DE69636838T2

DE69636838T2 - Verfahren zur herstellung vielfältiger doppelsträngiger nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69636838T2
Application number: DE69636838T
Authority: DE
Inventors: Henrik Orum; Corina Seeger
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1995-11-25
Filing date: 1996-11-22
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2016-11-23
Also published as: WO1997020068A2; WO1997020068A3; EP0873422A2; EP0873422B1; DE69636838D1; ES2279530T3; JP2000500976A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung mehrfacher doppelsträngiger Nukleinsäuren und ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten durch Verwendung der erzeugten mehrfachen doppelsträngigen Nukleinsäuren.
Hintergrund der Erfindung
Die Bestimmung der Analyten in den Proben spielt eine wichtige Rolle bei der Umwelt- oder Humandiagnoseanalyse. Die Infektion oder Verschmutzung von Proben durch Substanzen, die aus der Umgebung stammen, ist in der Industrie von Hauptinteresse. Da viele der Substanzen in den Proben in sehr niedrigen Mengen zugegen sind, müssen die Analyseverfahren sehr empfindlich sein. Dies gilt insbesondere für die immunologischen Bestimmungen oder Analysen auf der Basis des Vorkommens von Nukleinsäuren.
Der erste Anstieg der Empfindlichkeit, der in Nukleinsäureassays erzielt werden soll, wurde durch die Möglichkeit zur Amplifikation der Menge an Analyt-Nukleinsäure in einer Probe verwirklicht. Dies wurde ermöglicht durch die Bestimmung von sogar sehr niedrigen Mengen an Nukleinsäuren in einer Probe. Ein Beispiel für ein Verfahren zur Amplifikation der Analyt-Nukleinsäuren in einer Probe ist die so genannte Polymerasekettenreaktion, die eingehend in US-A-4,683,202 beschrieben ist. Dieses Verfahren verwendet zwei Primer, die so ausgewählt werden, dass die Sequenz des ersten Primers zu einem Bereich der zu amplifizierenden Ziel-Nukleinsäure komplementär ist und die Sequenz des zweiten Primers zu einer Sequenz auf der Ziel-Nukleinsäure homolog ist, so dass das Elongationsprodukt eines Primers als Matrize für die Elongation des anderen Primers verwendet werden kann. Dieses Verfahren ergibt mehrfache Kopien der zu bestimmenden Nukleinsäure.
Als weitere Entwicklung dieses Verfahrens in EP-A-0 379 369 ist ein Verfahren zur Umwandlung eines Analyt-Polynukleotids in ein Polynukleotid, bei dem sich an einem Ende eine Nukleobasensequenz befindet, die zur Sequenz am anderen Ende komplementär ist, beschrieben. Dieses neu konstruierte Polynukleotid, das ein Fragment der Analyt-Nukleinsäure enthält, kann mit nur einer Primersequenz analysiert werden. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass die Enden der erzeugten Nukleinsäure miteinander hybridisieren können und daher jegliches Anlagern des Primers verhindern können. Daher ist die Amplifikation nicht sehr effizient. Die Herstellung des amplifizierbaren Zwischenproduktes erfordert die Verwendung von zwei verschiedenen Primersequenzen und somit das Wissen über zwei verschiedene Sequenzen in der zu bestimmenden oder zu amplifizierenden Nukleinsäure.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Versorgung des Fachgebiets mit einem Verfahren zur Erzeugung mehrfacher doppelsträngiger Nukleinsäuren, die zur Bestimmung von Analyten verwendet werden können, wobei nur eine Primersequenz verwendet wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Erzeugen von doppelsträngigen Nukleinsäuren durch:

a. Verlängern eines Primermoleküls, das eine Nukleobasensequenz B' umfasst, durch Verwendung von Nukleotiden, von denen 80% oder mehr Nukleotide sind, die eine oder mehrere promiskuitive Basen aufweisen, die im Prinzip mit jedem der Nukleotide Adenosin, Guanin, Cytosin und Thymin Basenpaare bilden können, und zudem durch Verwendung einer Ziel-Nukleinsäure T, die eine Nukleobasensequenz B enthält, an die die Nukleobasensequenz B' hybridisiert und einer Matrizensequenz I, die als Matrize für die Elongation des Primers dient, wodurch ein Elongationsprodukt E erhalten wird, das als Matrize für die Elongation eines weiteren Primermoleküls wirken kann, das die Nukleobasensequenz B' enthält.
b. Trennen der Ziel-Nukleinsäure T von dem Elongationsprodukt E,
c. Verwenden des Elongationsproduktes E als Matrize für die Elongation eines weiteren Primermoleküls, das ein Elongationsprodukt E' ergibt, und
d. Wiederholen der Schritte Verlängern der Primermoleküle und Trennen der Elongationsprodukte hinreichend oft, dass die gewünschte Menge an doppelsträngiger Nukleinsäure erhalten wird.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten mit diesem Verfahren, insbesondere

– Binden einer Ziel-Nukleinsäure T mit einem Bereich, der einen analytenspezifischen Bereich A umfasst, und einem Bereich, der eine analytenunspezifische Domäne umfasst, die die Sequenz B enthält, an den Analyten;
– Hybridisieren eines Primers, der eine Nukleobasen-enthaltende Sequenz B' umfasst, die komplementär zur Sequenz B ist, an die Ziel-Nukleinsäure;
– Verlängern des Primers unter Verwendung der Ziel-Nukleinsäure als Matrize, so dass man ein erstes Elongationsprodukt E durch die kovalente Bindung von einem oder mehreren Nukleotiden, von denen mindestens 80% promiskuitive basenhaltige Nukleotide sind, wobei die promiskuitiven Basen Basenpaare mit jeder Nukleobase Adenin, Gianosin, Cytosin und Thymin bilden können, an dem Primer erhält;
– Trennen der Ziel-Nukleinsäure T von dem Elongationsprodukt E;
– Verwenden des Elongationsproduktes E als Matrize zur Elongation eines weiteren Moleküls des Primers, so dass man ein Elongationsprodukt E' erhält; und
– Wiederholen der Schritte Verlängern der Primermoleküle und Trennen der Elongationsprodukte hinreichend oft, dass die gewünschte Menge an doppelsträngiger Nukleinsäure erhalten wird; und
– Bestimmen des Vorkommens jedes Elongationsproduktes als Maß für die Anwesenheit oder Menge des Analyten.

Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Erzeugung mehrfacher doppelsträngiger Nukleinsäuren ein Verfahren zur Erzeugung einer großen Zahl identischer doppelsträngiger Nukleinsäuren. Dieses Verfahren umfasst, besteht aber nicht notwendigerweise aus der Amplifikation dieser doppelsträngingen Nukleinsäuren. Die Amplifikation kann linear sein, ist aber vorzugsweise vollständig oder unvollständig exponential. Vollständig exponential ist eine Amplifikation, bei der die Anzahl der erzeugten Nukleinsäuren in n Amplifikationsschritten gleich 2ⁿ ist, wohingegen dieser theoretische Amplifikationsfaktor bei einer unvollständig exponentiellen Amplifikation nicht erzielt wird. Die erzeugten doppelsträngigen Nukleinsäuren können weiteren Verarbeitungsschritten unterworfen werden, wie einer chemischen Modifikation oder physikalischen Behandlung, wie Strangtrennung, die einzelsträngige Nukleinsäuren ergibt.
Ein erfindungsgemäßer Primer ist ein Molekül, das eine Nukleobasensequenz B' umfasst, die eine Affinität zu einer Nukleobasensequenz B hat, die in einer Zielsequenz enthalten ist und die durch ein oder mehrere Nukleotide an einem verlängerbaren Ende verlängert werden kann. Die Nukleobasensequenz B des Primers ist vorzugsweise im Wesentlichen komplementär zu einer Sequenz B in der Ziel-Nukleinsäure. Der Primer hat vorzugsweise eine solche Spezifität für die Ziel-Nukleinsäure oder die Nukleobasensequenz B, dass er unter den Bedingungen, die für Nukleinsäuren ausgewählt wurden, die nicht zur Verwendung als Ziel zur Erzeugung mehrfacher doppelsträngiger Nukleinsäuren vorgesehen sind, nicht hybridisiert. Der erfindungsgemäße Primer ist vorzugsweise eine Nukleinsäure, beispielsweise DNA oder RNA, wobei DNA bevorzugt ist. Der Primer kann als Substrat für die Bindung von einem oder mehreren Nukleotiden wirken. Der Primer hat eine 3'-terminale Hydroxylgruppe, an die Mononukleotide enzymatisch gebunden werden können, wobei das vorspringende Ende der Ziel-Nukleinsäure als Matrize verwendet wird, so dass man ein Elongationsprodukt des Primers erhält. Im Folgenden wird das Ende des Primers, das verlängert werden soll, als verlängerbares Ende des Primers bezeichnet. Die Primer werden gewöhnlich in großem Überschuss gegenüber der Ziel-Nukleinsäure verwendet.
