DE60011178T2

DE60011178T2 - Amplifikation und Detektion von Yersina enterocolitica

Info

Publication number: DE60011178T2
Application number: DE60011178T
Authority: DE
Inventors: Qimin Lutherville You; Thomas L. Finksburg Fort
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1999-04-12
Filing date: 2000-03-02
Publication date: 2005-06-09
Anticipated expiration: 2020-03-03
Also published as: EP1045031A3; US6197514B1; EP1045031A2; EP1045031B1; JP2000342283A; DE60011178D1; CA2303303A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Yersinia enterocolitica in Patienten, Nahrungsmitteln oder Wasser. Das Verfahren beinhaltet die Verwendung von Nucleinsäureprimern, um spezifisch ein yst-Gen-Ziel von Y. enterocolitica zu amplifizieren, wobei vorzugsweise eine der folgenden Techniken zur Anwendung kommt: Strangverdrängungsamplifikation (SDA), thermophile Strangverdrängungsamplifikation (tSDA) oder Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA, wobei wahlweise ein mikroelektronisches Array verwendet wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Drei Spezies von Yersinia sind bekanntermaßen Humanpathogene, Y. enterocolitica, Y. pestis und Y. pseudotuberculosis. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf den Nachweis von Y. enterocolitica über Amplifikation und Nachweis einer DNA-Sequenz innerhalb des yst-Gens. Y. enterocolitica ist ein invasives enterisches Pathogen, das hämorrhagische Enterocolitis, terminale Ileitis, mesenterische Lymphadenitis und Septikämie verursachen kann. Nucleinsäureamplifikation ist eine leistungsfähige Technologie, die einen schnellen Nachweis spezifischer Zielsequenzen ermöglicht. Sie ist daher bei der schnellen Detektion und Identifikation von Y. enterocolitica einsetzbar. Die Oligonucleotidprimer der vorliegenden Erfindung sind auf Nucleinsäureamplifikation und Nachweis von Y. enterocolitica anwendbar.
Die internationale Anmeldung WO-A-9311264 offenbart ein Amplifikationsverfahren zum Nachweis von Y. enterocolitica.
Die folgenden Begriffe werden hier wie folgt definiert:
Ein Amplifikationsprimer ist ein Primer zur Amplifikation einer Zielsequenz durch Verlängerung des Primers nach Hybridisierung an die Zielsequenz. Amplifikationsprimer sind typischerweise etwa 10–75 Nucleotide lang, vorzugsweise etwa 15–50 Nucleotide lang. Die Gesamtlänge eines Amplifikationsprimers für die SDA beträgt typischerweise etwa 25–50 Nucleotide. Das 3'-Ende eines SDA-Amplifikationsprimers (die Zielbindungssequenz) hybridisiert an das 3'-Ende der Zielsequenz. Die Zielbindungssequenz ist etwa 10–25 Nucleotide lang und verleiht dem Amplifikationsprimer Hybridisierungsspezifität. Der SDA-Amplifikationsprimer umfaßt ferner 5' zur Zielbindungssequenz eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease. Die Erkennungsstelle ist für eine Restriktionsendonuclease, welche einen Strang eines DNA-Doppelstranges nicken wird, wenn die Erkennungsstelle hemimodifiziert ist, wie von G. Walker et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392–396 und 1992 Nucl. Acids Res. 20: 1691–1696) beschrieben. Die Nucleotide 5' zur Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle (der "Schwanz") fungieren als eine Polymerase-Repriming-Stelle, wenn der Rest des Amplifikationsprimers während der SDA genickt und verdrängt wird. Die Repriming-Funktion der Schwanznucleotide erhält die SDA-Reaktion aufrecht und ermöglicht die Synthese mehrerer Amplikons von einem einzigen Zielmolekül. Der Schwanz ist typischerweise 10–25 Nucleotide lang. Seine Länge und Sequenz sind im allgemeinen nicht entscheidend und können routinemäßig ausgewählt und modifiziert werden. Da die Zielbindungssequenz der Teil eines Primers ist, der seine Ziel-Spezifität bestimmt, besteht bei Amplifikationsverfahren, die keine spezialisierten Sequenzen an den Enden des Ziels erfordern, der Amplifikationsprimer gewöhnlich im wesentlichen nur aus der Zielbindungssequenz., Zum Beispiel wird die Amplifikation einer erfindungsgemäßen Zielsequenz mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Amplifikationsprimer verwenden, die aus den Zielbindungssequenzen der hierin beschriebenen Amplifikationsprimer bestehen. Bei Amplifikationsverfahren, die andere an das Ziel angehängte spezialisierte Sequenzen erfordern als die nickbare Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle und den Schwanz der SDA (z.B. einen RNA-Polyrnerase-Promotor für selbstunterhaltende Sequenzreplikation (3SR), nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) oder das auf Transkription beruhende Amplifikationssystem (TAS)) kann die erforderliche spezialisierte Sequenz mittels Routineverfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden mit der Zielbindungssequenz verbunden werden, ohne die Hybridisierungsspezifität des Primers zu verändern.
Ein Bumper-Primer oder externer Primer ist ein Primer, der dazu verwendet wird, Primerverlängerungsprodukte bei isothermen Amplifikationsreaktionen zu verdrängen. Der Bumper-Primer bindet an eine Zielsequenz stromaufwärts vom Amplifikationsprimer, so daß die Verlängerung des Bumper-Primers den stromabwärtigen Amplifikationsprimer und sein Verlängerungsprodukt verdrängt.
Die Begriffe Ziel oder Zielsequenz bezeichnen zu amplifizierende Nucleinsäuresequenzen. Diese umfassen die ursprüngliche zu amplifizierende Nucleinsäuresequenz, den komplementären zweiten Strang der ursprünglichen zu amplifizierenden Nucleinsäuresequenz und jeden Strang einer Kopie der ursprünglichen Sequenz, der durch die Amplifikationsreaktion erzeugt wird. Diese Kopien dienen als amplifizierbare Ziele aufgrund der Tatsache, daß sie Kopien der Sequenz enthalten, an welche die Amplifikationsprimer hybridisieren.
Kopien der Zielsequenz, die während der Amplifikationsreaktion erzeugt werden, werden als Amplifikationsprodukte, Amplimere oder Amplikons bezeichnet. Der Begriff Verlängerungsprodukt bezeichnet die Kopie einer Zielsequenz, die durch Hybridisierung eines Primers und Verlängerung des Primers durch Polymerase mittels der Zielsequenz als Matrize erzeugt wird.
Der Begriff artspezifisch bezeichnet die Detektion, Amplifikation oder Oligonucleotid-Hybridisierung bei einer Art von Organismen oder einer Gruppe verwandter Arten ohne wesentliche Detektion, Amplifikation oder Oligonucleotid-Hybridisierung bei anderen Arten der gleichen Gattung oder Arten einer anderen Gattung.
Der Begriff Testsonde bezeichnet jedes Oligonucleotid, das dazu verwendet wird, den Nachweis oder die Identifizierung einer Nucleinsäure zu erleichtern.
Detektorsonden, Detektorprimer, Fangsonden, Signalprimer und Reportersonden, wie sie nachstehend beschrieben werden, sind Beispiele für Testsonden.
Der Begriff Amplikon bezeichnet das Produkt der Amplifikationsreaktion, das durch die Verlängerung eines oder beider Primer eines Paares von Amplifikationsprimern erzeugt wird. Ein Amplikon kann exponentiell amplifizierte Nucleinsäuren enthalten, wenn beide verwendeten Primer an eine Zielsequenz hybridisieren. Alternativ können Amplikons durch lineare Amplifikation erzeugt werden, wenn einer der verwendeten Primer nicht an die Zielsequenz hybridisiert. Somit wird dieser Begriff hierin generisch verwendet und impliziert nicht das Vorliegen exponentiell amplifizierter Nucleinsäuren.
Ein mikroelektronisches Array (oder elektronisches Mikroarray) ist eine Vorrichtung mit einem Array elektronisch selbstadressierbarer mikroskopischer Lokationen. Jede mikroskopische Lokation umfaßt eine zugrundeliegende Arbeits-Gleichstrom(DC)-Mikroelektrode, die von einem Substrat getragen wird. Die Oberfläche von jeder Mikrolokation weist eine Permeationsschicht für den freien Transport kleiner Gegenionen und eine Bindeschicht für die kovalente Kopplung spezifischer Bindungseinheiten auf.
Ein Array oder eine Matrix ist eine Anordnung von Lokationen auf der Vorrichtung. Die Lokationen können in zweidimensionalen Arrays, dreidimensionalen Arrays oder anderen Matrixformaten angeordnet sein. Die Zahl der Lokationen kann sich zwischen einigen und wenigstens Hunderttausenden bewegen.
Elektronisches Adressieren (oder Targeting) ist die Plazierung geladener Moleküle an spezifischen Testorten. Da DNA eine starke negative Ladung besitzt, kann sie elektronisch zu einem Bereich mit positiver Ladung bewegt werden. Ein Testort oder eine Reihe von Testorten auf dem Mikrochip wird mit einer positiven Ladung elektronisch aktiviert. Auf den Mikrochip wird eine Lösung von DNA-Sonden gegeben. Die negativ geladenen Sonden bewegen sich schnell zu den positiv geladenen Orten, wo sie sich konzentrieren und chemisch an diesen Ort gebunden werden. Der Mikrochip wird dann gewaschen, und es kann eine andere Lösung verschiedener DNA-Sonden zugesetzt werden. Ort für Ort, Reihe für Reihe kann ein Array spezifisch gebundener DNA-Sonden auf dem Mikrochip zusammengefügt oder adressiert werden. Mit der Möglichkeit, Fangsonden elektronisch an spezifische Orte zu adressieren, erlaubt das System die Herstellung maßgeschneiderter Arrays durch die Plazierung spezifischer Fangsonden auf einem Mikrochip. In diesem Zusammenhang bezeichnet der Begriff "elektronisch adressierbar" das Vermögen eines Mikrochips, Substanzen wie Nucleinsäuren und Enzyme sowie andere Amplifikationskomponenten durch elektronische Vorspannung der Fangorte des Chips auf dem Mikrochip von einer Position zur anderen zu lenken. "Elektronische Vorspannung" soll bedeuten, daß die elektronische Ladung an einem Fangort oder einer anderen Position auf dem Mikrochip zwischen einer netto positiven und einer netto negativen Ladung manipuliert werden kann, so daß Moleküle in Lösung und in Kontakt mit dem Mikrochip zu einer Position auf dem Mikrochip hin oder von dieser weg oder von einer Position zu einer anderen gelenkt werden können.
