JP2000500976A - 多数の二本鎖核酸の生成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 １つのプライマー配列のみまたは／およびヌクレオチドを含む非特異的塩基の使用による多数の核酸の生成方法を用いて、高感度で容易に被検体を測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】多数の二本鎖核酸の生成方法 本発明は、多数の二本鎖核酸の生成方法および生成した多数の二本鎖核酸を用 いることによる被検体の測定方法に関する。発明の背景 試料中の被検体の測定は、環境またはヒト診断いずれかの分析において重要な 役割を果している。環境に由来する物質による試料の感染または汚染は、工業の 主要な焦点となっている。試料中には非常に少ない量で多くの物質が存在してい るので、分析方法は非常に高感度であることが要求される。このことは、核酸の 存在に基づく免疫学的測定または分析に関して特に正しい。 核酸分析において達成されるべき感度の最初の増加は、試料中の被検体核酸の 量を増幅させる可能性により実現された。これにより、試料中に存在する非常に 少量の核酸の測定さえも可能にした。試料中の被検体の核酸の増幅方法の１例は 、米国特許ＵＳ−Ａ ４，６８３，２０２号明細書に詳細に記載されているいわ ゆるポリメラーゼ連鎖反応である。この方法は、１つのプライマーの伸長産物が 他のプライマーの伸長用の鋳型として使用できるように、第１のプライマー配列 が増幅対象の標的核酸の領域に相補的であり、第２のプライマ一配列が標的核酸 上の配列に相同であるように選ばれる２つのプライマーを使用する。この方法は 、多コピー数の測定対象の核酸を生ずる。 前記方法のさらなる開発として、欧州特許ＥＰ−Ａ ０ ３７９ ３６９号明 細書において、被検体ポリヌクレオチドを、一方の末端に他の末端の配列に相補 的なヌクレオ塩基配列を有するポリヌクレオチドに変換する方法が記載されてい る。被検体核酸の断片を含むこの新規に構築されたポリヌクレオチドは、１つの プライマー配列のみを用いて増幅可能である。しかしながら、この手法は、製造 された核酸の末端が互いにハイブリダイズ可能であり、よって、プライマーのア ニーリングを妨害可能であるという不利な点を有する。したがって、増幅は、あ まり効果的ではない。さらに、増幅可能な中間産物の調製は、２つの異なるプラ イマー配列の使用、よって、測定または増幅対象の核酸における２つの異なる配 列の知識を必要とする。 したがって、本発明の目的は、１つのプライマー配列のみを用いる、被検体の 測定に使用されうる多数の二本鎖核酸の生成方法を有する技術を提供することに ある。発明の概要 したがって、本発明の主題は、 ａ．生成した伸長産物Ｅがヌクレオ塩基配列Ｂ’を含むさらなるプライマー分子 の伸長のための鋳型として作用可能であるように、１以上のヌクレオチドおよび プライマーの伸長のための鋳型として作用する標的核酸Ｔを使用することにより 、ヌクレオ塩基配列Ｂ’からなるプライマー分子を伸長させる工程； ｂ．前記伸長産物Ｅから標的核酸Ｔを分離する工程； ｃ．伸長産物Ｅ’を生じるさらなるプライマー分子の伸長のための鋳型として、 前記伸長産物Ｅを使用する工程； ｄ．二本鎖核酸の所望量を達成するために、十分な回数のプライマー分子の伸長 工程と前記伸長産物の分離工程とを繰り返す工程； による多数の二本鎖核酸の生成方法である。 本発明のさらなる主題は、本発明の方法、特に、 − 前記被検体に、被検体特異的領域Ａからなる領域および配列Ｂを含む被検体 非特異的ヌクレオ塩基からなる領域を有する標的核酸Ｔを結合させる工程； − 前記標的核酸に、前記配列Ｂに相補的なヌクレオ塩基配列Ｂ’からなるプラ イマーをハイブリダイズする工程； − 前記標的核酸を鋳型として用いて前記プライマーを伸長させ、前記プライマ ーに対して１以上のヌクレオチドの共有結合により第１の伸長産物Ｅを生成させ る工程； − 被検体の存在または量の尺度として前記伸長産物の発生を測定する工程 を用いる被検体の測定方法である。発明の詳細な説明 本発明によれば、多数の二本鎖核酸の生成方法は、多数の同一の二本鎖核酸の 創出方法である。この方法は、これらの二本鎖核酸の増幅を含むが、必ずしも本 質的に含む必要はない。該増幅は、正比例であってもよいが、好ましくは、完全 にまたは不完全に指数関数であってもよい。完全な指数関数とは、ｎ回の増幅工 程で創出された核酸の数が２ⁿとなる増幅であり、一方、不完全な指数関数増幅 においては、この理論上の増幅因子が達成されない。生成した二本鎖核酸は、化 学的修飾または一本鎖核酸を生じる鎖の分離等の物理的処理等のさらなる工程に 供することができる。 本発明のプライマーは、標的核酸内に含まれ、伸長末端で１または複数のヌク レオチドにより伸長可能なヌクレオ塩基配列Ｂに親和性を有するヌクレオ塩基配 列Ｂ’からなる分子である。プライマーのヌクレオ塩基配列Ｂ’は、標的核酸中 のヌクレオ塩基配列Ｂと実質的に相補的であることが好ましい。プライマーは、 多数の二本鎖核酸の生成のための標的として使用されるつもりのない核酸に対し て選ばれた条件下ではハイブリダイズしないような、標的核酸またはヌクレオ塩 基配列Ｂに対する特異性を有することが好ましい。本発明のプライマーは、ＤＮ ＡまたはＲＮＡ等の核酸であることが好ましく、ＤＮＡが好ましい。該プライマ ーは、１以上のヌクレオチドの付着に関する基質として作用することができる。 該プライマーは、鋳型として標的核酸の突出末端を用いてモノヌクレオチドが酵 素的に付着可能な、したがって、プライマーの伸長産物を生成する３’末端ヒド ロキシル基を有する。下記において、伸長しようとするプライマーの末端を、プ ライマーの伸長可能な末端と称する。一般に、プライマーは、標的核酸よりも大 過剰に使用される。 特殊な態様において、プライマーは、同じヌクレオ塩基を生ずる少なくとも１ ０ｎｔの連続してつながったヌクレオチドの一続きを含み、ＴまたはＣのような ピリミジンヌクレオ塩基が好ましく、シトシンが最も好ましい。この一続きは、 配列Ｂ’内に位置することが最も好ましい。プライマーの伸長可能な末端では、 プライマーは、前記一続きのヌクレオチドとは異なる１以上のヌクレオチドを含 んでもよく、標的核酸Ｔのヌクレオ塩基配列Ｂに対するプライマーの結合の選択 性を改良する。好ましい態様において、プライマーは、好ましくは連続した順序 で少なくとも１０個の同一塩基および、伸長方向で前記塩基とは異なる３個以下 の塩基の同一塩基の一続きを含む。かかる塩基の２個または1個のみが該一続き のこの末端に付着していることが好ましい。