KR20240004546A - 결장직장암에 대한 바이오마커 - Google Patents

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트레버 로켓
에두아르도 봄
크레이그 루이스
마이클 버클리
루이스 밀러
크리스티안 다이쉬
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비전 테크 바이오 피티와이 엘티디
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Abstract

본 발명은, 대상체에서의, 진행된 결장직장 종양형성 (ACN), 예를 들어 결장직장암 (CRC)의 보다 높은 위험과 관련된 바이오마커의 식별에 관한 것이다. 생물학적 샘플에서의 이들 바이오마커의 검출 및 측정은 대상체에서 결장직장암의 최종적 진단을 제공하기 위해 대장내시경검사 또는 구불창자내시경검사를 포함한 추가의 침습적 절차가 필요한지의 여부에 대하여 임상의에게 알리는 데 사용될 수 있다.

Description

결장직장암에 대한 바이오마커
본 출원은 2021년 4월 20일에 출원된 AU2021901164에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 인용되거나 참조된 모든 문서, 및 본원에서 인용된 문서에서 인용되거나 참조된 모든 문서는, 본원에서 또는 본원에 참조로 포함된 임의의 문서에서 언급된 임의의 생성물에 대한 임의의 제조업체의 지침, 설명, 생성물 사양, 및 생성물 시트와 함께, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 전자 제출의 전체 내용은 모든 목적상 그 전체가 참조로 포함된다.
분야
본 발명은, 대상체에서의, 진행된 결장직장 종양형성 (ACN), 예를 들어 결장직장암 (CRC)의 보다 높은 위험과 관련된 바이오마커의 식별에 관한 것이다. 생물학적 샘플에서의 이들 바이오마커의 검출 및 측정은 대상체에서 결장직장암의 최종적 진단을 제공하기 위해 대장내시경검사 또는 구불창자내시경검사를 포함한 추가의 침습적 절차가 필요한지의 여부에 대하여 임상의에게 알리는 데 사용될 수 있다.
또한 결장암 또는 장암으로서 언급되는 결장직장암 (CRC)은 전 세계적으로 남성에서의 세 번째로 흔한 암의 원인이며, 여성에서의 두 번째로 흔한 암의 원인이다. 2018년에는, 180만 건 초과의 새로운 CRC 사례가 발생했으며 호주는 연령-표준화 비율이 100,000명 당 약 37명으로 세계에서 11 번째로 높았다. 불행하게도, 환자의 30-50%는 발현시 잠재성 또는 명시적인 전이를 갖고 일단 종양이 전이되면 예후는 10% 미만의 5년 생존율로 매우 나쁘다 (Etzioni et al., (2003) Nat Rev Cancer 3:243-252). 대조적으로, 종양이 여전히 국소화되어 있는 동안 존재하는 환자의 90% 초과는 5년 후에도 여전히 생존할 것이며 치유된 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 결장직장 병변의 조기 검출은 결장암의 영향을 현저히 감소시킬 것이다.
결장직장암의 진단을 위해 널리 사용되는 현재의 스크리닝 검정은 배설물 잠혈 시험 (FOBT), 굴곡성 구불창자내시경검사, 및 대장내시경검사이다 (Lieberman, (2010) Gastroenterology 138:2115-2126). 결장직장암에 대한 FOBT의 특이도는 상당히 높은 반면 (92-95%), 대장내시경검사에서 결장직장암을 갖는 것으로 나타난 FOBT 양성 대상체의 비율은 낮다 (약 3-4%). 따라서 모든 양성 FOBT는 대장내시경검사로 추적관찰되어야 한다. 샘플링은 개인이 집에서 수행하며 최적의 민감도를 달성하기 위해 적어도 2개의 연속 배설물 샘플이 분석되어야 한다. FOBT의 일부 버전은 또한 샘플링 전의 식이 제한도 요구한다. FOBT는 또한, 이들이 보다 진행된 암만큼 빈번하게 장으로 출혈을 발생시키지 않음에 따라 초기 스테이지 암 병변에 대한 민감도가 부족하지만, 치료가 가장 성공적인 것은 이들 초기 병변이다.
FOBT 스크리닝은 결장직장암으로 인한 사망률을 감소시키지만, 이는 부분적으로 시험의 불쾌한 성질로 인해, 낮은 순응률 (30-40%)을 겪으며, 이는 스크리닝 도구로서의 그의 유용성을 제한한다. 대장내시경검사는 현재의 최적 표준이며 90% 초과의 특이도를 갖지만, 이는 작지만 유한한 합병증의 위험 (1000개 절차당 2.1개)을 가지며 침입적이고 고비용이 든다 (Levin, (2004) Gastroenterology 127:1841-1844). 신속하고, 구체적이며, 저렴한 혈액 기반 검정의 개발은 다른 스크리닝 시험에서 통상적으로 보이는 순응성 문제를 극복하고 CRC 위험에 있는 보다 많은 대상체를 포착할 것이다.
요약
본 개시내용은 대상체에서의 결장직장암의 보다 높은 위험과 관련된 혈액 기반 바이오마커의 식별에 기초한다. 본 발명자들은 또한 남성 및 여성에 대해 성별 특이적인 바이오마커 조합을 식별하였다. 본 발명은 바이오마커의 특이적 조합 뿐만 아니라 결장직장암을 진단하고 검출하는 방법, 또한 결장직장암의 위험이 있는 대상체의 식별 방법에 관한 것이다.
따라서, 제1 측면에서, 본 개시내용은 결장직장암의 진단 방법 및/또는 결장직장암을 갖는 것으로 의심되는, 또는 이를 가질 보다 큰 위험에 있는 대상체의 식별 방법을 제공하며, 방법은
대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 바이오마커의 패널에 대한 측정을 결정하며, 여기서 패널은 적어도 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF) 및 종양 M2-PK를 포함하는 것인 단계
를 포함하며, 여기서 측정은 패널 내의 바이오마커 각각의 수준의 측정을 포함한다.
제1 측면에 따른 일례에서, 측정의 결정은, 샘플을 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출가능한 결합 작용제와 접촉시킴으로써 생물학적 샘플에서 적어도 BDNF 및 M2PK (및 하나 이상의 다른 바이오마커)를 검출하는 것을 포함한다. 추가의 예에서, 방법은 검출 검정을 사용하여 특이적 결합 작용제와 바이오마커 사이의 특이적 결합을 검출하는 것을 포함한다. 일례에서, 검출 검정은 ELISA 검정이다. 추가의 예에서, 측정의 결정은 생물학적 샘플 중의 바이오마커의 농도 측정을 포함한다. 추가의 예에서, 측정의 결정은 통계적 분석의 수행을 포함한다. 또 다른 예에서, 방법은 바이오마커 농도를 본원에 기재된 바와 같은 알고리즘에 대입하는 것을 포함한다.
본원의 임의의 측면에 따른 일례에서, 방법은 DKK3, TGFβ1, IGFBP2, TIMP1, IL6, IL8, TNFα, IGFII, 리포칼린, M30, M65, Mac2BP, MMP1, MMP7, MIP1B 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 바이오마커의 측정의 결정을 추가로 포함한다. 또 다른 예에서, 하나 이상의 추가의 바이오마커는 DKK3, TGFβ1, IGFBP2, TNFα, TIMP1, IL8, MIP1B 및 Mac2BP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제1 측면에 따른 일례에서, 방법은 적어도 3개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK를 포함한다.
추가의 예에서, 적어도 3개의 바이오마커는 BDNF 및 M2PK 및 DKK-3, TNFα, IL-8, MAC2BP 및 IGFBP2로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 바이오마커를 포함한다.
제1 측면에 따른 일례에서, 3개의 바이오마커 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i) BDNF, M2PK, DKK-3; ii) BDNF, M2PK, TNFα; iii) BDNF, M2PK, IL-8; iv) BDNF, M2PK, MAC2BP; 또는 v) BDNF, M2PK, IGFBP2.
제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 4개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK를 포함한다. 추가의 예에서, 적어도 4개의 바이오마커는 BDNF, M2PK 및 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 바이오마커를 포함한다.
추가의 예에서, 적어도 4개의 바이오마커는 BDNF, M2PK 및 DKK3, IGFBP2, TIMP1, 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 바이오마커를 포함한다. 추가의 예에서, 적어도 4개의 바이오마커는 BDNF, M2PK 및 DKK3, IGFBP2 및 TIMP1로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 바이오마커를 포함한다. 제1 측면에 따른 일례에서, 4개의 바이오마커는 DKK3, M2PK, IGFPB2 및 BDNF를 포함한다.
제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 4개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i) BDNF, M2PK, IL8, TNFα; ii) BDNF, M2PK, IL8, MIP1B; iii) BDNF, M2PK, IL8, DKK3; iv) BDNF, M2PK, MMP1, DKK3; v) BDNF, M2PK, IL8, IGFBP2; vi) BDNF, M2PK, IL8, TIMP1; vii) BDNF, M2PK, MMP7, TNFα; viii) BDNF, M2PK, IL8, MMP1; ix) BDNF, M2PK, IGFBP2, TNFα; 또는 x) BDNF, M2PK, IL8, IGFII.
제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 4개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, IL-8 및 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1 및 IGFII로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 바이오마커를 포함한다.
제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 5개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 DKK3, TNFα, TGF베타1, 리포칼린, IGFBP2, MAC2BP, MIP1β, MMP7, 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 바이오마커를 포함한다.
일례에서, 5개의 바이오마커 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i) BDNF; M2PK; IL8; TNFA; MIP1β; ii) BDNF; M2PK; IL8; 리포칼린; DKK3; iii) BDNF; M2PK; IL8; TGFβ1; DKK3; iv) BDNF; M2PK; IL8; TNFA; TGFβ1; v) BDNF; M2PK; IGFBP2; TNFA; DKK3; vi) BDNF; M2PK; IL8; MMP7; DKK3; vii) BDNF; M2PK; IL8; TNFA; DKK3; viii) BDNF; M2PK; IL8; IGFBP2; MIP1β; ix) BDNF; M2PK; IL8; MAC2BP; DKK3; 또는 x) BDNF; M2PK; IL8; TNFA; MAC2BP.
제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 5개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 TIMP1, DKK3, TNFα, TGF베타1, 리포칼린, IGFBP2, MAC2BP, MIP1β, MMP7, 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 TIMP1, DKK3, IGFBP2, MAC2BP, IL13 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 바이오마커를 포함한다.
일례에서, 5개의 바이오마커 패널은 PKM2 (또한 M2PK로서 언급됨), BDNF, DKK3, IGFBP2 및 TIMP1을 포함한다.
일례에서, 5개의 바이오마커 패널은 DKK3, M2PK, Mac2BP, IGFBP2 및 BDNF를 포함한다.
제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 6개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 DKK3, TNFα, IGFBP2, MIP1β, TGFβ1, MMP1, MAC2BP, IGFII, 리포칼린, IL6, M30 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 바이오마커를 포함한다.
제1 측면에 따른 일례에서, 6개의 바이오마커 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i) BDNF; M2PK; MIP1β; DKK3; IGFBP2; TNFα; ii) BDNF; M2PK; MIP1β; DKK3; IGFBP2; MMP1; iii) BDNF; M2PK; MAC2BP; DKK3; IGFBP2; TNFα; iv) BDNF; M2PK; 리포칼린; DKK3; IGFBP2; TNFα; v) BDNF; M2PK; IL6; DKK3; IGFBP2; TNFα; vi) BDNF; M2PK; IL8; DKK3; 리포칼린; TGFβ1; vii) BDNF; M2PK; IL8; MIP1B; TGFβ1; TNFα; viii) BDNF; M2PK; IL8; MIP1B; IGFII; TNFα; ix) BDNF; M2PK; IL8; M30; TGFβ1; TNFα; 또는 x) BDNF; M2PK; IL8; DKK3; IGFII; TNFα.
제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 7개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 TNFα, DKK3, MIP1β, IL8, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, M65, TIMP1 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된 5개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 7개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK 및 TNFα 및 DKK3, MIP1β, IL8, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, M65, TIMP1 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 7개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, TNFα 및 DKK3 및 MIP1β, IL8, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, M65, TIMP1 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 바이오마커를 포함한다.
제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 8개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 DKK3, TNFα, MIP1β, IL8, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, M65, TIMP1, TGFβ1 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 6개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 패널은 BDNF, M2PK 및 DKK3 및 TNFα, MIP1β, IL8, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, M65, TIMP1, TGFβ1 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 5개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 패널은 BDNF, M2PK, DKK3 및 IGFBP2 및 TNFα, MIP1β, IL8, MMP1, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, M65, TIMP1, TGFβ1 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 바이오마커를 포함한다.
제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 4개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, DKK3 및 M2PK 및 TNFα, MIP1β, IL8, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, M65, TIMP1, TGFβ1 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커를 포함한다.
제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 5개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 DKK3, IGFBP2, BDNF 및 M2PK 및 TNFα, MIP1β, IL8, MMP1, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, M65, TIMP1, TGFβ1 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커를 포함한다.
제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 표 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15에 제시된 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함한다.
일부 예에서, 개시내용의 방법은 또한, 본원에 기재된 바이오마커 패널 내의 바이오마커로서 대상체의 연령 및/또는 성별의 포함을 고려한다.
일부 예에서, 개시내용의 방법은 또한, 본원에 기재된 바이오마커 패널 내의 바이오마커로서 대상체의 연령의 포함을 고려한다. 일례에서, 대상체의 연령은 세(year) 단위의 그의 연령이다. 제1 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 표 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24에 제시된 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함한다.
일부 예에서, 개시내용의 방법은 또한 본원에 기재된 바이오마커 패널 내의 바이오마커로서 대상체의 성별의 포함을 고려한다. 남성 및 여성으로부터의 샘플을 분리하고 이들을 별도로 분석함으로써 성별을 방법에 포함시킬 수 있다. 대안적으로, 여성에 대해 임의 값 및 남성에 대해 상이한 임의 값을 할당함으로써 성별을 로지스틱 회귀 알고리즘에 포함시킬 수 있다. 일례에서, 남성 및 여성에 대해 임의 값 (예를 들어, 여성에 대해 1.1 및 남성에 대해 1.0)을 할당함으로써 대상체의 성별을 로지스틱 회귀 알고리즘에 포함시킬 수 있다.
본 발명자들은 또한 특히 남성 및 여성에 대해 관련 있는 바이오마커 패널을 결정하였다.
제2 측면에서, 본 개시내용은 결장직장암의 진단 방법 및/또는 결장직장암을 갖는 것으로 의심되는, 또는 이를 가질 보다 큰 위험에 있는, 여성인 대상체의 식별 방법을 제공하며, 방법은
대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 바이오마커의 패널에 대한 측정을 결정하며, 여기서 패널은 적어도 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF) 및 종양 M2-PK를 포함하는 것인 단계
를 포함하며, 여기서 측정은 패널 내의 바이오마커 각각의 수준의 측정을 포함한다.
제2 측면에 따른 일례에서, 방법은 적어도 3개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 MIP1β, MMP1, 리포칼린, IL13, IL8, MAC2BP, 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 바이오마커를 포함한다.
제2 측면에 따른 또 다른 예에서, 3개의 바이오마커 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
(i) BDNF; M2PK; IL8; ii) BDNF; M2PK; MAC2BP; iii) BDNF; M2PK; MMP1; iv). BDNF; M2PK; 리포칼린; v) BDNF; M2PK; IL13; vi) BDNF; M2PK; MIP1β; 또는 vii) BDNF; M2PK; IL6.
제2 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 4개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP, TGF베타1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 TNFα, MIP1β, MMP1, IGFII, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 바이오마커를 포함한다.
제2 측면에 따른 또 다른 예에서, 4개의 바이오마커 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i) BDNF, M2PK, IL8, MMP1; ii) BDNF, M2PK, IL8, 리포칼린; iii) BDNF, M2PK, IL8, IL6; iv) BDNF, M2PK, IL8, MIP1β; v) BDNF, M2PK, IL8, MAC2BP; vi) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ; vii) BDNF, M2PK, IL8, IL13; viii) BDNF, M2PK, IL8, IGFII; ix) BDNF, M2PK, IL8, TNFα; 또는 x). BDNF, M2PK, TGFβ1, MMP1.
제2 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 5개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 TNFα, MIP1β, MMP1, IGFII, IL8, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 바이오마커를 포함한다.
제2 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 5개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK 및 IL-8 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 TNFα, MIP1β, MMP1, IGFII, 리포칼린, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 바이오마커를 포함한다.
제2 측면에 따른 또 다른 예에서, 5개의 바이오마커 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, TNFα; ii) BDNF, M2PK, IL8, TNFα, MMP1; iii). BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, MMP1; iv) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, MAC2BP; v) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ; vi) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, IL13; vii) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, IGFII; viii) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, MIP1β; ix) BDNF, M2PK, IL8, MMP1, MIP1β, 또는 x) BDNF, M2PK, IL8, MAC2BP, MIP1β.
제2 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 6개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 DKK3, TNFα, MIP1β, MMP1, M65, M30, IL8, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개의 바이오마커를 포함한다.
제2 측면에 따른 또 다른 예에서, 6개의 바이오마커 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i). BDNF, M2PK, IL8, IL13, M65, M30; ii) BDNF, M2PK, IL8, MMP1, TGFβ1, TNFα; iii) BDNF, M2PK, IL8, MAC2BP, TGFβ1, TNFα; iv) BDNF, M2PK, IL8, IL6, TGFβ1, TNFα; v) BDNF, M2PK, IL8, MMP1, MAC2BP, TNFα; vi) BDNF, M2PK, IL8, MMP1, TGFβ1, MAC2BP; vii) BDNF, M2PK, IL8, MMP1, TGFβ1, DKK3; viii) BDNF, M2PK, IL8, IL6, TGFβ1, MAC2BP; ix). BDNF, M2PK, IL8, MMP1, DKK3, MAC2BP, 또는 x) BDNF, M2PK, IL8, IL13, TGFβ1, MIP1β.
제2 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 7개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 IL8, M65, MMP1, IL13, IGFBP2, TNFA, MIP1β, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, TGFβ1 및 M30으로 이루어진 군으로부터 선택된 5개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 7개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK 및 IL8, 및 M65, MMP1, IL13, IGFBP2, TNFA, MIP1β, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, TGFβ1 및 M30으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 7개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, M65 및 IL8, 및 MMP1, IL13, IGFBP2, TNFA, MIP1β, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, TGFβ1 및 M30으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 7개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, M65, MMP1 및 IL8, 및 IL13, IGFBP2, TNFA, MIP1B, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, TGFβ1 및 M30으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 바이오마커를 포함한다.
일례에서, 제2 측면에 따라, 방법은 표 28에 제시된 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함한다.
제2 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 8개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 IL8, M65, MMP1, TNFA, MIP1B, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, TIMP1, TGFβ1, M30 및 DKK3으로 이루어진 군으로부터 선택된 6개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 8개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK 및 IL8 및 M65, MMP1, TNFA, MIP1B, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, TIMP1, TGFβ1, M30 및 DKK3으로 이루어진 군으로부터 선택된 5개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 8개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, IL8 및 M65 및 MMP1, TNFA, MIP1B, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, TIMP1, TGFβ1, M30 및 DKK3으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 8개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, IL8, M65 및 MMP1 및 TNFA, MIP1B, 리포칼린, MAC2BP, IL6, MMP7, IGFII, TIMP1, TGFβ1, M30 및 DKK3으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 바이오마커를 포함한다.
일례에서, 제2 측면에 따라, 방법은 표 27, 26 또는 25에 제시된 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함한다.
제2 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 추가의 바이오마커로서 대상체 연령을 추가로 포함한다. 일례에서 방법은 표 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 또는 42에 제시된 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함한다.
제3 측면에서, 본 개시내용은 결장직장암의 진단 방법 및/또는 결장직장암을 갖는 것으로 의심되는, 또는 이를 가질 보다 큰 위험에 있는 대상체의 식별 방법을 제공하며, 여기서 대상체는 남성이고, 방법은
대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 바이오마커의 패널에 대한 측정을 결정하며, 여기서 패널은 적어도 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF) 및 종양 M2-PK를 포함하는 단계
를 포함하며, 여기서 측정은 패널 내의 바이오마커 각각의 수준의 측정을 포함한다.
제3 측면에 따른 일례에서, 방법은 적어도 3개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 DKK3, TNFA, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 TNFA, IGFBP2, TIMP1, MMP7, IGFII, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 바이오마커를 포함한다.
제3 측면에 따른 또 다른 예에서, 3개의 바이오마커 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i) BDNF, M2PK, TNFα; ii) BDNF, M2PK, TIMP1; iii) BDNF, M2PK, IL8; iv) BDNF, M2PK, TGFβ; v) BDNF, M2PK, MMP7; vi) BDNF, M2PK, IL13; vii) BDNF, M2PK, IGFII; viii) BDNF, M2PK, IGFBP2; ix) BDNF, M2PK, MAC2BP, 또는 x) BDNF, M2PK, 리포칼린.
제3 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 4개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1B, MMP7, M65 및 IL8로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 바이오마커를 포함한다.
제3 측면에 따른 또 다른 예에서, 4개의 바이오마커 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i) BDNF, M2PK, DKK3, TIMP1; ii) BDNF, M2PK, IL8, TNFα; iii) BDNF, M2PK, IGFBP2, TNFα; iv) BDNF, M2PK, IL8, IGFBP2; v) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα; vi) BDNF, M2PK, IL8, MMP7; vii) BDNF, M2PK, DKK3, M65; viii) BDNF, M2PK, DKK3, IL8; ix) BDNF, M2PK, DKK3, IGFBP2, 또는 x) BDNF, M2PK, MIP1β, TIMP1.
제3 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 5개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF 및 M2PK 및 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 DKK3, TNFA, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, IGFII, M65, 리포칼린, IL8 및 Mac2BP로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 바이오마커를 포함한다.
제3 측면에 따른 또 다른 예에서, 5개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i) BDNF; M2PK; DKK3; IGFBP2; TNFα; ii) BDNF; M2PK; DKK3; 리포칼린; TIMP1; iii) BDNF; M2PK; DKK3; M65; TNFα; iv) BDNF; M2PK; DKK3; IGFBP2; TIMP1; v) BDNF; M2PK; DKK3; IL8; IGFII; vi) BDNF; M2PK; IL13; IL8; TNFα; vii) BDNF; M2PK; DKK3; MAC2BP; TIMP1; viii) BDNF; M2PK; DKK3; M65; TIMP1; ix) BDNF; M2PK; DKK3; MIP1B; TNFα; 또는 x) BDNF; M2PK; DKK3; MIP1B; TIMP1.