Elektronische Konzentrierung und Hybridisierung verwendet Elektronik, um Zielmoleküle zu einem oder mehreren Testorten (oder Fangorten) auf dem Mikrochip zu bewegen und dort zu konzentrieren. Die elektronische Konzentrierung von Proben-DNA an jedem Testort fördert die schnelle Hybridisierung von Proben-DNA mit komplementären Fangsonden. Im Gegensatz zum passiven Hybridisierungsprozeß besitzt der elektronische Konzentrierungsprozeß den klaren Vorteil einer erheblichen Beschleunigung der Hybridisierungsgeschwindigkeit. Zur Entfernung jeglicher ungebundenen oder unspezifisch gebundenen DNA von jedem Ort wird die Polarität oder Ladung des Ortes in negativ umgekehrt und dadurch jede ungebundene oder unspezifisch gebundene DNA von den Fangsonden weg in die Lösung zurückgetrieben. Überdies ist, da die Testmoleküle über dem Testort elektronisch konzentriert werden, eine geringere Konzentration an Ziel-DNA-Molekülen erforderlich, wodurch die sonst vor dem Test für eine Probenaufbereitung erforderliche Zeit und Arbeit reduziert wird. Der Begriff "Fangort" bezeichnet eine spezifische Position auf einem elektronisch adressierbaren Mikrochip, an die elektronische Vorspannung angelegt wird und wo Moleküle wie Nucleinsäuresonden und -zielmoleküle durch eine solche Vorspannung angezogen oder adressiert werden.
Elektronische Stringenzkontrolle ist die Umkehr des elektrischen Potentials, um ungebundene und unspezifisch gebundene DNA schnell und leicht als Teil des Hybridisierungsprozesses zu entfernen. Elektronische Stringenz schafft eine Qualitätskontrolle für den Hybridisierungsprozeß und stellt sicher, daß alle gebundenen DNA-Paare wirklich komplementär sind. Die Präzision, Steuerung und Genauigkeit von Plattformtechnologie durch die kontrollierte Stromabgabe in dem elektronischen Stringenzprozeß ermöglicht den Nachweis einzelner Punktmutationen, einzelner Basenfehlpaarungen oder anderer genetischer Mutationen, der bei etlichen diagnostischen Anwendungen und Forschungsanwendungen eine erhebliche Bedeutung haben kann. Elektronische Stringenz wird ohne die beschwerliche Aufbereitung und Behandlung erreicht, die sonst zur Erzielung der gleichen Ergebnisse durch herkömmliche Verfahren erforderlich sind. Im Gegensatz zu passiven Arrays kann diese Technologie sowohl kurzen als auch langen einzelsträngigen DNA-Fragmenten gerecht werden. Die Verwendung längerer Sonden erhöht die Sicherheit, daß die DNA, die mit der Fangsonde hybridisiert, das richtige Ziel ist. Elektronische Stringenzkontrolle verringert die erforderliche Anzahl an Sonden und daher Testorten auf dem Mikrochip verglichen mit herkömmlichen DNA-Arrays. Traditionelle passive Hybridisierungsverfahren sind dagegen schwer zu kontrollieren und erfordern mehr Replikate jeder möglichen Basenpaarung, so daß korrekte Paarungen definitiv identifiziert werden können.
Elektronisches Multiplexing ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Tests von einer einzigen Probe. Elektronisches Multiplexing wird erleichtert durch die Möglichkeit, einzelne Testorte unabhängig voneinander zu steuern (zwecks Adressierung von Fangsonden oder Fangmolekülen und Konzentrierung von Testprobenmolekülen), was die gleichzeitige Verwendung biochemisch nichtverwandter Moleküle auf dem gleichen Chip gestattet. Orte auf einem konventionellen DNA-Array können nicht einzeln kontrolliert werden, und es müssen daher auf dem gesamten Array die gleichen Verfahrensschritte durchgeführt werden. Die Verwendung von Elektronik bei dieser Technologie schafft eine über solche herkömmlichen Verfahren hinausreichende größere Vielseitigkeit und Flexibilität.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Oligonucleotidprimer bereit, die zur Amplifikation von Zielsequenzen verwendet werden können, welche in Y. enterocolitica vorkommen. Die Zielsequenz umfaßt, genauer gesagt, Segmente des yst-Gens. Die Amplifikationsprimer sind für eine hocheffiziente, hochspezifische Amplifikation bei hohen Temperaturen wie bei der tSDA und der PCR konstruiert worden, sind jedoch ebenfalls in Amplifikationsreaktionen von niedrigerer Temperatur wie der herkömmlichen SDA, 3SR oder NASBA brauchbar. Zum Nachweis der Amplifikationsprodukte werden Oligonucleotid-Testsonden verwendet, die mit der Testregion des amplifizierten Ziels hybridisieren.
Die Oligonucleotide der Erfindung können nach einer Kultivierung als Mittel zur Bestätigung der Identität des kultivierten Organismus verwendet werden. Alternativ können sie mit klinischen Proben von Menschen oder Tieren wie Fäkalmaterial oder Urin oder mit Proben von kontaminierter Nahrung oder kontaminiertem Wasser zum Nachweis und zur Identifizierung von Y.-enterocolitica-Nucleinsäure mittels bekannter Amplifikationsverfahren verwendet werden. In jedem Fall liefern die erfindungsgemäßen Oligonucleotide und Testverfahren ein Mittel zur schnellen Unterscheidung zwischen Y. enterocolitica und anderen Mikroorganismen, wobei sie es dem Praktiker ermöglichen, schnell diesen Mikroorganismus zu identifizieren, ohne auf die eher traditionellen Verfahren zurückzugreifen, auf die man sich üblicherweise stützt. Eine solche schnelle Identifizierung des spezifischen, an einer Infektion beteiligten ätiologischen Agens liefert Informationen, die dazu verwendet werden können, innerhalb einer kurzen Zeitspanne die geeignete Maßnahme zu bestimmen.
ZUSAMMENFASSUNG DER SEQUENZEN
SEQ ID NOs: 1–3 sind Sequenzen von Oligonucleotiden, die als stromaufwärtige Primer zur Amplifikation des yst-Gens verwendet werden. SEQ ID NOs: 4–6 sind Sequenzen von Oligonucleotiden, die als stromabwärtige Primer zur Amplifikation des yst-Gens verwendet werden. SEQ ID NO: 7 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als ein stromaufwärtiger Bumper zur SDA-Amplifikation verwendet wird. SEQ ID NO: 8 ist die Sequenz eines Oligonucleotids, das als ein stromabwärtiger Bumper zur SDA-Amplifikation verwendet wird. SEQ ID NOs: 9–10 sind Sequenzen von Detektor-Oligonucleotiden (Sonden oder Reportern) für das yst-Gen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonucleotide, Amplifikationsprimer und Testsonden, welche in Nucleinsäure-Amplifikationsreaktionen Y.-enterocolitica-Spezifität zeigen. Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Y.-enterocolitica-Nucleinsäuren mittels der Oligonucleotide der Erfindung. Die bevorzugten Verfahren sind die Verwendung von SDA, tSDA oder homogener Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA. Diese Verfahren sind dem Fachmann aus Quellen wie US-Patent Nr. 5,547,861, US-Patent Nr. 5,648,211 und US-Patent Nr. 5,846,726 bekannt. Die Verwendung mikroelektronischer Arrays zur Analyse von Nucleinsäuren ist dem Fachmann aus Quellen wie US-Patent Nr. 5,605,662 und US-Patent Nr. 5,632,957 und den veröffentlichten PCT-Anmeldungen Nr. WO 96/01836 und WO 97/12030 bekannt.
Die Primer der vorliegenden Erfindung wurden auf der Basis einer Analyse der yst-Gensequenzdaten mehrerer Quellen konstruiert, die zwecks Primerkonstruktion alight wurden, um Y.-enterocolitica-spezifische Regionen zu identifizieren. Die zur Verwendung in der SDA entwickelten Primer sind in Tabelle 1 dargestellt. Ebenfalls dargestellt sind Sonden zum Nachweis der resultierenden Amplikons. Die exemplarischen Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen (BsoBI) in den Amplifikationsprimern sind fett gedruckt und die Zielbindungssequenzen sind kursiv gedruckt. Die Zielbindungssequenz eines Amplifikationsprimers bestimmt seine Zielspezifität.
TABELLE 1 Amplifikations-Oligonucleotide
Da Nucleinsäuren zur Hybridisierung keine völlige Komplementarität benötigen, versteht sich, daß die hier offenbarten Sonden- und Primersequenzen in gewissem Ausmaß modifiziert werden können, ohne daß die Brauchbarkeit als Y.-enterocoliticaspezifische Sonden und Primer verlorengeht. Wie auf dem Fachgebiet bekannt, kann die Hybridisierung komplementärer und teilweise komplementärer Nucleinsäuresequenzen durch Anpassung der Hybridisierungsbedingungen zur Erhöhung oder Verringerung von Stringenz erreicht werden (d:h. Anpassung von pH, Temperatur oder Salzgehalt des Hybridisierungspuffers). Solche geringfügigen Modifikationen der offenbarten Sequenzen und jegliche notwendigen Anpassungen der Hybridisierungsbedingungen zur Beibehaltung der Y.-enterocolitica-Spezifität erfordern lediglich routinemäßiges Experimentieren und sind Bestandteil des gewöhnlichen Fachwissens.
