DE102006014879B4 - RNA-Markierungsverfahren - Google Patents

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Abstract

Verfahren zum Markieren von RNA (102, 202) in einer Probe, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
Kontaktieren der Probe mit einem Enzym (114, 214), das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, bei Vorhandensein eines markierten Substrats (110A, 110B, 110C, 210A, 210B) unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zu einer Kopplung des markierten Substrats mit der RNA in der Probe zu führen, um markierte RNA (118A, 118B, 118C, 218A, 218B) zu liefern, wobei die Bedingungen eine DMSO-Konzentration in dem Bereich von 20% bis 30% umfassen, wobei das markierte Substrat eine beobachtbare Markierungskomponente aufweist, die an eine Nukleotidkomponente angelagert ist, und wobei das Verfahren ferner vor dem Kontaktieren ein Erhitzen der Probe auf zumindest 80°C unter Bedingungen aufweist, die zumindest 40% DMSO umfassen.

Description

  • Die Erfindung bezieht sich allgemein auf Verfahren zur biochemischen Analyse. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Bereitstellen eines Verfahrens zum Anlagern einer beobachtbaren Markierung an RNA.
  • Einfache und zuverlässige Verfahren zum gleichzeitigen Analysieren mehrerer Bestandteile einer komplexen Probe sind äußerst erwünscht. Polynukleotidarrays (wie zum Beispiel DNA- oder RNA-Arrays) sind bekannt und werden zum Beispiel als Diagnose- oder Untersuchungswerkzeuge verwendet. Derartige Arrays umfassen Regionen von normalerweise Polynukleotiden unterschiedlicher Sequenz („Fangmittel – capture agents), die in einer vorbestimmten Konfiguration auf einem Träger angeordnet sind. Die Arrays sind dahingehend „adressierbar”, dass diese Regionen (bisweilen als „Arraymerkmale” bezeichnet) unterschiedliche vorbestimmte Orte („Adressen”) auf dem Arrayträger aufweisen. Die Polynukleotidarrays sind normalerweise auf planaren Trägern hergestellt, entweder durch ein Aufbringen von vorhergehend erhaltenen Polynukleotiden auf den Träger auf eine stellenspezifische Weise oder durch eine stellenspezifische Synthese der Polynukleotide in situ auf dem Träger. Nach dem Aufbringen der Polynukleotidfangmittel auf den Träger wird der Träger normalerweise bearbeitet (zum Beispiel gewaschen und blockweise gruppiert) und vor einer Verwendung gelagert.
  • Bei der Verwendung wird ein Array mit einer Probe oder einer markierten Probe, die Analyten (normalerweise, aber nicht unbedingt andere Polynukleotide) enthält, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die ein spezifisches Binden der Analyten in der Probe an eines oder mehr der Fangmittel, die sich auf dem Array befinden, fördern. Somit durchlaufen die Arrays, wenn sie einer Probe ausgesetzt werden, eine Bindereaktion mit der Probe und weisen ein beobachtetes Bindemuster auf. Dieses Bindemuster kann bei einem Abfragen des Arrays erfasst werden. Zum Beispiel können alle Zielpolynukleotide (zum Beispiel DNA) in der Probe mit einer geeigneten Markierung (zum Beispiel einer Fluoreszenzverbindung) markiert sein, und die Markierung kann dann auf dem Array nach dem Aussetzen des Arrays gegenüber der Probe genau beobachtet werden (zum Beispiel durch ein Beobachten des Fluoreszenzmusters). Wird angenommen, dass die Polynukleotide unterschiedlicher Sequenz gemäß der vorbestimmten Konfiguration richtig aufgebracht wurden, dann zeigt das beobachtete Bindungsmuster das Vorhandensein und/oder die Konzentration von ein oder mehr Bestandteilen der Probe an. Techniken zum Abtasten von Arrays sind zum Beispiel in dem US-Patent 5,763,870 A und dem US-Patent 5,945,679 A beschrieben. Weitere Techniken, die zum Beobachten eines Arrays nützlich sind, sind in dem US-Patent 5,721,435 A beschrieben.
  • Seit der Entdeckung der biologischen Aktivität von siRNA vor über einem Jahrzehnt besteht großes Interesse an der Analyse von kleinen RNAs, wie zum Beispiel kurzen interferierenden RNAs (si-RNAs), Mikro-RNAs (miRNA), kleinen nicht-codierenden RNAs (tncRNA) und kleiner regulierender RNA (smRNA). Siehe Novina et al., Nature 430: 161–164 (2004). Obwohl die Funktionen der meisten entdeckten miRNAs ein Geheimnis bleiben, ist klar geworden, dass dieselben im Überfluss in Pflanzen und Tieren existieren, mit bis zu Zehntausenden von Kopien pro Zelle. Bei der Fruchtfliege sind 78 identifiziert worden, und über 200 sind beim Menschen identifiziert worden (siehe die öffentliche Datenbank, die über die Webseite zugänglich ist, die sich an folgender Adresse befindet: >>http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/Rfam/mirna/browse.pl<<). Die Pegel von einzelnen miRNAs scheinen mit Entwicklungsstadien und Gewebetypen zu variieren. Der Schwankungsgrad kann für ein besseres biologisches Verständnis mit Phänotyp, mRNA-Pegeln oder Proteinpegeln korreliert werden. Somit können quantitative miRNA-Messungen von großer Bedeutung sein. Ferner sind virale miRNAs identifiziert worden und können eine Rolle bei der Latenz spielen (siehe Pfeffer et al., Science, 304: 734–736 (2004)), was die Erfassung und quantitative Bestimmung von miRNAs zu einem potentiell wertvollen Diagnosewerkzeug macht.
  • Analytische Verfahren, die Polynukleotidarrays verwenden, werden zum Untersuchen dieser kleinen RNAs verwendet, zum Beispiel sind miRNAs zu einem Untersuchungsobjekt bei der Mikroarrayanalyse geworden. Siehe zum Beispiel Liu et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 101: 9740–9744 (2004); Thomson et al., Nature Methods, 1: 1–7 (2004); und Babak et al., RNA, 10: 1813–1819 (2004). Verfahren zum Markieren von RNAs sind von Interesse zur Verwendung bei der Arrayanalyse von RNA, um eine beobachtbare Markierung zu liefern, die beim Abfragen des Arrays verwendet wird. In der Studie von Liu et al. wurde die miRNA mit einem biotinmarkierten Primer zu DNA transkribiert. Dieser Primer wurde nachfolgend mit einem Streptavidin-verknüpften Alexa-Farbstoff vor einer Arrayhybridisierung markiert. Dieses Verfahren ist anfällig gegenüber jeglicher Reverse-Transkriptase-Reaktionsverzerrung. Ferner kann es schwierig sein, den Streptavidin-Farbstoff und die Streptavidin-Biotin-RNA-Stöchiometrie quantitativ zu bestimmen. In der Studie von Thomson et al. wurde die miRNA direkt mit 5'-Phosphat-Cytidyl-Uridyl-Cy3-3' unter Verwendung von T4-RNA-Ligase markiert. Diese Reaktion ist gegenüber der Akzeptorsequenz empfindlich. Siehe England et al., Biochemistry, 17: 2069–2776 (1978). In der Studie von Babak et al. (4) wurde die miRNA mit einem Ulysis-Alexa-Fluor-System markiert, das mit einem Guaninrest (G) der RNA reagiert. Da unterschiedliche miRNAs keinen einheitlichen G-Gehalt aufweisen, ist dieses Verfahren nicht quantitativ.
  • Somit besteht ein fortgesetzter Bedarf an Verfahren zum Markieren von RNA mit einer beobachtbaren Markierung. Derartige Verfahren können zusammen mit analytischen Verfahren verwendet werden, die auf einem Beobachten der Markierung basieren, wie zum Beispiel einer arraybasierten Analyse von Polynukleotiden.
  • Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Markieren von RNA in einer Probe und ein Verfahren zum Durchführen einer Arrayanalyse mit verbesserten Charakteristika zu schaffen.
  • Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie ein Verfahren gemäß Anspruch 21 gelöst.
  • Die Erfindung bezieht sich somit auf neuartige Verfahren zum Markieren von RNA in einer Probe. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen liefert die Erfindung Verfahren, bei denen eine Probe, die RNA enthält, mit einem Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, bei Vorhandensein eines markierten Substrats in Kontakt gebracht wird. Dies erfolgt unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zu einem Koppeln des markierten Substrats mit der RNA in der Probe zu führen, um markierte RNA zu liefern, wobei die Bedingungen eine DMSO-Konzentration in dem Bereich von etwa 20% bis etwa 30% umfassen. Das markierte Substrat umfasst eine beobachtbare Markierungskomponente, die an eine Nukleotidkomponente angelagert ist.
  • Verfahren zum Durchführen einer Arrayanalyse einer RNA-Probe werden hier ebenfalls gelehrt. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen liefert die Erfindung ein Verfahren zum Durchführen einer Arrayanalyse, wobei das Verfahren ein Markieren der RNA in der Probe umfasst, um markierte RNA zu liefern. Die markierte RNA wird dann unter Bedingungen, die ausreichen, um eine spezifische Bindung von markierter RNA an das Array zu liefern, mit einem Array in Kontakt gebracht. Das Array wird dann normalerweise abgefragt, um Daten bezüglich der Bindung von RNA in der Probe an das Array zu liefern.
  • Zusätzliche Aufgaben, Vorteile und neuartige Merkmale dieser Erfindung werden teilweise in den folgenden Beschreibungen und Beispielen dargelegt und werden teilweise für Fachleute bei der Durchsicht der folgenden Beschreibungen ersichtlich oder können durch das Praktizieren der Erfindung erkannt werden. Die Aufgaben und Vorteile der Erfindung können mittels der Instrumente, Kombinationen, Zusammensetzungen und Verfahren, auf die in den angehängten Ansprüchen besonders hingewiesen wird, realisiert und erreicht werden.
  • Diese und andere Merkmale der Erfindung werden aus der Beschreibung von repräsentativen Ausführungsbeispielen des Verfahrens und der Offenbarung einer veranschaulichenden Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens zusammen mit den Figuren verstanden. Es zeigen:
  • 1 Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung im Schema; und
  • 2 andere Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung im Schema.
  • Um ein Verständnis zu erleichtern, wurden identische Bezugszeichen verwendet, wo es praktisch war, um entsprechende Elemente zu bezeichnen, die den Figuren gemeinsam sind. Figurbestandteile sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet.
  • Bevor die Erfindung im Detail beschrieben wird, sei darauf hingewiesen, dass diese Erfindung nicht auf bestimmte Materialien, Reagenzien, Reaktionsmaterialien, Herstellungsprozesse oder dergleichen beschränkt ist, es sei denn, dies ist anders angegeben, da dieselben variieren können. Es sei auch darauf hingewiesen, dass die hier verwendete Terminologie nur zu Zwecken eines Beschreibens bestimmter Ausführungsbeispiel dient und nicht einschränkend sein soll. Es ist bei der vorliegenden Erfindung auch möglich, dass Schritte in einer anderen Reihenfolge ausgeführt werden können, wo dies logisch möglich ist. Die im Folgenden beschriebene Reihenfolge wird jedoch bevorzugt.
  • Es muss darauf hingewiesen werden, dass, wie dieselben in der Beschreibung und den angehängten Ansprüchen verwendet werden, die Singularformen „ein/eine/einer” und „der/die/das” Pluralbezüge umfassen, es sei denn, der Kontext gibt dies klar anders vor. Somit umfasst zum Beispiel eine Bezugnahme auf „einen unlöslichen Träger” eine Mehrzahl von unlöslichen Trägern. Auf ähnliche Weise umfasst eine Bezugnahme auf „eine RNA” eine Mehrzahl von RNA-Spezies unterschiedlicher Identität (Sequenz).