제3 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 5개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 5개의 바이오마커는 BDNF, M2PK, DKK-3 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 또는 TGF베타1로부터 선택된, 바람직하게는 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, IGFII, M65, 리포칼린, IL8 또는 MAC2BP로부터 선택된 2개의 바이오마커를 포함한다.
제3 측면에 따른 일례에서, 5개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i) BDNF; M2PK; DKK3; IGFBP2; TNFα; ii) BDNF; M2PK; DKK3; 리포칼린; TIMP1; iii) BDNF; M2PK; DKK3; M65; TNFα; iv) BDNF; M2PK; DKK3; IGFBP2; TIMP1; v) BDNF; M2PK; DKK3; IL8; IGFII; vi) BDNF; M2PK; DKK3; MAC2BP; TIMP1; vii) BDNF; M2PK; DKK3; M65; TIMP1; viii). BDNF; M2PK; DKK3; MIP1β; TNFα; 또는 ix) BDNF; M2PK; DKK3; MIP1β; TIMP1.
제3 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 6개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 6개의 바이오마커는 BDNF 및 M2PK 및 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개의 바이오마커를 포함한다.
제3 측면에 따른 또 다른 예에서, 바이오마커는 BDNF, M2PK, DKK3, TNFα 및 IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 바이오마커를 포함한다.
제3 측면에 따른 일례에서, 6개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어진다:
i) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, TIMP1, IL8; ii) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, MMP1; iii) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, M30; iv) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, MIP1B, M65; v) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, MMP7; vi) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, M65; vii) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, 리포칼린; viii) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFII, IL8; ix) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, M65, M30, 또는 x) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, IL13.
제3 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 7개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK 및 DKK3, TNFα, MIP1β, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, TIMP1, M30, IGII, IL8, MMP7 및 M65로 이루어진 군으로부터 선택된 5개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 7개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, DKK3, 및 TNFα, MIP1β, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, TIMP1, M30, IGII, IL8, MMP7 및 M65로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 7개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, 및 MIP1β, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, TIMP1, M30, IGII, IL8, MMP7 및 M65로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 7개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, 및 MIP1β, MMP1, 리포칼린, TIMP1, M30, IGII, IL8, MMP7 및 M65로 이루어진 군으로부터 선택된 2개 이상의 바이오마커를 포함한다.
또 다른 예에서, 제3 측면에 따라, 방법은 표 46에 제시된 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함한다.
제3 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 적어도 8개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK 및 DKK3, TNFα, MIP1β, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, TIMP1, TGFβ1, M30, IL13, IGII, IL8, MMP7 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 6개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 8개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, DKK3 및 TNFα, MIP1β, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, TIMP1, TGFβ1, M30, IL13, IGII, IL8, MMP7 및 IL13로 이루어진 군으로부터 선택된 5개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 8개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, DKK3, TNFα 및 MIP1β, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, TIMP1, TGFβ1, M30, IL13, IGII, IL8, MMP7 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 이상의 바이오마커를 포함한다. 일례에서, 방법은 적어도 8개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, MMP7 및 MIP1β, MMP1, IGFBP2, 리포칼린, TIMP1, TGFβ1, M30, IL13, IGII, IL8 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이상의 바이오마커를 포함한다.
또 다른 예에서, 제3 측면에 따라, 방법은 표 45에 제시된 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함한다.
또 다른 예에서, 제3 측면에 따른 방법은 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 바이오마커의 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커는 적어도 BDNF 및 M2PK를 포함한다. 일례에서 방법은 표 44 또는 43에 제시된 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함한다.
추가의 예에서, 바이오마커는 PKM2 (또한 M2PK로서 언급됨), BDNF, DKK3, IGFBP2 및 TIMP1을 포함한다.
제3 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 추가의 바이오마커로서 대상체 연령을 추가로 포함한다. 일례에서 방법은 표 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60에 제시된 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함한다.
추가의 예에서, 본원에 기재된 방법은 표 7 내지 15, 표 16 내지 24, 표 25 내지 33, 표 34 내지 42, 표 43 내지 51, 표 52 내지 60 또는 표 61 내지 66에 제공된 바이오마커 조합 중 하나 이상 또는 모두를 사용할 수 있다.
제4 측면에서는, 표 7 내지 15, 표 16 내지 24, 표 25 내지 33, 표 34 내지 42, 표 43 내지 51, 표 52 내지 60 또는 표 61 내지 66 중 어느 하나에 기재된 바이오마커 조합이 제공된다.
본 개시내용은 본원에 구체적으로 기재되지 않은 추가의 공지된 결장직장암 바이오마커를 포함함을 이해할 것이다. 이들 추가의 바이오마커의 예는 IGF-I, 암피레귤린(Amphiregulin), VEGFA, VEGFD, MMP2, MMP3, MMP9, TIMP2, ENA-78, MCP-1, IFN-γ, IL10, IL-1β, IL4, OPN, CEACAM6, VEGF알파 및 VEGFpan 중 하나 이상을 포함한다.
연령 및/또는 성별에 추가로, 본 개시내용은 본원에 구체적으로 기재되지 않은 추가적인 인구통계학적 또는 형태계측학적 항을 포함함을 이해할 것이다. 이들 기타 인구통계학적 또는 형태계측학적 항의 예는 흡연 이력, 체질량 지수 (BMI), 및 엉덩이-허리 비율을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 임의의 측면에 따른 일례에서, 측정의 결정은 생물학적 샘플 중의 바이오마커의 농도 측정을 포함한다. 임의의 측면에 따른 일례에서, 측정의 결정은 샘플을 바이오마커에 특이적으로 결합하는 검출가능한 결합 작용제와 접촉시킴으로써 생물학적 샘플 중의 바이오마커를 검출하는 것을 포함한다. 임의의 측면에 따른 추가의 예에서, 방법은 검출 검정을 사용하여 특이적 결합 작용제와 바이오마커 사이의 특이적 결합을 검출하는 것을 포함한다. 임의의 측면에 따른 추가의 예에서, 측정의 결정은 통계적 분석의 수행을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 측면에 따른 일례에서, 방법은 포착 항체를 포함한다. 일례에서, 포착 항체는, 예를 들어, 플레이트 상에 부동화된다. 일례에서, 플레이트는 ELISA 플레이트이다. 임의의 측면에 따른 일례에서, 방법은 포착 항체에 대한 바이오마커의 결합을 검출하기 위한 라벨링된 항체를 포함한다.
임의의 측면에 따른 일례에서, 바이오마커의 패널 내의 적어도 하나의 바이오마커의 수준은 참조 패널 내의 동일한 바이오마커의 수준에 비해 증가 또는 감소된다. 보다 특히, 바이오마커의 측정은 사례 및 대조군 샘플에 대해 훈련된 알고리즘에 의해 알려진 CRC 사례 및/또는 대조군 샘플에서 결정된 그 바이오마커에 대한 참조 농도에 대한 것이다.
임의의 측면에 따른 일례에서, 개시내용의 방법은 하기를 포함한다:
(i) 통계 값을 도출하기 위해 본원에 기술된 바이오마커 패널 내의 각 바이오마커의 농도 측정을 수행하는 단계;
(ii) 단계 (i)에서 얻은 값을 상응하는 바이오마커 참조 패널 내의 동일한 바이오마커의 농도로부터 얻은 통계 값과 비교하는 단계; 및
(iii) 단계 (ii)에서 얻은 값을 상관시켜 대상체의 결장직장암 위험을 결정하는 값을 도출하는 단계.
일부 예에서, 바이오마커는 단백질 바이오마커이다. 일례에서, 바이오마커는 폴리뉴클레오티드 바이오마커이다.
일부 예에서, 개시내용의 방법은, 생물학적 샘플을 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 생물학적 샘플에서 검출하고자 하는 각 바이오마커에 개별적으로 결합하는 적어도 하나의 항체가 존재한다. 바람직하게는, 항체는 주어진 바이오마커에 특이적으로 결합한다. 일부 예에서는, 하나 초과의 항체가, 예를 들어 "샌드위치" 형식으로, 단일 바이오마커에 결합할 수 있다.
일부 예에서, 측정 형식은 면역검정이다. 또 다른 예에서, 면역검정은 ELISA이고, 전형적으로 여기서는 ELISA 플레이트의 표면에 결합된 포착 항체 및 포착 항체에 대한 바이오마커의 결합을 검출하기 위한 검출 항체가 존재할 것이다. 일례에서, 항체는 검출가능하게 라벨링될 수 있다. 일례에서 포착 항체는 검출 항체와 동일한 항체 또는 상이한 항체일 수 있다. 항체의 라벨링 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일부 예에서, 바이오마커가 폴리뉴클레오티드인 경우, 분석 방법은 개별 바이오마커에 상응하는 유전자 전사체를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 친숙할 것이다.
모델 구축 및 통계 분석을 수행하는 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 일부 예에서는, 선형 또는 비선형 회귀가 수행된다. 방법은 또한 베이시안(Baeysian) 확률 알고리즘을 활용할 수도 있다.
일부 예에서, 바이오마커 패널의 분석은 대상체에 대한 치료 요법을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커의 측정으로부터 얻은 통계 값은 결장직장암의 최종적 진단을 제공하기 위해 대장내시경검사 또는 구불창자내시경검사에 의한 추가 치료에 대한 정보를 제공하는 데 사용될 수 있다.
제5 측면에서는, 결장직장암을 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료 방법이 제공되며, 방법은
(i) 본원에 기재된 방법에 따라 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 중의 바이오마커의 패널에 대한 측정을 결정하는 단계; 및
(ii) 대상체를 대장내시경검사 또는 구불창자내시경검사에 의해 치료하는 단계를 포함한다.
임의의 측면에 따른 또 다른 예에서, 방법은 대상체로부터 생물학적 샘플을 얻는 것을 추가로 기재한다. 추가의 예에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플이다. 또 다른 예에서, 샘플은 혈청 또는 혈장 샘플이다. 생물학적 샘플을 얻는 방법은 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어 혈액 샘플의 추출의 경우, 정맥 채혈을 수행하는 것이 바람직하다.
제6 측면에서는, 본원에 기재된 바이오마커 패널 내의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 라벨링된 항체를 포함하는 조성물이 제공된다.
제7 측면에서는, 하기를 포함하는 키트가 제공된다:
(i) 본원에 기재된 바이오마커 패널 내의 바이오마커에 결합하는 라벨링된 항체; 및
(ii) 바이오마커 패널 내의 바이오마커의 검출을 수행하기 위한 설명서.
일부 예에서, 키트는 또한 바이오마커 패널 내의 각 바이오마커에 결합하는 포착 항체가 부동화된 표면을 포함한다. 일부 예에서, 키트는 또한 바이오마커 패널 내의 각 바이오마커에 결합하는 포착 항체가 부동화된 ELISA 플레이트를 포함한다. 일부 예에서, 키트는 또한 바이오마커 패널 내의 각 바이오마커에 결합하는 포착 항체가 부동화된 비드 (예: 마이크로비드 또는 자기 비드)를 포함한다. 일부 예에서, 키트는 또한 컴퓨터 생성 알고리즘에 의한 검출된 바이오마커의 분석을 위한 설명서를 제공한다. 추가의 예에서는, 임상 보고서가 만들어진다.
제8 측면에서는, 본원에 기재된 바이오마커 패널 내의 바이오마커의 측정을 기반으로 한 통계 값을 생성하기 위한 알고리즘을 포함하는 소프트웨어 패키지와 함께 본원에 기재된 바와 같은 키트가 제공된다.
제9 측면에서는, 하기를 포함하는, 결장직장암이 의심되는, 또는 그의 보다 큰 위험에 있는 대상체를 결정하기 위한 시스템이 제공된다:
(i) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정으로서, 여기서 측정은 패널 내의 각 바이오마커의 농도인 것,
(ii) 패널 내의 각 바이오마커의 농도를 수신하기 위해 컴퓨터에 작동 가능하게 연결된 입력 장치를 포함하는 컴퓨터에 패널 내의 각 바이오마커의 농도를 입력하는 것;
(iii) 사용자에게 정보를 제공하기 위해 컴퓨터에 연결된 출력 장치; 및
(iv) 컴퓨터에 의해 실행되는 알고리즘으로서, 여기서 알고리즘은 입력 장치에 의해 수신된 데이터를 기반으로 하여 실행되고, 여기서 알고리즘은 위험 점수를 계산하는 것.
도 1-1 및 1-2 (A)는 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 10-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도를 95% 특이도에서 85.6 - 82.2% 범위의 민감도로 나타낸다. (B)는 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 9-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도를 95% 특이도에서 84.7 - 81.7% 범위의 민감도로 나타낸다. (C) 95% 특이도에서 84.2-80.6% 범위의 민감도로 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 8-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (D) 95% 특이도에서 83.2 - 79.2% 범위의 민감도로 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 7-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (E) 95% 특이도에서 80.4 - 77.0% 범위의 민감도로 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 6-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (F) 95% 특이도에서 >75% (범위, 80.5 - 75.0%)의 민감도로 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 74개의 5-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도.
도 2-1 및 2-2 (A)는 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 10-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도를 95% 특이도에서 86.8% 내지 83.5% 범위의 민감도로 나타낸다. (B)는 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 9-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도를 95% 특이도에서 87.0% 내지 82.9% 범위의 민감도로 나타낸다. (C) 95% 특이도에서 85.1% 내지 81.7% 범위의 민감도로 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 8-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (D) 95% 특이도에서 84.2% 내지 79.9% 범위의 민감도로 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 7-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (E) 95% 특이도에서 83.2% 내지 77.5% 범위의 민감도로 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 6-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (F) 95% 특이도에서 >75% (범위, 80.0 - 75.0%)의 민감도로 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 73개의 5-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도.
도 3-1 및 3-2 (A)는 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 10-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도를 나타낸다. (B)는 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 9-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도를 나타낸다. (C) 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 8-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (D) 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 7-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (E) 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 6-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (F) 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 5-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도.
도 4-1 및 4-2 (A) 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 10-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (B) 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 9-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (C) 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 8-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (D) 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 7-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (E) 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 6-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (F) 95% 특이도에서 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 5-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도.
도 5-1 및 5-2 (A) 95% 특이도에서 남성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 10-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (B) 95% 특이도에서 남성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 9-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (C) 95% 특이도에서 남성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 8-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (D) 95% 특이도에서 남성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 7-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (E) 95% 특이도에서 남성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 6-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (F) 95% 특이도에서 > 75%의 민감도로 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 5-바이오마커 조합에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도.
도 6-1 및 6-2 (A) 95% 특이도에서 남성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 10-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (B) 95% 특이도에서 남성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 9-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (C) 95% 특이도에서 남성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 8-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (D) 95% 특이도에서 남성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 7-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (E) 95% 특이도에서 남성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 100개의 6-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도. (F) 95% 특이도에서 > 75%의 민감도로 여성 암 환자로부터의 혈청과 건강한 대조군의 것들을 구별하는 상위 5-바이오마커 조합 (플러스 연령)에서 각 바이오마커가 나타나는 빈도.
도 7은 연구 9에 대한 훈련 및 시험 구조를 나타낸다. 이 도는 훈련 시험 구성의 예를 나타낸다 (즉, 코호트 2는 알고리즘 훈련에도 사용되었고, 코호트 1은 시험에 사용되었음).
상세한 설명
일반적 기술 및 정의
달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 문서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 간주된다 (예: 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학에서).
달리 지시되지 않는 한, 본 발명에서 활용되는 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기술은 당업자에게 잘 알려진 표준 절차이다. 이러한 기술은 하기와 같은 출처의 문헌에 기재되어 있고 그 전반에 걸쳐 설명되어 있다: J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edn, Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001), R. Scopes, Protein Purification - Principals and Practice, 3rd edn, Springer (1994), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지의 모든 업데이트 포함).
본원에서 사용되는 바와 같이 "결장직장암 (CRC)"은 결장 또는 직장에서 시작되는 암을 지칭한다. 이들 암은 이들이 시작되는 위치에 따라 결장암 또는 직장암으로 별도로 지칭될 수도 있다. 결장암 및 직장암은 공통적으로 많은 특징을 갖는다. 결장직장암의 95% 초과가 선암종으로서 공지된 암의 유형이다. 이들 암은 점액을 만들어 결장 및 직장의 내부를 윤활시키는 샘으로부터 유래된 세포에서 시작된다. 대부분의 경우, 이들 세포는 먼저 선종이라 불리는 결장직장 상피의 양성 성장을 형성하며, 결장직장암의 90% 초과가 처음에는 이들 다른 상태의 양성 선종 내에서 고도 이형성 조직의 작은 병소로 나타난다. 다른, 보다 덜 통상적인 유형의 종양도 결장 및 직장에서 시작될 수 있다. 이들은 카르시노이드 종양, 위장관 간질 종양 (GIST), 림프종, 및 육종을 포함한다. 바람직한 예에서, 상기 결장직장암은 선암종이다. 선암종은 임상 관리를 안내하는 것을 돕도록 스테이징된다. 결장직장암에 가장 종종 사용되는 스테이징 시스템은 AJCC (American Joint Committee on Cancer) TNM 시스템 (https://www.cancer.org/cancer/colon-rectal-cancer/detection-diagnosis-staging/staged.html)이며, 이는 3개의 주요 정보 부분을 기반으로 한다:
Figure pct00001
T - 종양의 크기 (수준 0-4):
o 암이 결장 또는 직장 벽 안으로 얼마나 성장했는가: 이것이 여전히 결장 상피에 국한되어 있는가? 이것이 상피 바로 아래 얇은 근육 층까지 침투했는가? 이것이 얇은 근육 층 아래의 섬유상 조직으로 침투했는가? 이것이 아래의 보다 두꺼운 근육 층으로 침투했는가? 이것이 주요 근육 층 아래의 결합 조직의 층으로 침투했는가?
N - 림프절 침범 수준 (수준 0-2): 암이 인근 림프절로 확산되었는가? 그렇다면, 얼마나 많이?
M - 전이성 확산의 수준 (수준 0-1): 암이 먼 림프절 또는 간 또는 폐 등의 먼 기관으로 확산되었는가?
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "바이오마커"는, 생물학적 시스템의 생리학적 상태의 지표로서 측정될 수 있는 임의의 생물학적 화합물을 지칭한다. 일부 예에서, 바이오마커는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산이다. 일부 예에서, 바이오마커는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 바이오마커는 또한 본원에 추가로 기재된 바와 같은 대상체의 연령, 성별 및/또는 BMI일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "측정"은, 주어진 물질의 정성적 또는 정량적 농도 수준의 도출을 포함한, 샘플 중의 해당 물질의 존재, 부재, 수량 또는 양의 평가를 지칭한다. 용어 "측정"은, 샘플 중의 바이오마커(들)의 존재 또는 부재를 검출하고/거나, 샘플 중의 바이오마커(들)의 양을 정량화하고/거나, 바이오마커의 유형에게 자격부여하는 것을 포함하는 방법을 의미한다. 측정은 질량 분광측정 접근법 및 면역검정 접근법 (예: ELISA)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업계에 공지된 방법 및 본원에 추가로 기재된 방법에 의해 달성될 수 있거나, 또는 본원에 기재된 마커 중 하나 이상을 검출 및 측정하기 위해 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 바이오마커 서열에 대한 참조는 표 2에서 찾아볼 수 있으며, 이는 UniProt (uniprot.org) 및 NCBI/Genbank 가입 번호 (ncbi.nlm.nih.gov/genbank)를 제공한다.
용어 "검출"은 검출할 바이오마커의 존재, 부재 또는 양을 식별하는 것을 지칭한다. 비제한적 예는 단백질, 펩티드, 또는 핵산의 검출을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
용어 "보고서"는 본 발명의 방법으로부터 의사에게 제공되는 인쇄된 결과를 의미한다. 보고서는 병리학적 상태의 존재, 성질, 또는 위험을 나타낼 수 있다. 보고서는 또한, 어떤 치료가 가장 적절한지 (예: 무조치, 수술, 추가 시험, 또는 치료적 작용제의 투여)를 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 대상체로부터의 세포 또는 세포의 집단 또는 일정량의 조직 또는 체액을 지칭한다. 가장 종종, 샘플은 대상체로부터 제거되었지만, 용어 "생물학적 샘플"은 또한 생체내에서, 즉 대상체로부터의 제거 없이 분석된 세포 또는 조직을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, "생물학적 샘플"은 혈액, 타액, 또는 소변의 비-세포 분획을 지칭한다. 생물학적 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 림프, 또는 소변을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "대조군 참조"는 변동을 연구하거나 비정상 상태 분자 또는 질환에 걸리지 않은 정상 건강 상태를 비교하기 위한 상대적 마커로서 사용되는 알려진 정상 상태 분자 또는 질환에 걸리지 않은 건강한 상태를 지칭하거나, 또는 이는 값의 교정 또는 정규화에 사용될 수도 있다. 일부 예에서, 대조군 참조 값은 바이오마커 농도의 조합 또는 농도 범위의 조합과 같은 계산된 값이다.
용어 "면역검정"은 항원 (예: 마커)에 특이적으로 결합하도록 항체를 사용하는 분석이다. 면역검정은 항원을 단리, 표적화, 및/또는 정량화하기 위해 특정 항체의 특이적 결합 특성을 사용하는 것을 특징으로 한다.
용어 "항체"는, 에피토프에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 그의 단편에 의해 실질적으로 인코딩되는 폴리펩티드 리간드를 지칭한다. 항체는, 예를 들어, 온전한 면역글로불린으로서 또는 다양한 펩티다제로의 소화에 의해 생산된 특성이 잘 알려진 다수의 단편으로서 존재한다. 이는, 예를 들어 Fab" 및 F(ab)"2 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 또한 전체 항체의 변형에 의해 생산된 항체 단편 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 드 노보(de novo) 합성된 것들을 포함한다. 이는 또한 다클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 단일 사슬 항체를 포함한다. 항체의 "Fc" 부분은 하나 이상의 중쇄 불변 영역 도메인을 포함하지만 중쇄 가변 영역을 포함하지 않는 면역글로불린 중쇄의 부분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 결장직장암이 발병할 수 있는 임의의 동물을 지칭하고, 이는 포유동물, 예를 들어 인간, 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 고양이 및 개, 실험실 동물, 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 기니아 피그, 및 가축 등의 동물을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 대상체로부터 얻은 건강한 및/또는 병리학적 상태의 생물학적 체액, 조직, 또는 세포의 샘플을 지칭한다. 바람직하게는, 용어 "샘플"은 혈액 샘플, 더욱 바람직하게는 혈청 샘플이다.
