ES2233062T3 - Procedimientos de sintesis de polinucleotidos mediante ligadura de oligomeros multiples. - Google Patents

Procedimientos de sintesis de polinucleotidos mediante ligadura de oligomeros multiples.

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Abstract

Procedimiento para sintetizar una cadena de un ácido nucleico complementario en por lo menos una parte de una matriz diana de ácido nucleico de cadena simple, que comprende: a) proporcionar una mezcla de reacción que comprende la matriz, un cebador que tiene por lo menos 15 bases que es complementario con una parte de la matriz del ácido nucleico de una cadena simple diana y una pluralidad de 5¿-monofosfatos de oligonucleótido que tiene cada uno no más de 10 bases; b) hibridar el cebador con la matriz en condiciones tales que permitan la hibridación estable del cebador pero no la hibridación estable de los 5 monofosfatos de oligonucleótido para formar un híbrido cebador- matriz que tiene una región de cadena simple y una región de doble cadena; y c) ligar al híbrido cebador-matriz en la secuencia por lo menos alguna de una pluralidad de 5¿-monofosfatos de oligonucleótido de manera contigua sobre el cebador en un proceso continuo en condiciones tales que permitan la hibridación estable del cebador pero no la hibridación estable de los 5¿-monofosfatos de oligonucleótido para amplificar la región de doble cadena y sintetizar de este modo una cadena de ácido nucleico que sea complementaria con la parte de la matriz, en la que la ligadura de los 5¿-monofosfatos de oligonucleótido se produce solamente en presencia de cebador hibridado.

Description

Procedimientos de síntesis de polinucleótidos mediante ligadura de oligómeros múltiples.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a procedimientos de síntesis de polinucleótidos. Más particularmente, la invención se refiere a procedimientos de síntesis de polinucleótidos mediante ligadura de una pluralidad de unidades oligoméricas en un cebador unido a la matriz. Se pueden preseleccionar una pluralidad de oligómeros de modo que contengan oligómeros que sean complementarios con la cadena de la matriz o se pueden suministrar oligómeros en forma de banco y dejar que se seleccionen ellos mismos. La síntesis por ligadura puede realizarse en una dirección o en dos direcciones en el cebador y se puede utilizar para sintetizar ambas cadenas simultáneamente mediante la utilización de dos cebadores. Se puede realizar la amplificación lineal o exponencialmente y se puede utilizar para copiar ADN y ARN. Los procedimientos de la invención son útiles en varias aplicaciones, incluyendo la clonación, la preparación de polinucleótidos marcados para su utilización en diagnóstico, el análisis y la identificación de mutaciones, el control de la expresión de genes y el análisis de la secuencia.
Antecedentes de la invención
La ligadura enzimática de pares de oligonucleótidos unidos a un ácido nucleico diana es extensamente conocida. Se cree en general que cada uno de los oligómeros debe ser de una longitud mínima para que se liguen eficazmente. Un trabajo reciente ha demostrado que esta longitud mínima es aproximadamente de 6 a 8 bases (C.E. Pritchard y E.M. Southern, Nucl. Acids Res., 25, 3403-3407 (1997)). Se cree en general que no es posible la ligadura de los oligonucleótidos más cortos de aproximadamente 6 bases.
En determinadas condiciones, la ligadura independiente del cebador se puede llevar a cabo utilizando oligómeros de por lo menos seis bases de longitud. De este modo, se prepararon in situ cebadores de PCR a partir de grupos concatenados de pequeño número de hexámeros, heptámeros u octámeros (T. Kaczorowski y W. Sxybalski, Gene, 179, 189-193 (1996); L.E. Kotler, D. Zevin-Sonkin, I.A. Sobolev, A.D. Beskin y L.E. Ulanovsky, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4241-4245 (1993)). Dicha ligadura en ausencia de un cebador no es deseable en los presentes procedimientos y debe evitarse. El éxito en la replicación de una secuencia de nucleótidos de una manera controlada y definida se basa en el conocimiento del punto de origen de la cadena recién sintetizada.
El documento WO-A-9708344 da a conocer un ensayo basado en la ligasa para la identificación de mutaciones en una secuencia diana. Una secuencia diana de una cadena simple se híbrida, por ejemplo, con por lo menos 3 oligonucleótidos. Los oligonucleótidos presentan secuencias que son complementarias y se hibridan con partes de la secuencia y contiguas del ácido nucleico diana. Los oligonucleótidos se ligan posteriormente para formar un producto de ligadura único.
Los ácidos nucleicos se pueden sintetizar a partir de una matriz, un cebador y trifosfatos de nucleótido (NTP) mediante la acción de la polimerasa. Los marcadores se pueden incorporar sustituyendo un porcentaje de los NTP marcados. La capacidad para conseguir un alto grado de incorporación de marcador está limitada y el espaciado exacto de los marcadores no se puede controlar.
La reacción en cadena de polimerasa (PCR) es un procedimiento de amplificación de la cantidad de un polinucleótido mediante la utilización de un cebador complementario en cada cadena que abarca la región que se debe replicar. La síntesis del ácido nucleico continua mediante la amplificación de cada cebador con una polimerasa y los cuatro dNTP. La ciclación térmica permite una pluralidad de copias de la matriz que se debe sintetizar, duplicando aproximadamente la cantidad de amplicón en cada ciclo. Una variante denominada reacción en cadena de ligasa (LCR) implica la ligadura de dos pares de oligonucleótidos con una enzima ligasa para replicar la secuencia en cuestión (D.Y. Wu y R.B. Wallace, Genomics, 4, 560-569 (1989)). Los dos oligonucleótidos que se deben ligar constituyen la longitud completa de la cadena. La ligadura de un gran número de pequeños oligómeros a un cebador para replicar un ácido nucleico no se ha conseguido en el mejor entender de los solicitantes.
Los procedimientos para proporcionar la información de la secuencia que utilizan la ligadura de oligonucleótido se dan a conocer en los documentos U.S. nº 5.750.341 y U.S. nº 5.770.367 y en una publicación (S. Dubiley, E. Kirilov, Y. Lysov y A. Mirzabekov, Nucl. Acids Res., 25, 2259-2265 (1997)). Los procedimientos descritos se diferencian fundamentalmente de los de la presente invención en que necesitan que los oligómeros se unan de uno en uno y que la secuencia se analice después de cada etapa. Estos procedimientos son por consiguiente mucho más laboriosos que los de la presente invención.
Procedimientos de marcado de ácidos nucleicos - Los presentes procedimientos de marcado de ácidos nucleicos o de oligonucleótidos incluyen el procedimiento de cola, el marcado iniciado al azar, la traducción del corte, el ADN ramificado marcado y el marcado final utilizando un cebador marcado. Cada procedimiento adolece de inconvenientes en determinadas aplicaciones. La utilización de un cebador marcado al final amplificado por PCR con bases no marcadas conduce a sólo uno o pocos marcadores por ácido nucleico producto.
El método de cola incorpora un número indeterminado e incontrolado de marcadores al añadir una cola de bases no complementarias al ácido nucleico en cuestión. Esto añade muchas bases adicionales, que no solo añaden gastos, sino que pueden interferir con la hibridación y conducen a un enlace no específico. Además no es fácilmente aplicable a la síntesis de ácidos nucleicos cortos o de oligonucleótidos ya que la longitud de la cola podría superar la longitud de la secuencia en cuestión.
El procedimiento con cebador al azar, aplicable al marcado de ácidos nucleicos largos, utiliza una mezcla de cebadores que son amplificados por una polimerasa con una mezcla de bases marcadas y no marcadas. El número de bases que se pueden incorporar es variable y arbitrario en número. Una mezcla de numerosos fragmentos de ácido nucleico de longitudes variables se produce a partir de ambas cadenas. Igualmente, la traducción del corte produce una mezcla de numerosos fragmentos de ácido nucleico de longitudes variables a partir de ambas cadenas. Se crean roturas en ambas cadenas de ADN y se sintetizan nuevas cadenas de ácido nucleico en la posición del corte utilizando una mezcla de bases marcadas y no marcadas. Como la posición del corte es arbitraria, la incorporación del marcador tampoco está controlada.
Se ha utilizado la tecnología del ADN ramificado en pruebas de diagnóstico como un medio para atacar varios marcadores por un ADN diana. La metodología cuenta con la creación de varias ramas de ácido nucleico sintético unidas cada una a una sonda, seguida de hibridación de una pluralidad de oligonucleótidos marcados a cada uno de los multímeros ramificados de amplificación. El procedimiento requiere la preparación costosa de muchas sondas y de ADN ramificado y en general no es aplicable, especialmente para la generación de piezas cortas de ADN muy marcado.
Sumario de la invención
Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar procedimientos de síntesis de polinucleótidos de una o dos cadenas. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar procedimientos de síntesis de polinucleótidos ligando una pluralidad de 5'-fosfatos de oligonucleótido a un cebador hibridado con una matriz de polinucleótido. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar procedimientos de síntesis de polinucleótidos utilizando un banco de 5'-fosfatos de oligonucleótido. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar procedimientos de síntesis de polinucleótidos marcados en una posición y grado especificados de incorporación del marcador. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar procedimientos para amplificar la cantidad de un ácido nucleico mediante ligadura dirigida por el cebador. Otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar procedimientos para la detección de genes y de análisis de la expresión del gen. Todavía otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar procedimientos para la detección de mutaciones genéticas. Aún otro objetivo de la presente invención consiste en proporcionar procedimientos para el análisis de la secuencia de bases de un ácido nucleico.
El nuevo procedimiento de la invención se define en la reivindicación 1.
Descripción general
Se ha descubierto que una serie de 5'-fosfatos de oligonucleótido cortos se puede ligar simultáneamente a un cebador unido a la matriz de manera contigua para producir la cadena complementaria de un polinucleótido o ácido nucleico de la matriz. El ácido nucleico producido se puede marcar o no, utilizando oligómeros cortos marcados o no marcados. Los oligómeros de la serie contienen cada uno preferentemente el mismo número de bases. Cuando se conoce exactamente una secuencia que se debe sintetizar, se puede utilizar una serie que contiene el mínimo número de oligómeros. Los oligómeros se unen en el orden correcto partiendo del cebador, para producir la secuencia correcta. La ligadura independiente del cebador no se produce cuando se utilizan oligonucleótidos de longitud \leq 5 bases. Cuando la secuencia que se debe sintetizar no es conocida, se utiliza un banco de un gran número del grupo de oligómeros total posible. Esta última situación se produce en el análisis de la secuencia y en la identificación de la mutación. Las ligaduras se realizan preferentemente por medio de una enzima ligasa. También se puede emplear agentes químicos conocidos para ligar nucleótidos y oligonucleótidos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa esquemáticamente la ligadura de dos oligómeros P1 y P2 en un cebador unido a la matriz en presencia de un oligómero P3 complementario competitivo no enlazable.