Die mittels der hier offenbarten Primer erzeugten Amplifikationsprodukte können durch eine charakteristische Größe nachgewiesen werden, zum Beispiel auf Polyacrylamid- oder Agarosegelen, die mit Ethidiumbromid gefärbt sind. Alternativ können amplifizierte Zielsequenzen mittels einer Testsonde nachgewiesen werden, die ein Oligonucleotid ist, das mit einer detektierbaren Markierung versehen ist. Bei einer Ausführungsform kann wenigstens eine markierte Testsonde zum Nachweis amplifizierter Zielsequenzen durch Hybridisierung (eine Detektorsonde), durch Hybridisierung und Verlängerung, wie von Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res., 20: 1691–1696) beschrieben, (ein Detektorprimer) oder durch Hybridisierung, Verlängerung und Umwandlung in die doppelsträngige Form, wie in EP 0 678 582 beschrieben, (ein Signalprimer) verwendet werden. SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 sind in Verbindung mit den Amplifikationsprimern der Erfindung besonders gut als Detektorprimer, d.h. Primerverlängerungs-Detektorsonden, zum Nachweis von Y. enterocolitica brauchbar. Vorzugsweise wird die Testsonde so ausgewählt, daß sie an eine Sequenz in dem Ziel hybridisiert, die sich zwischen den Amplifikationsprimern befindet, d.h., sie sollte eine innere Testsonde sein. Alternativ können ein Amplifikationsprimer oder dessen Zielbindungssequenz als Testsonde Verwendung finden.
Die detektierbare Markierung der Testsonde ist ein Anteil, der entweder direkt oder indirekt als Indiz für die Anwesenheit der Zielnucleinsäure nachgewiesen werden kann. Für den direkten Nachweis der Markierung können Testsonden mit einem Radioisotop markiert und durch Autoradiographie detektiert werden oder mit einem fluoreszierenden Anteil markiert und durch Fluoreszenz detektiert werden, wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist. Alternativ können die Testsonden indirekt nachgewiesen werden, indem sie mit einer Markierung versehen werden, die zusätzliche Reagenzien erfordert, um sie detektierbar zu machen. Indirekt nachweisbare Markierungen umfassen zum Beispiel chemilumineszierende Agenzien, Enzyme, die sichtbare Reaktionsprodukte erzeugen, und Liganden (z.B. Haptene, Antikörper oder Antigene), die durch Bindung an markierte spezifische Bindungspartner (z.B. Antikörper oder Antigene/Haptene) detektiert werden können. Liganden sind auch zur Immobilisierung des ligandenmarkierten Oligonucleotids (der Fangsonde) auf einer festen Phase brauchbar, um dessen Nachweis zu erleichtern. Besonders nützliche Markierungen umfassen Biotin (nachweisbar durch Bindung an markiertes Avidin oder Streptavidin) und Enzyme wie Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase (nachweisbar durch Zugabe von Enzymsubstraten zur Erzeugung farbiger Reaktionsprodukte). Verfahren zum Anfügen solcher Markierungen an oder Einfügen solcher Markierungen in Oligonucleotide sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt, und jedes dieser Verfahren eignet sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
Beispiele für spezifische Nachweisverfahren, die verwendet werden können, schließen ein Chemilumineszenzverfahren ein, bei dem amplifizierte Produkte mittels einer biotinylierten Fangsonde und einer enzymkonjugierten Detektorsonde, wie in dem U.S.-Patent Nr. 5,470,723 beschrieben, detektiert werden. Nach Hybridisierung dieser beiden Testsonden an verschiedene Stellen in der Testregion der Zielsequenz (zwischen den Bindungsstellen der zwei Amplifikationsprimer) wird der Komplex auf einer streptavidinbeschichteten Mikrotiterplatte mittels der Fangsonde eingefangen, und es wird das Chemilumineszenzsignal entwickelt und in einem Luminometer gelesen. Als weitere Alternative für den Nachweis von Amplifikationsprodukten kann ein Signalprimer, wie er in EP 0 678 582 beschrieben ist, in die SDA-Reaktion einbezogen werden. Bei dieser Ausführungsform werden während der SDA zielamplifikationsabhängig markierte sekundäre Amplifikationsprodukte erzeugt und können als ein Indiz für Zielamplifikation mittels der zugehörigen Markierungen detektiert werden.
Zu praktischen Zwecken im Handel können Amplifikationsprimer zum spezifischen Nachweis und zur Identifizierung von Nucleinsäuren in Form eines Kits abgepackt werden. Typischerweise enthält ein solcher Kit wenigstens ein Paar von Amplifikationsprimern. Reagenzien zur Durchführung einer Nucleinsäure-Amplifikationsreaktion können ebenfalls mit den zielspezifischen Amplifikationsprimern mitgeliefert werden, zum Beispiel Puffer, zusätzliche Primer, Nucleotidtriphosphate, Enzyme etc. Die Bestandteile des Kits werden zusammen in einem gemeinsamen Behälter abgepackt, wobei fakultativ Anweisungen zur Durchführung einer speziellen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren mitgeliefert werden. Es können auch weitere fakultative Bestandteile in dem Kit enthalten sein, z.B. ein Oligonucleotid, das mit einer Markierung versehen ist, die sich zur Verwendung als Testsonde eignet, und/oder Reagenzien oder Mittel zur Detektion der Markierung.
Die Zielbindungssequenzen der Amplifikationsprimer verleihen den Oligonucleotiden Hybridisierungs-Artspezifität und verleihen daher der Amplifikationsreaktion Artspezifität. Somit sind die Zielbindungssequenzen der Amplifikationsprimer der Erfindung auch, in anderen Nucleinsäureamplifikationsprotokollen wie PCR, konventioneller SDA (ein Reaktionsschema, das im wesentlichen dem der tSDA entspricht, jedoch bei niedrigeren Temperaturen unter Verwendung mesophiler Enzyme durchgeführt wird), 3SR, NASBA und TAS brauchbar. Insbesondere kann jedes Amplifikationsprotokoll, das zyklische, spezifische Hybridisierung von Primern an die Zielsequenz, Verlängerung der Primer mittels der Zielsequenz als Matrize und Abtrennung oder Verdrängung der Verlängerungsprodukte von der Zielsequenz anwendet, die Zielbindungssequenzen der Erfindung verwenden. Für Amplifikationsverfahren, die keine spezialisierten Nicht-Zielbindungssequenzen erfordern (z.B. PCR) können die Amplifikationsprimer lediglich aus der Zielbindungssequenz der in Tabelle 1 angeführten Amplifikationsprimer bestehen.
Den hier offenbarten Zielbindungssequenzen können wahlweise weitere Sequenzen, wie sie zur Durchführung einer gewählten Amplifikationsreaktion erforderlich sind, hinzugefügt werden, ohne die Artspezifität der Oligonucleotide zu verändern. Beispielsweise können die spezifischen Amplifikationsprimer eine Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease BsoBI enthalten, die während der SDA-Reaktion genickt wird. Für den Fachmann wird ersichtlich sein, daß die BsoBI-Erkennungsstelle gegen andere nickbare Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen austauschbar ist, eingeschlossen, jedoch nicht beschränkt auf die in EP 0 684 315 offenbarten Erkennungsstellen. Vorzugsweise handelt es sich um eine Erkennungsstelle für eine thermophile Restriktionsendonuclease, so daß die Amplifikationsreaktion unter den Bedingungen einer tSDA durchgeführt werden kann. Desgleichen ist die Schwanzsequenz des Amplifikationsprimers (5' zur Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle) im allgemeinen nicht entscheidend,. obwohl die für die SDA verwendete Restriktionsstelle und Sequenzen, die entweder an ihre eigene Zielbindungssequenz oder an die anderen Primer hybridisieren, vermieden werden sollten. Einige Amplifikationsprimer für die SDA bestehen daher aus 3'-Zielbindungssequenzen, einer nickbaren Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle 5' zur Zielbindungssequenz und einer Schwanzsequenz von etwa 10–25 Nucleotiden Länge 5' zur Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle. Die nickbare Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle und die Schwanzsequenz sind Sequenzen, die für die SDA-Reaktion erforderlich sind. Für andere Amplifikationsreaktionen (z.B. 3SR, NASBA und TAS) können die Amplifikationsprimer aus der Zielbindungssequenz und zusätzlichen Sequenzen bestehen, die für die gewählte Amplifikationsreaktion erforderlich sind, (z.B. für die SDA erforderlichen Sequenzen, wie sie oben beschrieben sind, oder einem von RNA-Polymerase erkannten Promotor für die 3SR). Die Anpassung der Zielbindungssequenzen der Erfindung an andere Amplifikationsverfahren als SDA erfolgt unter Anwendung von Routineverfahren zur Herstellung von Amplifikationsprimern wie der chemischen Synthese und mittels der wohlbekannten strukturellen Anforderungen an die Primer der gewählten Amplifikationsreaktion. Die Zielbindungssequenzen der Erfindung können daher leicht an die Amplifikation und Detektion Y.-enterocoliticaspezifischer Ziele in einer Vielzahl verschiedener Amplifikationsreaktionen angepasst werden, indem lediglich Routineverfahren zur Herstellung, zum Screening und zur Optimierung verwendet werden.
