JP2786857B2

JP2786857B2 - 検体中の目的核酸の検出法

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Publication number: JP2786857B2
Application number: JP14915788A
Authority: JP
Inventors: 明男山根; 智中上; 孝紀岡
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-06-16
Filing date: 1988-06-16
Publication date: 1998-08-13
Anticipated expiration: 2013-08-13
Also published as: JPH01314965A

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕技術分野本発明は、いわゆるハイブリダイゼーション法を用い
ないで特定の遺伝子の塩基配列を検出する方法に関す
る。より詳細には、検出すべき核酸配列に相補的な少な
くとも１種のプライマーを用いて、核酸配列に相補的な
プライマーの伸長反応を行って得られる二本鎖核酸また
はプライマーの伸長生成物同志で形成された二本鎖核酸
を、一本鎖核酸あるいは単位核酸と分離することによっ
て、検出すべき核酸を検出する方法に関する。

先行技術遺伝子の分子生物学の急速な進歩に伴い、特定の遺伝
子の塩基配列を検出することはきわめて重要なものとな
ってきている。例えば、遺伝病の出生前診断、癌の分子
レベルでの診断あるいはウイルスのような病原体の検出
において遺伝子の検出を行うことは重大な意義がある。

このような遺伝子の検出を行うには、一般的にはハイ
ブリダイゼーションと呼ばれる方法が使われる（B.D.Ha
mesおよびS.J.Higgins:Mucleic acid hybridization.a
practical approach.IRL Press.1985）。この方法は、
標識配列と相補的な塩基配列をもつ単鎖あるいは相補鎖
を放射性あるいは非放射性の標識物質で標識し、そのの
ち標的配列との相補性を利用して結合させて、すなわち
ハイブリダイズさせて、標的配列を検出する方法であ
る。この場合、一般的には、標的物質を担体に固定する
ドットハイフリダイゼーション法〔DNA.4.327-331.（19
85）〕あるいはサザンハイブリダイゼーション法〔Mole
cular Cloning.p382.Cold Spring Harbor（1982）〕等
が行われる。しかしながら、これらの方法は煩雑で手間
がかかり。機械化の努力もされているにもかかわらず、
未だに多数に試料をルーチン作業として分析することは
不可能である。これらの問題を解消するためにプローブ
を担体に固定するハイブリダイゼーション法が工夫され
ているが〔例えば、T.R.Gingerasら:Nucleic Acids Re
s.15.5373-5390〕、このような液相−固相間のハイブリ
ダイゼーションには限界があり、感度等の点で実際に応
用できる方法とはなり得ていない。これらの液相−固相
間のハイブリダイゼーションの欠点を克服するためにサ
ンドイッチ型の液相−固相間のハイブリダイゼーション
が工夫されている〔例えば、Ann-Christine Syvaenen
ら:Nucleic Acids Res.14.5037-5048（1986）、特開昭6
2-229068号公報〕。しかしながら、これらの方法も、ブ
ローブを大過剰に使う事から来る高いバックグラウンド
や感度の点で、満足のいくものとはなり得ていない。

また、感度を向上させるために、特定の核酸配列を増
幅する方法が開発されているが（特開昭62-281号公
報）、この方法においてもハイブリダイゼーションの操
作は必要であって、煩雑さを減じることになっていな
い。

〔発明の概要〕

要旨本発明は、上記問題点を解決し、特定の塩基配列を用
意にしかも感度よく検出する方法を与えることを目的と
し、検出すべき核酸配列に相補的な少なくとも１種のプ
ライマーを用いて、該核酸配列に相補的なプライマーの
伸長反応を行って得られる二本鎖核酸、またはプライマ
ーの伸長生成物同士で形成された二本鎖核酸を、一本鎖
核酸（プライマー）あるいは鎖長伸長用単位核酸と分離
した後、二本鎖核酸の存在を調べることにより目的の核
酸配列を検出する方法である。

即ち、本発明による検体中の目的核酸の検出法は、下
記の工程（イ）〜（リ）を実施すること、を特徴とする
ものである。

（イ）少なくとも一つの目的核酸（以下、核酸（Ｉ）と
いう）存在の有無を検知しようとする検体を用意するこ
と。

（ロ）核酸（Ｉ）が二本鎖の場合は核鎖に対して相補的
であり、核酸（Ｉ）が一本鎖の場合は核酸（Ｉ）および
核酸（Ｉ）と相補的な核酸の核鎖に対して相補的であ
り、かつ核酸（Ｉ）よりは短いが核酸（Ｉ）と特異的に
ハイブリダイズするのに充分な長さの一対の一本鎖核酸
（以下、核酸（II）という）を用意すること。

