gly Ser Glu Lys Gly Phe Gln Ser Arg His Leu Ala Cys Leu Pro Arg
180 185 190
Glu Pro Gly Leu Cys Thr Trp Gln Ser Leu Arg Ser Gln Ile Ala
195 200 205
<210> 14
<211> 212
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro
20 25 30
Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr
35 40 45
Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile
50 55 60
Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser
65 70 75 80
Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala
85 90 95
Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu
100 105 110
Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr
115 120 125
Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln
130 135 140
Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn
145 150 155 160
Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu
165 170 175
Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His
180 185 190
Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala
195 200 205
Leu Arg Gln Met
210
<210> 15
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 16
<211> 155
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 16
Tyr Arg Pro Ser Glu Thr Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val Asp Thr Leu
1 5 10 15
Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg Pro Ala Ser
20 25 30
Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Phe Arg
35 40 45
Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr Pro Ala Lys
50 55 60
Ser Glu Arg Asp Val Ser Thr Pro Pro Thr Val Leu Pro Asp Asn Phe
65 70 75 80
Pro Arg Tyr Pro Val Gly Lys Phe Phe Gln Tyr Asp Thr Trp Lys Gln
85 90 95
Ser Thr Gln Arg Leu Arg Arg Gly Leu Pro Ala Leu Leu Arg Ala Arg
100 105 110
Arg Gly His Val Leu Ala Lys Glu Leu Glu Ala Phe Arg Glu Ala Lys
115 120 125
Arg His Arg Pro Leu Ile Ala Leu Pro Thr Gln Asp Pro Ala His Gly
130 135 140
Gly Ala Pro Pro Glu Met Ala Ser Asn Arg Lys
145 150 155
<210> 17
<211> 178
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 17
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile
65 70 75 80
Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn
85 90 95
Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly
<210> 18
<211> 429
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Ser Phe Thr Thr Arg Ser Thr Phe Ser Thr Asn Tyr Arg Ser Leu Gly
1 5 10 15
Ser Val Gln Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Arg Pro Val Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Ser Val Tyr Ala Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Arg Ile Ser Val Ser
35 40 45
Arg Ser Thr Ser Phe Arg Gly Gly Met Gly Ser Gly Gly Leu Ala Thr
50 55 60
Gly Ile Ala Gly Gly Leu Ala Gly Met Gly Gly Ile Gln Asn Glu Lys
65 70 75 80
Glu Thr Met Gln Ser Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp Arg
85 90 95
Val Arg Ser Leu Glu Thr Glu Asn Arg Arg Leu Glu Ser Lys Ile Arg
100 105 110
Glu His Leu Glu Lys Lys Gly Pro Gln Val Arg Asp Trp Ser His Tyr
115 120 125
Phe Lys Ile Ile Glu Asp Leu Arg Ala Gln Ile Phe Ala Asn Thr Val
130 135 140
Asp Asn Ala Arg Ile Val Leu Gln Ile Asp Asn Ala Arg Leu Ala Ala
145 150 155 160
Asp Asp Phe Arg Val Lys Tyr Glu Thr Glu Leu Ala Met Arg Gln Ser