La Figura 2 representa esquemáticamente un procedimiento para amplificar la cantidad de un ácido nucleico utilizando la ligadura de varios oligómeros dirigidos al cebador unido a la matriz. Se muestra la síntesis produciéndose en una dirección en cada cadena, pero también se puede realizar en dos direcciones como se describe más adelante.
La Figura 3 representa esquemáticamente un procedimiento para detectar una mutación puntual en un gen mediante la ligadura de oligómeros específicos de la mutación marcados de forma detectable en un cebador unido a la matriz.
La Figura 4 representa esquemáticamente un procedimiento para detectar dos genotipos diferentes de una mutación en un gen mediante la ligadura de diferentes conjuntos de oligómeros específicos para la mutación marcados de forma detectable o específicos naturales en un cebador unido a la matriz. Los oligómeros específicos de la mutación llevan un primer marcador mientras que los oligómeros específicos naturales llevan un segundo marcador.
La Figura 5 representa un ejemplo de ADN ramificado o de multímeros de amplificación.
La Figura 6 representa una adaptación del ADN ramificado en el que por lo menos la primera rama se prepara por ligadura de oligómeros marcados para proporcionar puntos de la rama a intervalos espaciados de forma regular.
La Figura 7 representa esquemáticamente un procedimiento para determinar la secuencia de un ácido nucleico mediante la ligadura de los únicos oligómeros marcados en un cebador unido a la matriz, la escisión de los marcadores y el análisis de la masa de cada marcador único.
Descripción detallada de la invención Definiciones
Oligómero, oligonucleótido - tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un compuesto que contiene un enlace fosfodiéster internucleótido y un grupo monofosfato 5'-terminal. Los nucleótidos pueden ser los que producen normalmente ribonucleótidos A, C, G y U o desoxirribonucleótidos, dA, dC, dG y dT.
Cebador o sonda/cebador se refiere a un oligonucleótido utilizado para dirigirse al punto de ligadura y se necesita para iniciar el proceso de ligadura. Los cebadores son de una longitud suficiente para hibridarse de manera estable con la matriz y representar una única secuencia en la matriz. Los cebadores normalmente tendrán una longitud de aproximadamente 15 a 30 bases aunque se pueden utilizar cebadores mayores. Los cebadores marcados que contienen marcadores detectables o marcadores que permiten la captura en fase sólida están comprendidos dentro del alcance del término tal como se utiliza en la presente memoria. Cebador también contempla los oligómeros agrupados uno junto a otro de por lo menos seis bases como es conocido en la técnica (T. Kaczorowski y W. Szybalski, Gene, 179, 189-193 (1996)).
Matriz, polinucleótido de ensayo, diana, se utilizan indistintamente y se refieren al ácido nucleico cuya longitud se debe replicar.
Muestra - Fluido que contiene o se sospecha que contiene uno o más analitos que se deben analizar. Las muestras típicas que se analizan por el método de reacción quimioluminiscente son las muestras biológicas que incluyen fluidos corporales tales como sangre, plasma, suero, orina, semen, saliva, lisados celulares, extractos de tejido y similares. Otros tipos de muestras incluyen las muestras de alimentos y las muestras ambientales tales como suelo o agua.
Oligonucleótido corto - Tal como se utiliza en la presente memoria, es un 5'-fosfato de oligonucleótido de al menos dos y hasta aproximadamente 10 bases de longitud. Las bases pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o análogos de estos. La longitud de un oligonucleótido corto útil en un contexto dado puede variar dentro de este intervalo y puede ser menor del intervalo total. La longitud preferida varia dependiendo de la aplicación particular.
Par de unión específico - Dos sustancias que presentan una afinidad mutua de enlace. Los ejemplos incluyen los pares antígeno-anticuerpo, hapteno-anticuerpo o anticuerpo-anticuerpo, complementarios de oligonucleótidos o polinucleótidos, avidina-biotina, estreptavidina-biotina, hormona-receptor, lectina-carbohidrato, IgG-proteína A, ácido nucleico-proteína de fijación al ácido nucleico y ácido nucleico-anticuerpo del ácido anti-nucleico y complejo metálico-ligando.
Un procedimiento preferido de ligadura utiliza una ligasa tal como una ADN ligasa. Las ligasas representativas incluyen la ligasa T4, ligasa T7, ligasa Tth, ligasa Taq y ADN ligasa de E. coli. La ligasa puede ser una ligasa termoestable, en cuyo caso son posibles las técnicas de ciclación térmica expuestas más adelante. La ciclación térmica con una ligasa termoestable es útil en los procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos de una manera homóloga a la reacción en cadena de polimerasa, pero utilizando oligómeros y una ligasa en lugar de los dNTP y una polimerasa. Los procedimientos para llevar a cabo las reacciones de ligadura enzimática se describen en general p. ej., en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989.
Las reacciones de ligadura enzimática se realizan generalmente en una reacción tampón, opcionalmente en presencia de aditivos para favorecer la hibridación. El tampón tiene un pH normalmente en el intervalo de 6 a 9, más frecuentemente de 7 a 8,5 y preferentemente en el intervalo de 7,5 a 8. Son adecuados los tampones capaces de mantener un pH en este intervalo. La reacción se puede realizar en un intervalo de temperaturas comprendidas en el intervalo entre 0 y aproximadamente 50ºC. Las temperaturas óptimas variarán en un intervalo dependiendo de la naturaleza y del tamaño de los fosfatos de oligonucleótido que se deben ligar, de la enzima, de la presencia y cantidad de aditivo y se pueden optimizar experimentalmente con relación a la bibliografía general sobre ligasas y por referencia a los ejemplos específicos más adelante. La duración para realizar la ligadura puede ser tan corta como unos pocos minutos hasta varias horas, aunque es deseable que la reacción se realice tan rápidamente como sea posible. En las reacciones de ligadura del oligonucleótido se pueden añadir proteínas de unión al ADN de una cadena simple para mejorar su eficacia. Su efecto es debido a su relajación en cualquier estructura secundaria que esté en la cadena de la matriz permitiendo así que los oligonucleótidos complementarios se unan y se liguen. Se puede utilizar la proteína de unión de una cadena simple de E. coli (Promega, Madison, WI o Amersham/USB) y la proteína 32 del gen T4 (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). La utilización de agentes excluyentes de volumen tales como los polietilenglicoles (PEG) puede presentar ventajas para favorecer las ligaduras. La inclusión de NaCl de hasta 200 mM puede servir también para favorecer las ligaduras. Se contempla la utilización de otros aditivos en las ligaduras enzimáticas y está comprendida dentro del alcance de los presentes procedimientos. Los aditivos incluyen los agentes para la transferencia de fosfato tales como ATP, reactivos sulfhidrilo, incluyendo DTT y 2-mercaptoetanol, y los cationes divalentes tales como las sales de Mg^{+2}.
La ligadura de 5'-fosfatos de oligómero abarca también los procedimientos no enzimáticos de ligadura. Los reactivos químicos que efectúan la formación del enlace fosfodiéster internucleótido son conocidos (CNBr: K.D. James, A.D. Ellington, Chemistry & Biology, 4.595.605, (1997); N-cianoimidazol: T. Li, K.C. Nicalaou, Nature, 369, 218-221 (1994); EDAC: D. Sievers, G. Von Kiedrowski, Nature, 369, 221-224 (1994)). Los procedimientos de ligadura química no han sido aplicados a los procedimientos de análisis secuencial.
La incorporación de oligómeros incompatibles puede producirse en otras técnicas, especialmente cuando la secuencia presenta un alto contenido en G-C. La aparición de incompatibilidades se puede controlar como en el caso de los demás procedimientos de hibridación. Se pueden emplear la temperatura, la concentración salina y los aditivos en las formas reconocidas en la técnica para controlar la restricción del proceso de hibridación. Como el efecto de una incompatibilidad de un pequeño oligómero debería ser proporcionalmente mayor que el de uno mayor, la discriminación de las secuencias impropias puede presentar mejoras sobre otras técnicas de ligadura.
Otra forma de realización utiliza un banco de posibles secuencias para conseguir la ligadura de una serie de oligómeros cortos de bases de longitud n para sintetizar un ácido nucleico complementario. El banco contiene muchas más combinaciones posibles que las n bases (n-meros) que se necesitan para formar el ácido nucleico producto. Cuando n=5, por ejemplo, existen 4^{5} ó 1024 posibles pentámeros que contienen las cuatro bases A, C, G, T y U. El banco puede contener todos los 4^{n} oligómeros posibles o menos del conjunto total, pero debería contener al menos una proporción sustancial (> 50% y preferentemente > 75%, más preferentemente > 90%) de los oligómeros posibles.
Los procedimientos conocidos de síntesis de polinucleótidos, mediante amplificaciones de polimerasa con los dntp o por ligadura de oligonucleótidos formados previamente, funcionan proporcionando sólo un pequeño número de diferentes reactivos para la incorporación en la molécula producto. Los métodos basados en la ligadura preseleccionan normalmente uno de los oligonucleótidos con la secuencia correcta. Los procedimientos de amplificación con polimerasa suministran las cuatro bases individuales para su incorporación. Los presentes procedimientos se diferencian fundamentalmente en que proporcionan un gran número de reactivos potenciales en la mezcla de reacción. Además, un número significativo de oligonucleótidos cortos tienen una secuencia apropiada para la hibridación con la diana, pero si se hibridan, bloquearían o terminarían de forma prematura el proceso de ligadura.
Como se observa en la Figura 1, el oligómero P3 es complementario con una parte de la secuencia diana, pero, si está hibridado bloquearía la ligadura de P1 y P2 al cebador. Sorprendentemente, la presencia de oligómeros complementarios que no se pueden ligar al cebador no interfiere o impide la ligadura con éxito de los oligómeros deseados al cebador unido a la matriz.
El banco puede contener además una mayoría de secuencias de oligonucleótido que no son complementarias con la diana o solamente complementarias en parte. Este exceso de oligonucleótidos, en efecto, compite con las secuencias correctas para el reconocimiento y la ligadura. No obstante, la ligadura de oligonucleótidos cortos en el orden correcto se produce de forma eficaz a pesar de su improbabilidad estadística. La capacidad para replicar exactamente un ácido nucleico por ligadura sucesiva de muchos oligonucleótidos cortos en una etapa no es de esperar y simplifica en gran manera el proceso comparado con otros conocidos en la técnica.
La longitud de los oligonucleótidos que deben utilizarse en los presentes procedimientos está gobernada por la interacción de varios factores competitivos. Los oligómeros mayores se hibridarán más fuertemente en una serie de condiciones dadas (concentración salina, temperatura) y pueden por consiguiente hibridarse a una temperatura mayor. A medida que aumenta la longitud del oligonucleótido, el número de compuestos discretos requeridos para montar el banco completo de todos los n-meros posibles aumenta por un factor de 4 para cada de aumento de una unidad de n.