プライマーの伸長可能な末端におい て好ましい塩基とは、プライマー中の前記一続きの同一の塩基と塩基対を形成可 能な塩基である。しかしながら、これらの塩基数は、安定なプローブ内構造を作 るのに有用な数よりも小さい。ただし、プライマーの標的へのハイブリダイゼー ションとその後の伸長を不可能にしなければ、プライマーはさらなる付着部分を 有してもよい。特に、プライマーに付着可能な部分は、標識基を含有する。配列 Ｂ’は、前もって決定され、標的核酸中の対応する一続きのヌクレオ塩基に適合 するように選ばれる。 本発明のヌクレオ塩基配列は、通常の核酸におけるのと同様に、糖リン酸バッ クボーン等のバックボーンにより互いに結合している天然または非天然のヌクレ オ塩基から構成される。例えば、ヌクレオ塩基配列は、プライマーが標的核酸に 結合する特異性を決定する。一定の特異性を達成するためには、１５ヌクレオチ ド（ｎｔ）よりも長いヌクレオ塩基配列を選択することが適切であり、１６〜３ ０ｎｔの間が好ましい。 標的核酸は、試料内に含まれる、または試料から単離される、または前工程で 製造される、または一定の量で試料に添加される核酸である。標的核酸は、天然 の核酸ではなく、標的核酸の特殊な用途に適合される成分からなる構築物である ことが好ましい。より好ましい場合において、標的核酸は、試料中の被検体の測 定を可能にする成分から構成される。本発明のこの態様は、詳細に後述する。標 的核酸は、例えば、ヌクレオ塩基配列Ｂにより反応混合物の他の成分から区別可 能である。本発明の標的核酸は、多数の核酸の生成方法の出発化合物である。標 的核酸は、２以上の部分を含み、各部分がヌクレオ塩基配列を含む。標的核酸の ２つの必須のヌクレオ塩基配列を、配列Ｉおよび配列Ｂと称する。配列Ｉは、本 発明において鋳型配列として使用される。プライマーのヌクレオ塩基配列Ｂ’が ハイブリダイズする標的核酸中の配列Ｂは、標的核酸上のいかなる位置に存在し てもよい。しかしながら、プライマーの伸長可能な末端が突出末端に面するよう に、プライマーが標的にハイブリダイズするとき、標的核酸は、ヌクレオ塩基配 列Ｂ’の少なくとも１つの側で突出していることが認識されなければならない。 突出末端は、プライマーの３’末端の近傍にあることが好ましい。標的核酸のこ の突出末端は、配列Ｉが付着する配列Ｂの末端である。配列Ｂのもう一方の末端 において、別の部分またはヌクレオ塩基配列が付着してもよいし、付着しなくて もよい。配列Ｉおよび配列Ｂは、鋳型として配列Ｉを用いてプライマーの伸長が 可能となるように、結合している。したがって、大抵の場合、核酸のモノヌクレ オチド部分間の天然の結合が好ましい。配列Ｂおよびその標的核酸中の位置が前 もって定められ、一箇所であることが好ましい。しかしながら、プライマーが結 合可能な標的核酸中で１を越える前もって定められ、かつ、別々の位置が存在し てもよいということは除外されない。 配列Ｉおよび配列Ｂは、本発明の方法の計画された使用に必要な特異性を可能 にする長さを有することが好ましい。高い特異性または高感度が必要でないなら ば、これらの配列は、８以上のヌクレオチド等の長さの少数のヌクレオチドを有 してもよい。反応混合物が要求される特異性を破壊する他の核酸を含む場合、１ ５ｎｔよりも長い、さらに好ましくは１５〜３０ｎｔの配列Ｉおよび配列Ｂを選 択することがふさわしい。配列Ｂは、プライマーのヌクレオ塩基配列Ｂ’がこの 配列で標的核酸にハイブリダイズ可能であるように設計される。したがって、そ れは、プライマー配列Ｂ’に対して十分な相補性を含有する。大抵の場合、プラ イマーの伸長が配列Ｂの対応する部分に向けられた配列Ｂ’の末端での相補性が 完全であることが要求される。配列Ｂは、被検体非特異的配列であることが好ま しく、生成または測定の特異性を干渉する可能性のある試料等の反応混合物中の 被検体またはいかなる物質に対しても直接塩基対形成により結合するように設計 せずかつ計画しない。この配列Ｂは、同じヌクレオ塩基を生ずる連続して結合し たヌクレオチドの少なくとも１０ｎｔの一続きを含むことが好ましい。それは、 この一続きに５’方向に直接隣接した位置に局在した異なる塩基を有してもよい 。例えば、配列Ｂは、オリゴｄＡまたはオリゴｄＧまたはオリゴｄＣまたはオリ ゴｄＴからなってもよい。それは、オリゴプリン、特にオリゴｄＧまたはオリゴ ｄＩからなることが好ましい。好ましい場合において、配列Ｂの長さは、配列Ｉ の長さよりも６、４または２ヌクレオチド長い。この理由は、後で説明する。 本発明においてプライマーの伸長に使用するヌクレオチドは、モノヌクレオチ ド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチド は、モノヌクレオチド、特にモノヌクレオシド三リン酸であることが好ましく、 モノデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）であることが最も好ましい 。この場合、プライマーは、伸長工程において少なくとも１０ヌクレオチド、好 ましくは１１〜３０ヌクレオチドの間で伸長されることが好ましい。通常、伸長 は、標的核酸の（配列Ｉの）突出部分の末端に到達するやいなや終結する。 標的核酸にハイブリダイズしたとき、プローブの伸長は、使用するヌクレオチ ドの種類に依存する。他方、伸長は、プローブとヌクレオチドが互いに反応可能 な化学基を有するとき、化学的手段により達成可能であり、または酵素的手段に より達成可能である。酵素的伸長が好ましい場合である。鋳型として標的核酸を 用いてプローブの伸長が可能な酵素は、一般に知られている。例えば、ＤＮＡ− ポリメラーゼは、プライマーの３’末端にｄＮＴＰの連続付加によりプライマー を伸長させることが可能である。好ましいポリメラーゼとしては、例えば、大腸 菌または他の細菌およびウイルス由来のものが利用できる。また、耐熱性酵素も 利用できる。 本発明の態様に有用な他の群の酵素は、２つのオリゴヌクレオチドの共有結合 を触媒するリガーゼである。その時、オリゴヌクレオチドの１つはプライマーと して作用し、他のものはヌクレオチドとして作用する。 本発明の鋳型は、プライマーハイブリダイゼーション部分と鋳型部分とを含む 核酸である。 本発明の核酸の鋳型部分は、伸長を可能にする条件下で、プライマーが鋳型配 列に近接する位置にハイブリダイズするとき、プライマー伸長産物を作製する基 質として作用可能なヌクレオ塩基配列を有する。それは、前もって決定された、 定義されたまたは定義されない配列を有することが好ましい。