  • Außerdem sei darauf hingewiesen, dass, wo ein Wertebereich bereitgestellt ist, jeder dazwischenliegende Wert zwischen dem oberen und dem unteren Grenzwert dieses Bereichs und jeder andere angegebene oder dazwischenliegende Wert in diesem angegebenen Bereich in der Erfindung enthalten ist. Auch sei darauf hingewiesen, dass ein beliebiges optionales Merkmal der beschriebenen erfindungsgemäßen Variationen unabhängig oder in Kombination mit ein oder mehr beliebigen der hier beschriebenen Merkmale dargelegt und beansprucht werden kann. Es sei ferner darauf hingewiesen, dass die Ansprüche abgefasst sein können, um ein beliebiges optionales Element auszuschließen. Somit soll diese Aussage als eine vorausgehende Basis zur Verwendung solcher exklusiver Terminologie wie „nur”, „lediglich” und dergleichen in Verbindung mit der Anführung von Anspruchselementen oder zur Verwendung einer „negativen” Einschränkung dienen. In dieser Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen wird Bezug genommen auf eine Anzahl von Termini, die definiert werden, um die folgenden Bedeutungen zu haben, es sei denn, eine entgegengesetzte Absicht ist offensichtlich.
  • „Optional” bedeutet, dass der im Folgenden beschriebene Umstand erfolgen kann oder nicht, so dass die Beschreibung Fälle, wo der Umstand auftritt, und Fälle, wo dies nicht der Fall ist, umfasst. Falls zum Beispiel ein Schritt eines Prozesses optional ist, bedeutet dies, dass der Schritt durchgeführt werden kann oder nicht, und somit umfasst die Beschreibung Ausführungsbeispiele, bei denen der Schritt durchgeführt wird, und Ausführungsbeispiele, bei denen der Schritt nicht durchgeführt wird (d. h. auf denselben wird verzichtet.
  • Ein „Oligonukleotid” ist ein Molekül, das 2 bis etwa 100 Nukleotiduntereinheiten enthält. Die Begriffe „Nukleinsäure” und „Polynukleotid” werden hier untereinander austauschbar verwendet, um ein Polymer beliebiger Länge zu beschreiben, das aus Nukleotiden, zum Beispiel Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden, oder synthetisch erzeugten Verbindungen (zum Beispiel PNA, wie es in dem US-Patent Nr. 5,948,902 und den dort angeführten Dokumenten beschriebe ist) gebildet ist, das mit natürlich auftretenden Nukleinsäuren in einer sequenzspezifischen Weise hybridisieren kann, die analog zu derjenigen von zwei natürlich auftretenden Nukleinsäuren ist, das zum Beispiel an Watson-Crick-Basenpaarungswechselwirkungen teilnehmen kann. Die Begriffe „Nukleosid” und „Nukleotid” sollen die Komponenten umfassen, die nicht nur die bekannten Purin- und Pyrimidin-Basen enthalten, sondern auch andere heterozyklische Basen, die modifiziert worden sind. Derartige Modifizierungen umfassen methylierte Purine oder Pyrimidine, azylierte Purine oder Pyrimidine, alkylierte Ribosen oder andere Heterozyklen. Außerdem umfassen die Begriffe „Nukleosid” und „Nukleotid” die Komponenten, die nicht nur herkömmliche Ribose- und Desoxyribosezucker, sondern auch andere Zucker enthalten. Modifizierte Nukleoside oder Nukleotide umfassen auch Modifizierungen bei der Zuckerkomponente, wobei zum Beispiel eine oder mehr der Hydroxylgruppen durch Halogenatome oder aliphatische Gruppen ersetzt sind oder als Ether, Amine oder dergleichen funktionalisiert sind. „Analoge” bezieht sich auf Moleküle, die Strukturmerkmale aufweisen, die in der Literatur als Nachahmungen, Ableitungen, analoge Strukturen aufweisend oder andere derartige Begriffe anerkannt sind und zum Beispiel Polynukleotide, die nicht natürliche (normalerweise nicht in der Natur vorkommende) Nukleotide umfassen, nicht natürliche Nukleotidnachahmungen, wie zum Beispiel 2'-modifizierte Nukleoside, Peptidnukleinsäuren, oligomere Nukleosidphosphonate und jedes Polynukleotid umfassen, das hinzugefügte Substituentengruppen aufweist, wie zum Beispiel Schutzgruppen oder Verknüpfungskomponenten.
  • „Komponente” und „Gruppe” werden verwendet, um sich auf einen Teil eines Moleküls zu beziehen, der normalerweise ein bestimmtes Funktions- oder Strukturmerkmal aufweist, wie zum Beispiel eine Verknüpfungsgruppe (ein Teil eines Moleküls, der zwei andere Teile des Moleküls verbindet) oder eine Ethylkomponente (ein Teil eines Moleküls mit einer Struktur, die eng mit Ethan verwandt ist). Eine Komponente ist allgemein an eine oder mehr andere Komponenten gebunden, um eine molekulare Entität zu liefern. Als ein einfaches Beispiel liefert eine Hydroxylkomponente, die an eine Ethylkomponente gebunden ist, ein Ethanolmolekül. An mehreren Stellen kann sich der Text mit dem Namen der am engsten verwandten Struktur auf eine Komponente beziehen (zum Beispiel kann auf eine Oligonukleotidkomponente als ein Oligonukleotid Bezug genommen werden, auf eine Mononukleotidkomponente kann als ein Mononukleotid Bezug genommen werden). Trotz dieser scheinbaren Formlosigkeit der Terminologie wird die richtige Bedeutung Fachleuten bei gegebenem Kontext klar sein, zum Beispiel wird, falls bei dem Begriff, auf den Bezug genommen wird, ein Teil seiner Struktur durch eine andere Gruppe ersetzt wird, dann normalerweise verstanden, dass der Begriff, auf den Bezug genommen wird, die Komponente ist. Zum Beispiel ist eine Mononukleotidkomponente ein einzelnes Nukleotid, bei dem ein Teil seiner Struktur (zum Beispiel ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder eine andere Gruppe) durch eine andere Komponente (zum Beispiel eine Verknüpfungsgruppe, eine beobachtbare Markierungskomponente oder eine andere Gruppe) ersetzt wird. Auf ähnliche Weise ist eine Oligonukleotidkomponente ein Oligonukleotid, bei dem ein Teil seiner Struktur (zum Beispiel ein Wasserstoffatom, eine Hydroxylgruppe oder einer andere Gruppe) durch eine andere Komponente (zum Beispiel eine Verknüpfungsgruppe, eine beobachtbare Markierungskomponente oder eine andere Gruppe) ersetzt wird. „Nukleotidkomponente” ist allgemein für sowohl eine Mononukleotidkomponente als auch eine Oligonukleotidkomponente.
  • „Verknüpfung”, wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf eine erste Komponente, die mit zwei anderen Komponenten verbunden ist, wobei die zwei anderen Komponenten über die erste Komponente verknüpft sind. Typische Verknüpfungen umfassen ether (-O-), oxo (-C(O)-), amino (-NH-), amido (-N-C(O)-), thio (-S-), phospho (-P-), ester (-O-C(O)-).
  • ”Gebunden” kann hier verwendet werden, um eine direkte oder indirekte Anlagerung anzuzeigen. Im Zusammenhang mit chemischen Strukturen kann sich „gebunden” (oder „verbunden”) auf die Existenz einer chemischen Bindung beziehen, die zwei Komponenten direkt verbindet oder zwei Komponenten indirekt verbindet (zum Beispiel über eine Verknüpfungsgruppe oder einen anderen dazwischenliegenden Teil des Moleküls). Bei der chemischen Bindung kann es sich um eine kovalente Bindung, eine Ionenbindung, einen Koordinationskomplex, eine Wasserstoffbindung, van-der-Waals-Wechselwirkungen oder eine hydrophobe Stapelung handeln, oder dieselbe kann Charakteristika von mehreren Typen von chemischen Bindungen aufweisen. Bei bestimmten Fällen umfasst „gebunden” Ausführungsbeispiele, bei denen die Anlagerung direkt ist, und auch Ausführungsbeispiele, bei denen die Anlagerung indirekt ist. „Frei”, wie es im Zusammenhang mit einer Komponente verwendet wird, die frei ist, zeigt an, dass die Komponente verfügbar ist, um mit anderen Bestandteilen der Lösung, von der die Komponente ein Teil ist, zu reagieren oder durch dieselben kontaktiert zu werden.
  • „Isoliert” oder „gereinigt” bezieht sich allgemein auf eine Isolierung einer Substanz (Verbindung, Polynukleotid, Protein, Polypeptid, Polypeptid, Chromosom usw.) derart, dass die Substanz einen wesentlichen Teil der Probe bildet, in der sich dieselbe befindet (ausschließlich Lösungsmittel), d. h. mehr als die Substanz normalerweise in ihrem natürlichen oder nicht isolierten Zustand zu finden ist. Normalerweise umfasst ein wesentlicher Teil der Probe zumindest etwa 5%, zumindest etwa 10%, zumindest etwa 20%, zumindest etwa 30%, zumindest etwa 50%, bevorzugt zumindest etwa 80% oder bevorzugter zumindest etwa 90% der Probe (ausschließlich Lösungsmittel). Zum Beispiel weist eine Probe von isolierter RNA normalerweise zumindest etwa 5% RNA insgesamt auf, wobei Prozent in diesem Zusammenhang als Masse (zum Beispiel in Mikrogramm) der Gesamt-RNA in der Probe geteilt durch Masse (zum Beispiel in Mikrogramm) der Summe (Gesamt-RNA + andere Bestandteile in der Probe (ausschließlich Lösungsmittel)) berechnet wird. Techniken zum Reinigen von interessierenden Polynukleotiden und Polypeptiden sind in der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel Gelelektrophorese, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Flusssortieren und Sedimentation nach Dichte. Bei typischen Ausführungsbeispielen befinden sich eines oder mehr der Probe, des Enzyms, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, und des markierten Substrats in isolierter Form; typischer ist es, dass alle drei vor der Verwendung bei den vorliegenden Verfahren in isolierter Form erhalten werden.
  • Der Begriff „Probe”, wie derselbe hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Material oder eine Mischung von Materialien, normalerweise, jedoch nicht unbedingt, in Fluidform, das bzw. die eine oder mehr interessierende Bestandteile aufweist.
  • Der Begriff „Analyt” wird hier verwendet, um sich auf einen bekannten oder unbekannten Bestandteil einer Probe zu beziehen. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen der Erfindung kann sich ein Analyt spezifisch an ein Fangmittel auf einer Trägeroberfläche binden, falls der Analyt und das Fangmittel Elemente eines spezifischen Bindungspaars sind. Allgemein sind Analyte normalerweise RNA oder andere Polynukleotide. Normalerweise wird als ein „Analyt” eine Spezies in einer mobilen Phase (zum Beispiel ein Fluid) bezeichnet, die durch ein „Fangmittel” erfasst werden soll, das bei einigen Ausführungsbeispielen an einen Träger gebunden ist oder sich bei anderen Ausführungsbeispielen in Lösung befindet. Jedes des „Analyten” oder des „Fangmittels” kann jedoch dasjenige sein, das durch das andere ausgewertet werden soll (somit könnte es sich bei jedem um eine unbekannte Mischung von Bestandteilen einer Probe, zum Beispiel Polynukleotide, handeln, die durch ein Binden mit dem anderen ausgewertet werden soll). Ein „Ziel” verweist auf einen Analyten.
  • Der Begriff „Fangmittel” bezieht sich auf ein Mittel, das einen Analyten durch eine Wechselwirkung bindet, die ausreichend ist, um zu ermöglichen, dass das Mittel den Analyten aus einer homogenen Mischung von unterschiedlichen Analyten bindet und konzentriert. Die Bindungswechselwirkung kann über eine Affinitätsregion des Fangmittels laufen. Repräsentative Fangmittel umfassen Polypeptide und Polynukleotide, es können zum Beispiel Antikörper, Peptide oder Fragmente von Doppelstrang- oder Einzelstrang-DNA oder RNA verwendet werden. Fangmittel binden normalerweise „spezifisch” einen oder mehr Analyten.
  • Der Begriff „spezifisches Binden” bezieht sich auf die Fähigkeit eines Fangmittels, sich bevorzugt an einen bestimmten Analyten zu binden, der in einer homogenen Mischung aus unterschiedlichen Analyten vorhanden ist. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen unterscheidet eine spezifische Bindungswechselwirkung zwischen erwünschten und unerwünschten Analyten in einer Probe, bei einigen Ausführungsbeispielen mehr als etwa 10–100fach oder mehr (zum Beispiel mehr als etwa 1000- oder 10.000fach). Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist die Bindungskonstante eines Fangmittels und eines Analyten größer als 106 M–1, größer als 107 M–1, größer als 108 M–1, größer als 109 M–1, größer als 1010 M–1, normalerweise bis zu etwa 1012 M–1 oder sogar bis zu etwa 1015 M–1.