Bei einer speziellen Ausführungsform enthält der Primer eine Strecke von mindestens 10 nt kontinuierlich verbundenen Nukleotiden, die die gleiche Nukleobase tragen, vorzugsweise eine Pyrimidin-Nukleobase, wie T oder C, am stärksten bevorzugt Cytosin. Am stärksten bevorzugt befindet sich diese Strecke innerhalb einer Sequenz B'. Am verlängerbaren Ende des Primers kann der Primer ein oder mehrere Nukleotide enthalten, die sich von den Nukleotiden in der vorstehend genannten Strecke unterscheiden und die die Selektierbarkeit der Bindung des Primers an die Nukleobasensequenz B der Ziel-Nukleinsäure T verbessern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Primer eine Strecke identischer Basen mit vorzugsweise mindestens zehn identischen Basen, in aufeinander folgender Reihenfolge und in der Richtung der Verlängerung, drei oder weniger Basen, die sich von den vorstehend genannten Basen unterscheiden. Vorzugsweise sind nur zwei oder eine dieser Basen an dieses Ende der Strecke gebunden. Bevorzugte Basen am verlängerbaren Ende des Primers sind Basen, die eine Basenpaarung mit der vorstehend genannten Strecke identischer Basen in dem Primer bilden können. Die Anzahl dieser Basen ist jedoch kleiner als die Anzahl, die sich zur Produktion stabiler Intrasonden-Strukturen eignet. Die Primer können weitere geeignete Einheiten haben, vorausgesetzt, sie machen die Hybridisierung des Primers an das Ziel und die anschließende Elongation nicht unmöglich. Insbesondere umfassen Einheiten, die möglicherweise an den Primer gebunden sind, Markierungsgruppen. Die Sequenz B' wird festgelegt und derart ausgewählt, dass sie an die entsprechende Strecke der Nukleobasen in der Ziel-Nukleinsäure passt.
Eine erfindungsgemäße Nukleobasensequenz besteht aus natürlich oder nicht-natürlich vorkommenden Nukleobasen, die über ein Gerüst miteinander gebunden sind, beispielsweise ein Zucker-Phosphat-Gerüst, wie in gewöhnlichen Nukleinsäuren. Die Nukleobasensequenz bestimmt beispielsweise die Spezifität, mit der ein Primer an eine Ziel-Nukleinsäure bindet. Zur Erzielung einer bestimmten Spezifität kann es sich als zweckmäßig erweisen, eine Nukleobasensequenz auszuwählen, die länger ist als 15 Nukleotide (nt), vorzugsweise zwischen 16 und 30 nt.
Eine Ziel-Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die in einer Probe enthalten ist oder aus einer Probe erhalten wird oder in einem Vorschritt produziert wird oder zur Probe in einer definierten Menge zugegeben wird. Die Ziel-Nukleinsäure ist vorzugsweise keine natürlich vorkommende Nukleinsäure, aber ein Konstrukt, das aus Komponenten besteht, die für eine bestimmte Verwendung der Ziel-Nukleinsäure angepasst ist. In einem stärker bevorzugten Fall besteht die Ziel-Nukleinsäure aus Komponenten, die die Bestimmung eines Analyten in einer Probe ermöglichen. Diese Ausführungsform der Erfindung wird später genauer beschrieben. Die Ziel-Nukleinsäure kann von anderen Inhaltsstoffen des Reaktionsgemischs unterschieden werden, beispielsweise durch die Nukleobasensequenz B. Die erfindungsgemäße Ziel-Nukleinsäure ist die Ausgangsverbindung für das Verfahren zum Produzieren mehrfacher Nukleinsäuren. Die Ziel-Nukleinsäure enthält zwei oder mehrere Teile, die jeweils eine Nukleobasensequenz enthalten. Die beiden essentiellen Nukleobasensequenzen der Ziel-Nukleinsäure werden als Sequenz I und Sequenz B bezeichnet. Die Sequenz I wird als Matrizensequenz in der vorliegenden Erfindung verwendet. Die Sequenz B in der Ziel-Nukleinsäure, an die die Nukleobasensequenz B' des Primers hybridisiert, kann an einer beliebigen Position auf der Ziel-Nukleinsäure vorhanden sein. Es muss jedoch erkannt werden, dass die Ziel-Nukleinsäure sich an mindestens einer Seite der Nukleobasensequenz B' vorstreckt, wenn der Primer an das Ziel hybridisiert, so dass das verlängerbare Ende des Primers zum vorspringenden Ende weist. Das vorspringende Ende ist vorzugsweise nahe dem 3'-Ende des Primers. Dieses vorspringende Ende der Ziel-Nukleinsäure ist dasjenige Ende der Sequenz B, an das die Sequenz I gebunden ist. Am anderen Ende der Sequenz B können andere Nukleobasensequenzen gebunden oder nicht gebunden sein. Die Sequenzen I und B sind derart verbunden, dass die Elongation des Primers mit der Sequenz I als Matrize möglich ist. Daher ist in den meisten Fällen die natürliche Bindung zwischen den Mononukleotid-Einheiten der Nukleinsäure bevorzugt. Die Sequenz B und ihre Position in der Ziel-Nukleinsäure ist vorzugsweise vordefiniert und einzigartig. Es wird jedoch nicht ausgeschlossen, dass es mehr als eine vordefinierte und unabhängige Position in der Ziel-Nukleinsäure gibt, an die der Primer binden kann.
Die Sequenzen I und B haben vorzugsweise eine Länge, die die Spezifität ermöglicht, die für die vorgesehene Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens nötig ist. Ist keine Spezifität oder Selektivität notwendig, können diese Sequenzen nur eine geringe Anzahl von Nukleotiden in der Länge haben, beispielsweise 8 oder mehr Nukleotide. Enthält das Reaktionsgemisch andere Nukleinsäuren, die die erforderliche Spezifität zerstören können, ist es zweckmäßig, dass man längere Sequenzen I und B als 15 nt, stärker bevorzugt 15 bis 30 nt, wählt. Die Sequenz B ist derart ausgelegt, dass die Nukleobasensequenz B' des Primers an die Ziel-Nukleinsäure an dieses Sequenz binden kann. Daher enthält sie hinreichend Komplementarität zur Primersequenz B'. In den meisten Fällen ist es erforderlich, dass die Komplementarität an dem Ende der Sequenz B', an dem die Elongation des Primers am entsprechenden Teil der Sequenz B vorgesehen ist, vollständig ist. Die Sequenz B ist vorzugsweise eine analyt-unspezifische Sequenz, und sie ist nicht zur Bindung durch direkte Basenpaarung an den Analyten oder beliebige Substanzen in dem Reaktionsgemisch ausgelegt und vorgesehen, beispielsweise eine Probe, die möglicherweise die Spezifität der Erzeugung oder Bestimmung stört. Diese Sequenz B enthält vorzugsweise eine Strecke von mindestens 10 nt kontinuierlich miteinander verbundener Nukleotide, die die gleiche Nukleobase enthalten. Sie können eine unterschiedliche Base aufweisen, die sich an der Position direkt neben dieser Strecke in der 5'-Richtung befinden. Die Sequenz B kann beispielsweise aus Oligo-dA oder Oligo-dG oder Oligo-dC oder Oligo-dT bestehen. Sie besteht vorzugsweise aus Oligo-Purin, insbesondere Oligo-dG oder Oligo-dI. In einem bevorzugten Fall ist die Länge der Sequenz B um 6, 4, oder 2 Nukleotide länger als die Länge der Sequenz I. Der Grund dafür wird später erläutert.
Das zur Verlängerung des Primers in der vorliegenden Erfindung verwendete Nukleotid kann ein Mononukleotid, ein Oligonukleotid oder Polynukleotid sein. Das Nukleotid ist vorzugsweise ein Mononukleotid, insbesondere ein Mononukleosidtriphosphat, am stärksten bevorzugt ein Monodesoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP). In diesem Fall wird der Primer vorzugsweise um mindestens 10, vorzugsweise 11 bis 30 Nukleotide in dem Verlängerungsschritt verlängert. Die Verlängerung endet gewöhnlich, sobald das Ende des vorspringenden Teils (der Sequenz I) der Ziel-Nukleinsäure erreicht wurde.
