PT92420B

PT92420B - Metodo e combinacao de reagentes para a determinacao de sequencias de nucleotidos

Info

Publication number: PT92420B
Application number: PT92420A
Authority: PT
Inventors: Ann-Christine Elisabeth; Hans Erik Soderlund
Original assignee: Orion Yhtymae Oy
Priority date: 1988-11-29
Filing date: 1989-11-28
Publication date: 1995-08-09
Also published as: DK595389D0; JPH02219600A; GR3019105T3; CA2004056C; ES2082766T3; PT92420A; DK595389A; NO176362C; FI97153C; DE68925717T2; DE68925717D1; IL92474A0; NO894746L; EP0371437A2; ATE134388T1; EP0371437B1; FI895682A0; DK175170B1; CA2004056A1; EP0371437A3

Description

CAMPO TÉCNICO

O presente invento diz respeito a um método e a uma continuação de reagentes para determinação da sequência de nucleótidos numa região polinucleotidica definida e à utilização deste método na identificação de variações genéticas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A informação genética dos organismos vivos é transportada na sequência de nucleótidos do seu genoma. Ν o processo de expressão genética a sequência de nucleótidos é traduzida em sequências de aminoácidos, isto é, proteínas. Pequenas modificações na sequência de nucleótidos, até a substituição de uma única base, podem resultar em produtos proteicos alterados. As qualidades ou quantidades alteradas das proteínas dadas modifica o fenótipo (i.e. as características observáveis) do organismo as da célula o qual, por exemplo, se pode manifestar como desenvolvimento de uma doença. Seria, portanto, de grande importância, se modificações nas sequências de nucleótidos no genoma de organismos vivos podessem ser determinadas com precisão e com uma eficiência talque um grande número de amostras pudessem ser tratados. Isto poderia fornecer oportunidades para o diagnóstico de prediposições ou doenças hereditárias, detecções de mutações somáticas no cancro e selecção de células e estirpes para produção animal e de plantas.

A detecção de modificações na sequência de nucleotidos pode ser realizada de diferentes maneiras. Um método que produz resultados bastante convincentes é a determinação da sequência de nucleotidos na região do genoma que contem o gene de interesse. Se comparado com os métodos de hibridação de ácidos nucleicos, o método de determinação da sequência de nucleotidos torna desnecessário o conhecimento da mutação. Apenas é necessário conhecer a localização da região de interesse e compara esta região numa amostra com a mesma região num padrão normal .

Duas estratégias básicas são usadas na determinação de sequências de nucleotidos. São elas o método químico de Maxam e Gilbert e o método de terminação de cadeia de Sanger. Ambos os métodos estão bem descritos nos livros de texto de bioquímica contemporânea. Em comum estes métodos possuem o facto de requererem quantidades submicrográmicas polinucleotido alvo a ser sequênciado, relativamente puro. Na maior parte dos casos este polinucleotido alvo é cionado, por métodos de engenharia genética, em vectores apropriados pela amplificação bio-l· lógica, com o intuito de obter quantidades suficientes do polímero de ácido nucleico para análise. Recentemente o método da reacção de replicação repetida de acordo com Kleppe et al (J. Mol. Biol. (1971) 56, 341-361 forneceu uma outra via para a amplificação as regiões de polinucleotidos dados in vitro. 0 invento foi mais tarde aplicado por Mullis et al (PE 200 362). Apesar deste método fornecer vantagens substanciais em velocidade e eficácia, sobre os métodos de clonagem, para produzir quantidades adequadas <de DNA, não produz um produto capaz de ser usado directamente em sequênciação. Em vez disso, a região amplificada necessita ser cuihdosamente purificada, por electroforese ou ultrafiltração, da mistura de reacção de amplificação a qual se presente durante o processo de sequênciação seria

-5prejudicial à mesma: Estes processos de purificação tendem a ser morosos, o que é um argumento de peso contra o seu uso em análises de rotina.

SUMARIO DO INVENTO

Nós desenvolvemos agora um método melhorado para a detecção de modificações numa sequência de nucleotidos o qual é bem adaptado para usar como instrumento de diagnostico de rotina. Este método fornece diversas vantagens em relação aos métodos anteriores. Não há necessidade de clonagem do polinucleotido alvo em vectores específicos. O isolamento do polinucleotido alvo amplificado enzimáticamente é simples e não existem passos de purificação laboriosos, tais como electroforese e através de gel e ultrafiltração. Para além disso, as reacções de seguênciação são realizadas em matrizes imobilizadas o que fornece vantagens η o controlo do processo'e possibilidades de automatização e sequênciação simultânea de ambas as cadeias do polinucleotido alvo.

método para detecção de modificações numa sequência de nu leotidcs, desta invenção,é baseado na determinação da sequência de nucle tidos na região de interesse. De acordo com esta invenção, o primeiro passo deste processo envolve a obtenção duma amostra de DNA amplificado na qual pelo menos uma parte ligação foi introduzida em pelo menos uma cadeia do polinucleotido alvo especifico por uma modificação da reacção em cadeia da polimerase. Isto pode ser conseguido misturando uma amostra que contém o polímero de ácido nucleico alvo com uma mistura de monomeros de nucleotidos (dATP, dCTP, dGTP e dTTP),

uma polimerase de DNA e um primeiro e um segundo iniciadores de amplificação. Cada um dos iniciadores de amplificação inclui um oligonucleotido que possui uma região que é complementar e híbrida com uma cadeia diferente (i.e., uma das duas cadeias complementares) do polímero de ácido nucleico alvo que é eficaz como iniciador para a polimerização de DNA pela polimerase de DNA. Pelo menos um sal iniciador de amplificação inclui ainda uma primeira parte de ligação ligada ao oligonucleotido. A mistura de amplificação resultante é tratada repetida e ciclicamente entre uma primeira condição, sob a qual ocorre a polimerização do DNA e uma segunda cordLção, sob a qual ocorre a desnaturação do DNA de cadeia dupla até formar DNA de cadeia simples durante um número de ciclos suficientes para produzir cópias do polímero de ácido nucleico alvo em quantidades apropriadas para usar no processo de sequênciação de DNA de modo a formar uma amostra amplificada que inclui cópias da sequências de ácido nucleico alvo ligada à parte de ligação. Uma terceira condição de incubação, sob a qual ocor re a ligação entre DNA de cadeia simples para formar DNA de cadeia simples, em particular a ligação dos iniciadores de amplificação de cadeia simples à matriz de DNA de cadeia simples, pode ser incorporada com vantagens outros de cada passo de polimerização.

Após a amplificação, as cadeias do polímero de ácido nucleico alvo que possuem uma parte de ligação são adicionadas a uma matriz sólida revestida com um sítio de ligação ao qual se pode ligar a parte de ligação ou uma modificação desta. Deste modo, as cadeias do ácido nucleico alvo ficam ligadas à matriz sólida e podem ser imediatamente reparadas com a matriz sólida dos reagentes que não se ligarem.