Bei der SDA sind die Bumper-Primer nicht entscheidend für die Artspezifität, da sie dazu dienen, die stromabwärtigen, artspezifischen Amplifikationsprimer zu verdrängen. Es ist nur erforderlich, daß die Bumper-Primer an das Ziel stromaufwärts der Amplifikationsprimer hybridisieren, so daß sie bei ihrer Verlängerung den Amplifikationsprimer und dessen Verlängerungsprodukt verdrängen werden. Die spezielle Sequenz des Bumper-Primers ist daher im allgemeinen nicht entscheidend und kann von jeder stromaufwärtigen Zielsequenz abgeleitet sein, die sich nahe genug an der Bindungsstelle des Amplifikationsprimers befindet, um eine Verdrängung des Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukts infolge Verlängerung des Bumper- Primers zu ermöglichen. Gelegentliche Nichtübereinstimmung mit dem Ziel in der Bumper-Primer-Sequenz oder eine gewisse Kreuzhybridisierung mit Nicht-Zielsequenzen beeinträchtigen die Amplifikationseffizienz gewöhnlich nicht, solange der Bumper-Primer fähig bleibt, an die spezifische Zielsequenz zu hybridisieren.
Amplifikationsreaktionen, welche die Primer der Erfindung verwenden, können Thymin einbauen, wie von Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691–1696) gelehrt, oder sie können in der Reaktion TTP gänzlich oder teilweise durch 2'-Desoxyuridin-5'-triphoshat ersetzen, um die Kreuzkontamination anschließender Amplifikationsreaktionen zu verringern, wie dies z.B. in EP 0 624 643 gelehrt wird. dU (Uridin) wird in Amplifikationsprodukte eingebaut und kann durch Behandlung mit Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) herausgeschnitten werden. Diese abasischen Stellen machen das Amplifikationsprodukt in anschließenden Amplifikationsreaktionen unamplifizierbar. UDG kann vor Durchführung der anschließenden Amplifikation durch Uracil-DNA-Glycosylase-Inhibitor (UGI) inaktiviert werden, um das Herausschneiden von dU bei neugebildeten Amplifikationsprodukten zu verhindern.
SDA ist ein isothermes Verfahren der Nucleinsäure-Amplifikation, bei dem Verlängerung von Primern, Nicken einer hemimodifizierten Restriktionsendonuclease-Erkennungs-/ Schnittstelle, Verdrängung einzelsträngiger Verlängerungsprodukte, Annealen von Primern an die Verlängerungsprodukte (oder die ursprüngliche Zielsequenz) und anschließende Verlängerung der Primer in dem Reaktionsgemisch gleichzeitig erfolgen. Dies steht im Gegensatz zur PCR, bei der die Reaktionsschritte in getrennten Phasen oder Zyklen als Folge der Temperaturzyklierungseigenschaften der Reaktion ablaufen. SDA basiert auf 1) der Fähigkeit einer Restriktionsendonuclease, den unmodifizierten Strang einer Hemiphosphorothioat-Form ihrer doppelsträngigen Erkennungs-/ Schnittstelle zu nicken, und 2) der Fähigkeit bestimmter Polymerasen, an dem Nick Replikation zu starten und den stromabwärtigen Nichtmatrizenstrang zu verdrängen. Nach einer anfänglichen Inkubation bei erhöhter Temperatur (etwa 95°C) zur Denaturierung doppelsträngiger Zielsequenzen zum Annealen der Primer erfolgt die anschließende Polymerisation und Verdrängung neusynthetisierter Stränge bei konstanter Temperatur. Die Erzeugung jeder neuen Kopie der Zielsequenz besteht aus fünf Schritten: 1) Binden der Amplifikationsprimer an eine ursprüngliche Zielsequenz oder an ein zuvor polymerisiertes, verdrängtes, einzelsträngiges Verlängerungsprodukt, 2) Verlängerung der Primer durch eine Polymerase ohne 5'-3'-Exonuclease, die ein α- Thio-desoxynucleosid-triphosphat (α-Thio-dNTP) einbaut, 3) Nicken einer hemimodifizierten doppelsträngigen Restriktionsstelle, 4) Dissoziation des Restriktionsenzyms von der Nick-Stelle und 5) Verlängerung vom 3'-Ende des Nicks weg durch die Polymerase ohne 5'-3'-Exonuclease mit Verdrängung des stromabwärtigen neusynthetisierten Stranges. Nicken, Polymerisation und Verdrängung erfolgen gleichzeitig und kontinuierlich bei einer konstanten Temperatur, da die Verlängerung vom Nick weg eine weitere nickbare Restriktionsstelle erzeugt. Wenn ein Paar von Amplifikationsprimern verwendet wird, von denen jeder an einen der beiden Stränge einer doppelsträngigen Zielsequenz hybridisiert, ist die Amplifikation exponentiell. Dies ist so, weil die Sinn- und Antisinn-Stränge in nachfolgenden Amplifikationsrunden als Matrizen für die gegensätzlichen Primer dienen. Wenn ein einziger Amplifikationsprimer verwendet wird, ist die Amplifikation linear, weil nur ein Strang als Matrize zur Primerverlängerung dient. Beispiele für Restriktionsendonucleasen, die ihre doppelsträngigen Erkennungs-/Schnittstellen nicken, wenn ein α-Thio-dNTP eingebaut ist, sind HincII, HindII, AvaI, NciI und Fnu4HI. Alle diese Restriktionsendonucleasen und andere, welche die gewünschte Nicking-Aktivität zeigen, sind zur Verwendung in herkömmlicher SDA geeignet. Sie sind jedoch relativ thermolabil und verlieren über etwa 40°C ihre Aktivität.
Ziele für die Amplifikation mittels SDA können durch Fragmentierung größerer Nucleinsäuren durch Restriktion mit einer Endonuclease, welche nicht die Zielsequenz schneidet, hergestellt werden. Es wird jedoch gewöhnlich bevorzugt, Zielnucleinsäuren mit den ausgewählten Restriktionsendonuclease-Erkennungs-/Schnittstellen zum Nicken in der SDA-Reaktion herzustellen, wie dies von Walker et al. (1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696) und in US-Patent Nr. 5,270,184 beschrieben wird (durch Verweisung hierin einbezogen). Kurz gesagt: Wenn die Zielsequenz doppelsträngig ist, werden vier Primer an diese hybridisiert. Zwei der Primer (S₁ und S₂) sind SDA-Amplifikationsprimer und zwei (B₁ und B₂) sind externe oder Bumper-Primer. S₁ und S₂ binden an gegensätzliche Stränge doppelsträngiger Nucleinsäuren neben der Zielsequenz. B₁ und B₂ binden an die Zielsequenz 5' (d.h. stromaufwärts) von S₁ bzw. S₂. Die exonucleasefreie Polymerase wird dann dazu verwendet, gleichzeitig alle vier Primer in Gegenwart dreier Desoxynucleosid-triphosphate und wenigstens eines modifizierten Desoxynucleosid-triphosphats (z.B. 2'-Desoxyadenosin-5'-O-(1-thiotriphosphat); "dATPaS") zu verlängern. Die Verlängerungsprodukte von S₁ und S₂ werden dabei durch Verlängerung von B₁ und B₂ von der ursprünglichen Zielsequenz-Matrize verdrängt. Die verdrängten, einzelsträngigen Verlängerungsprodukte der Amplifikationsprimer dienen als Ziele zum Binden der gegensätzlichen Amplifikationsund Bumper-Primer (das Verlängerungsprodukt von S₁ bindet z.B. S₂ und B₂). Der nächste Zyklus von Verlängerung und Verdrängung resultiert in zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten mit hemimodifizierten Restriktionsendonuclease-Erkennungs/Schnittstellen an jedem Ende. Diese sind geeignete Substrate zur Amplifikation mittels SDA. Wie bei der SDA erfolgen die einzelnen Schritte der Zielerzeugungsreaktion gleichzeitig und kontinuierlich, wobei Zielsequenzen mit den Erkennungs/Schnittsequenzen an den Enden, die zum Nicken durch das Restriktionsenzym bei der SDA erforderlich sind, erzeugt werden. Da sämtliche Komponenten der SDA-Reaktion bereits in der Zielerzeugungsreaktion vorhanden sind, treten erzeugte Zielsequenzen automatisch und kontinuierlich in den SDA-Zyklus ein und werden amplifiziert.
Um die Kreuzkontamination einer SDA-Reaktion durch die Amplifikationsprodukte einer anderen zu verhindern, kann ohne Inhibition der Amplifikationsreaktion anstelle von dTTP dUTP in SDA-amplifizierte DNA eingebaut werden. Die uracilmodifizierten Nucleinsäuren können dann spezifisch erkannt und durch Behandlung mit Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) inaktiviert werden. Daher kann, wenn in einer vorhergehenden Reaktion dUTP in SDA-amplifizierte DNA eingebaut wurde, jede anschließende SDA-Reaktion vor der Amplifikation doppelsträngiger Ziele mit UDG behandelt werden, und jegliche dU-haltige DNA aus zuvor amplifizierten Reaktionen wird unamplifizierbar gemacht. Die in der anschließenden Reaktion zu amplifizierende Ziel-DNA enthält kein dU und wird nicht von der UDG-Behandlung beeinflußt. UDG kann dann vor der Amplifikation des Ziels durch Behandlung mit UGI inhibiert werden. Alternativ kann UDG hitzeinaktiviert werden. Bei tSDA kann die höhere Temperatur der Reaktion selbst (≥ 50°C) dazu verwendet werden, gleichzeitig UDG zu inaktivieren und das Ziel zu amplifizieren.