Longitud del oligómero nº total de secuencias
1 4
2 16
3 64
4 256
5 1024
6 4096
7 16.384
8 65.536
9 262.144
10 1.048.576
Los oligómeros más cortos requieren menos compuestos para construir el banco completo, pero se vuelve más difícil, p. ej., reducir la temperatura, para hibridarse y ligarse a medida que disminuye su longitud. Esto, a su vez, se traduce en una restricción mayor a una temperatura dada. Otro factor todavía es la capacidad del oligonucleótido para hibridarse e iniciar la amplificación en un punto no asociado con el cebador. Se ha demostrado que la hibridación independiente del cebador se produce, en condiciones correctas, con oligonucleótidos tan pequeños como de 6 bases. La ligadura de 2 o más hexámeros contiguos para producir p. ej., un dodecámero o un octadecámero, produce a continuación de forma eficaz un nuevo cebador. Si sucede esto, la capacidad para controlar el punto de partida para la síntesis del polinucleótido está comprometida. Por otra parte, la probabilidad de encontrar una pluralidad de sucesos de una secuencia dada en un ácido nucleico de centenares de bases aumenta sustancialmente a medida que se utilizan oligonucleótidos más cortos. En las aplicaciones que implican la determinación de la secuencia, es deseable impedir o minimizar la aparición de elementos duplicados en la secuencia. La selección del oligonucleótido de longitud óptima que debe utilizarse es un compromiso entre estos efectos en conflicto. La longitud óptima será diferente en las diferentes utilizaciones finales.
En la práctica puede que no sea necesario la utilización de todo el banco de oligonucleótidos de longitud n. Cuando el número de oligonucleótidos requeridos para producir la secuencia dada es pequeño en comparación con el número total de oligonucleótidos en el banco, se pueden utilizar bancos parciales y mantener todavía una gran probabilidad de que todos los oligonucleótidos requeridos estén presentes. En algunos casos puede ser deseable excluir determinados oligonucleótidos de la secuencia que se hidrolizan demasiado débil o fuertemente.
En los presentes procedimientos no es necesario, excepto que se indique más adelante explícitamente, que cada componente de la serie de 5'-fosfatos de oligonucleótido utilizados en un procedimiento dado tenga el mismo número de bases. Puede presentar ventajas en algunas formas de realización utilizar una combinación de oligómeros de dos o más longitudes diferentes, tales como pentámeros y hexámeros, con el fin de evitar la aparición de oligómeros por duplicado. Se prefiere con frecuencia que los oligonucleótidos utilizados en un procedimiento dado sean del mismo número de bases. Este número preferentemente es de 2 a 6, más preferentemente 5.
En otra forma de realización, la ligadura dirigida por la matriz de una serie de múltiples oligonucleótidos cortos de la misma longitud en un cebador se puede formar previamente de manera que controle el punto final de la ligadura mediante la utilización de oligómeros no amplificables. Un oligómero no amplificable puede contener el mismo o diferente número de bases que otros oligómeros en la serie. El oligómero no amplificable contiene un 5'-fosfato de modo que puede estar ligado, pero carece del grupo 3'-OH. Podría, por ejemplo, tener una base didesoxi en el extremo 3' del oligómero de modo que no exista 3'-OH para la ligadura. Otro tipo de oligómero no amplificable contiene un grupo 3'-OH bloqueado, por ejemplo, cuando el grupo hidroxilo está bloqueado con un grupo metilo o un grupo fosfato para impedir la ligadura posterior. Las modificaciones en la base terminal que impiden la ligadura son otro tipo posible de oligómero no amplificable. El oligómero no amplificable puede estar marcado o no marcado, dependiendo de la necesidad. Una forma de realización preferida consiste en utilizar oligómeros que contienen una base didesoxi en el terminal 3'.
Otro aspecto de la presente invención consiste en un procedimiento para sintetizar un ácido nucleico por ligadura de una pluralidad de 5'-fosfatos de oligonucleótido en un cebador unido a la matriz tanto en la dirección 5'\rightarrow3' como en la 3'\rightarrow5' a la vez. Este proceso se puede realizar, por ejemplo, proporcionando un grupo 5'-fosfato en el cebador. La ligadura puede producirse simultáneamente en ambos terminales del cebador con tal que se proporcionen los oligómeros ligables apropiados. El punto de terminación de la síntesis en una de las dos o en ambas direcciones puede estar controlado por la utilización de oligómeros no amplificables o excluyendo los oligómeros seleccionados. Un oligómero no amplificable para terminar la síntesis en la dirección 3'\rightarrow5' no debería tener el grupo 5'-fosfato.
La ligadura dirigida por la matriz de una serie de múltiples oligonucleótidos cortos en un cebador se puede utilizar en un procedimiento de amplificación de la cantidad de un ADN diana. Por consiguiente, otro aspecto de la invención comprende un procedimiento de amplificación de un ácido nucleico diana utilizando una ligasa, dos cebadores y una serie de oligonucleótidos cortos en los que las sondas son complementarias con las regiones en las cadenas opuestas que abarcan la región de la diana que se debe amplificar. Como mínimo, la serie de oligómero suministrada para la reacción debe contener los oligómeros requeridos para amplificar ambos cebadores en sus respectivas cadenas en cuanto a la posición correspondiente al extremo 5' del otro cebador. Se pueden incluir oligómeros adicionales por ejemplo como sucedería cuando se utiliza el banco completo de oligómeros en lugar de preseleccionar la serie de oligómeros. El proceso, mostrado esquemáticamente en la Figura 2, es distinto de la reacción en cadena de polimerasa, PCR, pero utilizando un banco de oligómeros y una ligasa en lugar de los cuatro desoxirribonucleótidos y una polimerasa. Cada ciclo de hibridación, amplificación de la ligasa y deshibridación produce una amplificación al doble de la secuencia diana. Como generalmente se necesita calentamiento para separar el ácido nucleico doble recién sintetizado, puede ser necesario añadir más ligasa en rondas posteriores de ligadura-amplificación. Por otra parte, el proceso se puede realizar con una ligasa termoestable. La ciclación térmica se puede realizar a continuación sin sustituir la ligasa en cada ciclo.
De acuerdo con la descripción anterior, se proporciona un procedimiento para amplificar la cantidad de una parte de un ácido nucleico de doble cadena que tiene una primera cadena y una segunda cadena tal como se define en la reivindicación 2.
En una forma de realización preferida de un procedimiento de amplificación, se preselecciona la serie de oligómeros que contenga únicamente aquellos oligómeros necesarios para replicar la doble cadena, es decir, aquellos oligómeros que se producen en la doble cadena en la región abarcada por los dos cebadores. En otra forma de realización preferida, se utilizan oligómeros no amplificables para las posiciones terminales de cada cadena. Estos dos oligómeros terminales, por definición, tienen una secuencia de bases complemetarias con el primer grupo de bases de la longitud del oligómero en el extremo 5' de cada cebador.
Los procedimientos de amplificación según la presente invención se pueden conseguir por síntesis de cada cadena tanto en la dirección 5'\rightarrow3' como en la dirección 3'\rightarrow5' a la vez. Este proceso de amplificación bidireccional se puede realizar, por ejemplo, proporcionando un grupo 5'-fosfato en el cebador. La ligadura puede producirse simultáneamente en ambos terminales de cada cebador con tal que se proporcionen los oligómeros ligables apropiados. El punto de terminación de la síntesis en una de las dos o en ambas direcciones puede estar controlado por la utilización de oligómeros no amplificables o excluyendo los oligómeros seleccionados como se describió anteriormente.
Como en el caso de otras utilizaciones del presente procedimiento con ligadura del oligómero de síntesis de ácido nucleico, se pueden utilizar oligómeros marcados o no marcados. La serie de oligómeros utilizados puede ser el banco completo, una parte sustancial del banco o un subconjunto preseleccionado si la secuencia que se debe amplificar se conoce de antemano.
En otro aspecto, el procedimiento de síntesis de secuencias de ácido nucleico específicas mediante ligadura de oligómeros en los cebadores unidos a la diana se puede utilizar en aplicaciones de diagnóstico. Las secuencias específicas características de la diana en cuestión se pueden detectar utilizando oligómeros marcados en el procedimiento de síntesis de la nueva cadena. Cuando se conoce la secuencia de las bases de la región del ácido nucleico diana, se utilizan los oligómeros correspondientes necesarios para completar esta secuencia, alguno de los cuales por lo menos lleva un marcador detectable. Dichos procedimientos se utilizan en muchas áreas de diagnósticos del ácidos nucleicos, incluyendo la detección de agentes infecciosos tales como C. trachomatis y N. gonorrhoeae, P. carinii, M. tuberculosis, la detección de transmisión por los alimentos tales como Salmonella y E. coli, procedimientos de detección de la expresión de genes en análisis de identificación de alto rendimiento, procedimientos de detección de anomalías genéticas, identificación legal de muestras de ADN de criminales sospechosos, confrontación de la identidad de restos humanos y una secuencia específica de una prueba de paternidad y diferenciándola de otras secuencias relacionadas.
En el contexto de las pruebas de las anomalías genéticas, una aplicación consiste en un procedimiento para la detección de mutaciones genéticas. Las mutaciones pueden ser una mutación en un punto (a y \beta-talasemia), una sustitución de una sola base (anemia depranocítica), una deleción (fibrosis cística \DeltaF_{508}, Tay-Sachs), una inserción, una duplicación, una transposición de bases o una combinación de las anteriores. Se seleccionan oligómeros marcados para la ligadura a una sonda/cebador de modo que el cebador amplificado resultante es un polinucleótido marcado específico de la mutación.
Los procedimientos de la presente invención se pueden utilizar para proporcionar un procedimiento para la diferenciación de heterozigotos a partir de homozigotos para dicha enfermedad genética. Como dos copias de un cromosoma que contiene una secuencia de ADN en cuestión están presentes en una muestra, el procedimiento de síntesis del ADN complementario marcado proporciona un medio para distinguir heterozigotos de cualquiera de los homozigotos. Se proporciona para la ligadura una serie de oligómeros que llevan un primer marcador que, cuando se liga, producen una parte de una cadena complementaria con la secuencia normal. Otra serie de oligómeros que llevan un segundo marcador produce una parte de una cadena complementaria con la secuencia mutante en la ligadura (Figura 4). La ligadura de conjuntos de oligómeros a una sonda hibridada a un ADN diana en la muestra crea un polinucleótido complementario con el genotipo de la muestra. El ADN homozigótico contendrá un marcador u otro; el ADN heterozigótico contendrá ambos.