As cópias purificadas do polinucleotido alvo são desnaturadas, quQ; antes da imobilização

quer após a separação da matriz sólida, dos reagentes não ligados, e, a sequência do polímero alvo amplificado é determinada. Por exemplo, as reacções de sequênciação de ter minação da cadeia podem ser iniciadas nas cópias desnaturadas do polinucleotido alvo que agora acham como matriz .

Os produtos da reacção de sequênciação sintetizados de novo são então libertados da matriz, separados e detectados pelo seu tamanho.

A presente invenção também abarca uma combinação de reagentes destinados à prática do seu método. A embalagem precisa dependerá das combinações de partes de ligação e sitios de ligação seleccionados, mas um tal conjunto de reagentes incluirá, em geral , um iniciador de amplificaç^Tao contendo uma parte de ligação e um suporte adaptado para imobilização do iniciador de amplificação .

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Fig .

tico da sequência de passos usada é um desenho esquemána invenção e a

A Fig. 2 é um esquema das possíveis regiões de complementaridade entre um ácido nucleico alvo e um iniciador de sequênciação.

-8DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção divulga um método para determinar a sequência de nucleótidos de regiões previamente definidas em misturas de ácido nucleico complexos. Básicamente e de preferência são utilizados dois métodos conhecidos: o grupo de sequênciação de terminação da cadeia de Sanger e a reacção de replicação repetida. O invento também usa o processo de lecolha de híbridos por afinidade descrito no requerimento anterior, U.S. Patent Application Serial N° 024.604, o qual é aqui incluído por referência. A nova combinação destes métodos na presente ivnenção produz um processo fácil e eficaz para a sequênciação de ácidos nucleicos o qual é bem apropriado para a detecção de defeitos genéticos.

De acordo com este invento, uma pequena amostra do ácido nucleico alvo é inirialmente amplificado usando a reacção de replicação repetida na qual um ou ambos os iniciadores de amplificação são modificados de modo a incluir uma parte de ligação, por exemplo, um membro de um par de afinidade. A sequência alvo de interesse é amplificada com um número apropriado de ciclo desta reacção de replicação repetida modificada. De seguida, a amostra deve ser tratada de modo a tornar os ácidos nucleicos de cadeia dupla em ácidos nucleicos de cadeia simples e todos os moléculos modificados com uma dada parte de ligação são ligados a uma matriz sólida convertida com um sítio de ligação complementar isto é o outro componente de um par de afinidade. A matriz é então lavada para remover todo o material não ligado. É também possível unir o DNA amplificando à matriz antes da ofesnaturação. neste caso, a desnaturação dos moléculos de ácido nucleico de cadeia dupla, adsorvido, a moléculos de cadeia ligada será realizada após imobilização (ligação). Esta estratégia também torna possível eluir a cadeia complementar essêncialmente pura mesmo que não tenha sido sintetizada com uma parte de ligação.

Independentemente da etapa em que a desnaturação é feita, o resultado é um suporte sólido no qual o ácido nucleico de cadeia simples é ligado a partir de uma extremidade. Este suporte sólido, de preferência microesferas, é então introduzido nas misturas de reacção do processo de sequênciação de terminação de cadeia uma mistura de reacção para cada nucleotido, A, C, G ou T.

O passo de polimerização é deixado prosseguir nas esferas. As esferas podem ser então lavadas e os produtos da polimerização são eluidos dos mesmos e analisados por electroforese através de gel como descrito em vários protocolos de sequênciação, semi-mansis a automáticos. Numa modificação deste processo a cadeia complementar essêncialmente pura, eludia de cadeia modificada ligada à matriz, é usada como matriz de sequênciação. Se ambos os iniciadores de amplificação fossem modificados com uma parte de ligação diferente e o DNA amplificado resultante por ligaos a diferen tes matrizes separáveis fisicamente, ambos as cadeias podem ser introduzidas na mesma mistura de reacção de sequênciação e as matrizes a qua estão ligadas podem ser separadas uma da outra até imediatamente antes da desnaturação final e da electroforese através de gel. Esta possibilidade de sequênciação de ambas as cadeias simultaneamente com a separação das duas não ocorrendo até imediatamente antes da electroforese, reduz a quantidade de trabalho de sequênciação quase num factor de dois. Os diferentes modos de praticar a presente invenção são agora descritos em detalhe .

a) Modificação de fragmentos de ácido nucleico alvo com partes de ligação

A origem do ácido nucleico alvo a analisar (DNA ou RNA) pelo método deste invento pode ser qualquer célula humana, animal, vegetal, ou micróbio. O ácido nucleico alvo pode ser isolado de amostras biológicas por métodos de purificação de ácidos nucleicos conveni-·· cionais mas, de acordo com o presente ivnento é também possível usar directamente amostras biológicas não purificadas .

Segundo o método deste ivnento são introduzidas partes de lgiação polinucleotido alvo pela reacção de replicação repetida modificada com a ajuda de dois oligonucleótidos iniciadores por regiões a amplificar. Pelo menos um destes iniciadores de amplificação foi modificado com uma parte de ligação. Para os fins deste requerimento e das suas reivindicações, uma parte de afinidade é um componente que possui afinidade para outro componente o qual forma um par de afinidade por ligação preferêncial e selectiva a cutro ©ponente. Por exemplo, biotina/Avidina ou estraplavidina, polinucleotidos complementares, incluindo homopolinucleotidos tais como poli-dA/poli-dT, poli-dG/poli-dC, heptenos/anticorpo e metal/quelante são pares de afinidade. Pares de quaisquer componentes com forte afinidade um para o outro podem funcionar como um par de afinidade. Uma parte de lgiação é uma parte de afinidade ou uma parte que fornece um sítio para a ligação de uma parte de afinidade.

Os iniciadores de oligonucleotidos podem ser sintetizados por métodos quimicos padrão.

Também podem ser usadas técnicas de DNA recombinante da preparação das iniciadores. O tamanho dos inciadores é de pre-11-

ferência de 14 a 40 bases, mas iniciadores de pelo menos 8 bases ou de consideravelmente mais de 40 bases podem também ser usados. Os inicidores são modificados com as partes de ligação usando métodos, enzimáticos ou outras. De preferência, a parte de ligação é unida à extremidade 5' do iniciador. Outros sítios de ligação são também possíveis desde que as propriedades de emparelhamento de bases do iniciador e a sua função de iniciador se mantenha.

Num dos exemplos do método deste invento são usados dois inciadores modificados. Neste caso, os iniciadores com diferentes partes de ligação.