  • Der Begriff „strenge Untersuchungs- bzw. Assaybedingungen”, wie derselbe hier verwendet wird, bezieht sich auf Bedingungen, die kompatibel sind, um Bindungspaare von Nukleinsäuren, zum Beispiel Fangmittel und Analyten, von ausreichender Komplementarität zu erzeugen, um den gewünschten Spezifitätspegel bei der Untersuchung zu liefern, während dieselben mit der Bildung von Bindungspaaren zwischen Bindungselement unzureichender Komplementarität, um die gewünschte Spezifität zu liefern, inkompatibel sind. Strenge Untersuchungsbedingungen sind die Summierung oder Kombination (Gesamtheit) von sowohl Hybridisierungs- als auch Waschbedingungen.
  • Eine „strenge Hybridisierung” und „strenge Hybridisierungswaschbedingungen” im Zusammenhang mit einer Nukleinsäurenhybridisierung (zum Beispiel wie bei Array-, Southern bzw. Süd- oder Northern bzw. Nordhybridisierungen) sind sequenzabhängig und sind bei unterschiedlichen experimentellen Bedingungen unterschiedlich. Strenge Hybridisierungsbedingungen, die verwendet werden können, um Nukleinsäuren innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung zu identifizieren, können zum Beispiel eine Hybridisierung in einem Puffer, der 50% Formamid, 5 × SSC und 1% SDS aufweist, bei 42°C oder eine Hybridisierung in einem Puffer, der 5 × SSC und 1% SDS aufweist, bei 65°C, beide mit einer Spülung von 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C umfassen. Beispielhafte strenge Hybridisierungsbedingungen können auch eine Hybridisierung in einem Puffer von 40% Formamid, 1 M NaCl und 1% SDS bei 37°C und eine Waschung in 1 × SSC bei 45°C umfassen. Alternativ können eine Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTE bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C verwendet werden. Noch zusätzliche strenge Hybridisierungsbedingungen umfassen eine Hybridisierung bei 60°C oder mehr und 3 × SSC (450 mM Natriumchlorid/45 mM Natriumcitrat) oder Inkubation bei 42°C in einer Lösung, die 30% Formamid, 1 M NaCl, 0,5% Natriumsarkosin, 50 mM MES, pH 6,5, enthält. Fachleute werden ohne weiteres erkennen, dass alternative, aber vergleichbare Hybridisierungs- und Waschbedingungen verwendet werden können, um Bedingungen ähnlicher Strenge (stringency) zu liefern.
  • Bei bestimmten Ausführungsbeispielen kann die Strenge der Waschbedingungen den Grad beeinflussen, zu dem Nukleinsäuren spezifisch an komplementäre Fangmittel hybridisiert werden. Waschbedingungen, die verwendet werden, um Nukleinsäuren zu identifizieren, können zum Beispiel folgendes umfassen: eine Salzkonzentration von etwa 0,02 molar bei pH 7 und einer Temperatur von zumindest etwa 50°C oder etwa 55°C bis etwa 60°C; oder eine Salzkonzentration von etwa 0,15 M NaCl bei 72°C für etwa 15 Minuten; oder eine Salzkonzentration von etwa 0,2 × SSC bei einer Temperatur von zumindest etwa 50°C oder etwa 55°C bis etwa 60°C für etwa 1 bis etwa 20 Minuten; oder mehrere Waschungen mit einer Lösung mit einer Salzkonzentration von etwa 0,1 × SSC, die 0,1% SDS enthält, bei 20 bis 50°C für 1 bis 15 Minuten; oder äquivalente Bedingungen. Strenge Bedingungen zum Waschen können auch zum Beispiel 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C sein. Bei Fällen, in denen die Nukleinsäuremoleküle Desoxyoligonukleotide (d. h. Oligonukleotide) sind, können strenge Bedingungen ein Waschen in 6 × SSC/0,05% Natriumpyrophosphat bei 37°C (für 14-Basen-Oligos), 48°C (für 17-Basen-Oligos), 55°C (für 20-Basen-Oligos) und 60°C (für 23-Basen-Oligos) umfassen. Siehe Sambrook, Ausubel, oder Tijssen (im Folgenden angeführt) für detaillierte Beschreibungen von äquivalenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen und für Reagenzien und Puffer, zum Beispiel SSC-Puffer und äquivalente Reagenzien und Bedingungen.
  • Ein spezifisches Beispiel für strenge Untersuchungsbedingungen ist eine Drehhybridisierung bei einer Temperatur von etwa 55°C bis etwa 70°C in einem salzbasierten Hybridisierungspuffer mit einer monovalenten Gesamtkationenkonzentration von 1,5 M (wie es zum Beispiel in der US-Patentanmeldung Nr. 09/655,482, eingereicht am 5.September 2000, beschrieben ist, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist), gefolgt von Spülungen von 0,5 × SSC und 0,1 × SSC bei Zimmertemperatur und 37°C.
  • Strenge Hybridisierungsbedingungen können auch eine „Vorhybridisierung” von Wässrigphasenukleinsäuren mit Komplexitätverringerungsnukleinsäuren umfassen, um sich wiederholende Sequenzen zu unterdrücken. Zum Beispiel umfassen bestimmte strenge Hybridisierungsbedingungen vor jeglicher Hybridisierung an oberflächengebundene Polynukleotide eine Hybridisierung mit Cot-1-DNA oder mit synthetischen Oligonukleotiden zufälliger Sequenz (zum Beispiel 25-mere) oder dergleichen.
  • Strenge Untersuchungsbedingungen sind Hybridisierungsbedingungen, die zumindest so streng wie die oben genannten repräsentativen Bedingungen sind, wobei ein gegebener Satz von Bedingungen als zumindest genauso streng betrachtet wird, wenn im Wesentlichen keine zusätzlichen Bindungskomplexe, die keine ausreichende Komplementarität aufweisen, um die gewünschte Spezifität zu liefern, bei dem gegebenen Satz von Bedingungen verglichen mit den oben genannten spezifischen Bedingungen erzeugt werden, wobei „im Wesentlichen nicht mehr” weniger als etwa 5fach mehr, normalerweise weniger als etwa 3fach mehr bedeutet. Andere strenge Hybridisierungsbedingungen sind in der Technik bekannt und können je nach Eignung ebenfalls verwendet werden.
  • Der Begriff „vorbestimmt” bezieht sich auf ein Element, dessen Identität vor seiner Verwendung bekannt ist. Zum Beispiel ist ein „vorbestimmter Analyt” ein Analyt, dessen Identität vor einer Bindung an ein Fangmittel bekannt ist. Ein Element kann mit Namen, Sequenz, Molekulargewicht, seiner Funktion oder einem anderen Attribut oder Identifizierer bekannt sein. Bei einigen Ausführungsbeispielen wird der Begriff „interessierender Analyt”, d. h. ein bekannter Analyt, der von Interesse ist, als Synonym zu dem Begriff „vorbestimmter Analyt” verwendet.
  • Der Begriff „Array” umfasst den Begriff „Mikroarray” und bezieht sich auf ein geordnetes Array von Fangmitteln zum Binden an wässrige Analyten und dergleichen. Ein „Array” umfasst jede zweidimensionale oder im Wesentlichen zweidimensionale (sowie eine dreidimensionale) Anordnung von räumlich adressierbaren Regionen (d. h. „Merkmalen”), die Fangmittel, insbesondere Polynukleotide und dergleichen, enthalten. Jeder gegebene Träger kann ein, zwei, vier oder mehr Arrays tragen, die an einer Oberfläche eines Trägers angeordnet sind. Abhängig von der Verwendung können beliebige oder alle Arrays gleich sein oder sich voneinander unterscheiden, und jedes kann mehrere Zonen oder Merkmale enthalten. Ein typisches Array kann ein oder mehr, einschließlich mehr als zwei, mehr als zehn, mehr als einhundert, mehr als eintausend, mehr als zehntausend Merkmale oder sogar mehr als einhunderttausend Merkmale auf einer Fläche von weniger als 100 cm2, 20 cm2 oder sogar weniger als 10 cm2, zum Beispiel weniger als etwa 5 cm2, einschließlich weniger als etwa 1 cm2, weniger als etwa 1 mm2, zum Beispiel 100 μm2 oder noch kleiner, enthalten. Zum Beispiel können Merkmale Breiten (d. h. für eine runde Zone Durchmesser) in dem Bereich von 10 μm bis 1,0 cm aufweisen. Bei anderen Ausführungsbeispielen kann jedes Merkmal eine Breite in dem Bereich von 1,0 μm bis 1,0 mm, normalerweise 5,0 μm bis 500 μm, und gewöhnlicher 10 μm bis 200 μm aufweisen. Nicht runde Merkmale können Flächenbereiche aufweisen, die zu denjenigen von kreisförmigen Merkmalen mit den vorgenannten Breiten-(Durchmesser-)Bereichen äquivalent sind. Zumindest einige oder alle Merkmale weisen die gleichen oder unterschiedliche Zusammensetzungen auf (wenn zum Beispiel Wiederholungen jeder Merkmalszusammensetzung ausgeschlossen sind, können die verbleibenden Merkmale zumindest 5%, 10%, 20%, 50%, 95%, 99% oder 100% der Gesamtanzahl von Merkmalen ausmachen). Es sind normalerweise (aber nicht grundsätzlich) Zwischenmerkmalsbereiche vorhanden, die keine Nukleinsäuren (oder ein anderes Biopolymer oder eine chemische Komponente eines Typs, aus dem die Merkmale gebildet sind) tragen. Derartige Zwischenmerkmalsbereiche sind normalerweise vorhanden, wenn die Arrays durch Prozesse gebildet werden, die eine Tropfenaufbringung von Reagenzien umfassen, es kann jedoch sein, dass dieselben nicht vorhanden sind, wenn zum Beispiel photolithographische Arrayherstellungsprozesse verwendet werden. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass die Zwischenmerkmalsbereiche, wenn dieselben vorhanden sind, verschiedene Größen und Konfigurationen aufweisen könnten.
  • Arrays können durch ein Aufbringen (zum Beispiel durch kontakt- oder strahlbasierte Verfahren) von entweder Vorläufereinheiten (wie zum Beispiel Nukleotid- oder Aminosäurenmonomere) oder einem vorsynthetisierten Fangmittel hergestellt werden. Ein Array ist „adressierbar”, wenn es mehrere Regionen unterschiedlicher Komponenten (zum Beispiel unterschiedliches Fangmittel) aufweist, derart, dass eine Region (d. h. ein „Merkmal” oder eine „Zone” des Arrays) an einem bestimmten vorbestimmten Ort (d. h. einer „Adresse”) an dem Array eine bestimmte Sequenz erfasst. Ein „Arraylayout” bezieht sich auf ein oder mehr Charakteristika der Merkmale, wie zum Beispiel Merkmalspositionierung auf dem Träger, ein oder mehr Merkmalsabmessungen und eine Anzeige einer Komponente an einem gegebenen Ort. „Abfragen” des Arrays bezieht sich auf ein Erhalten von Informationen von dem Array, insbesondere Informationen über Analyten, die sich an das Array binden. „Hybridisierungsuntersuchung bzw. -assay” verweist auf einen Prozess, ein Array mit einer mobile Phase, die einen Analyten enthält, in Kontakt zu bringen. Ein „Arrayträger” bezieht sich auf einen Artikel, der eine adressierbare Sammlung von Fangmitteln trägt.