165 170 175
Val Glu Asn Asp Ile His Gly Leu Arg Lys Val Ile Asp Asp Thr Asn
180 185 190
Ile Thr Arg Leu Gln Leu Glu Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys Glu Glu
195 200 205
Leu Leu Phe Met Lys Lys Asn His Glu Glu Glu Val Lys Gly Leu Gln
210 215 220
Ala Gln Ile Ala Ser Ser Gly Leu Thr Val Glu Val Asp Ala Pro Lys
225 230 235 240
Ser Gln Asp Leu Ala Lys Ile Met Ala Asp Ile Arg Ala Gln Tyr Asp
245 250 255
Glu Leu Ala Arg Lys Asn Arg Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Trp Ser Gln
260 265 270
Gln Ile Glu Glu Ser Thr Thr Val Val Thr Thr Gln Ser Ala Glu Val
275 280 285
Gly Ala Ala Glu Thr Thr Leu Thr Glu Leu Arg Arg Thr Val Gln Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Asp Leu Asp Ser Met Arg Asn Leu Lys Ala Ser Leu Glu
305 310 315 320
Asn Ser Leu Arg Glu Val Glu Ala Arg Tyr Ala Leu Gln Met Glu Gln
325 330 335
Leu Asn Gly Ile Leu Leu His Leu Glu Ser Glu Leu Ala Gln Thr Arg
340 345 350
Ala Glu Gly Gln Arg Gln Ala Gln Glu Tyr Glu Ala Leu Leu Asn Ile
355 360 365
Lys Val Lys Leu Glu Ala Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Arg Leu Leu Glu
370 375 380
Asp Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp Ser Ser Asn Ser
385 390 395 400
Met Gln Thr Ile Gln Lys Thr Thr Thr Arg Arg Ile Val Asp Gly Lys
405 410 415
Val Val Ser Glu Thr Asn Asp Thr Lys Val Leu Arg His
420 425
<210> 19
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys
20 25 30
Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val
35 40 45
Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu
50 55 60
Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys
85 90 95
Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser
100 105 110
Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu
115 120 125
Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu
165 170 175
Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr
180 185 190
Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Arg Gly Arg
225
<210> 20
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 20
Phe Pro Ala Thr Leu Glu Thr Gln Glu Gln Asp Val Asp Leu Val Gln
1 5 10 15
Lys Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn Leu Lys Asn Asp Gly Arg Gln Val
20 25 30
Glu Lys Arg Arg Asn Ser Gly Pro Val Val Glu Lys Leu Lys Gln Met
35 40 45
Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu Thr
50 55 60
Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala Gln
65 70 75 80
Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp Glu Gln Thr His Leu Thr
85 90 95
Tyr Arg Ile Glu Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Arg Ala Asp Val Asp
100 105 110
His Ala Ile Glu Lys Ala Phe Gln Leu Trp Ser Asn Val Thr Pro Leu
115 120 125
Thr Phe Thr Lys Val Ser Glu Gly Gln Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe
130 135 140
Val Arg Gly Asp His Arg Asp Asn Ser Pro Phe Asp Gly Pro Gly Gly
145 150 155 160
Asn Leu Ala His Ala Phe Gln Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Ala
165 170 175
His Phe Asp Glu Asp Glu Arg Trp Thr Asn Asn Phe Arg Glu Tyr Asn
180 185 190
Leu His Arg Val Ala Ala His Glu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Ser