일반적 개요
본 개시내용은, 결장직장암을 나타내는 바이오마커를 결정하기 위한 컴퓨터에 의해 실행가능한 알고리즘과 커플링된 검정을 사용한 대상체로부터의 생물학적 샘플의 분석 방법을 제공한다. 일반적으로, 방법은 대상체의 생물학적 샘플 중에 존재하는 단백질을 사용하여 바이오마커 또는 바이오마커 프로파일을 식별하고 그에 따라 결장직장암을 갖는 또는 결장직장암의 보다 높은 위험에 있는, 또한 대장내시경검사 또는 구불창자내시경검사 등의 추가의 스크리닝을 필요로 할 수 있는 대상체를 식별한다.
본 개시내용은 또한, 일반적으로 본원에 제공되는 바이오마커의 검출에 사용되는 조성물을 포함할 상업적 진단 키트를 제공한다.
바이오마커
본 개시내용은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 측정된 바이오마커의 패널을 활용하여 결장직장암을 갖는, 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체를 식별한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 '바이오마커"는, 생물학적 시스템의 생리학적 상태의 지표로서 측정될 수 있는 모든 생물학적 화합물을 지칭한다. 일부 예에서, 바이오마커는 단백질 바이오마커이다. 다른 예에서, 바이오마커는 핵산 바이오마커이다.
본 연구는 결장직장암의 위험이 증가된 대상체를 식별하기 위한 유익한 바이오마커로서 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF)의 특별한 역할을 입증하였다. BDNF는 결장직장암을 포함한 고형 종양에서 상승되는 것으로 관찰되었다 (Yang X et al., (2013) Exp Ther Med 6(6):1475-1481). 또한, 이 바이오마커가 CRC의 공지된 마커인 M2PK와 조합되는 경우, 검출 민감도는 대변 잠혈 검사 (FOBT)로 달성된 것과 유사하거나 그 초과이다. 호주 암 협의회에 따르면, 진행성 선종에 대한 FOBT의 민감도는 약 93% 특이도에서 16-64% 범위이다 (https://wiki.cancer.org.au/policy/Bowel_cancer/Screening 참조).
일부 예에서, 바이오마커 패널은 DKK3, M2PK, TGFβ, IGFBP2, TIMP1, BDNF, IL6, IL8, TNFα, IGFII, 리포칼린, M30, M65, Mac2BP, MMP1, MMP7, MIP1β, 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 바이오마커를 포함할 수 있다.
임의의 이들 바이오마커의 참조는 당업자에 의해 공지되어 있는 이소형 및 전사체 변이체와 같은 모든 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 변이체에 대한 참조를 포함한다. 각 바이오마커에 대한 대표적인 서열의 NCBI 가입 번호는 실시예의 표 1에 제공되어 있다.
일부 예에서는, 인구통계학적 또는 형태계측학적 항이 또한, 분석, 예를 들어 로지스틱 회귀 알고리즘에 포함될 수 있음을 이해할 것이다. 인구통계학적 또는 형태계측학적 항은 연령, 성별, 흡연 이력, 체질량 지수 (BMI) 및 엉덩이-허리 비율을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 예에서, 개시내용의 방법은 또한 본원에 기재된 바이오마커 패널 내의 바이오마커로서의 대상체의 성별의 포함을 고려한다. 이론에 얽매이지 않고, 여성에 대해 임의 값 및 남성에 대해 상이한 임의 값을 할당함으로써 대상체의 성별을 로지스틱 회귀 알고리즘에 포함시킬 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 임의 값의 수치는 중요하지 않지만, 남성 및 여성에 대해 상이한 임의 값이 할당되는 것이 중요하다. 일례에서, 여성에 대해 1 및 남성에 대해 0의 임의 값을 할당함으로써 대상체의 성별을 로지스틱 회귀 알고리즘에 포함시킬 수 있다. 일례에서, 여성에 대해 1.1 및 남성에 대해 1의 임의 값을 할당함으로써 대상체의 성별을 로지스틱 회귀 알고리즘에 포함시킬 수 있다.
일부 예에서, 개시내용의 방법은 또한, 본원에 기재된 바이오마커 패널 내의 바이오마커로서의 대상체의 연령의 포함을 고려한다.
샘플 준비 및 프로세싱
생물학적 샘플의 분석 전에, 샘플에 대해 하나 이상의 샘플 제조 작업을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로 이러한 샘플 준비 작업은, 샘플로부터의 핵산, 단백질, 또는 기타 거대분자의 추출과 같은, 세포 또는 조직으로부터의 세포내 물질의 추출 및 단리와 같은 조작을 포함할 수 있다.
개시내용의 방법과 사용될 수 있는 샘플 준비는 원심분리, 친화성 크로마토그래피, 자력 분리, 분별분리, 침전, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
샘플 준비는 주어진 검정에 의해 적절한 범위의 농도 수준이 검출되도록 보장하기 위한 적절한 용매 및 양에 의한 희석을 추가로 포함할 수 있다.
샘플의 세포간 공간으로부터 핵산 및 거대분자에 접근하는 것은 일반적으로 물리적, 화학적 방법, 또는 이들 둘 다의 조합에 의해 수행될 수 있다. 방법의 일부 적용에서는, 조 추출물의 단리 후, 핵산, 단백질, 세포막 입자 등을 분리하는 것이 종종 바람직할 것이다. 방법의 일부 예에서, 핵산을 그의 단백질, 및 세포막 입자와 함께 유지하는 것이 바람직할 것이다.
본원에 제공된 방법의 일부 예에서는, 핵산 및 단백질이 개시내용의 방법을 사용한 분석 전에 생물학적 샘플로부터 추출될 수 있다. 추출은, 세제 용해물, 음파처리, 또는 유리 비드로의 볼텍싱의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는 수단에 의해 수행될 수 있다.
일부 예에서는, 구배 원심분리 (예: 염화세슘 구배, 수크로스 구배, 글루코스 구배 등), 원심분리 프로토콜, 비등, 정제 키트, 및 Trizol 또는 DNAzol을 사용하는 방법과 같은 작용제 추출 방법으로의 액체 추출의 사용을 이용하는 기술을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업계에서의 적합한 임의의 기술을 사용하여 분자를 단리할 수 있다.
샘플은 요망되는 검출 방법에 따라 표준 생물학적 샘플 준비에 따라 준비될 수 있다. 예를 들어 질량 분광측정법 검출의 경우, 환자로부터 얻은 생물학적 샘플에 대하여 원심분리, 여과, 면역친화성 컬럼에 의한 프로세싱, 분획으로의 분리, 부분적으로 소화, 및 이들의 조합을 수행할 수 있다. 다양한 분획을 완충제 또는 검출 및 분석을 위한 다른 유형의 로딩 용액, 예컨대 LCMS 로딩 완충제와 같은 적절한 담체 중에 재현탁시킬 수 있다.
바이오마커 측정
바이오마커 패널의 측정은 복수의 바이오마커의 정량적 측정에 관한 것이다. 본 개시내용은 생물학적 샘플에서 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다. 바이오마커는 단백질, DNA 분자, 및 RNA 분자를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 결장직장암을 얻을 증가된 위험을 갖거나 결장직장암을 갖는 대상체에서 차등적으로 발현되는 단백질 바이오마커의 발견을 기반으로 한다. 따라서, 생물학적 샘플 중의 이들 차등적으로 발현되는 바이오마커 중 하나 이상의 검출은 대상체가 결장직장암을 앓을 위험에 있거나 앓고 있는지의 여부 및 병태의 성질 또는 상태의 유형이 무엇인지에 대한 유용한 정보를 제공한다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 본원에 기재된 바이오마커 중 하나 이상을 검출할 수 있다.
본 개시내용에서 사용될 수 있는 유용한 분석물 포착 작용제는 항체, 예컨대 항체 함유 조 혈청체, 정제된 항체, 단일클론 항체, 다클론 항체, 합성 항체, 항체 단편 (예를 들어 Fab 단편); 항체 상호작용 작용제, 예컨대 단백질 A, 탄수화물 결합 단백질, 및 기타 상호작용제; 단백질 상호작용제 (예를 들어 아비딘 및 그 유도체); 펩티드; 및 효소 기질, 보조 인자, 금속 이온/킬레이트 및 합텐과 같은 작은 화학 물질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체는 표적 또는 고체 표면 (예: 바이오칩 및 컬럼)에 대한 결합을 최적화하기 위해 변형되거나 화학적으로 처리될 수 있다.
개시내용의 하나의 특정 예에서, 바이오마커는 면역검정을 사용하여 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다. 면역검정은 항원 (예: 단백질 또는 펩티드 상의 부위, 바이오마커 표적)에 특이적으로 결합하거나 이를 인식하는 항체를 사용하는 검정이다. 방법은, 생물학적 샘플을 항체와 접촉시키고 항체가 샘플 중의 항원과 복합체를 형성할 수 있게 하는 단계, 샘플을 세척하는 단계 및 항체-항원 복합체를 검출 시약으로 검출하는 단계를 포함한다. 일례에서, 바이오마커를 인식하는 항체는 상업적으로 입수가능할 수 있다. 또 다른 예에서, 바이오마커를 인식하는 항체는 공지된 항체 생성 방법에 의해 생성될 수 있다.
대안적으로, 샘플 중의 마커는 간접적 검정을 사용하여 검출할 수 있으며, 여기서는, 예를 들어, 제2의 라벨링된 항체를 사용하여 결합된 마커-특이적 항체를 검출한다. 예시적 검출가능 라벨은 자기 비드 (예: DYNABEADS™), 형광 염료, 방사성 라벨, 효소 (예: 서양고추냉이, 알칼리성 포스파타제 및 통상적으로 사용되는 기타의 것들), 및 비색 라벨, 예컨대 콜로이드 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱 비드를 포함한다. 샘플 중의 마커는, 예를 들어, 마커의 별개의 에피토프에 결합하는 단일클론 항체를 혼합물과 동시에 인큐베이션하는 경쟁 또는 억제 검정을 사용하여 및/또는 이것에서 검출할 수 있다.
면역검정을 사용하여 항원을 검출하기 위한 조건은 사용되는 특정 항체에 따라 달라진다. 또한, 인큐베이션 시간은 검정 형식, 마커, 용액의 부피, 농도 등에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 면역검정은 실온에서 수행될 것이지만, 이들은 사용되는 항체에 따라 섭씨 10도 내지 40도와 같은 다양한 온도에서 수행될 수 있다.
본 개시내용의 바이오마커의 검출을 위한 검정을 맞춤화하기 위해 출발 기초로서 사용될 수 있는 다양한 유형의 면역검정이 당업계에 공지되어 있다. 유용한 검정은, 예를 들어, 샌드위치 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 포함한 ELISA 등의 효소 면역 검정 (EIA)을 포함할 수 있다. 이들 접근법의 다양한 변형이 존재하지만, 이들은 유사한 아이디어를 기반으로 한다. 예를 들어, 항원이 고체 지지체 또는 표면에 결합될 수 있는 경우, 이를 특정 항체와 반응시켜 검출할 수 있으며, 항체는 이를 2차 항체와 반응시키거나 1차 항체에 직접 라벨을 통합하여 정량할 수 있다. 대안적으로, 항체가 고체 표면에 결합되고 항원이 첨가될 수 있다. 이어서 항원 상의 별개의 에피토프를 인식하는 제2 항체를 첨가하고 검출할 수 있다. 이는 빈번히 '샌드위치 검정'이라 불리고, 높은 배경 또는 비-특이적 반응의 문제를 피하기 위해 빈번히 사용될 수 있다. 이들 유형의 검정은 생물학적 샘플 중의 저농도의 항원을 측정하기에 충분히 민감성이고 재현가능하다.
면역검정을 사용하여 샘플 중의 마커의 존재 또는 부재 뿐만 아니라 샘플 중의 마커의 양을 결정할 수 있다. 항체-마커 복합체의 양, 또는 존재를 측정하는 방법은 형광, 발광, 화학발광, 흡광도, 반사율, 투과율, 복굴절 또는 굴절률 (예: 표면 플라스몬 공명, 타원편광법, 공명 거울 방법, 격자 커플러 도파관 방법 또는 간섭계)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 이들 시약은 다양한 형태의 현미경검사, 이미징 방법, 및 비-이미징 방법과 같은 광학 검출 방법과 함께 사용된다. 전기화학적 방법은 전압전류법, 전류법 및 전기화학발광법을 포함한다. 무선 주파수 방법은 다극 공명 분광법을 포함한다.
일례에서, 개시내용은 바이오마커의 검출을 위해 항체를 사용할 수 있다. 본 검정의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체는 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 다량의 항체를 위해 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 또는 말 등의 포유동물에 항원을 주입함으로써 다클론 항체를 생산할 수 있다. 이들 동물로부터 단리된 혈액은 다클론 항체 (동일한 항원에 결합하는 다수의 항체)를 함유한다. 대안적으로, 달걀 노른자에서 다클론 항체의 생성을 위해 닭에 항원을 주입함으로써 다클론 항체를 생산할 수 있다. 추가로, 바이오마커의 인산화된 형태와 같은 바이오마커에 대한 변형된 형태를 특이적으로 인식하는 항체가 만들어질 수 있으며, 다시 말해서, 이들은 인산화 후 티로신 또는 세린을 인식할 것이지만, 포스페이트의 부재 하에는 그렇지 않다. 이러한 방식으로, 항체를 사용하여 특정 바이오마커의 인산화 상태를 결정할 수 있다.
항체는 상업적으로 얻거나 잘 확립된 방법을 사용하여 생산할 수 있다. 항원의 단일 에피토프에 대해 특이적인 항체를 얻기 위해, 항체-분비 림프구를 동물로부터 단리하고 이들을 암 세포주와 융합시켜 불멸화시킨다. 융합된 세포는 하이브리도마라 불리며, 배양 중에 지속적으로 성장하고 항체를 분비할 것이다. 단일 하이브리도마 세포는 희석 클로닝에 의해 단리되어 모두 동일한 항체를 생산하는 세포 클론을 생성하며; 이들 항체는 단일클론 항체라 불린다.
다클론 및 단일클론 항체는 여러 방식으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L과 같은 박테리아 단백질 또는 재조합 융합 단백질인 단백질 A/G에 커플링된 항원-친화성 크로마토그래피를 사용하여 항체를 단리한 후 용출액 분획의 280 nm 흡광도에서의 UV 광을 통해 검출하여 어떤 분획이 항체를 함유하는지를 결정할 수 있다. 단백질 A/G는 인간 IgG의 모든 서브클래스에 결합하여, 서브클래스가 결정되지 않은 다클론 또는 단일클론 IgG 항체를 정제하는 데 이를 유용하게 만든다. 추가로, 이는 IgA, IgE, IgM 및 (보다 낮은 정도로) IgD에 결합한다. 단백질 A/G는 또한 마우스 IgG의 모든 서브클래스에 결합하지만 마우스 IgA, IgM 또는 혈청 알부민에는 결합하지 않는다. 이 특징은, 단백질 A/G가 IgA, IgM 및 혈청 알부민으로부터의 간섭 없이 마우스 단일클론 IgG 항체의 정제 및 검출에 사용될 수 있게 한다.
항체는, 예를 들어, IgA, IgA IgD, IgE, IgM 및 IgG와 같은 분자의 상이한 부류 또는 이소타입으로부터 유래될 수 있다. 생물학적 연구에서 가장 유용한 항체는 IgG 부류이며, 이는 만들어지고 분비되고 특정 항원을 인식할 수 있는 단백질 분자이다. IgG는 2개의 "중"쇄 및 2개의 "경"쇄를 포함한 2개의 서브유닛으로 구성된다. 이들은 대칭 구조로 조립되어 있으며 각 IgG는 2개의 동일한 항원 인식 도메인을 갖는다. 항원 인식 도메인은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 아미노산의 조합이다. 분자는 대략 "Y"와 같은 형상이며 분자의 아암(arm)/팁은 항원-인식 영역 또는 Fab (단편, 항원 결합) 영역을 포함하지만, Fc (단편, 결정화가능) 영역의 줄기는 인식에 관여하지 않고 상당히 일정하다. 불변 영역은 동일한 이소타입의 모든 항체에서 동일하지만, 상이한 이소타입의 항체에서는 상이하다.
웨스턴 블롯팅에 의해 분별분리 후 단백질을 검출하기 위해 항체를 사용하는 것도 가능하다. 일례에서, 개시내용은 바이오마커의 검출을 위해 웨스턴 블롯팅을 사용할 수 있다. 웨스턴 블롯 (단백질 면역블롯)은 주어진 샘플 또는 샘플로부터의 단백질 추출물 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 사용되는 분석 기술이다. 이는 겔 전기영동, SDS-PAGE를 사용하여 네이티브 단백질을 그의 3-차원 구조에 의해 분리하거나, 또는 이는 단백질을 그의 길이에 의해 분리하도록 변성 조건 하에 실행될 수 있다. 이어서, 겔 전기영동에 의한 분리 후, 단백질은 막 (전형적으로 니트로셀룰로스 또는 PVDF)으로 전달된다. 이어서 SDS-PAGE로부터 막으로 전달된 단백질은 온화한 교반 하에 특정 항체와 인큐베이션되고, 비-특이적 결합을 제거하도록 헹구어질 수 있고, 블롯에 결합된 단백질-항체 복합체는 1-단계 또는 2 단계 검출 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 1 단계 방법은 관심 단백질을 인식하고 또한 검출가능한 라벨을 함유하는 프로브 항체를 포함하며, 여기서 프로브는 공지된 단백질 택에 대하여 종종 이용가능한 것이다. 2-단계 검출 방법은 리포터 효소 또는 그에 결합된 리포터를 갖는 2차 항체를 포함한다. 적절한 참조 대조와 함께, 이 접근법을 사용하여 단백질의 풍부성을 측정할 수 있다.
일례에서, 개시내용의 방법은 유세포 분석법을 사용할 수 있다. 유세포 분석법은 바이오마커 검출, 정량화 (세포 계수) 및 세포 단리에 사용될 수 있는 레이저 기반의 생물리학적 기술이다. 이 기술은 건강 장애, 특히 혈액암의 진단에 일상적으로 사용된다. 일반적으로, 유세포 분석법은 단일 세포를 유체의 스트림 중에 현탁시킴으로써 작동하며, 단일 파장의 광선 (통상적으로 레이저 광선)이 액체의 스트림 상으로 지향되고, 통과하는 세포에 의해 발생하는 산란 광이 전자 검출 장치에 의해 검출된다. 형광-활성화 세포 선별 (FACS)은 관심 세포 상의 항원을 검출하기 위해 형광-라벨링된 항체의 도움을 종종 사용하는 특수화된 유형의 유세포 분석법이다. FACS에서 항체 라벨링 사용의 이러한 추가의 특징은 각 세포 형광-라벨링된 세포의 특정 광 산란 및 형광 특징을 기반으로 하는 동시적인 다중파라미터 분석 및 정량화를 제공하며, 이는 전통적인 유세포 분석법이 제공하는 것 뿐만 아니라 관심 세포의 집단의 물리적 분리도 제공한다.
또 다른 예에서, 유세포 분석법은 비드 시스템과 조합되며, 여기서 표적 항원은 비드에 부착된다. 이러한 시스템은 당업자에게 공지되어 있다.
폭넓은 범위의 형광단이 유세포 분석법에서 라벨로서 사용될 수 있다. 형광단은 전형적으로 세포 상의 또는 세포 내의 표적 특징부를 인식하는 항체에 부착된다. 적합한 형광 라벨의 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 플루오레세인 (FITC), 5,6-카르복시메틸 플루오레세인, 텍사스 레드, 니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일 (NBD), 및 시아닌 염료 Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 및 Cy7. 기타 형광 라벨, 예컨대 Alexa Fluor® 염료, DNA 내용물 염료, 예컨대 DAPI, Hoechst 염료가 당업계에 잘 알려져 있고, 모두 다양한 상업적 공급원으로부터 용이하게 얻을 수 있다. 각 형광단은 특징적 피크 여기 및 방출 파장을 갖고, 방출 스펙트럼은 종종 중첩된다. 이들 형광체의 흡수 및 방출 최대 각각은 하기와 같고: FITC (490 nm; 520 nm), Cy3 (554 nm; 568 nm), Cy3.5 (581 nm; 588 nm), Cy5 (652 nm: 672 nm), Cy5.5 (682 nm; 703 nm) 및 Cy7 (755 nm; 778 nm), 그에 따라 많은 스펙트럼 중첩을 갖지 않는 것의 선택은 이들의 동시 검출을 가능하게 한다. 형광 라벨은 다양한 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 구별가능한 형광 라벨의 최대 수는 대략 17 또는 18개 정도의 상이한 형광 라벨인 것으로 여겨진다. 이러한 수준의 복잡한 판독은 인공물을 제한하기 위한 힘든 최적화, 뿐만 아니라 중첩되는 스펙트럼을 분리하기 위한 복잡한 디콘볼루션 알고리즘을 필요로 한다. 양자점은 이들의 보다 좁은 방출 피크로 인해 전통적인 형광단 대신에 때때로 사용된다. 검출에 사용될 수 있는 기타 방법은 란타나이드 동위원소와 같은 동위원소 라벨링된 항체를 포함한다. 그러나, 이 기술은 궁극적으로 세포를 파괴하여, 추가 분석을 위한 이들의 복구를 불가능하게 한다.
