ES2279530T3 - Metodo para generar multiples acidos nucleicos bicatenarios. - Google Patents
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Abstract
PUEDE UTILIZARSE UN PROCEDIMIENTO PARA GENERAR MULTIPLES ACIDOS NUCLEICOS UTILIZANDO SOLO UNA SECUENCIA CEBADORA Y/O UN NUCLEOTIDO QUE CONTIENE UNA BASE NO ESPECIFICA, PARA DETERMINAR FACILMENTE ANALITOS CON UNA ELEVADA SENSIBILIDAD.
Description
Método para generar múltiples ácidos nucleicos
bicatenarios.
La presente invención está dirigida a un método
para generar múltiples ácidos nucleicos bicatenarios y a un método
para determinar un analito mediante la utilización de los múltiples
ácidos nucleicos bicatenarios generados.
La determinación de analitos en muestras
desempeña un papel importante en los análisis diagnósticos
medioambientales y humanos. La infección o polución de muestras por
sustancias provenientes del entorno se está convirtiendo en un foco
principal de atención para la industria. Dado que muchas de las
sustancias se encuentran en las muestras en cantidades
extremadamente bajas, los métodos de análisis deben ser
extremadamente sensibles. Esto se cumple especialmente en el
caso de las determinaciones o análisis inmunológicos basados en la
aparición de ácidos nucleicos.
El primer incremento en la sensibilidad
alcanzado en los ensayos con ácidos nucleicos se llevó a cabo
gracias a la posibilidad de amplificar la cantidad de ácido
nucleico a analizar de una muestra. Esto ha permitido la
determinación incluso de cantidades extremadamente bajas de ácidos
nucleicos presentes en una muestra. Un ejemplo de un método para la
amplificación de ácidos nucleicos a analizar de una muestra es el
denominado reacción en cadena de la polimerasa, descrito en detalle
en la patente estadounidense US 4 683 202. Este método emplea dos
cebadores escogidos de manera que la secuencia del primero sea
complementaria a una región del ácido nucleico diana a amplificar y
la secuencia del segundo sea homóloga a una secuencia del ácido
nucleico diana, de forma que el producto de la elongación de un
cebador puede utilizarse como molde para la elongación del otro
cebador. Este método genera múltiples copias del ácido nucleico que
se pretende determinar.
En la patente europea EP-A 0 379
369 se describe un método, que constituye un posterior desarrollo
del antes mencionado, que permite convertir un polinucleótido a
analizar en un polinucleótido que presenta en un extremo una
secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia del otro
extremo. Este polinucleótido que se acaba de generar y que contiene
un fragmento del ácido nucleico a analizar permite su amplificación
solamente con el empleo de una única secuencia cebadora. El
procedimiento, sin embargo, tiene la desventaja de que los extremos
del ácido nucleico producido pueden hibridar entre sí, por lo que
pueden evitar la hibridación del cebador. En consecuencia, la
amplificación no es extremadamente efectiva. Además, la
preparación del producto intermedio amplificable requiere el uso de
dos secuencias cebadoras diferentes y, por tanto, el conocimiento
de dos secuencias diferentes del ácido nucleico a determinar o
amplificar.
Por lo tanto, el propósito de la presente
invención es proporcionar a la técnica un método para generar
múltiples ácidos nucleicos bicatenarios que pueden utilizarse para
determinar analitos en el que solamente se emplea un cebador.
Consecuentemente, la presente invención se ocupa
de un método para generar múltiples ácidos nucleicos bicatenarios
mediante los siguientes pasos:
a. la elongación de una molécula cebadora que
contiene una secuencia nucleotídica B' mediante el empleo de
nucleótidos, el 80% de los cuales o más son nucleótidos que
contienen una o más bases promiscuas que principalmente son capaces
de aparearse con cualquiera de los nucleótidos adenosina, guanina,
citosina o timina; y además el empleo de un ácido nucleico diana T
que contiene una secuencia nucleotídica B con la cual hibrida la
secuencia nucleotídica B', y una secuencia molde I que actúa como
molde para la elongación de dicho cebador para formar así un
producto de elongación E que es capaz de funcionar como un molde
para la elongación de otra molécula cebadora que contenga la
secuencia nucleotídica B';
b. la separación del ácido nucleico diana T del
producto de elongación E mencionado;
c. el uso de dicho producto de elongación E como
molde para la elongación de otra molécula cebadora que generará un
producto de elongación E';
d. la repetición de los pasos de elongación de
moléculas cebadoras y de separación de dichos productos de
elongación el número de veces suficiente para conseguir la cantidad
deseada de ácido nucleico bicatenario.
Otro asunto que trata la invención es un método
de determinación de un analito que utiliza este método,
especialmente
- uniendo al analito un ácido nucleico T que
presenta una región que contiene una región A específica para el
analito y una región que contiene un dominio no específico para el
analito en la que se encuentra la secuencia B;
- hibridando a dicho ácido nucleico diana un
cebador que comprende una secuencia nucleotídica B' complementaria
a dicha secuencia B;
- elongando dicho cebador utilizando como molde
el ácido nucleico mencionado para formar un primer producto de
elongación E mediante la adhesión covalente a dicho cebador de uno
o más nucleótidos, de los que al menos el 80% son nucleótidos con
bases promiscuas que pueden aparearse con cualquier base
nucleotídica de adenina, guanosina, citosina o timina;
- separando el ácido nucleico diana T del
producto de elongación E mencionado,
- utilizando dicho producto de elongación E como
molde para la elongación de otra molécula de dicho cebador que
generará un producto de elongación E',
- repitiendo los pasos de elongación de
moléculas cebadoras y de separación de dichos productos de
elongación el número de veces suficiente para conseguir la cantidad
deseada de ácido nucleico bicatenario, y
- determinando la aparición de cualquiera de los
productos de elongación mencionados como medida de la presencia o
la cantidad del analito.
De acuerdo con la presente invención, un método
para generar múltiples ácidos nucleicos bicatenarios es un método
para la creación de un gran número de ácidos nucleicos bicatenarios
idénticos. Este método, aunque no consistirá necesariamente en ello
de forma fundamental, comprenderá la amplificación de estos ácidos
nucleicos bicatenarios. La amplificación puede ser lineal, pero es
preferible que sea perfecta o imperfectamente exponencial. Una
amplificación perfectamente exponencial sería aquella en la que la
cantidad de ácido nucleico creado en n pasos de amplificación
asciende a 2^{n}, mientras que en una amplificación
imperfectamente exponencial no se alcanzaría este factor teórico de
amplificación. Los ácidos nucleicos bicatenarios generados pueden
someterse a otros pasos de procesado del tipo de modificación
química o tratamiento físico, como la separación de hebras dando
lugar a ácidos nucleicos de cadena única.
Un cebador de acuerdo con la presente invención
es una molécula que contiene una secuencia nucleotídica B' que
presenta una afinidad por una secuencia nucleotídica B que forma
parte de un ácido nucleico diana y permite su elongación por medio
de uno o varios nucleótidos en un extremo elongable. De forma
preferible, la secuencia nucleotídica B del cebador es
sustancialmente complementaria a una secuencia nucleotídica B del
ácido nucleico diana. También es preferible que el cebador tenga un
especificidad tal por el ácido nucleico diana o por la secuencia
nucleotídica B que no hibride bajo las condiciones elegidas con
ácidos nucleicos que no se pretendan utilizar como dianas para
generar múltiples ácidos nucleicos bicatenarios. El cebador de
acuerdo con la presente invención es preferiblemente un ácido
nucleico, por ejemplo DNA o RNA, siendo preferido el DNA. El
cebador puede funcionar como sustrato para la adhesión de uno o más
nucleótidos. El cebador presenta un grupo hidroxilo
3'-terminal al cual se pueden adherir
mononucleótidos de forma enzimática empleando el extremo
sobresaliente del ácido nucleico diana como molde, y formar de esta
forma un producto de elongación del cebador. De ahora en adelante
denominaremos extremo elongable del cebador al extremo del cebador
que se pretende elongar. En general, los cebadores se utilizan en
cantidades muy superiores al ácido nucleico diana.