195 200 205
His Ser Thr Asp Ile Gly Ala Leu Met Tyr Pro Ser Tyr Thr Phe Ser
210 215 220
Gly Asp Val Gln Leu Ala Gln Asp Asp Ile Asp Gly Ile Gln Ala Ile
225 230 235 240
Tyr Gly Arg Ser Gln Asn Pro Val Gln Pro Ile Gly Pro Gln Thr Pro
245 250 255
Lys Ala Cys Asp Ser Lys Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr Thr Ile Arg
260 265 270
Gly Glu Val Met Phe Phe Lys Asp Arg Phe Tyr Met Arg Thr Asn Pro
275 280 285
Phe Tyr Pro Glu Val Glu Leu Asn Phe Ile Ser Val Phe Trp Pro Gln
290 295 300
Leu Pro Asn Gly Leu Glu Ala Ala Tyr Glu Phe Ala Asp Arg Asp Glu
305 310 315 320
Val Arg Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Ala Val Gln Gly Gln Asn
325 330 335
Val Leu His Gly Tyr Pro Lys Asp Ile Tyr Ser Ser Phe Gly Phe Pro
340 345 350
Arg Thr Val Lys His Ile Asp Ala Ala Leu Ser Glu Glu Asn Thr Gly
355 360 365
Lys Thr Tyr Phe Phe Val Ala Asn Lys Tyr Trp Arg Tyr Asp Glu Tyr
370 375 380
Lys Arg Ser Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Met Ile Ala His Asp Phe
385 390 395 400
Pro Gly Ile Gly His Lys Val Asp Ala Val Phe Met Lys Asp Gly Phe
405 410 415
Phe Tyr Phe Phe His Gly Thr Arg Gln Tyr Lys Phe Asp Pro Lys Thr
420 425 430
Lys Arg Ile Leu Thr Leu Gln Lys Ala Asn Ser Trp Phe Asn Cys Arg
435 440 445
Lys Asn
450
<210> 21
<211> 250
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 21
Leu Pro Leu Pro Gln Glu Ala Gly Gly Met Ser Glu Leu Gln Trp Glu
1 5 10 15
Gln Ala Gln Asp Tyr Leu Lys Arg Phe Tyr Leu Tyr Asp Ser Glu Thr
20 25 30
Lys Asn Ala Asn Ser Leu Glu Ala Lys Leu Lys Glu Met Gln Lys Phe
35 40 45
Phe Gly Leu Pro Ile Thr Gly Met Leu Asn Ser Arg Val Ile Glu Ile
50 55 60
Met Gln Lys Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala Glu Tyr Ser Leu
65 70 75 80
Phe Pro Asn Ser Pro Lys Trp Thr Ser Lys Val Val Thr Tyr Arg Ile
85 90 95
Val Ser Tyr Thr Arg Asp Leu Pro His Ile Thr Val Asp Arg Leu Val
100 105 110
Ser Lys Ala Leu Asn Met Trp Gly Lys Glu Ile Pro Leu His Phe Arg
115 120 125
Lys Val Val Trp Gly Thr Ala Asp Ile Met Ile Gly Phe Ala Arg Gly
130 135 140
Ala His Gly Asp Ser Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly Asn Thr Leu Ala
145 150 155 160
His Ala Phe Ala Pro Gly Thr Gly Leu Gly Gly Asp Ala His Phe Asp
165 170 175
Glu Asp Glu Arg Trp Thr Asp Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asn Phe Leu
180 185 190
Tyr Ala Ala Thr His Glu Leu Gly His Ser Leu Gly Met Gly His Ser
195 200 205
Ser Asp Pro Asn Ala Val Met Tyr Pro Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Pro
210 215 220
Gln Asn Phe Lys Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu
225 230 235 240
Tyr Gly Lys Arg Ser Asn Ser Arg Lys Lys
245 250

Claims (40)

1.一种用于诊断结直肠癌和/或鉴定疑似患有结直肠癌的受试者的方法，所述方法包括：
确定从所述受试者获得的生物样品中的一组生物标志物的测量结果，所述组至少包括脑源性神经营养因子(BDNF)和肿瘤M2-PK；
其中所述测量结果包括测量所述组中的所述生物标志物中的每种生物标志物的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括确定一种或多种另外的生物标志物的测量结果，所述一种或多种另外的生物标志物选自由以下组成的组：DKK3、TGFβ1、IGFBP2、TIMP1、IL6、IL8、TNFα、IGFII、脂质运载蛋白、M30、M65、Mac2BP、MMP1、MMP7、MIP1B和IL13。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物标志物包括M2PK、BDNF、DKK3和IGFBP2。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物标志物包括M2PK、BDNF、DKK3、TIMP1和IGFBP2。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其进一步包括所述受试者的年龄和/或性别和/或身体质量指数(BMI)作为另外的生物标志物。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其包括确定一组至少3种生物标志物的测量结果，其中所述一组生物标志物组包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、DKK-3；