No método do invento, os iniciadores de amplificação, um ou ambos modificados, o ácido nucleico alvo, trifosfatos de mononucleosidos e uma enzima de síntese de DNA, tal como a polimerasa de DNA, são combinados. Ciclos repetidos de desnaturação do alvo, junção dos iniciadores às cadeias alvo e alongamento enzimático dos iniciadores são levados a cabo de acordo com qualquer protocolo da reacção em cadeia da polinérasa durante tantos ciclos quantos os necessários para obter uma quantidade de ácido nucleico suficiente para usar na reacção de sequênciação de DNA a utilizar. Para usar em reacções de sequencição de terminação da cadeia, são obtidos de preferência pelo menos ΙΟ^θ moléculas de DNA.

Còmo resultado do processo, são obtidas cópias do polinucleótido alvo original, modificados agora com partes de ligação, por incorporação dos iniciadores modificados nas moléculas de polinucleótidos sintetizados de novo.

-12Quando apenas um dos iniciadores é modificado, são sintetizados moléculas de polinucleótidos com uma cadeia modificada com uma parte de ligação. O uso de dois iniciadores modificados de modo diferente cada um adaptado a hibridar com uma cadeia diferente de ácido nucleico alvo, produz moléculas de polinucléotidos com uma cadeia modificada com uma parte de ligação e a outra cadeia modificada com uma diferente parte de ligação. Um caso especial é obtido quando um dos iniciadores é modificado com uma parte de ligação de polinucléotido. Neste caso, a outra cadeia fica modificada com a cadeia complementar durante o processo da reacção de replicação repetida, a qual pode servir como parte de ligação para a segunda cadeia. O tamanho e quantidade do DNA alvo modificado produzido apenas são limitados pela capacidade da reacção em cadeia da polimerasa.

b) Isolamento do polinucléotido alvo de cadeia simples

Após a sua síntese, o polinuceótido alvo modificado é capturado numa matriz sólida à qual foi ligado um sítio de ligação. Para os fins deste requerimento e das suas reivindicações, um sítio de ligação é um componente de um par de afinidade o qual é seleccionado de modo a ligar-se preferencial e selectivamente a uma parte de afinidade usada como ou ligada subseguentemente à parte de ligação incorporada no iniciador de aplificação. Quando uma cadeia do polinucléotido alvo é modificada com um par de afinidade, é usada uma matriz sólida e, quando ambas as cadeias são modificadas são usadas duas matrizes sólidas diferentes. De preferência as matrizes são seleccionadas de modo a poderem ser separadas fisicamente uma da outra. Em alternativa, a captura das duas cadeias modificadas diferentemente pode ser efectuada sequencialmente em duas matrizes

-13sólidas diferentes.

A matriz sólida pode ser de qualquer tipo tal como, esferas, micropartícuias, a superfície de um peço de microtitulação ou de tubo de ensaio, uma vareta ou um filtro. O material da matriz pode ser, por exemplo, poliestireno, celulose, latex, nitrocelulose, nilon, poliacrilamida, dextrano ou agarose. 0 único requesito prévio para o material de matriz é que o sítio de ligação se possa ligar a ela. A capacidade de ligação da matriz deve tornar possível a captura de uma quantidade suficiente do polinucéotido alvo modificado bem como do excesso de iniciador presente, o qual também será capturado. Contudo, o uso de uma matriz que possa ser facilmente dividida em partes é preferivel, e.g. um grande número de partículas da matriz de menor capacidade de ligação em oposição a poucas partículas da matriz com muito grande capacidade.

O ácido nucleico alvo modificado pode ser levado a contactar com a matriz de afinidade directamente, na mistura de reacção onde se deu a amplificação.

A mistura pode também ser diluida ou a sua composição modificada de modo a obter condições favoráveis à reacção entre os componentes do par de afinidade .

Quando são usados dois pares de afinidade, o polinucléotido alvo é desnaturado de preferência antes da reacção de captura por afinidade para permitir a recolha separada das duas cadeias em diferentes matrizes de afinidade. Se essas duas matrizes de afinidade podem ser separados fisicamente uma da outra, e.g. após a etapa da reacção de sequenclação, as duas matrizes podem ser manipula-

-14das como uma só na etapa de captura e na etapa da reacção de sequencição. Quando o alvo é modificado apenas numa cadeia, torna-se opcional a desnaturação do alvo da reacção de captura.

As partes de ligação do polinucléotido alvo são deixadas reagir com o sítio de ligação complementar imobilizado, durante um período de tempo suficiente para recolher uma porção substancial do ácido nucleico alvo amplificado, a qual pode variar dependendo da cinética da reacção de ligação. No caso da parte de ligação não ser capaz de se ligar directamente ao sítio de ligação, sêrá necessário a introdução adicional de uma parte de junção, uma molécula com sítios de ligação separados, para a parte de ligação e para o sítio de ligação, a qual pode formar uma junção entre os dois. Após a reacção de captura, o polinucléotido alvo ligado é separado do material não ligado, incluindo trifosfatos de mononucleóridos em excesso, iniciador não modificado, enzima, sais, etc., por lavagem da matriz em condições apropriadas. O processo de separação depende do estado físico da matriz e pode ser, por exemplo, centrifugação, preparação magnética, um processo em coluna, lavagem da superfície da matriz ou combinações de vários deles .

Após o processo de lavagem a matriz é tratada em condições que tornam o polinucléotido alvo ligado, num polinucléotido de cadeia simples. Quaisquer condições que desnaturem o polinucléotido de cadeia dupla, tais como aquecimento, substâncias alcalinas ou enzimas mas que não afectem as ligações entre os componentes do par afinidado, podem ser usados. Este peso é obrigátorio se o polinucléotido alvo não tiver sido desnaturado antes da reac ção de captura. Quando a desnaturação for feita antes da reacção de captura este torna-se vantajoso, embora opcional,

-15cleico. Neste uma vez que de porte.

te do invento, etaoa. fornece para assegurar que as moléculas alvo que se podem ter reassociado durante o processo de captura estão desnaturados. Clarro que uma excepção é o caso em que a parte de ligação e o sítio de ligação são cadeias complementares de ácido nucaso, a desnaturação deve preceder a ligação outra forma se pode perder a ligação ao suPara além disto, noutra variano passo de desnaturação levado a cabo nesta um novo método vantajoso para o isolamento de uma cadeia de alvo sintetizado pela reacção de replicação repetida. A cadeia isolada é livre de trifosfatos de monocleoridos, iniciadores e outros componentes da reacção de replicação repetida e pode ser sequenciada por sequencição convencional em solução ou usada para qualquer outro fim.

c) Reacção de sequenciação

De acordo com o presente invento a determinação da sequência dos fragmentos de polinucléotidos amplificados pode ser realizado usando o método de terminação da cadeia. O método baseia-se no uso de análogos de deoxinucléotidos que são incorporados ao acaso por uma enzima de síntese de polinucléotidos numa cadeia de polinucléotidos crescente de forma a dar-se a terminação especifica da cadeia. A terminação da cadeia também pode ser conseguida usando concentrações muito baixas de um dos trifosfatos de deoxinucléotidos.