Die Elongation der Sonde, wenn sie an die Ziel-Nukleinsäure hybridisiert, hängt von der Art der verwendeten Nukleotide ab. Die Elongation kann einerseits durch chemische Maßnahmen erzielt werden, wenn die Sonde und das Nukleotid chemische Gruppen aufweisen, die miteinander reagieren können, oder durch enzymatische Maßnahmen. Die enzymatische Elongation ist der bevorzugte Fall. Enzyme, die eine Sonde mit einer Ziel-Nukleinsäure als Matrize verlängern können, sind allgemein bekannt. DNA-Polymerasen können beispielsweise Primer durch nacheinander erfolgende Zugabe von dNTPS an ihr 3'-Ende verlängern. Bevorzugte Polymerasen sind beispielsweise aus E. coli oder anderen Bakterien und Viren erhältlich. Thermostabile Enzyme sind ebenfalls erhältlich.
Eine weitere Gruppe von Enzymen, die sich für eine Ausführungsform der Erfindung eignet, sind Ligasen, die die kovalente Verbindung von zwei Oligonukleotiden katalysieren. Dann wirkt eines der Oligonukleotide als Primer und das andere als Nukleotid.
Eine erfindungsgemäße Matrize ist eine Nukleinsäure, die einen Primer-Hybridisierungsteil und einen Matrizenteil enthält.
Ein erfindungsgemäßer Matrizenteil hat eine Nukleobasensequenz, die als Substrat zur Herstellung des Primerelongationsprodukts wirken kann, wenn der Primer an eine Stelle hybridisiert wird, die die Matrizensequenz unter den Bedingungen hybridisiert, die die Elongation ermöglichen. Sie hat vorzugsweise eine festgelegte, definierte oder undefinierte Sequenz. Die Sequenz muss die Verlängerung eines Primers ermöglichen und daher hinreichend lang sein. Die Matrizensequenz kann eine Sequenz beinhalten, die spezifisch für eine spezifische Verbindung ist, beispielsweise eine zu bestimmende Nukleinsäure. Die Elongation des Primers ergibt ein Elongations- oder Extensionsprodukt des Primers, so dass der Primer mehr Basen an seinem verlängerbaren Ende nach der Elongation als davor enthält. Die Extension beginnt vorzugsweise am 3'-Ende des Primers und endet am Ende der Matrizensequenz. Die erste Matrizensequenz, die erfindungsgemäß verwendet wird, ist Teil I der Ziel-Nukleinsäure.
Das Verfahren zur Erzeugung der erfindungsgemäßen mehrfachen Nukleinsäuren arbeitet mit einer Abfolge von Schritten. Nach jeglichen Präparationsschritten, die zur Erzeugung einer Probe nötig sind, wobei die Ziel-Nukleinsäure für das in der Erfindung verwendete Reagens zugänglich ist, ist der erste wesentliche Schritt der vorliegenden Erfindung die Hybridisierung eines Primer-Moleküls an die Nukleobasensequenz B der Ziel-Nukleinsäure T. Die Bedingungen, die sich zur Hybridisierung eignen, hängen beispielsweise von der Länge des Primers, dem Grad der Komplementarität und der Basen-Zusammensetzung der Primer ab. Solche Hybridisierungsbedingungen sind einem Fachmann jedoch im Allgemeinen bekannt. Insbesondere können solche Bedingungen nach der Offenbarung von Molecular Cloning, Hrsg. J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor 1989 gewählt werden.
In einem anschließenden Schritt wird das an die Ziel-Nukleinsäure hybridisierte Primer-Molekül Bedingungen unterworfen, die sich für die Elongation des Primer-Moleküls eignen, wobei man die Nukleobasensequenz I der Ziel-Nukleinsäure als Matrize zur Elongation dieses Primers verwendet. Die Elongations-Bedingungen hängen natürlich von der Art der verwendeten Elongation ab. Die Bedingungen für die am stärksten geeigneten Elongationsreaktionen, beispielsweise die durch DNA-Polymerase katalysierte Verlängerung von Primern durch aufeinander erfolgende Zugabe von dNTPs, ist allgemein in Molecular Cloning (siehe oben) beschrieben. Einige hilfreiche Hinweise sind ebenfalls in US-A-4,683,202 angegeben. Die Temperatur beim Elongationsschritt wird derart gewählt, dass der Primer an die Ziel-Nukleinsäure hybridisiert bleibt, aber auf eine Weise, die eine optimale Elongation ermöglicht. Bei einer enzymatischen Elongation sollte die Temperatur in der Nähe der Temperatur sein, die für die Enzymaktivität optimal ist. Die Elongationsgeschwindigkeit kann ansonsten nicht optimal sein. Von den erfindungsgemäß geeigneten Polymerasen sind DNA-abhängige DNA-Polymerasen besonders bevorzugt. Solche Enzyme sind beispielsweise aus E. coli T7 usw. erhältlich.
Das Elongationsprodukt E, das bei der ersten Elongation entstanden ist, ist der verlängerte Primer, der die Primersequenz und das bzw. die gebundenen Nukleotid(e) enthält. In den meisten Fällen wird das Elongationsprodukt in Bezug auf die Ziel-Nukleinsäure über die Sequenz B und die Sequenz I hinaus verlängert.
Ein zweiter wesentlicher Schritt in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Freisetzung der Ziel-Nukleinsäure T aus dem Elongationsprodukt E auf eine Weise, dass das Elongationsprodukt E und am stärksten bevorzugt auch die Ziel-Nukleinsäure T gegenüber einer Hybridisierung mit einem weiteren Primermolekül zugänglich ist.
Die Trennung einer Matrize vom Elongationsprodukt kann durch bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Chemikalien, wie Alkali, oder physikalische Maßnahmen, wie Erwärmen über den Schmelzpunkt des Hybrids, das sich aus der Matrizen-Nukleinsäure und dem Elongationsprodukt gebildet hat. Die Trennung erfolgt vorzugsweise durch Wärme. Die Temperatur hängt von der Länge des Elongationsproduktes und der Komplementarität und Basen-Zusammensetzung des Elongationsproduktes und der Primer ab. Allgemeine Berichte sind auch in Molecular Cloning (siehe oben) offenbart.
In einem dritten wesentlichen Schritt des Verfahrens wird das Elongationsprodukt E als Matrize für die Elongation eines weiteren Primer-Moleküls verwendet. Dies bedeutet, dass das weitere Primer-Molekül an einen Teil des Elongationsproduktes hybridisiert, der durch Bindung der Nukleotide an das erste Primer-Molekül neu erzeugt wurde. Dann arbeitet eine Nukleobasensequenz, die sich im vorherigen Primer-Molekül befindet, als tatsächliche Matrize für die Elongation des weiteren Primermoleküls. Ist die Sequenz I und somit die neu erzeugte Sequenz länger als die Sequenz B' des Primers, dann braucht der Primer nicht an das Elongationsprodukt zu hybridisieren, so dass ein Teil des Primermoleküls, das das verlängerbare Ende enthält, an die Nukleobasen der Sequenz B' des vorherigen Primermoleküls hybridisiert. In einem bevorzugten Fall ist jedoch die Sequenz I kürzer als die Sequenz B und die Sequenz B', und daher kommt es zu einer Überlappung von Basen, die vom vorherigen Primer-Molekül und dem neuen Primermolekül in dem Hybrid stammen, das aus dem Elongationsprodukt und dem weiteren Primermolekül gebildet wurde. Es gelten die gleichen Überlegungen wie oben. Dies bedeutet wiederum, dass die Temperatur unter der Schmelztemperatur des Hybrids sein sollte, das aus dem Elongationsprodukt und dem Primer gebildet wurde. Die Stelle des Elongationsproduktes E, an die das Primermolekül hybridisiert, wird derart ausgewählt, dass am verlängerbaren Ende des Primers eine hinreichende Länge einer Nukleobasensequenz existiert, die sich am Elongationsprodukt vorstreckt, das als Matrize zur Elongation des weiteren Primermoleküls dient. Der Matrizenteil in diesem Schritt des Verfahrens ist daher in den meisten Fällen der Teil des Elongationsproduktes der von dem ersten Primermolekül stammt, wohingegen die Primerhybridisierungsstelle mindestens einen Teil der Sequenz enthält, die durch Bindung von dem oder den Nukleotiden gebildet wurde. Das in diesem dritten Schritt erzeugte Elongationsprodukt wird als E' bezeichnet.