  • „Komplementär” verweist auf eine Eigenschaft eines spezifischen Bindens zwischen Polynukleotiden basierend auf den Sequenzen der Polynukleotide. Gemäß der Verwendung hier sind Polynukleotide komplementär, falls sie sich bei einer Hybridisierungsuntersuchung unter strengen Bedingungen aneinander binden, zum Beispiel falls dieselben einen gegebenen oder erfassbaren Pegel eines Signals bei einer Hybridisierungsuntersuchung erzeugen. Teile von Polynukleotiden sind komplementär zueinander, falls dieselben herkömmlichen Basenpaarungsregeln folgen, zum Beispiel A paart sich mit T (oder U), und G paart sich mit C. „Komplementär” umfasst Ausführungsbeispiele, bei denen eine absolute Sequenzkomplementarität vorliegt, und auch Ausführungsbeispiele, bei denen eine wesentliche Sequenzkomplementarität vorliegt. „Absolute Sequenzkomplementarität” bedeutet, dass eine 100%ige Sequenzkomplementarität zwischen einem ersten Polynukleotid und einem zweiten Polynukleotid vorliegt, d. h. es gibt keine Einfügungen, Deletionen oder Substitutionen bei einem des ersten und des zweiten Polynukleotids bezüglich des anderen Polynukleotids (über die komplementäre Region). Anders ausgedrückt kann jede Base der komplementären Region mit ihrer komplementären Base gepaart werden, d. h. normalen Basenpaarungsregeln folgend. „Wesentliche Sequenzkomplementarität” erlaubt eine oder mehr relativ kleine (weniger als 10 Basen, zum Beispiel weniger als 5 Basen, normalerweise weniger als 3 Basen, gewöhnlicher eine einzige Base) Einfügungen, Deletionen oder Substitutionen bei dem ersten und/oder zweiten Polynukleotid (über die komplementäre Region) relativ zu dem anderen Polynukleotid. Die Region, die zwischen einem ersten Polynukleotid und einem zweiten Polynukleotid (zum Beispiel einem Zielanalyten und einem Fangmittel) komplementär ist, ist normalerweise zumindest etwa 10 Basen lang, gewöhnlicher zumindest etwa 15 Basen lang, noch gewöhnlicher zumindest etwa 20 Basen lang oder zumindest etwa 25 Basen lang. Bei verschiedenen typischen Ausführungsbeispielen kann die Region, die zwischen einem ersten Polynukleotid und einem zweiten Polynukleotid (zum Beispiel Zielanalyt und ein Fangmittel) komplementär ist, bis zu etwa 200 Basen lang oder bis zu etwa 120 Basen lang, bis zu etwa 100 Basen lang, bis zu etwa 80 Basen lang, bis zu etwa 60 Basen lang oder bis zu etwa 45 Basen lang sein.
  • „Vorgelagert” bezieht sich bei der Verwendung hier auf die 5'-Richtung entlang einem Polynukleotid, zum Beispiel einem RNA-Molekül. „Nachgelagert” bezieht sich auf die 3'-Richtung entlang dem Polynukleotid. Somit ist eine einem Analyten nachgelagerte Markierung an einer Nukleotidkomponente angeordnet (oder an dieselbe gebunden), die in der 3'-Richtung von dem Analyten angeordnet ist, zum Beispiel an das 3'-Ende des Analyten gebunden ist. Auf ähnliche Weise verweist eine „vorgelagerte Markierung” auf eine Markierung, die an einer Nukleotidkomponente angeordnet ist (oder an dieselbe gebunden ist), die in der 5'-Richtung von dem Analyten angeordnet ist, zum Beispiel an das 5'-Ende des Analyten gebunden ist. „3'-” und „5'-” haben ihre herkömmliche Bedeutung, wie sie in der Technik bekannt ist. Ein 5'-Phosphat ist eine Phosphatgruppe, die an dem 5'-Ende eines Polynukleotids angeordnet ist. Ein 3'-Hydroxyl ist eine Hydroxylgruppe, die an dem 3'-Ende eines Polynukleotids angeordnet ist. Beispielsweise veranschaulicht 1 eine nachgelagerte Markierung eines Analyten. Als ein weiteres Beispiel veranschaulicht 2 eine vorgelagerte Markierung eines Analyten. Falls das Polynukleotid doppelsträngig ist, wird einer der Stränge als der Referenzstrang ausgewählt, zum Beispiel der Strang, der markiert ist, oder der Strang, der nicht markiert ist (oder es kann irgendein anderes Kriterium oder Merkmal des Stranges verwendet werden, um einen Strang als den Referenzstrang zu bestimmen).
  • Dementsprechend wird bei einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Markieren von RNA in einer Probe geliefert. Das Verfahren umfasst ein Kontaktieren der Probe mit einem Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, bei Vorhandensein eines markierten Substrats unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zu einem Koppeln des markierten Substrats mit der RNA in der Probe zu führen, um markierte RNA zu liefern, wobei die Bedingungen eine DMSO-Konzentration in dem Bereich von etwa 20% bis etwa 30% umfassen, wobei das markierte Substrat eine beobachtbare Markierungskomponente aufweist, die an eine Nukleotidkomponente angelagert ist.
  • Bei der Probe kann es sich um eine beliebige RNA-Probe handeln, normalerweise eine Probe, die RNA enthält, die aus einer biologischen Quelle, zum Beispiel irgendeiner Pflanzen-, Tier-, Hefe-, Bakterien- oder Virusquelle, oder einer nicht biologischen Quelle, zum Beispiel chemisch synthetisiert, isoliert wurde. Die Dimethylsulfoxid-(DMSO)Konzentration wird als Volumen (zum Beispiel in Millilitern) von DMSO geteilt durch das Gesamtvolumen (zum Beispiel in Millilitern) der Lösung, die das DMSO enthält, berechnet. Diese Menge wird normalerweise durch ein Multiplizieren mit 100% als ein Prozentsatz dargestellt. Zum Beispiel befindet sich die DMSO-Konzentration in einem Bereich von 20% bis etwa 30%, berechnet als das Volumen von DMSO in der Lösung, die sich aus einem Kontaktieren der Probe mit einem Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, bei Vorhandensein eines markierten Substrates ergibt, geteilt durch das Gesamtvolumen der Lösung und dann Multiplizieren mit 100%. Die anderen Bestandteile, die in der sich ergebenden Lösung vorhanden sind, sind normalerweise Wasser, Pufferbestandteile, Salz, RNA, markiertes Substrat und ein Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, obwohl andere Bestandteile ebenfalls vorhanden sein können. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst die Probe kleine RNAs, insbesondere RNAs, die weniger als etwa 500 Basen lang sind, zum Beispiel weniger als etwa 400 Basen lang, weniger als etwa 300 Basen lang, weniger als etwa 200 Basen lang oder weniger als etwa 100 Basen lang. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst die Probe eine oder mehr kurze RNAs, wie zum Beispiel kurze interferierende RNAs (siRNAs), Mikro-RNAs (miRNA), kleine nicht-codierende RNAs (tncRNA) und kleine regulierende RNA (smRNA). Siehe Novina et al., Nature 430: 161–164 (2004). Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst die Probe isolierte kleine RNAs, zum Beispiel ergibt sich die Probe aus einem Isolierungsprotokoll für kleine RNA, wie zum Beispiel eines oder mehr derjenigen, die in diesem Absatz aufgelistet sind. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen können die kleinen RNA-Ziele isolierte miRNAs umfassen, wie zum Beispiel diejenigen, die in der Literatur und in der öffentlichen Datenbank beschrieben sind, die über die Webseite zugänglich ist, die sich an folgender Adresse befindet: >>http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/Rfam/mirna/browse.pl<<). Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst die Probe isolierte kleine RNAs, zum Beispiel ergibt sich die Probe aus einem Isolierungsprotokoll für kleine RNA, insbesondere RNAs, die weniger als etwa 500 Basen lang sind, zum Beispiel weniger als etwa 400 Basen lang, weniger als etwa 300 Basen lang, weniger als etwa 200 Basen lang, weniger als etwa 100 Basen lang oder weniger als etwa 50 Basen lang.
  • Das Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, ist normalerweise ein beliebiges RNA-Ligaseenzym, obwohl andere Enzyme, die in der Lage sind, das markierte Substrat mit der RNA zu koppeln, verwendet werden können. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist das Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, in der Lage, ein Nukleotid (oder Oligonukleotid oder RNA), das ein 5'-Phosphat aufweist, mit einem Oligonukleotid zu koppeln, das ein 3'-Hydroxyl aufweist. Exemplarische Enzyme umfassen T4-RNA-Ligase, die von der Firma Amersham/Pharmacia erhältlich ist, ThermoPhageTM-RNA-Ligase II (erhältlich von Prokaria LTD, Island) oder andere verfügbare RNA-Ligaseenzyme, von denen bekannt ist, dass dieselben in der Lage sind, ein Nukleotid (oder Oligonukleotid oder RNA), das ein 5'-Phosphat aufweist, mit einem Oligonukleotid, das ein 3'-Hydroxyl aufweist, zu koppeln. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen kann das Enzym aus Hefe-Poly-A-Polymerase, E.coli-Poly-A-Polymerase oder terminaler Transferase (von denen jede von Amersham/Pharmacia erhältlich ist) ausgewählt sein. Das Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, sollte derart ausgewählt sein, dass das Enzym in der Lage ist, das Koppeln durchzuführen, wenn eines (oder beide) des Nukleotids (oder Oligonukleotids), das ein 5'-Phosphat aufweist, und/oder des Oligonukleotids, das ein 3'-Hydroxyl aufweist, eine Markierung umfasst. Die Auswahl des Enzyms, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, basiert normalerweise auf der Verfügbarkeit des Enzyms und der Aktivität des Enzyms unter den gewünschten Reaktionsbedingungen für das Koppeln (zum Beispiel Temperatur, pH, Ionenstärke, Quelle von RNA und/oder markiertem Substrat, Strukturmerkmal der RNA und/oder des markierten Substrats, Konzentration der RNA und/oder des markierten Substrats, Vorhandensein anderer Materialien (zum Beispiel Verunreinigungsstoffe, Salz, oberflächenaktives Mittel, andere Lösungsmittel) usw.).
  • Die Kopplungsreaktion erfolgt unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zu einer Kopplung zu führen. Die Bedingungen der Kopplungsreaktion werden allgemein hinsichtlich der bekannten (im Vorhergehenden beschriebenen) Bedingungen für eine Verwendung des bestimmten Enzyms ausgewählt, das zur Verwendung bei den Verfahren der Erfindung ausgewählt ist, mit den spezifischen hier beschriebenen Modifizierungen. Wie bereits angedeutet, ist das DMSO der Reaktionsmischung für die Kopplungsreaktion in dem Bereich von 20% bis 30%. Andere experimentelle Parameter können basierend auf bekannten Bereichen für die experimentellen Parameter ausgewählt werden oder durch Routineexperimentieren zum Beispiel basierend auf der Wirksamkeit der Markierungsreaktion bestimmt werden. Derartige andere experimentelle Parameter können zum Beispiel Temperatur, pH, Ionenstärke, Quelle der RNA und/oder des markierten Substrats, Strukturmerkmal der RNA und/oder des markierten Substrats, Konzentration der RNA und/oder des markierten Substrats, Vorhandensein anderer Materialien (zum Beispiel Verunreinigungsstoffe, Salz, oberflächenaktives Mittel, andere Lösungsmittel) usw. umfassen.
  • Das markierte Substrat weist eine beobachtbare Markierungskomponente auf, die an eine Nukleotidkomponente angelagert ist. Die Nukleotidkomponente ist normalerweise eine Mononukleotidkomponente oder eine Oligonukleotidkomponente. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist die Nukleotidkomponente weniger als etwa 100 Basen lang. Bei Ausführungsbeispielen, die zu einer vorgelagerten Markierung der RNA führen (Beispiele sind in 2 gezeigt), ist die Nukleotidkomponente normalerweise zumindest drei Basen lang. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist die Nukleotidkomponente weniger als 50 Basen lang, zum Beispiel weniger als 40 Basen lang, weniger als 30 Basen lang, weniger als 20 Basen lang. Bei einigen Ausführungsbeispielen ist die Nukleotidkomponente 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Basen lang. Die Nukleotidkomponente kann normalerweise eine beliebige gewünschte Sequenz oder sogar eine unbekannte Sequenz aufweisen. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen kann eine Mehrzahl von markierten Substraten bei der gleichen Reaktion verwendet werden (zum Beispiel eine Mehrzahl von Nukleotidkomponenten, von denen jede eine unterschiedliche Sequenz aufweist, wobei an jede eine beobachtbare Markierungskomponente angelagert ist), was dazu führt, dass eine von einer Mehrzahl von Nukleotidkomponenten mit jedem Molekül der RNA ligiert wird.