Os componentes necessários à reacção de sequênciação por terminação da cadeia são um iniciador de sequenciação, uma enzima de síntese de polinucléotidos, os dideoxinucléotidos de terminação da cadeia, deoxi-

-16nucléotidos de terminação da cadeia, deoxinucléotidos e um marcador detectável. De acordo com o presente invento, os diferentes protocolos laboratoriais padrão, para sequencição podem ser usados para sequenciar o polinucléotido alvo imobilizado.

A ordem de adição dos componentes da reacção de sequencição pode variar, dependendo da matriz de afinidade usada e do protocolo escolhido.

Como mostra a Fig. 2 o iniciador de sequenciação pode ser diferente ou igual ao iniciador escolhido na reacção de replicação repetida-amplificação se for diferente do inciador de aplificação, então deve estar completamente situado entre a região de interesse no polímero de ácido nucleico alvo e a extremidade 3' do inciador de amplificação (A), ou então pode cobrir parcialmente o iniciador de aplificação de tal forma que a sua extremidade 3' se associe a pelo menos um nucléotido, mas de preferência a mais de 3 nucléotidos na extremidade 5' do polímero de ácido nucleico alvo (Β). O iniciador de seuqencriação pode também ficar inteiramente situado no iniciador de aplificação (C) ou ser idêntico de anplificação (D).

A escolha do iniciador de sequenciação depende dos objectivos da análise. Um iniciador diferente do iniciador reacção de replicação repetida aumenta a especificidade da reacção de sequenciação, uma vez que evita a sequenciação de fragmentos errados produzidos provavelmente na reacção de replicação repetida. Deste modo é preferível usar um iniciador de seuqenciação diferente do iniciador de aplificação. Por outro lado, é necessária mais informação sobre a sequência do fragmento amplificado, para se fazer um tal iniciador.

-170 marcador para detecção dos fragmentos produzidos na reacção de sequenciação pode ser introduzido usando um iniciador de sequenciação marcado.

O marcador pode estar situado na extremidade 5' ou interna, 32 mento. Pode ser um isotopo, tal como P, um grupo flurorescente, qualquer outro marcador detectável, ou ainda um grupo que forneça um sítio para ligação posterior de um marcador detectável. 0 marcador também pode ser introduzido usando derivados de deoxinucléotidos marcados com um isótopo, tal 35 32 como S ou Ρ, ou com marcadores fluorescentes ou outros detectáveis. A parte de marcação é incorporada numa quantidade tal que, é introduzida em praticamente todo o ácido nucleico sintetizado, mesmo em pequenos fragmentos.

A matriz que transporta o fragmento de polinucléotidos é suspensa numa solução apropriada que contém o iniciador de sequenciação. 0 inciador é adicionado de preferência, numa concentração molar igual ou maior do que a do polinucléotido alvo. Permite-se que se dê a associação do iniciador e do polinucléotido alvo a uma temperatura -apropriada e durante o tempo suficiente, dependendo do tamanho e da quantidade do iniciador usado. Deve-se ter em conta que, quando ambas as cadeias do polinucléotido alvo são modificados e ligados a diferentes matrizes de afinidade, as quais podem ser separados fisicamente uma da outra e manipuladas como uma só, são-usados dois iniciadores de sequenciação diferentes.

Se for usada uma matriz de afinidade separável, tal como esferes, é conveniente dividir a amostra, após a associação do iniciador, em quatro partes para as reacções de sequenciação individuais. Se for usada uma matriz de afinidade não separável, tal como um poço de microtitulação, são preparados quatro reacções paralelas durante a etapa de captura por afinidade. Também é possível

realizar as quatro reacções sequencialmente no mesmo transportador, por eluição do produto de cada reacção antes de levar a cabo a próxima. Em certos casos obtém-se informação suficiente usando apenas uma, duas ou três reacções. Por exemplo, se se sabe que uma deficiência genética tem origem numa mutação pontual num único sítio especifico, o qual é normalmente C, deve ser entãõ suficiente realizar apenas as reacções C, uma vez que neste ponto não é necessário conhecer a identidade real do ácido nucleico não C. 0 facto relevante é que o resíduo não é C.

Após a associação, uma enzima de síntese de polinucléotidos, tal como a polímera I de DNA de E.coli ou a polimerase de DNA de T7 e, misturas que contenham dideoxinucléotidos de terminação de cadeia, deoxinucléotidõs e, se foram usadas iniciadores não marcados? decxinucléotidos marcados em proporções apropriadas as quais dependem da enzima usada e do tamanho do alvo, são adicionados A reacção de polimerização é deixada proceder durante um período de tempo suficiente para lacançar uma distribuição dos tamanhos dos fragmentos praticamente completa, a uma temperatura que depende da enzima e das condições usadas. Final mente, é levada a cabo uma reacção com deoxinucléotidos para completar a síntese das cadeias de polinucléotidos quenão tenham sido terminados. A reacção é, então parada.

No método deste invento, a matriz de afinidade pode ser levada nesta etapa, para remover os componentes da reacção de sequenciação. Assim, a compposição da mistura pode ser alterada de modo a obter condições mais favoráveis à análise dos fragmentos sintetizados. Se ambas as cadeias foram modificadas e ligadas a duas matrizes de afinidade diferentes então, as matrizes são separadas fisicamente nesta etapa e.g., por um campo magnético. O

-19DNA alvo é tornado de cadeia simples e os fragmentos sintetizados a partir das quatro reacções de sequenciação são separados por electroforese ou outro método apropriado. No método deste invento, a matriz de afinidade pode ser removida antes da electroforese, ou no caso da matriz de afinidade ser uma micropartícuia, pode ser aplicada juntamente com a amostra nos poços do gel para a etapa da electroforese. Isto tem vantagem na manipulação das amostras. Na etapa da electroforese é analisada a distribuição por tamanho dos fragmentos. O processo de detecção pode variar dependendo do marcador usado. Com isótopos, o gel é preparado por fixação, secagem e exposição a uma pelícúlà~de raios X de acordo com processos padronizados. Com marcadores fluorescentes, os fragmentos são detectados usando equipamento automático desenvolvido para esse fim. A distribuição por tamanho dos fragmentos de polinucléotidos produzidos pela reacção de seqiEnciação produz um padrão designado linha de sequenciação, o qual fornece a sequencia de nucléotidos do polinucléotido alvo.

Os reagentes para uso na prática do método deste invento podem ser embalados sob a forma de conjuntos. Por exemplo, esses conjuntos podem ser preparados incluindo combinações embaladas de um ou dois iniciadores de amplificação, os quais incluem partes de ligação e os respectivos suportes sólidos. Os conjuntos podem também ser preparados de modo a incluir adicionalmente um iniciador de sequenciação ou meios de referência para a comparação de determinada sequência de polímero de ácido nucleico com a sequência de um padrão. Exemplos de meios de referência incluem amostras que mostram a escada de sequenciação obtida a partir da sequênciação do padrão, ou uma amostra do próprio padrão. Se o padrão for fornecido possui, de preferência, uma parte de ligação unida a ele próprio de modo a poder ser manipulado de uma forma semelhante ao alvo a sequenciar.

arranjo dos reagentes nas embalagens dos conjuntos de reagentes, dependerá dos reagentes específicos envolvidos. Claro que cada reagente pode ser empacotado numa embalagem individual, mas também são possíveis várias combinações.