En una realización especial, el cebador contiene
un tramo de al menos 10 nucleótidos conectados de forma continua
que llevan la misma base nitrogenada, preferiblemente una base de
pirimidina como T o C, siendo la más preferida la citosina. Este
tramo se encuentra situado de forma especialmente preferida dentro
de la secuencia B'. El extremo elongable del cebador puede contener
un nucleótido o más que difiera de los nucleótidos del tramo
mencionado y mejore la capacidad selectiva de la unión del cebador
a la secuencia nucleotídica B del ácido nucleico diana T. En una
realización especial, el cebador contiene un tramo de bases
idénticas, preferiblemente de al menos diez bases idénticas, en
orden consecutivo y, en la dirección de la elongación, tres bases
como máximo que difieren de las bases antes mencionadas. De forma
preferible, solamente una o dos de estas bases está unida a este
extremo del tramo. Las bases preferidas del extremo elongable del
cebador son bases que pueden formar pares de bases con el tramo con
bases idénticas antes mencionado del cebador. No obstante, el
número de estas bases es menor que el número necesario para
producir estructuras estables dentro de las sondas. El cebador
puede tener anexionadas otras fracciones, siempre y cuando no
impidan la hibridación del cebador con la diana ni la posterior
elongación. En especial, las fracciones que pueden estar
anexionadas al cebador son grupos marcadores. La secuencia B' se
predetermina y escoge de forma que encaje con el tramo de bases
nitrogenadas correspondiente del ácido nucleico diana.
Una secuencia nucleotídica de acuerdo con la
presente invención está formada por bases nitrogenadas de origen
natural o sintético unidas entre sí por un esqueleto, por ejemplo
un esqueleto de pentosas y fosfatos como el de los ácidos nucleicos
convencionales. La secuencia nucleotídica, por ejemplo, determina
la especificidad con la que un cebador se une a un ácido nucleico
diana. Para conseguir una especificidad determinada sería adecuado
optar por una secuencia nucleotídica de más de 15 nucleótidos (nt),
preferiblemente entre 16 y 30 nt.
Un ácido nucleico diana es un ácido nucleico que
se encuentra dentro de una muestra, que se ha aislado de la misma,
que se ha producido en un paso previo o que se ha añadido a la
muestra en una cantidad definida. De forma preferible, el ácido
nucleico diana no es un ácido nucleico de origen natural, sino un
constructo formado por componentes adaptados para un uso específico
del ácido nucleico diana. En un caso más preferido, el ácido
nucleico diana está formado por componentes que permiten la
determinación de un analito en una muestra. Esta realización de la
invención se describe en profundidad más adelante en el presente
documento. El ácido nucleico diana puede diferenciarse de otros
ingredientes de la mezcla de reacción mediante, por ejemplo, la
secuencia nucleotídica B. El ácido nucleico diana contiene dos
partes como mínimo, cada una de las cuales contiene una secuencia
nucleotídica. Las dos secuencias nucleotídicas fundamentales del
ácido nucleico diana se denominan secuencia I y secuencia B. En la
presente invención, la secuencia I se emplea como secuencia molde.
La secuencia B del ácido nucleico diana con la que hibrida la
secuencia nucleotídica B' del cebador puede estar situada en
cualquier posición del ácido nucleico diana. Sin embargo, debe
reconocerse que el ácido nucleico diana sobresale al menos en un
lado de la secuencia nucleotídica B' cuando el cebador está
hibridado con la diana, de modo que el extremo elongable del
cebador se encuentra frente al extremo protuberante. De forma
preferible, el extremo protuberante se encuentra cercano al extremo
3' del cebador. Este extremo protuberante del ácido nucleico diana
es el extremo de la secuencia B al que se anexiona la secuencia I.
El otro extremo de la secuencia B puede tener anexionadas o no
otras fracciones o secuencias nucleotídicas. Las secuencias I y B
está unidas de forma que sea posible la elongación del cebador
empleando la secuencia I como molde. Por lo tanto, en la mayoría de
casos se prefiere el enlace natural entre fracciones
mononucleotídicas de un ácido nucleico. Es preferible que la
secuencia B esté predefinida y sea única, igual que su posición en
el ácido nucleico diana. No obstante, no se excluye que pueda haber
más de una posición predefinida e independiente en el ácido
nucleico diana a la que se pueda unir el cebador.
Las secuencias I y B poseen, preferentemente,
una longitud que permite la especificidad necesaria para el uso
que se le pretende dar en el método de la invención. Si no es
necesaria una especificidad o selectividad elevada, estas
secuencias pueden poseer una longitud con un número bajo de
nucleótidos, p. ej., ocho o más nucleótidos. En el caso de que la
mezcla de reacción contenga otros ácidos nucleicos que puedan
destruir la especificidad requerida, puede resultar apropiado
seleccionar secuencias I y B con una longitud superior a 15 nt, más
preferiblemente entre 15 y 30 nt. La secuencia B se diseña de
manera que la secuencia nucleotídica B' del cebador pueda hibridar
con el ácido nucleico diana en esa secuencia. Por consiguiente, es
lo suficientemente complementaria a la secuencia del cebador B'.
En la mayoría de los casos puede resultar necesario que la
complementariedad en el extremo de la secuencia B' en el que se
pretende realizar la elongación del cebador sea perfecta con la
parte correspondiente de la secuencia B. La secuencia B es,
preferentemente, una secuencia no específica del analito y no se
pretende unir, ni está diseñada para ello, mediante un apareamiento
de bases directo con el analito o cualquier sustancia de la mezcla
de reacción, por ejemplo una muestra que pueda interferir con la
especificidad de la generación o la determinación. Esta secuencia B
presenta preferentemente una extensión de al menos 10 nt conectados
entre sí de forma continua que poseen la misma base nitrogenada.
Puede presentar una base nitrogenada diferente localizada en la
posición directamente adyacente a esa extensión en dirección 5'.
Por ejemplo, la secuencia B puede consistir en un oligo dA, un
oligo dG, un oligo dC o un oligo dT. Preferentemente, consiste en
un oligo de purinas, especialmente oligo dG u oligo dI. En una
situación preferida, la longitud de la secuencia B es 6, 4 o 2
nucleótidos más larga que la secuencia I. Los motivos se explicarán
más adelante.
El nucleótido utilizado para la elongación del
cebador de la presente invención puede ser un mononucleótido, un
oligonucleótido o un polinucleótido. Preferiblemente, el nucleótido
es un mononucleótido, especialmente un mononucleósido trifosfato,
más preferiblemente un monodesoxirribonucleótido trifosfato (dNTP).
En este caso, se prefiere que el cebador se elongue en al menos 10,
preferiblemente entre 11 y 30 nucleótidos en el paso de elongación.
Generalmente, la elongación terminará tan pronto como se alcance
el extremo final de la región protuberante (de la secuencia I) del
ácido nucleico diana.
La elongación de la sonda cuando hibrida con el
ácido nucleico diana depende del tipo de nucleótidos utilizados.