ii)BDNF、M2PK、TNFα；
iii)BDNF、M2PK、IL-8；
iv)BDNF、M2PK、MAC2BP；或
v)BDNF、M2PK、IGFBP2。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其包括确定一组至少四种生物标志物的测量结果，其中所述一组生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、IL8、TNFα；
ii)BDNF、M2PK、IL8、MIP1β；
iii)BDNF、M2PK、IL8、DKK3；
iv)BDNF、M2PK、MMP1、DKK3；
v)BDNF、M2PK、IL8、IGFBP2；
vi)BDNF、M2PK、IL8、TIMP1；
vii)BDNF、M2PK、MMP7、TNFα；
viii)BDNF、M2PK、IL8、MMP1；
ix)BDNF、M2PK、IGFBP2、TNFα；或
x)BDNF、M2PK、IL8、IGFII。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法包括确定一组至少四种生物标志物的测量结果，其中所述组至少包括BDNF、M2PK、IL-8和选自由以下组成的组的另外的生物标志物：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1和IGFII。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其包括确定一组至少五种生物标志物的测量结果，其中所述一组生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF；M2PK；IL8；TNFα；MIP1β；
ii)BDNF；M2PK；IL8；脂质运载蛋白；DKK3；
iii)BDNF；M2PK；IL8；TGFβ；DKK3；
iv)BDNF；M2PK；IL8；TNFα；TGFβ；
v)BDNF；M2PK；IGFBP2；TNFα；DKK3；
vi)BDNF；M2PK；IL8；MMP7；DKK3；
vii)BDNF；M2PK；IL8；TNFα；DKK3；
viii)BDNF；M2PK；IL8；IGFBP2；MIP1β；
ix)BDNF；M2PK；IL8；MAC2BP；DKK3；或
x)BDNF；M2PK；IL8；TNFα；MAC2BP。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其包括确定一组至少六种生物标志物的测量结果，其中所述一组生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF；M2PK；MIP1β；DKK3；IGFBP2；TNFα；
ii)BDNF；M2PK；MIP1β；DKK3；IGFBP2；MMP1；
iii)BDNF；M2PK；MAC2BP；DKK3；IGFBP2；TNFα；
iv)BDNF；M2PK；脂质运载蛋白；DKK3；IGFBP2；TNFα；
v)BDNF；M2PK；IL6；DKK3；IGFBP2；TNFα；
vi)BDNF；M2PK；IL8；DKK3；脂质运载蛋白；TGFβ；
vii)BDNF；M2PK；IL8；MIP1B；TGFβ；TNFα；
viii)BDNF；M2PK；IL8；MIP1B；IGFII；TNFα；
ix)BDNF；M2PK；IL8；M30；TGFβ；TNFα；或
x)BDNF；M2PK；IL8；DKK3；IGFII；TNFα。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述组进一步包括所述受试者的年龄作为另外的生物标志物。
12.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者为女性，并且其中所述方法包括确定至少三种生物标志物的测量结果，所述生物标志物包括BDNF和M2PK以及选自由以下组成的组的另外的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6，优选地选自由以下组成的组：MIP1β、MMP1、脂质运载蛋白、IL13、IL8、MAC2BP和IL6。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述三种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF；M2PK；IL8；
ii)BDNF；M2PK；MAC2BP；
iii)BDNF；M2PK；MMP1；
iv)BDNF；M2PK；脂质运载蛋白；
v)BDNF；M2PK；IL13；
vi)BDNF；M2PK；MIP1β；
vii)BDNF；M2PK；IL6。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者为女性，并且其中所述方法包括确定一组至少四种生物标志物的测量结果，其中所述生物标志物至少包括BDNF和M2PK以及两种选自由以下组成的组的另外的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6，优选地选自由以下组成的组：TNFα、MIP1β、MMP1、IGFII、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述四种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、IL8、MMP1；
ii)BDNF、M2PK、IL8、脂质运载蛋白；
iii)BDNF、M2PK、IL8、IL6；
iv)BDNF、M2PK、IL8、MIP1β；
v)BDNF、M2PK、IL8、MAC2BP；
vi)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ；
vii)BDNF、M2PK、IL8、IL13；
viii)BDNF、M2PK、IL8、IGFII；
ix)BDNF、M2PK、IL8、TNFα；或
x)BDNF、M2PK、TGFβ1、MMP1。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者为女性并且其中：