SDA erfordert eine Polymerase ohne 5'-3'-Exonuclease-Aktivität, die Polymerisation an einem einzelsträngigen Nick in doppelsträngigen Nucleinsäuren startet und den Strang stromabwärts des Nicks verdrängt, während sie unter Verwendung des ungenickten Strangs als Matrize einen neuen komplementären Strang erzeugt. Die Polymerase muß verlängern, indem sie Nucleotide an freies 3'-OH anlagert. Um die SDA-Reaktion zu optimieren, ist es auch wünschenswert, daß die Polymerase hochprozessiv ist, um die Länge der Zielsequenz, die amplifiziert werden kann, zu maximieren. Hochprozessive Polymerasen sind imstande, neue Stränge von signifikanter Länge zu polymerisieren, bevor sie dissoziieren und die Synthese des Verlängerungsprodukts abbrechen. Verdrängungsaktivität ist wesentlich für die Amplifikationsreaktion, da sie das Ziel für die Synthese zusätzlicher Kopien zugänglich macht und das einzelsträngige Verlängerungsprodukt erzeugt, an das bei exponentiellen Amplifikationsreaktionen ein zweiter Amplifikationsprimer hybridisieren kann. Nicking-Aktivität des Restriktionsenzyms ist ebenfalls von großer Bedeutung, da es das Nicken ist, das die Reaktion aufrechterhält und die Einleitung anschließender Zielamplifikationsrunden ermöglicht.
tSDA wird im wesentlichen wie die herkömmliche, von Walker et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392–396 und 1992, Nucl. Acids Res. 20: 1691-1696) beschriebene SDA durchgeführt, wobei die gewünschte thermostabile Polymerase und thermostabile Restriktionsendonuclease eingesetzt werden. Natürlich wird die Temperatur der Reaktion an die für die eingesetzten Enzyme geeignete höhere Temperatur angepaßt werden, und die HincII-Restriktionsendonuclease-Erkennungs/Schnittstelle wird gegen die passende Restriktionsendonuclease-Erkennungs/Schnittstelle für die gewählte thermostabile Endonuclease ausgetauscht werden. Im Gegensatz zu Walker et al. kann der Praktiker die Enzyme auch vor dem anfänglichen Denaturierungsschritt in das Reaktionsgemisch einbringen, wenn sie bei der Denaturierungstemperatur stabil genug sind. Bevorzugte Restriktionsendonucleasen zur Verwendung in tSDA sind BsrI, BstNI, BsmAI, BslI und BsoBI (New England BioLabs) und BstOI (Promega). Die bevorzugten thermophilen Polymerasen sind Bca (Panvera) und Bst (New England Biolabs).
Homogene Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA ist eine Modifikation von tSDA. Sie verwendet Detektor-Oligonucleotide, um eine Abnahme von Fluoreszenzquenching in zielabhängiger Weise zu erzeugen. Die Detektor-Oligonucleotide enthalten ein Donor/Akzeptor-Farbstoffpaar, das so gebunden ist, daß in Abwesenheit von Ziel Fluoreszenzquenching erfolgt. Entfaltung oder Linearisierung einer intramolekular basengepaarten Sekundärstruktur in dem Detektor-Oligonucleotid in Gegenwart des Ziels vergrößert den Abstand zwischen den Farbstoffen und verringert das Fluoreszenzquenching. Entfaltung der basengepaarten Sekundärstruktur beinhaltet typischerweise intermolekulare Basenpaarung zwischen der Sequenz der Sekundärstruktur und einem komplementären Strang, so daß die Sekundärstruktur wenigstens teilweise gestört wird. Sie kann in Gegenwart eines komplementären Strangs von ausreichender Länge vollständig linearisiert werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich zwischen den beiden Farbstoffen eine Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle (RERS), so daß intermolekulare Basenpaarung zwischen der Sekundärstruktur und einem komplementären Strang außerdem die RERS doppelsträngig und mittels Restriktionsendonuclease schneidbar oder nickbar macht. Das Schneiden oder Nicken durch die Restriktionsendonuclease trennt den Donor- und den Akzeptorfarbstoff auf zwei verschiedene Nucleinsäurefragmente, was zusätzlich zu einem verringertem Quenching beiträgt. Bei jeder Ausführungsform wird eine begleitende Veränderung bei einem Fluoreszenzparameter (z.B. ein Anstieg der Donorfluoreszenzintensität, eine Abnahme der Akzeptorfluoreszenzintensität oder ein Verhältnis von Fluoreszenz vor und nach Entfaltung) als ein Indiz für die Anwesenheit der Zielsequenz beobachtet. Das Beobachten einer Änderung der Donorfluoreszenzintensität wird bevorzugt, da diese Änderung typischerweise größer ist als die Änderung der Akzeptorfluoreszenzintensität. Andere Fluoreszenzparameter wie eine Änderung der Fluoreszenzlebensdauer können ebenfalls verfolgt werden.
Ein Detektor-Oligonucleotid für die homogene Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA ist ein Oligonucleotid, das sowohl einen einzelsträngigen 5'- oder 3'-Abschnitt, der an die Zielsequenz hybridisiert, (die Zielbindungssequenz) als auch angrenzend an die Zielbindungssequenz eine intramolekular basengepaarte Sekundärstruktur umfaßt. Die Detektor-Oligonucleotide der Erfindung umfassen außerdem ein Donor/Akzeptor-Farbstoffpaar, das so an das Detektor-Oligonucleotid gebunden ist, daß die Donorfluoreszenz gequencht wird, wenn die Sekundärstruktur intramolekular basengepaart ist, und Entfaltung oder Linearisierung der Sekundärstruktur eine Abnahme des Fluoreszenzquenchings zur Folge hat. Mit Schneiden eines Oligonucleotids wird das Ausbrechen der Phosphodiesterbindungen beider Stränge eines DNA-Doppelstranges oder das Ausbrechen der Phosphodiesterbindung einer einzelsträngigen DNA bezeichnet. Dies steht im Gegensatz zum Nicken, welches das Ausbrechen der Phosphodiesterbindung nur eines der beiden Stränge in einem DNA-Doppelstrang bezeichnet.
Die Detektor-Oligonucleotide der Erfindung für die homogene Echtzeit-Fluoreszenz-tSDA enthalten eine Sequenz, die unter den zur Primerverlängerung oder – hybridisierung gewählten Reaktionsbedingungen eine intramolekular basengepaarte Sekundärstruktur bildet. Die Sekundärstruktur ist angrenzend an die Zielbindungssequenz des Detektor-Oligonucleotids angeordnet, so daß wenigstens ein Teil der Zielbindungssequenz einen einzelsträngigen 3' oder 5'-Schwanz bildet. Der Ausdruck "angrenzend an die Zielbindungssequenz", wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß die gesamte oder ein Teil der Zielbindungssequenz einzelsträngig in einem 5'- oder 3'-Schwanz belassen wird, der für die Hybridisierung an das Ziel zur Verfügung steht. Das heißt, die Sekundärstruktur umfaßt nicht die gesamte Zielbindungssequenz. Ein Teil der Zielbindungssequenz kann an der intramolekularen Basenpaarung in der Sekundärstruktur beteiligt sein, er kann die gesamte oder einen Teil einer ersten Sequenz enthalten, die an der intramolekularen Basenpaarung in der Sekundärstruktur beteiligt ist, erstreckt sich jedoch vorzugsweise nicht bis in deren komplementäre Sequenz. Wenn zum Beispiel die Sekundärstruktur eine Stiel-Schleifen-Struktur (z.B. eine "Haarnadel") ist und die Zielbindungssequenz des Detektor-Oligonucleotids als einzelsträngiger 3'-Schwanz vorliegt, kann sich die Zielbindungssequenz auch durch den gesamten oder einen Teil des ersten Armes des Stamms erstrecken und, wahlweise, durch die gesamte oder einen Teil der Schleife. Die Zielbindungssequenz erstreckt sich jedoch vorzugsweise nicht bis in den zweiten Arm der an der intramolekularen Basenpaarung des Stiels beteiligten Sequenz. Das heißt, es ist wünschenswert, zu vermeiden, daß beide Sequenzen, die an der intramolekularen Basenpaarung in einer Sekundärstruktur beteiligt sind, an das Ziel hybridisieren können. Fehlende Übereinstimmungen beim intramolekular basengepaarten Teil der Detektor-Oligonucleotid-Sekundärstruktur können das Ausmaß der Fluoreszenzänderung in Gegenwart von Ziel verringern, sind jedoch akzeptabel, wenn die Testempfindlichkeit nicht von Belang ist. Fehlende Übereinstimmungen bei der Zielbindungssequenz des einzelsträngigen Schwanzes sind ebenfalls akzeptabel, können jedoch gleichermaßen die Testempfindlichkeit und/oder -Spezifität herabsetzen. Es ist jedoch ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, daß perfekte Basenpaarung bei sowohl der Sekundärstruktur als auch der Zielbindungssequenz die Reaktion nicht beeinträchtigen. Perfekte Übereinstimmungen bei den an der Hybridisierung beteiligten Sequenzen verbessern die Testspezifität ohne negative Auswirkungen auf die Reaktionskinetik.
