DE102012204366B4

DE102012204366B4 - Verfahren und Kit zur Identifizierung und Quantifizierung von einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure

Info

Publication number: DE102012204366B4
Application number: DE102012204366.7A
Authority: DE
Inventors: Walter Gumbrecht; Yiwei Huang; Mathias Sprinzl; Katja Friedrich
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2012-03-20
Publication date: 2017-07-27
Anticipated expiration: 2032-03-21
Also published as: WO2013087630A1; CN104114716A; DE102012204366A1; US20140357515A1; EP2768979A1

Abstract

Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure (9), umfassend die Schritte a) Bereitstellen mindestens eines festen Trägers (1), auf dem mindestens ein Fänger-Oligonukleotid (5) immobilisiert ist; b) In-Kontaktbringen des Trägers (1) bei einer ersten Reaktionsbedingung mit mindestens einem Gegenstrang-Oligonukleotid (7), mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure (9) und mindestens einem Reporter-Oligonukleotid (11), das eine Markierung (13) aufweist, das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) umfassend eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid (5), eine Oligonukleotid-Sequenz komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure (9) und eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid (11), um das Fänger-Oligonukleotid (5) und das Reporter-Oligonukleotid (11) jeweils mindestens abschnittsweise und die Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) zu hybridisieren, so dass ein erstes Ende der Ziel-Nukleinsäure (9) und ein freies Ende des Fänger-Oligonukleotids (5) mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) Basenpaarungen bilden, und ein zweites Ende der Ziel-Nukleinsäure (9) und ein erstes Ende des Reporter-Oligonukleotids (11) mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) Basenpaarungen bilden; c) Inkubieren des Trägers (1) bei der ersten Reaktionsbedingung; d) Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids (5), um die Ziel-Nukleinsäure (9) kovalent an das Fänger-Oligonukleotid (5) zu binden, und Ligieren des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids (11), um die Ziel-Nukleinsäure (9) kovalent an das Reporter-Oligonukleotid (11) zu binden; e) Inkubieren des Trägers (1) bei einer zweiten Reaktionsbedingung derart, dass das Reporter-Oligonukleotid (11) nur bei Gegenwart von an ihren beiden Enden ligierter Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem Träger (1) verbunden bleibt; f) Auslesen der Markierung (13) des Reporter-Oligonukleotids (11) auf dem Träger (1), ...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure und ein Kit zum Nachweisen von mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure in einer Probe.
Die Expression von Genen in Zellen unterliegt einer strengen Kontrolle und wird durch vielfältige molekulare Prozesse reguliert. Neben der komplexen Regulation der Transkription der Gene spielen auch Mechanismen auf der post-transkriptionalen Ebene, das heißt auf der Ebene der mRNA, eine wichtige Rolle. Insbesondere können kurze, nicht-kodierende Nukleinsäure-Moleküle in die Genexpression eingreifen, indem sie sich hochspezifisch an komplementäre Sequenzen von mRNA-Molekülen anlagern und dadurch die Translation der mRNA in das entsprechende Protein regulieren. Die kurzen Nukleinsäure-Moleküle sind häufig sog. microRNAs (kurz „miRNAs”), die in den letzten Jahren zunehmend das Interesse der molekularbiologischen und medizinischen Forschung geweckt haben. So konnte gezeigt werden, dass manche miRNAs in einem direkten Zusammenhang mit dem Entstehen bestimmter Krebserkrankungen wie Brustkrebs, Lungenkrebs oder Leukämie stehen. Dabei weisen die Krebszellen eine erhöhte oder verminderte Anzahl spezifischer miRNAs auf. Auch bei immunologischen Erkrankungen, wie Rheuma, treten bestimmte miRNAs in veränderten Konzentrationen auf. Es wird davon ausgegangen, dass allein beim Menschen über 1000 verschiedene miRNA-Moleküle vorkommen.
Aufgrund der wachsenden Bedeutung und der Vielzahl von miRNAs werden Verfahren zu deren spezifischen Identifizierung und Quantifizierung benötigt. Es sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von miRNAs bekannt, beispielsweise die Sequenzierung der miRNAs oder die Amplifikation von miRNAs mittels realtime PCR.
Die US 6,322,971 A beschreibt ein hybridisierungsbasiertes Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure. Dabei wird die nachzuweisende Nukleinsäure mit einer zweiten, markierten Nukleinsäure kovalent verbunden, nachdem sich die beiden Nukleinsäuren an ein immobilisiertes Gegenstrang-Oligonukleotid angelagert haben und fehlende Nukleotide zwischen der nachzuweisenden und der markierten Nukleinsäure durch eine DNA-Polymerase aufgefüllt worden sind. Ungebundene markierte Nukleinsäuren werden durch Temperaturerhöhung entfernt.
Die US 6,344,316 A beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, bei dem ein immobilisiertes Fänger-Oligonukleotid mit einem zweiten, markierten Oligonukleotid kovalent verbunden wird, nachdem sich die Oligonukleotide an die nachzuweisende Nukleinsäure als Gegenstrang angelagert haben. Nach dem Entfernen der nachzuweisenden Nukleinsäure durch Waschen bei hoher Temperatur bleibt die kovalent gebundene Markierung zurück.
Pang et al., Analytical Biochemistry, Vol. 358, 2006, Seiten 99–103, beschreibt ein hybridisierungsbasiertes Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure, bei dem ein immobilisiertes Fänger-Oligonukleotid mit einem zweiten, markierten Oligonukleotid (Reporter-Oligonukleotid) kovalent verbunden wird, nachdem sich die Oligonukleotide an die nachzuweisende Nukleinsäure als Gegenstrang angelagert haben. Nicht kovalent verbundene Reporter-Oligonukleotide werden durch Temperaturerhöhung entfernt.
Wang et al., Analytica Chimica Acta, Vol. 688, 2011, Seiten 163–167, beschreibt ein hybridisierungsbasiertes Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure, bei dem ein immobilisiertes Fänger-Oligonukleotid mit einem zweiten Oligonukleotid (Ligations-Oligonukleotid) kovalent verbunden wird, nachdem sich die Oligonukleotide an die nachzuweisende Nukleinsäure als Gegenstrang angelagert haben. Nach dem Entfernen der nachzuweisenden Nukleinsäure und nicht kovalent verbundener Ligations-Oligonukleotide durch Temperaturerhöhung bleibt das kovalent gebundene Ligations-Oligonukleotid zurück, das mithilfe eines dritten, markierten Oligonukleotids ausgelesen wird.
Die US 2003/0082545 A1 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure, bei dem zwei Oligonukleotide durch eine Ligase kovalent verbunden werden, nachdem sich die Oligonukleotide an die nachzuweisende Nukleinsäure als Gegenstrang angelagert haben. Das Ligationsprodukt wird mithilfe eines immobilisierten Fänger-Oligonukleotids ausgelesen.