該配列は、プライ マーの伸長を可能にし、よって、十分な長さを有しなければならない。鋳型配列 は、測定対象の核酸等の特定の化合物について特異的な配列を取り込んでもよい 。プライマーの伸長は、プライマーが伸長前よりも伸長後に伸長可能な末端でよ り多くの塩基を含むように、プライマーの伸長産物または延長産物を生ずる。伸 長は、プライマーの３’末端で開始し、鋳型配列の末端で終結することが好まし い。本発明で使用される第１の鋳型配列は、標的核酸のＩ部分である。 本発明の多数の核酸の生成方法は、連続工程を対象とする。標的核酸が本発明 で使用される試薬に接近可能な試料を作製するために必要ないかなる調製工程の 後も、本発明の第１の必須工程は、プライマー分子を標的核酸Ｔのヌクレオ塩基 配列Ｂにハイブリダイズする工程である。ハイブリダイゼーションに有用な条件 は、プライマーの長さ、相補性の程度およびプライマーの塩基組成等に依存する 。しかしながら、かかるハイブリダイゼーション条件は、一般に当業者に知られ ている。特に、かかる条件は、Molecular Cloning、J．Sambrook ら編、Cold Sp ring Harbor 1989の開示に従って選択することが可能である。 次の工程において、標的核酸にハイブリダイズするプライマー分子を、このプ ライマーの伸長に対する鋳型として標的核酸のヌクレオ塩基配列Ｉを用いるプラ イマー分子の伸長に適した条件に付す。工程の伸長条件は、使用する伸長の種類 に依存する。通常、ｄＮＴＰの連続付加によるプライマーの伸長を触媒するＤＮ Ａポリメラーゼ等の最も好適な伸長反応の条件は、Molecular Cloning （前記 参照）に記載されている。米国特許ＵＳ−Ａ−４，６８３，２０２号明細書にも 、いくつかの助けとなるヒントが与えられている。伸長工程中の温度は、プライ マーが標的核酸にハイブリダイズしたままとなるように、しかし、最適の伸長を 可能にする方法で選択される。酵素的伸長の場合、温度は、酵素活性に最適な温 度の近傍であるべきである。そうでなければ、伸長速度は、最適とならないであ ろう。本発明において有用なポリメラーゼの内で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラ ーゼが特に好ましい。かかる酵素は、例えば、大腸菌Ｔ７等由来のものが利用で きる。 第１の伸長工程から生成された伸長産物Ｅは、プライマー配列および付着した １または複数のヌクレオチドからなる伸長プライマーである。したがって、大抵 の場合、伸長産物は、配列Ｂと配列Ｉよりも標的核酸の方へ伸びる。 本発明の方法における第２の必須工程は、伸長産物Ｅそして最も好ましくは標 的核酸Ｔもさらなるプライマー分子とのハイブリダイゼーションに接近可能な方 法での伸長産物Ｅから標的核酸Ｔの放出である。 伸長産物からの鋳型の分離は、例えば、アルカリ等の化学品または、鋳型核酸 と伸長産物から形成されたハイブリッドの融解温度を越える加熱等の物理学的手 段の公知の方法により行なうことができる。分離は、加熱により行なうことが好 ましい。温度は、伸長産物の長さおよび相補性および伸長産物とプライマーの塩 基組成に依存する。また、一般的な概略は、Molecular Cloning （前記参照） にも開示されている。 本発明の方法の第３の必須工程において、伸長産物Ｅをさらなるプライマー分 子の伸長のための鋳型として用いる。これは、さらなるプライマー分子が第１の プライマー分子へのヌクレオチドの付着により新規に創作された伸長産物の一部 にハイブリダイズすることを意味する。次いで、前者のプライマー分子に含まれ るヌクレオ塩基配列は、さらなるプライマー分子の伸長のための実際の鋳型とし て作用する。したがって、配列Ｉと新規に創作された配列がプライマーの配列Ｂ ’よりも長いならば、その時、伸長可能な末端を含むプライマー分子の一部が前 者のプライマー分子の配列Ｂ’のヌクレオ塩基にハイブリダイズするように、プ ライマーが伸長産物にハイブリダイズすることは要求されない。しかしながら、 好ましい場合において、配列Ｉは、配列Ｂや配列Ｂ’よりも短く、よって、前者 のプライマー分子および、伸長産物とさらなるプライマー分子とから形成された ハイブリッド中の新規なプライマー分子からステムを形成した塩基の重複が存在 する。前記と同様に、同じ考察を適用する。また、これは、温度が伸長産物とプ ライマーから形成されたハイブリッドの融解温度以下であるべきことを意味する 。プライマー分子がハイブリダイズする伸長産物Ｅの部位は、プライマーの伸長 可能な末端で、さらなるプライマー分子の伸長のための鋳型として役立つことが できる伸長産物上で突出した十分な長さのヌクレ才塩基配列が存在するように選 択される。したがって、該方法のこの工程における鋳型部分は、プライマーハイ ブリダイゼーション側に１または複数のヌクレオチドの付着により生成した配列 の少なくとも一部を含むが、大抵の場合、第１のプライマー分子からステム形成 した伸長産物の部分である。この第３の工程で生成した伸長産物を、Ｅ’と称す る。 本発明の方法の第１の工程において、プライマーの第１分子が使用される一方 、第２の工程において、前記プライマーのさらなる分子が使用される。本発明の 方法が、１種類のみのプライマーにより多数の核酸の生成を可能にすることを理 解することは重要である。標的核酸のいくつかの領域が多数の核酸の作製に付さ れるならば、もちろん、他の１または複数の領域に対する異なる配列のプライマ ーを使用することが要求されるであろう。 本発明の好ましい態様において、配列ＩとＢの長さは、プライマー分子が伸長 産物にハイブリダイズしたとき、ヌクレオチドの付着により新規に生成した配列 と配列Ｂ’の一部とに及ぶように選択される。この態様を図２Ｂに示す。重複は 、６以下、好ましくは４以下、最も好ましくは２ｎｔであるべきである。この態 様に関する理由は、１種類のみのヌクレオチドを伸長工程で付着させ、または／ およびプライマーが実質的に１種類のみのヌクレオチドを含むとしても、プライ マーのハイブリダイゼーション部位を用いて、一定の長さの伸長産物を生成する ことができることである。さらに好ましい態様を以下に示す。 本発明の方法は、必要な試薬を一緒に混合することにより実現可能であり、次 いで、本発明の工程を行なうことを可能にする温度プロフィールを使用する。前 記工程の結果は、伸長産物Ｅと伸長産物Ｅ’の二本鎖であり、前記工程の間、標 的核酸が破壊されないならば、標的核酸と伸長産物Ｅのさらなる分子とのハイブ リッドである。好ましい場合において、伸長産物Ｅと伸長産物Ｅ’は、本質的に 同じヌクレオ塩基配列を有する。