Por un lado, la elongación puede conseguirse por medios químicos,
cuando la sonda y el nucleótido presentan grupos químicos capaces de
reaccionar entre sí, o por medios enzimáticos. Se prefiere la
elongación enzimática. Las enzimas capaces de elongar una sonda
utilizando un ácido nucleico diana como molde son de conocimiento
general. Por ejemplo, las DNA polimerasas son capaces de elongar
cebadores mediante la adición secuencial de dNTP a su extremo 3'.
Las polimerasas que se prefieren son, por ejemplo, las que se
encuentran disponibles de E. coli o de otras bacterias o
virus. También se encuentran disponibles enzimas termoestables.
Otro grupo de enzimas útiles en una realización
de la invención son las ligasas que catalizan la unión covalente
de dos oligonucleótidos. Así, uno de los oligonucleótidos actúa
como cebador y el otro como nucleótido.
Un molde de acuerdo con la invención es un ácido
nucleico que contiene una parte que hibrida con el cebador y una
región molde.
La región molde del ácido nucleico de acuerdo
con la invención posee una secuencia nucleotídica que actúa como
sustrato para obtener el producto de elongación del cebador cuando
el cebador hibrida en una localización adyacente a la secuencia
molde en condiciones que permitan la elongación. Preferiblemente,
su secuencia estará predeterminada, definida o no definida. La
secuencia debe permitir la elongación de un cebador y, por tanto,
debe presentar la suficiente longitud. La secuencia molde debe
incorporar una secuencia que sea específica para un compuesto
específico, por ejemplo, un ácido nucleico a determinar. La
elongación del cebador produce un producto de extensión o elongación
del cebador de manera que el cebador contiene más bases en su
extremo susceptible de elongación que antes de la elongación.
Preferiblemente, la extensión se inicia en el extremo 3' del
cebador y finaliza en el extremo de la secuencia molde. La primera
secuencia molde utilizada en la presente invención es la parte I de
la secuencia de ácidos nucleicos.
El método para la generación de múltiples ácidos
nucleicos de la presente invención funciona mediante una secuencia
de pasos. Tras los pasos preparativos que sean necesarios para
crear una muestra en la que el ácido nucleico diana sea accesible
al reactivo utilizado en la invención, el primer paso esencial de
la presente invención es la hibridación de una molécula cebadora
con la secuencia B de bases nitrogenadas del ácido nucleico T
diana. Las condiciones que resultan útiles para la hibridación
dependen, p. ej., de la longitud del cebador, del grado de
complementariedad y de la composición de bases de los cebadores.
Sin embargo, dichas condiciones de hibridación son de conocimiento
general para los expertos en la materia. Especialmente dichas
condiciones pueden seleccionarse siguiendo la descripción de
Molecular Cloning, Editor: J. Sambrook et al., Cold Spring
Harbor 1989.
En un paso posterior, la molécula cebadora
hibridada con el ácido nucleico diana se somete a las condiciones
apropiadas para la elongación de la molécula cebadora utilizando la
secuencia nucleotídica I del ácido nucleico diana como molde para
la elongación de este cebador. Las condiciones de elongación
dependen, por supuesto, del tipo de elongación utilizada.
Generalmente, las condiciones para las reacciones de elongación más
apropiadas, por ejemplo la elongación de cebadores catalizada por
la DNA polimerasa mediante la adición secuencial de dNTP, se
describen en Molecular Cloning (véase más arriba). También se
ofrecen algunos consejos prácticos en la patente estadounidense
US-A-4 683 202. La temperatura del
paso de elongación se seleccionará de manera que se mantenga la
hibridación entre el cebador y el ácido nucleico diana, pero de
manera que permita una elongación óptima. En el caso de la
elongación enzimática, la temperatura debe encontrarse cerca de la
temperatura óptima de la actividad enzimática. De otro modo, la
velocidad de elongación no sería óptima. Entre las polimerasas
útiles en la presente invención, se prefieren especialmente las DNA
polimerasas dependientes de DNA. Dichas enzimas se encuentran
disponibles de E. coli o de otras bacterias o virus, por
ejemplo.
El producto de elongación E formado a partir de
la primera elongación es el cebador elongado que consta de la
secuencia del cebador y de los nucleótidos unidos. En la mayoría de
los casos, por tanto, el producto de elongación se extenderá en
relación al ácido nucleico diana a lo largo de las secuencias B e
I.
Un segundo paso esencial en el método de la
presente invención es la liberación del ácido nucleico diana T del
producto de elongación E de manera que el producto de elongación E
y, más preferiblemente, también el ácido nucleico T, sean
accesibles para su hibridación con otra molécula cebadora.
La separación del molde del producto de
elongación puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos, por
ejemplo, mediante compuestos químicos como bases, o mediante
métodos físicos como el calentamiento por encima del punto de
fusión del híbrido formado entre el ácido nucleico molde y el
producto de elongación. Preferiblemente, la separación se lleva a
cabo mediante calor. La temperatura dependerá de la longitud del
producto de elongación y de la complementariedad y de la
composición de bases del producto de elongación y de los cebadores.
Los detalles generales también se describen en Molecular Cloning
(véase más arriba).
En un tercer paso esencial del método, la
elongación del producto E se utiliza como molde para la elongación
de otra molécula cebadora. Esto significa que la otra molécula
cebadora hibrida con una parte del producto de elongación que se
creó de nuevo mediante la unión de nucleótidos a la primera
molécula cebadora. Entonces, una secuencia nucleotídica contenida
en la molécula cebadora anterior actuará posteriormente como molde
para la elongación de otra molécula cebadora. Si la secuencia I y,
por tanto, la secuencia creada nuevamente es más larga que la
secuencia B' del cebador, entonces no es necesario que el cebador
hibride con el producto de elongación, de manera que una parte de
la molécula cebadora que contiene el extremo susceptible de
elongación hibrida con la secuencia nucleotídica B' de la molécula
cebadora anterior. En una situación preferida, sin embargo, la
secuencia I es más corta que las secuencias B y B' y, por tanto,
existirá un solapamiento de bases procedentes de la molécula
cebadora anterior y de la molécula cebadora nueva en el híbrido
formado entre el producto de elongación y la molécula cebadora
posterior. Las mismas consideraciones anteriores son aplicables.
Esto significa nuevamente que la temperatura debe encontrarse por
debajo de la temperatura de fusión del híbrido formado entre el
producto de elongación y el cebador. El sitio del producto de
elongación E en el que la molécula cebadora hibrida se selecciona
de manera que el extremo susceptible de elongación del cebador sea
lo suficientemente largo para que la secuencia nucleotídica que
sobresalen del producto de elongación sirvan como molde para la
elongación de otra molécula cebadora. En este paso del método, por
tanto, la región molde es en la mayoría de los casos la parte del
producto de elongación que procede de la primera molécula cebadora,
mientras que la región de hibridación del cebador contiene, al
menos, una parte de la secuencia formada por la unión de
nucleótidos. El producto de elongación formado en este tercer paso
se denomi-
na E'.
na E'.
Mientras que en el primer paso del método de la
presente invención se utiliza la primera molécula de cebador, en el
segundo paso se utiliza otra molécula de dicho cebador. Es
importante entender que el método de la presente invención permite
la generación de múltiples ácidos nucleicos con un único tipo de
cebador. Por supuesto, si deben utilizarse diversas regiones del
ácido nucleico para realizar múltiples ácidos nucleicos, será
necesario utilizar cebadores para las distintas secuencias de las
otras regiones.