Aus dem Stand der Technik ergeben sich verschiedene Probleme. Beispielsweise sind die Spezifität und die Sensitivität des miRNA-Nachweises unzureichend. Bei hybridisierungsbasierten Verfahren liegt die geringe Spezifität unter anderem daran, dass keine vollständige Hybridisierung der miRNA für den Identifizierungsprozess erforderlich ist. Aufgrund der geringen Sensitivität der Verfahren müssen die miRNAs häufig vor ihrem Nachweis amplifiziert werden. Dabei kann es zu einem Einbau von fehlerhaften Nukleotiden kommen, so dass die Spezifität des miRNA-Nachweises noch weiter begrenzt wird. Die Verfahren müssen außerdem bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden, weil die geringe Länge von miRNA-Hybriden mit niedrigen Schmelztemperaturen verbunden ist. Dadurch ist der miRNA-Nachweis weder besonders robust noch quantitativ auswertbar. Zudem ist für viele Verfahren ein prä-analytisches Markieren der miRNA notwendig, das die Gefahr von ungenauen Ergebnissen und von Artefakten mit sich bringt.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren, das diese Probleme löst, sowie ein Kit zur Durchführung des Verfahrens bereit zu stellen.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 und ein Kit mit den Merkmalen gemäß Anspruch 9 gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure umfasst die Schritte: Bereitstellen mindestens eines festen Trägers, auf dem mindestens ein Fänger-Oligonukleotid immobilisiert ist, In-Kontaktbringen des Trägers bei einer ersten Reaktionsbedingung mit mindestens einem Gegenstrang-Oligonukleotid, mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure und mindestens einem Reporter-Oligonukleotid, das eine Markierung aufweist, das Gegenstrang-Oligonukleotid umfassend eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid, eine Oligonukleotid-Sequenz komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure und eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid, um das Fänger-Oligonukleotid und das Reporter-Oligonukleotid jeweils mindestens abschnittsweise und die Ziel-Nukleinsäure mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid zu hybridisieren, so dass ein erstes Ende der Ziel-Nukleinsäure und ein freies Ende des Fänger-Oligonukleotids mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids Basenpaarungen bilden, und ein zweites Ende der Ziel-Nukleinsäure und ein erstes Ende des Reporter-Oligonukleotids mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids Basenpaarungen bilden. Es folgen die Schritte Inkubieren des Trägers bei der ersten Reaktionsbedingung, Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids, um die Ziel-Nukleinsäure kovalent an das Fänger-Oligonukleotid zu binden, und Ligieren des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids, um die Ziel-Nukleinsäure kovalent an das Reporter-Oligonukleotid zu binden, Inkubieren des Trägers bei einer zweiten Reaktionsbedingung derart, dass das Reporter-Oligonukleotid nur bei Gegenwart von an ihren beiden Enden ligierter Ziel-Nukleinsäure mit dem Träger verbunden bleibt, und Auslesen der Markierung des Reporter-Oligonukleotids auf dem Träger, wobei die Ziel-Nukleinsäure eine Länge von 10 bis 30 Nukleotiden aufweist, und wobei vor dem Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids und des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids eine Phosphorylierung von einem zu ligierenden 5'-Ende der Ziel-Nukleinsäure, des Fänger-Oligonukleotids und/oder des Reporter-Oligonukleotids erfolgt, falls das zu ligierende 5'-Ende ein 5'-Hydroxyl-Ende ist.
Der Begriff „Ziel-Nukleinsäure” bezeichnet eine einzelsträngige Nukleinsäure mit einer Länge von etwa 10 bis etwa 30 Nukleotiden. Die Nukleinsäure kann eine RNA oder eine DNA sein. Bevorzugt sind natürlich vorkommende Nukleinsäuren sowie chemisch hergestellte oder rekombinant hergestellte Nukleinsäuren als Ziel-Nukleinsäure.
Für das erfindungsgemäße Verfahren wird zunächst mindestens ein fester Träger bereit gestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der feste Träger ein Chip, vorzugsweise ein Silizium-Chip. Silizium-Chips können kostengünstig hergestellt werden und bieten die Möglichkeit, zusätzliche Elemente wie beispielsweise Elektroden, Temperatursensoren oder Kühl- und Heizelemente einfach auf dem Chip zu integrieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist mindestens eine Elektrode, vorzugsweise eine Goldelektrode, auf der Oberfläche des Trägers integriert. Nukleinsäuren und Oligonukleotide lassen sich auf einfache Weise auf Goldoberflächen immobilisieren. Die Elektrode kann für ein elektrochemisches Auslesen der Markierung verwendet werden, insbesondere zum Messen eines Stroms.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der feste Träger eine Temperatursteuerung und/oder einen Temperatursensor auf. Damit kann eine Temperatur des festen Trägers eingestellt bzw. gemessen werden. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der feste Träger Kühl- und/oder Heizelemente zum Abkühlen bzw. Erwärmen des Trägers.
Auf dem festen Träger ist mindestens ein Fänger-Oligonukleotid immobilisiert. Der Begriff „Oligonukleotid” bezeichnet eine Nukleinsäure. Der Begriff umfasst sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Nukleinsäuren. Der Begriff umfasst sowohl RNA-Moleküle, sog. Oligoribonukleotide, als auch DNA-Moleküle, sog. Oligodesoxyribonukleotide.
Das Fänger-Oligonukleotid umfasst eine Oligonukleotid-Sequenz, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Gegenstrang-Oligonukleotid ist. Der Abschnitt des Fänger-Oligonukleotids, dessen Sequenz komplementär zu dem Gegenstrang-Oligonukleotid ist, weist vorzugsweise eine Länge bis etwa 30 Nukleotide auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fänger-Oligonukleotid ein einzelsträngiges Fänger-Oligonukleotid.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fänger-Oligonukleotid ein Oligodesoxyribonukleotid.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Fänger-Oligonukleotid über eine Thiol-Gruppe auf dem Träger immobilisiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Fänger-Oligonukleotid über einen Spacer auf dem Träger immobilisiert. Die Verwendung des Spacers ermöglicht die effiziente Hybridisierung des Fänger-Oligonukleotids mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid. Der Spacer ist vorzugsweise aus Thymidinnukleotiden aufgebaut. Er kann über eine Thiol-Gruppe auf dem Träger immobilisiert sein.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird anschließend der Träger bei einer ersten Reaktionsbedingung mit mindestens einem Gegenstrang-Oligonukleotid, mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure und mindestens einem Reporter-Oligonukleotid, das eine Markierung aufweist, in Kontakt gebracht.