これは、伸長の間１種類のみのヌクレオチドを 付着したとき、特に正しい。この事実は、反応の複雑性を有意に減少させる。こ れらのハイブリッドは、いかなる所望の工程においても処理することができる。 要求される核酸の量がすでに達成されたならば、本発明の方法は、この時点で停 止してもよい。次いで、該ハイブリッドは、いかなる所望の反応または単離、測 定等にもさらに付すことができる。これは、二本鎖の分離および／または産物へ のさらなる核酸のハイブリダイゼーションを含んでもよいし、含まなくてもよい 。 しかしながら、好ましい場合において、伸長産物ＥまたはＥ’等の創出された 核酸の量は、さらに増加する。米国特許ＵＳ−Ａ−４，６８３，２０２号明細書 のポリメラーゼ連鎖反応におけるサイクルと同様に、前工程の産物（伸長産物） または／および出発化合物（標的核酸）を、次のサイクル工程で基質として使用 して、それにより生成する核酸（伸長産物）の数を増加することができる。した がって、各サイクル工程は、プライマーの伸長工程および伸長産物から前者の鋳 型を分離する工程を含む、プライマーを核酸にハイブリダイズする工程を含有す る。本発明を例証するために、本発明の各反応サイクルにおいて、サイクル毎が 本発明の方法を再び開始しているとみなされうるために、伸長産物を生成するこ とにより新規な標的核酸Ｔを製造することが追加される。本発明の方法の意図し た使用によれば、該サイクルは、これらのサイクルのいかなるところでも停止す ることができる。該方法は、通常、所望の量の二本鎖核酸が生成したときに完了 する。一般に、工程のサイクル数は、１０〜５０の間であり、１５〜３０の間が 好ましい。別の定義において、生成した二本鎖核酸の数は、９を越えるべきであ り、１００を越えることが好ましい。 ポリメラーゼ連鎖反応の特徴の１つは、十分な回数の温度プロトコールを正確 に繰り返すことによりサイクルを達成されることである。工程ｃ）後の本発明の 場合、伸長産物および出発化合物から生成したハイブリッドを、出発化合物なら びに各伸長産物（ＥおよびＥ’）に対してさらなるプライマー分子のさらなるハ イブリダイゼーションを可能にするように変性する。各サイクルにおいて、伸長 産物のコピー数が増加する。 本発明の方法は、いかなる工程でも停止することができる。例えば、二本鎖核 酸の代わりに一本鎖核酸を所望するならば、伸長産物および／または出発化合物 （標的核酸）から生成した二本鎖核酸の分離工程を有するサイクルを停止するこ とが可能である。プライマー分子と伸長産物から生成したハイブリッドが該手法 の予定通りの産物であるならば、同様のことがあてはまる。次いで、ハイブリダ イゼーション条件を維持しながら伸長活性（酵素活性等）を破壊することは、全 く可能である。 本発明の１つの好ましい態様は、ヌクレオチドの使用であり、プライマーへの 付着のための乱交雑塩基を含むｄＮＴＰの使用が最も好ましい。本発明によれば 、乱交雑塩基とは、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンの各ヌクレオ塩 基と塩基対形成可能であると定義される。いくつかの塩基に対するアフィニティ ーが他のものに対するよりも高くてもよいが、乱交雑塩基は、主としてそれらの すべてと塩基対形成可能である。かかる乱交雑塩基は、例えば、イノシンである 。よって、１種類のモノヌクレオシド三リン酸の使用は、鋳型中のヌクレオチド の種類に関係なくプライマーを伸長させることを可能にする。イノシンはアデノ シンよりもシトシンと塩基対をよく形成し、チミンやグアニンよりもシトシンと 塩基対をさらによく形成するので、鋳型配列内に含まれるシトシンが多い程、恐 らく該方法は最もよく作用するであろう。イノシン三リン酸を独占的に有するプ ライマーの伸長の結果は、標的配列中の配列特異的情報がプライマー伸長産物中 で維持されないことである。しかしながら、本発明によれば、伸長反応において ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはｄＴＴＰのいずれかの一定量を取り込むこ とにより、伸長産物中にいくらかの配列特異的情報を維持することが可能である 。具体的には、ヌクレオチド中に存在する少なくとも３０％の塩基が乱交雑塩基 であり、８０％を越えることがより好ましく、１００％、すなわち、これらの塩 基のすべてが乱交雑塩基であることが最も好ましい。厳密に言えば、本発明のこ の態様は、元の標的核酸配列の増幅を生じないが、該標的配列から創出された配 列の増幅と考えてもよい。１つの乱交雑塩基を用いる態様のさらなる結果は、伸 長産物ＥおよびＥ’のヌクレオ塩基配列が本質的に同じであるということである 。さらに、それらは、互いにハイブリダイズしてもよい。 プライマーの伸長に用いられるヌクレオチドにおける乱交雑塩基の使用は、標 的核酸と伸長産物間で生成した二本鎖に、Ａ／ＴまたはＡ／ＵおよびＣ／Ｇ塩基 対を有するハイブリッドの有意に融解温度以下である融解温度を与える。これに より、約３０ｎｔの長さの標的または鋳型核酸に関して、相対的に低い温度、好 ましくは５５℃以下、最も好ましくは４５℃以下で該ハイブリッドを変性するこ とが可能であるという利点を有する本発明にする。変性工程は、通常、最高の温 度を要する増幅手法における工程である。したがって、本発明によれば、プライ マーハイブリダイゼーション工程、プライマー伸長工程および、５５℃を越える 温度を含まず、好ましくは４５℃を越えない温度による熱変性工程を含む温度サ イクルを用いる核酸配列の増幅方法を有する技術を提供することが可能である。 多数の二本鎖核酸を生成する本方法の好ましい態様を、図面の詳細な説明と関 連させて以下に記載する。 多数の二本鎖核酸を生成する本方法は、被検体の測定に関して非常に有利に使 用されうる。本発明の被検体の測定方法は、原理的には以下の工程： − 標的核酸Ｔの被検体への結合工程； − 標的核酸に結合した被検体を残りの試料から任意に分離する工程； − 標的核酸を多数の二本鎖核酸を生成する前記方法に付す工程、および − 被検体の存在または量の尺度として、伸長産物の発生を測定する工程 により定義される。 これらの方法における被検体とは、プローブにより認識可能ないかなる分子で あってもよく、抗体、抗原もしくはハプテン等の免疫学的に作用する被検体、ま たは核酸もしくは核酸類似体であることが好ましい。核酸の測定は、本発明の測 定方法の好ましい態様である。 測定される被検体は、体液またはそれに由来する液体等の試料の成分であって もよい。