일례에서, 개시내용의 방법은 본 개시내용의 바이오마커의 발현 수준을 검출하기 위해 면역조직화학을 사용할 수 있다. 따라서, 각 마커에 특이적인 항체는 생물학적 샘플 중의 청구된 바이오마커의 발현을 검출하는 데 사용된다. 항체는, 예를 들어, 방사성 라벨, 형광 라벨, 비오틴과 같은 합텐 라벨, 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제와 같은 효소를 사용하여, 항체 자체를 직접 라벨링함으로써 검출될 수 있다. 대안적으로, 라벨링되지 않은 1차 항체는 1차 항체에 특이적인 항혈청, 다클론 항혈청 또는 단일클론 항체를 포함하는 라벨링된 2차 항체와 함께 사용된다. 면역조직화학 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있으며, 프로토콜 및 항체는 상업적으로 입수가능하다. 대안적으로, 생물학적 샘플에서의 발현 수준을 결정하는 데 유용할 본원에 개시된 바와 같은 바이오마커 또는 바이오마커의 변형된 버전에 대한 항체 또는 결합 파트너를 만들 수 있다
일례에서, 개시내용의 방법은 바이오칩을 사용할 수 있다. 바이오칩은 다수의 거대분자를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 이 기술에서는 거대분자가 정렬된 배열 형식으로 바이오칩의 표면에 부착된다. 시험 영역의 격자 패턴은 이미징 소프트웨어에 의해 분석되어 이들의 미리 결정된 위치 (주소)에서 개개의 분석물을 신속하게 동시에 정량화하는 것을 가능하게 하였다. CCD 카메라는 칩 상의 매우 낮은 수준의 빛을 정확하게 검출하고 정량화할 수 있는 민감한 고해상도 센서이다.
바이오칩은 고정된 핵산 분자, 전장 단백질, 항체, 아피바디 (단일클론 항체를 모방하도록 조작된 소분자), 앱타머 (핵산-기반 리간드) 또는 화학적 화합물로 설계될 수 있다. 칩은 하나의 칩 상의 다수의 거대분자 유형을 검출하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 칩은 하나의 칩 상에서 핵산 분자, 단백질 및 대사물을 검출하도록 설계될 수 있다. 바이오칩은 단일 샘플 중의 패널 바이오마커를 동시에 분석하여, 이들 바이오마커에 대한 대상체 프로파일을 생성하도록 사용 및 설계된다. 바이오칩의 사용은 다수의 분석을 수행하여 전체 프로세싱 시간 및 필요한 샘플의 양을 감소시킬 수 있게 한다.
단백질 마이크로어레이는 본 개시내용과 함께 사용될 수 있는 특정 유형의 바이오칩이다. 칩은 유리 슬라이드, 니트로셀룰로스 막, 비드, 또는 마이크로타이터 플레이트와 같은 지지 표면으로 이루어지며, 여기에 포착 단백질의 어레이가 어레이 형식으로 고체 표면 상에 결합된다. 단백질 어레이 검출 방법은 높은 신호 및 낮은 배경을 제공해야 한다. 전형적으로 형광 염료로 라벨링된 검출 프로브 분자가 어레이에 추가된다. 프로브와 부동화된 단백질 사이의 임의의 반응은 레이저 스캐너에 의해 판독되는 형광 신호를 방출한다. 이러한 단백질 마이크로어레이는 신속하고 자동화될 수 있으며 진단 시험을 위한 높은 민감도의 단백질 바이오마커 판독을 제공한다. 그러나, 이 기술과 함께 사용될 수 있는 다양한 검출 방법이 존재함을 당업자가 즉시 이해할 것이다.
현재 단백질의 생화학적 활성을 연구하는 데 사용되는 단백질 마이크로어레이의 적어도 3개의 유형이 존재한다. 예를 들어 분석 마이크로어레이 (또한 포착 어레이로서 공지됨), 기능성 단백질 마이크로어레이 (또한 표적 단백질 어레이로서 공지됨) 및 역상 단백질 마이크로어레이 (RPA)가 있다.
본 개시내용은 분석 단백질 마이크로어레이, 예컨대 Luminex xMAP Technology를 사용한 바이오마커의 검출을 제공한다. 분석 단백질 마이크로어레이는 항체, 앱타머 또는 아피바디의 라이브러리를 사용하여 구성된다. 어레이는 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 포착함으로써 기능하는 혈액, 혈청 또는 세포 용해물과 같은 복잡한 단백질 용액으로 프로빙된다. 다양한 검출 시스템을 사용하여 결과적인 결합 반응을 분석하면 샘플 중의 특정 단백질의 발현 수준에 대한 정보 뿐만 아니라 결합 친화도 및 특이도의 측정을 제공할 수 있다. 이러한 유형의 단백질 마이크로어레이는 특히 상이한 샘플에서의 단백질 발현을 비교하는 데 유용하다.
일례에서, 개시내용의 방법은 기능성 단백질 마이크로어레이를 사용할 수 있다. 이들은 다수의 정제된 전장 기능성 단백질 또는 단백질 도메인을 부동화함으로써 구성되고 단백질-단백질, 단백질-DNA, 단백질-RNA, 단백질-인지질, 및 단백질-소분자 상호작용을 식별하고, 효소 활성을 검정하고, 항체를 검출하고, 그의 특이도를 입증하는 데 사용된다. 이들 단백질 마이크로어레이 바이오칩은 샘플 중의 전체 프로테옴의 생화학적 활성을 연구하는 데 사용될 수 있다.
일례에서, 개시내용의 방법은 역상 단백질 마이크로어레이 (RPA)를 사용할 수 있다. 역상 단백질 마이크로어레이는 마이크로어레이 상에 배열되고 관심 표적 단백질에 대한 항체로 프로빙되는 조직 및 세포 용해물로부터 구성된다. 이들 항체는 전형적으로 화학발광, 형광 또는 비색 검정으로 검출된다. 용해물 내의 단백질에 추가로, 참조 대조군 펩티드를 슬라이드 상에 인쇄하여 단백질 정량화를 가능하게 한다. RPA는 질환의 결과일 수 있고 질환에 걸린 세포에 존재할 수 있는 변경된 단백질 또는 기타 작용제의 존재를 결정할 수 있게 한다.
일부 예에서, 바이오마커의 검출은 ARCHITECT 시스템 (Abbott)을 활용한다.
본 개시내용은 질량 분광법 (대안적으로 질량 분광측정법으로서 언급됨)을 사용한 바이오마커의 검출을 제공한다. 질량 분광측정법 (MS)은 대전된 입자의 질량 대 전하 비율을 측정하는 분석 기술이다. 이는 주로 샘플 또는 분자의 원소 조성을 결정하고 펩티드 및 기타 화학적 화합물과 같은 분자의 화학 구조를 밝히는 데 사용된다. MS는 화학적 화합물을 이온화하여 대전된 분자 또는 분자 단편을 생성하고 그의 질량 대 전하 비율을 측정함으로써 작동한다. MS 기기는 전형적으로 하기 3개의 모듈로 이루어진다: (1) 기체 상 샘플 분자를 이온으로 전환할 (또는, 전기분무 이온화의 경우, 용액 중에 존재하는 이온을 기체 상으로 이동시킬) 수 있는 이온 공급원 (2) 전자기장을 적용함으로써 그의 질량에 의해 이온을 선별하는 질량 분석기 및 (3) 지시자 양의 값을 측정하여 존재하는 각 이온의 풍부성을 계산하기 위한 데이터를 제공하는 검출기.
본 개시내용과 함께 사용되기에 적합한 질량 분광측정법 방법은, 전기분무 이온화 질량 분광측정법 (ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분광측정법 (MALDI-TOF-MS), 표면-강화 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광측정법 (SELDI-TOF-MS), 탠덤 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS/MS) 질량 분광측정법, 실리콘 상의 탈착/이온화 (DIOS), 2차 이온 질량 분광측정법 (SIMS), 4극자 비행 시간 (Q-TOF), 대기압 화학 이온화 질량 분광측정법 (APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS), 대기압 광이온화 질량 분광측정법 (APPI-MS), APPI-MS/MS, 및 APPI-(MS)n, 4극자 질량 분광측정법, 푸리에 변환 질량 분광측정법 (FTMS), 및 이온 트랩 질량 분광측정법 중 하나 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 여기서 n은 0 초과의 정수이다.
샘플의 기본 단백질체학에 대한 통찰력을 얻기 위해, LC-MS가 통상적으로 복잡한 혼합물의 구성요소를 분석하는 데 사용된다. LC-MS 방법은 일반적으로 프로테아제 소화 및 변성 (통상적으로 프로테아제, 예컨대 트립신 및 3차 구조를 변성시키기 위한 우레아 등의 변성제 및 시스테인 잔기를 캡핑하기 위한 아이오도아세트아미드 포함), 그 후 펩티드 질량 핑거프린팅을 사용한 LC-MS 또는 개개의 펩티드의 서열을 도출하기 위한 LC-MS/MS (탠덤 MS)를 포함한다. LC-MS/MS는 고분해능 질량 분광계를 사용해도 펩티드 질량이 중첩될 수 있는 복잡한 샘플의 프로테오믹 분석에 가장 통상적으로 사용된다. 인간 혈청과 같은 복잡한 생물학적 유체의 샘플을 먼저 SDS-PAGE 겔 또는 HPLC-SCX 상에서 분리하고 이어서 LC-MS/MS에서 실행시켜 1000개 초과의 단백질의 식별을 가능하게 할 수 있다.
다중 질량 분광계 접근법이 본원에 제공된 바와 같은 개시내용의 방법과 함께 사용될 수 있지만, 일부 응용에서는 관심 단백질의 선택된 서브세트로부터 생물학적 샘플 중의 단백질을 정량화하는 것이 요망될 수 있다. 본 개시내용과 함께 사용될 수 있는 하나의 이러한 MS 기술은 다중 반응 모니터링 질량 분광측정법 (MRM-MS)이거나, 또는 대안적으로 선택 반응 모니터링 질량 분광측정법 (SRM-MS)으로서 언급된다.
MRM-MS 기술은 삼중 4극자 (QQQ) 질량 분광계를 사용하여 관심 펩티드로부터의 양으로 대전된 이온을 선택하고, 양으로 대전된 이온을 단편화하고, 이어서 선택된 양으로 대전된 단편 이온의 풍부성을 측정한다. 이 측정은 통상적으로 전이로서 언급된다.
일부 응용에서 MRM-MS는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 또한 최근에는 초고압 액체 크로마토그래피 (UHPLC)와 커플링된다. 다른 응용에서 MRM-MS는 모든 관심 펩티드 및 단백질에 대한 요망되는 LC-MS 전이 측정을 수행하도록 QQQ 질량 분광계를 갖는 UHPLC와 커플링된다.
일부 응용에서는, 하나 이상의 관심 단백질로부터의 양으로 대전된 이온에 대한 선택을 위해 4극자 비행 시간 (qTOF) 질량 분광계, 비행 시간 (TOF-TOF) 질량 분광계, Orbitrap 질량 분광계, 4극자 Orbitrap 질량 분광계 또는 임의의 Quadrupolar Ion Trap 질량 분광계의 활용이 사용될 수 있다. 이어서, 단편화된, 양으로 대전된 이온을 측정하여 관심 펩티드 또는 단백질의 정량화를 위한 양으로 대전된 이온의 풍부성을 결정할 수 있다.
일부 응용에서, 비행 시간 (TOF), 4극자 비행 시간 (qTOF) 질량 분광계, 비행 시간 (TOF-TOF) 질량 분광계, Orbitrap 질량 분광계 또는 4극자 Orbitrap 질량 분광계의 활용은 정량을 위한 단편화 없이 관심 단백질로부터 양으로 대전된 펩티드 이온의 질량 및 풍부성을 측정하는 데 사용될 수 있다. 이 응용에서는, 분석물 질량 측정의 정확성이 검정의 선택 기준으로서 사용될 수 있다. 알려진 조성 및 농도의 동위원소 라벨링된 내부 표준이 질량 분광계 정량 방법의 부분으로서 사용될 수 있다.
일부 응용에서, 비행 시간 (TOF), 4극자 비행 시간 (qTOF) 질량 분광계, 비행 시간 (TOF-TOF) 질량 분광계, Orbitrap 질량 분광계 또는 4극자 Orbitrap 질량 분광계는 정량을 위해 관심 단백질의 질량 및 풍부성을 측정하는 데 사용될 수 있다. 이 응용에서는, 분석물 질량 측정의 정확성이 검정의 선택 기준으로서 사용될 수 있다. 임의로 이 응용은 질량 분광측정법에 의한 분석 전에 단백질의 단백질분해 소화를 사용할 수 있다. 알려진 조성 및 농도의 동위원소 라벨링된 내부 표준이 질량 분광계 정량 방법의 부분으로서 사용될 수 있다.
일부 응용에서는, 다양한 이온화 기술이 본원에 제공된 질량 분광계에 커플링되어 요망되는 정보를 생성할 수 있다. 본 개시내용과 함께 사용될 수 있는 비제한적인 예시적 이온화 기술은 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI), 탈착 전기분무 이온화 (DESI), 직접 보조 실시간 (DART), 표면 보조 레이저 탈착 이온화 (SALDI), 또는 전기분무 이온화 (ESI)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 응용에서는, HPLC 및 UHPLC가 질량 분광계에 커플링될 수 있으며, 질량 분광계 전에 많은 기타 단백질 분리 기술이 수행될 수 있다. 매트릭스 배경으로부터 요망되는 분석물 (예: 펩티드 또는 단백질)을 분리하는 데 사용될 수 있는 일부 예시적 분리 기술은 단백질 또는 펩티드의 역상 액체 크로마토그래피 (RP-LC), MALDI 전의 오프라인 액체 크로마토그래피 (LC), 1 차원 겔 분리, 2-차원 겔 분리, 강한 양이온 교환 (SCX) 크로마토그래피, 강한 음이온 교환 (SAX) 크로마토그래피, 약한 양이온 교환 (WCX), 및 약한 음이온 교환 (WAX)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 기술 중 하나 이상이 질량 분광계 분석 전에 사용될 수 있다.
개시내용의 일례에서 바이오마커는 마이크로어레이를 사용하여 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다. 차등적 유전자 발현은 또한 마이크로어레이 기술을 사용하여 식별 또는 확인될 수 있다. 따라서, 발현 프로파일 바이오마커는 마이크로어레이 기술을 사용하여 신선 조직 또는 고정 조직에서 측정될 수 있다. 이 방법에서는, 관심 폴리뉴클레오티드 서열 (cDNA 및 올리고뉴클레오티드 포함)을 마이크로칩 기판 상에 플레이팅하거나 배열한다. 이어서 배열된 서열은 관심 세포 또는 조직으로부터의 특정 DNA 프로브와 혼성화된다. mRNA의 공급원은 전형적으로 생물학적 샘플로부터 단리된 전체 RNA이며, 상응하는 정상 조직 또는 세포주를 사용하여 차등적 발현을 결정할 수 있다.
마이크로어레이 기술의 특이적 구현예에서, cDNA 클론의 PCR 증폭 삽입물은 조밀한 어레이로 기판에 적용된다. 바람직하게는 적어도 10,000개의 뉴클레오티드 서열이 기판에 적용된다. 각각 10,000개의 요소로 마이크로칩에 부동화된 마이크로어레이 유전자는, 엄격한 조건 하에 혼성화에 적합하다. 형광 라벨링된 cDNA 프로브는 관심 조직으로부터 추출된 RNA의 역전사에 의한 형광 뉴클레오티드의 통합을 통해 생성될 수 있다. 칩에 적용된 라벨링된 cDNA 프로브는 어레이 상의 DNA의 각 지점에 특이적으로 혼성화된다. 비-특이적으로 결합된 프로브를 제거하기 위해 엄격한 세척 후, 마이크로어레이 칩은 공초점 레이저 현미경검사와 같은 장치에 의해 또는 CCD 카메라와 같은 또 다른 검출 방법에 의해 스캐닝된다. 배열된 각 요소의 혼성화의 정량은 상응하는 mRNA 풍부성의 평가를 가능하게 한다. 이중 색상 형광을 사용하면, 두 가지 RNA 공급원으로부터 생성된 별도로 라벨링된 cDNA 프로브가 어레이에 쌍으로 혼성화된다. 따라서 각 특정된 유전자에 상응하는 두 공급원으로부터의 전사체의 상대적 풍부성이 동시에 결정된다. 마이크로어레이 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 상업적으로 입수가능한 장비에 의해 수행될 수 있다.
개시내용의 일례에서, 바이오마커는 qRT-PCR을 사용하여 생물학적 샘플에서 검출될 수 있으며, 이는 약물 치료 유무에 관계없이, 상이한 샘플 집단에서, 정상 및 종양 조직에서의 mRNA 수준을 비교하여, 유전자 발현의 패턴을 특성화하고, 밀접하게 관련된 mRNA를 구별하고, RNA 구조를 분석하는 데 사용될 수 있다. RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링의 제1 단계는 생물학적 샘플로부터 RNA를 추출한 후 RNA 주형을 cDNA로 역전사하고 PCR 반응에 의해 증폭시키는 것이다. 역전사 반응 단계는 일반적으로, 발현 프로파일링의 목표에 따라, 특정 프라이머, 랜덤 헥사머, 또는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 프라이밍된다. 통상적으로 사용되는 두 가지 역전사효소는 아빌로 골수모구증 바이러스 역전사효소 (AMV-RT) 및 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 역전사 효소 (MLV-RT)이다.
PCR 단계는 다양한 내열성 DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있지만, 이는 전형적으로 5'-3' 뉴클레아제 활성을 갖지만 3'-5' 교정 엔도뉴클레아제 활성은 부족한 Taq DNA 폴리머라제를 사용한다. 따라서, TaqMan™ PCR은 전형적으로 Taq 또는 Tth 폴리머라제의 5'-뉴클레아제 활성을 활용하여 그의 표적 앰플리콘에 결합된 혼성화 프로브를 가수분해하지만, 동등한 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 효소가 사용될 수 있다. 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 PCR 반응의 전형적인 앰플리콘을 생성하는 데 사용된다. 제3 올리고뉴클레오티드, 또는 프로브는 두 PCR 프라이머 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 검출하도록 설계된다. 프로브는 Taq DNA 폴리머라제에 의해 확장가능하지 않으며 리포터 형광 염료 및 소광제 형광 염료로 라벨링된다. 리포터 염료로부터의 레이저-유도된 방출은 두 염료가 프로브 상에 있음에 따라 함께 가까이 위치할 때 켄칭 염료에 의해 켄칭된다. 증폭 반응 동안, Taq DNA 폴리머라제 효소는 주형-의존적 방식으로 프로브를 절단한다. 생성된 프로브 단편은 용액 중에서 해리되고, 방출된 리포터 염료로부터의 신호는 제2 형광단의 켄칭 효과를 갖지 않는다. 합성된 각 새로운 분자에 대해 리포터 염료 1개 분자가 유리되며, 켄칭되지 않은 리포터 염료의 검출은 데이터의 정량적 해석을 위한 기초를 제공한다.
TaqMan™ RT-PCR은, 예를 들어, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System™ (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티), 또는 Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, 독일 만하임) 등의 상업적으로 입수가능한 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 5' 뉴클레아제 절차는 ABI PRISM 7700™ Sequence Protection System™과 같은 실시간 정량적 PCR 장치에서 실행된다. 시스템은 열순환기, 레이저, 전하-커플링 장치 (CCD), 카메라 및 컴퓨터로 이루어진다. 시스템은 기기를 실행하고 데이터를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다. 5'-뉴클레아제 검정 데이터는 초기에 Ct, 또는 임계치 사이클로서 표현된다. 상기에서 논의된 바와 같이, 형광 값은 매 사이클 동안 기록되며 증폭 반응에서 해당 지점까지 증폭된 생성물의 양을 나타낸다. 형광 신호가 통계적으로 유의한 것으로 처음 기록되는 시점이 임계치 사이클 (Ct)이다.
오류 및 샘플 간 변동의 영향을 최소화하기 위해, RT-PCR은 통상적으로 내부 표준을 사용하여 수행된다. 이상적인 내부 표준은 상이한 조직 사이에서 일정한 수준으로 발현되며 실험적 치료에 의해 영향 받지 않는다. 유전자 발현의 패턴을 정규화하는 데 가장 빈번히 사용되는 RNA는 하우스키핑 유전자인 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제 (GAPDH) 및 베타-액틴에 대한 mRNA이다.
RT-PCR 기술의 보다 최근의 변형은 이중-라벨링된 형광성 프로브 (즉, TaqMan™ 프로브)를 통해 PCR 생성물 축적을 측정하는 실시간 정량 PCR이다. 실시간 PCR은 각 표적 서열에 대한 내부 경쟁자를 정규화에 사용하는 정량적 경쟁 PCR, 또한 샘플 내에 함유된 정규화 유전자 또는 RT-PCR을 위한 하우스키핑 유전자를 사용하는 정량적 비교 PCR 둘 다와 상용성이다. 추가의 세부사항에 대하여, 예를 들어 하기 참조: Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996). 다른 정량적 방법은 디지털 소적 PCR을 포함한다.
전형적으로, 본 개시내용에서 수행되는 바와 같은 바이오마커의 정량화는 참조 대조군 샘플을 포함할 것이다. 일부 예에서, 대조군 참조는 건강한 개체의 집단으로부터의 바이오마커의 상응하는 패널 내의 바이오마커의 측정으로부터 결정된다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "건강한 개체"는 결장직장암을 갖지 않는 것으로 알려진 사람 또는 사람들의 집단을 지칭하며, 이러한 지식은 대장내시경검사 또는 구불창자내시경검사로부터 결정되었을 수 있는 개체에 대한 임상 데이터로부터 유래된다. 일부 예에서, 대조군 참조는 "전형적인 집단"에서의 상응하는 바이오마커의 측정으로부터 결정된다. 바람직하게는, "전형적인 집단"은 질환 진행의 상이한 스테이지에서의 결장직장암의 스펙트럼을 나타낼 것이다. "전형적인 집단"이 본원에 기재된 바와 같은 대상체 코호트의 발현 특징을 나타내는 것이 특히 바람직하다.
또 다른 예에서, 대조군 참조는 하기 중 하나 이상을 포함한 확립된 데이터 세트로부터 유래될 수 있다:
1. 결장직장암을 갖는 것으로 알려진 대상체의 집단에 대한 바이오마커의 측정을 포함하는 데이터 세트;
2. 시험되는 대상체에 대한 바이오마커의 측정을 포함하는 데이터 세트, 여기서 상기 측정은, 예를 들어, 대상체가 건강한 것으로 알려졌을 때, 또는 결장직장암을 갖는 대상체의 경우, 대상체가 진단되었거나 질환 진행의 초기 스테이지에 있을 때와 같이, 이전에 수행된 것임; 및/또는
3. 건강한 개체 또는 건강한 개체들의 집단에 대한 바이오마커의 측정을 포함하는 데이터 세트.