Das Reporter-Oligonukleotid umfasst eine Oligonukleotid-Sequenz, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Gegenstrang-Oligonukleotid ist. Der Abschnitt des Reporter-Oligonukleotids, dessen Sequenz komplementär zu dem Gegenstrang-Oligonukleotid ist, weist vorzugsweise eine Länge bis etwa 30 Nukleotide auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reporter-Oligonukleotid ein einzelsträngiges Reporter-Oligonukleotid.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reporter-Oligonukleotid ein Oligodesoxyribonukleotid.
Das Reporter-Oligonukleotid weist eine Markierung auf. Die Markierung kann beispielsweise ein Enzym, insbesondere eine Esterase, oder ein Fluoreszenzfarbstoff sein. Die Markierung kann an einem zweiten Ende des Reporter-Oligonukleotids angebracht sein. Die Markierung kann auch zwischen den beiden Enden des Reporter-Oligonukleotids, beispielsweise an eine Base gebunden, mit dem Reporter-Oligonukleotid verbunden sein.
Das Gegenstrang-Oligonukleotid ist ein einzelsträngiges Oligonukleotid, das mindestens die folgenden Oligonukleotid-Sequenzen umfasst: eine Oligonukleotid-Sequenz, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid ist, eine Oligonukleotid-Sequenz, die komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure ist, und eine Oligonukleotid-Sequenz, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid ist. Somit können das Fänger-Oligonukleotid und das Reporter-Oligonukleotid jeweils mindestens abschnittsweise und die Ziel-Nukleinsäure mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid hybridisieren.
Die Abschnitte des Gegenstrang-Oligonukleotids, deren Sequenzen komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid oder dem Reporter-Oligonukleotid sind, weisen vorzugsweise jeweils eine Länge bis etwa 30 Nukleotide auf.
Der Begriff „hybridisieren” bezeichnet das Anlagern einer einzelsträngigen RNA oder DNA an eine mindestens abschnittsweise komplementäre einzelsträngige RNA oder DNA unter Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen den jeweils komplementären Basen, so dass sich in dem zueinander komplementären Abschnitt zwischen den zwei Nukleinsäure-Molekülen Basenpaarungen bilden. Der Begriff „Basenpaarung” umfasst sowohl Watson-Crick-Basenpaarungen als auch nicht Watson-Crick-Basenpaarungen wie die sog. Wobble-Basenpaarung. Eine typische Wobble-Basenpaarung ist eine Basenpaarung von Guanin mit Uracil, die sich beispielsweise beim Anlagern einer DNA an eine RNA bilden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids, die komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure ist, vollständig komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure. Somit kann die Ziel-Nukleinsäure vollständig mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid hybridisieren. Vollständiges Hybridisieren bedeutet, dass jede einzelne Base der Ziel-Nukleinsäure eine Basenpaarung mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid bildet und damit kein einziger Basen-Mismatch vorliegt.
Die Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid ist, grenzt unmittelbar an die Oligonukleotid-Sequenz an, die komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure ist. Dadurch bilden das erste Ende der Ziel-Nukleinsäure und das freie Ende des Fänger-Oligonukleotids mit unmittelbar anschließend benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids Basenpaarungen. An das andere Ende der Oligonukleotid-Sequenz, die komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure ist, grenzt unmittelbar die Oligonukleotid-Sequenz an, die mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid ist. Dadurch bilden das zweite Ende der Ziel-Nukleinsäure und das erste Ende des Reporter-Oligonukleotids mit unmittelbar anschließend benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids Basenpaarungen. Damit sind die zu ligierenden Enden der jeweiligen Nukleinsäure-Moleküle benachbart angeordnet und können ohne ein vorheriges Auffüllen von fehlenden Nukleotiden unmittelbar miteinander ligiert werden. Weil fehlende Nukleotide für das Ligieren der jeweiligen Nukleinsäure-Moleküle nicht aufgefüllt werden müssen, kann das Verfahren besonders einfach und schnell durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ziel-Nukleinsäure vollständig komplementär zu der entsprechenden Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids, so dass die Ziel-Nukleinsäure hochspezifisch identifiziert und/oder quantifiziert werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Gegenstrang-Oligonukleotid eine Oligonukleotid-Sequenz, die vollständig komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid ist, und/oder eine Oligonukleotid-Sequenz, die vollständig komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid ist. Dadurch wird eine besonders stabile Hybridisierung des Gegenstrang-Oligonukleotids mit dem Fänger-Oligonukleotid und/oder dem Reporter-Oligonukleotid erreicht. Dies trägt zu einer zuverlässigen Identifizierung und Quantifizierung der Ziel-Nukleinsäure bei.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gegenstrang-Oligonukleotid ein Oligodesoxyribonukleotid.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind das Gegenstrang-Oligonukleotid, das Fänger-Oligonukleotid und das Reporter-Oligonukleotid Oligodesoxyribonukleotide, während die Ziel-Nukleinsäure eine RNA ist, so dass bei der Hybridisierung mindestens abschnittsweise RNA/DNA-Duplexe gebildet werden, welche thermodynamisch sehr stabil sind.
Der Begriff „Reaktionsbedingung” bezeichnet mindestens einen Parameter oder eine Kombination von Parametern, bei dem/der mindestens einer der Verfahrensschritte durchgeführt wird. Die Parameter umfassen vorzugsweise eine Temperatur, eine Salzkonzentration, eine Ionenstärke, einen pH-Wert und/oder einen Zusatz von Reagenzien wie beispielsweise Formamid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Reaktionsbedingung eine geeignete Bedingung für das Aufschmelzen von Basenpaarungen von Fänger-Oligonukleotid, Ziel-Nukleinsäure, Reporter-Oligonukleotid und Gegenstrang-Oligonukleotid.
Die Reaktionsbedingung ist insbesondere eine Temperatur.
Die erste Reaktionsbedingung ist die Reaktionsbedingung, bei der das Fänger-Oligonukleotid und das Reporter-Oligonukleotid mindestens abschnittsweise und die Ziel-Nukleinsäure mit den jeweils dazu komplementären Abschnitten des Gegenstrang-Oligonukleotids hybridisieren. Die erste Reaktionsbedingung wird vorzugsweise in Abhängigkeit der Sequenz und der Länge der Oligonukleotide und der Ziel-Nukleinsäure gewählt. Die Wahl der ersten Reaktionsbedingung kann weiterhin davon abhängen, ob die Oligonukleotide bzw. die Ziel-Nukleinsäure RNA- und/oder DNA-Moleküle sind.