En una realización preferida de la invención, la
longitud de las secuencias I y B se selecciona de manera que
cuando hibridan la molécula cebadora y el producto de elongación se
produce una nueva secuencia formada a partir de la unión de
nucleótidos y una parte de la secuencia B'. Esta realización se
muestra en la Figura 2B. El solapamiento debe ser menor de 6 nt,
preferentemente ser de 4 o menos y, más preferentemente, ser de 2.
El motivo de esta realización es permitir que los sitios de
hibridación del cebador puedan utilizarse para crear productos de
elongación de una longitud específica, incluso si solo se une un
tipo de nucleótido en la fase de elongación y los cebadores
contienen sustancialmente un único tipo de nucleótido. Más adelante
se describirá una realización aún más preferida.
\newpage
El método de la presente invención puede
llevarse a cabo mezclando los reactivos necesarios y utilizando,
entonces, un perfil de temperaturas que permita la realización de
los pasos de la presente invención. Como resultado de los pasos
antes mencionados se forma un producto bicatenario entre el
producto de elongación E y el producto de elongación E' y, si el
ácido nucleico diana no se destruye durante las fases previas, se
forma un híbrido entre el ácido nucleico diana y otra molécula
producto de elongación E'. En la situación preferida, el producto
de elongación E y el producto de elongación E' poseen esencialmente
la misma secuencia nucleotídica. Este hecho resulta especialmente
cierto cuando únicamente se une un tipo de nucleótido durante el
proceso de elongación y, de ese manera, se reduce considerablemente
la complejidad de la reacción. Estos híbridos pueden procesarse en
el paso que se desee. Cuando ya se ha alcanzado la cantidad de
ácidos nucleicos deseada, el método de la invención debe pararse en
ese punto. Entonces, los híbridos pueden ser sometidos a cualquier
reacción posterior que se desee como el aislamiento, su
determinación, etc. Este proceso puede incluir (o no) la separación
de las hebras de las moléculas bicatenarias o la hibridación de
otros ácidos nucleicos con los productos.
No obstante, en una situación preferida, la
cantidad de ácidos nucleicos creada, es decir, los productos de
elongación E y E', puede aumentarse aún más. De forma similar a los
ciclos de la reacción en cadena de la polimerasa de la patente
estadounidense US-A-4 683 202, los
productos (productos de elongación) o los compuestos iniciales (el
ácido nucleico diana) de los pasos previos pueden utilizarse como
sustratos para el siguiente ciclo de pasos de manera que se
incrementa el número de ácidos nucleicos (productos de elongación)
generados. Cada ciclo de pasos incluirá, por tanto, una fase de
hibridación entre el cebador y un ácido nucleico, una fase de
elongación del cebador y una fase de separación del molde de su
producto de elongación. Con el objetivo de ilustrar la presente
invención, cabe añadir que en cada ciclo de reacciones de acuerdo
con la invención se produce un nuevo ácido nucleico diana T
mediante la formación de un producto de elongación de manera que se
considera que en cada ciclo se inicia de nuevo el método de la
invención. De acuerdo con el uso que se pretende dar al método de
la presente invención, la realización de ciclos puede pararse en
cualquiera de esos ciclos. El método terminará, generalmente,
cuando se genere la cantidad deseada de ácidos nucleicos
bicatenarios. En general, el número de ciclos de pasos se situará
entre 10 y 50, preferiblemente entre 15 y 30. En otra definición,
el número de ácidos nucleicos bicatenarios generados deberá ser
superior a 9 y, preferiblemente, mayor de 100.
Una de las características de la reacción en
cadena de la polimerasa es que la realización de ciclos se consigue
repitiendo sencillamente el protocolo de temperaturas un número
suficiente de veces. En el caso que nos ocupa, tras el paso c) los
híbridos formados con productos de elongación y los compuestos de
partida se desnaturalizan para permitir la hibridación posterior
del compuesto de partida con otra molécula cebadora, así como cada
uno de los productos de elongación (E y E'). En cada ciclo se
incrementará el número de copias de productos de elongación. El
método de acuerdo con la invención puede pararse en cualquiera de
los pasos. Por ejemplo, si se prefiere la obtención de ácidos
nucleicos monocatenarios en lugar de ácidos nucleicos bicatenarios,
es posible parar los ciclos en el paso de separación de ácidos
nucleicos bicatenarios formados por productos de elongación o los
compuestos de partida (ácidos nucleicos diana). Se cumple lo mismo
si lo que se busca durante el procedimiento es un híbrido formado a
partir de una molécula cebadora y el producto de elongación.
Entonces, sencillamente es posible destruir la actividad de
elongación (p. ej., la actividad enzimática) mientras se mantienen
las condiciones de hibridación.
Uno de los aspectos preferidos de la presente
invención es la utilización de nucleótidos, más preferiblemente
dNTP, que contienen bases promiscuas para unirse al cebador. Una
base promiscua se define, de acuerdo con la presente invención,
como aquella que es capaz de aparearse con cualquiera de las bases
nitrogenadas adenina, guanina, citosina y timina. Aunque la
afinidad porn algunas de las bases puede ser superior que por
otras, una base promiscua es capaz principalmente de aparearse con
todas ellas. Un ejemplo de esas bases promiscuas es la inosina.
Así, la utilización de un tipo de mononucleósido trifosfato permite
la elongación del cebador independientemente del tipo de
nucleótidos del molde. Dado que la inosina se aparea mejor con la
citosina que con la adenosina, y aún mejor que con la timina y la
guanina, el método presumiblemente funcionará mejor cuanto mayor
contenido en citosina tenga la secuencia molde. Un resultado de la
elongación del cebador con inosina trifosfato exclusivamente es que
la información específica de la secuencia diana no se mantiene en
el producto de elongación del cebador. De acuerdo con la
invención, sin embargo, es posible mantener cierta información
específica de secuencia en el producto de elongación incorporando
cierta cantidad de dATP, dGTP, dCTP y dTTP en la reacción de
elongación. Habitualmente, al menos el 80% de las bases presentes
en el nucleótido son bases promiscuas, más preferiblemente el 100%
o todas las bases. Estrictamente hablando, este aspecto de la
invención no produce la amplificación de la secuencia de ácidos
nucleicos diana inicial, aunque puede ser considerada como la
amplificación de una secuencia creada a partir de la secuencia
diana. Otra consecuencia de la realización que utiliza una base
promiscua es que las secuencias nucleotídicas de los productos de
elongación E y E' son esencialmente las mismas. Es más, pueden
hibridar entre ellas.
La utilización de bases promiscuas en los
nucleótidos utilizados para la elongación del cebador tiene como
resultado la formación de una cadena bicatenaria formada por el
ácido nucleico diana y el producto de elongación a una temperatura
de fusión que se encuentra considerablemente por debajo de la
temperatura de fusión de los híbridos que poseen las parejas de
bases A/T o A/U y C/G. Esta característica supone una ventaja para
la presente invención porque es posible desnaturalizar los híbridos
a temperaturas relativamente bajas, preferiblemente por debajo de
55ºC, más preferiblemente por debajo de 45ºC, para ácidos
nucleicos diana o molde de una longitud aproximada de 30 nt. El
paso de desnaturalización es generalmente el paso en el proceso de
amplificación que requiere la temperatura más alta. Por tanto, es
posible de acuerdo con la presente invención proveer a este campo
de un método para amplificar secuencias de ácidos nucleicos
utilizando ciclos térmicos que incluyen los siguientes pasos:
hibridación con el cebador, extensión del cebador y
desnaturalización térmica, sin necesidad de utilizar temperaturas
superiores a los 55ºC, preferiblemente no superiores a 45ºC.