데이터 분석
일부 예에서, 대상체가 결장직장암을 갖는지 또는 그렇지 않으면 결장직장암의 증가된 발병 위험에 있는지의 여부를 결정하는 방법은 통계적 분석과 함께 이루어질 수 있는 참조 프로파일과 비교한 바이오마커 패널 측정을 기반으로 한다.
정량적 점수는 특정 알고리즘의 적용에 의해 결정될 수 있다. 본원에 개시된 방법에서 정량적 점수를 계산하는 데 사용되는 알고리즘은 바이오마커의 발현 수준 값 또는 바이오마커의 그룹을 그룹화할 수 있다. 바이오마커의 특정 그룹의 형성은, 추가로, 바이오마커 또는 바이오마커 서브세트 (예: 분류자)의 다양한 발현 수준의 정량적 점수에 대한 기여도의 수학적 가중치 부여를 용이하게 할 수 있다.
일부 예에서, SPSS 소프트웨어가 통계 분석에 사용될 수 있다. 일부 예에서, 선택된 바이오마커의 진단 효율성을 예측하기 위해 이진 로지스틱 회귀 분석이 사용될 수 있다. 일부 예에서는, 통계 알고리즘을 구현하기 위해 컴퓨터와 함께 사용되는 통계 알고리즘이 사용될 수 있다. 일부 예에서, 통계 알고리즘은 학습 통계 분류자 시스템이다. 이러한 시스템의 예는 Random Forest, 대화형 트리, 분류 및 회귀 트리 분류 또는 신경망을 포함한다.
시험의 공정한 평가는, "샘플 외" 대상체, 즉 초기 예측 모델 구성에 포함되지 않은 대상체를 사용한 그의 평가를 필요로 한다. 이는 n겹 교차 검증을 사용하여 시험 성능을 평가함으로써 달성된다.
통계적 유의성에 대한 시험은 선형 및 비선형 회귀, 예컨대 ANOVA, Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney 및 승산비, Bayesian 확률 알고리즘을 포함한다. 그러나, 측정된 바이오마커의 수가 증가함에 따라, 일반적으로 몇몇 예를 들자면 Random Forest, 단순 로지스틱, 또는 Bayes Net와 같은 보다 정교한 기술을 사용하는 것이 보다 편리할 수 있다.
일부 예에서, Bayesian 확률이 채택될 수 있다. 이러한 상황에서는 10겹 교차 검증을 사용하여 해당 모델의 "샘플 외" 성능을 추정할 수 있다. 고려 중인 각 바이오마커의 조합에 대해, 데이터는 무작위로 10개의 하위샘플로 나뉠 수 있으며, 이들 각각은 건강한 대상체 및 질환의 각 스테이지에 있는 대상체의 유사한 비율을 갖는다. 차례로, 각 하위샘플이 제외될 수 있고, 나머지 90%의 대상체를 사용하여 로지스틱 모델을 구축할 수 있다. 이어서 이 모델을 사용하여 제외된 하위샘플에 대한 암의 확률을 추정하여 "샘플 외" 성능의 추정치를 제공할 수 있다. 나머지 9개 하위샘플에 대해 이를 반복함으로써, 연구 데이터 자체로부터 "샘플 외" 성능을 추정할 수 있다. 이어서 이들 "샘플 외" 예측 확률을 대상체의 실제 질환 상태와 비교하여 ROC (Receiver Operating Characteristic) 곡선을 생성할 수 있고, 이로부터 주어진 특이도 (예: 95% 특이도)에서의 교차 검증된 민감도를 추정할 수 있다.
교차 검증 (또는 임의의 다른 방법)을 사용한 "샘플 외" 성능의 각 추정치는, 불편(unbiased)이지만, 그에 대한 가변성의 요소를 갖는다. 따라서, 모델의 순위 (바이오마커 조합을 기반으로 함)는 이러한 모델의 상대적 성능만을 나타낼 수 있다. 그러나, "샘플 외" 성능 평가를 통해 입증된 바와 같이 진단 시험을 생성하기 위해 다수의 조합으로 사용될 수 있는 바이오마커의 세트는 그 자체 내에 반복 평가를 견딜 바이오마커의 조합을 거의 확실히 함유한다.
일례에서, 바이오마커는 하기 알고리즘을 사용하여 측정된다:
여기서 p는 사람이 결장직장암을 가질 확률을 나타낸다. 각 CBMi는 시험되는 코호트에서의 하나의 대상체의 혈장 (또는 혈청) 내의 i번째 바이오마커의 농도의 로그이다. 각 베타 (β BM )는 측정되는 농도 단위의 그 바이오마커에 적용되는 계수이다 (β 0 은 "오프셋" 또는 "절편"임). 이 선형 로지스틱 모델은 본원에 제시된 모든 결과에 대해 공통적이지만, 암의 확률을 예측하기 위해 바이오마커 농도의 조합이 모델링될 수 있는 유일한 방식과는 거리가 멀다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 바이오마커 농도의 밑이 10인 로그가 본원에 예시되어 있지만, 다른 로그, 예를 들어 밑이 2인 로그도 사용될 수 있다.
동등하게 적용가능한 다른 비선형 또는 선형 로지스틱 알고리즘은 Random Forest, Linear Models for MicroArray data (LIMMA) 및/또는 Significance Analyses of Microarray Data (SAM), Best First, Greedy Stepwise, Naive Bayes, Linear Forward Selection, Scatter Search, Linear Discriminant Analysis (LDA), Stepwise Logistic Regression, Receiver Operating Characteristic 및 Classification Trees (CT)를 포함한다.
당업자는 회귀 알고리즘에서 계수 값의 결정에 친숙할 것이다.
본원에 기재된 알고리즘은 암 가능성 점수를 도출하는 데 사용될 수 있다. 일부 예에서는, 불량한 임상 결과, 양호한 임상 결과, 높은 CRC 위험, 또는 낮은 CRC 위험 가능성의 증가를 나타낼 수 있는 정량적 점수가 도출된다. 그에 따라 점수는 치료 관리에 대한 정보를 제공할 수 있다.
일부 예에서, 바이오마커 패널은 FOBT와 유사하거나 그보다 양호한 민감도 및 특이도로 CRC를 검출할 수 있다. 당업자는 민감도가 결장직장암을 갖는 것으로 정확하게 식별된 진단 시험에서의 실제 양성 비율을 지칭한다는 것을 알 것이다. 특이도는 결장직장암을 갖지 않는 것으로 정확하게 식별된 음성의 비율을 측정한다.
일부 예에서, 바이오마커 패널은 적어도 50%, 60% 또는 65%, 또는 적어도 70%, 80%, 83%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 93% 또는 적어도 95%의 민감도를 갖는다.
일부 예에서, 바이오마커 패널은 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 적어도 95%의 특이도를 갖는다.
데이터 취급
알고리즘을 구현하기 위한 지식-기반 컴퓨터 소프트웨어 및 하드웨어도 본 개시내용의 부분을 형성함이 본원에서의 논의로부터 명백해질 것이다. 이러한 컴퓨터 소프트웨어 및/또는 하드웨어는 본 개시내용에 따라 결장직장암을 검출하는 방법을 수행하는 데 유용하다.
본원에 기재된 검정으로부터의 값은 수동으로 계산 및 저장될 수 있다. 대안적으로, 통계 분석 단계는 컴퓨터 프로그램 제품에 의해 완전히 또는 부분적으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 컴퓨터 프로그램이 저장되어 있는 컴퓨터 판독가능 저장 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다. 프로그램은, 컴퓨터에 의해 판독시, 대상체로부터 하나 이상의 생물학적 샘플의 분석으로부터 얻은 값을 기반으로 한 관련 계산 (예: 유전자 또는 단백질 발현 수준, 정규화, 표준화, 임계치 설정, 및 검정으로부터의 값을 임상 결과 점수 및/또는 임상 상태 또는 스테이지 및 관련 정보에 대한 텍스트 또는 그래프 도시로 전환)을 실행할 수 있다. 컴퓨터 프로그램 제품은 계산을 수행하기 위한 컴퓨터 프로그램을 그 안에 저장하고 있다.
본 개시내용은 또한, 상기에 기재된 데이터 수집 및 취급 또는 계산 소프트웨어 프로그램을 실행하기 위한 시스템을 제공하며, 이 시스템은 일반적으로 하기를 포함한다: a) 중앙 컴퓨팅 환경; b) 환자 데이터를 수신하기 위해, 컴퓨팅 환경에 작동가능하게 연결된 입력 장치, 여기서 환자 데이터는, 예를 들어, 유전자 또는 단백질 발현 수준 또는 대상체로부터의 생물학적 샘플을 사용한 검정으로부터 얻은 다른 값, 또는 질량 스펙트럼 데이터 또는 본 개시내용에 의해 제공되는 임의의 검정에 대한 데이터를 포함할 수 있음; c) 사용자 (예: 의료진)에게 정보를 제공하기 위해 컴퓨팅 환경에 연결된 출력 장치; 및 d) 중앙 컴퓨팅 환경 (예: 프로세서)에 의해 실행되는 알고리즘, 여기서 알고리즘은 입력 장치에 의해 수신된 데이터를 기반으로 하여 실행되고, 여기서 알고리즘은 발현 점수, 임계치, 또는 본원에 기재된 기타 기능을 계산한다. 본 개시내용에 의해 제공되는 방법은 또한 전체적으로 또는 부분적으로 자동화될 수 있다. 일부 예에서, 방법은 실험실 기반 방법 및 컴퓨터 기반 방법의 조합을 포함한다.
일례에서, 개시내용의 방법은 병리학 서비스와 관련된 기존 지식-기반 아키텍처 또는 플랫폼에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법으로부터의 결과는 통신 네트워크 (예: 인터넷)를 통해 프로세싱 시스템으로 전송되고, 여기서 알고리즘이 저장되고 질환 확률의 점수로 번역되고 이어서 진단 또는 예측 보고서의 형태로 최종 사용자에게 전달되는 예측 사후 확률 값을 생성하는 데 사용된다.
따라서, 개시내용의 방법은, 바이오마커의 농도를 검출하는 데 필요한 시약 및 보고의 결정 및 임상의에 대한 보고의 전송을 용이하게 하기 위한 컴퓨터 하드웨어 및/또는 소프트웨어를 포함하는 키트 또는 컴퓨터-기반 시스템의 형태일 수 있다.
본원에 기재된 검정은 기존 또는 새로 개발된 병리학 아키텍처 또는 플랫폼 시스템에 통합될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용은 사용자가 결장직장암과 관련된 대상체의 위험도를 결정할 수 있게 하는 방법을 고려하며, 방법은 하기를 포함한다:
(a) 본원에 기재된 바이오마커 패널 내의 각 바이오마커의 측정의 결정으로부터 얻은 대상체 데이터를 수신하는 단계;
(b) 다변량 분석 (예: 회귀 분석)을 통해 데이터를 프로세싱하여 질환 점수를 제공하는 단계;
(c) 미리 결정된 값과 비교하여 질환 점수의 결과에 따라 대상체의 상태를 결정하는 단계; 및
(d) 다변량 분석 기능을 수행하는 알고리즘을 포함하는 다변량 분석에 대한 통신 네트워크 참조를 통해 대상체의 상태 표시를 사용자에게 전달하는 단계.
키트
본 발명은 바이오마커 검출용 키트를 제공한다. 이러한 키트는 핵산 종의 검출에 적합할 수 있거나, 또는 대안적으로 단백질 또는 폴리펩티드의 검출에 적합할 수 있다.
폴리펩티드의 검출을 위해, 항체가 가장 전형적으로 키트의 구성요소로서 사용될 것이다. 그러나, 바이오마커 유전자 생성물에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 작용제가 유용할 것이다. 키트의 기타 구성요소는 전형적으로 라벨, 2차 항체, 억제제, 보조 인자 및 사용자가 발현 수준을 정량하고/거나 측정이 정확하게 작동하였는지의 여부를 평가할 수 있게 하기 위한 대조군 유전자 또는 단백질 생성물 제조물을 포함한다. 효소-결합 면역흡착 검정-기반 (ELISA) 시험 및 경쟁 ELISA 시험은 키트 구성요소를 사용하여 숙련자에 의해 용이하게 수행될 수 있는 특히 적합한 검정이다.
일부 예에서, 키트는 측정되는 바이오마커에 상응하는 포착 항체가 부동화된 마이크로타이터 플레이트를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 키트는 측정되는 바이오마커에 상응하는 포착 항체가 부동화된 비드를 포함한다.
임의로, 키트는 바이오마커 폴리펩티드에 대한 항체의 결합의 검출을 위한 수단을 추가로 포함한다. 이러한 수단은, 예를 들어, 효소 (예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제), 염료, 방사성뉴클레오티드, 발광성 그룹, 화학발광성 그룹, 형광성 그룹, 비오틴 또는 콜로이드 입자, 예컨대 콜로이드 금 또는 셀레늄 등의 리포터 분자를 포함한다. 바람직하게는 이러한 리포터 분자는 항체에 직접 연결된다.
일례에서, 키트는 참조 샘플을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 참조 샘플은 항체에 의해 검출되는 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 알려진 농도를 갖는다. 이러한 폴리펩티드는 특히 표준으로서 사용된다. 따라서, 이러한 폴리펩티드의 다양한 알려진 농도는 본원에 기재된 진단 검정을 사용하여 검출될 수 있다.
핵산의 검출을 위해, 이러한 키트는 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유하는 바이알 또는 플라스틱 튜브 또는 마이크로타이터 플레이트 등의 제1 용기를 함유할 수 있다. 키트는 임의로 프라이머를 담는 제2 용기를 함유할 수 있다. 프로브는 변경된 발현이 결장직장암과 관련되는 DNA에 대해 혼성화가능할 수 있고, 프라이머는 이 DNA를 증폭시키는 데 유용하다. 예를 들어, 어레이를 사용하여, 고체 지지체 상에 부동화된 올리고뉴클레오티드 프로브를 함유하는 키트가 개발될 수도 있다 (하기 문헌 참조: supplement of issue 21(1) Nature Genetics, 1999).
핵산의 PCR 증폭을 위해, 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커 유전자의 적어도 일부에 상보적인 핵산 프라이머가 키트에 포함될 수 있다. 프라이머의 세트는 전형적으로 DNA의 특정 증폭이 가능한 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 4개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 정량적 PCR 결정을 가능하게 할 형광-라벨링된 올리고뉴클레오티드가 포함될 수 있다 (예: TaqMan chemistry, Molecular Beacons). DNA의 증폭에 적합한 효소가 또한 포함될 것이다.
비교 또는 검증 목적으로 대조군 핵산이 포함될 수 있다. 이러한 대조군은 건강한 조직으로부터, 또는 건강한 개인으로부터 단리된 RNA/DNA이거나, mRNA 수준이 결장직장암에 의해 영향 받지 않는 β-액틴 또는 GAPDH 등의 하우스키핑 유전자일 수 있다.
당업자는, 본 개시내용의 광범위한 일반적인 범위를 벗어나지 않으면서, 상기에 기재된 구현예에 대하여 다양한 변화 및/또는 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 구현예는 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적이 아닌 것으로 간주되어야 한다.
실시예
물질 및 방법
윤리
본 연구에 사용된 모든 연구 프로토콜은 관련 인간 연구 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 혈액 샘플 수집 전에 각 참가자로부터 서면 동의를 얻었다.
참가자 샘플
여러 병원에서 치료받고 있는 96명의 결장직장암 환자의 코호트 (Dukes 스테이지 I-IV)로부터 혈장 및 혈청 샘플의 수집물을 채취하고 프로세싱하였다. 샘플은 Victorian Cancer Biobank로부터 얻었다.
50세 초과 및 50-85세 사이의 약 50명의 건강한 지원자 (대조군)의 그룹으로부터 혈액을 수집하고 프로세싱하였다.
이미 화학요법 및/또는 방사선요법을 받은 대상체는 분석으로부터 제외되었다. 대상체의 특징이 하기 표 1에 요약되어 있다.
표 1 환자 특징 (연구 3)
혈액 수집 및 프로세싱
대상체로부터의 혈청 샘플은 이전에 기재된 표준 작업 절차를 사용하여 수집하였다 (Brierley GV, et al. (2013) Cancer Biomark. 13: 67-73). 혈액을 혈청 겔 튜브 (Scientific Specialties Inc., USA) 내에 수집하고, 각 샘플을 적어도 30 min 동안 실온에서 방치한 후 원심분리 (1,200g, 10 min, 실온)하였다. 이어서 혈청 분획을 깨끗한 15 mL 튜브로 전달하고 다시 원심분리한 (1,800g, 10 min, 실온) 후 분취 (250 μL) 및 저장 (-80℃)하였다. 모든 샘플을 수집 2 hr 이내에 프로세싱하고 저장하였다. 혈청 샘플을 사용 전에 단지 1회 해동하였다.
혈액 바이오마커 및 바이오마커 분석
총 18개의 바이오마커를 평가하였다. 평가된 마커가 하기 표 2에 요약되어 있다.
표 2 분석된 바이오마커
혈액 바이오마커 분석
표준 프로토콜을 사용하여 환자로부터의 혈청 샘플 중의 바이오마커의 수준을 정량화하기 위해 샌드위치 ELISA 분석을 사용하였다. 바이오마커의 분석을 상업적 키트 및 공급된 항체로 수행하였다. 평가된 바이오마커 및 사용된 항체/ELISA 키트에 대한 세부사항이 표 3에 나타나 있다
표 3 연구에서 사용된 항체의 공급원
각 검정에서, 샘플을 이중으로 측정하였고 인-하우스 품질 관리 (QC) 샘플이 포함되었다. QC 샘플은 풀링된 정상 및 풀링된 CRC 환자 혈청 샘플로 이루어졌다.
표준 ELISA의 경우, Wallac Victor3 1420 다중라벨 카운터 (Perkin Elmer, USA)를 사용하여 흡광도 또는 형광 신호를 검출하였다. 바이오마커 농도는 WorkOut 소프트웨어 (Qiagen, 독일 힐덴)를 사용하여 각각의 표준 곡선으로부터 도출되었다.
민감도 및 특이도 결정
임의의 주어진 시험의 진단 가능성은 전형적으로 주어진 질환에 대한 그의 민감도 및 특이도와 관련하여 표현된다. 주어진 사례/대조군 실험에 대한 결과는 표 4에 예시된 4개 사분면 중 하나에 할당될 수 있다.
표 4 민감도 및 특이도와 관련하여 결과를 분석하기 위해 필요한 카테고리
민감도는 대장내시경검사 및 조직병리학으로부터의 진단을 참조로서 사용하여 결장직장암을 갖는 사람들을 정확하게 검출하는 시험 능력의 척도이며 하기 등식에 의해 결정된다:
시험 민감도 (%) = 100% x TP/(TP+FN)
특이도는 대장내시경검사/조직병리학 결과를 참조로서 사용하여 결장직장암을 갖지 않는 사람들을 정확하게 검출하는 시험 능력의 척도이며 하기 등식에 의해 결정된다:
시험 특이도 (%) = 100% x TN/(FP+TN)
ELISA 시험에 따라 어떤 환자 결과가 양성 또는 음성으로 간주되는지 정의하기 위해서는 주어진 바이오마커의 임계치 농도 (바이오마커 단백질의 ELISA-결정된 혈청 농도)를 선택해야 한다. 실험에서 관찰된 전체 농도 범위에 걸쳐 임의의 임계치 농도 값에서의 시험의 민감도 및 특이도를 결정하는 것이 가능하다. 민감도와 특이도 사이에는 역의 관계가 있다.
통계적 평가 및 모델링
대조군과 결장직장암 환자를 가장 잘 분리한 바이오마커의 조합을 찾기 위해, 하기 등식을 기반으로 한 로지스틱 회귀를 하기 등식에 나타낸 바와 같이 활용하였다:
여기서:
Figure pct00011
Yi는 실험 코호트에서 대장내시경검사에 의해 결정된 CRC의 존재 또는 부재의 이진 지표이다.
βo은 회귀 절편 값이다.
M1 등은 특정된 단위로 측정된 바이오마커 1의 농도의 밑이 10인 로그이다. M2, M3 등은 각각의 개별 바이오마커를 나타낸다.
β1 등은 기록된 바이오마커 농도를 곱한 계수이다.
εi는 모델과 관련된 오류 항이다.
대조군과 결장직장암 환자를 가장 잘 분리한 바이오마커 플러스 연령의 조합을 찾기 위해, 하기 등식을 기반으로 한 로지스틱 회귀를 하기 등식에 나타낸 바와 같이 활용하였다:
여기서:
Yi는 실험 코호트에서 대장내시경검사에 의해 결정된 CRC의 존재 또는 부재의 이진 지표이다.
βo은 회귀 절편 값이다.
M1 등은 특정된 단위로 측정된 바이오마커 1의 농도의 밑이 10인 로그이다. M2, M3 등은 각각의 개별 바이오마커를 나타낸다.
β1은 기록된 바이오마커 농도를 곱한 계수이다.
연령은 세 단위의 대상체 연령이다.
β연령은 세 단위의 대상체의 연령을 곱한 계수이다.
εi는 모델과 관련된 오류 항이다.
바이오마커의 상이한 조합 및 관련 β0-10 계수에 대한 다양한 값을 사용하여 모델을 구축하면, 실제 값 Yi에 가장 가깝게 근접하는 모델이 다양한 크기의 바이오마커의 패널에 대해 결정될 수 있다.
통계 및 기계 학습 프로세스에서 종종 직면하는 오버핏팅 또는 선택 편향과 같은 문제에 대응하고, 임의의 주어진 모델이 어떻게 독립적인 데이터 세트로 일반화될지에 대한 통찰력을 제공하기 위해, 각 마커에 대한 데이터를 10겹 교차 검증을 사용하여 재분석하였다. 간단히 말하면, 임의의 마커에 대한 전체 데이터 세트는 10개의 동등한 크기의 하위샘플로 나뉘었다. 하나의 하위샘플은 검증 데이터 세트로서 유지되었고, 나머지 9개의 하위샘플은 훈련 데이터로서 사용되었다. 이 프로세스는 검증 데이터로서 정확히 한 번씩 사용된 각 하위샘플로 10회 반복되었다. 하기 표에 제시된 데이터는 이 교차 검증 절차를 사용하여 얻었다.