In dem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das erste Primermolekül verwendet, in dem zweiten Schritt wird ein weiteres Primermolekül verwendet. Man muss verstehen, dass das erfindungsgemäße Verfahren die Erzeugung der mehrfachen Nukleinsäuren durch nur eine Art von Primer ermöglicht. Sollen mehrere Bereiche einer Ziel-Nukleinsäure der Herstellung mehrfacher Nukleinsäuren unterworfen werden, kann es natürlich nötig sein, dass man Primer einer anderen Sequenz für den oder die anderen Bereich(e) braucht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Länge der Sequenzen I und B so gewählt, dass das Primermolekül beim Hybridisieren an das Elongationsprodukt eine Sequenz überspannt, die durch Bindung der Nukleotide und einen Teil der Sequenz B' gebildet wurde. Diese Ausführungsform ist in 2B gezeigt. Die Überlappung sollte nicht mehr als 6, vorzugsweise 4 oder weniger und am stärksten bevorzugt 2 nt aufweisen. Der Grund für diese Ausführungsform ist, dass die Primerhybridisierungsstellen zur Erzeugung von Elongationsprodukten einer bestimmten Länge verwendet werden können, selbst wenn nur eine Art von Nukleotid in dem Elongationsschritt und/oder den Primern gebunden ist, die im Wesentlichen nur eine Art Nukleotide enthalten. Eine stärker bevorzugte Ausführungsform wird nachstehend angegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann durch Mischen der nötigen Reagensien und dann durch Verwenden eines Temperaturprofils verwirklicht werden, das die Durchführung der Schritte der vorliegenden Erfindung ermöglicht. Das Ergebnis der oben erwähnten Schritte ist ein Doppelstrang aus Elongationsprodukt E und Elongationsprodukt E', und wenn die Ziel-Nukleinsäure nicht während der vorhergehenden Schritte zerstört wurde, einem Hybrid aus der Ziel-Nukleinsäure und einem weiteren Molekül des Elongationsproduktes E. Im bevorzugten Fall haben das Elongationsprodukt E und das Elongationsprodukt E' im Wesentlichen die gleiche Nukleobasensequenz. Dies gilt insbesondere, wenn nur eine Art von Nukleotid während der Elongation gebunden wird. Diese Tatsache reduziert die Komplexität der Reaktion erheblich. Diese Hybride können in irgendeinem gewünschten Schritt verarbeitet werden. Ist die Menge der Nukleinsäuren bereits erreicht, kann das erfindungsgemäße Verfahren zu diesem Zeitpunkt gestoppt werden. Dann können die Hybride einer weiteren Reaktion oder Isolation, Bestimmung usw. unterworfen werden. Dies kann die Trennung der Stränge der Doppelstränge und/oder Hybridisierung weiterer Nukleinsäuren an die Produkte umfassen oder nicht.
In einem bevorzugten Fall wird die Menge der erzeugten Nukleinsäuren, beispielsweise der Elongationsprodukte E oder E', jedoch weiter erhöht. Entsprechend der Cyclierung in der Polymerasekettenreaktion von US-A-4,683,202 können die Produkte (Elongationsprodukte) oder/und die Ausgangsverbindungen (Ziel-Nukleinsäure) der vorherigen Schritte als Substrate im nächsten Zyklus von Schritten verwendet werden, wodurch die Anzahl der erzeugten Nukleinsäuren (Elongationsprodukte) erhöht wird. Jeder Zyklus der Schritte umfasst daher einen Schritt Hybridisieren des Primers an eine Nukleinsäure, einen Schritt Verlängern des Primers und einen Schritt Trennen der vorherigen Matrize vom Elongationsprodukt. Zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung kann hinzugefügt werden, dass in jedem erfindungsgemäßen Reaktionszyklus eine neue Ziel-Nukleinsäure T erzeugt wird durch Bilden eines Elongationsproduktes, so dass man davon ausgehen kann, dass jeder Zyklus wiederum das erfindungsgemäße Verfahren beginnt. Gemäß der vorgesehenen Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann die Kettenreaktion an jedem dieser Zyklen anhalten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist im Allgemeinen beendet, wenn die gewünschte Menge an doppelsträngigen Nukleinsäuren erzeugt wurde. Die Anzahl der Zyklen der Schritte ist gewöhnlich zwischen 10 und 50, vorzugsweise zwischen 15 und 30. Bei einer anderen Definition sollte die Anzahl der erzeugten doppelsträngigen Nukleinsäuren mehr als 9, vorzugsweise mehr als 100 betragen.
Eine der Eigenschaften der Polymerasekettenreaktion ist, dass die Kettenreaktion erzielt wird, indem man das Temperaturprotokoll einfach hinreichend oft wiederholt. In dem vorliegenden Fall werden nach Schritt c) die aus den Elongationsprodukten und der Ausgangsverbindung gebildeten Hybride denaturiert, so dass eine weitere Hybridisierung eines weiteren Primermoleküls an die Ausgangsverbindung sowie jeweils an die Elongationsprodukte (E und E') ermöglicht wird. In jedem Zyklus wird die Anzahl der Kopien der Elongationsprodukte erhöht.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann an einem beliebigen Schritt anhalten. Werden beispielsweise einzelsträngige Nukleinsäuren statt doppelsträngiger Nukleinsäuren gewünscht, kann man die Kettenreaktion mit einem Schritt beenden, der die doppelsträngigen Nukleinsäuren, die aus den Elongationsprodukten und/oder Ausgangsverbindungen (Ziel-Nukleinsäuren) gebildet wurden, trennt. Das Gleiche gilt, wenn ein Hybrid, das aus einem Primermolekül und einem Elongationsprodukt gebildet wurde, das vorgesehene Produkt des Verfahrens ist. Dann kann man einfach die Elongationsaktivität (beispielsweise Enzymaktivität) zerstören, während die Hybridisierungsbedingungen beibehalten werden.
Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Nukleotiden, am stärksten bevorzugt dNTPs, die eine promiskuitive Base enthalten, zur Bindung an den Primer. Die promiskuitive Base ist erfindungsgemäß so definiert, dass sie mit jeder der Nukleobasen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin Basenpaare bilden kann. Die Affinität zu einigen der Basen kann zwar höher sein als gegenüber anderen, eine promiskuitive Base kann prinzipiell mit allen von ihnen Basenpaare bilden. Eine solche promiskuitive Base ist beispielsweise Inosin. So ermöglicht die Verwendung einer Art von Mononukleosidtriphosphat, dass der zu verlängernde Primer, ungeachtet der Art der Nukleotide in der Matrize verlängert wird. Da Inosin eine bessere Basenpaarung mit dem Cytosin als mit Adenosin ermöglicht und noch besser als mit Thymin und Guanin, arbeitet das Verfahren wahrscheinlich am besten, je mehr Cytosin in der Matrizensequenz enthalten ist. Ein Ergebnis der Elongation des Primers mit Inosintriphos phaten ist ausschließlich, dass die sequenzspezifische Information in der Zielsequenz nicht im Primerelongationsprodukt enthalten ist. Erfindungsgemäß kann man jedoch eine sequenzspezifische Information in dem Elongationsprodukt aufrechterhalten, indem eine bestimmte Menge von dATP, dGTP, dCTP oder dTTP in der Elongationsreaktion eingebaut wird. Gewöhnlich sind mindestens 80% der Basen in dem Nukleotid promiskuitive Basen, stärker bevorzugt 100% oder all diese Basen. Genau genommen ergibt dieser Aspekt der Erfindung keine Amplifikation einer ursprünglichen Ziel-Nukleinsäuresequenz, wohingegen es als eine Amplifikation einer Sequenz angesehen werden kann, die aus der Zielsequenz erzeugt wird. Eine weitere Folge der Ausführungsform mit einer promiskuitiven Base ist, dass die Nukleobasensequenz der Elongationsprodukte E und E' im Wesentlichen gleich ist. Sie können zudem aneinander hybridisieren.
Die Verwendung einer promiskuitiven Base in den zur Elongation der Primer verwendeten Nukleotiden verleiht dem Doppelstrang, der sich zwischen der Ziel-Nukleinsäure und dem Elongationsprodukt gebildet hat, eine Schmelztemperatur, die erheblich niedriger ist als die Temperatur der Hybride mit A/T- oder A/U- und C/G-Basenpaaren. Dies ergibt für die vorliegende Erfindung den Vorteil, dass man die Hybride mit relativ niedrigen Temperaturen denaturieren kann, und zwar vorzugsweise unter 55°C, am stärksten bevorzugt unter 45°C, für Ziel- oder Matrizen-Nukleinsäuren mit einer Länge von etwa 30 nt. Der Denaturierungsschritt ist gewöhnlich der Schritt in einem Amplifikationsverfahren, der die höchste Temperatur erfordert. Daher kann man erfindungsgemäß das Fachgebiet mit einem Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäuresequenzen versorgen, wobei Thermozyklen verwendet werden, die die Schritte Primerhybridisierung, Primerextension und thermische Denaturierung umfassen, aber keine Temperatur über 55°C, vorzugsweise nicht über 45°C, umfassen.
Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens zum Erzeugen mehrfacher doppelsträngiger Nukleinsäuren sind nachstehend im Zusammenhang mit der eingehenden Beschreibung der Zeichnungen beschrieben.
Dieses Verfahren zum Erzeugen mehrfacher doppelsträngiger Nukleinsäuren kann sehr vorteilhaft zur Bestimmung der Analyten verwendet werden. Das Verfahren zur Bestimmung eines erfindungsgemäßen Analyten ist prinzipiell durch die folgenden Schritte definiert:

– Binden einer Ziel-Nukleinsäure T an den Analyten;
– Gegebenenfalls Trennen des an die Ziel-Nukleinsäure gebundenen Analyten von der restlichen Probe;
– Unterwerfen der Ziel-Nukleinsäure dem vorstehend erwähnten Verfahren zum Erzeugen mehrfacher doppelsträngiger Nukleinsäuren und
– Bestimmen des Auftretens der Elongationsprodukte als Maß für die Anwesenheit oder Menge des Analyten.

Ein Analyt in diesen Verfahren kann ein beliebiges Molekül sein, das von einer Sonde erkannt werden kann, vorzugsweise immunologisch aktive Analyten, wie Antikörper, Antigene oder Haptene oder Nukleinsäuren oder Nukleinsäuren-Analoga. Die Bestimmung der Nukleinsäuren ist eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens.
Der zu bestimmende Analyt kann eine Komponente einer Probe sein, wie eine Körperflüssigkeit oder eine davon hergeleitete Flüssigkeit. Bei Nukleinsäuren werden gewöhnlich sämtliche Proben den vorherigen Schritten zum Freisetzen der Nukleinsäuren ausgesetzt, die möglicherweise in den Zellen enthalten sind. Die Analyt-Nukleinsäure kann daher aus einer beliebigen Quelle, insbesondere einer bakteriellen oder viralen Quelle stammen. Die Analyt-Nukleinsäure kann insbesondere eine Ribonukleinsäure oder eine Desoxyribonukleinsäure sein.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten durch: Binden einer Ziel-Nukleinsäure T mit einem Bereich, der einen analytenspezifischen Bereich A umfasst, und einem Bereich, der eine analytenunspezifische Domäne umfasst, die die Nukleobasensequenz B enthält, an den Analyten; Hybridisieren eines Primers, der eine Nukleobasen-enthaltende Sequenz B' umfasst, die komplementär zur Sequenz B ist, an die Ziel-Nukleinsäure; Verlängern des Primers unter Verwendung der Ziel-Nukleinsäure als Matrize, so dass man ein erstes Elongationsprodukt E durch die kovalente Bindung von einem oder mehreren Nukleotiden, an die Sonde erhält; Trennen der Ziel-Nukleinsäure T von dem Elongationsprodukt E; Verwenden des Elongationsproduktes E als Matrize zur Elongation eines weiteren Moleküls des Primers, so dass man ein Elongationsprodukt E' erhält; Wiederholen der Schritte Verlängern der Primermoleküle und Trennen der Elongationsprodukte hinreichend oft, dass die gewünschte Menge an doppelsträngiger Nukleinsäure erhalten wird; und Bestimmen des Vorkommens des Elongationsproduktes als Maß für die Anwesenheit oder Menge des Analyten.
Verglichen mit dem Verfahren zum Erzeugen mehrfacher doppelsträngiger Nukleinsäuren wie oben beschrieben erfordert das Verfahren zur Bestimmung des Analyten, dass die Ziel-Nukleinsäure einen analytenerkennenden Bereich A aufweist. Dieser Bereich A in der Ziel-Nukleinsäure ist eine Einheit, die den Analyten auf spezifische Weise erkennt, es wird beispielsweise nur der zu bestimmende Analyt unter den angewendeten Bedingungen erkannt. Daher kann dieser Bereich A ein Bereich sein, der ein Epitop oder eine Nukleobasensequenz des Analyten erkennt, beispielsweise eine Antikörper-Einheit oder eine Nukleobasensequenz, die komplementär zu einem Teil der Analyt-Nukleobasensequenz ist.
Je nach der Art des analytenspezifischen Bereichs (immunologisch aktive Stelle, Nukleobasensequenz usw.) kann ein analytenspezifischer Bereich innerhalb der Sequenz I der Ziel-Nukleinsäure T lokalisiert sein oder nicht. Die Hauptüberlegung darüber, wo sich der Bereich A befindet, ist ob die Elongation des Primers mit der Sequenz I als Matrize noch möglich ist.
Der analytenspezifische Bereich A und die Sequenz B können kovalent oder nicht-kovalent gebunden sein, sind aber vorzugsweise kovalent gebunden. Im speziellen Fall, wobei A und B Nukleotid-Sequenzen sind, ist das 5'-Terminus von A vorzugsweise an den 3'-Terminus von B gebunden, oder der 3'-Terminus von A ist an den 5'-Terminus von B gebunden. A und B können direkt oder über eine Zwischeneinheit verbunden sein. Eine solche Zwischeneinheit kann eine weitere Nukleobasensequenz mit einer Länge von mehr als 10 Nukleotiden vorzugsweise zwischen 12 und 20 nt sein. Diese Nukleinsäuresequenz ist vorzugsweise nicht für den Analyten spezifisch. Daher kann es sogar eine Nukleinsäuresequenz geben, die aus identischen Baseneinheiten besteht, beispielsweise OligodA, OligodG, OligodC oder OligodT. Diese Zwischensequenz ist vorzugsweise derart ausgelegt, dass sie als Matrize für die Elongation eines Primers wirkt, der an die Sequenz B hybridisiert ist, und ist am stärksten bevorzugt Sequenz I. In dem am stärksten bevorzugten Fall der Bestimmung einer Nukleinsäure ist die Ziel-Nukleinsäure T ein funktionelles Oligonukleotid, das in dieser Reihenfolge (5'-) die analytenspezifische Sequenz A, die Zwischenmatrizensequenz I, und die analytenunspezifische Sequenz B(-3') enthält.
Die Bindung der Ziel-Nukleinsäure an den Analyten erfolgt unter Bedingungen, die es ermöglichen, dass der Analytenerkennungsbereich A an den Analyten bindet. Bevorzugte Wechselwirkungen sind spezifische Wechselwirkungen wie in immunologischen Reaktionen oder Nukleobasenpaarung. Die Bedingungen, unten denen diese Bindungen erfolgen können, sind dem Fachmann bekannt.
Der Schritt Trennen der analytengebundenen Ziel-Nukleinsäure von der verbleibenden Probe ist bei der Steigerung der Spezifität der Bestimmung höchst hilfreich. Diese Trennung erfolgt vorzugsweise durch Immobilisieren des Komplexes auf einer festen Phase, vorzugsweise durch Verwendung einer analytenspezifischen Festphase. Analytenspezifische Festphasen sind beispielsweise Festphasen, an die ihre beiden Einheiten gebunden sind, die den Analyten erkennen, beispielsweise Antikörper gegen den Analyten. Die Bedingungen für die Bindung des Komplexes an die Festphase kann wie bei üblichen immunchemischen Bestimmungen angewendet werden, wie die Bedingungen, die in US-A-4,624,930 beschrieben sind. Durch Entfernung der restlichen Flüssigkeit von der Festphase wird der Überschuss an Ziel-Nukleinsäure zusammen mit anderen störenden Substanzen weggewaschen.
Einige bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind unten im Zusammenhang mit der eingehenden Beschreibung der Zeichnungen gezeigt.
Das Verfahren zur Bestimmung eines Analyten wird durch die Bestimmung des Auftretens des Elongationsproduktes als Maß für die Anwesenheit oder Menge des Analyten abgeschlossen. Das Auftreten des Elongationsproduktes kann direkt oder indirekt bestimmt werden. Sämtliche Verfahren, die im Allgemeinen für die Bestimmung von Nukleinsäuren geeignet sind, sind für das Verfahren zur Bestimmung des Elongationsproduktes anwendbar. In fast jedem Fall wird das Auftreten des Elonagationsproduktes von dem Auftreten einer markierten Einheit abhängig gemacht. Dies sind zwei besonders bevorzugte Wege zur Bestimmung der Elongationsprodukte.