Die Abkürzung „mN” steht im Folgenden für die Einheit mmol/l.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Reaktionsbedingung eine Temperatur von 42°C bei 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM EDTA und 0,025% Tween-20.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die erste Reaktionsbedingung eine Temperatur von 37°C bei 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 mM ATP und 7,5% PEG6000.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst außerdem das Inkubieren des Trägers bei der ersten Reaktionsbedingung.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids, um die Ziel-Nukleinsäure kovalent an das Fänger-Oligonukleotid zu binden, und Ligieren des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids, um die Ziel-Nukleinsäure kovalent an das Reporter-Oligonukleotid zu binden. Die Begriffe „Ligieren” und „Ligation” bezeichnen die Ausbildung einer kovalenten chemischen Bindung zwischen zwei einzelsträngigen Oligonukleotiden an deren Zucker-Phosphat-Rückgrat. Der Begriff umfasst die Bindung des 3'-Hydroxyl-Endes einzelsträngiger RNA oder DNA an das 5'-Phosphoryl-Ende einer zweiten RNA oder DNA, wobei auch ein Ligieren von RNA und DNA umfasst ist. Die Herstellung der kovalenten Bindung kann durch Enzyme, die sog. Ligasen, vorzugsweise DNA-Ligasen, katalysiert werden und ist ATP-abhängig.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Inkubieren des Trägers bei einer zweiten Reaktionsbedingung derart, dass das Reporter-Oligonukleotid nur bei Gegenwart von an ihren beiden Enden ligierter Ziel-Nukleinsäure mit dem Träger verbunden bleibt. Die zweite Reaktionsbedingung ist die Reaktionsbedingung, bei der die Basenpaarung des Gegenstrang-Oligonukleotids mit dem Fänger-Oligonukleotid, der Ziel-Nukleinsäure und dem Reporter-Oligonukleotid aufgeschmolzen wird. Dabei werden die Wasserstoffbrücken zwischen den jeweils gepaarten Basen aufgehoben. Ist die Ziel-Nukleinsäure nicht an beiden Enden ligiert, löst sich das Reporter-Oligonukleotid von dem Träger.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Reaktionsbedingung eine höhere Temperatur und/oder eine niedrigere Ionenstärke als die erste Reaktionsbedingung. Dadurch wird das Aufbrechen der Wasserstoffbrücken zwischen den jeweils gepaarten Basen bei der zweiten Reaktionsbedingung erleichtert.
In einer Ausführungsform löst sich das Gegenstrang-Oligonukleotid von dem Träger, indem es sich von dem Fänger-Oligonukleotid, der Ziel-Nukleinsäure und dem Reporter-Oligonukleotid löst.
In einer bevorzugten Ausführungsform verbleibt das Gegenstrang-Oligonukleotid auf dem Träger. Um dies zu erreichen, weist die zweite Reaktionsbedingung im Vergleich zu der Reaktionsbedingung, bei der sich das Gegenstrang-Oligonukleotid von dem Träger löst, vorzugsweise eine niedrigere Temperatur und/oder eine niedrigere Ionenstärke auf. Aufgrund eines Energiegewinns durch die zwei Ligationen wirkt die Anwesenheit des Gegenstrang-Oligonukleotids, das mit dem Fänger-Oligonukleotid, der Ziel-Nukleinsäure und dem Reporter-Oligonukleotid durch Basenpaarungen verbunden ist, energetisch stabilisierend. Durch die Stabilisierung kann das Auslesen der Markierung auf dem Träger unter milderen Bedingungen im Vergleich zur Abwesenheit des Gegenstrang-Oligonukleotids durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Reaktionsbedingung eine Temperatur von 52°C bei 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 150 mM NaCl.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die zweite Reaktionsbedingung eine Temperatur von 50°C C bei 25 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 25 mM NaCl.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Auslesen der Markierung des Reporter-Oligonukleotids auf dem Träger. Mit der Anwesenheit der Markierung auf dem Träger wird nachgewiesen, dass die Ziel-Nukleinsäure an ihren beiden Enden ligiert wurde, wobei das erste Ende der Ziel-Nukleinsäure mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids und das zweite Ende der Ziel-Nukleinsäure mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotid ligiert wurde. Da das Reporter-Oligonukleotid nur bei Gegenwart von an ihren beiden Enden ligierter Ziel-Nukleinsäure mit dem Träger verbunden bleibt, wird durch Nachweisen der Markierung des Reporter-Oligonukleotids auf dem Träger die Ziel-Nukleinsäure identifiziert. Der Nachweis der Markierung auf dem Träger kann auch der Quantifizierung der Ziel-Nukleinsäure dienen.
Die Reihenfolge der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens ist nicht festgelegt, das heißt, die einzelnen Schritte können auch in einer anderen Abfolge als in Anspruch 1 angegeben durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgen die Schritte in der Reihenfolge, wie sie in Anspruch 1 angegeben ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei oder mehr Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens miteinander kombiniert. Dadurch kann das Verfahren besonders effizient durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Schritt b) und Schritt d) miteinander kombiniert. Dazu können die für das Ligieren erforderlichen Reagenzien wie beispielsweise Ligase schon in Schritt b) dem Träger zugeführt werden. In einer weiteren Ausführungsform werden Schritt b) und Schritt c) in einem einzigen Schritt durchgeführt.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass die Ziel-Nukleinsäure direkt identifiziert und/oder quantifiziert wird. Insbesondere ist es nicht notwendig, die Ziel-Nukleinsäure chemisch oder enzymatisch zu modifizieren. Da bestimmte Ziel-Nukleinsäuren bevorzugt eine Modifizierung eingehen, kann die Quantifizierung von modifizierten Ziel-Nukleinsäuren zu ungenauen Ergebnissen führen. Diese Ungenauigkeiten werden durch den direkten Nachweis der Ziel-Nukleinsäure vermieden. Ferner werden Artefakte, die beim Modifizieren der Ziel-Nukleinsäure auftreten können, vermieden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist sehr sensitiv, so dass auch geringe Mengen der Ziel-Nukleinsäure nachgewiesen werden können. Dadurch ist es nicht notwendig, die Ziel-Nukleinsäure vor der Identifizierung zu amplifizieren, so dass auch keine falschen Nukleotide in die Ziel-Nukleinsäure eingebaut werden. Dadurch wird die Spezifität des Verfahrens erhöht.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist dadurch, dass beide Enden der Ziel-Nukleinsäure an deren Identifizierung beteiligt sind, eine hohe Selektivität auf.