각 검정에 대한 결과는 통계 소프트웨어 패키지 Prism 및 "R"을 사용하여 분석되었다. 비모수 Mann-Whitney t-시험을 사용하여 마커의 개별 성능을 평가하고 개별 수신자 운영자 특징 (ROC) 곡선을 생성하였다.
실시예 1 개별 바이오마커의 분석
본 연구에서 분석된 대상체에 대한 임상적 특징은 표 1에 나타나 있다. 대장내시경검사에 의해 결장직장암 (CRC)의 진단이 확인된 총 95명의 대상체를 50명의 건강한 대조군과 함께 분석하였다. CRC 대상체 중, 중앙값 연령은 67세였다. 남성과 여성의 비율은 대략 동등하였다.
개별 바이오마커를 ELISA 검정에 의해 평가하고, 각 바이오마커에 대한 사례와 대조군에 대한 중앙값 사이의 통계적 차이를 Mann-Whitney 양측 T 시험을 사용하여 평가하였다. p<0.05로 결장직장암 대상체와 대조군 대상체를 개별적으로 구별하는 바이오마커는 BDNF, TIMP1, TNFα, MAC2BP, MMP1, MMP7, IGFII, M65, TGFβ1, IL6, IL8, VEGFA, IGFBP2, DKK3 및 M2PK였다.
표 5에 따르면 바이오마커 M2PK, TIMP1, IGFBP2, BDNF, IL6 및 IL8은 결장직장암 대상체와 대조군 사이의 가장 큰 차별성을 제공하는 것으로 나타났다.
각 바이오마커 (연령 포함 및 미포함)를 모든 개체에 걸쳐, 또한 데이터를 남성/여성을 기반으로 분리하였을 때 결장직장암 대상체와 대조군 대상체를 구별하는 그의 능력에 대해 조사하였다. 각 개별 바이오마커 (연령 포함 및 미포함)에 대한 교차 검증된 민감도가 표 5에 제시되어 있다. 교차 검증된 민감도는 개별적으로 고려된 각 바이오마커의 농도 값에 대한 로지스틱 회귀의 적용으로부터 도출되었으며, 모든 사례 및 대조군 샘플에 적용되고 특정 바이오마커에 대한 로그 농도 값에 차등적으로 가중치를 부여함으로써 95% 특이도에서 달성가능한 최선의 민감도를 나타낸다.
표 5 결장직장암 대상체와 대조군 대상체를 구별하는 능력에 대해 조사된 개별 바이오마커에 대한 95% 특이도에서의 교차 검증된 민감도 (%).
개별적으로 고려하면, 진단 가능성이 가장 큰 바이오마커는 주어진 질환의 검출에 대한 높은 민감도와 높은 특이도를 커플링한다. 단독으로든 연령과 조합되든, 스크리닝 적용을 위한 독립형 바이오마커로서 유용하도록 95% 특이도에서 충분한 민감도로 암과 정상 대조군을 구별한 개별 바이오마커는 없다.
실시예 2 바이오마커 조합의 분석
결장직장암 검출에 대한 최선의 성능을 제공한 바이오마커의 조합을 식별하기 위해, 본 발명자들은 표 6에 기재된 특성을 갖는 새로운 대상체의 코호트로부터의 혈청 샘플 중의 18개의 리드 바이오마커의 수준 (표 3에서 식별된 바와 같음)을 측정하였다.
표 6 바이오마커가 평가된 코호트의 대상체 프로파일 (연구 3 및 4 조합)
표 6에 언급된 대상체로부터의 혈청 샘플은 Victorian Cancer Biobank로부터 얻었다. 샘플을 https://viccancerbiobank.org.au/for-researchers/quality-assurance/)에 기재된 바와 같은 엄격한 표준 운영 프로토콜에 따라 준비하였다. 상기 표 3에 기재된 바와 같이 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트를 사용하여 각 혈청 샘플에서 바이오마커의 농도를 측정하였다.
각 조합에 대해 사례 샘플과 대조군 샘플 사이에서 가능한 최선의 해상도를 제공하기 위해 차등적으로 가중치를 부여한 2 내지 10개의 바이오마커의 조합을 상기에 기재된 바와 같이 로지스틱 회귀를 사용하여 식별하였다. 하기 표 7-15에서의 민감도 값은 10겹 교차 검증된 것이다. 2 내지 10개의 바이오마커의 조합에 대한 상위 10개의 성능 바이오마커가 하기 표 7 내지 15에 나타나 있다.
표 7 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 10개의 바이오마커 조합.
표 8 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 9개의 바이오마커 조합.
표 9 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 8개의 바이오마커 조합.
표 10 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 7개의 바이오마커 조합.
표 11 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 6개의 바이오마커 조합.
표 12 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 5개의 바이오마커 조합.
표 13 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 4개의 바이오마커 조합.
표 14 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 3개의 바이오마커 조합.
표 15 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 2개의 바이오마커 조합.
표 7-15로부터, 보다 많은 바이오마커가 패널에 포함될 때 최고 민감도가 얻어졌음이 명백할 것이다. 4 내지 10개의 바이오마커 패널 크기 부류 내의 패널의 경우, 임의의 특정 바이오마커 패널 수치 부류에 대한 상위 10개 모델 내에서 관찰된 민감도 감소는 8개의 바이오마커 패널에 대한 1.2% 내지 4개의 바이오마커 패널에 대한 3.8%의 범위로 매우 완만하였다. 7 내지 10개의 바이오마커 및 4 내지 6개의 바이오마커를 포함하는 바이오마커 패널의 경우, 상위 10개 패널에 대해 관찰된 민감도 값의 범위는 인접한 바이오마커 패널 크기 부류 사이에서 중첩되었다. 기록된 최고 민감도 (남성 및 여성 성별 혼합의 경우)는 BDNF, M2PK, DKK3, TGF베타, IGFBP2, 리포칼린, TNFα, MIP1β, M65 및 IGFII를 포함하는 10개의 바이오마커 패널에 대하여 95% 특이도에서 85.6%였다.
BDNF 및 M2PK는 각 바이오마커 패널 크기 부류에서 상위 성능 패널에 존재하하였다. 상위 10개의 6 내지 10개 바이오마커 패널 크기 부류에서, 두드러지게 관찰된 다른 바이오마커는 IGFBP2, DKK3 및 TNFα를 포함하였다. 4 내지 8개의 바이오마커에서, IL8 또한 상위 10개 모델에서 잘 나타나는 것으로 보였다.
진행성 결장직장 종양형성을 갖는 사람과 갖지 않는 사람 (남성 및 여성 조합)으로부터의 혈청 사이에 강한 분해능을 나타내는 바이오마커 패널의 보다 광범위한 세트에서 가장 빈번히 나타나는 바이오마커를 식별하기 위해, 개별 바이오마커가 상위 100개 모델 (또는 95% 특이도에서 ≥75%의 민감도를 생성하는 상위 모델)에서 나타난 빈도를 각각 10 내지 3개의 바이오마커 패널에 대해 플롯팅하였다.
모델링에 연령 항이 포함되지 않은 두 성별 조합에서 얻은 결과가 도 1-1 및 1-2에 나타나 있다. 모든 바이오마커 패널에 대하여, M2PK 및 BDNF가 존재하였다.
8 내지 10개의 바이오마커의 패널에 대하여, 다른 바이오마커 (고성능 패널의 이러한 보다 광범위한 선택의 >50%에 존재)는 DKK3, IGFBP2, 및 TNFα를 포함하였다. 4 내지 7개의 바이오마커의 패널에 대하여, IL8은 TNFα와 같이 두드러진 마커로서 나타났고, IGFBP2는 여전히 강한 성능의 바이오마커 패널의 상당 부분에 기여하면서도 약해지기 시작하였다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 바이오마커 패널 내의 BDNF의 포함이 보다 이전에 개시된 바이오마커 조합과 비교하여 95% 특이도에서의 시험 민감도 및/또는 95% 특이도에서의 교차 검증 민감도에서 예상치 못한 개선을 제공함을 발견하였다. 예를 들어, WO 2012/006681은 대상체에서 결장직장암을 진단 또는 검출하는 방법을 개시한다. 이 출원에서, 최고 순위의 3개의 바이오마커 조합은 DKK3, M2PK 및 IGFBP2였고, 이는 95% 특이도에서 72.9%의 시험 민감도 및 70.8%의 교차 검증된 민감도를 가졌다. 본 발명자들은, 이 바이오마커 패널 내의 BDNF의 포함 (즉, BDNF, DKK3, M2PK 및 IGFBP2)이 95% 특이도에서의 시험 민감도 및 교차 검증된 민감도를 각각 73.9% 및 74.5%까지 개선함을 입증하였다. 유사하게, WO 2012/006681에서 최고 순위의 4개의 바이오마커 조합은 DKK3, M2PK, IGFBP2 및 Mac2BP였고, 이는 95% 특이도에서 68.8%의 시험 민감도 및 69.8%의 교차 검증된 민감도를 가졌다. 본 발명자들은, 이 바이오마커 패널 내의 BDNF의 포함 (즉, BDNF, DKK3, M2PK, IGFBP2 및 Mac2BP)이 95% 특이도에서의 시험 민감도 및 교차 검증된 민감도를 각각 77.7% 및 76.6%까지 개선함을 입증하였다. 마지막으로, WO2012/006681에서, 4개의 바이오마커 조합 DKK3, M2PK, IGFBP2 및 TIMP1은 95% 특이도에서 61.5%의 시험 민감도 및 53.1%의 교차 검증된 민감도를 갖는 것으로 보고되었다. 본 발명자들은, 이 바이오마커 패널 내의 BDNF의 포함 (즉, BDNF, DKK3, M2PK, IGFBP2 및 TIMP1)이 95% 특이도에서의 시험 민감도 및 교차 검증된 민감도를 각각 77% 및 76%까지 현저히 개선함을 입증하였다.
다양한 바이오마커 패널에서 상위 성능 바이오마커 조합을 고려할 때, BDNF의 포함에 기인하는 WO 2012/006681에서 언급된 바이오마커 조합에 비해 향상된 성능이 관찰되었다. 예를 들어, BDNF가 모델링 프로세스에 포함되었을 때 식별된 상위 성능 7-마커 패널은 BDNF를 함유하였고, 이는 BDNF가 포함되지 않은 WO 2012/006681에 기재된 상위 성능의, 내부적으로 교차 검증된, 7-바이오마커 패널 모델에 대한 69%와 비교하여 95% 특이도에서 83.2%의 모든 스테이지 CRC (연령 및/또는 성별 포함되지 않음)에 대한 내부적으로 교차 검증된 민감도를 나타내었다. BDNF를 포함하는 3, 4 및 5개의 바이오마커 패널에 대해 유사하게, 각 부류에서의 상위 성능 모델은, BDNF가 포함되지 않은 상위 성능 모델에 대한 70.8%, 69.8% 및 70.8%와 비교하여 95% 특이도에서 각각 74.6%, 77.8% 및 80.5%의 민감도를 나타내었다. 실로, 놀랍게도, BDNF는 5-10개의 바이오마커의 패널을 기반으로 한 100개 상위 성능 모델 (또는 >75%의 95% 특이도에서의 민감도를 생성하는 모델)의 전부 또는 대다수에 포함되었다 (도 2-1 및 2-2 참조).
실시예 3 인구통계학적 데이터 추가의 영향 - 연령
연령은 CRC의 최고 위험 인자이다. 결장직장암 발병 위험은 50세부터 급격하게 증가한다. 따라서 본 발명자들은, 로지스틱 회귀 분석을 사용하여, 다수의 바이오마커 조합과 함께 연령 포함이 바이오마커 조합으로 달성된 CRC 검출에 대한 민감도를 변형할 수 있는지의 여부를 평가하였다. 하기 표 16-24는, 가중치를 부여한 세 단위의 연령이 추가의 바이오마커로서 분석에 추가될 때, 상위 10개 성능 2 내지 10개의 바이오마커 패널의 95% 특이도에서의 민감도를 나타낸다. 상위 10개의 성능 2 내지 10개의 바이오마커 조합, 플러스 연령의 예가 표 16 - 24에 나타나 있다.
표 16 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 10개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 17 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 9개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 18 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 8개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 19 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 7개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 20 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 6개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 21 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 5개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 22 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 4개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 23 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 3개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 24 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두)를 대조군과 구별하는 2개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
연령의 부재 하에서의 바이오마커 조합과 유사하게, 연령이 포함되었을 때, 패널 내에 보다 많은 바이오마커가 존재하는 경우 최고 민감도가 얻어졌다. 상위 10개의 4 내지 10개의 바이오마커 패널 플러스 연령 내에서, 임의의 특정 바이오마커 패널 크기 부류 내에서 관찰된 민감도 감소는 10개 바이오마커 패널 크기 부류에 대한 1.2% 내지 4 및 6개 바이오마커 패널 크기 부류에 대한 3.3% 범위에서 또한 미미하였다. 4 내지 10개의 바이오마커 패널 플러스 연령의 경우, 상위 10개 바이오마커 패널에 대해 관찰된 민감도 값의 범위는 인접한 패널 크기 부류 사이에서 중첩되었다. 95% 특이도에서 바이오마커 플러스 연령, 두 성별 모두에 대해 기록된 최고 민감도는 9개의 바이오마커 패널에서의 87%였다.
6 내지 10개의 바이오마커의 패널의 경우, 연령을 포함한 상위 모델은 연령을 포함하지 않은 그의 대응물보다 약간 더 높은 민감도 값을 나타내었다. 각 바이오마커 패널 크기 부류에서의 상위 성능 패널에 대한 바이오마커 조성은, 5개의 바이오마커 패널을 제외하고는, 연령을 포함한 모델과 포함하지 않은 모델 사이에서 다소 상이하였다. 그러나, 중요하게는, 연령의 부재 하에 상위 10개의 바이오마커 패널 크기 부류에서 가장 두드러진 바이오마커가 연령이 포함된 동등한 패널에서 보존되었다. 특히, BDNF 및 M2PK (종양 형태)는 모든 모델에서 존재하였다. DKK3 및 IGFBP2는, 특히 6 내지 10개의 바이오마커 패널 크기 부류에서 두드러졌다.
또한 IL8, TNFα 및 MMP1은 많은 상위 바이오마커 패널에서 빈번히 나타났다. IGFBP2 및 MMP1은 6 내지 10개의 바이오마커의 패널에서 보다 통상적으로 나타났지만, IL8 및 TNFα는 모든 바이오마커 패널에서 두드러졌다. MIP1β는 8 내지 10개의 바이오마커 패널에 대한 상위 모델에서 강하게 나타났지만 6개 이하의 바이오마커를 포함하는 상위 모델에서는 그의 빈도가 다소 약해졌다.
모델링에 연령이 포함된 경우 조합된 두 성별 모두로부터의 데이터를 기반으로 하여 각각 10 내지 5개의 바이오마커 패널에 대한 상위 100개의 바이오마커 모델 (또는 95% 특이도에서 ≥75%의 민감도를 생성하는 상위 모델)에서 개별 바이오마커가 나타난 빈도가 도 2-1 및 2-2에 나타나 있다. 거의 모든 바이오마커 패널의 경우, M2PK 및 BDNF는 연령이 포함되었을 때 조합된 성별에 대한 상위 성능 모델의 이러한 보다 광범위한 선택에서 모든 패널에 존재하였다. 예외는 상위 100개의 모델 중 8%가 BDNF를 함유하지 않은 5개의 바이오마커 패널이었다. 8 내지 10개의 바이오마커 패널의 경우, 다른 두드러진 바이오마커 (고성능 모델의 이러한 보다 광범위한 선택의 >50%에 존재)는 DKK3, IGFBP2, MMP1 및 TNFα를 포함하였다. 4 내지 7개의 바이오마커 패널의 경우, IL8은 M2PK 및 BDNF보다 더 낮지만 두드러지게 유지되었다. TNFα, DKK3, MMP1 및 IGFBP2 패널 포함 비율은 이들 패널에서 50% 미만으로 떨어졌지만 다른 바이오마커보다 더 강한 성능의 패널의 보다 높은 비율에 계속 포함되었다.
당업자는 민감도와 특이도 사이에 역의 관계가 있음을 이해할 것이다. 따라서 특이도가 감소하면, 시험의 민감도는 일반적으로 증가할 것이다. 운영상, 보다 높은 민감도가 요구될 수 있고 보다 낮은 특이도가 허용가능한 상황이 존재한다. 예를 들어, 95% 특이도에서 >75% 민감도로 대조군 혈청 샘플과 암을 구별하는 2개의 마커 패널 플러스 연령은 존재하지 않지만, 특이도가 90%로 감소하면, M2PK, BDNF 및 연령을 포함하는 모델은 77.8%의 교차 검증된 민감도를 제공하였다.
실시예 4 성별의 영향 (별도로 분석된 남성 및 여성)
결장직장암은 남성이 발병률 및 사망률이 더 높은 것으로 알려져 있다. 2015년, 호주에서 진단된 새로운 결장직장암 사례 15,604명 중 7,031명이 여성이었고 8,573명이 남성이었다. 2019년에는, 결장직장암으로 인한 그 해의 추정 사망자 5,597명 중 2,588명이 여성이었으며 3,009명이 남성이었다. 또한 2019년에는, 호주인 개인이 85세 생일까지 결장직장암으로 진단될 위험이 14명 중 1명 (남성 12명 중 1명, 여성 17명 중 1명)인 것으로 추정되었다 (https://bowel-cancer.canceraustralia.gov.au/statistics). 결장직장암 위험 통계에서 이러한 성별 편향은 2017년 데이터 (남성 8.8%, 여성 7.1%)를 기반으로 한 호주 국립 장암 스크리닝 프로그램에서 FIT에 의해 평가시 성별에 의한 양성률에도 반영된다 (호주 보건 복지 연구소 2019. 국립 장암 스크리닝 프로그램: 모니터링 보고서 2019. 암 일련 번호 125. Cat. no. CAN 125. 캔버라: AIHW). 여성에 비해 남성에서의 증가된 결장직장암 빈도에 대한 이들 패턴은 또한 결장직장암에 대한 새로운 메틸화 진단 시험의 연구에서 반영되었지만, 성별은 그 자체로 그 시험에 대한 양성 예측변수는 아니었다 (Pedersen et al. Evaluation of an assay for methylated BCAT1 and IKZF1 in plasma for detection of colorectal neoplasia. BMC Cancer (2015) 15:654 DOI 10.1186/s12885-015-1674-2).
95% 특이도에서의, 두 성별 모두의 조합에 대해 BDNF를 포함하지만 연령은 포함하지 않는 최선의 성능 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 및 2개의 바이오마커 패널이 상기 표 7-15에 예시되어 있으며, 여기서 상위 관찰 민감도는 각각 85.6%, 84.7%, 84.2%, 83.2%, 80.4%, 80.5%, 77.8%, 74.6% 및 63.8%였다.
이들 패널이 두 성별 모두에 대해 동등하게 잘 작동하는지의 여부를 이해하기 위해, 193명의 결장직장암, 149명의 건강한 대조군 코호트로부터 얻은 동일한 코어 바이오마커 농도 데이터를 남성만의 및 여성만의 사례/대조군 코호트로 분리하였다. 하기 표 25-60은, 이들 여성 또는 남성 코호트로부터 도출된 바이오마커 데이터에 대해 독립적으로 수행된 로지스틱 회귀 및 10겹 교차 검증에 의해 식별된 최선의 성능 2 내지 10개 바이오마커 패널을 나타낸다.
BDNF를 포함한 여성에 대한 2 내지 10개 바이오마커 패널의 예가 표 25 - 33에 나타나 있다. 연령이 또한 고려되었을 때 BDNF를 포함하는 여성에 대한 2 내지 10개 바이오마커 패널의 예가 표 34 - 42에 나타나 있다. 상위 10개 바이오마커 조합이 하기 각각의 표에 나타나 있다.
표 25 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 10개의 바이오마커 조합.
표 26 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 9개의 바이오마커 조합.
표 27 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 8개의 바이오마커 조합.
표 28 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 7개의 바이오마커 조합.
표 29 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 6개의 바이오마커 조합.
표 30 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 5개의 바이오마커 조합.
표 31 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 4개의 바이오마커 조합.
표 32 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 3개의 바이오마커 조합.
표 33 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 2개의 바이오마커 조합.
표 34 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 10개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 35 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 9개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 36 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 8개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 37 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 7개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 38 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 6개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 39 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 5개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 40 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 4개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 41 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 3개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 42 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성)를 대조군과 구별하는 2개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
상기 표 25-33 및 34-42를 고려하면, 연령이 알고리즘에 포함되든 아니든, 여성만의 참가자로부터 개발된 상위 성능의 바이오마커 세트는 패널이 점차적으로 보다 높은 수의 바이오마커를 함유할 때 95% 특이도에서 보다 높은 민감도를 달성하였음이 드러난다. 6 내지 9개의 바이오마커 패널의 경우, 여성만의 데이터로 달성된 관찰된 최대 민감도는 모델에 연령이 포함될 때 약간 증가한다.
표 7-15 (성별 조합됨, 바이오마커만)와 표 25-33 (여성, 바이오마커만)을 비교하면, 두 성별 모두의 조합으로부터의 데이터 상에서 모델링된 경우보다 여성 단독으로부터의 데이터 상에서 모델링된 경우, 95% 특이도에서 상당히 더 높은 민감도를 갖는 교차 검증된 모델이 식별되었다는 것을 관찰한 점이 놀랍다. 모든 바이오마커 패널 크기 부류에서 10%만큼 높은 차이가 관찰되었으며 이는 모델링에 연령이 포함되든 아니든 관찰되었다 (연령이 포함된 모델링에 대한 표 34 - 42와 표 16 - 24를 비교).