核酸の場合、通常、いかなる試料も細胞内に含まれる可能性のある核酸 を放出する前記工程に付される。したがって、被検体核酸は、いかなる起源のも のであってもよく、特に、細菌またはウイルス起源のものであってもよい。被検 体核酸は、特に、リボ核酸またはデオキシリボ核酸であってもよい。 したがって、本発明のさらなる主題は、被検体特異的領域Ａからなる領域およ びヌクレオ塩基配列Ｂを含む被検体非特異的ドメインからなる領域を有する前記 被検体標的核酸Ｔへの結合工程；前記配列Ｂに相補的な配列Ｂ’を含むヌクレオ 塩基からなるプライマーを前記標的核酸にハイブリダイズする工程；前記プロー ブへの１以上のヌクレオチドの共有結合による第１の伸長産物Ｅを形成するため の鋳型として前記標的核酸を用いる前記プライマーの伸長工程、および被検体の 存在または量の尺度として、前記伸長産物の発生を測定する工程による被検体の 測定方法である。 前記多数の二本鎖核酸の生成方法と比べて、被検体の測定方法は、標的核酸が 被検体認識領域Ａを有することを要求する。標的核酸中のこの領域Ａは、測定対 象の被検体のみが適用される条件下で認識される等の特別な方法で被検体を認識 する部分である。したがって、この領域Ａは、例えば、抗体部分または被検体ヌ クレオ塩基配列の一部に相補的なヌクレオ塩基配列である、エピトープまたは被 検体のヌクレオ塩基配列を認識する領域であってもよい。 被検体特異的領域の種類（免疫学的に作用する部位、ヌクレオ塩基配列等）に 依存して、被検体特異的領域は、標的核酸Ｔの配列Ｉ内に位置してもよいし、し なくてもよい。領域Ａが位置する所に関する主な要件は、鋳型として配列Ｉを使 用するプライマーの伸長がいまだ可能であるかどうかである。 被検体特異的領域Ａと配列Ｂは、共有結合してもよいし、非共有結合であって もよいが、共有結合していることが好ましい。ＡおよびＢがヌクレオチド配列で ある特別な場合において、Ａの５’末端がＢの３’末端に結合しているかＡの３ ’末端がＢの５’末端に結合していることが好ましい。 ＡおよびＢは、直接結合してもよいし、中間部分を介して結合してもよい。か かる中間部分は、１０ヌクレオチドを越える長さのさらなるヌクレオ塩基配列で あってもよく、１２〜２０ｎｔの間が好ましい。このヌクレオチド配列は、被検 体に特異的でないことが好ましい。したがって、それは、例えば、オリゴｄＡ、 オリゴｄＧ、オリゴｄＣまたはオリゴｄＴの同一塩基ユニットからなるヌクレオ チド配列であってさえもよい。この中間配列は、配列Ｂにハイブリダイズするプ ライマーの伸長用の鋳型として作用することが可能なように設計されることが好 ましく、配列Ｉであることが最も好ましい。核酸の測定の最も好ましい場合にお いて、標的核酸Ｔは、（５’−）被検体特異的配列Ａ、中間鋳型配列Ｉ、および 被検体非特異的配列Ｂ（−３’）の順で含む機能的オリゴヌクレオチドである。 標的核酸の被検体への結合は、被検体を認識する領域Ａを被検体への結合を可 能にする条件下で行なう。好ましい相互作用は、免疫学的反応またはヌクレオ塩 基対形成におけるような特異的相互作用である。これらの結合が起こる条件は、 当業者に公知である。 標的核酸に結合した被検体を残りの試料から分離する任意の工程は、測定の特 異性の増加において大抵手助けとなる。この分離は、固相上の複合体の固定によ り、好ましくは被検体に特異的な固相を用いることにより行なうことが好ましい 。被検体に特異的な固相とは、例えば、被検体に対する抗体等の被検体を認識す る２つの部分を付着している固相である。複合体の固相への結合条件は、通常、 米国特許ＵＳ−Ａ−４，６２４，９３０号明細書に記載の条件等の免疫化学決定 基として適用される。固相から残りの液体を除去することにより、過剰の標的核 酸を他の妨害物質とともに洗浄除去する。 本方法のいくつかの好ましい態様は、図面の詳細な説明と関連させて、以下に 記載する。 被検体の測定方法は、被検体の存在または量の尺度として前記伸長産物の発生 を測定することにより終結される。伸長産物の発生は、直接または間接に測定さ れうる。核酸の測定に通常有用なすべての方法は、該伸長産物の測定方法に適用 可能である。ほとんどすべての場合、伸長産物の発生は、標識部分の存在に依存 してなされる。伸長産物の測定の２つの特に好ましい方法がある。 第１の好ましい態様において、蛍光部分または、ビオチンもしくはジゴキシゲ ニン（例えば、米国特許ＵＳ−Ａ−５，３４４，７５７号明細書による）等の検 出可能な部分に付着可能な部分のような検出可能な標識を付着したこと等による 、それ自体が測定可能である核酸等の標識プローブに、伸長産物をハイブリダイ ズさせる。一般に、伸長産物およびこのプローブから生成したハイブリッドの量 または存在を測定する。伸長産物以上の過剰の量でプローブを使用し、伸長産物 に結合しないプローブの量を分離除去することが有利である。これは、プローブ 以外の異なる部位で伸長産物を結合するように設計されたさらなるプローブを用 いることにより、単純な方法でなされうる。一般的なフォーマットは、公知の「 サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイフォーマット(formate)」に従う ことができる。１つの好適な方法は、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０ ０７９ １３ ９号明細書に記載されている。この方法は、測定対象の核酸として伸長産物を選 択することにより適用することができる。 伸長産物の量を測定するためのさらに有利な方法は、伸長産物に標識を取り込 むことである。伸長産物の生成の間にそれを標識することが特に都合がよく、付 着のための標識ヌクレオチドを使用することによるのが最も好ましい。いかなる 場合も、取り込まれたすべてのヌクレオチドが標識される必要はないものと解さ れる。この場合において、伸長産物の測定は、固相上で標識伸長産物を捕捉する ことおよび過剰のヌクレオチドをある溶液で除去すること等により、過剰の標識 ヌクレオチドを分離除去することにより簡単になされうる。この手法は、欧州特 許ＥＰ−Ｂ−０ ２３７ ３６２号明細書の一般的な開示に従うことができる。 この場合において、伸長産物は、この開示の標識増幅物のように取り扱われる。 