Bei einer ersten bevorzugten Ausführungsform wird das Elongationsprodukt an eine markierte Sonde hybridisiert, beispielsweise eine Nukleinsäure, die an sich bestimmt werden kann, beispielsweise indem eine nachweisbare Markierung daran gebunden ist, wie eine fluoreszierende Einheit oder eine Einheit, die an eine nachweisbare Einheit gebunden werden kann, beispielsweise Biotin oder Digoxigenin (beispielsweise gemäß US-A-5,344,757). Die Menge oder die Anwesenheit eines Hybrids, das aus dem Elongationsprodukt und dieser Sonde gebildet wird, wird im Allgemeinen bestimmt. Es kann vorteilhaft sein, eine Sonde in einer überschüssigen Menge gegenüber dem Elongationsprodukt zu verwenden, und die Menge der Sonde abzutrennen, die nicht an das Elongationsprodukt gebunden ist. Dies kann auf einfache Weise erfolgen, indem eine weitere Sonde verwendet wird, die derart ausgelegt ist, dass das Elongationsprodukt an einer anderen Stelle als die Sonde gebunden wird. Das allgemeine Format kann dem bekannten "Sandwich-Hybridisierungstestformat" folgen. Ein geeignetes Verfahren ist in EP-A-0 079 139 beschrieben. Dieses Verfahren kann durch Auswahl des Elongationsproduktes als zu bestimmende Nukleinsäure angewendet werden.
Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren zur Bestimmung der Menge an Elongationsprodukt ist der Einbau einer Markierung in das Elongationsprodukt. Besonders geeignet ist die Markierung des Elongationsproduktes während seiner Erzeugung, am stärksten bevorzugt durch Verwendung markierter Nukleotide zur Bindung. Es versteht sich, dass nicht alle eingebauten Nukleotide in jedem Fall markiert sein müssen. In diesem Fall kann die Bestimmung des Elongationsproduktes einfach durch Abtrennen des Überschusses an markiertem Nukleotid erfolgen, beispielsweise durch Einfangen des markierten Elongationsproduktes auf einer Festphase und Entfernen der überschüssigen Nukleotide mit einer Lösung. Dieses Verfahren kann der allgemeinen Offenbarung von EP-B-0 237 362 folgen. In diesem Fall wird das Elongationsprodukt behandelt wie die markierten Amplifikate dieser Offenbarung.
Eine mögliche Ausführungsform eines Verfahrens zur Bestimmung eines Analyten arbeitet folgendermaßen:

i) Inkubieren der Ziel-Nukleinsäure (gegebenenfalls im Überschuss) mit einer Probe, die den Analyten enthält, unter Bedingungen, die die Bindung der Ziel-Nukleinsäure an den Analyten ermöglichen,
ii) Fangen des an die Ziel-Nukleinsäure gebundenen Analyten an einer Festphase, beispielsweise durch analytenspezifische Erkennung,
iii) Trennen der ungebundenen Ziel-Nukleinsäure von der immobilisierten Ziel-Nukleinsäure,
iv) gegebenenfalls Ablösen der Ziel-Nukleinsäure von der Festphase,
v) Inkubieren der Ziel-Nukleinsäure unter den Bedingungen, wie für das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung mehrfacher Kopien von Nukleinsäuren beschrieben (beispielsweise ein Primer, eine DNA-Polymerase, dITP und die nötigen Puffer), Unterwerfen des Gemischs Temperaturzyklen zur Vervielfältigung der Elongationsprodukte, gegebenenfalls Einbringen von Markierungen in die Elongationsprodukte und Bestimmen des Auftretens der Elongationsprodukte wie oben beschrieben.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den 1A bis 1H sind verschiedene mögliche Anordnungen zur Auswahl der analytenspezifischen Sequenz in Bezug auf die Ziel-Nukleinsäure und des Primers beschrieben.
In den 2A, B und C sind mögliche Reaktionsmodi beschrieben.
Die 3 zeigt ein Autoradiogramm, das das Ergebnis der Amplifikation gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verglichen mit den Kalibrierungsbedingungen veranschaulicht.
Die 4 zeigt das Ergebnis des Verfahrens mit verschiedenen Enzymen.
Die 5 und 6 zeigen Schemata für mögliche Reaktionswege für 2 erfindungsgemäße Modi, die sich in der Hybridisierungsstelle des Primers unterscheiden.
Die 6 zeigt die zweite erfindungsgemäße Ausführungsform, wobei m und n nicht gleich sind.
Die 7 zeigt ein Beispiel der schematischen Übersicht von 5.
Die 8 zeigt eine schematische Übersicht über ein spezifisches Beispiel von 6.
In den Zeichnungen und in der Beschreibung soll nichts die Erfindung auf Ausführungsformen einschränken, bei denen nur doppelsträngige Hybride gebildet werden. Es gibt einige Anzeichen dafür, dass zumindest unter spezifischen Bedingungen Triplices gebildet werden. Die Bildung von Triplices hat aber offensichtlich keinen negativen Einfluss auf die Produkte, die hergestellt werden oder erfindungsgemäß produzierbar sind.
Eingehende Beschreibung der Zeichnungen
Die 1A zeigt das Hybrid, das aus einer Ziel-Nukleinsäure, die einen gesonderten analytenspezifischen Teil A, einen analytenunspezifischen Matrizensequenzteil I und die analytenunspezifische Sequenz B enthält, mit einem Primer gebildet wird, dessen Sequenz B' komplementär zur Sequenz B ist.
Die 1B zeigt das Konstrukt, das aus dem Analyten gebildet wird, das an die Ziel-Nukleinsäure über den analytenspezifischen Teil von 1A gebunden ist. Es lässt sich ersehen, dass zudem der Primer, der die Sequenz B' enthält, an die Ziel-Nukleinsäure hybridisieren kann.
Die 1C zeigt ein Konstrukt, das aus einer Ziel-Nukleinsäure ohne gesonderten analytenspezifischen Teil und einem Primer mit Teil B' gebildet wird. Es ist ersichtlich, dass die Sequenz B länger als die Sequenz I ist.
Das Konstrukt von 1D kann zur Bestimmung eines Analyten verwendet werden, wenn der Analyt eine Nukleinsäure ist, und die Sequenzen von I und B derart ausgewählt werden, dass sie komplementär sind zu einem Teil der Analyten-Nukleinsäuresequenz. In diesem Fall kann es zur Durchführung der Erzeugung mehrfacher Kopien von Nukleinsäuren nötig sein, das Hybrid zu denaturieren, das aus der Ziel-Nukleinsäure T und dem Analyten vor der Hybridisierung des Primers gebildet wurde.
Die 1E zeigt den bevorzugten Fall, wobei sich der analytenspezifische Teil A im Wesentlichen innerhalb der Sequenz I befindet und über diese hinausragt. Daher kann der Primer, der die Sequenz B' enthält, an die Ziel-Nukleinsäure hybridisieren, aber nicht direkt verlängert werden. Wird ein Enzym mit Strangversetzungsaktivität verwendet, kann eine Elongation erfolgen.
Die 1F zeigt einen Fall, bei dem der analytenspezifische Teil an I in der Sequenz I gebunden sein kann und wobei A keine Nukleinsäuresequenz ist, aber beispielsweise durch immunaktive Wechselwirkungen an den Analyten binden kann.
Die 2A zeigt schematisch das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung mehrfacher Nukleinsäuren, wobei ein Primer verwendet wird, der im Wesentlichen aus einer Nukleobasensequenz besteht, die zur analytenunspezifischen Sequenz B der Ziel-Nukleinsäure komplementär ist. Der Primer B' wird verlängert, um das Elongationsprodukt E zu erhalten. Nach der Strangtrennung kann an jeden der Einzelstränge ein Primermolekül hybridisieren und verlängert werden, wobei entweder die Ziel-Nukleinsäure oder das Elongationsprodukt E als Matrize verwendet wird. Nach der Strangtrennung können die neu erzeugten Extensionsprodukte E' und die Ziel-Nukleinsäure als Matrizen in einer neuen Runde aus Primerhybridisierung, Elongation und Denaturierung usw. verwendet werden.
Die 2B zeigt eine mit Figur A vergleichbare Ausführungsform und unterscheidet sich nur insofern, dass das zweite Primermolekül teilweise in die Sequenz B hineinreicht, wenn es an eines der Elongationsprodukte hybridisiert.
Die 2C zeigt den Fall, bei dem keine Verlängerung des Primers mit dem analytenspezifischen Bereich als Matrize erfolgt. In diesem Fall wird der Primer derart an die analytenunspezifische Sequenz B hybridisiert, dass er nur mit der Sequenz I als Matrize zur Elongation verlängert werden kann. Die Elongation endet am Ende des analytenunspezifischen Teils. Den 2A und 2C zufolge erzeugen wiederholte abwechselnde Schritte der Strangtrennung, Hybridisierung zusätzlicher Primermoleküle und Elongation mehrfache Nukleinsäuren.