(i)所述方法包括确定至少五种生物标志物加上女性性别的测量结果，其中所述生物标志物至少包括BDNF和M2PK以及三种选自由以下组成的组的另外的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6，优选地选自由以下组成的组：TNFα、
MIP1β、MMP1、IGFII、IL8、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6；或
(ii)所述方法包括确定至少五种生物标志物加上女性性别的测量结果，其中所述生物标志物至少包括BDNF、M2PK和IL-8以及两种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6，优选地选自由以下组成的组：TNFα、
MIP1β、MMP1、IGFII、脂质运载蛋白、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述五种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、TNFα；
ii)BDNF、M2PK、IL8、TNFα、MMP1；
iii)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、MMP1；
iv)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、MAC2BP；
v)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、IL6；
vi)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、IL13；
vii)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、IGFII；
viii)BDNF、M2PK、IL8、TGFβ1、MIP1β；
ix)BDNF、M2PK、IL8、MMP1、MIP1β；或
x)BDNF、M2PK、IL8、MAC2BP、MIP1β。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述受试者为女性，并且所述方法包括确定至少六种生物标志物的测量结果，其中所述生物标志物至少包括BDNF和M2PK以及四种选自由以下组成的组的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6，优选地选自由以下组成的组：DKK3、TNFα、MIP1β、MMP1、M65、M30、IL8、IL13、MAC2BP、TGFβ1和IL6。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述六种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、IL8、IL13、M65、M30；
ii)BDNF、M2PK、IL8、MMP1、TGFβ1、TNFα；
iii)BDNF、M2PK、IL8、MAC2BP、TGFβ1、TNFα；
iv)BDNF、M2PK、IL8、IL6、TGFβ1、TNFα；
v)BDNF、M2PK、IL8、MMP1、MAC2BP、TNFα；
vi)BDNF、M2PK、IL8、MMP1、TGFβ1、MAC2BP；
vii)BDNF、M2PK、IL8、MMP1、TGFβ1、DKK3；
viii)BDNF、M2PK、IL8、IL6、TGFβ1、MAC2BP；
ix)BDNF、M2PK、IL8、MMP1、DKK3、MAC2BP；或
x)BDNF、M2PK、IL8、IL13、TGFβ1、MIP1β。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其进一步包括所述受试者的年龄作为另外的生物标志物。
21.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者为男性，并且所述方法包括确定至少三种生物标志物的测量结果，其中所述生物标志物至少包括BDNF和M2PK以及另外的选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1，优选地选自由以下组成的组：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MMP7、IGFII、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述三种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、TNFα；
ii)BDNF、M2PK、TIMP1；
iii)BDNF、M2PK、IL8；
iv)BDNF、M2PK、TGFβ；
v)BDNF、M2PK、MMP7；
vi)BDNF、M2PK、IL13；
vii)BDNF、M2PK、IGFII；
viii)BDNF、M2PK、IGFBP2；
ix)BDNF、M2PK、MAC2BP；或
x)BDNF、M2PK、脂质运载蛋白。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者为男性，并且所述方法包括确定至少四种生物标志物的测量结果，其中所述生物标志物至少包括BDNF和M2PK以及两种选自由以下组成的组的另外的生物标志物：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1，优选地选自由以下组成的组：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1B、MMP7、M65和IL8。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述四种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、DKK3、TIMP1；
ii)BDNF、M2PK、IL8、TNFα；
iii)BDNF、M2PK、IGFBP2、TNFα；
iv)BDNF、M2PK、IL8、IGFBP2；
v)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα；
vi)BDNF、M2PK、IL8、MMP7；
vii)BDNF、M2PK、DKK3、M65；
viii)BDNF、M2PK、DKK3、IL8；
ix)BDNF、M2PK、DKK3、IGFBP2；或
x)BDNF、M2PK、MIP1β、TIMP1。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者为男性，并且所述方法包括确定至少五种生物标志物的测量结果，其中所述生物标志物至少包括BDNF和M2PK以及三种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1，优选地选自由以下组成的组：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、IGFII、M65、脂质运载蛋白、IL8和MAC2BP。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述五种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF；M2PK；DKK3；IGFBP2；TNFα；