（ハ）工程（イ）の検体を、核酸（Ｉ）が一本鎖核酸で
あればそのままで、これが二本鎖核酸であれば一本鎖に
してから次の工程に供すること。

（ニ）前の工程で得られる一本鎖核酸に核酸（II）をハ
イブリダイズさせ、単位核酸の存在下で該一本鎖を鋳型
として核酸（II）の鎖長を伸長させて二本鎖核酸（二本
鎖のうち鎖長の伸長によって生成した核酸鎖を合成核酸
鎖という（以下、同様））を形成させるか、必要に応じ
て、該二本鎖核酸を一本鎖にした後に合成核酸鎖同士を
ハイブリダイズさせて、二本鎖核酸を得ること。

（ホ）工程（ニ）で得られる二本鎖核酸を一本鎖にする
こと。

（ヘ）工程（ホ）で得られる一本鎖核酸を用いて、工程
（ニ）を行うか、工程（ニ）および（ホ）の操作を順次
段階的に繰り返し行い、最終的に工程（ニ）に相当する
段階でこの繰り返しを終了して二本鎖核酸を得ること。

（ト）工程（ニ）または（ヘ）の産物である二本鎖核酸
に下記のいずれかの手段によって、検出可能な標識から
なる官能基を持たせること。

（ｉ）官能基を持つ核酸（II）を使用する。

（ii）官能基を持たない核酸（II）を使用する場合は、
官能基を持つ単位核酸の使用によって、該合成核酸鎖を
官能基を持つものとして得る。

（iii）該合成核酸鎖を官能基を持たないものとして形
成させ、その後、そこへ、該検体中において、官能基を
導入する。

（チ）官能基をもつ二本鎖核酸を含む検体を二本鎖核酸
と一本鎖核酸および単位核酸とに対して選択的吸着能を
持つ固体吸着剤に接触させて、該二本鎖核酸と一本鎖核
酸および／または単位核酸とを分離すること。

（リ）工程（チ）より得られる官能基をもつ二本鎖核酸
を、該標識からなる官能基を利用する検出操作に付し
て、この核酸の有無を、検出すべき核酸に対応するもの
として検知すること。

効果本発明においては、先に出願した方法（特願昭62-328
785号明細書参照のこと）同様、検体中の一種以上の目
的核酸の存在の有無を同時にしかも迅速に検出できる点
に特徴がある。

本発明による核酸配列の検出法は、前記で定義したよ
うに、ポリメラーゼなどを用いた一連の反応で、標識し
た検出対象物の複製物（標識二本鎖核酸）を得、これを
適当な固体吸着剤を用いて検体中の標識一本鎖プライマ
ーあるいは標識単位核酸から分離して目的の標識二本鎖
核酸のみを検出することからなり、いわゆるハイブリダ
イゼーション法という煩雑な操作を必要とせず、現在、
他の分野例えば抗原抗体反応の分野で利用されている装
置を容易に本法に応用することができる。その結果、一
度に多検体を分析することができる。

そして、核酸のハイブリダイゼーションやゲル電気泳
動での核酸の分離を必要としないため、核酸を含む試料
は粗精製の状態でよく、試料の調整も容易で、装置を用
いて行うことができる。

また、本発明ではハイブリダイゼーションを行わない
でプライマーによる伸長反応を行うために、分析時間を
大幅に短縮することができる。また、本測定法において
あらかじめ用意しておく標識物質としては、標識化プラ
イマーあるいは標識化モノヌクレオチドでいずれも化学
的に大量合成でき、従来のハイブリダイゼーション法の
ように天然のDNAフラグメントを酵素等を使って標識す
る必要はない。

さらに、それぞれの検出しようとする試料中におい
て、目的核酸（Ｉ）の塩基配列が微妙に（一塩基以上）
異なる場合も、ポリメラーゼ等の反応条件を適当に調節
することにより、プライマーが目的核酸に完全に相補的
である場合とそうでない場合を区別することができる。
つまり、ハイブリダイゼーション法等によらないで容易
に点突然変異をも検出することができる。