Durch die zwei Ligationen wird das Reporter-Oligonukleotid über die Ziel-Nukleinsäure und das Fänger-Oligonukleotid kovalent an den Träger gebunden. Damit ist der Nachweis der Markierung des Reporter-Oligonukleotids unabhängig von der Sequenz und der Länge der Oligonukleotide und der Ziel-Nukleinsäure, die zu der Temperaturabhängigkeit der Anlagerung von Reporter-Oligonukleotid, Ziel-Nukleinsäure und Fänger-Oligonukleotid an das Gegenstrang-Oligonukleotid führen. Dadurch kann die Temperatur, bei der die Markierung ausgelesen wird, optimal an die Art der verwendeten Markierung angepasst werden. Dies trägt zu der hohen Sensitivität des Verfahrens bei. Des Weiteren wird durch die stabile kovalente Bindung des Reporter-Oligonukleotids an den Träger ein robustes und quantitativ auswertbares Auslesen der Markierung ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt vor Schritt d) und/oder in Schritt e) und/oder vor Schritt f) zusätzlich ein Waschen des Trägers. Durch das Waschen wird gelöstes Gegenstrang-Oligonukleotid von dem Träger entfernt. Außerdem werden ungebundene Reporter-Oligonukleotide und ungebundene Nukleinsäuren von dem Träger entfernt. Dadurch wird ein Wiederanlagern des Gegenstrang-Oligonukleotids an das Fänger-Oligonukleotid und des Reporter-Oligonukleotids an dieses Gegenstrang-Oligonukleotid während des Auslesen der Markierung vermieden. Dies ermöglicht eine erhöhte Spezifität des Nachweises der Markierung auf dem Träger und damit eine erhöhte Spezifität der Identifizierung der Ziel-Nukleinsäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Waschen des Trägers vor Schritt d) bei einer stringenten Reaktionsbedingung.
Der Begriff „stringente Reaktionsbedingung” bezeichnet eine Reaktionsbedingung, bei der nur vollständig hybridisierte Ziel-Nukleinsäure mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid verbunden bleibt, während sich Ziel-Nukleinsäure-Moleküle, deren Sequenz eine oder mehrere Basen-Mismatches gegenüber der entsprechenden Oligonukleotid-Sequenz des Gegenstrang-Oligonukleotids aufweist, vom Gegenstrang-Oligonukleotid lösen. Durch das Waschen des Trägers bei einer stringenten Reaktionsbedingung vor dem Ligieren wird eine hohe Spezifität des Verfahrens erreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ziel-Nukleinsäure eine RNA, vorzugsweise eine microRNA (miRNA). miRNAs sind nicht kodierende, einzelsträngige RNAs mit einer Länge von etwa 17 bis etwa 25 Nukleotiden, die in der post-transkriptionalen Regulation der Genexpression wirksam sind. MiRNAs lagern sich hochspezifisch an komplementäre Sequenzen von mRNA-Molekülen an und regulieren dadurch die Translation der mRNA in das entsprechende Protein.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Ziel-Nukleinsäure eine einzelsträngige small interfering RNA (siRNA). Ähnlich der miRNAs können auch siRNAs an der post-transkriptionalen Regulation der Genexpression beteiligt sein, indem sie sich spezifisch an komplementäre Sequenzen von mRNA-Molekülen anlagern und die Translation der mRNA in das entsprechende Protein regulieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird für das Ligieren eine T4 DNA Ligase verwendet. T4 DNA Ligase ist ein Enzym, das die ATP-abhängige Ligation eines 3'-Hydroxyl-Endes eines ersten Nukleinsäure-Moleküls an ein unmittelbar anschließend benachbartes 5'-Phosphoryl-Ende eines zweiten Nukleinsäure-Moleküls in doppelsträngigen DNA-, RNA/DNA- oder RNA-Molekülen katalysiert. Dabei wird eine kovalente Phosphodiesterbindung hergestellt.
Gegebenenfalls erfolgt eine Phosphorylierung von einem Ende der Ziel-Nukleinsäure, des Fänger-Oligonukleotids und/oder des Reporter-Oligonukleotids. Der Begriff „Phosphorylierung” bezeichnet das Anhängen eines Phosphatrestes an das 5'-Hydroxyl-Ende von RNA oder DNA. Das Ligieren von zwei unmittelbar anschließend benachbarten Oligonukleotiden bzw. Nukleinsäure-Molekülen erfordert ein 5'-Phosphoryl-Ende an dem zweiten Nukleinsäure-Molekül. Das Vorliegen eines 5'-Phosphoryl-Endes des zweiten Nukleinsäure-Moleküls hängt unter anderem von dessen Synthese ab. Ein fehlendes 5'-Phosphoryl-Ende kann durch die Phosphorylierung angefügt werden, damit das Fänger-Oligonukleotid mit der Ziel-Nukleinsäure und die Ziel-Nukleinsäure mit dem Reporter-Oligonukleotid ligiert werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Phosphorylierung eine enzymatische Phosphorylierung.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Phosphorylierung durch In-Kontaktbringen des zu phosphorylierenden Moleküls mit einer T4 Polynukleotidkinase. T4 Polynukleotidkinase ist ein Enzym, das die Phosphorylierung von 5'-Hydroxyl-Enden von RNA- oder DNA-Molekülen katalysiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Markierung des Reporter-Oligonukleotids ein Enzym.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym eine Esterase, insbesondere eine thermostabile Esterase. Durch die Thermostabilität bleibt die enzymatische Aktivität der Esterase auch bei erhöhten Temperaturen während des Verfahrens erhalten. Somit kann ein Esterase-markiertes Reporter-Oligonukleotid vorteilhaft bereits zu Beginn des Verfahrens mit dem Träger in Kontakt gebracht werden, während das Auslesen der Markierung erst im letzten Schritt des Verfahrens erfolgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Esterase die thermostabile Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius. Die Esterase 2 ist aus einer einzigen Proteinkette aufgebaut und kann somit auf einfache Weise an das Reporter-Oligonukleotid gekoppelt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym kovalent an das Reporter-Oligonukleotid gebunden. Dadurch ist das Enzym stabil mit dem Reporter-Oligonukleotid verbunden und kann sich nicht aufgrund von Waschvorgängen oder den sich ändernden Temperaturen von dem Reporter-Oligonukleotid ablösen. Somit kann eine zuverlässige Identifizierung und Quantifizierung der Ziel-Nukleinsäure sicher gestellt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym über eine Thiolgruppe an eine Amino-Gruppe des Reporter-Oligonukleotids gebunden. Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius kann insbesondere über ein Cystein gerichtet an das Reporter-Oligonukleotid gebunden werden. Durch das gerichtete Binden wird gewährleistet, dass das aktive Zentrum der Esterase 2 für Substrat zugänglich ist. Das gerichtete kovalente Binden der Esterase 2 an ein Oligodesoxynukleotid kann der Fachmann beispielsweise aus Wang et al., Biosensors and Bioelectronics 22, 2007, 1798–1806 entnehmen.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff, der vorzugsweise kovalent an das Reporter-Oligonukleotid gebunden ist. Die Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs ermöglicht ein besonders einfaches und schnelles Auslesen der Markierung. Ferner wird für das Auslesen kein Substrat benötigt, so dass das Verfahren besonders kostengünstig durchgeführt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Markierung elektrochemisch ausgelesen. Bei einem elektrochemischen Auslesen werden an der Markierung, die vorzugweise ein Enzym ist, Substrate zu redoxaktiven Reaktionsprodukten umgesetzt, so dass ein Strom oder eine Änderung der Spannung an einer Elektrode gemessen werden kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Auslesen durch Redoxcycling von p-Aminophenol und Quinonimin.