ii)BDNF；M2PK；DKK3；脂质运载蛋白；TIMP1；
iii)BDNF；M2PK；DKK3；M65；TNFα；
iv)BDNF；M2PK；DKK3；IGFBP2；TIMP1；
v)BDNF；M2PK；DKK3；IL8；IGFII；
vi)BDNF；M2PK；IL13；IL8；TNFα；
vii)BDNF；M2PK；DKK3；MAC2BP；TIMP1；
viii)BDNF；M2PK；DKK3；M65；TIMP1；
ix)BDNF；M2PK；DKK3；MIP1B；TNFα；或
x)BDNF；M2PK；DKK3；MIP1B；TIMP1。
27.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者为男性，并且所述方法包括确定至少五种生物标志物的测量结果，其中所述五种生物标志物包括BDNF、M2PK、DKK3以及两种选自以下的生物标志物：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP或TGFβ1，优选地选自以下：TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、IGFII、M65、脂质运载蛋白、IL8或MAC2BP。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述五种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF；M2PK；DKK3；IGFBP2；TNFα；
ii)BDNF；M2PK；DKK3；脂质运载蛋白；TIMP1；
iii)BDNF；M2PK；DKK3；M65；TNFα；
iv)BDNF；M2PK；DKK3；IGFBP2；TIMP1；
v)BDNF；M2PK；DKK3；IL8；IGFII；
vi)BDNF；M2PK；DKK3；MAC2BP；TIMP1；
vii)BDNF；M2PK；DKK3；M65；TIMP1；
viii)BDNF；M2PK；DKK3；MIP1β；TNFα；或
ix)BDNF；M2PK；DKK3；MIP1β；TIMP1。
29.根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者为男性并且其中：
(i)所述方法包括确定至少六种生物标志物的测量结果，其中所述六种生物标志物包括BDNF和M2PK以及四种选自由以下组成的组的生物标志物：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1，优选地选自由以下组成的组：DKK3、TNFα、IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8和IL13；或
(ii)所述方法包括确定至少六种生物标志物的测量结果，其中所述六种生物标志物包括BDNF、M2PK、DKK3、TNFα以及两种选自由以下组成的组的生物标志物：IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8、IL13、MAC2BP和TGFβ1，优选地选自由以下组成的组：IGFBP2、TIMP1、MIP1β、MMP7、MMP1、IGFII、M65、M30、脂质运载蛋白、IL8和IL13。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述六种生物标志物包括以下或由以下组成：
i)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、TIMP1、IL8；
ii)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、MMP1；
iii)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、M30；
iv)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、MIP1B、M65；
v)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、MMP7；
vi)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、M65；
vii)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、脂质运载蛋白；
viii)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFII、IL8；
ix)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、M65、M30；或
x)BDNF、M2PK、DKK3、TNFα、IGFBP2、IL13。
31.根据权利要求21至30中任一项所述的方法，其进一步包括所述受试者的年龄作为另外的生物标志物。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中确定测量结果包括使所述生物样品与可检测结合剂接触，所述可检测结合剂与所述生物标志物中的每种生物标志物特异性结合。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述方法包括使用检测测定检测特异性结合剂与所述生物标志物之间的特异性结合。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中确定测量结果包括测量所述生物样品中的生物标志物的浓度。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述结合剂为抗体。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述生物样品为血液样品。
37.一种治疗患有或疑似患有结直肠癌的受试者的方法，所述方法包括：
(i)根据权利要求1至36中任一项，确定从所述受试者获得的的生物样品中的一组生物标志物的测量结果；以及
(ii)通过结肠镜检查或乙状结肠镜检查来治疗所述受试者。
38.一种试剂盒，其包括：
(i)与权利要求1至36中任一项所定义的生物标志物组中的生物标志物结合的标记的抗体；以及
(ii)用于对所述生物标志物组中的所述生物标志物进行检测的说明书。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其进一步包括用于通过计算机生成的算法分析检测到的生物标志物的说明书。
40.一种组合物，其包括与权利要求1至36中任一项所定义的生物标志物组中的生物标志物特异性结合的标记的抗体。
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