Por exemplo, se a parte de ligação e o sítio de ligação usados não se unirem um ao outro nas condições da reacção de replicação repetida, ambos podem ser fornecidos numa única embalagem. Pode acontecer no caso de ser usada uma parte de união.

O presente invento é listrado mais especificamente com os exerpplos seguintes, os quais não têm como finalidade limitar o campo deste invento.

Determinação da sequência de nucléotidos de um fragmento de DNA de citomegalovirus, biotinilado, imobilizado em micropartícuias de avidína.

-21Exemplo 1

Síntese dos iniciadores

Os inciadores foram sintetizados num sintetizador de DNA 381A de Applied Biosystems, pelo método da metoxi fosforamidite. Os iniciadores (denominados 25A e 25B) possuiam 25 nucléotidos com a sequência seguinte:

25A: 5'-TCG CAA GCT CTT TCC CGG CCT GGC T

25B: 5'-GCT CTG CGC GAA CAT GTA GTC GGC C

Foi adicionado um grupo amino terminal 5' ao iniciador 25A, como último passo na síntese, usando o reagente aminolink II (Applied Biosystems, P/N 400808). 0 grupo amino foi biotinilado com sulfo-NHS-biotina (Pierce Chemical Co.). O oligonucléotido biotinilado foi purificado por HPLC numa coluna de fase reversa C-18.

O DNA alvo

O DNA alvo foi um fragmento da região longa única do genoma de citomegalovirus (CMV) na posição do mapa 0,30-0,35, i.e., o fragmento de 12,2 kb Hind III L do DNA de CMV AD 169 (ATC VR-538) cionado no vector pAT153. O plasmídeo alvo foi linearizado com a enzima de

-22*

restrição EcoRi. Os iniciadores estão situados no flanco de uma região de 115 bp no fragmento HindIII L de CMV.

Reacção de replicação repetida-amplificação

Foi introduzida biotina num fragmento de 165 pares de base do DNA de CMV, por uma amplificação de 25 ciclos pela reacção de replicação repetida, usando o iniciador 25A biotinilado na extremidade 5' e o iniciador não modificado 25B. A amplificação foi levada a cabo com 3x10 moléculas do fragmento HindIII L de CMV linearizado, 100 pmol de cada iniciador, 200 uM de cada um dos quatro trifosfatos de mononucléosidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) em 100 ul de uma solução de TRIS-HC1 10 mM, pH 8,35, KC1 50 mM, MgC^ 1,5 mM e 0,1 mg/ml de gelatina em tubos Eppendorf de 0,5 ml, sob uma camada de parafina viscosa. O DNA alvo foi fervido durante 5 min. na mistura de reacção com o fim de o tornar de cadeia simples, após o que foram adicionadas 2U de polimerase de DNA de Thermus aquaticus (New England Biolabs). Os tubos foram então processados durante 25 ciclos como segue:

Associação do inciador a 55°C durante 1 min., extensão dos iniciadores a 72°C durante 3 min., desnaturação da matriz a 95°C durante 1 min. 15 seg..

Captura do DNA biotinilado, amplificado, em partículas de poliestireno revestidas com avidina

-23Uma amostra de 25 μΐ que continha cerca de ΙΟ^θ moléculas, i.e. 0,02 pmoles, do fragmento de DNA amplificado, o qual era de cadeia dupla e continha uma biotina na extremidade 5' de uma cadeia, foi colhido da mistura de reacção por incubação com 5 μΐ de uma solução a 5% de partículas de poliestireno revestidas com avidina (0,8 um, Pandex Laboratories), durante 1 hora à temperatura ambiente.

As esferas foram colhidas por centrifugação numa centrífuga durante 3 min. e lavadas três vezes, por agitação num vortex, com 1 ml de tampão fosfato salino (PBS), pH 7,5, contendo 0,1% de tritão x-100, seguido de centrifugação como descrito acima. O DNA ligado foi desnaturado por tratamento com 200 ul de NaOH 0,15 M durante 15' a 37°C, as partíauLas foram colhidas e lavadas duas vezes com 1 ml de tritão x-100 a 0,1% e, juntamente, lavadas com 1 ml de tritão x-100 a 0,001%.

Sequenciação do fragmento de DNA imobilizado

As micropartícuias que transportam o fragmento de DNA foram suspensas em 10 μΐ de Tris-HCl 40 mM, pH 7,5, MgC^ 20 mM, NaCl 50 mM, 100 pg/ml de albumina sérica bovina, contendo 0,06-0,08 pmoles do iniciador 25B. O inciador foi deixado associar-se durante 10 min. a

55°C seguido de 30 min. a 37°C. Foram, então, adicionados 35 μΐ de dCTP marcado com S (600 Ci/mmol; Amersham) e 1 μΐ (5 unidades) de polimerase de DNA de E.coli (fragmento Klenow; Boehringer Mannheim). A suspensão foi dividida por quatro tubos tb.ensaio, 2,5 μΐ em cada, para as reacçoes de sequenci-

-24ação individuais. Foram adicionados 2 μΐ de misturas de deoxi e dideoxinucléotidos de'modo a obter as seguintes concentrações finais:

Reacção

A:

125 uM ddATP

de

dGTP ,

dTTP ,

16

uM

de

dATP,

250

uM

de

Reacção

C:

125 uM

de

dGTP ,

dTTP ,

dATP ,

20

uM de

ddCTP

Reacção

G:

125 uM ddGTP

de

dTTP ,

dATP ,

15

uM

de

dGTP ,

200

uM

de

Reacção

T:

125 uM

de

dGTP ,

dATP ,

16

uM

de

dTTP ,

500

uM

de

ddTTP

A reacção foi deixada prosseguir durante 20 min. à temperatura ambiente. Foram adicionados mais 5 μΐ de uma solução 5 mM dos quatro dNTP e a reacção foi deixada prosseguir durante 20 min. à temperatura ambiente. A reacção foi parada por adição de 4 jal de formamida a 95%. EDTA 20 mM, azul de bromofenol a 0,05%., cianol de xileno a 0,05%. As amostras foram aquecidas durante 3 min. a 98°C. Os tubos foram centrifugados e foram aplicados ³ P¹ do sobrenadante num gel de sequênciação de poliacrilamida a 8%. As amostras foram submetidas a electroforese, o gel removido, fixado e exposto a uma película de raios X de acordo com processos padronizados. Após a revelação foram observadas linhas de sequênciação nitidas.