そして、それぞれ官能基の異なる標識物質で標識され
た複数のプライマーを使用すれば、同時に一種類以上の
目的核酸（Ｉ）に対する伸長反応を行う事ができ、それ
ぞれの標識物質の官能基を利用する検出操作を行う事に
よって、同時に多数の目的核酸の存在の有無を調べる事
ができる。

〔発明の具体的説明〕

検出原理本発明による目的核酸の検出法は前記の工程（イ）〜
（リ）を含んでなるが、この方法は、（ｉ）検体中の目
的核酸（核酸（Ｉ）という）からそれと相補的な核酸を
検体中でつくって（この核酸を合成核酸という）二本鎖
を形成させ、それについて検出を行うこと、（ii）検体
中の合成核酸を作る際にプライマーあるは鎖長伸長用単
位核酸を適当な官能基をもつ標識物で標識しておくこと
により合成核酸を標識物質を持つものとして得ること、
あるいは事後的に標識物質を導入すること、（iii）上
記（ii）で得られた標識物質を導入した合成核酸を適当
な固体吸着剤を用いて標識物質をもつ一本鎖プライマー
あるいは単位核酸から分離して、目的とする標識合成核
酸を選択的に検出することを基本原理とするものであ
る。

このように、適当な官能基で標識したプライマーある
いは単位核酸を用いてポリメラーゼによる伸長反応を行
った場合、反応液中の標識物質は、合成核酸とプライマ
ーあるいは単位核酸だけに存在する（合成核酸は、目的
核酸と二本鎖を形成しているか、あるいは合成核酸同士
で二本鎖を形成している。）そこで、該合成核酸とプラ
イマーとを分離する場合は、二本鎖核酸と一本鎖核酸を
分離できる固体吸着剤を用いればよいし、合成核酸と単
位核酸を分離する場合二本鎖核酸と単位核酸とをそれぞ
れ分離できる固体吸着剤を用いれば良い。

このようにして、目的核酸の塩基核酸を写しとった合
成核酸を、それに導入された標識物質を用いて検出する
ことによって目的核酸を検出することができる。なお、
検体中に目的核酸が存在しなければ、標識物質が導入さ
れた合成核酸が生成しないことから、検出結果は、検体
中には目的核酸不在となる。

このような選択検出性を実現すべき前記官能基の導入
は、所謂プライマー（前記の核酸（II））を使用して、
たとえば目的核酸がDNAであればそれを一本鎖にしてか
らDNAポリメラーゼにより、目的核酸がRNAであれば逆転
写酵素によって、プライマーから鎖長を伸長させ、その
際に、プライマーとして官能基をもつものあるいはもた
ないものを使用し、鎖長延伸の際のモノマーないし単位
核酸として官能基をもつものまたはもたないものを使用
して、これらの適宜な組合せにより最終的に該合成核酸
を官能基を持つものとして得ることによって行うことが
できる。このようにして得られる官能基を持つ合成核酸
鎖の具体例を挙げれば、目的核酸（Ｉ）が二本鎖である
時に一方または両方の鎖について、また、一本鎖である
ときにはそれについて、官能基を持つプライマーあるい
は持たないプライマー｛核酸（II）｝をハイブリダイズ
させ、そこへ単位核酸としてdATP,dGTP,dCTP,TTP存在
下、DNAポリメラーゼを働かせて該プライマーの鎖長を
伸長させる際に、必要に応じて（官能基を持たないプラ
イマーを用いる場合は必ず）単位核酸の一個ないし一種
あるいは複数個ないし複数種に標識を持たせたものを使
用して原DNA鎖と合成核酸鎖との二本鎖としたもの、二
本鎖DNA鎖の一方について上記の通りに二本鎖構造体を
つくり、他方のDNA鎖についても上記の通りに二本鎖構
造体をつくり、両二本鎖構造体から原DNA由来の鎖を除
去して合成鎖を遊離させ、両合成鎖をハイブリダイズさ
せて、プライマーから供給された官能基を持つ二本鎖と
したもの（（遊離させた各合成鎖についてプライマーの
付加および（または）鎖長の伸長ないし合成鎖の形成を
行って、合成鎖からなる二本鎖の増幅を行うこともでき
る））、その他がある。また官能基の導入は、その他の
合目的的な方法によって実施することができ、目的とす
る合成核酸を形成させた後、任意の官能基を導入するこ
ともできる。このような反応において、導入される官能
基は少なくとも一種類で良い。