Más adelante se describen realizaciones
preferidas de este método para generar ácidos nucleicos múltiples
bicatenarios en relación con la descripción detallada de las
figuras.
En la determinación de analitos, es muy
ventajosa la utilización de este método para generar ácidos
nucleicos múltiples bicatenarios. El método para la determinación
de un analito de acuerdo con la invención se define principalmente
por los siguientes pasos:
- La unión de un ácido nucleico diana T al
analito.
- La separación opcional del analito unido al
ácido nucleico diana del resto de la muestra.
- La aplicación del método descrito
anteriormente sobre el ácido nucleico diana para generar ácidos
nucleicos múltiples bicatenarios.
- La determinación de la aparición de los
productos de elongación como medida de la presencia o la cantidad
del analito.
\vskip1.000000\baselineskip
En estos métodos, un analito puede ser cualquier
molécula capaz de ser reconocida por una sonda, preferiblemente
analitos inmunológicamente activos, como anticuerpos, antígenos o
haptenos, o ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos. La
determinación de ácidos nucleicos constituye una realización
preferida del método de determinación de la invención.
El analito a determinar puede ser el componente
de una muestra, como un fluido corporal o un fluido derivado del
mismo. En el caso de los ácidos nucleicos, es habitual someter
cualquier muestra a procesos previos de liberación de los ácidos
nucleicos que posiblemente se encuentren en el interior de las
células. El ácido nucleico que actúa como analito puede, por tanto,
ser de cualquier origen, especialmente origen bacteriano o vírico.
El ácido nucleico que actúa como analito puede ser especialmente un
ácido ribonucleico o un ácido desoxirribonucleico.
Por tanto, es también objeto de la presente
invención un método para la determinación de un analito mediante el
siguiente procedimiento: la unión de dicho analito a un ácido
nucleico diana T que posee una región A específica de analito y una
región con un dominio no específico de analito que contiene una
secuencia nucleotídica B; la hibridación de dicho ácido nucleico
diana con un cebador con una secuencia nucleotídica B'
complementaria a la mencionada secuencia B; la elongación de dicho
cebador utilizando dicho ácido nucleico diana como molde para
formar un primer producto de elongación E mediante la unión
covalente de uno o más nucleótidos a dicha sonda; la separación del
ácido nucleico diana T del producto de elongación E; la
utilización de dicho producto de elongación E como molde para la
elongación de otra molécula del mencionado cebador que tiene como
resultado un producto de elongación E'; la repetición de los pasos
de elongación de moléculas cebadoras y la separación de dichos
productos de elongación un número suficiente de veces para
conseguir la cantidad deseada de ácidos nucleicos bicatenarios; y
la determinación de la aparición de dicho producto de elongación
como medida de la presencia o la cantidad del
analito.
analito.
En comparación con el método para generar ácidos
nucleicos múltiples bicatenarios tal como se ha descrito
anteriormente, el método para la determinación de analitos necesita
que el ácido nucleico diana posea una región A de reconocimiento
del analito. Dicha región A del ácido nucleico diana es un dominio
que reconoce el analito de una forma específica, es decir, en las
condiciones aplicadas únicamente se reconoce el analito a
determinar. Por tanto, esta región A puede ser una región que
reconoce un epítopo o una secuencia nucleotídica del analito, por
ejemplo, el dominio de un anticuerpo o una secuencia nucleotídica
complementaria a una región de la secuencia nucleotídica del
analito.
Dependiendo del tipo de región específica de
analito (sitio inmunológicamente activo, secuencia nucleotídica,
etc.), la región específica de analito puede localizarse (o no) en
el interior de la secuencia I del ácido nucleico diana T. El
aspecto fundamental a tener en cuenta para situar la región A es si
empleando la secuencia I como molde todavía es posible la
elongación del cebador.
La región específica de analito A y la secuencia
B pueden estar unidas covalentemente o de forma no covalente,
aunque es preferible la unión covalente. En la situación especial
en la que A y B son secuencias nucleotídicas, se prefiere que el
extremo 5' de A se una al extremo 3' de B o que el extremo 3' de A
se una al extremo 5' de B.
A y B pueden estar unidos directamente o a
través de una región intermedia. Dicha región intermedia puede ser
otra secuencia nucleotídica con una longitud de más de 10
nucleótidos, preferiblemente entre 12 y 20 nt. Es preferible que
esta secuencia de nucleótidos no sea específica del analito. Por
consiguiente, puede ser incluso una secuencia nucleotídica con
unidades de base idénticas, por ejemplo, un oligodA, un oligodG, un
oligodC o un oligodT. Es preferible que esta secuencia intermedia
se diseñe para que sea capaz de actuar como molde para la
elongación de un cebador hibridado con la secuencia B, y es más
preferiblemente que sea la secuencia I. En la situación más
preferida para la determinación de un ácido nucleico, el ácido
nucleico diana T es un oligonucleótido funcional que contiene en
este orden (5')-la secuencia A específica de
analito, la secuencia molde intermedia I, la secuencia B no
específica de analito (-3').
La unión del ácido nucleico diana al analito
tiene lugar en condiciones que permitan el reconocimiento de la
región A por parte del analito. Se prefieren las interacciones
específicas como las reacciones inmunológicas y el apareamiento de
bases. Las condiciones en las que se producen dichas uniones son de
conocimiento general para los expertos en la materia.
La fase de separación del analito unido al ácido
nucleico diana del resto de la muestra es útil fundamentalmente
para incrementar la especificidad de la determinación. Esta
separación se lleva a cabo preferiblemente mediante la retención
del complejo en una fase sólida, preferiblemente utilizando una
fase sólida específica del analito. Son ejemplos de fases sólidas
específicas de analito aquellas fases sólidas que unen sus dos
dominios de reconocimiento del analito, por ejemplo, anticuerpos
frente al analito. A la unión del complejo a dicha fase sólida
pueden ser aplicables las mismas condiciones que en las
determinaciones inmunoquímicas habituales, como las condiciones
descritas en la patente estadounidense
US-A-4 624 930. Al eliminar el
resto de líquido de la fase sólida, se elimina el exceso de ácidos
nucleicos diana junto con otras sustancias no deseadas.
Más adelante se describen algunas realizaciones
preferidas de este método en relación con la descripción detallada
de las figuras.
El método para la determinación de un analito
finaliza cuando se determina la aparición de cualquiera de los
productos de elongación mencionados como medida de la presencia o
la cantidad del analito. La aparición del producto de elongación se
puede determinar directa o indirectamente. Todos los métodos útiles
en general para la determinación de ácidos nucleicos son aplicables
como métodos para la determinación del producto de elongación. En
casi todos los casos, se hará que la aparición del producto de
elongación dependa de la aparición de una región marcada. Existen
dos maneras especialmente buenas para la determinación de los
productos de elongación.
En una primera realización preferida, el
producto de elongación hibrida con una sonda marcada, p. ej. un
ácido nucleico que es capaz de ser detectado gracias a, p. ej., la
unión de una molécula marcadora, como una región fluorescente o una
región capaz de unirse a una región detectable, p. ej. biotina o
digoxigenina (de acuerdo, por ejemplo, con la patente
estadounidense US-5 344 757). Generalmente, se
determina la cantidad o la presencia de un híbrido formado por el
producto de elongación y esta sonda. Puede resultar ventajoso
utilizar una cantidad de sonda en exceso respecto al producto de
elongación y separar la cantidad de sonda no unida al producto de
elongación. Esto puede realizarse de forma sencilla utilizando otra
sonda diseñada para unir el producto de elongación en un lugar
diferente a la sonda. El formato general puede seguir el conocido
“ormato de ensayo de hibridación tipo sándwich”. En la patente
europea EP-A-0 079 139 se describe
un método apropiado. Este método es aplicable cuando se selecciona
el producto de elongación como el ácido nucleico a determinar.