  • Die beobachtbare Markierungskomponente ist eine Komponente, die ein beobachtbares Signal liefert, das das Vorhandensein der beobachtbaren Markierungskomponente anzeigt. Typische Beispiele umfassen eine chromogene Komponente, einen Fluorophor, eine Massenmarkierung, eine Spinmarkierung, eine Radiomarkierung oder andere Markierungen, die in der Technik bekannt sind. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist die beobachtbare Markierungskomponente ein Fluorophor, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cy3, Cy5 und einen Alexa-Farbstoff umfasst. Weitere Beispiele für Markierungskomponenten umfassen alle im Handel erhältlichen Fluorophore, die mit Mononukleotiden oder Polynukleotiden konjugiert werden können, zum Beispiel Farbstoffe von Molecular Probes (Eugene, Oregon, und Leiden, Niederlande), wie zum Beispiel die Alexa-Fluor-Reihe (Beispiel: Alexa 350, Alexa 430, Alexa 532, Alexa 546, Alexa 568 und Alexa 594) und die Reihe der BODIPY-Kunjugate. Andere Beispiele umfassen: Tamra, Fluorescein, Carboxyfluorescene, JOE, Rhodamin, Carboxyrhodamin, die CY-Reihe, die Oyster-Reihe. Mehr Informationen zu im Handel erhältlichen Farbstoffen zur Oligonukleotidkonjugation sind auf der Webseite zu finden, die sich an folgender Adresse befindet: >>http://www.synthegen.com<<. Alle derartigen Farbstoffe können potentiell gemäß der hier beschriebenen Verfahren verwendet werden. Obwohl die hier beschriebenen Beispiele einen Fluorophor als die Markierung verwenden, ist es für Fachleute ersichtlich, dass andere Markierungen verwendet werden können (statt einem Fluorophor oder sogar zusätzlich zu einem Fluorophor). Derartige Markierungen sind normalerweise in der Technik bekannt.
  • Die beobachtbare Markierungskomponente kann an die Nukleotidkomponente an einer beliebigen Stelle der Nukleotidkomponente, die mit der Ligationsreaktion kompatibel ist, angelagert sein. In anderen Worten sollte die Markierungskomponente die Ligationsreaktion nicht verhindern, zum Beispiel durch ein Beeinträchtigen des Enzyms, das eine RNA Ligationsaktivität aufweist. Bei Ausführungsbeispielen einer nachgelagerten Markierung (zum Beispiel in 1 veranschaulicht) kann die Markierungskomponente über die 3'-Stelle an dem Ende der Nukleotidkomponente an die Nukleotidkomponente angelagert sein oder kann an einer beliebigen verfügbaren „internen” Stelle (d. h. einer anderen als der 3'-Stelle oder der 5'-Stelle) der Nukleotidkomponente angelagert sein. Bei Ausführungsbeispielen einer vorgelagerten Markierung (wie zum Beispiel in 2 veranschaulicht) kann die Markierungskomponente über die 5'-Stelle an dem Ende der Nukleotidkomponente an die Nukleotidkomponente angelagert sein oder kann an einer beliebigen verfügbaren „internen” Stelle (d. h. einer anderen als der 3'-Stelle oder der 5'-Stelle) der Nukleotidkomponente angelagert sein. Die beobachtbare Markierungskomponente könnte als ein Spezialphosphoramidit während der Oligoribonukleotidsynthese oder als eine Nachsynthesemodifizierung eingegliedert werden. Ein Beispiel für das Phosphoramiditverfahren umfasst ein direktes Koppeln eines eine Markierung enthaltenden Phosphoramidits während einer Synthese der Oligonukleotidkomponente oder die Eingliederung eines amino-aktivierten Phosphoramidits während einer Synthese der Oligonukleotidkomponente, was eine Nachsynthesekopplung mit einer gewünschten beobachtbaren Markierungskomponente ermöglicht. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist die beobachtbare Markierungskomponente über eine Verknüpfungsgruppe an die Nukleotidkomponente angelagert, wobei die. Verknüpfungsgruppe über ein 5'-Ende oder ein 3'-Ende der Nukleotidkomponente oder eine beliebige andere verfügbare Stelle der Nukleotidkomponente an die Nukleotidkomponente angelagert sein kann. Bei der Verknüpfungsgruppe kann es sich um eine beliebige Verknüpfungsgruppe handeln, die in der Technik bekannt ist, die nicht die Ligationsreaktion verhindert (z. B. nicht verhindert, dass das Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, die RNA und das markierte Substrat ligiert). Beliebige derartige Verknüpfungsgruppen oder eine andere Einrichtung zur Anlagerung der Markierungskomponente an die Nukleotidkomponente, die in der Technik bekannt ist, können für das markierte Substrat sorgen.
  • Somit weist das markierte Substrat bei bestimmten Ausführungsbeispielen folgende Struktur auf: N-D wobei: N aus einer Mononukleotidkomponente oder einer Oligonukleotidkomponente ausgewählt ist, die eine Länge von weniger als etwa 100 Basen aufweist, und
    D eine beobachtbare Markierungskomponente ist (zum Beispiel über ein 5'-Ende oder ein 3'-Ende von N oder eine beliebige andere verfügbare Stelle von N an N angelagert).
  • Ein Ausführungsbeispiel eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 1 veranschaulicht. In 1 umfasst das Verfahren 100 zum Markieren von RNA ein Hinzufügen 104 von DMSO 106 zu der Probe (die die RNA 102 umfasst). Das markierte Substrat 110A, 110B oder 110C kann dann zu der sich ergebenden Lösung (die das DMSO 106 und die RNA 102 von der Probe enthält) hinzugefügt werden 108. Das markierte Substrat 110A, 110B oder 110C ist normalerweise ein Mononukleotid mit einem 3'-Fluorophor und einem 5'-Phosphat 110A, ein Oligonukleotid mit einem 5'-Phosphat und ein oder mehr internen Fluorophoren 110B oder ein Oligonukleotid mit einem 3'-Fluorophor und einem 5'-Phosphat 110C. (Bei einem Ausführungsbeispiel, bei dem das markierte Substrat 110B ein oder mehr interne Fluorophore aufweist, hat das 3'-Ende des Oligonukleotids kein 3'-Hydroxyl, wie es in 1 durch das „X” angezeigt ist. Zum Beispiel kann eine Periodatoxidationsreaktion verwendet werden, um das 3'-Ende zu modifizieren, oder das 3'-Ende kann modifiziert werden, indem ein Fluorophor daran gebunden wird.) Das Enzym 114, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, wird ebenfalls hinzugefügt 112. Bei typischen Ausführungsbeispielen sollen die Konzentrationen der Lösungen und die hinzugefügten Volumen dafür sorgen, dass die sich ergebende Lösung die gewünschte Konzentration von DMSO aufweist (zum Beispiel in dem Bereich von etwa 20% bis etwa 30%, gewöhnlicher in dem Bereich von etwa 22% bis etwa 28%, noch gewöhnlicher in dem Bereich von etwa 24% bis etwa 26%). Dann lässt man die sich ergebende Lösung unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichend dafür ist, dass das Koppeln des markierten Substrats mit der RNA auftritt, reagieren 116, wodurch die markierte RNA 118A, 118B oder 118C geliefert wird. Typische Bedingungen 120 einer Inkubation über Nacht bei 16°C sind für das Ausführungsbeispiel von 1 gezeigt, obwohl diese Bedingungen abhängig von dem bestimmten verwendeten Enzym und der RNA und dem markierten Substrat, die bereitgestellt werden, variieren. Bei dem veranschaulichten Ausführungsbeispiel ist die Markierung ein Fluorophor 111, es können jedoch andere Markierungen verwendet werden, solange das Koppeln des markierten Substrats mit der RNA noch erfolgen kann. Die Auswahl und Optimierung der Bedingungen liegt für einen Fachmann bei gegebener vorliegender Offenbarung im Rahmen eines Routineexperimentierens.
  • Ein weiteres Ausführungsbeispiel eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 2 veranschaulicht. In 2 umfasst das Verfahren 200 zum Markieren von RNA ein Vorbehandeln der RNA 102 durch ein Durchführen einer Periodatoxidationsreaktion 222 bei der anfänglichen RNA-Probe. Mit Hilfe der Periodatoxidationsreaktion wird verhindert, dass sich die RNA mit sich selbst verkettet oder ligiert, wenn das Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, später hinzugefügt wird. Die Periodatoxidationsreaktion 222 wird von Inaktivierung und Entsalzung 224 der Lösung gefolgt, die sich aus der Periodatoxidationsreaktion ergibt. Die Periodatoxidationsreaktion kann unter Verwendung eines beliebigen in der Technik bekannten Protokolls durchgeführt werden. Siehe zum Beispiel Neu, Harold C., et al., J. Biol. Chem 239: 2927–34 (1964); Kurata, Shinya, et al., Nucleic Acids Res. 31: e145 (2003); England, T. E., et al., Meth. Enzymol. 65: 65–74 (1980); England, T. E., et al., Nature 275: 560–61 (1978); und Maruyama, K., et al., Gene 138: 171–74 (1994). Bei einer typischen Periodatoxidationsreaktion werden Ribonukleotide mit einem geschätzten fünffachen molaren Überschuss von Natriummetaperiodat 20 Minuten bis 1 Stunde lang bei 0°C bis Zimmertemperatur im Dunkeln behandelt. Die Ribonukleotide können aus der Lösung durch eine Ethanolausfällung oder Entsalzungssäulen, wie zum Beispiel BioRad Micro Bio-SpinTM 6, gereinigt werden.
  • Um mit dem Ausführungsbeispiel fortzufahren, das in 2 gezeigt ist, umfasst das Verfahren 200 ein Hinzufügen 204 von DMSO 206 zu der Lösung, die die RNA 202 enthält. Das markierte Substrat 210A oder 210B kann dann zu der sich ergebenden Lösung (die das DMSO 206 und die RNA 202 aus der Probe enthält) hinzugefügt werden 208. Das markierte Substrat 210A oder 210B ist normalerweise ein Oligonukleotid mit einem 5'-Fluorophor 210A oder ein Oligonukleotid mit ein oder mehr internen Fluorophoren 210B. Das Enzym 214, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, wird ebenfalls hinzugefügt 212. Bei typischen Ausführungsbeispielen sollen die Konzentrationen der Lösungen und die hinzugefügten Volumen dafür sorgen, dass die sich ergebende Lösung die gewünschte Konzentration von DMSO aufweist (zum Beispiel in dem Bereich von etwa 20% bis etwa 30%, gewöhnlicher in dem Bereich von etwa 22% bis etwa 28%, noch gewöhnlicher in dem Bereich von etwa 24% bis etwa 26%). Dann lässt man die sich ergebende Lösung unter Bedingungen und für eine Zeit, die ausreichend ist, dass das Koppeln des markierten Substrats mit der RNA erfolgt, reagieren 216, wodurch die markierte RNA 218A oder 218B geliefert wird (Produkte, die 210A bzw. 210B entsprechen). Typische Bedingungen 220 einer Inkubation über Nacht bei 16°C sind für das Ausführungsbeispiel von 2 gezeigt, obwohl diese Bedingungen abhängig von dem bestimmten verwendeten Enzym und der RNA und dem markierten Substrat, die bereitgestellt werden, variieren können. Zum Beispiel liegt die Temperatur der Inkubation normalerweise in dem Bereich von etwa 4°C bis etwa 37°C, gewöhnlicher in dem Bereich von etwa 10°C bis etwa 30°C, noch gewöhnlicher in dem Bereich von etwa 14°C bis etwa 20°C. Bei dem veranschaulichten Ausführungsbeispiel ist die Markierung ein Fluorophor 211, es können jedoch andere Markierungen verwendet werden, solange das Koppeln des markierten Substrats mit der RNA noch erfolgen kann. Die Auswahl und Optimierung der Bedingungen liegt für einen Fachmann bei gegebener vorliegender Offenbarung im Rahmen eines routinemäßigen Experimentierens.
  • Bei dem Ausführungsbeispiel, das in 1 veranschaulicht ist, ist das markierte Substrat, das mit 110A bezeichnet ist, als ein Mononukleotid gezeigt, das an einen Fluorophor angelagert ist. Bei anderen Ausführungsbeispielen, die in 1 veranschaulicht sind, sind die markierten Substrate 110B und 110C als ein Oligonukleotid gezeigt, das ein oder mehr Fluorophore aufweist, die an das Oligonukleotid angelagert sind, wobei das Oligonukleotid kein 3'-Hydroxyl aufweist. Das Fehlen des 3'-Hydroxyls ist dabei hilfreich, eine Verkettung des markierten Substrats zu verhindern. Dies ist analog zu dem Ausführungsbeispiel, das in 2 gezeigt ist, wobei die RNA 202 einer Periodatoxidation unterzogen wird, um dazu beizutragen, zu verhindern, dass sich die RNA mit sich selbst verkettet oder ligiert. Das markierte Substrat 110C ist als ein Oligonukleotid gezeigt, das ein oder mehr Fluorophore aufweist, die an ein Oligonukleotid an dem 3'-Ende des Oligonukleotids angelagert sind. In 2 veranschaulicht das markierte Substrat, das mit 210A und 210B bezeichnet ist, repräsentative Ausführungsbeispiele, bei denen das markierte Substrat ein Oligonukleotid umfasst, das an ein oder mehr Fluorophore angelagert ist. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das markierte Substrat ein Oligonukleotid, an das eine Mehrzahl, zum Beispiel 2, 3, 4, 5 oder mehr Markierungskomponenten, bis zu etwa 10, 20, 30 oder mehr Markierungskomponenten angelagert sind, die an die Oligonukleotidkomponente an internen (nicht End-)Stellen angelagert sind. Bei bestimmten derartigen Ausführungsbeispielen ist eine Markierungskomponente auch über einen der 3'- oder 5'-Endkohlenstoffe des Oligonukleotids an das Oligonukleotid angelagert.