Cuando no se conoce la secuencia que se debe sintetizar, se utiliza un banco de un gran número de oligómeros del grupo total posible. Esta última situación produce el análisis de la secuencia y la identificación de la mutación. Cuando se utiliza junto con los procedimientos de determinación de la secuencia de bases de un polinucleótido recién sintetizado descrito con detalle más adelante, se pueden analizar e identificar simultáneamente numerosas mutaciones de un gen determinado. La capacidad para analizar una pluralidad de mutaciones en un gen permitiría la identificación de enfermedades genéticas tales como la fibrosis quística para la que se han identificado más de 500 mutaciones.
En otro aspecto todavía, el cebador está inmovilizado.
Tras la ligadura se separan los 5'-monofosfatos de oligonucleótido que no están ligados y el se desnaturaliza híbrido de ácido nucleico de la prueba con sonda capturado que tiene una región con doble cadena amplificada para separar el ácido nucleico de la prueba de un soporte sólido y produce el ácido nucleico de una cadena simple inmovilizado.
El procedimiento controla el punto de origen y no está limitado por el tamaño del oligómero al que se debe ligar. Cuando se conoce exactamente la secuencia que se debe transcribir, los oligómeros se pueden preseleccionar para reducir costes y complejidad.
Otro aspecto de la invención consiste en un procedimiento de síntesis de ácido múltiplemente marcado en el que se controla el alcance de la incorporación del marcador y proporciona una gran densidad de marcado. Cuando se utiliza un cebador inmovilizado para que sirva al doble fin de sonda de captura y cebador el híbrido capturado se pone en contacto con una pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótidos marcados, tras la ligadura los 5'-monofosfatos de oligonucleótido marcados que no están ligados se separan; y el híbrido de ácido nucleico de la prueba con sonda capturado que posee una región con doble cadena amplificada se desnaturaliza para separar el ácido nucleico del soporte sólido y producir un ácido nucleico de una cadena simple marcado inmovilizado que contiene una pluralidad de marcadores.
El cebador puede ser alternativamente un cebador no inmovilizado con objeto de sintetizar un ácido nucleico múltiplemente marcado. Esta forma de realización utiliza una pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido marcados y tras la ligadura se separan los 5'-monofosfatos de oligonucleótido marcados que no están ligados.
El procedimiento puede comprender además, si se desea, la etapa de separación de la cadena del cebador amplificada a partir de la cadena de ácido nucleico de la matriz. La transmisión por el marcador en cada 5'-monofosfato de oligonucleótido puede ser por diferentes marcadores o puede ser por el mismo marcador. Por otra parte, se puede emplear un número limitado de diferentes marcadores, p. ej. 2 a 5 marcadores. La selección de marcadores utilizados estará gobernada por la aplicación final.
Los presentes procedimientos, al contrario que otros procedimientos de marcado de ácidos nucleicos descritos en el apartado anterior, pueden preparar prácticamente cualquier longitud de ácido nucleico, pero sería probablemente más útil para los productos de por lo menos aproximadamente 50 bases. Los productos más cortos tendrían menos marcadores unidos. Una de las principales ventajas es que el grado y la posición de la unión del marcador están controlados con precisión. Por ejemplo, los pentámeros que llevan un marcador conducen cada uno a un producto en el que cada quinta base está marcada, proporcionando una densidad de marcador del 20%. Se pueden conseguir densidades todavía mayores con oligómeros más cortos o con pentámeros que llevan dos o más marcadores cada uno.
La capacidad para marcar de forma controlable a estas altas densidades será particularmente ventajosa en las pruebas de diagnóstico en las que la sensibilidad de la detección es primordial. Densidades de marcador mayores se traducirían en límites mejores de detección. El marcado controlado contribuirá a mejorar la precisión de la prueba. Los marcadores pueden ser prácticamente especies detectables, incluyendo radioisótopos, marcadores quimioluminiscentes y marcadores fluorescentes, marcadores colorimétricos detectados basándose en la absorción de la luz, moléculas de fijación específica incluyendo los antígenos y los anticuerpos, proteínas de unión tales como la estreptavidina y los haptenos tales como la biotina y la digoxigenina. Además, cuando el marcador es un hapteno pequeño, el marcador detectable puede ser una especie tal como una enzima que está unida al ácido nucleico mediante un conjugado enzima-anti-hapteno. A este último respecto, la utilización de la ligadura del pentámero para producir un ácido nucleico marcado proporciona todavía otra ventaja. Los marcadores de enzima voluminosos estarían unidos a cada quinta base, que les sitúa en ángulos de casi 180º a lo largo de la doble hélice del marcador vecino más próximo. La consideración de la separación internucleótido y de los diámetros moleculares de las enzimas, pone de manifiesto que incluso proteínas globulares relativamente grandes se pueden adaptar a esta densidad de marcado sin congestión estérica grave.
Se pueden conseguir densidades de marcador aún mayores adoptando el principio del marcador ramificado junto con la incorporación de oligómeros regulares marcados tal como se representa en las Figuras 5 y 6. En la práctica, algunos o todos los oligómeros constituirían un "asa" tal como un hapteno o una secuencia corta de reconocimiento que se utiliza para unirse a un multímero de amplificación ramificado.
Como alternativa, las extremidades de las ramas se podrían preparar mediante la ligadura de los oligómeros cortos marcados, de modo que cada una de una pluralidad de extremidades lleva marcadores detectables. La síntesis de ácidos nucleicos densamente marcados por ligadura de oligómeros marcados se puede adaptar a otros tipos de tecnología de ADN ramificado tales como los dendrímeros de ADN (Polyprobe, Filadelfia).
Los 5'-fosfatos de oligonucleótido utilizados en los procedimientos de síntesis, amplificación, preparación de polinucleótidos marcados o polinucleótidos inmovilizados expuestos anteriormente son preferentemente relativamente cortos. En estas aplicaciones, no es necesario utilizar una fracción sustancial del banco total de oligómeros de una longitud dada para que sea capaz de sintetizar el ácido nucleico deseado de la secuencia conocida. El tamaño de los oligómeros puede tener cualquier valor conveniente, normalmente de 2 a aproximadamente 20 bases. Cuando se desea el marcado de alta densidad, es preferible que los oligómeros contengan menos de aproximadamente 10 bases y preferentemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 bases.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan procedimientos para determinar la secuencia (secuenciado) de un ácido nucleico de una cadena simple desconocido. El procedimiento se puede aplicar a secuencias de ARN, ssADN y dsADN desnaturalizado de longitudes adecuadas con la condición de que al menos una parte de la secuencia sea conocida. Esta última restricción es necesaria con el fin de que se pueda diseñar una sonda/cebador de captura.
La sonda/cebador de captura está inmovilizada o es capaz de ser inmovilizada en un soporte sólido tal como una bola, tubo, filtro, placa de microvaloración de membrana o chip. La sonda de captura debería tener suficiente longitud de bases para garantizar la hibridación eficaz y representa una única secuencia parcial del ácido nucleico de la prueba. Estas condiciones generalmente se satisfarán con una longitud de al menos 10 bases y preferentemente de por lo menos 15 bases. La sonda de captura se puede inmovilizar en el soporte sólido de cualquier manera reconocida en la técnica. Un medio utilizado generalmente consiste en proporcionar un marcador de biotina para unirse a un soporte recubierto con estreptavidina. Las bolas recubiertas con estreptavidina y las placas de microvaloración están disponibles en el comercio.
Los 5'-fosfatos de oligonucleótido utilizados en las determinaciones del análisis de la secuencia realizados según los procedimientos expuestos en la presente memoria son preferentemente relativamente cortos. Es necesario utilizar una fracción sustancial de todos los oligómeros posibles de una longitud dada con el fin de que sea capaz de sintetizar tramos largos de ácido nucleico de secuencia desconocida. Con el fin de mantener el tamaño total del banco manejable, es deseable limitar el tamaño del oligómero a menos de aproximadamente 8 bases. Es preferible que los oligómeros contengan 5 ó 6 bases. Un requisito adicional en las formas de realización que implican el análisis de la secuencia es que todos los 5'-fosfatos de oligonucleótido tengan el mismo número de bases.
Los marcadores escindibles pueden ser cualquier fragmento molecular capaz de ser liberado de forma controlable desde la sonda/cebador amplificada. Los marcadores preferidos son pequeñas moléculas orgánicas de masa molecular menor de aproximadamente 50.000 amu. Es deseable que todos los marcadores sean de un tipo de estructura, que tenga un grupo funcional común de modo que todos sean escindibles por un medio común. Un medio de efectuar la escisión es por termólisis de un grupo térmicamente lábil. Un grupo térmicamente lábil preferido para su utilización en los marcadores escindibles es el 1,2-dioxetano. Es bien sabido que los 1,2-dioxetano experimentan una fragmentación térmica del anillo dioxetano para producir dos fragmentos de carbonilo. Pueden prepararse oligómeros marcados con dioxetano que liberen un compuesto carbonilo cuando se calientan ligando un grupo dioxetano a un ribonucleótido o desoxirribonucleótido.
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Un banco de oligómeros comprendería la serie de todas las secuencias posibles de n bases, unida cada una por enlace covalente a un único grupo dioxetano. Por comodidad de síntesis, el grupo funcional de enlace que conecta el grupo del anillo de dioxetano al oligómero sería común a todos los miembros de la familia de oligómeros marcados. Los sustituyentes en el anillo de dioxetano en el carbono que se escinde variarán entre los miembros de la serie de compuestos.
Se conocen y se pueden utilizar otros grupos funcionales térmicamente escindibles tales como los peróxidos no cíclicos. La temperatura requerida para la termólisis debería ser suficiente baja de modo que no se produzca la fragmentación del oligonucleótido.
Los medios de escisión del marcador escindible no se limitan a la escisión térmica. Se puede emplear cualquier medio para liberar de forma controlada el marcador de la sonda/cebador amplificada. Otros medios incluyen, sin limitación, reacciones enzimáticas, reacciones químicas incluyendo los desplazamientos nucleófilos tales como la escisión con éter silílico producida por fluoruro, las fragmentaciones hidrolíticas básicas o ácidas tales como la hidrólisis del éster o la hidrólisis del éter vinílico, fragmentaciones fotoquímicas, escisión reductora tal como la escisión reductora provocada por metales de un disulfuro o peróxido, la escisión oxidante de alquenos o dioles.
Una reacción enzimática a título de ejemplo para la escisión del marcador utiliza dioxetanos como marcadores enzimáticamente activables. La desprotección enzimática de un sustituyente fenólico protegido activa la escisión del anillo de dioxetano en dos compuestos de carbonilo como se representó anteriormente. La reacción se puede realizar a temperatura ambiente y controlar la velocidad de escisión por la cantidad y naturaleza de la enzima activadora y por las características de la solución de reacción, p. ej. pH. Numerosas estructuras de dioxetano activables se conocen bien en la técnica y han sido objeto de numerosas patentes. Los dioxetanos estabilizados por espiro-adamantilo dados a conocer en la patente U.S. nº 5.707.599 son un ejemplo, otros sustituyentes que contienen alquilo o cicloalquilo que se dan a conocer en la patente US nº 5.578.253 serían también adecuados. Un sustituyente de enlace de los grupos espiroadamantilo, alquilo o cicloalquilo mencionados anteriormente se requerirían para unir el marcador de dioxetano al oligómero. Los dioxetanos que se pueden unir se dan a conocer en la patente U.S. nº 5.770.743.