また、ポリメラーゼによるプライマーの延伸反応は、
別々の官能基または同一の官能基をもつそれぞれ別々の
プライマーを用いて、同一検体中複数個の目的核酸
（Ｉ）に対して同時に検出を行うこともできる。

検出の実際 a.核酸本発明でいう検出すべき核酸とは、検出しようとする
塩基配列を含むものであって、DNAでもRNAでもよい。こ
のような核酸は大腸菌、ビールスおよび高等動植物など
あらゆる生命体から調整することができる。また、上記
核酸を、本検出法に用いる場合、核酸は精製されていて
も、されていなくてもよい。

プライマーおよびその伸長反応 b.（ｉ）プライマー（核酸（II））本発明でいうプライマーは、検出しようとする上記核
酸の塩基配列（DNAの場合は変性などの手段により、日
本鎖核酸配列を一本鎖にする必要がある）と特異的に相
補鎖を形成し、その３′末端にモノヌクレオチドが順次
付加されるもので、３′末端の水酸基が不可欠である。
一般に、プライマーとはオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドのことをさすが、天然から得られる長鎖のDNAフラグ
メントでもよい。目的核酸（核酸（Ｉ））と特異的にハ
イブリダイズするのに充分な長さのものであるべきであ
る。

点突然変異を検出しようとする場合は、点突然変異を
起した目的核酸と特異的にハイブリダイズするのに充分
な長さを有し、かつ完全に相補的なプライマー及び点突
然変異を起してない該核酸と特異的にハイブリダイズす
るのに充分な長さを有し、かつ完全な相補的なプライマ
ーの二種を用いる。これらのプライマーはいずれもオリ
ゴデオキシリボヌクレオチドである。

この様な一連のプライマーの具体例としては何も修飾
されていないプライマーまたは標識物質が導入されたプ
ライマーを用いることができる。

なお、ここでいうプライマーの標識物質は、プライマ
ーの伸長反応を妨げない位置であればどこでもよいが、
好ましくは５′末端である。

標識物質としては、非放射性、放射性物質のどちらを
用いてもよい。

非放射性の標識物質としては、例えば後記実験例で示
したフルオレセインおよびその誘導体〔フルオレセイン
イソチオシアネート（FITC）〕、ローダミンおよびその
誘導体〔例えば、テトラメチルローダミンイソチオシア
ネート（TRITC）、テキサスレッド等、〕、４−フルオ
ロ−７−ニトロベンゾフラン（NBDF）およびダンシルな
どの螢光物質あるいは化学発光物質などがあり、いずれ
も公知手段（特開昭59-93098号、特開昭59-93099号各公
報参照）により、標識化を行うことができる。

また、放射性物質で標識する場合は、例えば¹³¹I、
¹³³I、¹⁴C、³H、³⁵S、³²P等の放射性同位元素を用いて
公知の手段により標識物質を導入することができる。

（ii）プライマーの伸長反応上記のプライマーのうち、プライマーが標識されてい
ないものを用いた場合、伸長反応は標識物質が導入され
た４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸であるデ
オキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン
酸、デオキシシチジン三リン酸およびチミジン三リン酸
のうち少くとも１種類を基質としてプライマーにとりこ
ませることがでる。また、標識されているプライマーを
用いる場合、標識または非標識の上記４種のデオキシリ
ボヌクレオチド三リン酸のうち少くとも一種類を基質と
して同様にプライマーにとりこませることができる。こ
の伸長反応にはE.コーリDNAポリメラーゼＩ、E.コーリD
NAポリメラーゼＩのクレイウー断片、T4 DNAポリメラ
ーゼ、あるいは逆転写酵素が使用できる。特に、高温で
伸長反応を行える耐熱酵素を用いればプライマーによる
標的配列認識の特異性を高めることもでき、点突然変異
等を検出する場合にもこの耐熱酵素が好ましい。

また、より高感度の検出が求められる時、特に検出対
象の塩基配列の量が少ない時は、核酸配列の増幅法を用
いることができる（特開昭62-281号公報）。すなわち、
上記記載の標識プライマーおよび標識モノヌクレオチド
三リン酸を使えば、容易に二種類の官能基（固相担体と
結合可能な部位または検出に用いる標識物質）を持たせ
た標的塩基配列を増幅して得ることができる。