Eingehende Beschreibungen der 3 und 4 finden sich in den Beispielen.
Die 5 und 6 zeigen ein allgemeines Schema für die erfindungsgemäßen Reaktionen, wobei sich 2 Ausführungsformen definieren lassen. Y und X sind Nukleotide. Alle Nukleotide in einer Reihe sind so verbunden, dass sie eine Nukleinsäure veranschaulichen. Die Nukleotide, die mit einem Prime(') spezifiziert sind, sind komplementär zu den Nukleotiden ohne Prime('). Die Nukleotide Y befinden sich in Segment I, die Nukleotide X befinden sich in Segment B bzw. B'. In allen Fällen sind m und n natürliche Zahlen, die so groß sind wie die Menge der Nukleotide in dem erwogenen Bereich.
Im allgemeinen Fall können die Nukleotide Y und X eine beliebige gewünschte Bedeutung haben, wobei die Baseneinheiten aus A, G, C, T und U ausgewählt werden. Unter den Bedingungen, dass die spezifische Hybridisierung des Primers an ein Ziel möglich ist, wird ein Konstrukt, wie es zuerst in den 5 und 6 gezeigt ist, gebildet. Nach der Elongation mit einem Enzym und einer promiskuitiven Base, die Mononukleosidtriphosphat, beispielsweise dITP, enthält, wird ein Homoinosin-Schwanz an den Primer gebunden, ungeachtet der Art der Nukleotide Y₁ ... Y_m. Nach der Denaturierung kann ein Primer an das Ziel hybridisieren und einer an das verlängerte E, und zwar je nach n, m und dem Komplementär zu X und Y. Nach der Kettenreaktion durch Elongation, Denaturierung und Hybridisierung wird eine große Zahl verlängerter Moleküle gebildet.
In einer einfachen Ausführungsform sind die Nukleobasen in den Nukleotiden X₁ ... X_n gleich. In diesem Fall können sie aus A, G, C oder T ausgewählt werden, oder sie können eine promiskuitive Base wie Inosin sein. Im letzteren Fall sind die Nukleotide X₁' ... X_n' vorzugsweise Cytosineinheiten, weil die Affinität von OligodC zu OligodI hoch ist.
Die Ausführungsform der 5 ist besonders einfach, wenn n und m identisch sind, beispielsweise jeweils 30 im Durchschnitt. In diesem Fall kann der Primer in einer spezifischen Weise an die Strecke der 30 Nukleotide (I), die am 3'-Ende des vorherigen Primers gebunden sind, hybridisieren. Wenn alle Nukleotide X' die gleiche Bedeutung haben, wird keine Überlappung der Hybridisierung des zweiten Primers mit den Sequenzen des vorherigen Primers vorgesehen und erzielt (5). In diesem Fall können m und n gleich sein, beispielsweise 30.
Die 6 zeigt einen Fall, bei dem m gleich n_–2 ist und X₁' zu X₂' komplementär ist. In diesem Fall gibt es eine Überlappung der Hybridisierungsposition des zweiten Primers mit den letzten 2 Nukleotiden des vorherigen Primers. Diese Überlappung hilft bei der Erzeugung einer Übereinstimmungslänge der Elongationsprodukte. Die 5 zeigt das allgemeine Schema einer erfindungsgemäßen Ausführungsform.
Die 7 zeigt den Fall, bei dem Y gleich C ist, X gleich I ist und X' gleich C ist, und m und n gleich sind. Es lässt sich ersehen, dass erstens in diesem Fall die Hybridisierungsposition des Primers an das Ziel nicht sehr klar definiert ist, und zweitens die Möglichkeit, dass interne Schleifenstrukturen gebildet werden, erhöht wird.
Daher zeigt die 7 die bevorzugte Ausführungsform, bei der X'₁ (beispielsweise G) so ausgewählt ist, dass es komplementär zu X₂' (beispielsweise C) ist. Dies vermeidet Nebenprodukte der Reaktion. Die 7 ist eine schematische Zeichnung der Situation, wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist.
Die vorliegende Erfindung hat einige beträchtliche Vorteile. Die Verwendung von nur einem Primer pro Zielsequenz vereinfacht dieses Verfahren sehr. In dem Fall, dass nur ein Nukleotid verwendet wird, wird die Komplexität des Systems noch weiter reduziert. In dem Fall, bei dem eine promiskuitive Base verwendet wird, brauchen keine stark thermostabilen Polymerasen verwendet werden. Wird nur eine Art von gebundenem Nukleotid verwendet, kann die Geschwindigkeit des Verfahrens erhöht werden. Das Verfahren versorgt das Fachgebiet mit einer universellen, anwendbaren sequenzunabhängigen Amplifikation und kurzen Zyklusperioden.
Die vorliegende Erfindung kann in fast allen Formaten zur Bestimmung der Analyten verwendet werden. Gewöhnlich werden die erzeugten Kopien der Nukleinsäure anschließenden Bestimmungsschritten unterworfen. Dies kann durch die Bindung einer beliebigen Markierung an die erzeugten Nukleinsäuren erzielt werden.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung eingehender.
Beispiel 1
Synthetische DNA-Oligonukleotide (5'-C₃₀I₃₀-3', SEQ ID NO 1) können an synthetische DNA-Oligonukleotide (5'-C₃₀-3' (SEQ ID NO 2), 5'-T₃₀-3' (SEQ ID NO 3), 5-C₃₀G-3' (SEQ ID NO 4) und 5'-C₃₀GG-3' (SEQ ID NO 5)) hybridisieren.
Alle Oligonukleotide wurden erhalten von:
DNA Technology APS
Forsherparken/Science Park Aarhus
Gustav Wieds Vej 10
8000 Aarhus C
Dänemark
Ein Satz von Hybridisationsreaktionen (10 μl) wurde hergestellt, die jeweils 100 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄, pH-Wert 7,0, 0,1 mM EDTA, 0,2 μM Ziel-Oligonukleotid (5'-C₃₀I₃₀-3') und 0, 2 μM der in 3 gezeigten unterschiedlichen Oligonukleotidprimer enthielten. Jede Reaktion wurde für 5 min in einem Heizblock auf 95°C erwärmt und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden 2 μl Ladepuffer (0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylolcyanol, 30% verdünntes Glycerin, 0,09 M Tris-Borat, pH-Wert 8,3, 1 mM EDTA) zu jeder Reaktion gegeben. Die Proben (10 μl) wurden dann auf ein 2% Agarosegel geladen und einer Elektrophorese unterworfen, bis das Bromphenolblau bis zur Mitte des Gels gewandert war. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt, so dass die DNA sichtbar gemacht wurde, und das Gel wurde photographiert. Wie in der 4 gezeigt produziert das Ziel-C₃₀I₃₀-Oligonukleotid allein (Spur 1) keine sichtbare Bande im Gel. Entsprechend ist keine Bande im Gel offensichtlich, wenn die Hybridisierungsreaktionen das Ziel-C₃₀I₃₀-Oligonukleotid und entweder den Primer I₃₀ (SEQ ID NO 6) (Spur 2), den Primer A₃₀ (SEQ ID NO 7) (Spur 3) oder den Primer G₃₀ (SEQ ID NO 8) (Spur 6) enthalten, was zeigt, dass diese Primer nicht an das Ziel-Oligonukleotid hybridisieren. Die Reaktionen, die die C₃₀I₃₀-Matrize und entweder den Primer T₃₀ (Spur 4), den Primer C₃₀ (Spur 5), den Primer C₃₀G (Spur 7) oder den Primer C₃₀GG (Spur 8) enthalten, produzieren hingegen eine sichtbare Bande im Gel, was zeigt, dass sämtliche Primer an die Matrize hybridisieren. Der Befund, dass nur die Primer mit vielen Pyrimidin-Resten an die Matrize hybridisieren, legt nahe, dass der beobachtete Komplex ein Triplex ist, der aus 1 Ziel-Oligonukleotid und 2 Primern besteht. Diese Behauptung wird zudem durch die offensichtliche Unfähigkeit des Primers I₃₀ zur Bindung an die Zielsequenz unterstützt.
Beispiel 2
Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim GmbH), Stoffel-Fragment (Perkin Elmer) und Super-Taq-Polymerase können in einer Ein-Primer-ein-Nukleotid-PCR verwendet werden.
Ein Satz PCR-Reaktionen (50 μl) wurde wie in der Tabelle gezeigt hergestellt. Die Matrize ist 5'C₃₀I₃₀-3', der Primer ist 5'-C₃₀G-3', und das Nukleotid ist dITP (Boehringer Mannheim GmbH).