被検体の測定方法の１つの可能な態様は、以下： ｉ）標的核酸（任意に過剰で）を、標的核酸の被検体への結合を可能にする条件 下で、被検体を含む試料とともにインキュベートする工程、 ii）被検体特異的認識等により、標的核酸に結合した被検体を固相上に捕捉する 工程、 iii）未結合の標的核酸を固定された標的核酸から分離する工程、 iv）固相から任意に標的核酸を放出する工程、 v）前記核酸の多コピーを生成する方法のために記載した条件（プライマー、Ｄ ＮＡポリメラーゼ、ｄＩＴＰおよび必要な緩衝液等）下で標的核酸をインキュベ ートし、該混合物を伸長産物を増幅するための温度サイクルに付し、任意に標識 を伸長産物に取り込んで前記したように伸長産物の発生を測定する工程 のようにして作用する。図面の簡単な説明 図１Ａ〜１Ｈにおいて、標的核酸とプライマーに関連した被検体特異的配列を 選択するいくつかの可能な配置を記載する。 図２Ａ、ＢおよびＣにおいて、反応の可能な様式を記載する。 図３は、較正条件に比べて、本発明の方法による増幅の結果を示すオートラジ オグラフィーを示す。 図４は、異なる酵素を使用する方法の結果を示す。 図５〜６は、プライマーのハイブリダイゼーション部位が異なる、本発明の２ つの様式に関して可能な反応経路の概略を示す。 図６は、ｍとｎが等しくない場合の、本発明の第２の態様を示す。 図７は、図５の概略の例を示す。 図８は、図６の具体例の概略を示す。 図面および明細書において、二本鎖のハイブリッドのみが形成される態様に関 して、本発明を限定するように構築されるものは何もない。特別な条件下で少な くとも三本鎖が形成されるいくつかの指示がある。しかしながら、三本鎖の形成 は、明らかに、本発明によって製造されるまたは製造可能な産物に負の影響を与 えない。図面の詳細な説明 図１Ａにおいて、別の被検体特異的部分Ａ、被検体非特異的鋳型配列部分Ｉお よび被検体非特異的配列Ｂを含む標的核酸から生成し、配列Ｂに相補的な配列Ｂ ’を保持するプライマーを有するハイブリッドを示す。 図１Ｂにおいて、図１Ａの被検体特異的部分を介して標的核酸に結合した被検 体から生成した構築物を示す。さらに、配列Ｂ’を含むプライマーが標的核酸に ハイブリダイズ可能であることがわかる。 図１Ｃにおいて、別の被検体特異的部分を含まない標的核酸と部分Ｂ’を含む プライマーとから生成した構築物を示す。配列Ｂは、配列Ｉよりも長いことがわ かる。 被検体が核酸であり、ＩとＢの配列が被検体核酸配列の一部に相補的となるよ うに選択されるならば、図１Ｄの構築物を用いて、被検体を測定することが可能 である。この場合、核酸の多コピー数の生成を行なうために、プライマーのハイ ブリダイゼーションの前に、標的核酸Ｔと被検体とから生成したハイブリッドを 変性することが必要であるかもしれない。 図１Ｅにおいて、被検体特異的部分Ａが本質的に配列Ｉ内に位置し、配列Ｉを 越えて伸長する好ましい場合を示す。したがって、配列Ｂ’を含むプライマーは 、標的核酸にハイブリダイズ可能であるが、直接伸長され得ない。しかしながら 、鎖の置換活性を保持する酵素が用いられるならば、伸長が起こりうる。 図１Ｆにおいて、被検体特異的部分が配列Ｉ内でＩに付着可能であり、Ａは核 酸配列でないが、免疫活性な相互作用等により被検体を結合可能な場合が示され る。 図２Ａにおいて、多数の核酸を生成する本発明の方法を、実質的に、標的核酸 の被検体非特異的配列Ｂに相補的なヌクレオ塩基配列からなるプライマーを用い て、概略的に示す。プライマーＢ’を伸長させて、伸長産物Ｅを生じる。各一本 鎖への鎖の分離後、プライマーの１つの分子を、鋳型として標的核酸または伸長 産物Ｅのいずれかを用いて、ハイブリダイズさせ、伸長させることができる。鎖 の分離後、新規に創出した伸長産物Ｅ’ と標的核酸とを、プライマーハイブリ ダイゼーション、伸長および変性等の新しいサイクルで再び鋳型として用いるこ とができる。 図２Ｂは、図Ａに比べて、いかなる伸長産物とハイブリダイズしたときも、第 ２のプライマー分子が一部配列Ｂに到達するという点のみが異なる態様を示す。 図２Ｃにおいて、鋳型として被検体特異的領域を用いてプライマーの伸長が起 こらない場合を示す。この場合、伸長用鋳型として配列Ｉのみを用いてプライマ ーが伸長可能な方法で、プライマーを被検体非特異的配列Ｂにハイブリダイズさ せる。伸長は、被検体非特異的部分の末端で停止する。図２Ａと２Ｃにおいて示 されるように、鎖の分離、追加のプライマー分子のハイブリダイゼーションおよ び伸長の交互に繰り返された工程は、多数の核酸を生成する。 図３と４の詳細な説明は、実施例で示す。 図５と６において、２つの態様が定義されうる、本発明の反応のための一般的 な概略図を示す。ＹとＸはヌクレオチドである。一直線上のすべてのヌクレオチ ドは連結して、核酸を表す。プライム（’）で指定したヌクレオチドは、プライ ム（’）のないヌクレオチドと相補的である。ヌクレオチドＹはセグメントＩに 位置し、ヌクレオチドＸはセグメントＢとＢ’にそれぞれ位置する。すべての場 合において、ｍとｎは、考慮されるセクション中のヌクレオチドの量と同じ大き さの自然数である。 一般的な場合において、ヌクレオチドＹとＸは、いかなる所望の意味、Ａ、Ｇ 、Ｃ、ＴおよびＵから選ばれた塩基部分を保持してもよい。プライマーの標的と の特異的ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、最初は、図５と６に示され たような構築物が生成される。酵素とｄＩＴＰ等のモノヌクレオシド三リン酸を 含む乱交雑塩基を用いて伸長後、ヌクレオチドＹ₁...．Ｙ_mの種類とは関係なく 、ホモイノシンテールがプライマーに付着する。変性後、１つのプライマーは標 的にハイブリダイズし、１つはｎ、ｍならびにＸおよびＹの相補性に依存して伸 長産物Ｅにハイブリダイズすることができる。伸長、変性およびハイブリダイゼ ーションによるサイクルの後、高い数の伸長分子が生成する。 単純な態様において、ヌクレオチドＸ₁...．Ｘ_n中のヌクレオ塩基は同じであ る。この場合、それらは、Ａ、Ｇ、ＣもしくはＴから選択されたいかなる塩基で あってもよく、またはイノシンのような乱交雑塩基であってもよい。後者の場合 、オリゴｄＣの才リゴｄＩに対するアフィニティーが高いので、ヌクレオチドＸ₁ ’ ....Ｘ_n’は、シトシン部分であることが好ましい。 図５の態様は、ｎとｍが同一、例えば、各３０を意味するときに特に単純であ る。この場合、プライマーは、前者プライマーの３’末端に付着した３０ヌクレ オチド（Ｉ）の範囲に、特別な様式でハイブリダイズすることができる。すべて のヌクレオチドＸ’が同じ意味を有するならば、第２のプライマーの前者のプラ イマ一配列とのハイブリダイゼーションの重複が予定されず、達成されない（図 ５）。この場合、ｍとｎは同一、例えば、３０であってもよい。 図６において、ｍがｎ−２であり、Ｘ₁’がＸ２’に相補的である場合を示す 。