조합된 남성 및 여성 데이터 상에서 구축된 모델의 경우와 같이, 여성만으로 개발된 모델의 경우, 각 바이오마커 패널에서 상위 성능 패널에 대한 바이오마커 조성은 연령을 포함한 모델과 포함하지 않은 모델 사이에서 다소 상이하였다 (예외는 각 부류에서의 상위 모델이 연령의 존재 및 부재 하에 동일한 바이오마커 조성을 갖는 3 및 4개의 바이오마커 패널 크기 부류였음). 그러나, 연령의 부재 하에 각 바이오마커 수치 클래스에 대한 상위 모델에서 두드러진 바이오마커는 연령이 포함된 동등한 모델에서 보존되었다. 특히, BDNF 및 M2PK는 모든 모델에 존재하였다. IL8과 MMP1은 많은 부류에 걸쳐 두드러졌다. IGFBP2 및 리포칼린은 연령의 부재 하에 여성만의 데이터로부터 유래된 임의의 바이오마커 패널의 임의의 상위 모델에서 나타나지 않았지만, 분석에 연령이 포함되었을 때, 이들 마커 둘 다 6 내지 10개의 바이오마커 패널에서 두드러졌다.
도 3-1 및 3-2는 5 내지 10개의 바이오마커를 함유하는 바이오마커 패널에 대한 여성만의 데이터 상에서 개발된 상위 100개의 모델 (또는 95% 특이도에서 ≥75%의 민감도를 생성하는 상위 모델)에서 개별 바이오마커 (연령이 고려되지 않음)가 나타나는 빈도를 도시한 그래프를 나타낸다. 도 4-1 및 4-2는 5 내지 10개의 바이오마커를 함유하는 바이오마커 패널에 대한 여성만의 데이터 상에서 개발된 상위 100개의 모델 (또는 95% 특이도에서 ≥75%의 민감도를 생성하는 상위 모델)에서 개별 바이오마커 (연령이 고려됨)가 나타나는 빈도를 도시한 그래프를 나타낸다.
여성 데이터만을 기반으로 한 모델의 경우, M2PK는 연령이 포함되었는지의 여부에 관계없이 모든 수치 부류에서의 모든 고성능 모델에 존재하였다. BDNF는 모델링에 연령이 포함되었는지의 여부에 관계없이 5 내지 10개의 바이오마커 조합에서 고성능 바이오마커 패널의 ≥80%에 존재하였다. 3 및 4개의 바이오마커 패널에서, BDNF는 연령 포함과 관계없이 두 번째로 가장 빈번한 바이오마커로 남아 있었다. 8 내지 10개의 바이오마커의 여성만의 바이오마커 조합의 경우, 다른 두드러진 바이오마커 (고성능 모델의 이러한 보다 광범위한 선택의 >50%에 존재)는 MMP1, M65 및 IL8을 포함하였다. 연령 항이 포함되면, 리포칼린 및 IGFBP2 또한 이들 고성능 패널의 50%에서 나타났다. 4 내지 7개의 바이오마커 패널의 경우, IL8은 두드러진 것으로 남아 있었다. MMP1은 또한 3 내지 5개의 바이오마커의 패널에서 그의 빈도가 50% 미만으로 떨어졌지만 보다 통상적으로 포함되는 바이오마커 중 하나였다. IL6은 모델링에 연령이 포함되었는지의 여부에 관계없이 3 및 4개의 바이오마커 패널에서 고성능 패널의 ≥20%에서 나타났다.
남성만의 데이터 상에서 개발된 2 내지 10개 바이오마커의 패널에 대한 상위 10개의 바이오마커 조합의 예가 표 43 - 51에 나타나 있다. 연령이 또한 고려될 때 남성만의 데이터 상에서 개발된 2 내지 10개 바이오마커의 패널에 대한 상위 10개의 바이오마커 조합의 예가 표 52 - 60에 나타나 있다.
표 43 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 10개의 바이오마커 조합.
표 44 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 9개의 바이오마커 조합.
표 45 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 8개의 바이오마커 조합.
표 46 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 7개의 바이오마커 조합.
표 47 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 6개의 바이오마커 조합.
표 48 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 5개의 바이오마커 조합.
표 49 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 4개의 바이오마커 조합.
표 50 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 3개의 바이오마커 조합.
표 51 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 2개의 바이오마커 조합.
표 52 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 10개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 53 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 9개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 54 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 8개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 55 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 7개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 56 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 6개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 57 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 5개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 58 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 4개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 59 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 3개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 60 BDNF를 포함하고 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성)를 대조군과 구별하는 2개의 바이오마커 조합 플러스 연령.
표 7-15 (성별 조합됨, 바이오마커만)와 표 43-51 (남성, 바이오마커만)을 비교하면, 두 성별 조합으로부터의 데이터 상에서 개발된 모델과 남성만의 데이터 상에서 개발된 것들의 성능 차이는 최소였다. 이 패턴은 또한 모델링이 연령을 포함한 경우에도 관찰되었다 (표 16-24를 표 52-60과 비교). 남성에 대한 이들 결과는 여성만의 데이터 상에서 구축된 모델에서 얻은 유사한 결과와 현저하게 대조되었다.
상기 표 43-51 및 52-60을 고려하면, 일반적으로, 계산에 연령이 포함되었든 아니든, 남성만의 대상체로부터의 데이터 상에서 개발된 모델의 상위 성능 세트는 패널이 보다 높은 수의 바이오마커를 함유할 때 95% 특이도에서 보다 높은 민감도를 달성하였음이 드러났다. 성별 조합에 대해 관찰된 바와 같이, 남성만의 데이터로 얻은 2 내지 10개 범위의 인접한 바이오마커 패널 크기 부류 사이에서 상위 성능 모델로 달성된 민감도에서의 중첩이 존재하였다. 남성만의 데이터로 수행된 모델링에 연령 항이 포함되었을 때 민감도 개선은 관찰되지 않았다.
조합된 남성 및 여성 데이터 상에서 구축된 모델의 경우와 같이, 남성만으로 개발된 모델의 경우, 각 바이오마커 수치 부류에서 상위 성능 패널에 대한 바이오마커 조성은 연령을 포함한 모델과 포함하지 않은 모델 사이에서 다소 상이하였다. 유일한 예외는 상위 모델이 연령의 존재 및 부재 하에 동일한 바이오마커 조성을 갖는 5개의 바이오마커 패널이었다. 그러나, 각 바이오마커 수치 부류에서 연령을 더하거나 뺀 상위 성능 모델에서는 주요 바이오마커가 여전히 강력하게 보존되었다. 특히, BDNF 및 M2PK는 모든 상위 모델에 존재하였다. DKK3 및 TNFα는 대부분의 바이오마커 조합에 걸쳐 두드러졌으나, IL8 및 TIMP1도 상당히 통상적으로 나타났다. IGFBP2는 5개의 바이오마커 조합의 바이오마커만의 상위 모델에서만 나타났지만, 4, 7, 9 및 10개의 바이오마커 조합의 연령을 포함하는 상위 모델에 존재하였다.
도 5-1 및 5-2는 5 내지 10개의 바이오마커의 패널에 대한 남성만의 데이터 상에서 개발된 상위 100개의 모델 (또는 95% 특이도에서 ≥75%의 민감도를 생성하는 상위 모델)에서 개별 바이오마커가 나타나는 빈도를 도시한 그래프를 나타낸다. 도 6-1 및 6-2는 5 내지 10개의 바이오마커를 함유하는 바이오마커 패널에 대한 남성만의 데이터 상에서 개발된 상위 100개의 모델 (또는 95% 특이도에서 ≥75%의 민감도를 생성하는 상위 모델)에서 개별 바이오마커 (연령이 고려됨)가 나타나는 빈도를 도시한 그래프를 나타낸다.
남성 데이터만을 기반으로 한 모델의 경우, M2PK는 연령이 포함되었는지의 여부에 관계없이 모든 바이오마커 수치 부류에서의 모든 고성능 모델에 존재하였다. 유사한 성별-조합 및 여성만의 데이터 세트 상에서 구축된 모델과 달리, 남성만의 모델에서는, DKK3이 다음으로 가장 널리 퍼진 마커였으며, 이들이 연령을 포함하였는지의 여부에 관계없이, 고성능 모델의 이러한 보다 광범위한 선택에서 7 내지 10개의 바이오마커 조합의 모든 패널에서, 또한 4 내지 6개의 바이오마커 조합의 모든 모델의 80% 초과에서 존재하였다. BDNF는 모든 모델에서 8 내지 10개의 바이오마커 조합에서, 고성능 7개의 바이오마커 패널의 90% 초과에, 또한 6개의 바이오마커 조합의 50% 초과에 존재하였다. 4 및 5개의 바이오마커 조합에서 그의 빈도는 50% 미만으로 떨어졌지만, BDNF는 바이오마커 빈도의 두 번째 계층 내에서 견고하게 유지되었다. TNFα는 고성능 6 내지 10개의 바이오마커 조합에서 널리 퍼져 있었고 여전히 5개의 바이오마커 조합에서 건전한 2차 계층 마커였다. IGFBP2는 또한 7 내지 10개의 바이오마커 조합의 고성능 모델 사이에서 널리 퍼져 있었지만, 그의 표시는 3 내지 6개의 바이오마커 조합에서 상당히 떨어졌다. 대조적으로, 7 내지 10개의 바이오마커 패널에서 상위 성능 모델에 대한 부수적 기여자인 TGFβ1은, 고성능 4 내지 6개의 바이오마커 패널에서 두드러진 기여자가 되었으며, 4 및 5개의 바이오마커 패널에서 세 번째로 가장 빈번하게 나타난 마커가 되었다.
남성의 경우 95%의 특이도에서 민감도 >75%로 남성으로부터 도출된 사례 혈청과 대조군 혈청을 구별하는 2-바이오마커 조합 (연령 유무)은 없었다. 남성의 경우 BDNF를 포함한 최선의 성능 쌍별 조합 (연령을 고려하지 않은 경우)은 M2PK + BDNF (민감도 52.3%)였다. 남성의 경우 BDNF를 포함한 최선의 성능 쌍별 조합 (연령을 고려한 경우)은 M2PK + BDNF (민감도 57.9%)였다.
실시예 5 기타 고성능 바이오마커 조합
본원에 기재된 방법, 용도 등은 또한 표 61 내지 66에 제공된 바이오마커 조합 중 하나 이상 또는 모두를 사용할 수 있다. 이들 표에서 Sens. = 평균 교차 검증된 민감도이다.
표 61 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두, 연령은 고려되지 않음)를 대조군과 구별하기 위해 사용될 수 있는 상위 20개의, 7 내지 3개의 바이오마커 조합.
표 62 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (두 성별 모두, 연령 또한 분석에 포함됨)를 대조군과 구별하기 위해 사용될 수 있는 상위 20개의, 7 내지 3개의 바이오마커 조합.
표 63 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성만, 연령은 고려되지 않음)를 대조군과 구별하기 위해 사용될 수 있는 상위 20개의, 7 내지 3개의 바이오마커 조합.
표 64 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (여성만, 연령 또한 분석에 포함됨)를 대조군과 구별하기 위해 사용될 수 있는 상위 20개의, 7 내지 3개의 바이오마커 조합.
표 65 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성만, 연령은 고려되지 않음)를 대조군과 구별하기 위해 사용될 수 있는 상위 20개의, 7 내지 3개의 바이오마커 조합.
표 66 95% 특이도에서 결장직장암 대상체 (남성만, 연령 또한 분석에 포함됨)를 대조군과 구별하기 위해 사용될 수 있는 상위 20개의, 7 내지 3개의 바이오마커 조합.
실시예 6 5개의 바이오마커 패널의 성능 (연구 9)
CRC의 조기 검출을 위한 혈액-기반 5-바이오마커 패널의 잠재적 유용성을 검사하고, CRC 발병 위험이 정상인 무증상 사람의 CRC 스크리닝에 대한 그의 잠재적 적용을 검사하기 위해, 사례/대조군 연구를 먼저 수행하여 M2PK, BDNF, IGFBP2, TIMP1 및 DKK3을 포함하는 예시 5개의 바이오마커 패널의 성능 특징을 식별하였다.
이러한 패널은 하기 다수의 상황에서 유용할 수 있다: 대변 시험을 사용하여 결장직장암에 대해 시험할 수 없거나 하지 않을 사람들을 위한 대체 시험을 제공하는, 현재의 FIT 또는 대장내시경검사 스크리닝의 보조 수단으로서; 대장내시경검사에 대한 양성 FIT 결과를 갖는 사람의 분류를 용이하게 하기 위한 추가의 시험으로서, 또는 잠재적으로 1차 CRC 스크리닝 적용을 위한 FIT의 대안으로서. 따라서, 5-바이오마커 패널의 성능과 FIT의 것의 비교, 특히 무증상, 정상 위험, 스크리닝 집단에 적용시 시험의 상대적인 양성 및 음성 예측 값이 중요하다.
방법
연구 집단
표 67 코호트 1 및 코호트 2의 연구 집단.
CRC=결장직장암
코호트 1은 349개의 샘플로 구성되었고, 코호트 2는 94개의 샘플로 구성되었다. *3개의 샘플은 스테이지 0 암이었고 TMN 스테이지 수에 포함되지 않는다.
샘플 및 정량화
2018년 내지 2021년에 수집된 이 연구의 혈청 샘플은 Victorian Cancer Biobank로부터 또는 상업적으로 ProteoGenex (ProteoGenex, Inc., 미국 캘리포니아주 잉글우드)로부터 공급되었다. 연구 프로토콜은 ProteoGenex를 통해 암위원회 빅토리아 인간 연구 윤리 위원회 (HREC-1803)와 러시아 종양학 연구 센터 윤리 위원회 (IRB PG-ONC 2003/1)에 의해 승인되었다.
M2PK, BDNF, IGFBP2, TIMP1 및 DKK3의 농도는 2개의 독립적인 CRC 사례/건강한 정상 대조군 코호트로부터의 혈청 샘플에서 정량화되었으며, 그의 특징은 표 67에 기재되어 있다. ELISA를 사용하여 바이오마커의 농도를 측정하였다. 바이오마커 농도를 본원에 기재된 알고리즘을 통해 연령, 성별 또는 BMI 데이터와 조합하여 결장직장암 가능성 점수를 제공하였다. 본 실시예에서, 여성에는 1.1의 임의 값이, 또한 남성에는 1의 임의 값이 할당되었다. 정의된 임계치 초과의 점수를 갖는 사람은 최종적 진단을 위해 대장내시경검사를 진행하도록 그의 의료 전문가에 의해 조언을 받을 것으로 예상된다. 임계치 미만의 점수를 갖는 사람들은 2년 후에 다시 스크리닝하도록 권고될 것이다.
바이오마커 패널 훈련 및 시험
연령 및 성별을 추가한 두 코호트 모두로부터의 샘플 농도를 로지스틱 회귀-기반 알고리즘의 훈련 및 시험에 사용하였다. 이들 등식을 도출할 때, 단백질 바이오마커 농도는 log 10으로 변환되었다. 여성성은 1.0의 바이오마커 값, 남성성은 1.1의 값으로 할당되었다. 연령은 세 단위로 표현되었다. BMI가 포함된 알고리즘 도출에서는 참가자의 키 및 체중 측정으로부터 체질량 지수 값을 계산하였다. 100개의 리샘플링 및 1000회 반복과 함께, 섞인 데이터에 대한 훈련-시험 분할 (60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 및 100:100의 분할비) 및 K겹 교차 검증 (K=5, 10) 방법을 적용하여 고려 중인 5 내지 8-파라미터 패널을 포함하는 알고리즘을 생성하였다. 훈련, 시험 및 검증 방법은 2개의 상이한 접근법으로 적용하였다 (도 7).
훈련 및 시험 서브세트를 생성하기 위해 훈련-시험 분할 또는 k겹 교차 검증을 사용하여 하나의 코호트를 분할하였다. 이어서 결과 알고리즘을 제2 코호트에 대해 검증하였다.
하나의 코호트를 전체적으로 사용하여 알고리즘을 훈련한 다음 제2 코호트 상에서 시험하였다.
파이썬-기반 통합 개발 환경 PyCharm (Version X, JetBrains, Praha 4, Praha, 체코 공화국) 및 수치 컴퓨팅 환경 MATLAB (Version 2021b, MathWorks, 미국 매사추세츠주 네이틱)를 사용하여 데이터에 대한 로지스틱 회귀 및 퍼지 논리 분석을 수행하였다.
알고리즘 선택
코호트 1에서 훈련 및 샘플 내 시험된 알고리즘을 코호트 2에서 시험하였다. 상위 성능 알고리즘은 성능 (95%의 특이도에서 73%의 성능 목표를 초과하는 훈련 및 시험 민감도), 성능에 대한 신뢰도, 견고성 (데이터세트 간 전달가능성) 및 훈련 데이터세트 크기를 기반으로 하여 선택되었다. 95% 신뢰도의 Wilson 점수 간격은 이항 분포로 표현된 진양성 (민감도)의 수를 사용하여 상위 성능 알고리즘 민감도에 대해 수동으로 계산되었다 ((E. B. Wilson, "Probable inference, the law of succession, and statistical inference," Journal of the American Statistical Association, vol. 22, no. 158, pp. 209-212, 1927). 20 ug Hb/g의 컷오프 값을 사용하여 FIT의 메타-분석을 기반으로 하여 73% 성능 목표를 선택하였다 (K. Selby et al., "Effect of sex, age, and positivity threshold on fecal immunochemical test accuracy: a systematic review and meta-analysis," Gastroenterology, vol. 157, no. 6, pp. 1494-1505, 2019). 상위 성능 알고리즘에 대한 결과가 하기에 나타나 있다.
결과
결장직장암 (CRC) 및 대조군 환자의 혈청에서 측정된 개별 바이오마커의 성능
개별적으로 고려하면, 5개의 바이오마커 각각의 수준은 코호트 1에서의 CRC와 대조군 혈청 샘플 사이에서 유의하게 상이하였다 (표 68). 대조군에 비해 CRC 환자로부터의 혈청에서 M2PK, IGFBP2 및 TIMP1의 수준은 상승되었지만, BDNF 및 DKK3의 수준은 대조군에 비해 감소하였다. 보다 작은 코호트 2에서는, 암과 대조군 혈청 사이에서 바이오마커 농도의 유이한 차이가 M2PK, IGFBP2 및 TIMP1에서 관찰되었지만 DKK3은 유의성에 접근하였다.
표 68 암 및 대조군 환자의 혈청에서 측정된 개별 단백질 바이오마커의 농도 (중앙값 및 범위). 비모수 Wilcoxon 순위 합계 시험을 사용하여 결정된 P 값.
개별적으로 고려할 때, M2PK는 각각 코호트 1 및 2에서 8.30e-06 및 5.46e-009의 최소 P 값을 가지며 암과 대조군을 최선으로 차별화하였다. IGFBP2는 각각 코호트 1 및 2에서 4.68e-023 및 1.03e-006의 P 값을 가지며 두 번째로 우수하였다. 사례와 대조군 사이의 차별성은 코호트 1에서는 DKK3에서 최저였지만 (P = 0.0049) 코호트 2에서는 BDNF가 최저였고 (P = 0.3041), 이는 이 코호트의 작은 크기에 기인하였을 수 있다. 그러나, ROC 분석을 기반으로 하여, 이들 마커 중 어느 것도 CRC의 조기 검출을 위해 임상적으로 사용하기에 충분한 정확도로 사례와 대조군을 개별적으로 구별하지 못하였다.
바이오마커 패널 성능
이들 5개의 (M2PK, DKK3, IGFBP2, TIMP1 및 BDNF) 바이오마커가, 연령, 성별 또는 체질량 지수 (BMI)에 대한 항과 커플링시, 유용하게 CRC 환자와 대조군으로부터의 샘플을 구별할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 로지스틱 회귀 및 수신자 운영자 특징 (ROC) 곡선 분석을 적용하였다.
바이오마커 농도를 연령 및 성별에 대한 추가 항과 조합하여 높은 민감도 및 특이도로 사례와 대조 샘플을 구별하는 고성능 알고리즘을 본원에 기재된 바와 같이 코호트 1로부터의 데이터 상에서 훈련하였다. 이어서 리드 알고리즘을 80/20 분할, 훈련/시험 접근법의 다수 반복을 사용하여 샘플-내 교차 검증하였다. ROC 분석 (ROC 평면에서 (0, 1) 모서리에 가장 가까운 지점)에서 최고 교차 검증된 민감도 및 특이도를 생성하는 알고리즘을 선택하고 락킹하였다. 이들 락킹된 파라미터에는 그 초과에서는 시험 결과가 양성으로 간주되고 그 미만에서는 시험이 음성으로 채점되는 임계치가 포함된다. 이어서 이 알고리즘을 완전 독립적 데이터 세트, (코호트 2)에서 시험하였다. 각 분석에 대하여, ROC 곡선 하 면적을 결정하였다. 락킹된 임계치 값에서의 민감도 및 특이도 값을, 양성 및 음성 예측 값과 함께 결정하였다.
결과는 하기와 같았다:
AUC 코호트 1 교차 검증 - 88% 코호트 2 교차 검증 - 84%
민감도 코호트 1 교차 검증 - 84% 코호트 2 교차 검증 - 78%
특이도 코호트 1 교차 검증 - 97% 코호트 2 교차 검증 - 93%
PPV 코호트 1 교차 검증 - 97.1% 코호트 2 교차 검증 - 92.7%
NPV 코호트 1 교차 검증 - 83.8% 코호트 2 교차 검증 - 78.8%
이들 상이한 훈련 및 시험 작업에 걸쳐 민감도 값의 작은 명백한 변동은 통계적으로 유의하지 않았다. 또한, 민감도 및 특이도 값은 50 내지 69세의 무증상 정상 CRC 위험 집단에 대해 수행된 호주 NBCSP 파일럿 연구에서 FIT에 대해 관찰된 것들과 매우 경쟁적이다.
0.00264의 CRC 유병률을 나타내는 100만 명의 참가자의 이론적 정상 CRC 위험 스크리닝 집단에 대한 상기에 설명된 5개의 단백질 플러스 연령 및 성별 분류자에 대한 민감도 및 특이도 값의 맵핑 (호주 보건 복지 연구소 2014. 국립 장암 스크리닝 프로그램에 대한 장암 결과 분석. Cat. no. CAN 87. 캔버라: AIHW)은 스크리닝 집단에서 예상되는 이론적 양성 예측 값 (PPV) 및 음성 예측 값 (NPV)의 계산을 가능하게 한다. 호주 국립 장암 스크리닝 프로그램에서의 FIT 집단 스크리닝에서 관찰된 등가물에 대한 이들 값의 비교가 표 69에 나타나 있다.