Exemplo 2

Todo o processo foi levado a cabo de modo idêntico ao Exemplo 1, com a excepção de que as amostras de reacção de sequênciação foram aplicadas directamente no gel em remoção prévia das micropartí cuLas. Foram obtidas linhas de sequênciação idênticas às do Exemplo 1.

Exemplo 3

Neste exemplo, foram usados ini32 ciadores com P, nas reacções de sequeriação. 0 processo foi realizado como no Exemplo 1, com as seguintes excepções:

r— iniciador de sequênciação 3 2 (25B) foi marcado usando gama- P-ATP e cinasa de polinucleótidos de acordo com um método padrão. Foram usados, por reacção de marcação, 2 pmoles de oligonucléotido iniciador e 14 pmoles de gama- P-ATP ( 5000 Ci/mmol; Amersham). Foram obti7 dos iniciadores com actividades especificas de 10 cpm/pmol.

Para as reacções de seuqenciação, foram suspensas micropartíalas, transportando cerca de 0,02 pmoles do fragmento de DNA amplificado, em tampão de sequenciação (ver Exemplo 1) contendo 0,1 pmole de iniciador 25B marcado. A reacção de associação do iniciador foi realizado como no Exemplo 1. Foram então adicionados 1 jal (5 unidades) de polimerase de DNA e a suspensão foi dividida em quatro partes com 2,5 μΐ em cada. Foram adicionados 2 μΐ de misturas de deoxi e dideoxinucléotidos de modo a obter as seguintes concentrações finais:

Reacção	A:	125 uM de ddATP
Reacção	C:	125 uM de de ddCTP
Reacção	G:	125 uM de de ddGTP
Reacção	T:	125 uM de de ddTTP

dCTP, dTTP, 16 uM dATP, dGTP, dTTP, dATP, dCTP, dTTP, dATP, dCTP, dGTP,

de	dATP e	250	uM	í de
16	uM	de	dCTP	e	80	uM
16	uM	de	dGTP	e	200	uM
16	uM	de	dTTP	e	500	uM

A reacção de terminação e demais bem como a análise dos fragmentos produzidos levados a cabo como no Exemplo 1. Também neste exemplo, foram obtidas nítidas linhas de sequenciação.

Exemplo 4

Neste exemplo o da reacção de replicação repetida e o iniciador de sequenciação não eram idênticos. 0 iniciador de sequenciação estava localizado a uma distância de 78 bases do iniciador de aplificação em direcção à extremidade 5' biotinilada do fragmento amplificado.

A reacção de replicação repetida-amplificação foi levada a cabo com o iniciador biotinilado 25A e com um iniciador de 25 bases, denominado 25C, com a sequência seguinte:

5¹-CAG GGT CAC TGA CAA CAG CCG CCC T. Os iniciadores 25A e 25C flanqueiam uma sequência de 209 bp no genoma de CMV.

Os processos de amplificação e captura foram realizados como descrito no Exemplo 1. O 32 iniciador 25B foi marcado com P e usado como iniciador de sequenciação nas condições descritas no Exemplo 3. A sequência obtida foi idêntica à obtida no Exemplo 3.

Exemplo 5

Todos os processos foram levados a cabo como no Exemplo 1, exceptando o passo de captura por afinidade. Neste exemplo, foram usados esferas magnéticas como matriz de afinidade. As esferas tinham um diâmetro de 2 pM e um núcleo paramagnético com uma cobertura esférica de poliestireno revestida com estreptavidina. As esferas (Dynabead 280-Streptavidin) foram obtidas de Dynal, Noruega. Antes de usar, as esferas foram lavadas uma vez com tampão fosfato salino (PBS).

Como no Exemplo 1, foram analisados 25 Pi de amostra contendo o fragmento de DNA amplificado. Foram adicionados 5 ul de uma suspensão a 4% de esferas magnéticas em PBS e a reacção de captura foi deixada prosseguir durante 30 min. a 37°C, em tubos Eppendorf num agitador rotativo. As esferas foram separadas da solução durante 1 min. usando um magnete de laborátorio vulgar e a solução foi rejeitada. As esferas foram lavadas três vezes com 1 pl de PBS, por agitação num vortex seguida de separação magnética como descrito acima. O DNA ligado foi desnaturado por tratamento com 200 μΐ de NaOH 0,15 M durante 15 min. a 37°C. As esferas foram colhidas e lavadas duas vezes com PBS e uma vez com TRIS-HC1 40 mM, pH 7,5, MgCl^ 20 mM, NaCl 50 mM . A sequenciação do fragmaito de DNA imobilizado foi realizada como no Exemplo 1.

Exemplo 6

Os processos de reacção de replicação repetida-amplificação e captura foram levadas a cabo como no Exemplo 1. Neste exemplo, a segunda cadeia do fragmento de DNA amplificado, obtida na etapa de desnaturação foi sequenciada.

O sobrenadante de 200 μΐ com NaOH 0,15 M, contendo a cadeia de DNA eluída da matriz de afinidade, foi neutralizado por adição de 30 pl de ácido acético 1,0 M e 10 pl de acetato de sódio 5 M (pH7). O DNA foi precipitado com etanol e dissolvido em 10 jul de tampão de sequenciação (ver Exemplo 1) contendo o iniciador de sequenciação. O processo de sequenciação foi realizado nas condições especificadas no Exemplo 1. Foram obtidas, novamente, linhas de sequenciação nítidas.

Exemplo 7

Identificação do pd. imorf ismo genético da apolipoprotéina E por sequenciação de fragmentos de DNA de apolipoprotéina E imobilizados e biotinilados.

-29Síntese dos iniciadores

Foram sintetizados quatro (Pl-P4) num sintetizador de DNA 381A de Applied Biosystems. A sequência de nucléotidos dos iniciadores e a sua localização (dada em números de nucléotidos) no gene da apolipoprotéina E foram:

Pl:	5 '	-AAG	GAG	TTG	AAG	GCC	TAC	AAA	T	(3615-3637)
P2:	5 ¹	-TCG	CGG	GCC	CCG	GCC	TGG	TAC	A	(3893-3914)
P3:	5 '	-GAA	CAA	CTG	AGC	CCG	GTG	GCG	G	(3649-3671)
P4:	5 '	-GGA	TGG	CGC	TGA	GGC	CGC	GCT	C	(4012-4034)

Um grupo amino 5¹ foiiadicionado ao iniciador P2 com o reagente aminolink II (Applied Biosystems). O grupo amino foi biotinilado usando sulfo-NHS-biotina (Pierce Chemical Co.) e purificado por HPLC de fase reversa. O inciador de sequenciação (P3) foi marcado com /gama- P7 dATP e cinasa de polinucléotido de T4 até uma actividade especifica de 4χ10θ cpm/pm.

Amostras de DNA

Amostras de sangue venoso foram de doentes possuidores de um fénotipo de Apo E conhecido e que eram assistidos no dipid Outpatien Clinic do University Central Hospital of Helsinki. Foi extraído DNA leucocitário de acordo com métodos padrão.