  • Bei bestimmten Ausführungsbeispielen katalysiert das Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, eine Kopplungsreaktion zwischen einem Donatormolekül, das ein 5'-Phosphat aufweist, und einem Akzeptormolekül, das ein 3'-Hydroxyl aufweist, wie es in folgender Reaktion gezeigt ist: Acc-3'-OH + PO4-5'-Don → (enz) Acc-3'-O-PO3-5'-Don wobei: Acc-3'-OH das Akzeptormolekül ist, das ein 3'-Hydroxyl aufweist;
    PO4-5'-Don das Donatormolekül ist, das ein 5'-Phosphat aufweist;
    Acc-3'-O-PO3-5'-Don das Produkt ist, das die gekoppelten Donator- und Akzeptorkomponenten aufweist (zum Beispiel die markierte RNA); und
    (enz) das Enzym ist, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist.
  • Bei bestimmten Ausführungsbeispielen, wie zum Beispiel demjenigen, das in 1 veranschaulicht ist, ist das Akezptormolekül die RNA 102, und das Donatormolekül ist das markierte Substrat 110A, 110B oder 110C. Das sich ergebende Produkt 118A, 118B oder 118C weist die markierte Substratkomponente der RNA nachgelagert auf, d. h. das Produkt ist eine nachgelagerte markierte RNA. Bei anderen Ausführungsbeispielen, wie zum Beispiel demjenigen, das in 2 veranschaulicht ist, ist das Akezptormolekül das markierte Substrat 210A oder 210B, und das Donatormolekül ist die RNA 202. Das sich ergebende Produkt 218A oder 218B weist die markierte Substratkomponente der RNA vorgelagert auf, d. h. das Produkt ist eine vorgelagerte markierte RNA. Somit können basierend auf der Auswahl der RNA und des markierten Substrats, wie es hier offenbart ist, Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung entweder zu einer vorgelagerten oder einer nachgelagerten markierten RNA führen.
  • Es sei darauf hingewiesen, dass der allgemeine Nutzen des Verfahrens nicht auf die bestimmte Sequenz von Schritten beschränkt ist, die in den Figuren gezeigt ist. Andere Schrittsequenzen, die zu im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen führen, sollen in der Erfindung enthalten sein. Zum Beispiel kann das markierte Substrat bei bestimmten Ausführungsbeispielen in einer Lösung aufgelöst werden, die das DMSO enthält, und die sich ergebende Lösung kann vor einem Kontaktieren mit dem Enzym, das eine RNA-Ligaseaktivität aufweist, mit der Probe gemischt werden. Somit umfasst die Erfindung bei bestimmten Ausführungsbeispielen jeden beliebigen Prozess, der zu einem Kontaktieren der Probe mit dem Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, bei Vorhandensein des markierten Substrats unter Bedingungen, die eine DMSO-Konzentration in dem Bereich von etwa 20% bis etwa 30% umfassen, führt.
  • Unter Bezugnahme auf 1 umfasst das Verfahren 100 bei bestimmten Ausführungsbeispielen, nachdem das DMSO 106 hinzugefügt worden ist 104 und bevor das Enzym 114, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, hinzugefügt worden ist 112, ein Erhitzen der Lösung, die das DMSO 106 und die RNA 102 von der Probe enthält. Bei diesem optionalen Erhitzungsschritt wird die RNA normalerweise auf eine Temperatur von zumindest etwa 80°C (zum Beispiel zumindest etwa 85°C, zumindest etwa 90°C, zumindest etwa 95°C; und bis zu etwa 105°C oder 110°C) unter Bedingungen erhitzt, die eine DMSO-Konzentration von zumindest etwa 40% DMSO (normalerweise bis zu etwa 60% DMSO, obwohl bei einigen Ausführungsbeispielen die DMSO-Konzentration bis zu 70% DMSO, bis zu 80% DMSO oder sogar mehr betragen kann) umfassen. Diese optionale Erhitzung wird für zumindest 10 Sekunden, normalerweise zumindest etwa 20 Sekunden, zumindest etwa 30 Sekunden, zumindest etwa 1 Minute, zumindest etwa 2 Minuten und bis zu etwa 15 Minuten oder mehr aufrechterhalten. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen werden Reaktionslösungen von bis zu etwa 50 Mikrolitern für etwa 30 bis etwa 60 Sekunden pro 5 bis 10 Mikroliter Reaktionslösung erhitzt. Nach dem Erhitzen wird die RNA normalerweise rasch abgekühlt (zum Beispiel auf weniger als etwa 40°C, gewöhnlicher weniger als etwa 20°C oder bei einigen Ausführungsbeispielen weniger als etwa 5°C), bevor das Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, hinzugefügt wird. Unter Bezugnahme auf 2 kann ein ähnlicher Erhitzungsschritt optional in Ausführungsbeispielen, wie zum Beispiel demjenigen, das in der Figur veranschaulicht ist, enthalten sein.
  • Es sei darauf hingewiesen, dass die RNA in der Probe bei bestimmten Ausführungsbeispielen über einen Prozess isoliert wird, der dazu führt, dass die RNA in der Probe ein 5'-Phophat aufweist. Bei Ausführungsbeispielen wie demjenigen, das in 1 gezeigt ist, bei denen die RNA in der Probe kein 5'-Phosphat aufweist, wird eine Vorbereitungsbehandlung, die RNA in der Probe einer Dephosphorylierungsreaktion zu unterziehen, durchgeführt, bevor die RNA in der Probe durch das Ligationsverfahren, das in 1 veranschaulicht ist, markiert wird. Derartige Dephosphorylierungsreaktionen sind in der Technik bekannt, zum Beispiel ein Behandeln der RNA-Probe mit einem Enzym, das eine 5'-Phosphataseaktivität aufweist, zum Beispiel alkalische Kalbsdarmphosphatase, alkalische Garnelenphosphatase oder alkalische E.-coli-Phosphatase, oder ein beliebiges anderes Verfahren zum Dephosphorylieren der RNA, das in der Technik bekannt ist. Somit umfasst das Verfahren zum Markieren von RNA in einer Probe bei bestimmten Ausführungsbeispielen vor dem Kontaktieren der Probe mit dem Enzym, das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, ein Kontaktieren der Probe mit einem Enzym, das eine 5'-Phosphataseaktivität aufweist, um 5'-Phosphatgruppen von der RNA in der Probe zu entfernen.
  • Bei einigen Ausführungsbeispielen weist das markierte Substrat nur eine beobachtbare Markierungskomponente auf, die an die Nukleotidkomponente angelagert ist. Bei derartigen Ausführungsbeispielen besteht die markierte RNA im Wesentlichen aus RNA, die mit einer einzigen Markierungskomponente markiert ist (d. h. an jedes markierte RNA-Molekül ist nur eine beobachtbare Markierungskomponente angelagert – hier als „einfach markierte RNA” bezeichnet). Dies liefert potentiell eine vereinfachte Verwendung bei quantitativen Verfahren, die die markierte RNA verwenden.
  • Bei anderen Ausführungsbeispielen weist die Nukleotidkomponente des markierten Substrats eine Mehrzahl von beobachtbaren Markierungskomponenten auf. Bei derartigen Ausführungsbeispielen weist jedes markierte RNA-Molekül, wenn die Markierungsreaktion durchgeführt wird, um die markierte RNA zu ergeben, eine Mehrzahl von beobachtbaren Markierungskomponenten auf (hier als „mehrfach markierte RNA” bezeichnet). Somit besteht die markierte RNA im Wesentlichen aus RNA, die mit einer Mehrzahl von Markierungskomponenten markiert ist. Diese vermehrte Markierung der RNA kann eine größere Empfindlichkeit bei Analysen liefern, die die markierte RNA verwenden. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen ist jedes markierte RNA-Molekül in der Probe mit einer übereinstimmenden Anzahl von beobachtbaren Markierungskomponenten (relativ zu den anderen markierten RNA-Molekülen in der Probe) markiert. Dies liefert die Möglichkeit einer quantitativeren Analyse von markierter RNA als bei Verfahren, die eine nicht übereinstimmende Anzahl von beobachtbaren Markierungen pro markiertem RNA-Molekül liefern.
  • Bei bestimmten Ausführungsbeispielen werden Verfahren zum Durchführen einer Arrayanalyse einer RNA-Probe geliefert. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen liefert die Erfindung ein Verfahren zum Durchführen einer Arrayanalyse, wobei das Verfahren ein Markieren der RNA in der Probe umfasst, um unter Verwendung eines Markierungsverfahrens gemäß der hier beschriebenen Verfahren markierte RNA zu liefern. Die markierte RNA wird dann unter Bedingungen mit einem Array in Kontakt gebracht, die ausreichend sind, um eine spezifische Bindung von markierter RNA an das Array zu liefern. Das Array wird dann normalerweise abgefragt, um, Daten bezüglich der Bindung der markierten RNA an das Array zu liefern.
  • Standardmäßige Hybridisierungstechniken (unter Verwendung von strengen Hybridisierungsbedingungen) werden verwendet, um eine markierte Probe an ein Nukleinsäurearray zu hybridisieren. Geeignete Verfahren sind in Druckschriften beschrieben, die CGH-Techniken beschreiben (Kallioniemi et al., Science 258: 818–821 (1992) und WO 93/18186 ). Mehrere Anleitungen für allgemeine Techniken sind erhältlich, zum Beispiel Tijssen, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parts I and II (Elsevier, Amsterdam 1993). Für Beschreibungen von Techniken, die für in situ-Hybridisierungen geeignet sind, sei verwiesen auf Gall et al. Meth. Enzymol., 21: 470–480 (1981); und Angerer et al. in Genetic Engineering: Principles and Methods (Setlow and Hollaender, Eds.) Bd. 7, S. 43–65 (Plenum Press, New York 1985). Es sei auch auf die US-Patente Nr.: 6,335,167 ; 6,197,501 ; 5,830,645 ; und 5,665,549 verwiesen, deren Offenbarungen hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Ein Hybridisieren der Probe an das Array wird normalerweise unter strengen Hybridisierungsbedingungen durchgeführt, wie es hier beschrieben und in der Technik bekannt ist. Die Auswahl von geeigneten Bedingungen, einschließlich Temperatur, Salzkonzentration, Polynukleotidkonzentration, Zeit (Dauer) der Hybridisierung, Strenge der Waschbedingungen und dergleichen, hängt von der Experimentausgestaltung ab, einschließlich Quelle der Probe, Identität von Fangmitteln, erwarteter Komplementaritätsgrad usw., und dieselben liegen für Fachleute, an die sich die Erfindung richtet, im Rahmen eines routinemäßigen Experimentierens.
  • Nach der Hybridisierung werden die an der Arrayoberfläche gebundenen Polynukleotide normalerweise gewaschen, um nicht gebundene und nicht fest gebundene markierte Nukleinsäuren zu entfernen. Ein Waschen kann unter Verwendung eines beliebigen herkömmlichen Waschprotokolls durchgeführt werden, wobei die Waschbedingungen normalerweise streng sind, wie es im Vorhergehenden beschrieben ist.