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Los procedimientos químicos de escisión de dioxetanos activables son asimismo bien conocidos y se utilizarían igualmente en los procedimientos de la invención. En el ejemplo anterior, X puede ser un grupo trialquilsililo y el agente activador fluoruro. Otros pares de agente activador/grupo escindible se describen, por ejemplo, en las patentes nº 5.707.559, nº 5.578.253 y nº 5.770.743 mencionadas anteriormente.
Existen varias formas en las que se puede detectar el marcador. Cada procedimiento o tipo de marcador constituye una forma de realización diferente de la invención. En una forma de realización, el marcador es una molécula fluorescente tales como las FAM, JOE, ROX y TAMRA fluorescentes utilizadas frecuentemente en el secuenciado automático con didesoxi. Se conocen numerosos procedimientos de marcado de nucleótidos y oligonucleótidos en la técnica que incluyen la unión directa del marcador (Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, (Molecular Probes, Eugene, OR), 1992). El marcado se puede realizar también por medios indirectos en los que, por ejemplo, cuando se proporciona un enlazador universal tal como la biotina como marcador primario y un compañero de fijación marcado por el fluorescente para la biotina proporciona el marcador.
En otra forma de realización, el marcador es un compuesto quimioluminiscente y la cantidad de marcador se detecta por la intensidad de luz producida al desencadenar la generación de quimioluminiscencia del marcador. Se conocen varios tipos de compuestos quimioluminiscentes y se pueden utilizar como marcadores. Los ejemplos representativos incluyen los ésteres de acridinio y las sulfonamidas, derivados de luminol o isoluminol y dioxetanos (R. Handley, H. Akhavan-Tafti, A.P. Schaap, J. Clin. Ligand Assay, 20(4) 302-312 (1997)). Un marcador quimioluminiscente preferido es un compuesto de fosfato de acridano tal como se da a conocer en la solicitud WO-A-9966328 de los solicitantes en trámite con la presente. Estos últimos compuestos se utilizan de forma ventajosa debido a su estabilidad, eficacia del cuanto de quimioluminiscencia elevada, facilidad de conjugación y capacidad para activarse en un amplio intervalo de condiciones, incluyendo en los geles de electroforesis. Los compuestos bioluminiscentes y electroquimioluminiscentes se consideran dentro del alcance de los marcadores quimioluminiscentes detectables.
En otra forma de realización, el marcador es un compuesto cromógeno y la cantidad de marcador se detecta por absorbancia de la luz. Otro tipo de marcador es un radioisótopo tal como ^{32}P y ^{35}S cuya presencia se puede detectar utilizando recuento por centelleo o detección de la imagen por rayos x. El marcador puede ser también una enzima tal como la fosfatasa alcalina, la \beta-galactosidasa, la luciferasa y la peroxidasa del rábano picante. La cantidad de enzima se determina midiendo la acción de la enzima en un sustrato fluorógeno, cromógeno o quimioluminógeno.
Otro aspecto de la invención comprende un procedimiento de detección de un ácido nucleico diana detectando un ácido nucleico amplificado marcado que es complementario con la diana, siendo el procedimiento una alternativa más sencilla que la transferencia Southern y la transferencia northern tradicionales. La preparación del ácido nucleico complementario amplificado marcado se realiza mediante ligadura de múltiples oligómeros cortos marcados en una sonda/cebador que se hibrida con la diana. La amplificación es seguida de la separación electroforética desnaturalizante y de la detección de las especies marcadas. La presencia del cebador amplificado marcado es indicadora de la presencia de la diana ya que la ligadura solamente tiene lugar cuando se hibrida el cebador con la diana. Es preferible que el marcador sea detectable en el gel. Los marcadores adecuados incluyen los alquenos de acridano descritos en el documento WO-A-9966328 los cuales se pueden detectar por quimioluminiscencia y los fluorescentes que son fácilmente detectables en geles. En esta forma de realización no se realiza transferencia. Si el marcador es tal que la detección en el gen no es viable, entonces se realiza la transferencia en la membrana y luego se realiza la detección del marcador en la membrana. En ningún caso es necesaria la hibridación en la membrana, la fijación al anticuerpo, la fijación enzima-conjugado, la adición al sustrato u otros procedimientos normalmente utilizados.
En una forma de realización alternativa de este procedimiento, el ácido nucleico complementario amplificado marcado permanece hibridado con la diana y después de la electroforesis, se detecta la banda en el peso molecular apropiado de la manera descrita anteriormente. Este modo puede ser deseable cuando se necesite una información de peso molecular exacta. En este procedimiento es más conveniente proporcionar de manera sustancial el banco completo de los 5'-fosfatos de oligómero posibles de n bases cuando la diana sea mucho mayor que la sonda/cebador. En los casos en los que la secuencia de la diana sea conocida y en los que su longitud lo haga más práctico, puede ser preferible preseleccionar el subconjunto de 5'-fosfatos de oligonucleótido.
Todavía otra forma de realización comprende proporcionar un donante fluorescente adecuado como marcador en una sonda/cebador y un aceptor fluorescente adecuado como marcador en los oligómeros. No es necesario marcar cada oligómero. La ligadura se realiza en el cebador hibridado para formar un cebador amplificado que lleva un donante fluorescente y uno o más marcadores fluorescentes del aceptor. En condiciones adecuadas, es decir cuando el donante y el aceptor posean suficiente solapamiento espectral para transferir energía que sea viable y la separación espacial entre el donante y los aceptores estén a la distancia de Förster, la transferencia de energía entre los fluorescentes puede producirse en el cebador amplificado. La irradiación del cebador amplificado a una longitud de onda absorbida por el donante fluorescente en el cebador produce fluorescencia del aceptor en la parte amplificada. Este procedimiento puede servir por consiguiente como base para un análisis homogéneo para detectar un ácido nucleico diana ya que se requiere la presencia de la diana para permitir que se produzca la ligadura y llevando de este modo los fluoróforos a la distancia de transferencia de la energía.
Otro procedimiento para la detección de un ácido nucleico diana basado en la ligadura de múltiples oligómeros marcados comprende la utilización de un colorante de intercalado fluorescente como marcador. Es sabido que determinados colorantes se vuelven fluorescentes cuando se intercalan en ácidos nucleicos de doble hélice o de doble cadena. Un ejemplo es el compuesto de bromuro de etidio extensamente utilizado.
Como etapa opcional, se puede añadir agarosa a la reacción para aumentar la fluorescencia. En ausencia de diana, no se produce la ligadura, de este modo la detección de la fluorescencia es una prueba de la presencia de la diana y además es una prueba de que el cebador fue lo suficientemente complementario con la diana para hibridarse. La colección de oligómeros puede ser el banco completo de todas las secuencias posibles o un subconjunto que contiene los elementos preseleccionados si se conoce la secuencia diana.
La fracción de oligómeros marcados que se debe utilizar se puede seleccionar experimentalmente con respecto al grado deseado de sensibilidad de detección utilizando un intervalo de diferentes densidades de marcador. Puede ser deseable, dependiendo del tamaño de los 5'-fosfatos de oligonucleótido, limitar la fracción de oligómeros marcados para impedir el autoenfriamiento de la fluorescencia.
Síntesis de oligómeros - Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente utilizando procedimientos normalizados de síntesis bien conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, p. ej., la química del fosforamidato. La fosforilación de los oligonucleótidos se realiza utilizando una polinucleótido cinasa y ATP o por procedimientos químicos de fosforilación descritos en (L.A. Slotin, Synthesis, 737-752 (1977); T. Horn, M. Urdea, Tetrahedon Lett., 27, 4705-4708 (1986)). Está disponible en el comercio un kit para realizar la 5'-fosforilación (Phosphate-ON, Clontech, Palo Alto, CA).
Los procedimientos de síntesis automática de oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica y en la utilización comercial habitual. Un procedimiento habitual utiliza un soporte sólido de inmovilización y la manipulación de un reactivo automático para añadir nucleótidos sucesivamente. Todas las etapas de adición, bloqueo y desbloqueo se controlan por ordenador. Dichos instrumentos están disponibles en varios suministradores comerciales tales como Applied Biosystems, CA (modelo 392 y 394). Los instrumentos automáticos para transferir reactivos líquidos y muestras se pueden realizar por control por ordenador utilizando los robots de labotario tales como los que están disponibles en el comercio (Perkin-Elmer, modelo 800 Catalyst, Beckman Instruments Biomek). Las técnicas más recientes para la síntesis a alta velocidad o la síntesis de numerosos oligonucleótidos utilizan las técnicas fotolitográficas o la tecnología de chorro de tinta para la administración rápida y precisa de reactivos y reactantes.
Otro aspecto todavía de la invención comprende la hibridación de un cebador de 5'-fosfato de oligonucleótido a una matriz de una cadena simple y, de la forma descrita anteriormente, la ligadura de un banco de oligómeros para amplificar el cebador en ambos extremos para duplicar la cadena de la matriz. El procedimiento es útil en un procedimiento para convertir una matriz de una cadena simple en una de doble cadena con el fin de clonarla. Esto hallaría utilidad en los procedimientos para aislar genes afines o genes familiares.
En un procedimiento a título de ejemplo, se hibrida un oligonucleótido de cebador con una cadena de la matriz en presencia de un banco de todas las combinaciones posibles de pentámeros, una ADN ligasa y un tampón de reacción adecuado. Los pentámeros que son complementarios con la cadena de la matriz y en registro exacto con los terminales 5' y 3' del oligonucleótido del cebador, se hibridan y se ligan posteriormente mediante la acción de la ADN ligasa. La cadena de la matriz se llega a copiar de este modo de forma sustancial y se convierte en una de doble cadena. Este procedimiento se puede utilizar para detectar matrices diana en una mezcla de cadenas de ácido nucleico y preparar ácidos nucleicos de doble cadena para la clonación utilizando vectores y técnicas de clonación conocidas en la técnica.
Ejemplos Ejemplo 1 Procedimiento general
La matriz utilizada en este experimento fue un producto amplificado por PCR (200 bp) de la región 10 del exón del gen regulador de la transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). El ADN amplificado por PCR del gen CFTR se purificó pasándolo a través de una columna (Qiaquick PCR purification kit, Qiagen, Santa Clarita, CA) o por precipitación con etanol. Se volvió a poner en suspensión el ADN en agua destilada a una concentración de aproximadamente 0,5 \mug/\muL. Se obtuvieron en el comercio (Oligos Etc., Wilsonville, OR) pentámeros que llevan un grupo 5'-fosfato y cebadores.