-30Amplificação

O DNA (100 ng por amostra) foi amplificado com os iniciadores PI e P4 (concentração final 1 μΜ) em 100 μΐ de uma solução de dATP, dCTP, dGTP, dTTP,

0,2 mM cada, 20 mM TRIS-HC1, pH8,8, 15 mM (NH)₄SC»₄, 1,5 mM MgC^, 0,1% tween 20, 0,1 mg/ml de gelatina e 2,5 unidades de polimerase de DNA de Thermus aquatieus (Promega) num reciclador termal de DNA (Perkin-Elmer/Cetus) durante 25 ciclos, 1 min. a 96°C e 2 min. a 65°C. Uma pequena aliquota (3 μΐ de uma diluição 1:100) desta primeira mistura de amplificação foi transferida para uma segunda amplificação.

Esta segunda amplificação foi levada a cabo nas condições descritas acima e conduzida por um par de iniciadores, um dos quais foi biotinilado (biotinilados P2 e P3).

Captura por afinidade do DNA de Apo E amplificado e biotinilado em partículas de poliestireno revestidas com avidina.

Uma aliquota de 25 μΐ da segunda mistura de amplificação foi diluída até 50 μΐ com 0,15 M NaCl, 20 mM tampão fosfato de sódio, pH 7,5 (PBS) , após o que foram adicionados 5 ^ul de uma suspensão a 5% (p/v) de partículas de poliestireno revestidas com avidina (0,8 um, Baxter Healthcare Corp.). As amostras foram guardadas a 20°C durante 1 hora. As partículas foram colhidas por centrifugação durante 2 min. numa centrífuga Eppendorf e foram lavadas duas vezes por agitação num vortex com 1 ml de NaCl, mM, 1,5 mM citrato de sódio e duas vezes com 1 ml de 0,1% Tween 20 em PBS. As partículas foram tratadas duas vezes com 0,15 M NaOH durante 15 min. a 37°C, seguido de duas lavagens com 0,1% Twwen 20 em 50 mM NaCl, 40 mM TRIS-HC1, pH 7,5 e uma lavagem final com 0,01% Tween 20 em 50 mM NaCl, 40 mM TRIS_HCL, pH 7,5.

Sequenciação dos nucléotidos do fragmento de DNA imobilizado

As partículas transportadoras de DNA foram suspensas em 10 pl de 50 mM NaCl, 20 mM MgC^, mM TRIS-HC1, pH 7,5, contendo 0,5-1 pmole do inciador de sequenciação P2 ou P3. Os tubos foram aquecidos a 65°C durante 2 min. e arrefecidos lentamente até à temperatura ambiente. Um pl de 0,1 M ditiotreitol, 2,5 μΐ de H-0 e 2 pl ^TM (3,25 unidades) de polimerase de DNA T7 (Sequenase , United States Biochemical Corp.) foram adicionados e os tubos foram deixados a 22°C durante 3 min.. Foi transferida uma aliquota (3,5 pl) da mistura de reacção para quatro tubos contendo 2,5 pl da mistura de terminação da cadeia (80 pM dNTP, 8 pM ddNTP para as reacções A e T; 320 pM dNTP, 8 pM ddNTP para as reacções C e G). Os tubos foram incubados a 42°C durante 6 min. e a reacção foi parada por adição de 4 pl de uma solução contendo 95% de formamida, 20 mM EDTA, 0,05% de azul de bromofenol e 0,05% de cianol de xileno. As amostras foram aquecidas a 80°C durante 2 min. e as partículas centrifugadas durante 2 min.. Os produtos da reacção de terminação da cadeia foram submetidos a electroforese através de um gel de sequenciação a 6%. A electroforese foi levada a cabo e o gel foi processado de acordo com métodos padrão. Os alelos correctos foram identificados ras linhas obtidas nos géis de sequenciação. Nas amostras heterozigóticas ambos os alelos foram identificados em linhas de sequenciação sobrepostas na posição de variação do nucléotido.

Claims

REIVINDICAÇÕES lâ.- Método para determinar a sequência de um polímero de ácido nucleico alvo, caracterizado por compreender:

a) a combinação de uma amostra que contem o polímero de ácido nucleico alvo com uma mistura de trifosfatos de nucleosidos, uma polimerase de ácido nucleico e, um primeiro e um segundo iniciadores de amplificação cada um dos quais contendo um oligonucleotido que possui uma região que é complementar e hibrida com uma cadeia diferente do polímero de ácido nucleico alvo, sendo eficaz como iniciador da polimerização do ácido nucleico pela polimerase de ácido nucleico de modo a formar uma mistura de amplificação, em que o referido o primeiro iniciador de amplificação compreende também uma primeira parte de ligação unida ao oligonucleotido;

b) o tratamento repetida e ciclicamente da mistura de amplificação, entre uma primeira condição na qual ocorre a polimerização do DNA e uma segunda condição na qual ocorre a desnaturação do DNA de cadeia dupla até DNA de cadeia simples, durante um número de ciclos suficiente para produzir cópias do polímero de ácido nucleico alvo em quantidade apropriada para usar num processo de sequênciação de DNA de modo a formar uma amostra amplificada que inclui cópias de sequencia de ácido nucleico alvo ligadas à parte de ligação;

c) a adição à amostra amplificada de múltiplos primeiros suportes, cada um incluindo uma matriz sólida e um primeiro sítio de ligação capaz de imobilizar uma cadeia do polímero de ácido nucleico alvo por intermédio da primeira parte de ligação;

-33d) o permitir a interacção entre os primeiros sítios e os primeiros fontes de ligação de modo a que as cópias do ácido nucleico alvo na amostra amplificada sejam imobilizadas nos primeiros suportes;

e) a separação dos ácidos nucleicos imobilizados, da mistura de amplificação;

f) a desnaturação da amostra de ácido nucleico amplificada de modo a formar ácidos nucleicos de cadeia simples , e

g) a determinação da sequencia dos ácidos nucleicos de cadeia simples.
2§.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o passo respeitante à desnaturação da amostra amplificada ser realizada antes da imobilização das cópias do ácido nucleico alvo, no suporte.
3â.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequencia dos ácidos nucleicos de cadeia simples imobilizados ser determinada utilizando o método de terminação da cadeia.
4ã.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as mencionadas primeira parte de ligação e primeiro sítio de ligação serem componentes de um par de afinidade.