Otro método ventajoso para determinar la
cantidad de producto de elongación consiste en incorporar una sonda
en el producto de elongación. Es especialmente apropiado marcar el
producto de elongación durante su generación, más preferiblemente
mediante la unión de nucleótidos marcados. En cualquier caso, se
entiende que no todos los nucleótidos incorporados deben estar
marcados. En este caso, la determinación del producto de elongación
puede realizarse simplemente separando el exceso de nucleótidos
marcados, p. ej., capturando el producto de elongación en una fase
sólida y eliminando el exceso de nucleótidos con una solución. Este
procedimiento puede seguir la descripción general ofrecida en la
patente europea EP-B-0 237 362 en
cuyo caso el producto de elongación se trata como los productos
amplificados marcados de esa descripción.
Una posible realización de un método para la
determinación de un analito podría realizarse con los pasos que se
describen a continuación:
i) la incubación de un ácido nucleico diana
(opcionalmente en exceso) con una muestra que contiene el analito en
condiciones que permitan la unión del ácido nucleico diana al
analito,
ii) la captura del analito unido al ácido
nucleico diana en una fase sólida, p. ej. mediante el
reconocimiento específico del analito,
iii) la separación del ácido nucleico diana no
unido del ácido nucleico diana retenido,
iv) la liberación opcional del ácido nucleico
diana de la fase sólida,
v) la incubación del ácido nucleico diana en las
condiciones descritas anteriormente para el método de producción
de copias múltiples de ácidos nucleicos (p. ej., un cebador, una
DNA polimerasa, dITP y los tampones necesarios), el sometimiento de
la mezcla a ciclos de temperatura para multiplicar los productos de
elongación que pueden incorporar opcionalmente marcadores en los
productos de elongación y la determinación de la aparición de
productos de elongación tal como se ha descrito anteriormente.
En las Figuras de la 1A a la 1H, se describen
diversas especificaciones posibles de elección de la secuencia
específica de analito relativa al ácido nucleico diana y al
cebador.
En las Figuras 2A, B y C, se describen posibles
modos de llevar a cabo la reacción.
La Figura 3 muestra una autorradiografia con los
resultados de la amplificación de acuerdo con el método de la
invención en comparación con las condiciones de calibrado.
En la Figura 4 se muestra el resultado del
método utilizando enzimas diferentes.
Las Figuras 5 y 6 muestran esquemas de las
posibles rutas de reacción para dos modalidades de la invención que
difieren en el lugar de hibridación del cebador.
La Figura 6 muestra una segunda realización de
la invención en la que m y n no son iguales.
La Figura 7 muestra un ejemplo del esquema de la
Figura 5.
La Figura 8 muestra el esquema de un ejemplo
específico de la Figura 6.
Ni las figuras ni la descripción de las mismas
deben entenderse como una limitación de la invención a las
realizaciones en las que solo se forman híbridos de doble cadena.
Existen algunos indicios de que, al menos bajo condiciones
específicas, se forman moléculas tricatenarias. La formación de
cadenas triples, sin embargo, no parece afectar negativamente a los
productos producidos o producibles de acuerdo con la presente
invención.
En la Figura 1A se muestra el híbrido formado
por el ácido nucleico diana que contiene una región A específica
de analito separada, una región I molde no específica de analito y
una secuencia B no específica de analito con un cebador que posee
la secuencia B' que es complementaria a la secuencia B.
En la Figura 1B se muestra el constructo formado
por el analito unido al ácido nucleico diana a través de la región
específica de analito de la Figura 1A. Cabe resaltar que además el
cebador que contiene la secuencia B' puede hibridar con el ácido
nucleico diana.
En la Figura 1C se muestra un constructo formado
por un ácido nucleico diana que contiene una región específica de
analito no separada y un cebador que contiene la región B'. Cabe
resaltar que la secuencia B tiene una longitud mayor que la
secuencia I.
El constructo de la Figura 1D puede utilizarse
para determinar un analito, si el analito es un ácido nucleico y
se seleccionan las secuencias I y B para que sean complementarias a
una región de la secuencia de ácidos nucleicos del analito. En este
caso, para llevar a cabo la generación de copias múltiples de
ácidos nucleicos puede ser necesario desnaturalizar el híbrido
formado entre el ácido nucleico diana T y el analito de forma
previa a la hibridación del cebador.
En la Figura 1E se muestra la situación
preferida en la que la región A específica de analito se localiza
esencialmente dentro de la secuencia I y se extiende a lo largo de
ella. Por tanto, el cebador que contiene la secuencia B' podría
hibridar con el ácido nucleico diana, pero no podría ser elongado
directamente. No obstante, si se utiliza una enzima con actividad
de desplazamiento de cadena, la elongación puede ocurrir.
En la Figura 1F se muestra una situación en la
que la región específica de analito puede unirse a I dentro de la
secuencia I y en la que A no es una secuencia de ácidos nucleicos,
pero puede unirse al analito mediante interacciones inmunoactivas,
por ejemplo.
En la Figura 2A, se muestra un esquema del
método de la presente invención para generar ácidos nucleicos
múltiples que utiliza un cebador que consta sustancialmente de una
secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia B no
específica de analito del ácido nucleico diana. Se elonga el
cebador B' para conseguir el producto de elongación E. Tras la
separación de las hebras en cadenas sencillas, una molécula de
cebador puede hibridar y ser elongada utilizando como molde tanto
el ácido nucleico diana como el producto de elongación E. Tras la
separación de las cadenas, los nuevos productos de extensión E'
creados y el ácido nucleico diana se pueden utilizar de nuevo como
moldes en un nuevo ciclo de hibridación de cebador, elongación y
desnaturalización y, así sucesivamente.
La Figura 2B muestra una realización comparable
a la Figura A que difiere únicamente en que la segunda molécula
cebadora alcanza en parte la secuencia B cuando hibrida con
cualquiera de los productos de elongación.
En la Figura 2C se muestra la situación en la
que la elongación del cebador no tiene lugar utilizando una región
específica de analito como molde. En este caso, el cebador hibrida
de tal forma con la secuencia B no específica de analito que solo
puede ser elongado utilizando la secuencia I como molde para la
elongación. La elongación finaliza en el extremo de la región no
específica de analito. Tal como se muestra en las Figuras 2A y 2C,
los pasos alternos de separación de cadenas, la hibridación de
moléculas adicionales cebadoras y la elongación generarán múltiples
ácidos nucleicos.
En los ejemplos se encontrarán descripciones
detalladas de las Figuras 3 y 4.
En las Figuras 5 y 6 se muestra un esquema
general de reacciones de acuerdo con la invención en las que se
pueden definir dos realizaciones. Y y X son nucleótidos. Todos los
nucleótidos de una misma línea están conectados y representan un
ácido nucleico. Los nucleótidos marcados con el símbolo “
' ” son complementarios a los nucleótidos
sin el símbolo “ ' ”. Los nucleótidos Y se
localizan en el segmento I y los nucleótidos X se localizan en los
segmentos B y B', respectivamente. En todos los casos m y n son
números naturales tan grandes como el número de nucleótidos de la
región considerada.