Se diseñaron el cebador y los pentámeros que deben ser complementarios con la cadena transcrita o la complementaria de la matriz utilizada. La longitud del cebador utilizado en estos experimentos oscilaba entre 21 y 26 nucleótidos. Se diseñaron pentámeros de tal modo que el primer pentámero se hibrida con la matriz inmediatamente adyacente al terminal 3' del cebador. Los cebadores posteriores se alinean al lado del comienzo del terminal 3' en el primer pentámero. La hibridación del cebador y de los pentámeros con la matriz tras la ligadura por la ADN ligasa T4 produce la ligadura dorso con dorso en las uniones 5'-3'. Para permitir la detección de los productos cebador-pentámero ligados, se utilizaron los pentámeros marcados con biotina-dUTP (en la posición interna dTTP).
La hibridación del cebador y de los pentámeros con la matriz y su ligadura entre sí se realizó en un proceso en 3 etapas. En primer lugar, la mezcla matriz-cebador-pentámero se calentó a 94ºC y se mantuvo durante 5 minutos para permitir la desnaturalización de la matriz de doble cadena. Se enfrió la mezcla a 60ºC o 65ºC, dependiendo del tamaño y de la composición de la base del cebador, para hibridar el cebador a la matriz durante 2 min. Por último, se enfriaron los tubos de reacción a 16ºC. Después de aproximadamente 2 min a 16ºC, se añadieron tampón de ligadura (Tris HCl 66 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 6,6 mM, DTT 10 mM, ATP 66 \muM, Amersham) y ADN ligasa T4, 1 U (Amersham, dilución 1:10) y se ligaron a 16ºC durante 2 horas. La reacción de ligadura se interrumpió añadiendo 1/10 de volumen del colorante de carga (xileno cianol al 0,01% y azul de bromofenol al 0,01% y EDTA 0,1 M en formamida desionizada).
Se realizó la electroforesis de las reacciones de ligadura en un gel de poliacrilamida desnaturalizado junto con marcadores de tamaño de oligonucleótido marcados con biotina. El ADN se transfirió por capilaridad a una membrana de nilón, unida a un conjugado anticuerpo-HRP con anti-biotina y se detectó mediante reacción con Lumigen PS-3 (un sustrato quimioluminiscente de HRP) y exponiéndole a una película de rayos-x. El tamaño del producto ligado varía en función del número de pentámeros ligados al cebador.
Ejemplo 2 Determinación de las concentraciones óptimas de matriz, cebador y pentámeros
Matriz: El producto de exón 10 de CFTR por PCR de 200 bp (véase la fijación para la secuencia del ADN de la matriz) se obtuvo por amplificación por PCR utilizando una serie de cebadores con cadena transcrita (5' ACTTCACTTCTAATGATGATTATG 3') (SEC. ID nº: 1) y con cadena complementaria (5' CTCTTCTAGTTGGCATGCTTTGAT 3') (SEC. ID nº: 2).
Un oligonucleótido de 26 bases complementario con la cadena transcrita del ADN de la matriz se diseñó como cebador (5' AGTGGAAGAATTTCATTCTGTTCTCA 3') (SEC. ID nº: 3).
Pentámeros: Se prepararon seis 5'-fosfatos de oligonucleótido largos de 5 bases complementarios con la cadena transcrita inmediatamente adyacente al terminal 3' del cebador. El terminal 5' del primer pentámero se alinea inmediatamente a continuación del terminal 3' del cebador, el terminal 5' del segundo pentámero se alinea inmediatamente después del terminal 3' del primer pentámero y así sucesivamente. Para facilitar la ligadura, se fosforiló el terminal 5' de cada pentámero. Para permitir la detección de los productos de la ligadura, se marcaron los pentámeros 1 y 3 con biotina-dUTP en la posición central de dTTP y se marcó el último pentámero con biotina en el terminal 3'. Los pentámeros fueron los siguientes:
Pentámero 1: 5' PO_{4}- GTTTT 3'
Pentámero 2: 5' PO_{4}-CUU*GG 3' U* = U-Biotina
Pentámero 3: 5' PO_{4}-ATTAT 3'
Pentámero 4: 5' PO_{4}-GCCU*G 3'
Pentámero 5: 5 PO_{4}-GCACC 3'
Pentámero 6: 5' PO_{4}-ATTAA 3'-Biotina
Se realizaron las ligaduras utilizando ADN ligasa T4 y tampón de ligadura (Amersham), según las condiciones de ligadura descritas en el Ejemplo 1. Se realizaron las ligaduras en un volumen de 20 \mul. Se mantuvo constante la cantidad de matriz en aproximadamente 1 \mug por reacción. Se varió la cantidad de cebador de 100 ng a 1 pg entre las reacciones. La cantidad de cada pentámero se varió desde 2 ng a 0,2 pg en cada reacción. La reacción con 1 \mug de matriz, 100 ng de cebador y 2 ng de cada pentámero contenía concentraciones aproximadamente equimolares de la matriz, cebador y pentámeros. El cebador y los pentámeros se variaron sistemáticamente para determinar la cantidad más baja de producto de ligadura detectable.
Se realizó la electroforesis de las reacciones de ligadura, se transfirió por capilaridad a una membrana de nilón se unió con un conjugado anticuerpo-HRP con anti-biotina y se detectó con Lumigen PS-3 tal como se describe en el Ejemplo 1. Se detectó un producto de ligadura cebador-pentámero completo del tamaño esperado (56 bp) en la reacción de ligadura que contiene 100 ng de cebador y 20 ng de cada pentámero (0,6 \muM). Las concentraciones más bajas del cebador y de los pentámeros en la reacción de ligadura dieron muy poca cantidad de producto de ligadura detectable en estas condiciones.
Ejemplo 3 Ligaduras con número variable de pentámeros
Para demostrar que los pentámeros están ligados sucesivamente al cebador que comienza en el primer pentámero (corriente arriba inmediatamente del cebador), se realizaron las ligaduras utilizando la matriz, el cebador y los pentámeros del Ejemplo 2 incrementando el número de pentámeros en cada reacción. Todas las reacciones contenían concentraciones equimolares (0,6 \muM) de la matriz, del cebador y de cada pentámero. Se realizaron las ligaduras tal como se describió anteriormente y se detectaron los productos uniéndolos con anticuerpo de anti-biotina-HRP y haciéndolos reaccionar con sustrato PS-3 de Lumigen.
Como es de esperar, el tamaño del producto de ligadura aumentó en incrementos de cinco bases con la adición de cada pentámero empezando en el primer pentámero y así sucesivamente. No hubo producto de ligadura en ausencia del primer pentámero y con el resto de los pentámeros en la reacción, lo que demuestra el requisito del cebador y la especificidad de los pentámeros para que se produzca la ligadura. En una reacción de ligadura que contiene el primero de los cuatro pentámeros, existieron dos bandas del producto ligado una que era del tamaño esperado y la otra que era del tamaño esperado cuando los cinco pentámeros están presentes en la reacción. Comparando las secuencias de los pentámeros se puso de manifiesto una única diferencia de bases entre el tercero y quinto pentámeros. El tercer pentámero parece que se hibrida en la posición del quinto pentámero cuando el cuarto pentámero está presente en la reacción.
Reacción Pentámeros utilizados Longitud del producto
1 2, 3, 4, 5, 6 26 (cebador)
2 1, 2 36
3 1, 2, 3 41
4 1, 2, 3, 4 46
5 1, 2, 3, 4, 5 51, 56
6 1, 2, 3, 4, 5, 6 56
En la reacción 1 se detectó, el producto, que estaba constituido por el cebador solo, en virtud de un marcador en el cebador.
Ejemplo 4 Competencia de la serie de pentámeros "fuera de registro"
Este ejemplo demuestra que la ligadura de una serie de pentámeros a un cebador en una cadena contigua que comienza en el terminal 3' del cebador no está afectada por la presencia de una segunda serie de pentámeros que son también complementarios con la matriz y también se alinean de manera contigua, pero comienzan en una posición "una base fuera" del terminal 3' del cebador. Tanto las series de pentámeros correctas (1 a 8) como las series de una base fuera del pentámero (1a a 5a) se incluyeron en la reacción junto con la matriz y el cebador durante las etapas de desnaturalización, hibridación a 60ºC y ligadura. Las reacciones de ligadura contenían concentraciones (0,6 \muM) equimolares de la matriz, el cebador y de cada uno de los pentámeros.
Cebador (5' ATTAAGCACAGTGGAAGAATTTCAT 3') (SEC. ID nº: 4).
Pentámero 1: 5' PO_{4}-TCU*GT 3' Pentámero 1a: 5' PO_{4}-CTGTT 3'
Pentámero 2: 5' PO_{4}-TCTCA 3' Pentámero 2a: 5' PO_{4}-CTCAG 3'
Pentámero 3: 5' PO_{4}-GTTTU* 3' Pentámero 3a: 5' PO_{4}-TTTTC 3'
Pentámero 4: 5' PO_{4}-CCU*GG 3' Pentámero 4a: 5' PO_{4}-CTGGA 3'
Pentámero 5: 5' PO_{4}-ATTAT 3' Pentámero 5a: 5' PO_{4}-TTATG 3'
Pentámero 6: 5' PO_{4}-GCCU*G 3' Pentámero 6a: 5' PO_{4}-CCTGG 3'
Pentámero 7: 5' PO_{4}-GCACC 3'
Pentámero 8: 5' PO_{4}-ATTAA 3'-biotina
La región diana de la matriz comprende la secuencia: 3' TAA TTC GTG TCA CCT TCT TAA AGT AAG ACA AGA GTC AAA AGG ACC TAA TAC GGA CCG TGG TAA TT 5' (SEC. ID nº: 5).
Reacción Pentámeros utilizados Longitud del producto
1 1, 1a-6a 31 (cebador + 5)
2 1, 2, 1a-6a 36
3 1-3, 1a-6a 41
4 1-4, 1a-6a 46
5 1-5, 1a-6a 51
6 1-6, 1a-6a 56
(Continuación)
Reacción Pentámeros utilizados Longitud del producto
7 1-7, 1a-6a 61
8 1-8, 1a-6a 66
9 2-8, 1a 26 (cebador)
10 1-8, 1a-6a (sin cebador) ninguna
Aún en presencia de una serie de seis pentámeros competitivos, los productos de la ligadura formados fueron el resultado de la ligadura de los pentámeros "correctos" que se ligaron con el cebador. La reacción 10 confirmó que se necesita la presencia de cebador para que se produzca la ligadura. Los pentámeros con una base fuera no parecieron interferir con la ligadura de los pentámeros correctos.