この場合において、第２のプライマーの前者プライマーの最後の２ヌクレオチ ドとのハイブリダイゼーション位置の重複が存在する。この重複は、一致した長 さの伸長産物の創出を助長する。図５は、本発明の１つの態様の一般的概略図を 示す。 図７において、ＹがＣであり、ＸがＩであり、Ｘ’がＣであり、ｍとｎが等し い場合を示す。この場合、最初に、プライマーの標的へのハイブリダイゼーショ ンの位置があまり明確に定義されず、第２に、内部ループ構造を形成する可能性 が増加することがわかる。 したがって、図７は、Ｘ’₁（Ｇ等）がＸ₂’（Ｃ等）に相補的となるように選 択される好ましい態様を示す。これは、反応の副産物を防止するのに役立つ。図 ７は、実施例２に記載されたような状況の概略図である。 本発明は、いくつかの重要な利点を有する。標的配列当たり１つのプライマー のみの使用は、本発明の方法を非常に単純にする。１つのヌクレオチドのみを使 用する場合では、系の複雑さはさらに一層減少する。乱交雑塩基を使用する場合 では、高温で安定なポリメラーゼを使用しない。付着した１種類のみのヌクレオ チドを使用する場合では、工程の速度が上昇するかもしれない。該方法は、普遍 的な、応用可能な配列非依存性増幅および短いサイクル期間を有する技術を提供 する。 本発明は、被検体の測定に関してほとんどすべてのフォーマットに使用するこ とができる。通常、生成したコピー数の核酸をその後の測定工程に付す。これは 、生成した核酸へのいかなる標識の付着によっても達成される。 以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。実施例１ 合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’−Ｃ₃₀Ｉ₃₀−３’、配列番号１）は、合成 ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’−Ｃ₃₀−３’ （配列番号２、５’−Ｔ₃₀−３ ’（配列番号３）、５’−Ｃ₃₀Ｇ−３’ （配列番号４）および５’−Ｃ₃₀ＧＧ −３’ （配列番号５））にハイブリダイズ可能である。 すべてのオリゴヌクレオチドは、 ＤＮＡテクノロジーＡＰＳ フォルシェルパルケン／サイエンス パーク オルフス グスタフ ヴィーズ ヴェイ １０ ８０００，オルフス Ｃ デンマーク で購入した。 それぞれ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０、０ ．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２μＭの標的オリゴヌクレオチド（５’−Ｃ₃₀Ｉ₃₀− ３’）および０．２μＭの図３に示された異なるオリゴヌクレオチドプライマー を含む１組のハイブリダイゼーション反応液（１０μｌ）を調製した。各反応液 を加熱ブロック中で９５℃で５分間加熱し、室温で一晩インキュベートした。次 の日、２μｌの負荷緩衝液（０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩 ｐＨ８．３、１ ｍＭ ＥＤＴＡで希釈した０．１％ブロモフェノールブルー、０．ｌ％キシレン シアノール、３０％グリセロール）を各反応液に添加した。次いで、試料（１０ μｌ）を２％アガロースゲルに負荷し、ブロモフェノールブルーがゲルの中央に 移動するまで電気泳動に付した。該ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを可 視化してゲルの写真を撮った。図４に示されるように、標的Ｃ₃₀Ｉ₃₀オリゴヌク レオチド単独（レーン１）は、ゲル中で可視バンドを生じない。同様に、ハイブ リダイゼーション反応が、標的Ｃ₃₀Ｉ₃₀オリゴヌクレオチドと、Ｉ₃₀（配列番号 ６）プライマー（レーン２）、Ａ₃₀（配列番号７）プライマー（レーン３）また はＧ₃₀（配列番号８）プライマー（レーン６）のいずれかとを含むとき、ゲル中 にバンドが存在せず、これらのプライマーは、標的オリゴヌクレオチドとハイブ リダイズしないことを示す。対照的に、Ｃ₃₀Ｉ₃₀鋳型と、Ｔ₃₀プライマー（レー ン４）、Ｃ₃₀プライマー（レーン５）、Ｃ₃₀Ｇプライマー（レーン７）またはＣ₃₀ ＧＧプライマー（レーン８）のいずれかとを含む反応は、ゲル中に可視バンド を生じ、これらのプライマーのすべてが鋳型にハイブリダイズすることを示す。 ピリミジン残基に富むプライマーのみが鋳型にハイブリダイズするという知見は 、観察された複合体が１つの標識オリゴヌクレオチドと２つのプライマーからな る三本鎖であることを示唆する。この主張は、Ｉ₃₀プライマーの標的配列への結 合の明らかな不可能性によりさらに支持される。実施例２ Ｔａｑポリメラーゼ（ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー）、Ｓｔｏｆｆ ｅｌ断片（パーキンエルマー）およびＳｕｐｅｒ Ｔａｑポリメラーゼは、ｌプ ライマー、１ヌクレオチドＰＣＲに使用可能である １組のＰＣＲ反応液（５０μｌ）を、表に示されたように調製した。鋳型は５ ’ −Ｃ₃₀Ｉ₃₀−３’であり、プライマーは５’−Ｃ₃₀Ｇ−３’であり、ヌクレ オチドはｄＩＴＰ（ベーリンガーマンハイムゲーエムベーハー）である。 酵素緩衝液 １０ｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、ベーリンガーマンハイム社製： ｌ００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５００ｍＭ ＫＣｌ− ｐＨ８．３（２０℃） １０ｘ Ｓｔｏｆｆｅｌ断片緩衝液： １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ − ｐＨ８．３（２０℃） １０ｘ Ｓｕｐｅｒ Ｔａｑ緩衝液： ５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＫＣｌ、７０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、 １６０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄−ｐＨ９．０（２５゜Ｃ）、０．２ｍｇ／ｍｌ Ｂ ＳＡ 反応液に２０μｌのミネラルオイルを重層して、チューブをプログラム可能な サーマルコントローラーモデルＰＴＣ−１００−９６Ｖ内に置いた。ＰＣＲサイ クルは、変性５５℃で 分間、アニーリング２０℃で１分間、合成３７℃で２分 間であり、３０サイクルであった。