Dazu ist die Markierung vorzugsweise ein Enzym, welches das Substrat p-Aminophenylbutyrat zu dem redoxaktiv Reaktionsprodukt p-Aminophenol hydrolysiert. Durch Umpolen der Elektrodenpotentiale erfolgt ein Redoxcycling von p-Aminophenol und Quinonimin, bei dem fortwährend Elektronen produziert werden. Dadurch kann an den Elektroden ein Strom gemessen werden. Der Strom zeigt den Nachweis der Enzym-Markierung an und ist außerdem ein Maß für den Umsatz von Substrat zu Reaktionsprodukt an der Enzym-Markierung. Somit kann das elektrochemische Auslesen der Markierung mittels des Messen des Stroms für die Identifizierung und/oder Quantifizierung der Ziel-Nukleinsäure genutzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Auslesen der Markierung auf dem Träger bei einer Auslese-Temperatur. Die Auslese-Temperatur liegt in einem Bereich, in dem das Enzym eine hohe enzymatische Aktivität aufweist. Wird Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius als Markierung verwendet, so liegt die Auslese-Temperatur vorzugsweise bei etwa 30°C.
In einer weiteren Ausführungsform erfolgt das Auslesen der Markierung auf dem Träger optisch. Ein optisches Auslesen der Markierung ist einfach und kostengünstig. Ist die Markierung ein Enzym, so besitzen das Substrat des Enzyms und das durch die Umsetzung erhaltene Reaktionsprodukt vorzugsweise unterschiedliche optische Eigenschaften. Insbesondere weist das Reaktionsprodukt eine andere Lichtabsorption als das Substrat auf. Das Reaktionsprodukt kann dann beispielsweise mittels eines Spektrophotometers nachgewiesen werden. Wenn die Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff ist, kann die Markierung vorzugsweise mittels eines Fluoreszenzphotometers ausgelesen werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Auslesen der Markierung positionsspezifisch. Dadurch können mehrere unterschiedliche Ziel-Nukleinsäuren in einem einzigen Verfahren parallel identifiziert und/oder quantifiziert werden. Dadurch können auch mehrere zu untersuchende Proben mit einem einzigen Verfahren analysiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt vor Schritt d) und/oder e) ein erstes Auslesen der Markierung auf dem Träger und/oder in Schritt f) erfolgt ein zweites Auslesen der Markierung auf dem Träger. Bei dem ersten Auslesen der Markierung wird ein Referenzwert erhalten, während bei dem zweiten Auslesen der Markierung ein Messwert erhalten wird. Der Messwert wird vorzugsweise in Relation zu dem Referenzwert gesetzt. Dadurch können von verschiedenen Trägern gewonnene Daten untereinander verglichen werden. Der Referenzwert kann beispielsweise ein Maß für die Anzahl der Fänger-Oligonukleotide, die auf dem Träger immobilisiert sind, sein. Sind auf einem ersten Träger weniger Fänger-Oligonukleotide immobilisiert als auf einem zweiten Träger, dann ist sowohl der Referenzwert als auch der Messwert des ersten Trägers niedriger. Somit kann eine Kalibierung der einzelnen Träger durchgeführt werden.
Ein Quotient aus dem Messwert und dem Referenzwert bleibt bei unterschiedlicher Anzahl an immobilisierten Fänger-Oligonukleotiden auf unterschiedlichen Trägern näherungsweise konstant. Dadurch können Streuungen von Messwerten, die von verschiedenen Trägern gewonnen werden, eliminiert werden. Somit werden auch eine bessere Reproduzierbarkeit und niedrigere Standardabweichungen für die Werte, die beim Auslesen der Markierung erhalten werden, erreicht.
Weiterhin wird eine Kalibrierung einzelner Positionen auf demselben Träger ermöglicht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgen das erste Auslesen und das zweite Auslesen bei einer gleichen Reaktionsbedingung. Dadurch wird sichergestellt, dass die Enzymaktivität, die von der Reaktionsbedingung, insbesondere von der Temperatur, abhängig ist, bei dem ersten und dem zweiten Auslesen gleich ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, umfassend mindestens einen festen Träger, auf dem mindestens ein Fänger-Oligonukleotid immobilisiert ist, mindestens ein Reporter-Oligonukleotid, das eine Markierung aufweist, mindestens ein Gegenstrang-Oligonukleotid, das Gegenstrang-Oligonukleotid umfassend eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid, eine Oligonukleotid-Sequenz komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure in der Probe, und eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid, um das Fänger-Oligonukleotid und das Reporter-Oligonukleotid jeweils mindestens abschnittsweise und die Ziel-Nukleinsäure mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid zu hybridisieren, so dass ein erstes Ende der Ziel-Nukleinsäure und ein freies Ende des Fänger-Oligonukleotids mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids Basenpaarungen bilden, und ein zweites Ende der Ziel-Nukleinsäure und ein erstes Ende des Reporter-Oligonukleotids mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids Basenpaarungen bilden, wobei die Markierung des Reporter-Oligonukleotids die Anwesenheit der Ziel-Nukleinsäure in der Probe anzeigt, wobei die Ziel-Nukleinsäure eine Länge von 10 bis 30 Nukleotiden aufweist, wobei das Kit weiterhin mindestens eine Nukleinsäure-Ligase zum Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids und zum Ligieren des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids, und ein Enzym zur Phosphorylierung von einem zu ligierenden 5'-Ende der Ziel-Nukleinsäure, des Fänger-Oligonukleotids und/oder des Reporter-Oligonukleotids, falls das zu ligierende 5'-Ende ein 5'-Hydroxyl-Ende ist, umfasst.
Die Probe kann ein Gemisch der Ziel-Nukleinsäure mit anderen Nukleinsäuren und/oder Proteinen sein. Die Probe kann weiter ein aus Zellen gewonnenes Lysat sein. Dabei können die Zellen humane, tierische, pflanzliche oder bakterielle Zellen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Zellen aus einer Biopsie, die einem Patienten entnommen wurde. Hat der Patient eine Erkrankung oder den Verdacht auf eine Erkrankung, bei der die Ziel-Nukleinsäure spezifisch vermehrt oder vermindert auftritt, kann das Kit für den diagnostischen Nachweis der Ziel-Nukleinsäure in der Biopsie verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erkrankung eine Krebserkrankung, insbesondere Brustkrebs, Lungenkrebs oder Leukämie. In einer weiteren Ausführungsform ist die Erkrankung durch eine Störung des Immunsystems verursacht.