Ejemplo 5 Competencia del pentámero marcado "fuera de registro"
El experimento fue como en el Ejemplo 4 pero el pentámero 1a estaba biotinilado. Esto proporcionó la oportunidad de observar directamente la formación de algunos productos de ligadura de la serie de pentámeros 1a a 6a. No se observaron productos de ligadura de la serie de pentámeros con una base fuera.
Ejemplo 6 Experimentos de ligadura utilizando la matriz JH corriente abajo
Se obtuvieron asimismo productos de ligadura del pentámero dirigidos por el cebador utilizando como matriz un ADN de 700 bp corriente abajo de la región de unión (JH) de la cadena pesada de inmunoglobulina clonada en un vector del plásmido. Se amplificó por PCR la región corriente abajo de JH, se clonó en un vector del plásmido que se digirió a continuación con Eco Ri para obtener una cantidad suficiente del ADN de la matriz. Se separó el digesto de restricción en gel de agarosa y se extrajo la banda de ADN en cuestión utilizando un kit de extracción de gel (Qiagen). Se volvió a poner en suspensión el ADN en agua destilada a una concentración de aproximadamente 0,5 \mug/\mul.
A continuación se muestran el cebador y los pentámeros utilizados con esta matriz:
21mero cebador: 5' GAAACCAGCTTCAAGGCACTG 3' (SEC. ID nº: 6)
Pentámero 1: 5' fosfato AGGU*C
Pentámero 2: 5' fosfato CU*GGA 3'
Pentámero 3: 5' fosfato GCCU*C 3'
Pentámero 4: 5' fosfato CCU*AA 3'
Pentámero 5: 5' fosfato GCCCC 3'-biotina
Se realizaron las ligaduras con 500 ng de matriz, 100 ng de cebador y 20 ng de cada pentámero en cada 20 \muL de reacción de ligadura. El número de pentámeros se aumentó de manera incremental en cada reacción de ligadura sucesiva para demostrar que el tamaño del producto de ligadura crecía en incrementos de 5 bases en cada adición de pentámero.
Después de realizar las reacciones de ligadura según el procedimiento general del Ejemplo 1, existía un aumento en incrementos de 5 bases del tamaño del producto de ligadura en cada adición de los sucesivos pentámeros. Existían dos bandas en la reacción de ligadura que contiene los primeros cuatro pentámeros, siendo la banda superior más intensa que la banda inferior. El tamaño de la banda superior fue el mismo que cuando se utilizaron los cinco pentámeros para la ligadura. Esto se debe probablemente a que existe similitud de secuencia entre el tercer y quinto pentámeros, por eso el tercer pentámero se ligó también en la posición del quinto pentámero.
Ejemplo 7 Ligadura a varias temperaturas
Se realizaron las ligaduras a 30ºC, 37ºC, 40ºC y 45ºC utilizando la matriz, el cebador y el primero de los cuatro pentámeros del Ejemplo 6 para examinar el efecto de la temperatura de ligadura para hacer incompatible la discriminación. Las concentraciones de la matriz, del cebador y del pentámero fueron las mismas que en el experimento anterior. Se realizaron reacciones en paralelo y se evaluó la cantidad relativa de los productos de amplificación de cuatro pentámeros y de cinco pentámeros. A la temperatura de ligadura de 30ºC el tamaño correcto y los productos de ligadura no específicos eran de la misma intensidad. Se detectó más producto con ligadura de tamaño correcto a las temperaturas de ligadura de 37ºC y 40ºC. A 45ºC disminuyó la cantidad de producto con ligadura de tamaño correcto detectado.
Ejemplo 8 Ligadura utilizando octámeros
Se realizaron ligaduras de octámeros con 5' fosfato y un marcador de biotina interno en un cebador de 23 elementos específico para la matriz del plásmido pUC18 utilizando ADN ligasa T4 (Amersham), ADN ligasa Taq (New England Biolabs) y Ampligase^{TM} (Epicenter Technologies, Madison, WI), una ligasa termoestable dependiente de NAD, utilizando cada una sus respectivos tampones de ligadura. En estos experimentos se utilizaron 100 a 800 mg de la matriz del plásmido linealizado EcoRI. Las concentraciones del cebador y de los octámeros fueron de 12 pmoles por reacción.
En los experimentos con ADN ligasa T4 y ADN ligasa Taq, se calentó en primer lugar la mezcla de la matriz, el cebador y el pentámero a 94ºC durante 5 min, se enfrió a 60ºC durante 2 min para hibridar el cebador con la matriz y se redujo más hasta 16ºC (para ADN ligasa T4) o 45ºC (para ADN ligasa Taq) durante 2 min. A continuación se añadieron los tampones y enzimas de ligadura respectivos (1 U/reacción) y se ligaron durante 2 h.
Para la ligadura con Ampligase, la mezcla de ligadura que contiene la matriz, el cebador y los octámeros (los mismos que anteriormente) se calentó a 94ºC durante 5 min, a continuación se utilizaron para la ligadura temperaturas de ciclación de 94ºC durante 5 min y 45ºC durante 5 min (35 ciclos). En otro experimento utilizando la Ampligase, se utilizó como matriz un producto corto de PCR de pUC18 (100 bp) y las condiciones de ligadura fueron de 94ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min y 15ºC durante 5 min para un total de 20 ciclos.
Se realizó la electroforesis de los productos de ligadura en un gel de urea-PAGE al 8%, se hizo la transferencia en semiseco (transferidor Hoefer TE90) sobre una membrana de nilón cargada positivamente, se reticuló en UV, se incubó con un anticuerpo anti-biotina conjugado con HRP y se identificó con sustrato PS-3 de Lumigen.
Se identificó un producto de ligadura del tamaño esperado con una ADN ligasa T4 y Ampligase utilizando el plásmido pUC18 linealizado. Sin embargo, en las condiciones utilizadas, Ampligase parecía que era mucho menos eficiente que ADN ligasa T4 como se demostró a partir de las cantidades detectadas de producto de ligadura. La reacción de ADN ligasa Taq no dio un producto de ligadura detectable. Utilizando el producto de pCR corto de pUC18, la ligadura de Ampligase produjo más producto de ligadura que utilizando el pUC18 completo.
Ejemplo 9 Ligadura bidireccional
En este experimento, se ligó un cebador 5'-fosforilado a ambos extremos de una serie de pentámeros con 5'-fosfato utilizando ADN ligasa T4. Se calentó a 94ºC durante 5 min una mezcla de la matriz del producto CFTR por ECR, del cebador y de pentámero, se hibridó el cebador a 65ºC durante 5 min y se ligaron los pentámeros a 16ºC durante 2 h. Se añadieron el tampón de ligadura y la enzima después que la mezcla de reacción estaba a 16ºC durante 2 min. Se realizó la electroforesis de la mezcla de reacción, se hizo la transferencia y se detectó como en el Ejemplo 8. Se ligaron los pentámeros al cebador en ambas direcciones 5' y 3' del cebador. Las bandas de producto del tamaño observado únicamente pudrían producirse por ligadura de cada uno de los pentámeros de la serie. Las señales de los productos de ligadura resultantes de la ligadura de los pentámeros en el terminal 5' del cebador fueron menos intensas que las de los ligados en el terminal 3' del cebador. Esto podría ser debido a diferencias en la eficacia de la ligadura en las dos direcciones o en el marcado con biotina de las series de dos pentámeros.
Ejemplo 10 Ligadura isotérmica a varias temperaturas
Se realizó la ligadura de una serie de octámeros 5-fosforilados en un cebador unido a la matriz a temperatura constante sin calentar previamente y la rehibridación del cebador con la matriz. Todos los componentes de la reacción de ligadura, la matriz, el cebador, los octámeros, el tampón de ligadura y la ligasa, se añadieron a temperatura ambiente y se ligaron a 25ºC, 30ºC, 37ºC o 45ºC durante 2 h. Para las ligaduras se utilizó como matriz pUC18 linealizado (EcoRI) a concentraciones que oscilan entre 10 ng y 800 ng utilizando ADN ligasa T4. Las concentraciones del cebador y del octámeros utilizadas fueron de 12 pmoles en cada reacción.
Se realizaron también ligaduras isotérmicas (37ºC, 45ºC, 55ºC, 65ºC) con ADN ligasa Taq, Ampligase y ADN ligasa de Pfu utilizando sus respectivos tampones de ligadura. Con ADN ligasa T4, el producto de ligadura fue detectable en todas las condiciones isotérmicas utilizadas. A 37ºC, una cantidad tan baja como 10 ng de la matriz produjo un producto de ligadura detectable. Cantidades mayores de matriz dieron productos de ligadura con señal intensa.
Ninguna de las demás ligasas produjo ningún producto de ligadura detectable en condiciones isotérmicas.
<110> Akhava-Tafti Hashem
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<120> PROCEDIMIENTOS DE SÍNTESIS DE POLINUCLEÓTIDOS MEDIANTE LIGADURA DE OLIGÓMEROS MÚLTIPLES
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> LUM-4.1-53
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> 09/121.887
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<141> 24.07.1998
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<160> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> cebador
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
acttcacttc taatgatgat tatg 
\hfill
24 
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<210> 2
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> cebador
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctcttctagt tggcatgctt tgat 
\hfill
24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> cebador
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
agtggaagaa tttcattcatg ttctca 
\hfill
26 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 25
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<212> ADN
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<213> cebador
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
attaagcaca gtggaagaat ttcat 
\hfill
25 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 65
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<212> ADN
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<213> matriz de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
ttaatggtgc caggcataat ccaggaaaac tgagaacaga atgaaattct tccactgtgc 
\hfill
60 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttaat 
\hfill
65 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskip
gaaaccagct tcaaggcact g 
\hfill
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attcagtgcc atgggacata g 
\hfill
21

Claims (61)

1. Procedimiento para sintetizar una cadena de un ácido nucleico complementario en por lo menos una parte de una matriz diana de ácido nucleico de cadena simple, que comprende:
a)
proporcionar una mezcla de reacción que comprende la matriz, un cebador que tiene por lo menos 15 bases que es complementario con una parte de la matriz del ácido nucleico de una cadena simple diana y una pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido que tiene cada uno no más de 10 bases;
b)
hibridar el cebador con la matriz en condiciones tales que permitan la hibridación estable del cebador pero no la hibridación estable de los 5 monofosfatos de oligonucleótido para formar un híbrido cebador-matriz que tiene una región de cadena simple y una región de doble cadena; y
c)
ligar al híbrido cebador-matriz en la secuencia por lo menos alguna de una pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido de manera contigua sobre el cebador en un proceso continuo en condiciones tales que permitan la hibridación estable del cebador pero no la hibridación estable de los 5'-monofosfatos de oligonucleótido para amplificar la región de doble cadena y sintetizar de este modo una cadena de ácido nucleico que sea complementaria con la parte de la matriz, en la que la ligadura de los 5'-monofosfatos de oligonucleótido se produce solamente en presencia de cebador hibridado.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se amplía la cantidad de una parte de un ácido nucleico de doble cadena que tiene una primera cadena y una segunda cadena, cuyo procedimiento comprende:
a)
proporcionar en una mezcla de reacción al ácido nucleico de doble cadena un primer cebador que tiene por lo menos 15 bases que es complementario con una región de la primera cadena, un segundo cebador que tiene por lo menos 15 bases que es complementario con una región de la segunda cadena en el que la primera y segunda regiones definen la parte del ácido nucleico de doble cadena que se debe amplificar y una pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido que constan cada uno de más de 10 bases;
b)
separar la primera y la segunda cadenas del ácido nucleico de doble cadena;
c)
hibridar el primer y el segundo cebadores con las cadenas separadas; en condiciones tales que permitan la hibridación estable de los cebadores pero no la hibridación estable de los 5'-monofosfatos de oligonucleótido;
d)
ligar a cada uno del primero y del segundo cebadores hibridados por lo menos alguno de la pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido de manera contigua en un proceso continuo en condiciones tales que permitan la hibridación estable de los cebadores pero no la hibridación estable de los 5'-monofosfatos de oligonucleótido, para amplificar el primer y segundo cebadores, en el que la ligadura solamente se produce en presencia de los cebadores hibridados, produciendo de este modo ácido nucleico de doble cadena; y
e)
repetir las etapas b a d para aumentar la cantidad de la parte de ácido nucleico de doble cadena.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la ligadura se realiza por medio de una enzima ligasa.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la ligadura se realiza mediante la ADN ligasa T4.