増幅後、各反応液をエッペンドルフチューブ に移し、１０μｌの負荷緩衝液（０．０９Ｍ Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩 ｐＨ８．３ 、１ｍＭ ＥＤＴＡで希釈した０．１％ブロモフェノールブルー、０．１％キシ レンシアノール、３０％グリセロール）を添加した。次いで、試料（１０μ１） を２％アガロースゲルに負荷し、２つのサイズマーカーとともに電気泳動に付し た。サイズマーカー１は、０．２μＭの鋳型（５’−Ｃ₃₀Ｉ₃₀−３’）、０．２ μＭのプライマー（５’−Ｃ₃₀Ｇ−３’）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣ１₂、１６ｍＭ（ＮＨ₄）₂Ｓ０₄、ｐＨ９．０（２ ５℃）および０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含んでいた。サイズマーカー２は、０ ．４μＭの鋳型（５’−Ｃ₃₀Ｉ₃₀−３’）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、ｐＨ９．０（２ ５℃）および０．２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含んでいた。サイズマーカーを室温で ３０分間、１０μｌの反応容量中でハイブリダイズした。ゲルに負荷する前に２ μｌの負荷緩衝液を添加した。プロモフェノールブルーがゲルの中央に移動する まで、ゲルを電気泳動した。該ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを可視化 して写真を撮った。ゲル中のＤＮＡを、アルカリ性の転写緩衝液（０．４Ｍ Ｎ ａＯＨ、０．６Ｍ ＮａＣ１）を用いて、デュポン製のGene-Screen＋膜に転写 した。転写は、室温で一晩行なった。次の日、該膜を０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液中で1０分間中和した。該膜をハイブリ ダイゼーションチューブに入れ、ハイブリダイゼーションオーブンで室 温で２時間、２０ｍ１のハイブリダイゼーション緩衝液（０．５Ｍ Ｎａ₂ＨＰ Ｏ₄ ｐＨ７．２、７％ ＳＤＳ、１Ｍ ＮａＣｌ）中でプレハイブリダイズし た。プローブ（１μＭの32Ｐ標識５’−Ｃ₃₀Ｇ−３’オリゴヌクレオチドを１０ μｌ）を９５℃で５分間変性させ、ハイブリダイゼーションチューブに添加した 。ハイブリダイゼーションは、室温で一晩行なった。次の日、該膜を２００ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄中、室温で１５分間洗浄−風乾し、オートラジオグラフィーに付 した。６時間後、フィルムを現像した。 図５に示されるように、ベーリンガーマンハイム製のＴａｑポリメラーゼ（レ ーン３）およびＳｕｐｅｒ Ｔａｑポリメラーゼ（レーン５）は、両方とも予想 されたサイズ（サイズマーカーと比べて）の検出可能な増幅物を産生する。ベー リンガーマンハイム製のＴａｑポリメラーゼを用いた対照反応、すなわち、鋳型 を除いたとき（レーン４）、プライマーを除いたとき（レーン１０）または酵素 を反応液から除いたとき（レーン９）では、何のシグナルも検出されない。また 、Ｓｕｐｅｒ Ｔａｑ酵素も、プライマーを除いたとき（レーン１２）または酵 素を除いたとき（レーン１１）には、検出可能な増幅物を産生しない。しかしな がら、正しい増幅物とは異なる位置での弱いシグナルが、鋳型を除いた対照反応 （レーン６）で検出される。おそらく、このシグナルは、鋳型として作用するＳ ｕｐｅｒ Ｔａｑ酵素中に存在する内在性ＤＮＡ混入物により生成されるであろ う。Ｓｔｏｆｆｅｌ断片は、完全な反応（レーン１）または、鋳型なし（レーン ２）、プライマーなし（レーン８）および酵素なし（レーン７）のいかなる対照 反応でも検出可能な増幅物を産生しない。結論として、ベーリンガーマンハイム 製のＴａｑポリメラーゼ、およびＳｕｐｅｒ Ｔａｑポリメラーゼは両方とも単 一のプライマーと単一のヌクレオチドを用いて、合成された鋳型の増幅を触媒す る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ．伸長産物Ｅがヌクレオ塩基配列Ｂ’を含むさらなるプライマー分子の伸 長のための鋳型として作用可能であるように、１以上のヌクレオチドおよび該プ ライマーの伸長のための鋳型として作用する標的核酸Ｔを使用することにより、 ヌクレオ塩基配列Ｂ’からなるプライマー分子を伸長させる工程； ｂ．前記伸長産物Ｅから標的核酸Ｔを分離する工程； ｃ．伸長産物Ｅ’を生じるさらなるプライマー分子の伸長のための鋳型として、 前記伸長産物Ｅを使用する工程；ならびに ｄ．二本鎖核酸の所望量を達成するために、十分な回数のプライマー分子の伸長 工程と前記伸長産物の分離工程とを繰り返す工程； による多数の二本鎖核酸の生成方法。 ２．− 被検体特異的領域Ａからなる領域および配列Ｂを含む被検体非特異的ド メインからなる領域を有する標的核酸Ｔを、該被検体に結合させる工程； − 前記標的核酸に、前記配列Ｂに相補的な配列Ｂ’を含むヌクレオ塩基からな るプライマーをハイブリダイズする工程； − 前記標的核酸を鋳型として用いて前記プライマーを伸長させ、前記プライマ ーに対して１以上のヌクレオチドの共有結合により第１の伸長産物Ｅを生成させ る工程； ー 被検体の存在または量の尺度として前記伸長産物の発生を測定する工程 による被検体の測定方法。 ３．付加したヌクレオチドの少なくとも１つが乱交雑塩基を含むものであること を特徴とする、前記請求項いずれか記載の方法。 ４．１種類のみのヌクレオチド三リン酸を使用することを特徴とする、前記請求 項いずれか記載の方法。 ５．ヌクレオチドの付加がポリメラーゼの作用により達成されることを特徴とす る、前記請求項いずれか記載の方法。 ６．該ポリメラーゼが半耐熱性または非耐熱性であることを特徴とする、前記請 求項いずれか記載の方法。 ７．該プライマーが、各伸長産物上のハイブリダイゼーション領域が３個以下の ヌクレオチド塩基で重複するように設計された配列を有することを特徴とする、 前記請求項いずれか記載の方法。 ８．付加したヌクレオチドがモノヌクレオチドであることを特徴とする、前記請 求項いずれか記載の方法。 ９．該乱交雑塩基がイノシンまたはデアザイノシンであることを特徴とする、請 求項３〜７いずれか記載の方法。 １０．５５℃を越える温度を含まない温度サイクルを用いて、核酸配列を増幅す る方法。