  • Nach der Hybridisierung und dem Waschen, wie sie im Vorhergehenden beschrieben sind, wird die Hybridisierung der markierten Zielnukleinsäuren an die Fangmittel dann unter Verwendung von Standardtechniken zum Lesen des Arrays erfasst, d. h. das Array wird abgefragt. Das Lesen des sich ergebenden hybridisierten Arrays kann durch ein Beleuchten des Arrays und ein Lesen von Ort und Intensität einer sich ergebenden Fluoreszenz bei jedem Merkmal des Arrays, um jegliche Bindungskomplexe an der Oberfläche des Arrays zu erfassen, erreicht werden. Zum Beispiel kann zu diesem Zweck eine Abtastvorrichtung verwendet werden, die dem AGILENT MICROARRAY SCANNER ähnlich ist, der von Agilent Technologies, Palo Alto, Kalifornien erhältlich ist. Andere geeignete Vorrichtungen und Verfahren sind in den folgenden US-Patentanmeldungen beschrieben: Seriennr. 09/846125 „Reading Multi-Featured Arrays” von Dorsel et al.; und US-Patent Nr. 6,406,849 . Arrays können jedoch durch ein beliebiges anderes Verfahren oder eine beliebige andere Vorrichtung als die Vorhergehenden mit anderen Leseverfahren gelesen werden, einschließlich anderer optischer Techniken (zum Beispiel Erfassen von Chemilumineszenz- oder Elektrolumineszenzmarkierungen) oder elektrischer Techniken (wobei jedes Merkmal mit einer Elektrode ausgestattet wird, um eine Hybridisierung an dem Merkmal auf eine Weise zu erfassen, die in der US 6,221,583 und an anderer Stelle offenbart ist). In dem Fall einer indirekten Markierung kann eine nachfolgende Behandlung des Arrays mit den geeigneten Reagenzien eingesetzt werden, um ein Lesen des Arrays zu ermöglichen. Einige Erfassungsverfahren, wie zum Beispiel Oberflächenplasmonresonanz, erfordern kein Markieren von Nukleinsäuren und sind für einige Ausführungsbeispiele geeignet.
  • Ergebnisse des Lesens oder Auswertens können Rohergebnisse sein (zum Beispiel Fluoreszenzintensitätsablesungen für jedes Merkmal in ein oder mehr Farbkanälen) oder können verarbeitete Ergebnisse sein (wie zum Beispiel diejenigen, die durch ein Abziehen einer Hintergrundmessung oder durch Verwerfen einer Ablesung für ein Merkmal, die sich unterhalb einer vorbestimmten Schwelle befindet, ein Normieren der Ergebnisse und/oder ein Ziehen von Schlussfolgerungen basierend auf dem Muster, das von dem Array gelesen wird (zum Beispiel ob eine bestimmte Zielsequenz eventuell in der Probe vorhanden war oder nicht, oder ob ein Muster einen bestimmten Zustand eines Organismus anzeigt, von dem die Probe kam), erhalten werden).
  • Bei bestimmten Ausführungsbeispielen werden Ergebnisse des Abfragens des Arrays verwendet, um den Bindungspegel der Population von markierten Nukleinsäuren an Fangmittel an dem Array zu bewerten. Der Begriff „Bindungspegel” bedeutet eine beliebige Bewertung der Bindung (zum Beispiel eine quantitative oder qualitative, relative oder absolute Bewertung), die normalerweise, wie es in der Technik bekannt ist, durch ein Erfassen eines Signals (d. h. Pixelhelligkeit) von einer Markierung erfolgt, die den Probenukleinsäuren zugeordnet ist, zum Beispiel wird die aufgelöste Probe markiert. Der Bindungspegel einer markierten Nukleinsäure an ein Fangmittel wird normalerweise durch ein Messen der Oberflächendichte der gebundenen Markierung (oder eines Signals, das sich aus der Markierung ergibt) erhalten.
  • Bei bestimmten Ausführungsbeispielen kann ein oberflächengebundenes Polynukleotid durch ein Auswerten seiner Bindung an zwei Populationen von Nukleinsäuren, die unterscheidbar markiert sind, bewertet werden. Bei diesen Ausführungsbeispielen können bei einem einzigen interessierenden oberflächengebundenen Polynukleotid die Ergebnisse, die aus einer Hybridisierung mit einer ersten Population von markierten Nukleinsäuren erhalten werden, mit Ergebnissen verglichen werden, die von einer Hybridisierung mit der zweiten Population von Nukleinsäuren erhalten werden, normalerweise nach einer Normierung der Daten. Die Ergebnisse können unter Verwendung von beliebigen herkömmlichen Mitteln, zum Beispiel als eine Zahl oder ein Zahlenverhältnis usw., ausgedrückt werden.
  • Beispiele:
  • Die Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet, wenn es nicht anders angegeben ist, herkömmliche Techniken von synthetischer organischer Chemie, Biochemie, Molekularbiologie und dergleichen, die zum Fachwissen gehören. Derartige Techniken sind in der Literatur umfassend erläutert. Wenn es hier nicht anders definiert ist, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung auf, wie dieselben allgemein von Fachleuten verstanden werden, an die sich die Erfindung richtet.
  • Die folgenden Beispiele werden dargelegt, um Fachleuten eine vollständige Offenbarung und Beschreibung zu liefern, wie die Verfahren durchzuführen sind und die hier offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen zu verwenden sind. Es wurde Sorgfalt darauf verwandt, Genauigkeit bezüglich der Zahlen (zum Beispiel Mengen, Temperatur usw.) sicherzustellen, aber einige Fehler und Abweichungen können auftreten. Wenn es nicht anders angegeben ist, sind Teile Gewichtsteile, die Temperatur ist in °C, und der Druck liegt bei oder nahe dem atmosphärischen. Standardtemperatur und -druck sind als 20°C und 1 Atmosphäre definiert.
  • Experimentelle Verfahren:
  • Eine RNA-Ligation wurde mit synthetischen RNA-Oligonukleotiden (21–23 Nukleotide, Dharmacon) in Reaktionslösungen bewertet, die 0, 15, 20, 25 und 30% DMSO enthielten. Die Reaktionen, die 25% DMSO enthielten, wurden mit und ohne den Vorerhitzungsschritt untersucht. Vorratslösungen von 20 μM RNA-Oligonukleotiden wurden in 1 × TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTE) gelagert. Anfangsmischungen von RNA, DMSO und Wasser wurden zunächst zusammengestellt. Für vorerhitzte Proben enthielt die erhitzte Mischung 40–70% DMSO und wurde unter Verwendung eines 104°C-Heizblocks 1,5 bis 2 Minuten lang erhitzt. Die erhitzten Proben wurden sofort vor einer Endzusammenstellung für > 5 Minuten auf Eis gelegt. Die Endreaktion enthält 1 × Amersham Pharmacia RNA-Ligasepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 60 ng/μL BSA) 1 Einheit/μL T4-RNA-Ligase, 100 μM, 5'-Phosphat-Cytidyl-Phosphat-Cy5-3' (pCpCy5) oder 5'-Phosphat-Cytidyl-Phosphat-Cy3-3' (pCpCy3) (Dharmacon) und 2–4 μM RNA-Oligonukleotide. Die Reaktionen wurden über Nacht bei 16°C inkubiert. RNA-Ligase wurde durch ein Erhitzen der Reaktionslösungen unter Verwendung eines 104°C-Heizblocks für 1,5–2 Minuten inaktiviert, gefolgt von einem unmittelbaren auf Eis Legen für > 5 Minuten.
  • Der Markierungswirkungsgrad wurde durch eine 5'-Phosphorylierung von RNA-Ligationsreaktionsaliquoten mit radioaktivem P32-Gamma-ATP bestimmt. Die sich ergebende Mischung wurde mit Micro Bio-SpinTM (BioRad)-Entsalzungssäulen entsalzt. Die entsalzte Mischung wurde auf Denaturierungspolyacrylamidgel geladen. Da die Ligationsprodukte ein zusätzliches Nukleotid und Fluorophor enthalten, weisen dieselben eine geringere elektrophoretische Migrationsrate auf als die nicht ligierten Vorläufer. P32-markierte RNA-Bänder werden mit Phosphorimager (Phosphorbildvorrichtung) (Molecular Dynamics) visualisiert und quantitativ bestimmt. Der Ligationswirkungsgrad wurde durch das Verhältnis von ligierten gegenüber nicht ligierten P32-markierten RNA-Bändern bestimmt. Somit kann ein Ligationswirkungsgrad als Mol-% von anfänglicher RNA ausgedrückt werden, die schließlich eine angelagerte Markierungskomponente aufweist.
  • Beschreibung von Experimenten:
  • Bei den hier beschriebenen Experimenten wird T4-RNA-Ligase verwendet, um synthetische RNA-Oligonukleotide mit 5'-Phosphat-Cytidyl-Phosphat-Cy5-3' (pCpCy5) oder 5'-Phosphat-Cytidyl-Phosphat-Cy3-3' (pCpCy3) zu markieren. Bei den hier beschriebenen Reaktionsbedingungen wurde beobachtet, dass dieselben zu Ligationswirkungsgraden von etwa 60% oder mehr, zum Beispiel etwa 70% oder mehr oder 80% oder mehr bis zu etwa 95% oder mehr, zum Beispiel bis zu etwa 99% mit minimaler Sequenzdiskriminierung führen. Dies wurde durch ein Reagieren bei 25% DMSO, 16°C über Nacht, mit einem Donator-Akzeptor-Verhältnis von > 12,5:1 erreicht. Der Reaktionspuffer enthält 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 60 μg/mL BSA und 25% DMSO. Typische Reaktionen sind 10 μL mit 2 μM RNA, 100 μM pCpCy5 oder pCpCy3 und 4 Einheiten T4-RNA-Ligase (Amersham/Pharmacia). Der Reaktionswirkungsgrad schien von einem Erhöhen der RNA-Konzentration auf 8 μM oder einem Senken des Enzyms auf 2 Einheiten unbeeinflusst.
  • Der Markierungswirkungsgrad wurde durch zunächst ein Durchführen der Ligationsreaktion bestimmt. Eine Aliquote der Ligationsmischung wurde dann an dem 5'-Ende mit radioaktivem P32-γ-ATP und T4-Polynukleotidkinase markiert. Die Kontrollprobe, die keiner Ligationsreaktion unterzogen wurde, und die Endreaktionsmischung wurden mit Formamid denaturiert und mit einer Denaturierungspolyacrylamidgelelektrophorese (1× oder 0,5 × TBE, 50% Harnstoff; 15–20% Polyacrylamid mit einem Verhältnis von 19:1 Acrylamid zu Bisacrylamid, bei etwa 50°C) bewertet. Das sich ergebende Gel wurde mit Molecular Dynamics Storm Phosphorimager nach pCpCy5-markierter RNA abgetastet. Das Ligationsprodukt war deutlich als eine rot fluoreszierende miRNA sichtbar. Das Gel wurde dann einem Phosphorbildschirm (phosphor screen) ausgesetzt, um den pCpCy5-Markierungswirkungsgrad zu bestimmen. Da das Hinzufügen von pCpCy5 die Akezptor-miRNA um 1 Nukleotid und einen Fluorophor erhöht, war die Mobilität des cy5-markierten Stranges niedriger als bei dem nicht in Reaktion getretenen Strang. Dieselben erscheinen als separate Bänder, wenn dieselben in dem Phosphormodus an der Phosphorbildvorrichtung abgetastet werden; dies wurde ferner durch die relative Mobilität zwischen den mit Ligase in Reaktion getretenen Proben und nicht in Reaktion getretenen Vergleichsproben verifiziert (sowohl die mit Ligase in Reaktion getretenen Proben als auch die nicht in Reaktion getretenen Vergleichsproben wurden mit P32-γ-ATP markiert). Somit zeigt der relative Radioaktivitätspegel zwischen den Cy-markierten und nicht markierten Bändern den Ligationswirkungsgrad. Der Reaktionswirkungsgrad von pCpCy3 wurde auf ähnliche Weise bestimmt, mit der Ausnahme, dass der Cy3-markierte Strang durch den Fluoreszenzmodus der Phosphorbildvorrichtung nicht erfassbar war. Die Produkt- und Reaktant-miRNA-Bänder der Cy3-Reaktion wurden durch die Mobilität von Cy5-Reaktionen bei Polyacrylamidgelelektrophorese und Phosphorimager-Analyse definiert.