Enzym-Puffer

10 × Taq DNA Polymerasepuffer von Boehringer Mannheim: 100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl₂, 500 mM KCI – pH 8,3 (20°C)
10 × Stoffelfragmentpuffer: 100 mM Tris-HCl, 100 mM KCI, 30 mM MgCl₂ – pH 8,3 (20°C)
10 × Super-Taq-Puffer: 500 mM Tris-HCl, 500 mM KCI, 70 mM MgCl₂, 160 mM (NH₄)₂SO₄ – pH 9,0 (25°C), 0,2 mg/ml BSA

Die Reaktionen wurden mit 20 μl Mineralöl überschichtet, und die Röhrchen wurden in einem programmierbaren Thermal Controller Model PTC-100-96V untergebracht. Der PCR-Zyklus bestand aus: Denaturierung bei 55°C für min, Anlagern bei 20°C für 1 min, Synthese bei 37°C für 2 min und 30 Zyklen. Nach der Amplifikation wurden die Reaktionen jeweils in ein Eppendorf-Röhrchen überführt, und 10 μl Ladepuffer (0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylolcyanol, 30% verdünntes Glycerin, 0,09 M Tris-Borat pH-Wert 8,3, 1 mM EDTA) wurden zugegeben. Die Proben (10 μl) wurden dann auf ein 2% Agarosegel geladen und zusammen mit zwei Größenmarkern einer Elektrophorese unterworfen. Der Größenmarker 1 enthielt 0, 2 μM Matrize (5'-C₃₀I₃₀-3') 0,2 μM Primer (5'-C₃₀G-3'), 50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 7 mM MgCl₂, 16 mM (NH₄)₂SO₄, pH-Wert 9,0 (25°C) und 0,2 mg/ml BSA. Der Größenmarker 2 (10 μl) enthielt 0,4 μM Matrize (5'-C₃₀I₃₀-3'), 50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 7 mM MgCl₂, 16 mM (NH₄)₂SO₄, pH-Wert 9,0 (25°C) und 0,2 mg/ml BSA. Die Größenmarker wurden bei Raumtemperatur für 30 min in einem 10 μl Reaktionsvolumen hybridisiert. Vor der Beladung auf das Gel wurden 2 μl Lade-Puffer zugegeben. Das Gel wurde elektrophoretisch aufgetrennt, bis das Bromphenolblau bis zur Mitte des Gels gewandert war. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt, so dass die DNA sichtbar gemacht wurde, und photographiert. Die DNA in dem Gel wurde auf eine Gene-Screen+Membran von DuPont überführt, wobei ein alkalischer Übertragungspuffer (0,4 M NaOH, 0,6 M NaCl) verwendet wurde. Die Übertragung erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Am folgenden Tag wurde die Membran für 10 min in 0,5 M Tris-HCl pH-Wert 7,5, 1 M NaCl-Puffer neutralisiert. Die Membran wurde in einem Hybridisierungsröhrchen untergebracht und in 20 ml Hybridisierungspuffer (0,5 M Na₂HPO₄, pH-Wert 7,2, 7% SDS, 1 M NaCl) für 2 Std. bei Raumtemperatur in einem Hybridisierungsofen vorhybridisiert. Die Sonde (10 μl eines 1 μM, ³²P-markierten 5'-C₃₀G-3'-Oligonukleotids) wurde für 5 min bei 95°C denaturiert und zu dem Hybridisierungsröhrchen gegeben. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag wurde die Membran für 15 min bei Raumtemperatur in 200 mM Na₂HPO₄ gewaschen, an der Luft getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen. Nach 6 Stunden wurde der Film entwickelt.
Wie in der 5 gezeigt produzieren die Taq-Polymerase von Boehringer Mannheim (Spur 3) und die Super-Taq-Polymerase (Spur 5) jeweils ein nachweisbares Amplifikat der erwarteten Größe (verglichen mit den Größenmarkern). Es wird kein Signal in den Kontrollreaktionen mit der Taq-Polymerase von Boeringer Mannheim erfasst, d.h. wenn die Matrize weggelassen wird (Spur 4), wenn der Primer weggelassen wird (Spur 10) oder wenn das Enzym aus der Reaktion weggelassen wird (Spur 9). Das Super-Taq-Enzym produziert auch kein nachweisbares Amplikon, wenn der Primer weggelassen wird (Spur 12), und wenn das Enzym weggelassen wird (Spur 11). Ein schwaches Signal mit einer Stelle, die sich vom korrekten Amplikon unterscheidet, wird jedoch in der Kontrollreaktion erfasst, bei der die Matrize weggelassen wird (Spur 6). Am wahrscheinlichsten wird dieses Signal erzeugt durch endogene DNA-Kontaminanten, die in dem Super-Taq-Enzym vorhanden sind, und die als Matrize arbeiten. Das Stoffelfragment produziert kein nachweisbares Amplikon in der kompletten Reaktion (Spur 1) oder in einer der Kontrollreaktionen ohne Matrize (Spur 2), ohne Primer (Spur 8) und ohne Enzym (Spur 7). Zusammengefasst katalysieren die Taq-Polymerase von Boehringer Mannheim und das Super-Taq-Enzym jeweils die Amplifikation der synthetischen Matrize mit einem einzelnen Primer und einem einzelnen Nukleotid.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Herstellen mehrfacher doppelsträngiger Nukleinsäuren, durch: a. Verlängern eines Primermoleküls, das eine Nukleobasensequenz B' umfasst, durch Verwendung von Nukleotiden, von denen 80% oder mehr Nukleotide sind, die eine oder mehrere promiskuitive Basen aufweisen, die im Prinzip mit jedem der Nukleotide Adenosin, Guanin, Cytosin und Thymin Basenpaare bilden können, und zudem durch Verwendung einer Ziel-Nukleinsäure T, die eine Nukleobasensequenz B enthält, an die die Nukleobasensequenz B' hybridisiert und einer Matrizensequenz I, die als Matrize für die Elongation des Primers dient, wodurch ein Elongationsprodukt E erhalten wird, das als Matrize für die Elongation eines weiteren Primermoleküls wirken kann, das die Nukleobasensequenz B' enthält. b. Trennen der Ziel-Nukleinsäure T von dem Elongationsprodukt E, c. Verwenden des Elongationsproduktes E als Matrize für die Elongation eines weiteren Primermoleküls, das ein Elongationsprodukt E' ergibt, und d. Wiederholen der Schritte Verlängern der Primermoleküle und Trennen der Elongationsprodukte hinreichend oft, dass die gewünschte Menge an doppelsträngiger Nukleinsäure erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei 100% der Nukleotide promiskuitive Nukleotide sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Matrizensequenz I kürzer als die Nukleobasensequenz B ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleobasensequenz B' eine Spanne von 10 oder mehr identischen Basen enthält.
Verfahren zur Bestimmung eines Analyten durch – Binden einer Ziel-Nukleinsäure T mit einem Bereich, der einen analytenspezifischen Bereich A umfasst, und einem Bereich, der eine analytenunspezifische Domäne umfasst, die die Sequenz B enthält, an den Analyten; – Hybridisieren eines Primers, der eine Nukleobasen-enthaltende Sequenz B' umfasst, die komplementär zur Sequenz B ist, an die Ziel-Nukleinsäure; – Verlängern des Primers unter Verwendung der Ziel-Nukleinsäure als Matrize, so dass man ein erstes Elongationsprodukt E durch die kovalente Bindung von einem oder mehreren Nukleotiden, von denen mindestens 80% promiskuitive basenhaltige Nukleotide sind, wobei die promiskuitiven Basen Basenpaare mit jeder Nukleobase Adenin, Gianosin, Cytosin und Thymin bilden können, an dem Primer erhält; – Trennen der Ziel-Nukleinsäure T von dem Elongationsprodukt E; – Verwenden des Elongationsproduktes E als Matrize zur Elongation eines weiteren Moleküls des Primers, so dass man ein Elongationsprodukt E' erhält; und – Wiederholen der Schritte Verlängern der Primermoleküle und Trennen der Elongationsprodukte hinreichend oft, dass die gewünschte Menge an doppelsträngiger Nukleinsäure erhalten wird; und – Bestimmen des Vorkommens jedes Elongationsproduktes als Maß für die Anwesenheit oder Menge des Analyten.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass 100% der gebundenen Nukleotide promiskuitive Basen enthalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass nur eine Sorte Nukleotidtriphosphat verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung der Nukleotide durch die Wirkung einer Polymerase erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerase semithermostabil oder nicht thermostabil ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die promiskuitive Base Inosin oder Deazainosin ist.