Das Kit umfasst mindestens eine Nukleinsäure-Ligase, vorzugsweise eine T4 DNA Ligase, zum Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids, um die Ziel-Nukleinsäure kovalent an das Fänger-Oligonukleotid zu binden, und zum Ligieren des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids, um die Ziel-Nukleinsäure kovalent an das Reporter-Oligonukleotid zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Markierung ein Enzym und das Kit umfasst weiterhin mindestens ein Substrat, das spezifisch für das Enzym ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ziel-Nukleinsäure eine RNA, vorzugsweise eine miRNA.
Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand schematischer Zeichnungen dargestellt.
1 zeigt die Identifizierung einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure (9) mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Ziel-Nukleinsäure (9) ist miR-16. MiR-16 ist eine miRNA, welche in Lymphozyten die Expression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 vermindern kann. Es wird ein Silizium-Chip mit zwei integrierten Goldelektroden als fester Träger (1) verwendet, auf dem ein einzelsträngiges Fänger-Oligonukleotid (5) über einen Spacer (3) immobilisiert ist. Zunächst wird eine erste Temperatur von 42°C eingestellt, bei der ein Gegenstrang-Oligonukleotid (7), die miR-16 und ein einzelsträngiges Reporter-Oligonukleotid (11) mit dem Träger (1) in Kontakt gebracht werden. Das Reporter-Oligonukleotid (11) weist als Markierung (13) eine thermostabile Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius auf, die kovalent an das Reporter-Oligonukleotid (11) gebunden ist. Das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) umfasst drei Oligonukleotid-Sequenzen, die so angeordnet sind, dass sie unmittelbar aneinander grenzen. Eine Oligonukleotid-Sequenz ist vollständig komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid (5). Daran schließt sich eine Oligonukleotid-Sequenz an, die vollständig komplementär zu der miRNA ist. Darauf folgt eine Oligonukleotid-Sequenz, die vollständig komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid (11) ist. Der Träger (1) wird für 20 min bei 42°C inkubiert, so dass das Fänger-Oligonukleotid (5), die miR-16 und das Reporter-Oligonukleotid (11) mit den jeweils dazu komplementären Abschnitten des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) vollständig hybridisieren. Wie in 1 dargestellt, führt die Anordnung der Oligonukleotid-Sequenzen auf dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) dazu, dass ein unteres Ende der miR-16 und ein freies oberes Ende des Fänger-Oligonukleotids (5) sowie ein oberes Ende der miR-16 und ein unteres Ende des Reporter-Oligonukleotids (11) jeweils mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) hybridisieren. In einem nächsten Schritt wird eine T4 DNA Ligase mit dem Träger (1) in Kontakt gebracht, welche in einer ersten Ligation (15) die benachbarten Enden des Fänger-Oligonukleotids (5) und der miR-16 und in einer zweiten Ligation (17) die benachbarten Enden der miR-16 und des Reporter-Oligonukleotids (11) miteinander ligiert. Dadurch wird die miR-16 am unteren Ende kovalent an das Fänger-Oligonukleotid (5) und am oberen Ende kovalent an das Reporter-Oligonukleotid (11) gebunden. Der Träger (1) wird anschließend bei einer zweiten Temperatur von 52°C für 10 min inkubiert. Dadurch wird die Basenpaarung des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) mit dem Fänger-Oligonukleotid (5), der miRNA und dem Reporter-Oligonukleotid (11) aufgeschmolzen, so dass sich das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) löst. Der Träger (1) wird bei 52°C mit einer salzhaltigen Pufferlösung gewaschen, um das gelöste Gegenstrang-Oligonukleotid (7) zu entfernen. Anschließend wird der Träger (1) auf eine Auslese-Temperatur von 30°C gebracht, bei der die Esterase 2 auf dem Träger (1) ausgewertet wird. Dieses Auslesen wird elektrochemisch durchgeführt. Dazu wird der Träger (1) mit einem Substrat (19) der Esterase 2 p-Aminophenylbutyrat in Kontakt gebracht. Die Esterase 2 setzt das p-Aminophenylbutyrat zu einem Reaktionsprodukt (21) p-Aminophenol um, welches redoxaktiv ist. Durch Redoxcycling von p-Aminophenol und Quinonimin wird Strom erzeugt, der an der Goldelektrode gemessen wird. Die Messung des Stroms dient als Nachweis der Esterase 2 auf dem Träger (1) und zeigt die Gegenwart der miR-16 an.
2 und 3 zeigen das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer Nukleinsäure (23, 25), deren Sequenz nicht oder nur abschnittsweise mit der Sequenz der zu identifizierenden miR-16 überein stimmt (2 bzw. 3). Eine solche Nukleinsäure (23, 25) wird als Negativkontrolle zur Verifizierung des erfindungsgemäße Verfahrens eingesetzt. 2 zeigt, dass eine Nukleinsäure (23), deren Sequenz nicht mit der Sequenz der miR-16 überein stimmt, bei der Inkubation des Trägers (1) bei 42°C nicht mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) hybridisiert. Daher kann die T4 DNA Ligase die Enden des Fänger-Oligonukleotids (5) und des Reporter-Oligonukleotids (11) nicht mit den Enden der Nukleinsäure (23) ligieren. Während der Inkubation und des Waschens des Trägers (1) bei 52°C löst sich das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) von dem Fänger-Oligonukleotid (5) und dem Reporter-Oligonukleotid (11). Aufgrund der fehlenden kovalenten Bindung des Reporter-Oligonukleotids (11) über die Ziel-Nukleinsäure (9) und das Fänger-Oligonukleotid (5) an den Träger (1), wird das Reporter-Oligonukleotid (11) von dem Träger (1) entfernt, sodass keine Esterase 2 auf dem Träger (1) verbleibt. Folglich wird beim Auslesen der Esterase 2 kein Strom gemessen.
3 zeigt, dass eine Nukleinsäure (25), deren Sequenz abschnittsweise mit der Sequenz der miR-16 überein stimmt, bei der Inkubation des Trägers (1) bei 42°C in dem mit der Sequenz der miRNA übereinstimmenden Abschnitt, aber nicht vollständig, mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) hybridisiert. Das erste Ende der Nukleinsäure (25) und das freie Ende des Fänger-Oligonukleotids (5) hybridisieren mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids (7), sodass im nächsten Schritt die T4 DNA Ligase die benachbarten Enden des Fänger-Oligonukleotids (5) und der Nukleinsäure (25) miteinander ligiert. Damit wird die Nukleinsäure (25) kovalent an das Fänger-Oligonukleotid (5) gebunden. Das zweite Ende der Nukleinsäure (25) hybridisiert aufgrund der fehlenden Komplementarität nicht mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7), sodass die T4 DNA Ligase das zweite Ende der Nukleinsäure (25) nicht mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids (11) ligiert. Während der Inkubation und des Waschens des Trägers (1) bei 52°C löst sich das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) von dem Fänger-Oligonukleotid (5), der Nukleinsäure (25) und dem Reporter-Oligonukleotid (11). Aufgrund der fehlenden kovalenten Bindung des Reporter-Oligonukleotids (11) an die Nukleinsäure (25) wird auch das Reporter-Oligonukleotid (11) von dem Träger (1) entfernt, sodass keine Esterase 2 auf dem Träger (1) verbleibt. Folglich wird beim Auslesen der Esterase 2 kein Strom gemessen.