5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que la ligadura se realiza mediante una enzima ligasa que es termoestable.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada uno de los 5'-monofosfatos de oligonucleótido contienen el mismo número de bases y el número de bases es de 2 a 6.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el número de bases es 5.
8. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que cada uno de los 5'-monofosfatos de oligonucleótido contienen el mismo número de bases y una pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido es una serie de 5'-monofosfatos de oligonucleótido preseleccionada para contener únicamente los oligómeros necesarios para replicar la cadena.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la secuencia del ácido nucleico sintetizado se conoce de antemano.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que cada uno de los 5'-monofosfatos de oligonucleótido contienen el mismo número de bases y la pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido es un banco de 5'-monofosfatos de oligonucleótido que comprende por lo menos el 50% de todos los 5'-monofosfatos de oligonucleótido posibles de la misma longitud que contienen A, C, G, y T.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la síntesis de la cadena de ácido nucleico es unidireccional y se realiza por ligadura del terminal 3' del cebador.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la síntesis de la cadena de ácido nucleico es unidireccional y se realiza por ligadura del terminal 5' del cebador.
13. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el cebador o por lo menos uno de los cebadores contiene un grupo 5'-fosfato y la síntesis de la cadena o de cada cadena de ácido nucleico es bidireccional.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cebador está inmovilizado en una fase sólida.
15. Procedimiento según la reivindicación 14 en el que, después de la etapa c) se separan los oligonucleótidos que no están ligados y se desnaturaliza el producto que presenta una región con doble cadena para separar la matriz y producir un producto de ácido nucleico de una cadena simple inmovilizado.
16. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cebador está en solución.
17. Procedimiento según las reivindicaciones 1, 14, 15 ó 16, en el que por lo menos alguno de los 5'-monofosfatos de oligonucleótido comprenden un marcador detectable.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que todos los 5'-monofosfatos de oligonucleótido están marcados.
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que cada uno de la pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido contiene 5 bases.
20. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que cada uno de la pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido presentan idéntica longitud.
21. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que algunos de la pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido contienen un número de bases diferente de otra pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido.
22. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la ligadura se realiza mediante una enzima ligasa.
23. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la enzima ligasa se selecciona de entre ligasa T4, ligasa T7, ligasa Tth, ligasa Taq y ADN ligasa de E. coli.
24. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la enzima ligasa es la ADN ligasa T4.
25. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que cada 5'-monofosfato de oligonucleótido marcado está marcado con el mismo marcador.
26. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que cada 5'-monofosfato de oligonucleótido marcado está marcado con un marcador específico del 5'-monofosfato de oligonucleótido.
27. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que cada 5'-monofosfato de oligonucleótido contiene 1 marcador.
28. Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, en el que el marcador detectable se selecciona de entre radioisótopos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores fluorescentes, marcadores colorimétricos, enzimas, proteínas de fijación, antígenos, anticuerpos y haptenos.
29. Procedimiento según la reivindicación 18, en el cada marcador es un oligonucleótido.
30. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que el marcador detectable se escinde de la cadena de ácido nucleico complementaria sintetizada antes de la detección.
31. Procedimiento según la reivindicación 30, en el que la detección de los marcadores escindidos se realiza determinando la masa molecular de los marcadores escindidos.
32. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 18, que comprende además la incorporación de por lo menos un oligómero no amplificable, que termina la síntesis de la cadena de ácido nucleico.
33. Procedimiento según la reivindicación 32, en el que cada uno de los oligómeros no amplificables se selecciona de entre los oligómeros que tienen una base didesoxi en el terminal 3', los oligómeros que tienen un grupo 3'-OH bloqueado en el terminal 3' y los oligómeros que carecen de un grupo fosfato en el terminal 5'.
34. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la síntesis de la cadena de ácido nucleico sintetizada en la etapa d) se termina en una posición predeterminada excluyendo, de entre la pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido por lo menos un 5'-monofosfato de oligonucleótido que es complementario con la matriz de ácido nucleico de una cadena simple y que posee una secuencia necesaria para prolongar la región de doble cadena.
35. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la síntesis de la cadena de ácido nucleico es unidireccional y se realiza por ligadura del terminal 3' del cebador.
36. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que el cebador contiene un grupo 5'-fosfato y la síntesis de la cadena de ácido nucleico es unidireccional y se realiza por ligadura al terminal 5' del cebador.
37. Procedimiento según al reivindicación 18, en el que el cebador contiene un grupo 5'-fosfato y la síntesis de la cadena de ácido nucleico se realiza en ambos terminales del cebador.
38. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 14, 15 ó 16, en el que la matriz diana de ácido nucleico de una cadena simple es un analito, por lo menos alguno de los 5'-monofosfatos de oligonucleótido están marcados y en el que, después de la etapa c) se separan todos los oligonucleótidos no ligados y se detecta el ácido nucleico marcado de la etapa c.
39. Procedimiento según la reivindicación 18 ó 38, en el que la matriz de ácido nucleico de una cadena simple presenta un segmento con la secuencia conocida, en el que el cebador es complementario con una parte del segmento de secuencia conocida y la pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido marcados comprenden una serie de 5'-monofosfatos de oligonucleótido marcados seleccionados para ser complementarios con una parte de un segmento de secuencia conocida de la matriz adyacente al cebador.
40. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que cada uno de la pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido contiene 5 bases.
41. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que cada uno de la pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido presentan idéntica longitud.
42. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que algunos de la pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido contienen un número de bases diferente de otra pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótido.
43. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que la ligadura se realiza mediante una enzima ligasa.
44. Procedimiento según la reivindicación 43, en el que la enzima ligasa se selecciona de entre ligasa T4, ligasa T7, ligasa Tth, ligasa Taq y ADN ligasa de E. coli.
45. Procedimiento según la reivindicación 43, en el que la enzima ligasa es la ADN ligasa T4.
46. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que cada 5'-monofosfato de oligonucleótido marcado está marcado con el mismo marcador.
47. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que cada 5'-monofosfato de oligonucleótido marcado está marcado con un marcador específico del 5'-monofosfato de oligonucleótido.
48. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que cada 5'-monofosfato de oligonucleótido contiene 1 marcador.
49. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que el marcador se selecciona de entre radioisótopos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores fluorescentes, marcadores colorimétricos y enzimas.
50. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que el marcador se selecciona de entre proteínas de fijación, antígenos, anticuerpos, haptenos y oligonucleótidos.
51. Procedimiento según la reivindicación 50, en el que por lo menos un marcador se une a un multímero de amplificación ramificado que está marcado de forma detectable, en el que el analito se detecta al detectar los marcadores en los multímeros de la amplificación unidos.
52. Procedimiento según la reivindicación 38, que comprende además:
a)
unir los marcadores con un conjugado de una enzima y una sustancia con afinidad de unión específica a los marcadores; y
b)
hacer reaccionar los conjugados de la enzima unidos con un sustrato para que la enzima produzca un producto de reacción detectable.
53. Procedimiento según la reivindicación 50, en el que la reacción de la enzima con el sustrato produce quimioluminiscencia como producto detectable.
54. Procedimiento según la reivindicación 38, en el que el marcador es un colorante de intercalado fluorescente y en el que la fluorescencia del marcador intercalado unido se detecta en la etapa de detección.
55. Procedimiento según la reivindicación 2, para la síntesis de un ácido nucleico de doble cadena marcado en el que ambas cadenas están marcadas y en el que la pluralidad de 5'-monofosfatos de oligonucleótidos están marcados.
56. Procedimiento según la reivindicación 1, para distinguir entre diferentes secuencias de ácido nucleico en una muestra, en el que
la muestra comprende por lo menos una parte de una matriz diana de ácido nucleico de una cadena simple;
la mezcla de reacción contiene un cebador que es complementario con una parte de cada una de las secuencias de ácido nucleico diferentes y para cada secuencia que se debe distinguir, y una serie de 5'-monofosfatos de oligonucleótidos complementarios de la secuencia en la que por lo menos uno de los 5'-monofosfatos de oligonucleótido en cada serie está marcado con un único marcador en cada serie;
el producto de la etapa (c) es una cadena de ácido nucleico complementaria marcada que contiene un marcador que es específico para esta secuencia y la identifica; y
el procedimiento comprende además las etapas adicionales siguientes:
d)
eliminar todos los 5'-monofosfatos de oligonucleótido no ligados; y
e)
detectar el producto de ácido nucleico marcado de la etapa (c) como indicador de la presencia de los ácidos nucleicos diferentes en la muestra, distinguiendo de este modo entre los ácidos nucleicos diferentes en la muestra.
57. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que una de las diferentes secuencias de ácido nucleico representa una secuencia normal y las demás secuencias contiene cada una mutación diferente.
58. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que cada secuencia de ácido nucleico diferente contiene una mutación diferente.
59. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que las diferentes secuencias representan diferentes genotipos.
60. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que la detección de productos de ácido nucleico marcados permite la diferenciación de un heterozigoto y el primer y el segundo homozigotos para una enfermedad genética.
61. Procedimiento según la reivindicación 56, en el que los ácidos nucleicos en la muestra, si están presentes en forma de doble cadena, se separan en cadenas simples antes o mientras se hibrida el cebador.
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