Bei Zugabe zur Amplifikationsreaktion werden die Detektor-Oligonucleotid-Signalprimer der Erfindung durch Hybridisierung und Verlängerung wie oben beschrieben in die doppelsträngige Form überführt. Strangverdrängung durch die Polymerase entfaltet oder linearisiert die Sekundärstruktur ebenfalls und überführt sie durch Synthese eines komplementären Stranges in die doppelsträngige Form. Die RERS, falls vorhanden, wird ebenfalls doppelsträngig und mittels der Restriktionsendonuclease schneidbar oder nickbar. Da die Sekundärstruktur durch die Strangverdrängungsaktivität der Polymerase entfaltet oder linearisiert wird, vergrößert sich der Abstand zwischen dem Donor- und dem Akzeptorfarbstoff, wodurch das Quenching der Donorfluoreszenz verringert wird. Die begleitende Änderung der Fluoreszenz entweder des Donor- oder des Akzeptorfarbstoffs kann als Indiz für die Amplifikation der Zielsequenz verfolgt oder detektiert werden. Ein Schneiden oder Nicken der RERS erhöht gewöhnlich das Ausmaß der Fluoreszenzänderung noch weiter, indem es zwei getrennte Fragmente des doppelsträngigen sekundären Amplifikationsprodukts erzeugt, an die jeweils einer der beiden Farbstoffe gebunden ist. Diese Fragmente können frei in der Reaktionslösung diffundieren, wodurch sich der Abstand zwischen den Farbstoffen des Donor/Akzeptor-Paares weiter vergrößert. Als Indiz dafür, daß Zielamplifikation stattfindet oder stattgefunden hat, kann ein Anstieg der Donorfluoreszenzintensität oder ein Abfall der Akzeptorfluoreszenzintensität detektiert und/oder verfolgt werden, es können jedoch auch andere Fluoreszenzparameter, die von der Nähe des Donor/Akzeptor-Farbstoffpaares beeinflusst werden, beobachtet werden. Eine Änderung der Fluoreszenzintensität des Donors oder Akzeptors kann ebenfalls als Änderung eines Verhältnisses von Donor- und/oder Akzeptorfluoreszenzintensitäten erfaßt werden. Zum Beispiel kann eine Änderung der Fluoreszenzintensität erfaßt werden als a) ein Anstieg im Verhältnis von Donorfluorophor-Fluoreszenz nach Linearisierung oder Entfaltung der Sekundärstruktur zu Donorfluorophor-Fluoreszenz bei dem Detektor-Oligonucleotid vor Linearisierung oder Entfaltung oder b) als ein Abfall im Verhältnis von Akzeptorfarbstoff-Fluoreszenz nach Linearisierung oder Entfaltung zu Akzeptorfarbstoff-Fluoreszenz bei dem Detektor-Oligonucleotid vor Linearisierung oder Entfaltung.
Es wird ersichtlich werden, daß die Detektor-Oligonucleotide der Erfindung neben der SDA für die Verwendung als Signalprimer in anderen Primerverlängerungs-Amplifikationsverfahren (z.B. PCR, 3SR, TMA oder NASBA) angepaßt werden können. Zum Beispiel können die Verfahren für die Verwendung in einer PCR angepaßt werden, indem bei der PCR PCR-Amplifikationsprimer und eine strangverdrängende DNA-Polymerase ohne 5'→3'-Exonuclease-Aktivität (z.B. Sequencing Grade Taq von Promega oder exo^– Vent oder exo^– Deep Vent von New England BioLabs) verwendet werden. Die Detektor-Oligonucleotid-Signalprimer hybridisieren an das Ziel stromabwärts von den PCR-Amplifikationsprimern, werden verdrängt und doppelsträngig gemacht, wie dies im wesentlichen für die SDA beschrieben wurde. Bei der PCR kann fakultativ irgendeine RERS zur Verwendung in dem Detektor-Oligonucleotid gewählt werden, da typischerweise keine modifizierten Desoxynucleosid-triphosphate vorhanden sind, die statt des Schneidens ein Nicken der RERS induzieren könnten. Da Thermozyklierung ein Merkmal der Amplifikation durch PCR ist, wird die Restriktionsendonuclease vorzugsweise bei niedriger Temperatur nach dem letzten Zyklus von Primerannealing und -verlängerung zur Endpunkt-Detektion von Amplifikation zugesetzt. Jedoch könnte eine thermophile Restriktionsendonuclease, welche die Hochtemperaturphasen der PCR-Reaktion hindurch aktiv bleibt, während der Amplifikation vorhanden sein, um einen Echtzeit-Test zu liefern. Wie in SDA-Systemen verringert die Trennung des Farbstoffpaares das Fluoreszenzquenching, wobei eine Änderung eines Fluoreszenzparameters wie der Intensität als Indiz für Zielamplifikation dient.
Die Änderung der Fluoreszenz, die von der Entfaltung oder Linearisierung der Detektor-Oligonucleotide herrührt, kann an einem gewählten Endpunkt der Reaktion detektiert werden. Da jedoch linearisierte Sekundärstrukturen gleichzeitig mit Hybridisierung oder Primerverlängerung erzeugt werden, kann die Fluoreszenzänderung auch verfolgt werden, während die Reaktion abläuft, d.h. in "Echtzeit". Dieses homogene Echtzeit-Testformat kann verwendet werden, um semiquantitative oder quantitative Informationen über die anfängliche Menge an vorhandenem Ziel zu liefern. Zum Beispiel ist die Geschwindigkeit, mit der sich die Fluoreszenzintensität während der Entfaltungs- oder Linearisierungsreaktion (entweder als Teil der Zielamplifikation oder in Nachweisverfahren ohne Amplifikation) ändert, ein Indiz für anfängliche Zielpegel. Wenn mehr anfängliche Kopien der Zielsequenz vorhanden sind, erreicht folglich die Donorfluoreszenz schneller einen gewählten Schwellenwert (d.h. kürzere Zeit bis zur Positivität). Der Abfall der Akzeptorfluoreszenz zeigt gleichfalls eine kürzere Zeit bis zur Positivität, erfaßt als Zeit, die zur Erreichung eines gewählten Minimalwertes erforderlich ist. Außerdem ist die Geschwindigkeit der Änderung von Fluoreszenzparametern während des Verlaufs der Reaktion schneller bei Proben, die höhere Anfangsmengen an Ziel enthalten, als bei Proben, die niedrigere Anfangsmengen an Ziel enthalten (d.h. größere Steigung der Fluoreszenzkurve). Diese oder andere Messungen, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, können als Indiz für die Gegenwart von Ziel oder als Indiz für Zielamplifikation durchgeführt werden. Die anfängliche Menge an Ziel wird typischerweise durch Vergleich der Versuchsergebnisse mit Ergebnissen für bekannte Zielmengen bestimmt.
Tests auf Anwesenheit einer gewählten Zielsequenz gemäß den Verfahren der Erfindung können in Lösung oder auf einer Festphase durchgeführt werden. Homogene Echtzeit- oder Endpunkt-Tests, in denen das Detektor-Oligonucleotid als ein Primer dient, werden typischerweise in Lösung durchgeführt. Hybridisierungstests unter Verwendung des Detektor-Oligonucleotids der Erfindung können ebenfalls in Lösung durchgeführt werden (z.B. als homogene Echtzeit-Tests), sind jedoch besonders gut für Festphasen-Tests zur Echtzeit- oder Endpunkt-Detektion von Ziel geeignet. Bei einem Festphasen-Test können Detektor-Oligonucleotide über innere oder terminale Markierungen mittels auf dem Fachgebiet bekannter Methoden auf der Festphase (z.B. Kügelchen, Membranen oder dem Reaktionsgefäß) immobilisiert werden. Zum Beispiel kann ein biotinmarkiertes Detektor-Oligonucleotid auf einer avidininodifizierten Festphase immobilisiert werden, wo es die Fluoreszenz ändern wird, wenn es unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen dem Ziel ausgesetzt wird. Das Einfangen des Ziels auf diese Weise erleichtert die Trennung des Ziels von der Probe und ermöglicht die Entfernung von Substanzen in der Probe, welche die Detektion des Signals oder andere Aspekte des Tests stören könnten. Ein Beispiel für ein Festphasensystem, das verwendet werden kann, ist ein elektronisches Mikroarray, d.h. ein Hybridisierungssystem mit aktiver programmierbarer elektronischer Matrix.
Eine vereinfachte Version des Hybridisierungssystems mit aktiver programmierbarer elektronischer Matrix zur Verwendung mit dieser Erfindung wird wie folgt beschrieben. Allgemeinen trägt ein Substrat eine Matrix oder ein Array elektronisch adressierbarer Mikrolokationen. Über den einzelnen Elektroden ist eine Permeationsschicht angeordnet. Die Permeationsschicht gestattet den Transport relativ kleiner geladener Einheiten durch sie hindurch, schließt jedoch große geladene Einheiten wie DNA von einem direkten Kontakt mit den Elektroden aus. Die Permeationsschicht verhindert die elektrochemische Degradation, die bei der DNA durch direkten Kontakt mit den Elektroden stattfinden würde. Sie dient außerdem dazu, die starke unspezifische Adsorption von DNA an Elektroden zu verhindern. Auf der Permeationsschicht sind Bindungsregionen angeordnet und stellen spezifische Bindungsstellen für Zielsubstanzen bereit.
Bei Betrieb umfaßt ein Behälter diesen Raum über den Bindungsregionen, der die gewünschten (sowie unerwünschten) Substanzen zur Detektion, Analyse oder Verwendung enthält. Im Behälter befinden sich geladene Einheiten wie geladene DNA. Bei einer Erscheinungsform umfaßt das System mit aktiver programmierbarer Matrix ein Verfahren zum Transport der geladenen Substanzen zu einem der spezifischen Mikrolokationen. Bei Aktivierung erzeugt eine Mikrolokation den freien feldelektrophoretischen Transport einer geladenen, funktionalisierten, spezifischen Bindungseinheit zur Elektrode. Wenn zum Beispiel eine Elektrode positiv und eine zweite Elektrode negativ gemacht wären, würden zwischen zwei Elektroden elektrophoretische Kraftlinien verlaufen. Die Linien elektrophoretischer Kraft bewirken den Transport geladener Bindungseinheiten, die eine negative Ladung aufweisen, zur positiven Elektrode. Geladene Substanzen mit einer positiven Nettoladung bewegen sich unter der elektrophoretischen Kraft zur negativ geladenen Elektrode. Wenn die netto negativ geladene Bindungseinheit, welche funktionalisiert wurde, die Bindeschicht infolge ihrer Bewegung unter elektrophoretischer Kraft berührt, wird die funktionalisierte spezifische Bindungseinheit kovalent an die der ersten Elektrode entsprechende Bindeschicht gebunden.