4 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassend eine Kalibrierung des Trägers (1). Dazu wird nach dem Ligieren der jeweils benachbarten Enden des Fänger-Oligonukleotids (5), der miR-16 und des Reporter-Oligonukleotids (11) die Auslese-Temperatur von 30°C eingestellt und es wird die Esterase 2 auf dem Träger (1) ein erstes Mal ausgewertet. Dabei wird ein Referenzwert erhalten. Anschließend wird der Träger (1) bei 52°C inkubiert, bei der sich das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) von dem Fänger-Oligonukleotid (5), der miR-16 und dem Reporter-Oligonukleotid (11) trennt. Es wird erneut eine Temperatur von 30°C eingestellt und die Esterase 2 auf dem Träger (1) wird ein zweites Mal ausgewertet. Dabei wird ein Messwert erhalten. Der Messwert wird in Relation zu dem Referenzwert gesetzt, so dass die von verschiedenen Trägern gewonnenen Daten untereinander verglichen werden können.

Claims

Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure (9), umfassend die Schritte a) Bereitstellen mindestens eines festen Trägers (1), auf dem mindestens ein Fänger-Oligonukleotid (5) immobilisiert ist; b) In-Kontaktbringen des Trägers (1) bei einer ersten Reaktionsbedingung mit mindestens einem Gegenstrang-Oligonukleotid (7), mindestens einer einzelsträngigen Ziel-Nukleinsäure (9) und mindestens einem Reporter-Oligonukleotid (11), das eine Markierung (13) aufweist, das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) umfassend eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid (5), eine Oligonukleotid-Sequenz komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure (9) und eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid (11), um das Fänger-Oligonukleotid (5) und das Reporter-Oligonukleotid (11) jeweils mindestens abschnittsweise und die Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) zu hybridisieren, so dass ein erstes Ende der Ziel-Nukleinsäure (9) und ein freies Ende des Fänger-Oligonukleotids (5) mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) Basenpaarungen bilden, und ein zweites Ende der Ziel-Nukleinsäure (9) und ein erstes Ende des Reporter-Oligonukleotids (11) mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) Basenpaarungen bilden; c) Inkubieren des Trägers (1) bei der ersten Reaktionsbedingung; d) Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids (5), um die Ziel-Nukleinsäure (9) kovalent an das Fänger-Oligonukleotid (5) zu binden, und Ligieren des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids (11), um die Ziel-Nukleinsäure (9) kovalent an das Reporter-Oligonukleotid (11) zu binden; e) Inkubieren des Trägers (1) bei einer zweiten Reaktionsbedingung derart, dass das Reporter-Oligonukleotid (11) nur bei Gegenwart von an ihren beiden Enden ligierter Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem Träger (1) verbunden bleibt; f) Auslesen der Markierung (13) des Reporter-Oligonukleotids (11) auf dem Träger (1), wobei die Ziel-Nukleinsäure (9) eine Länge von 10 bis 30 Nukleotiden aufweist, und wobei vor dem Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids (5) und des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids (11) eine Phosphorylierung von einem zu ligierenden 5'-Ende der Ziel-Nukleinsäure (9), des Fänger-Oligonukleotids (5) und/oder des Reporter-Oligonukleotids (11) erfolgt, falls das zu ligierende 5'-Ende ein 5'-Hydroxyl-Ende ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt d) und/oder in Schritt e) und/oder vor Schritt f) zusätzlich ein Waschen des Trägers (1) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Waschen des Trägers (1) vor Schritt d) bei einer stringenten Reaktionsbedingung erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ziel-Nukleinsäure (9) eine RNA, vorzugsweise eine microRNA, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung (13) ein Enzym, vorzugsweise eine Esterase, insbesondere eine thermostabile Esterase, ist, die an das Reporter-Oligonukleotid (11) gebunden, vorzugsweise kovalent gebunden, ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Auslesen der Markierung (13) elektrochemisch, vorzugsweise durch Redoxcycling von p-Aminophenol und Quinonimin, erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt d) und/oder e) ein erstes Auslesen der Markierung (13) auf dem Träger (1) erfolgt und/oder in Schritt f) ein zweites Auslesen der Markierung (13) auf dem Träger (1) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Auslesen und das zweite Auslesen bei einer gleichen Reaktionsbedingung erfolgen.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend mindestens einen festen Träger (1), auf dem mindestens ein Fänger-Oligonukleotid (5) immobilisiert ist; mindestens ein Reporter-Oligonukleotid (11), das eine Markierung (13) aufweist; mindestens ein Gegenstrang-Oligonukleotid (7), das Gegenstrang-Oligonukleotid (7) umfassend eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Fänger-Oligonukleotid (5), eine Oligonukleotid-Sequenz komplementär zu der Ziel-Nukleinsäure (9) in der Probe, und eine Oligonukleotid-Sequenz mindestens abschnittsweise komplementär zu dem Reporter-Oligonukleotid (11), um das Fänger-Oligonukleotid (5) und das Reporter-Oligonukleotid (11) jeweils mindestens abschnittsweise und die Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem Gegenstrang-Oligonukleotid (7) zu hybridisieren, so dass ein erstes Ende der Ziel-Nukleinsäure (9) und ein freies Ende des Fänger-Oligonukleotids (5) mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) Basenpaarungen bilden, und ein zweites Ende der Ziel-Nukleinsäure (9) und ein erstes Ende des Reporter-Oligonukleotids (11) mit benachbarten Nukleotiden des Gegenstrang-Oligonukleotids (7) Basenpaarungen bilden; wobei die Markierung (13) des Reporter-Oligonukleotids (11) die Anwesenheit der Ziel-Nukleinsäure (9) in der Probe anzeigt, wobei die Ziel-Nukleinsäure (9) eine Länge von 10 bis 30 Nukleotiden aufweist, wobei das Kit weiterhin mindestens eine Nukleinsäure-Ligase zum Ligieren des ersten Endes der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem freien Ende des Fänger-Oligonukleotids (5) und zum Ligieren des zweiten Endes der Ziel-Nukleinsäure (9) mit dem ersten Ende des Reporter-Oligonukleotids (11), und ein Enzym zur Phosphorylierung von einem zu ligierenden 5'-Ende der Ziel-Nukleinsäure (9), des Fänger-Oligonukleotids (5) und/oder des Reporter-Oligonukleotids (11), falls das zu ligierende 5'-Ende ein 5'-Hydroxyl-Ende ist, umfasst.