-345§.- Método de acordo com a rei vindicação 4, caracterizado por o par de afinidade ser seleccionado a partir do grupo que consiste em biotina/avidina biotina/estreptavidina, poli-dA/poli-dT, poli-dG/poli-dC, hapteno/anticorpo e metal/quelante.
6â.- Método de acordo com a rei vindicação 1, caracterizado por o mencionado segundo iniciador de amplificação incluir uma segunda parte de ligação diferente da mencionada primeira ponte de ligação.
7â.- Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por incluir adicionalmente, o passo de adição à amostra amplificada de uma multiplicidade de segundos suportes que incluem uma matriz de suporte e um segundo sítio de ligação capazes de imobilizar uma cadeia do polímero de ácido nucleico alvo por intermédio da segunda parte de ligação.
8â.- Método de acordo com a rei vindicação 6, caracterizado por as mencionadas segunda parte de ligação e segundo sítio de ligação serem componentes de um par de afinidade.
9ã.- Método de acordo com a rei vindicação 8, caracterizado por o par de afinidade ser sEleccionado a partir do grupo que consiste em biotina/avidina, biotina/estreptavidina, poli-dA/poli-dT, poli-dG/poli-dC, hepteno/anticorpo e metal/quelante.
10ã.- Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por os primeiros e segundo suportes presentes concorrentemente na amostra amplificada e serem seleccionados de modo a serem separáveis fisicamente um do outro.
11â.- Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por um dos mencionados primeiro e segundo suportes ser magnético.
12â.- Método reivindicação 10, caracterizado por um ou e segundo suportes serem varetas.

de acordo com a ambos os primeiros
13â.- Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o processo de determiração da sequencia incluir de combinação os ácidos nucleicos de cadeia simples imobilizados com um iniciador de sequenciação e uma mistura de sequenciação que inclui trifosfatos de nucleosidos, um nucleotido de terminação de cadeia, um enzima de síntese de polinucleotidos e uma parte de marcação que é incorporada durante a síntese do ácido nucleico, permitir que a polimerização ocorra durante um período de tempo suficiente para que se dêem acontecimentos de terminação de cadeia em número a permitir a determinação da sequência formando uma amostra parcialmente polimerizada, adição de um reagente de complenHito que inclui uma mistura de trifosfatos de nucleosidos à amostra parcialmente polimerizada, permitir a ocorrência da polimerização na presença do reagente de complenHito durante um periodo de tempo suficiente para que se complete substancialmente a síntese de DNA, separação de amostra completamente polimerizada dó rea-

-36gente de complemento;

libertação dos ácidos nucleicos polimerizados do suporte, desnaturação dos ácidos nucleicos polimerizados de forma a que se tornem de cadeia simples, análise do tamanho dos polímeros de ácido nucleico de cadeia simples para determinar a sequência do polímero de ácido nucleico alvo.
14â.- Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o inciador de sequenciação ser um oligonucleótido seleccionado dentre os oligonucleotidos complenei tares com pelo menos, uma porção do iniciador de amplificação e os oligonucleótidos complementares com uma porção do polímero de ácido nucleico alvo que está situada entre a extremidade 3' do inciador de amplificação e uma região de interesse no polímero de ácido nucleico alvo.
15â.- Método de acrodo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir, adiçionalmente, o passo de incubação da mistura de amplificação a uma temperatura seleccionada de modo a promover o recoziiento das ácidos nucleicos antes de cada passo de polimerização.
16â.- Conjunto de reagentes (kit) para usar na determinação da sequência de um polímero de ácido nucleico alvo, caracterizado por incluir, numa combinação embalada,

a) um primeiro inciador de amplificação que inclui um oligonucleótido que é complementar e híbrida com uma porção do polímero de ácido nucleico alvo e que é eficaz como iniciador para a polimerização enzimática do ácido nucleico e uma primeira parte de ligação; e

b) uma multiplicidade de primeiros suportes, cada um incluindo uma matriz sólida e, pelo menos, um sítio de ligação capaz de imobilizar o oliginucleotido da sonda de amplificação por intermédio da parte de ligação.
17â.— Conjunto de reagentes de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a parte e o sítio de ligação serem componentes de um par de afinidade.
18ã4- Conjunto de reagentes, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o par de afi nidade ser seleccionado de entre o grupo que consiste em biotina/avidina, biotina/estreptavidina, poli-dA/poli-dT, poli-dG) poli-dC, hapteno/anticorpo e Metal/quelante.
19§.- Conjunto de reagentes de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a parte de ligação não formar directamente a ligação com o sítio de ligação e que inclui adicionalmente uma parte de união seleccionada de modo a formar uma ligação entre a parte de ligação e o sítio de ligação.
20 a.- Conjunto de reagentes de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por incluir, adicionalmente, um inciador de sequenciação o qual é um oligonucleótido seleccionado entre as oligonucleótidos complementares a pelo meoos uma porção do inciador de amplificação e os oligonucleótidos complementares a uma porção do polímero de ácido nucleico alvo e que está localizada entre a extremidade 3' do iniciador de amplificação e uma região de interesse no polímero de ácido nucleico alvo.

-38211.- Conjunto de reagentes, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o iniciador de sequênciação incluir, adicionalmente, um marcador detectável.

221.- Conjunto de reagentes de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por incluir, adicionalmente, meios de referência que permitem a comparação da sequência determinada do polímero de áddó nucleico alvo com a sequência de um padrão.

231,- Conjunto de reagentes, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o meio de referência inserido na embalagem, mostrar a sequência obti da a partir da sequênciação do padrão.

241.- Conjunto de reagentes de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o meio de referência ser uma amostra do padrão.

251.- Conjunto de reagentes, de acordo cpm a reivindicação 16, caracterizado por o oligonucleotido do iniciador de amplificação ser complemntar e hibridar com uma porção do polímero de ácido nucleico alvo o qual tem origem num organismo alvo.

261.- Conjunto de reagentes, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por se incluir adicionalmente, um segundo iniciador de amplificação que compreende um oligonucléotido que é compleneitar e hibrida com uma porção da segunda cadeia do polímero de ácido nuclei-39co alvo e é eficaz como iniciador para a polimerização enzimática do ácido nucleico e uma segunda parte de ligação diferente da primeira parte da ligação; inclui ainda uma multiplicidade de segundos suportes, cada um incluindo uma matriz sólida e, pelo menos, um sítio de ligação capaz de imobilizar o oligonucleotido da sonda de amplificação por intermédio da segunda parte de ligação.

27â.- Conjunto de reagentes, de acrodo com a reivindicação 26, caracterizado por a parte de ligação e o sítio de ligação serem componentes de um par de afinidade.

28ã.- Conjunto de reagentes, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o qual par de afinidade ser seleccionado de entre o grupo que consiste em biotina/avidina, biotina/estreptavidina, poli-dA/poli-dT, poli-dG/poli-dC, hapteno/anticorpo e metal/quelante.

29ã.- Conjunto de reagentes de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por incluir adicionalmente, um meio de referência para comparação da sequência determinada do polímero de ácido nucleico alvo com a sequência de um padrão.

305.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência a determinar conter uma modificação na sequência de nucleótidos relacionados com predisposições ou doenças hereditárias.

31ê.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência a determinar conter uma modificação na sequência de nucleótidos relacionada com mutação somáticas.

325.- Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência a determinar conter uma modificação na sequência de nucleótidos com a selecção de células e estirpes para produção animal e de plantas .