Elektrophoretischer Transport entsteht gewöhnlich durch das Anlegen einer Spannung, die ausreicht, um innerhalb des Systems eine Elektrolyse und Innentransport zu ermöglichen. Es entsteht elektrophoretische Mobilität, und es fließt Strom durch das System, zum Beispiel durch Innentransport durch die Elektrolytlösung. Auf diese Weise kann über den Stromfluß der Ionen ein geschlossener Stromkreis gebildet werden, wobei der restliche Stromkreis von den üblichen elektronischen Bauteilen wie z.B. den Elektroden und gesteuerten Schaltungen gebildet wird. Zum Beispiel ist für eine wässerige Elektrolytlösung, die übliche Substanzen wie Natriumchlorid, Natriumphosphat, Puffer und Innenspezies enthält, die Spannung, die Elektrolyse und Innentransport induziert, größer als oder etwa gleich 1,2 Volt.
Es ist möglich, die Bindeschichten, die nicht der Reaktion unterworfen sind, zu schützen, indem man ihre entsprechenden Elektroden negativ macht. Dies hat elektrophoretische Kraftlinien zu Folge, die von solchen Bindungsregionen ausgehen.
Die elektrophoretischen Kraftlinien dienen dazu, negativ geladene Bindungseinheiten von der nichtreaktiven Bindeschicht weg- und zur Bindeschicht hinzulenken, die der ersten Elektrode entspricht. Auf diese Weise wird um die Bindeschichten, von denen gewünscht wird, daß sie zu diesem Zeitpunkt mit den geladenen Molekülen nicht reagieren, ein "Kraftfeld"-Schutz gebildet.
Eine stark vorteilhafte Auswirkung dieses Systems ist, daß geladene Bindungssubstanzen in Regionen, welche an die Signalbindeschichten angrenzen, hoch konzentriert werden können. Wenn zum Beispiel eine einzelne Mikrolokation positiv geladen ist und die übrigen Mikrolokationen negativ geladen sind, werden die Linien der elektrophoretischen Kraft den Transport der netto negativ geladenen Bindungseinheiten zur positiv geladenen Mikrolokation bewirken. Auf diese Weise kann ein Verfahren geschaffen werden, um Analyten oder Reaktanten an jeder spezifischen Mikrolokation auf der Vorrichtung zu konzentrieren und zur Reaktion zu bringen. Nach dem Anheften der spezifischen Bindungseinheiten an die Bindeschicht kann die darunterliegende Mikroelektrode weiter in einem Gleichstrom(DC)-Modus arbeiten. Dieses einzigartige Merkmal ermöglicht es, daß relativ verdünnte geladene Analyten oder Reaktantmoleküle, die sich frei in Lösung befinden, seriell oder parallel schnell zu jeder spezifischen Mikrolokation, die auf einer den Analyt- oder Reaktantmolekülen entgegengesetzten Ladung gehalten wird, transportiert, dort konzentriert und zur Reaktion gebracht werden. Diese Möglichkeit, verdünnte Analyt- oder Reaktantmoleküle an ausgewählten Mikrolokationen zu konzentrieren, beschleunigt die Reaktionsgeschwindigkeiten an diesen Mikrolokationen beträchtlich.
Nach Abschluß der gewünschten Reaktion, kann das Potential der Elektrode umgekehrt werden, wodurch eine elektrophoretische Kraft in einer der früheren Anziehungskraft entgegengesetzten Richtung erzeugt wird. Auf diese Weise können unspezifische Analyten oder unreagierte Moleküle von der Mikrolokation entfernt werden. Spezifische Analyten oder Reaktionsprodukte können von jeder Mikrolokation gelöst und zur weiteren Analyse zu anderen Lokationen transportiert, an anderen adressierbaren Lokationen angesammelt oder völlig aus dem System entfernt werden. Diese Entfernung oder Dekonzentration von Substanzen durch Umkehr des Feldes steigert das Auflösungsvermögen des Systems, indem die Entfernung unspezifisch gebundener Substanzen bewirkt wird. Durch Steuerung des Ausmaßes der nun abstoßenden elektrophoretischen Kraft auf unspezifisch gebundene Substanzen an der Bindeschicht kann eine elektronische Stringenzkontrolle erreicht werden. Durch Erhöhung des elektrischen Potentials an der Elektrode zur Erzeugung eines Feldes, das ausreicht, um teilweise hybridisierte DNA-Sequenzen zu entfernen, wodurch eine Identifikation einzelner fehlgepaarter Hybridisierungen ermöglicht wird, können Punktmutationen identifiziert werden.
Arbeitsgänge können an den verschiedenen Bindeschichten parallel oder seriell durchgeführt werden. Zum Beispiel kann eine Reaktion zuerst an einer ersten Bindeschicht ablaufen, wobei die Potentiale wie dargestellt benutzt werden. Das Potential an einer ersten Elektrode kann umgekehrt werden, daß heißt negativ gemacht werden, und das Potential an der angrenzenden zweiten Elektrode kann positiv gemacht werden. Auf diese Weise läuft eine Serienreaktion ab. Substanzen, die nicht spezifisch an die erste Bindeschicht gebunden wurden, würden durch elektrophoretische Kraft zur Bindeschicht transportiert werden. Auf diese Weise wird die Konzentrationswirkung benutzt, um hohe Konzentrationen an dieser nun der positiven elektrophoretischen Kraft unterworfenen spezifischen Bindeschicht zu schaffen. Die konzentrierten Substanzen können anschließend zu einer angrenzenden oder anderen Bindeschicht bewegt werden. Alternativ können Mehrfach-Bindeschichten entschützt werden, in dem Sinne, daß es ein elektrophoretisches Netto-Kraftfeld gibt, das sich von der Elektrode durch die Bindeschicht in das Reservoir hinaus erstreckt. Durch Entschützen der Mehrfach-Bindeschicht werden Multiplex-Reaktionen durchgeführt. Jeder einzelne Ort kann im wesentlichen als ein separates "Teströhrchen" dienen, insofern als sich die spezielle von einer gegebenen Bindeschicht adressierte Umgebung von jenen Umgebungen unterscheiden kann, welche die anderen Bindeschichten umgeben.
Bei einer Ausführungsform enthält die Permeationsschicht Avidin und enthält einer der SDA-Primer Biotin. Im Anschluß an die Amplifikation werden die Amplikons elektronisch an das Array adressiert und binden an das Avidin. Es werden dann eine oder mehrere markierte Detektorsonden zugesetzt und mit den Amplikons hybridisieren gelassen. Dann wird die Anwesenheit hybridisierter Detektorsonden detektiert. Bei einer zweiten Ausführungsform werden eine oder mehrere Fangsonden konstruiert, die mit der amplifizierten Nucleinsäure hybridisieren. Jede Fangsonde enthält Biotin und wird entweder an ein Array gebunden oder elektronisch an ein Array adressiert und gebunden, bei dem die Permeationsschicht Avidin enthält. Die Amplikons werden dann elektronisch an das Array adressiert und hybridisieren mit den Fangsonden. Es werden nun eine oder mehrere markierte Detektorsonden zugesetzt und mit den Amplikons hybridisieren gelassen. Dann wird die Anwesenheit hybridisierter Detektorsonden detektiert.
Weitere Einzelheiten des elektronischen Mikroarrays und zugehöriger Systeme werden von Heller et al. (1997, US-Patent Nr. 5,605,662; 1997, US-Patent Nr. 5,682,957; 1997, veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. WO97/12030) und Sosnowski et al. (1998, veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. WO98/10273) beschrieben, deren Offenbarungen hiermit durch Verweisung spezifisch hierin einbezogen sind).
Außerdem werden Techniken, die SDA und elektronische Mikroarrays anwenden, einschließlich verschiedener Testformate in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung der laufenden Nummer 09/___ offenbart, die gleichzeitig hiermit eingereicht wurde (Anwaltliche Aktenzahl Nr. 235/139) und durch Verweisung hierin einbezogen ist. Bei einer Ausführungsform, die in dieser Anmeldung beschrieben ist, wird ein Sandwich-Test verwendet, bei dem eine einzelsträngige Fangsonde elektronisch auf dem Array aufgebracht wird und dazu dient, einen Strang eines geladenen Moleküls wie beispielsweise Zielnucleinsäure oder deren Amplikon einzufangen. Es kann eine Vielzahl von Molekülen wie z.B. Nucleinsäure-Fangsonden elektronisch auf verschiedenen Array-Blöcken aufgebracht werden. Es wird bevorzugt, daß die Hybridisierung des Zielmoleküls oder Amplikons und der Fangsonde elektronisch durchgeführt wird. Nach dem Einfangen des geladenen Moleküls an den Fangorten kann das eingefangene Molekül durch eine markierte Reportersonde, die an das eingefangene Molekül bindet, detektiert werden.
Bei einer zweiten Ausführungsform, die in dieser Anmeldung beschrieben ist, wird eine elektronische Amplifikation auf dem Mikroarray durchgeführt. Bei dieser Ausführungsform wird Zielnucleinsäure elektronisch in der Nähe verankerter Primer konzentriert, die sich an einem Fangort befinden und in einer SDA oder einem anderen Amplifikationsverfahren verwendet werden. Elektronische Hybridisierung wird verwendet, um die Matrizen-Moleküle an die verankerten SDA-Primer zu hybridisieren. Die Mikrochips werden dann mit einem SDA-Reaktionsgemisch inkubiert, das die SDA-Komponenten außer der Matrize und den Amplifikationsprimern enthält. Nach dem Stoppen der Reaktion werden die Produkte denaturiert, und der Mikrochip wird mit Reportersonden inkubiert, um die Anwesenheit von Zielnucleinsäure zu detektieren. Diese Ausführungsformen zeigen, daß (a) die Amplifikation auf einem elektronischen Mikroarray mit anschließender Analyse durchgeführt werden kann oder (b) die Amplifikation in Lösung erfolgen kann und dann eine Analyse auf einem elektronischen Mikroarray durchgeführt werden kann.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele erläutern spezielle Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung. Wie für den Fachmann ersichtlich, sind verschiedene Änderungen und Modifikationen möglich und werden im Rahmen der beschriebenen Erfindung erwogen.