표 69 CRC에 대한 집단 스크리닝에서 FIT와 예상 ColoSTAT 성능의 비교
표 69의 결과는 FIT에 비해 BDNF, M2PK, IGFBP2, TIMP1 및 DKK3, 플러스 연령 및 성별을 포함한 5-바이오마커 패널에 대한 성능 파라미터의 실질적인 개선을 예상하며, 이는 무증상 정상 CRC 위험 스크리닝 집단에 적용될 때 강한 잠재적 유용성을 시사한다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 실시예는 5-단백질 바이오마커 패널 (M2PK, BDNF, IGFBP2, TIMP1 및 IGFBP2) 플러스 연령 및 성별에 대한 인구통계학적 지표의 정량화로 달성되었지만, 연령 단독과 함께, 또한 성별 단독과 함께, 5-단백질 바이오마커 단독 사용시 유사한 강한 성능이 또한 예상될 수 있다. 또한, 당업자는, 흡연 이력, 체질량 지수 (BMI) 및 엉덩이-허리 비율을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 인구통계학적 또는 형태계측학적 항과의 하나 이상의 인구통계학적 항의 추가 또는 대체 또한 FIT와 매우 경쟁적인 강한 성능 시험을 제공할 것으로 예상됨을 이해할 것이다.
하기 결과 표는 이러한 이해를 뒷받침한다. 이들은 BDNF, M2PK, IGFBP2, TIMP1 및 DKK3을 포함하는 5개 단백질 바이오마커 단독 뿐만 아니라 이들과 함께 대상체의 연령, 성별 및 BMI (체질량 지수 값은 참가자의 키 및 체중 측정으로부터 계산됨)를 포함한 추가의 인구통계학적 및 형태계측학적 바이오마커에 대한 민감도 및 특이도 데이터를 기재한다. 성별의 고려를 위해, 여성에는 1.1의 임의 값이 할당되었고, 남성에는 1의 임의 값이 할당되었다.
하기 표를 참조하여, BM1은 PKM2 종양 형태를 지칭하고; BM2 = TIMP1; BM3 = IGFBP2; BM4 = DKK3 및 BM5 = BDNF이다.
표 70 각 모델의 평균 성능.
모든 '시험' 결과는 모든 샘플을 고려한다 (즉, 제외된 샘플 없음). 제2 및 제3 열의 민감도 및 특이도 값은 ROC 곡선과 (0, 1) 지점 사이의 유클리드 거리를 최소화하는 지점에서 측정되었다. 제4, 제5 및 제6 열에 나타낸 민감도는 95% 특이도를 생성하는 임계치에서 결정되었다.
요약
검사된 모든 바이오마커 패널 카테고리는 강한 암/건강 대조군 차별화 성능을 나타내었다. 5개의 단백질 바이오마커를 BMI와 조합하면 평균 특이도에서 최선의 성능을 나타내는 것으로 보인다. 그러나, 통계적으로, 5개 단백질 바이오마커 단독, 5개 단백질 바이오마커 마커 플러스 연령, 5개 단백질 바이오마커 플러스 성별, 5개 단백질 바이오마커 플러스 연령 플러스 성별, 5개 단백질 바이오마커 플러스 연령 플러스 성별 플러스 BMI 및 5개 단백질 바이오마커 플러스 BMI를 포함하는 패널은 유사한 것으로 보인다.
이 특정 연구에서는 연령 및 성별의 영향이 과소평가되었을 수 있다는 점에 유의해야 한다. 사례 및 대조군 샘플은 전향적으로 모집된 임상 증상이 있는 환자 또는 무증상의 정상 위험도의 50 - 74세 연령의 CRC 스크리닝 집단에서 나타날 것으로 예상되는 것보다 이들 코호트에서 더 밀접하게 매칭된다. 그러나, 중요하게는, 이들 결과는, 유용한 바이오마커 패널 및 알고리즘이 5-단백질 바이오마커 패널을 단독으로 또는 다양한 추가의 인구통계학적 및/또는 형태계측학적 파라미터와 조합하여 사용하여 개발될 수 있음을 나타낸다.
당업자는, 광범위하게 기재된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서, 구체적 구현예에 나타낸 바와 같이 본 발명에 대하여 다양한 변화 및/또는 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 구현예는 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적이 아닌 것으로 간주되어야 한다.
본원에서 논의 및/또는 참조된 모든 공개물은 그 전체가 본원에 포함된다.
본 명세서에 포함된 문서, 행위, 자료, 장치, 물품 등에 대한 임의의 논의는 단지 본 발명의 맥락을 제공하기 위한 것이다. 이들 사항 중 임의의 것 또는 모두가 선행 기술 기반의 부분을 형성하거나 본 출원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재했던 본 발명과 관련된 분야의 통상적 일반 지식이었다는 것을 인정하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> VisionTech Bio Pty Ltd <120> Biomarkers for colorectal cancer <130> 532236PCT <150> AU 2021901164 <151> 2021-04-20 <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 99 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Ile Ser 1 5 10 15 Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu 20 25 30 Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe 35 40 45 Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr 50 55 60 Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro 65 70 75 80 Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala 85 90 95 Glu Asn Ser <210> 2 <211> 328 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Pro Arg Val Gly Cys Pro Ala Leu Pro Leu Pro Pro Pro Pro 1 5 10 15 Leu Leu Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Ala Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Gly Ala Arg Ala Glu Val Leu Phe Arg Cys Pro Pro Cys 35 40 45 Thr Pro Glu Arg Leu Ala Ala Cys Gly Pro Pro 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Homo sapiens <400> 20 Phe Pro Ala Thr Leu Glu Thr Gln Glu Gln Asp Val Asp Leu Val Gln 1 5 10 15 Lys Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn Leu Lys Asn Asp Gly Arg Gln Val 20 25 30 Glu Lys Arg Arg Asn Ser Gly Pro Val Val Glu Lys Leu Lys Gln Met 35 40 45 Gln Glu Phe Phe Gly Leu Lys Val Thr Gly Lys Pro Asp Ala Glu Thr 50 55 60 Leu Lys Val Met Lys Gln Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Ala Gln 65 70 75 80 Phe Val Leu Thr Glu Gly Asn Pro Arg Trp Glu Gln Thr His Leu Thr 85 90 95 Tyr Arg Ile Glu Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Arg Ala Asp Val Asp 100 105 110 His Ala Ile Glu Lys Ala Phe Gln Leu Trp Ser Asn Val Thr Pro Leu 115 120 125 Thr Phe Thr Lys Val Ser Glu Gly Gln Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe 130 135 140 Val Arg Gly Asp His Arg Asp Asn Ser Pro Phe Asp Gly Pro Gly Gly 145 150 155 160 Asn Leu Ala His Ala Phe Gln Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Ala 165 170 175 His Phe Asp Glu Asp Glu Arg Trp Thr Asn Asn Phe Arg Glu Tyr Asn 180 185 190 Leu His Arg Val Ala Ala His Glu Leu Gly His Ser Leu Gly Leu Ser 195 200 205 His Ser Thr Asp Ile Gly Ala Leu Met Tyr Pro Ser Tyr Thr Phe Ser 210 215 220 Gly Asp Val Gln Leu Ala Gln Asp Asp Ile Asp Gly Ile Gln Ala Ile 225 230 235 240 Tyr Gly Arg Ser Gln Asn Pro Val Gln Pro Ile Gly Pro Gln Thr Pro 245 250 255 Lys Ala Cys Asp Ser Lys Leu Thr Phe Asp Ala Ile Thr Thr Ile Arg 260 265 270 Gly Glu Val Met Phe Phe Lys Asp Arg Phe Tyr Met Arg Thr Asn Pro 275 280 285 Phe Tyr Pro Glu Val Glu Leu Asn Phe Ile Ser Val Phe Trp Pro Gln 290 295 300 Leu Pro Asn Gly Leu Glu Ala Ala Tyr Glu Phe Ala Asp Arg Asp Glu 305 310 315 320 Val Arg Phe Phe Lys Gly Asn Lys Tyr Trp Ala Val Gln Gly Gln Asn 325 330 335 Val Leu His Gly Tyr Pro Lys Asp Ile Tyr Ser Ser Phe Gly Phe Pro 340 345 350 Arg Thr Val Lys His Ile Asp Ala Ala Leu Ser Glu Glu Asn Thr Gly 355 360 365 Lys Thr Tyr Phe Phe Val Ala Asn Lys Tyr Trp Arg Tyr Asp Glu Tyr 370 375 380 Lys Arg Ser Met Asp Pro Gly Tyr Pro Lys Met Ile Ala His Asp Phe 385 390 395 400 Pro Gly Ile Gly His Lys Val Asp Ala Val Phe Met Lys Asp Gly Phe 405 410 415 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Gly Leu Gly Gly Asp Ala His Phe Asp 165 170 175 Glu Asp Glu Arg Trp Thr Asp Gly Ser Ser Leu Gly Ile Asn Phe Leu 180 185 190 Tyr Ala Ala Thr His Glu Leu Gly His Ser Leu Gly Met Gly His Ser 195 200 205 Ser Asp Pro Asn Ala Val Met Tyr Pro Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Pro 210 215 220 Gln Asn Phe Lys Leu Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu 225 230 235 240 Tyr Gly Lys Arg Ser Asn Ser Arg Lys Lys 245 250

Claims (40)

  1. 결장직장암의 진단 방법 및/또는 결장직장암을 갖는 것으로 의심되는 대상체의 식별 방법으로서, 방법은
    대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 바이오마커의 패널에 대한 측정을 결정하며, 여기서 패널은 적어도 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF) 및 종양 M2-PK를 포함하는 단계
    를 포함하고, 여기서 측정은 패널 내의 바이오마커 각각의 수준의 측정을 포함하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, DKK3, TGFβ1, IGFBP2, TIMP1, IL6, IL8, TNFα, IGFII, 리포칼린, M30, M65, Mac2BP, MMP1, MMP7, MIP1B 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 바이오마커의 측정의 결정을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이오마커가 M2PK, BDNF, DKK3, 및 IGFBP2를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 바이오마커가 M2PK, BDNF, DKK3, TIMP1 및 IGFBP2를 포함하는 것인 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 추가의 바이오마커로서 대상체의 연령 및/또는 성별 및/또는 체질량 지수 (BMI)를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 3개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커의 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF, M2PK, DKK-3;
    ii) BDNF, M2PK, TNFα;
    iii) BDNF, M2PK, IL-8;
    iv) BDNF, M2PK, MAC2BP; 또는
    v) BDNF, M2PK, IGFBP2.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 4개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커의 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF, M2PK, IL8, TNFα;
    ii) BDNF, M2PK, IL8, MIP1β;
    iii) BDNF, M2PK, IL8, DKK3;
    iv) BDNF, M2PK, MMP1, DKK3;
    v) BDNF, M2PK, IL8, IGFBP2;
    vi) BDNF, M2PK, IL8, TIMP1;
    vii) BDNF, M2PK, MMP7, TNFα;
    viii) BDNF, M2PK, IL8, MMP1;
    ix) BDNF, M2PK, IGFBP2, TNFα; 또는
    x) BDNF, M2PK, IL8, IGFII.
  8. 제5항에 있어서, 방법은 적어도 4개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 패널은 적어도 BDNF, M2PK, IL-8 및 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1 및 IGFII로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 5개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커의 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF; M2PK; IL8; TNFα; MIP1β;
    ii) BDNF; M2PK; IL8; 리포칼린; DKK3;
    iii) BDNF; M2PK; IL8; TGFβ; DKK3;
    iv) BDNF; M2PK; IL8; TNFα; TGFβ;
    v) BDNF; M2PK; IGFBP2; TNFα; DKK3;
    vi) BDNF; M2PK; IL8; MMP7; DKK3;
    vii) BDNF; M2PK; IL8; TNFα; DKK3;
    viii) BDNF; M2PK; IL8; IGFBP2; MIP1β;
    ix) BDNF; M2PK; IL8; MAC2BP; DKK3; 또는
    x) BDNF; M2PK; IL8; TNFα; MAC2BP.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 6개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커의 패널은 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF; M2PK; MIP1β; DKK3; IGFBP2; TNFα;
    ii) BDNF; M2PK; MIP1β; DKK3; IGFBP2; MMP1;
    iii) BDNF; M2PK; MAC2BP; DKK3; IGFBP2; TNFα;
    iv) BDNF; M2PK; 리포칼린; DKK3; IGFBP2; TNFα;
    v) BDNF; M2PK; IL6; DKK3; IGFBP2; TNFα;
    vi) BDNF; M2PK; IL8; DKK3; 리포칼린; TGFβ;
    vii) BDNF; M2PK; IL8; MIP1B; TGFβ; TNFα;
    viii) BDNF; M2PK; IL8; MIP1B; IGFII; TNFα;
    ix) BDNF; M2PK; IL8; M30; TGFβ; TNFα; 또는
    x) BDNF; M2PK; IL8; DKK3; IGFII; TNFα.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 패널은 추가의 바이오마커로서 대상체의 연령을 추가로 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체는 여성이고, 방법은 적어도 3개의 바이오마커에 대한 측정의 결정을 포함하고, 바이오마커는 BDNF 및 M2PK 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 MIP1β, MMP1, 리포칼린, IL13, IL8, MAC2BP, 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 3개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF; M2PK; IL8;
    ii) BDNF; M2PK; MAC2BP;
    iii) BDNF; M2PK; MMP1;
    iv) BDNF; M2PK; 리포칼린;
    v) BDNF; M2PK; IL13;
    vi) BDNF; M2PK; MIP1β;
    vii) BDNF; M2PK; IL6.
  14. 제12항에 있어서, 대상체는 여성이고, 방법은 적어도 4개의 바이오마커의 패널에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커는 적어도 BDNF 및 M2PK 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 TNFα, MIP1β, MMP1, IGFII, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 추가의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 4개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF, M2PK, IL8, MMP1;
    ii) BDNF, M2PK, IL8, 리포칼린;
    iii) BDNF, M2PK, IL8, IL6;
    iv) BDNF, M2PK, IL8, MIP1β;
    v) BDNF, M2PK, IL8, MAC2BP;
    vi) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ;
    vii) BDNF, M2PK, IL8, IL13;
    viii) BDNF, M2PK, IL8, IGFII;
    ix) BDNF, M2PK, IL8, TNFα; 또는
    x) BDNF, M2PK, TGFβ1, MMP1.
  16. 제12항에 있어서, 대상체는 여성이고,
    (i) 방법은 적어도 5개의 바이오마커 플러스 여성 성별에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커는 적어도 BDNF 및 M2PK 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 TNFα, MIP1β, MMP1, IGFII, IL8, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 추가의 바이오마커를 포함하거나, 또는
    (ii) 방법은 적어도 5개의 바이오마커 플러스 여성 성별에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커는 적어도 BDNF, M2PK 및 IL-8 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 TNFα, MIP1β, MMP1, IGFII, 리포칼린, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 5개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, TNFα;
    ii) BDNF, M2PK, IL8, TNFα, MMP1;
    iii) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, MMP1;
    iv) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, MAC2BP;
    v) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, IL6;
    vi) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, IL13;
    vii) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, IGFII;
    viii) BDNF, M2PK, IL8, TGFβ1, MIP1β;
    ix) BDNF, M2PK, IL8, MMP1, MIP1β, 또는
    x) BDNF, M2PK, IL8, MAC2BP, MIP1β.
  18. 제12항에 있어서, 대상체는 여성이고, 방법은 적어도 6개의 바이오마커에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커는 적어도 BDNF 및 M2PK 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 DKK3, TNFα, MIP1β, MMP1, M65, M30, IL8, IL13, MAC2BP, TGFβ1 및 IL6으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 6개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF, M2PK, IL8, IL13, M65, M30;
    ii) BDNF, M2PK, IL8, MMP1, TGFβ1, TNFα;
    iii) BDNF, M2PK, IL8, MAC2BP, TGFβ1, TNFα;
    iv) BDNF, M2PK, IL8, IL6, TGFβ1, TNFα;
    v) BDNF, M2PK, IL8, MMP1, MAC2BP, TNFα;
    vi) BDNF, M2PK, IL8, MMP1, TGFβ1, MAC2BP;
    vii) BDNF, M2PK, IL8, MMP1, TGFβ1, DKK3;
    viii) BDNF, M2PK, IL8, IL6, TGFβ1, MAC2BP;
    ix) BDNF, M2PK, IL8, MMP1, DKK3, MAC2BP, 또는
    x) BDNF, M2PK, IL8, IL13, TGFβ1, MIP1β.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 바이오마커로서 대상체의 연령을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체는 남성이고, 방법은 적어도 3개의 바이오마커에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커는 적어도 BDNF 및 M2PK 및 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MMP7, IGFII, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 3개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF, M2PK, TNFα;
    ii) BDNF, M2PK, TIMP1;
    iii) BDNF, M2PK, IL8;
    iv) BDNF, M2PK, TGFβ;
    v) BDNF, M2PK, MMP7;
    vi) BDNF, M2PK, IL13;
    vii) BDNF, M2PK, IGFII;
    viii) BDNF, M2PK, IGFBP2;
    ix) BDNF, M2PK, MAC2BP, 또는
    x) BDNF, M2PK, 리포칼린.
  23. 제21항에 있어서, 대상체는 남성이고, 방법은 적어도 4개의 바이오마커에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커는 적어도 BDNF 및 M2PK 및 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1B, MMP7, M65 및 IL8로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 추가의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 4개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF, M2PK, DKK3, TIMP1;
    ii) BDNF, M2PK, IL8, TNFα;
    iii) BDNF, M2PK, IGFBP2, TNFα;
    iv) BDNF, M2PK, IL8, IGFBP2;
    v) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα;
    vi) BDNF, M2PK, IL8, MMP7;
    vii) BDNF, M2PK, DKK3, M65;
    viii) BDNF, M2PK, DKK3, IL8;
    ix) BDNF, M2PK, DKK3, IGFBP2, 또는
    x) BDNF, M2PK, MIP1β, TIMP1.
  25. 제21항에 있어서, 대상체는 남성이고, 방법은 적어도 5개의 바이오마커에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 바이오마커는 적어도 BDNF 및 M2PK 및 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, IGFII, M65, 리포칼린, IL8 및 Mac2BP로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 5개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF; M2PK; DKK3; IGFBP2; TNFα;
    ii) BDNF; M2PK; DKK3; 리포칼린; TIMP1;
    iii) BDNF; M2PK; DKK3; M65; TNFα;
    iv) BDNF; M2PK; DKK3; IGFBP2; TIMP1;
    v) BDNF; M2PK; DKK3; IL8; IGFII;
    vi) BDNF; M2PK; IL13; IL8; TNFα;
    vii) BDNF; M2PK; DKK3; MAC2BP; TIMP1;
    viii) BDNF; M2PK; DKK3; M65; TIMP1;
    ix) BDNF; M2PK; DKK3; MIP1B; TNFα; 또는
    x) BDNF; M2PK; DKK3; MIP1B; TIMP1.
  27. 제21항에 있어서, 대상체는 남성이고, 방법은 적어도 5개의 바이오마커에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 5개의 바이오마커는 BDNF, M2PK, DKK3 및 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 또는 TGFβ1로부터 선택된, 바람직하게는 TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, IGFII, M65, 리포칼린, IL8 또는 MAC2BP로부터 선택된 2개의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 5개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF; M2PK; DKK3; IGFBP2; TNFα;
    ii) BDNF; M2PK; DKK3; 리포칼린; TIMP1;
    iii) BDNF; M2PK; DKK3; M65; TNFα;
    iv) BDNF; M2PK; DKK3; IGFBP2; TIMP1;
    v) BDNF; M2PK; DKK3; IL8; IGFII;
    vi) BDNF; M2PK; DKK3; MAC2BP; TIMP1;
    vii) BDNF; M2PK; DKK3; M65; TIMP1;
    viii) BDNF; M2PK; DKK3; MIP1β; TNFα; 또는
    ix) BDNF; M2PK; DKK3; MIP1β; TIMP1.
  29. 제21항에 있어서, 대상체는 남성이고,
    (i) 방법은 적어도 6개의 바이오마커에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 6개의 바이오마커는 BDNF 및 M2PK 및 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 DKK3, TNFα, IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개의 바이오마커를 포함하거나; 또는
    (ii) 방법은 적어도 6개의 바이오마커에 대한 측정의 결정을 포함하며, 여기서 6개의 바이오마커는 BDNF, M2PK, DKK3, TNFα 및 IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8, IL13, MAC2BP 및 TGFβ1로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 IGFBP2, TIMP1, MIP1β, MMP7, MMP1, IGFII, M65, M30, 리포칼린, IL8 및 IL13으로 이루어진 군으로부터 선택된 2개의 바이오마커를 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 6개의 바이오마커는 하기를 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법:
    i) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, TIMP1, IL8;
    ii) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, MMP1;
    iii) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, M30;
    iv) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, MIP1B, M65;
    v) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, MMP7;
    vi) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, M65;
    vii) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, 리포칼린;
    viii) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFII, IL8;
    ix) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, M65, M30, 또는
    x) BDNF, M2PK, DKK3, TNFα, IGFBP2, IL13.
  31. 제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 바이오마커로서 대상체의 연령을 추가로 포함하는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 측정의 결정은 생물학적 샘플을 바이오마커 각각에 특이적으로 결합하는 검출가능한 결합 작용제와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 방법은 검출 검정을 사용하여 특이적 결합 작용제와 바이오마커 사이의 특이적 결합을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 측정의 결정이, 생물학적 샘플 중의 바이오마커의 농도 측정을 포함하는 것인 방법.
  35. 제32항에 있어서, 결합 작용제는 항체인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플인 방법.
  37. 결장직장암을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체의 치료 방법으로서, 방법은
    (i) 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 따라 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플 중의 바이오마커의 패널에 대한 측정을 결정하는 단계; 및
    (ii) 대상체를 대장내시경검사 또는 구불창자내시경검사에 의해 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  38. 하기를 포함하는 키트:
    (i) 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바이오마커 패널 내의 바이오마커에 결합하는 라벨링된 항체; 및
    (ii) 바이오마커 패널 내의 바이오마커의 검출을 수행하기 위한 설명서.
  39. 제38항에 있어서, 컴퓨터 생성 알고리즘에 의한 검출된 바이오마커의 분석을 위한 설명서를 추가로 포함하는 키트.
  40. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 정의된 바이오마커 패널 내의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 라벨링된 항체를 포함하는 조성물.
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