  • Der Ligationswirkungsgrad unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen wurde umfassend mit pCpCy5 und 4 getrennten synthetischen Oligonukleotiden (SEQ-ID-Nr.: 1–4) getestet, von denen jedes die gleiche Sequenz wie Drosophila-miRNA enthält (wie angezeigt): Tabelle 1: miRNAs Testprobe
    Figure 00390001
  • Diese miRNAs wurden mit 80–99%igem Wirkungsgrad markiert, wenn die Reaktionsmischung 95% (Molverhältnis) Konkurrenten enthielt, die aus anderen miRNAs und längeren einsträngigen RNAs (100–500 nts) zusammengesetzt waren. Somit ist es angemessen, einen hohen Markierungswirkungsgrad bei heterogenen biologischen RNA-Mischungen zu erwarten.
  • Nach der Optimierung von Markierungswirkungsgraden dieser RNAs mit Cy5 wurde die Markierungsreaktion erweitert, um die folgenden Sequenzen (SEQ-ID-Nr: 6–10) mit pCpCy5 und pCpCy3 in getrennten Studien zu umfassen. Diese zusätzlichen Stränge adressieren jegliche Verzerrung, die sich aus einem 3'-Endnukleotid, potentiellen sekundären Strukturen und dem Nukleotidgehalt der miRNA ergeben kann.
  • Tabelle 2: miRNAs zusätzliche Testprobe
    Figure 00390002
  • Potentiell kann das RNA-Ligaseverfahren für andere Farbstoffe als Cy5 und Cy3 verwendet werden, es kann jedoch sein, dass sich der Wirkungsgrad von den hier präsentierten unterscheidet. Außerdem ist es möglich, die Markierungswirkungsgrade jeder einzelnen miRNA eines gegebenen Satzes zu bestimmen und hochgradig quantitative Mikroarrayexperimente durch ein Korrelieren von Fluorophorzählwerten mit Molekülanzahl durchzuführen. Zum Beispiel ist es bei einem Arrayhybridisierungsexperiment, bei dem ein Array mit einer markierten RNA-Probe in Kontakt gebracht wird, möglich, die Gesamtmenge von Fluorophoren in einem gegebenen Bereich des Arrays durch ein Abfragen (oder Abtasten) des Arrays festzustellen; bei gegebenem Markierungswirkungsgrad der markierten RNA-Probe (der bestimmt wird, wie es hier offenbart ist) kann die Menge von RNA, die an den gegebenen Bereich des Arrays hybridisiert ist, bestimmt werden.
  • Ist gegeben, dass der näherungsweise Markierungswirkungsgrad bestimmt werden kann (wie es hier beschrieben ist), liefert die vorliegende Erfindung somit bei bestimmten Ausführungsbeispielen quantitative Verfahren zum Durchführen von Arrayhybridisierungsexperimenten. Es wird erwartet, dass dies ein empfindlicheres Untersuchungssystem für die Erfassung von Schwankungen von miRNA liefert, wie dieselben zum Beispiel in Entwicklungsstadien, Gewebsproben, Krankheitszuständen und bei beliebigen individuellen und/oder anormalen Veränderungen zu finden sind. Falls außerdem mehr virale miRNAs identifiziert werden, kann dies zu einem neuartigen Diagnosewerkzeug für aktive sowie latente Virusinfektionen werden.
  • Bestimmung des Markierungswirkungsgrads von miRNAs bei komplexen Proben:
    RNA-Ligase wird verwendet, um eine komplexe RNA-Mischung zu markieren, wie zum Beispiel die Gesamt-RNA oder isolierte Mischungen von kleinen RNAs aus biologischen Proben. Die markierten Mischungen werden auf Denaturierungspolyacrylamidgel laufen gelassen, und Northern-Blots werden von einzelnen miRNAs mit radioaktiven Sonden durchgeführt. Die RNAs, die durch RNA-Ligase markiert sind, weisen eine geringere Mobilität relativ zu ihrem nicht markierten Gegenstück auf. Somit läuft jede Zielsequenz als ein Dublett, wenn dieselbe durch Northern-Blot sondiert wird. Das Verhältnis von RNA-Spezies bei diesen Dubletten reflektiert das Molverhältnis der RNA-Ligase-markierten gegenüber den nicht markierten RNA-Spezies.
  • Mikroarrayhybridisierung:
  • Die im Vorhergehenden dargelegte synthetische miRNA wurde entweder mit Cy5 oder Cy3 markiert und folgendermaßen auf Mikroarrays hybridisiert:
    Markierte miRNA wurde mit BioRad Micro Bio-SpinTM 6 entsalzt (wie durch BioRad-Anleitungen angewiesen), um freie Fluoreszenz-Tags zu entfernen. Die entsalzte miRNA wurde zu einer Lösung hinzugefügt, die Wasser und Träger enthielt (25-mer-DNA mit zufälliger Sequenz). Die Lösung wurde etwa 1 Minute lang pro 10 μl Lösung bei 100°C erhitzt und sofort auf Eis gelegt. Nach dem Abkühlen wurde 2 × Agilent Hyb Buffer (1225 mM LiCl, 300 mM Li-MES, pH 6,1, 12 mM EDTE, 3,0% (Gew./Vol.) Lithiumdodecylsulfat, 2,0% (Gew./Vol.) Triton X-100) zu der Mischung hinzugefügt, und die viskose Flüssigkeit wurde sorgfältig gemischt. Die Endlösung enthielt 1 × Hyb-Puffer und 0,1 μg/μl Zufalls-25-mer. Die Konzentration von miRNA war für unterschiedliche Experimente verschieden.
  • Die Hybridisierung wurde mit einer SureHyb-Hybridisierungskammer (Agilent Artikelnummer: G2534A) durchgeführt und über Nacht auf die Rotisserie eines Hybridisierungsofens platziert. Die Hybridisierungtemperatur wurde bei 50°C und 60°C getestet.
  • Nachdem die Hybridisierung abgeschlossen war, wurde der Sure-Hyb-Kammerkomplex aus dem Ofen entfernt und sofort in Waschpuffer 1 (6 × SSC, 0,005% Triton X-102) bei Zimmertemperatur zerlegt. Das Mikroarray wurde in eine frische Waschkammer verlegt, die Waschpuffer 1 enthielt, und durch Rühren für 10 Minuten bei Zimmertemperatur gewaschen. Das Mikroarray wurde dann in Waschpuffer 2 (0,1 × SSC, 0,005% Triton X-102) durch Rühren bei Zimmertemperatur für 5 Minuten gewaschen. Das Mikroarray wurde nach dem Waschen langsam aus der Waschkammer herausgehoben und nach Bedarf mit Stickstoff getrocknet. Die Mikroarrays wurden mit Agilent Scanner (Abtastvorrichtung) (Agilent Produktnummer: G2565BA) abgetastet. Die abgetasteten Daten wurden mit Agilent Feature Extraction Software (Merkmalsextraktionssoftware) (Agilent Produktnummer: G2567AA) extrahiert, und die Grün- und Rothintergrund-subtrahierten Signale wurden bezüglich Hybridisierungswirkungsgrad und Spezifität ausgewertet. Daten wurden ferner unter Verwendung von Spotfire-Software und Microsoft Excel analysiert.
  • Obwohl die vorhergehenden Ausführungsbeispiele der Erfindung zum Zweck der Erstellung einer vollständigen Offenbarung der Erfindung in beträchtlichem Detail dargelegt wurden, ist es für Fachleute ersichtlich, dass zahlreiche Veränderungen an derartigen Details vorgenommen werden können, ohne von der Wesensart und den Prinzipien der Erfindung abzuweichen. Dementsprechend soll die Erfindung nur durch die folgenden Ansprüche beschränkt sein.
  • Alle Patente, Patentanmeldungen und Veröffentlichungen, die hier erwähnt wurden, sind hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen, vorausgesetzt, dass, falls ein Definitionskonflikt vorliegt, die hier bereitgestellten Definitionen gelten.

Claims (20)

  1. Verfahren zum Markieren von RNA (102, 202) in einer Probe, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: Kontaktieren der Probe mit einem Enzym (114, 214), das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, bei Vorhandensein eines markierten Substrats (110A, 110B, 110C, 210A, 210B) unter Bedingungen, die ausreichend sind, um zu einer Kopplung des markierten Substrats mit der RNA in der Probe zu führen, um markierte RNA (118A, 118B, 118C, 218A, 218B) zu liefern, wobei die Bedingungen eine DMSO-Konzentration in dem Bereich von 20% bis 30% umfassen, wobei das markierte Substrat eine beobachtbare Markierungskomponente aufweist, die an eine Nukleotidkomponente angelagert ist, und wobei das Verfahren ferner vor dem Kontaktieren ein Erhitzen der Probe auf zumindest 80°C unter Bedingungen aufweist, die zumindest 40% DMSO umfassen.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Nukleotidkomponente aus einer Mononukleotidkomponente oder einer Oligonukleotidkomponente ausgewählt ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Nukleotidkomponente eine Länge in dem Bereich von 2 bis 50 Basen aufweist.
  4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die RNA (102) in der Probe isolierte RNA aufweist, die eine Länge von weniger als 500 Basen aufweist.
  5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die RNA (102) in der Probe isolierte RNA aufweist, die eine Länge von weniger als 200 Basen aufweist.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem das markierte Substrat (110A, 110B, 110C) folgende Struktur aufweist: N-D wobei N aus einer Mononukleotidkomponente oder einer Oligonukleotidkomponente ausgewählt ist, die eine Länge von weniger als 100 Basen aufweist, und D eine beobachtbare Markierungskomponente ist, die an N angelagert ist.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem N ein 5'-Ende, ein 3'-Ende und eine interne Anlagerungsstelle aufweist, wobei D über eine Stelle, die aus dem 5'-Ende, dem 3'-Ende und der internen Anlagerungsstelle ausgewählt ist, an N angelagert ist.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die beobachtbare Markierungskomponente aus einer chromogenen Komponente, einem Fluorophor, einer Massenmarkierung, einer Spinmarkierung oder einer Radiomarkierung ausgewählt ist.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die beobachtbare Markierungskomponente ein Fluorophor (111) ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cy3, Cy5 oder einen Alexa-Farbstoff umfasst.
  10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Nukleotidkomponente ein freies 5'-Phosphat und ein 3'-Ende aufweist, das an die beobachtbare Markierungskomponente gebunden ist.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Nukleotidkomponente ein freies 3'-OH und ein 5'-Ende aufweist, das an die beobachtbare Markierungskomponente gebunden ist.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem das markierte Substrat (110A, 110B, 110C, 210A, 210B) eine Mehrzahl von beobachtbaren Markierungskomponenten aufweist, und die markierte RNA (118A, 118B, 118C, 218A, 218B) im Wesentlichen RNA umfasst, die mit einer Mehrzahl von Markierungskomponenten markiert ist.
  13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem das markierte Substrat (110A, 110B, 110C) eine einzige beobachtbare Markierungskomponente aufweist, und die markierte RNA (118A, 118B, 118C) im Wesentlichen einfach markierte RNA umfasst.
  14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem die markierte RNA (118A, 118B, 118C) zumindest 70% der Anfangs-RNA in der Probe beträgt.
  15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem die Dauer des Erhitzens zumindest 10 Sekunden beträgt.
  16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, das ferner vor dem Kontaktieren der Probe mit dem Enzym (114), das eine RNA-Ligationsaktivität aufweist, ein Kontaktieren der Probe mit einem Enzym aufweist, das eine 5'-Phosphataseaktivität aufweist, um 5'-Phosphatgruppen von der RNA in der Probe zu entfernen.
  17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, bei dem das Enzym in der Lage ist, eine Spezies, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die ein Nukleotid, das ein 5'-Phosphat aufweist, ein Oligonukleotid, das ein 5'-Phosphat aufweist, und eine RNA, die ein 5'-Phosphat aufweist, umfasst, mit einem Oligonukleotid zu koppeln, das ein 3'-Hydroxyl aufweist.
  18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem das Enzym aus T4-RNA-Ligase, RNA-Ligase II, Hefe-Poly-A-Polymerase, E.coli-Poly-A-Polymerase oder terminaler Transferase ausgewählt ist.
  19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem das Enzym T4-RNA-Ligase ist.
  20. Verfahren zum Durchführen einer Arrayanalyse, das folgende Schritte aufweist: Markieren von RNA (102) in einer Probe unter Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1, um die markierte RNA (118A, 118B, 118C) zu liefern; Kontaktieren der markierten RNA mit einem Array unter Bedingungen, die ausreichend sind, um eine spezifische Bindung von markierter RNA an das Array zu liefern; und Abfragen des Arrays, um Daten bezüglich der Bindung der markierten RNA an das Array zu liefern.
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