En una situación general, los nucleótidos Y y X
pueden tener cualquier significado que se desee, seleccionando las
regiones nucleotídicas entre A, G, C, T y U. Se forman los
constructos mostrados inicialmente en las Figuras 5 y 6 bajo las
condiciones en las que es posible la hibridación del cebador con
una diana. Tras la elongación con una enzima y una base promiscua
que contiene mononucleósidos trifosfato, p. ej. dITP, se une al
cebador una cola de homoinosinas, independientemente del tipo de
nucleótidos Y_{1}...Y_{m}. Tras la desnaturalización, un
cebador puede hibridar con la diana y otro con el producto de
elongación E, dependiendo de n, m y de la complementariedad de X e
Y. Tras las ciclos de elongación, desnaturalización e hibridación
se forma un número elevado de moléculas de
elongación.
elongación.
En una realización sencilla las bases
nitrogenadas de los nucleótidos X_{1}...X_{n} son iguales. En
este caso pueden ser cualquier base seleccionada entre A, G, C y T
o puede ser una base promiscua como la inosina.
En el último caso, los nucleótidos
X_{1'}...X_{n'} son preferentemente regiones ricas en citosina,
porque la afinidad entre los oligodC y los oligodI es elevada.
La realización de la Figura 5 es especialmente
sencilla cuando n y m son idénticos, por ejemplo cuando ambos
significan 30. En este caso el cebador puede hibridar de forma
específica con los 30 nucleótidos (I) unidos al extremo 3' del
primer cebador. Si todos los nucleótidos X' tienen el mismo
significado, no se pretende ni se consigue un solapamiento cuando
hibrida el segundo cebador con las secuencias del cebador anterior.
En este caso, m y n pueden ser iguales, por ejemplo 30.
En la Figura 6 se muestra una situación en la
que m es n_{_2} y X'_{1} es complementario a X'_{2}. En este
caso existe un solapamiento en el lugar de hibridación del segundo
cebador con los últimos 2 nucleótidos del cebador anterior. Este
solapamiento ayuda a crear un longitud apropiada para los productos
de elongación. La figura muestra un esquema general de una
realización de la presente invención.
En la Figura 7 se muestra la situación en la que
Y es C, X es I, X' es C y m y n son iguales. Cabe resaltar que en
este caso el lugar de hibridación del primer cebador con la diana
no está claramente definido y en el segundo se incrementa la
posibilidad de formar estructuras internas en forma de bucle.
Por tanto, la Figura 7 muestra una realización
preferida en la que X'1 (p. ej. G) se elige para que sea
complementaria a X'2 (p. ej. C). Esto ayuda a evitar la aparición
de productos secundarios en la reacción. En la Figura 7 se muestra
una ilustración esquemática de la situación descrita en el ejemplo
2.
La presente invención presenta algunas ventajas
considerables. La utilización de un único cebador por secuencia
diana hace que este método sea muy sencillo. En el caso de que se
utilice un único nucleótido, la complejidad del sistema se reduce
aún más. En el caso de que se utilice una base promiscua, no es
necesario utilizar polimerasas altamente termoestables. En el caso
de que únicamente se utilice un tipo de nucleótido unido, la
velocidad del proceso puede incrementarse. El método proporciona al
ámbito un método de amplificación independiente de secuencia,
pertinente y universal, con ciclos de corta duración.
La presente invención se puede utilizar en casi
todos los formatos para la determinación de analitos.
Generalmente, las copias generadas de ácidos nucleicos serán
sometidas a procedimientos posteriores de determinación. Esto puede
conseguirse mediante la unión de cualquier marcador a los ácidos
nucleicos generados.
Los siguientes ejemplos describen la invención
en más detalle.
\newpage
Todos los oligonucleótidos fueron suministrados
por
- DNA Technology APS
- Forsherparken/Science Park Aarhus
- Gustav Wieds Vej 10.
- 8000, Aarhus C
- Dinamarca.
Se prepararon equipos para la reacción de
hibridación (10 \mul) que contenían cada uno NaCl 100 mM,
Na_{2}HPO_{4} 10 mM, pH 7,0, EDTA 0,1 mM, 0,2 \muM del
oligonucleótido diana
(5'-C_{30}1_{30}-3' ) y 0,2
\muM de los diferentes oligonucleótidos cebadores mostrados en la
Figura 3. Cada reacción se calentó a 95ºC durante 5 min en un
termobloque y se incubó a temperatura ambiente durante toda la
noche. Al día siguiente se añadieron 2 \mul de tampón de carga
(azul de bromofenol 0,1%, xileno cianol 0,1%, glicerol diluido 30%,
Tris borato 0,09 M pH 8,3, EDTA 1 mM) a cada reacción. Entonces,
las muestras (10 \mul) se cargaron en un gel de agarosa al 2% y
se sometieron a electroforesis hasta que el azul de bromofenol
migró hacia la mitad del gel. El gel se tiñó con bromuro de etidio
para visualizar el DNA y se realizó una fotografía del gel. Tal
como se muestra en la Figura 4, el oligonucleótido diana
C_{30}I_{30} solo (carril 1) no produce una banda visible en el
gel. De forma similar, no se observa ninguna banda aparente en el
gel cuando las reacciones de hibridación contienen el
oligonucleótido diana C_{30}I_{30} y lo mismo ocurre con el
cebador I_{30} (ID. de SEC. núm.: 6) (carril 2), el cebador
A_{30} (ID. de SEC. núm.: 7) (carril 3) y el G_{30} (ID. de
SEC. núm.: 8) (carril 6), lo que indica que estos cebadores no
hibridan con el oligonucleótido diana. En contraste, las reacciones
que contienen el molde C_{30}I_{30} y el cebador T_{30}
(carril 4), el cebador C_{30} (carril 5), el cebador C_{30}G
(carril 7) o el cebador C_{30}GG (carril 8) producen una banda
visible en el gel que indica que todos estos cebadores hibridan con
el molde. La observación de que únicamente los cebadores ricos en
residuos de pirimidina hibridan con el molde sugiere que el
complejo observado es una molécula triple de un oligonucleótido
diana y dos cebadores. La aparente incapacidad del cebador I_{30}
para unirse a la secuencia diana apoya este punto de vista.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se preparó un equipo para reacciones de PCR (50
\mul) tal como se muestra en la tabla. El molde es
5'-C_{30}I_{30}-3', el cebador
es 5'-C_{30}G-3' y el nucleótido
es dITP (Boehringer Mannheim, GmbH):
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Tampón DNA polimerasa Taq 10x de Boehringer
Mannheim:
- Tris-HCl 100 mM, MgCl_{2} 15 mM, KCl 500 mM - pH 8,3 (20ºC)
- Tampón fragmento stoffel 10x
- Tris-HCl 100 mM, KCl 100 mM, MgCl_{2} 30 mM - pH 8,3 (20ºC)
- Tampón Super Taq 10x
- Tris-HCl 500 mM, KCl 500 mM, MgCl_{2} 70 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 160 mM - pH 9,0 (25ºC), BSA 0,2 mg/ml.
\newpage
Las reacciones se cubrieron con 20 \mul de
aceite mineral y los tubos se colocaron en un aparato programable
Thermal Controller Model
PTC-100-96V. El ciclo de PCR fue el
siguiente: desnaturalización a 55ºC durante min, hibridación a 20ºC
durante 1 min, síntesis a 37ºC durante 2 min y 30 ciclos. Tras la
amplificación cada reacción se transfirió a un tubo Eppendorf y se
añadieron 10 \mul de tampón de carga (azul de bromofenol 0,1%,
xileno cianol 0,1%, glicerol diluido 30%, Tris borato 0,09 M pH
8,3, EDTA 1 mM). Entonces, las muestras (10 \mul) se cargaron en
un gel de agarosa al 2% y se sometieron a electroforesis junto con
dos marcadores de peso molecular. El marcador de peso molecular 1
contiene 0,2 \muM de molde (5'-C_{30}
I_{30}-3'), 0,2 \muM de cebador
(5'-C_{30}G-3'),
Tris-HCl 50 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2} 7 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 16 mM, pH 9,0 (25ºC) y BSA 0,2
mg/ml. El marcador de peso molecular 2 (10 \mul) contiene 0,4
\muM de molde
(5'-C_{30}I_{30}-3'),
Tris-HCl 50 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2} 7 mM,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 16 mM, pH 9,0 (25ºC) y BSA 0,2
mg/ml. Se hibridaron los marcadores de peso molecular a temperatura
ambiente durante 30 min en un volumen de reacción de 10 \mul.