BEISPIEL 1
Primer-Screening
Sämtliche paarweisen Kombinationen der in Tabelle 1 dargestellten stromaufwärtigen und stromabwärtigen Amplifikationsprimer wurden auf Amplifikation des Ziels getestet. Amplifikationsreaktionen wurden in Gegenwart von 0 oder 10⁶ Genom-Äquivalenten von Y.-enterocolitica-Ziel-DNA durchgeführt. Die Amplifikationsreaktionen wurden bei 52°C in Puffern durchgeführt, welche Endkonzentrationen der folgenden Komponenten enthielten: 30–40 mM Kaliumphosphat (pH 7,6), 5–9% Glycerol, 3–7% Dimethylsulfoxid (DMSO), 5 mM Magnesiumacetat, 700 ng humane Placenta-DNA, 10 μg acetyliertes Rinderserumalbumin, 1,82% Trehalose, 0,36 mM Dithiothreitol, 500 nM tSDA-Primer, 50 nM Bumper-Primer, 0,25 mM dUTP, 0,7 mM 2'-Desoxycytidin-5'-O-(1-thiotriphoshat), 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP und etwa 640 Units BsoBI und 40 Units Bst-Polymerase.
In Kürze: Ziel-DNA wurde 5 Minuten bei 95°C denaturiert und vor Zugabe zu einem die Primer und Bumper enthaltenden Puffer auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Inkubation wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur fortgeführt, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation bei 70°C, um potentielles falsches Priming zu minimieren. Es wurde dann bei 52°C die Amplifikation gestartet, indem ein bestimmtes Volumen des Priming-Gemisches in Mikrotitervertiefungen überführt wurde, welche die Amplifikationsenzyme enthielten. Die Amplifikation wurde 1 Stunde bei einer konstanten Temperatur von 52°C durchgeführt. Die Amplifikationsprodukte wurden nach Primerverlängerung mit der ³²P-markierten Detektor-Sequenz SEQ ID NO: 10 und Auftrennung in 8%igen denaturierenden Polyacrylamidgelen durch Autoradiographie detektiert. Mit allen 9 getesteten Primerkombinationen wurden spezifische Amplifikationsprodukte detektiert.
BEISPIEL 2
Bestimmung der analytischen Empfindlichkeit
tSDA wurde mit SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 wie oben beschrieben durchgeführt. Y.-enterocolitica-DNA war mit 0, 10², 10³, 10⁴, 10⁵ und 10⁶ Genom-Äquivalenten pro Reaktion enthalten. Es wurde eine analytische Empfindlichkeit von 10² Zielen erreicht.
BEISPIEL 3
Evaluierung der Primer-Spezifität
Mittels der in Beispiel 2 angeführten Sequenzen und der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde die Primerspezifität evaluiert. Es wurden zweiundvierzig Stämme von Y. enterocolitica mit 10⁵ Genom-Äquivalenten pro Reaktion getestet (Tabelle 2). Einundvierzig der Stämme testeten positiv auf eine errechnete Spezifität von 98%.
TABELLE 2 Tafel der Y.-enterocolitica-Spezifität
BEISPIEL 4
Evaluierung der Kreuzreaktivität
Mittels der oben beschriebenen Sequenzen und Reaktionsbedingungen wurde die Kreuzreaktivität evaluiert. Es wurden andere Organismen als Y. enterocolitica mit 10⁶-10⁷ Genom-Äquivalenten pro Reaktion getestet. Mit allen 32 getesteten Organismen wurden negative Ergebnisse erzielt (Tabelle 3).
TABELLE 3 Tafel der Y.-enterocolitica-Kreuzreaktivität
BEISPIEL 5
Elektronische Mikroarray-Analyse
Die mikroelektronische Array-Anordnung wurde an früherer Stelle beschrieben (R.G. Sosnowski et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 119–123). Elektronisches Targeting von Fangsonden, Amplikons oder Detektorsonden verwendete Bedingungen, über die an anderer Stelle berichtet wurde (R.G. Sosnowsi et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 119–123; C.F. Edman et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 4907–4914). Die Permeationsschicht der mikroelektronischen Array-Anordnung enthält vorteilhafterweise Avidin. In Kürze: Fangsonden werden elektronisch an ein mikroelektronisches Array adressiert. Rohe Amplifikationsreaktionen werden entweder 2 Minuten durch G6-Säulen zentrifugiert (Biorad, Hercules, CA), die mit destilliertem Wasser voräquilibriert sind, oder in Multiwell-Platten (Millipore, Bedford, MA) für ≥5 Stunden gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die vorbereiteten Proben werden dann in einem 1:1-Verhältnis mit 100 mM Histidin gemischt und vor dem elektronischen Adressieren für 5 Minuten auf 95°C erhitzt. Zur Detektion wird ein fluoreszenzmarkiertes Oligonucleotid (Detektorsonde) in 6xSSC zugesetzt und 30 min bei Raumtemperatur hybridisieren gelassen. Das Array wird dann in 0,1×STE/1%SDS, gefolgt von 1×STE, gewaschen. Dann wird die Anwesenheit von Detektorsonde detektiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Oligonucleotid, das aus einer Zielbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Zielbindungssequenzen von AL48 (SEQ ID NO: 1), AL46 (SEQ ID NO: 2), AL42 (SEQ ID NO: 3), AR48 (SEQ ID NO: 4), AR46 (SEQ ID NO: 5) und AR42 (SEQ ID NO: 6), und wahlweise einer für eine Amplifikationsreaktion erforderlichen Sequenz besteht.
Oligonucleotid nach Anspruch 1, wobei die für die Amplifikationsreaktion erforderliche Sequenz eine Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle ist, die während einer Strangverdrängungsamplifikation durch eine Restriktionsendonuclease genickt wird.
Oligonucleotid,das aus BL44 (SEQ ID NO: 7) oder BR44 (SEQ ID NO: 8) besteht.
Oligonucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D50 (SEQ ID NO: 9), einer zu SEQ ID NO: 9 komplementären Nucleinsäure, DR50 (SEQ ID NO: 10) und einer zu SEQ ID NO: 10 komplementären Nucleinsäure.
Kit, umfassend: a) einen oder mehrere Primer, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus AL48 (SEQ ID NO: 1), AL46 (SEQ ID NO: 2) und AL42 (SEQ ID NO: 3), b) einen oder mehrere Primer, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus AR48 (SEQ ID NO: 4), AR46 (SEQ ID NO: 5) und AR42 (SEQ ID NO: 6), c) die Bumper BL44 (SEQ ID NO: 7) und BR44 (SEQ ID NO: 8) und d) einen oder mehrere Detektoren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D50 (SEQ ID NO: 9), einer zu SEQ ID NO: 9 komplementären Nucleinsäure, DR50 (SEQ ID NO: 10) und einer zu SEQ ID NO: 10 komplementären Nucleinsäure.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Yersinia enterocolitica in einer Probe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) das Behandeln der Probe unter Verwendung eines Paares von Nucleinsäureprimern in einer Nucleinsäure-Amplifikationsreaktion, wobei ein erster Primer aus der Gruppe bestehend aus AL48 (SEQ ID NO: 1), AL46 (SEQ ID NO: 2) und AL42 (SEQ ID NO: 3) ausgewählt wird und ein zweiter Primer aus der Gruppe bestehend aus AR48 (SEQ ID NO: 4), AR46 (SEQ ID NO: 5) und AR42 (SEQ ID NO: 6) ausgewählt wird, und b) das Nachweisen eines etwaigen amplifizierten Nucleinsäureprodukts, wobei der Nachweis von amplifiziertem Produkt die Anwesenheit von Yersinia enterocolitica anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Nachweis des amplifizierten Nucleinsäureprodukts durch Hybridisieren des amplifizierten Nucleinsäureprodukts mit einem Detektor, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D50 (SEQ ID NO: 9), einer zu SEQ ID NO: 9 komplementären Nucleinsäure, DR50 (SEQ ID NO: 10) und einer zu SEQ ID NO: 10 komplementären Nucleinsäure, geführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Amplifikationsreaktion, der Nachweis oder sowohl die Amplifikationsreaktion als auch der Nachweis ein elektronisches Mikroarray verwenden.
Verfahren zur Amplifikation einer Zielnucleinsäuresequenz von Yersinia enterocolitica, umfassend: a) die Hybridisierung an die Nucleinsäure i) eines ersten Amplifikationsprimers, der aus einer Zielbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Zielbindungssequenzen von AL48 (SEQ ID NO: 1), AL46 (SEQ ID NO: 2) und AL42 (SEQ ID NO: 3), und wahlweise einer für eine Amplifikationsreaktion erforderlichen Sequenz besteht, und ii) eines zweiten Amplifikationsprimers, der aus einer Zielbindungssequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Zielbindungssequenzen von AR48 (SEQ ID NO: 4), AR46 (SEQ ID NO: 5) und AR42 (SEQ ID NO: 6), und wahlweise einer für die Amplifikationsreaktion erforderlichen Sequenz besteht, und b) die Verlängerung der hybridisierten ersten und zweiten Amplifikationsprimer auf der Zielnucleinsäuresequenz, wodurch die Zielnucleinsäuresequenz amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 9, das außerdem das Nachweisen der amplifizierten Zielnucleinsäure durch Hybridisierung an eine Detektorsonde umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Detektorsonde aus D50 (SEQ ID NO: 9) oder DR50 (SEQ ID NO: 10) besteht, die mit einer nachweisbaren Markierung versehen sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Amplifikationsreaktion, der Nachweis oder sowohl die Amplifikationsreaktion als auch der Nachweis ein elektronisches Mikroarray verwenden.