Antes de cargar el gel, se añadieron 2 \mul de tampón de carga.
El gel se sometió a electroforesis hasta que el azul de bromofenol
migró hacia la mitad del gel. El gel se tiñó con bromuro de etidio
para visualizar el DNA y se realizó una fotografía del gel. El DNA
del gel se transfirió a una membrana Gene-Screen
+ de DuPont utilizando un tampón de transferencia alcalino
(NaOH 0,4 M, NaCl 0,6 M). La transferencia se realizó a temperatura
ambiente durante toda la noche. Al día siguiente, se neutralizó la
membrana durante 10 min en tampón Tris-HCl 0,5 M pH
7,5, NaCl 1 M. La membrana se colocó en un tubo de hibridación y se
prehibridó en 20 ml de tampón de hibridación (Na_{2}HPO_{4} 0,5
M pH 7,2, SDS 7%, NaCl 1 M) durante 2 horas a temperatura ambiente
en un horno de hibridación. La sonda (10 \mul de oligonucleótido
5'-C_{30}G-3' 1 \muM marcado con
^{32}P) se desnaturalizó durante 5 min a 95ºC y se añadió al
tubo de hibridación. La hibridación se realizó a temperatura
ambiente durante toda la noche. Al día siguiente, la membrana se
lavó durante 15 min a temperatura ambiente en Na_{2}HPO_{4} 200
mM, se secó al aire y se sometió a autorradiografía. Después de 6
horas se reveló la película.
Tal como se muestra en la Figura 5, la Taq
polimerasa de Boehringer Mannheim (carril 3) y la Super Taq
polimerasa (carril 5) producen un producto de amplificación
detectable del tamaño esperado (respecto a los marcadores de peso
molecular). No se detectan señales en las reacciones control con la
Taq polimerasa de Boehringer Mannheim, es decir, cuando se omite el
molde (carril 4), cuando se omite el cebador (carril 10) o cuando
se omite la enzima (carril 9) en la reacción. La enzima Super Taq
tampoco produce un amplicón detectable cuando se omite el cebador
(carril 12) y cuando se omite la enzima (carril 11). No obstante,
en la reacción control en la que se omite el molde (carril 6) se
detecta una señal débil en una localización diferente a la del
amplicón correcto. Lo más probable es que sea una señal generada
por contaminantes de DNA endógeno presente en la enzima Super Taq
que actúa como molde. El fragmento Stoffel no produce un amplicón
detectable en la reacción completa (carril 1) ni en ninguna de las
reacciones control sin molde (carril 2), sin cebador (carril 8) y
sin enzima (carril 7). En conclusión, la Taq polimerasa de
Boehringer Mannheim y la enzima Super Taq catalizan la
amplificación del molde sintético utilizando un único cebador y un
único nucleótido.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Boehringer Mannheim GmbH
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Sandhofer Stra\betae 116
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Mannheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 68305
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Método para generar múltiples ácidos nucleicos bicatenarios
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO DE LECTURA ELECTRÓNICO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- APLICACIÓN INFORMÁTICA: Patentln Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = “Oligonucleótido”
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:31..60
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL:/nota = “R es desoxiinosina”
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = “Oligonucleótido”
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = “Oligonucleótido”
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = “Oligonucleótido”
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = “Oligonucleótido”
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCCC GG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = “Oligonucleótido”
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: - -
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN:1..30
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL:/nota = “R es desoxiinosina”
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipRRRRRRRRRR RRRRRRRRRR RRRRRRRRRR
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = “Oligonucleótido”
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 7 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. de SEC. núm.: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = “Oligonucleótido”
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. de SEC. núm.: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG
\hfill30
Claims (10)
1. Un método para generar múltiples ácidos
nucleicos bicatenarios mediante:
a. la elongación de una molécula cebadora que
contiene una secuencia nucleotídica B' mediante el empleo de
nucleótidos, de los que el 80% o más son nucleótidos que contienen
una o más bases promiscuas que principalmente son capaces de
aparearse con cualquiera de los nucleótidos adenosina, guanina,
citosina o timina; y además el empleo de un ácido nucleico diana T
que contiene una secuencia nucleotídica B con la que híbrida la
secuencia nucleotídica B', y una secuencia molde I que actúa como
molde para la elongación de dicho cebador para formar así un
producto de elongación E que es capaz de funcionar como un molde
para la elongación de otra molécula cebadora que contenga la
secuencia nucleotídica B';
b. la separación del ácido nucleico diana T del
producto de elongación E mencionado;
c. el uso de dicho producto de elongación E como
molde para la elongación de otra molécula cebadora que generará un
producto de elongación E'; y
d. la repetición de los pasos de elongación de
moléculas cebadoras y de separación de dichos productos de
elongación el número suficiente de veces para conseguir la cantidad
deseada de ácido nucleico bicatenario.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
en el que el 100% de los nucleótidos son promiscuos.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que dicha secuencia molde I tiene
una longitud menor que la mencionada secuencia nucleotídica B.
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores en el que dicha secuencia nucleotidica
B posee un tramo de 10 o más bases idénticas.
5. Un método para la determinación de un analito
mediante:
- la unión de dicho analito a un ácido nucleico
T que presenta una región que contiene una región A específica
para el analito y una región que contiene un dominio no específico
para el analito en la que se encuentra la secuencia B;
- la hibridación de dicho ácido nucleico diana
con un cebador que comprende una secuencia nucleotídica B'
complementaria a dicha secuencia B;
- la elongación de dicho cebador utilizando como
molde el ácido nucleico mencionado para formar un primer producto
de elongación E mediante la adhesión covalente a dicho cebador de
uno o más nucleótidos, de los que al menos el 80% son nucleótidos
con bases promiscuas que pueden aparearse con cualquiera de las
siguientes bases nitrogenadas: adenina, guanosina, citosina y
timina;
- la separación del ácido nucleico diana T del
mencionado producto de elongación E;
- la utilización de dicho producto de elongación
E como molde para la elongación de otra molécula de dicho cebador
que generará un producto de elongación E';
- la repetición de los pasos de elongación de
moléculas cebadoras y de separación de dichos productos de
elongación el número suficiente de veces para conseguir la cantidad
deseada de ácido nucleico bicatenario; y
- la determinación de la aparición de cualquiera
de los mencionados productos de elongación como medida de la
presencia o la cantidad del analito.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5
caracterizado por el hecho de que el 100% de los nucleótidos
anexionados contienen bases promiscuas.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 5 y 6 caracterizado por la utilización de un
único tipo de nucleótido trifosfato.
8. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 5 a la 7 caracterizado por el hecho de
que la unión de los nucleótidos se consigue gracias a la acción de
una polimerasa.
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 5 a la 8 caracterizado por la
utilización de una polimerasa semitermoestable o no
termoestable.
10. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores caracterizado por el hecho de que
la base promiscua es inosina o deazainosina.
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