また、上記プライマーの伸長反応によって得られた二
本鎖核酸を一本鎖にした後、再びプライマーによる伸長
反応を行なう工程を順次段階的に繰り返して行なうこと
により、標識された合成核酸鎖が増幅され、検出感度を
高めることができる。

また、プライマーの伸長反応が正しく目的の位置で始
まるためには、プライマーと鋳型（すなわち目的核酸
（Ｉ））との間での相補性の度合、プライマーの長さ、
反応温度、などの因子を考慮しなければならない。一般
に、プライマーの長さが短い場合や、相補性の度合が低
い場合は、反応をより低い温度にしなければならないこ
とはいうまでもない。

また、プライマーの伸長反応をより正しい目的の位置
で行わせるためには、最初のプライマー（核酸（II））
の伸長反応以降に、得られる二本鎖核酸について、これ
を一本鎖にした後、目的核酸（Ｉ）の、核酸（II）とハ
イブリダイズする塩基部分より５′側の塩基部分と相補
的で、該塩基部分より短いが該塩基部分と特異的にハイ
ブリダイズするのに充分な長さの一本鎖核酸（核酸（II
I））を用いてさらに新たな伸長反応を行うことが好ま
しい。

さらに、本法を用いて点突然変異などを検出する場合
は、上記に増してプライマーの伸長条件を考慮しなけれ
ばならない。たとえばプライマーと目的核酸（Ｉ）との
間で形成した二本鎖（完全に相補的である場合とそうで
ない場合）の安定性に差を出すために反応液にDMSOを加
えたり、競合プライマー（目的核酸（Ｉ）中の点突然変
異を調べる場合、正常の塩基配列に完全に相補的なプラ
イマーと点突然変異を起した塩基配列に完全に相補的な
プライマーの２種を混合してプライマーの伸長反応を行
う。この時、目的核酸（Ｉ）中の塩基配列が正常であれ
ば後者のプライマーが競合プライマーであり、逆に目的
核酸（Ｉ）中に塩基配列に点突然変異を生じている場合
は前者が競合プライマーとなる。）を加えて伸長反応を
行う必要がある。

c.固体吸着剤本発明でいう固体吸着剤は、上記プライマーの伸長反
応液中の標識物質を導入した合成核酸（二本鎖）と標識
物質を導入したプライマー、または標識物質を導入した
合成核酸（二本鎖）と標識物質を導入した単位核酸とを
容易に分離できるものであれば何であってもよい。これ
らの条件を満たすものとしては、ゲルロ渦法に使用され
る担体やイオン交換法に使用される担体が考えられる。
これらの固体吸着剤は、特に標識物質を導入した合成核
酸と標識物質を導入した単位核酸を分離するのにはふさ
わしいが、標識物質を導入した合成核酸と標識物質を導
入したプライマーを分離する場合には必ずしも好ましく
ない。後者の場合にふさわしいものとしてはヒドロキシ
アパタイトや逆相系の固体吸着剤、例えば、シリカゲル
誘導体などがあげられる。ヒドロキシアパタイトは従来
より一本鎖DNAと二本鎖DNAの分離に用いられ、低リン酸
緩衝液中では二本鎖DNAのみ吸着され、リン酸緩衝液の
濃度を上げると二本鎖DNAも溶出してくる｛Y.Miyazawa,
Thomas,C.A（1965）J.Mol.Biol.11,223.,M.McCallum,P.
M.B.Walker（1967）Biochem.J.105,163｝。

一方、逆相系の固体吸着剤であるシリカゲル誘導体、
特にオクタデシルシランは高速液体クロマトグラフィー
に頻繁に利用されており、親水性または疎水性の差で物
質を分離することができる。ところで核酸上について考
えると二本鎖DNAは塩基同士で水素結合し、塩基間では
スタッキングして、さらにリン酸ジエステルは二本鎖の
外側に位置していることから一本鎖DNAよりも親水的で
ある。それゆえ上記シリカゲル誘導体、例えばオクタデ
シルシラン等を用いれば容易に一本鎖DNAと二本鎖DNAと
を分離する事ができ、しかも二本鎖DNAを最初に溶出さ
せることができる。

ここでいう、逆相系の固体吸着剤とは、シリカゲル等
に、ジメチルシラン、オクタデシルシラン、オクチルシ
ラン等の炭素数１〜18の炭化水素残基を持つシランを化
学結合させたものや、スチレン−ジビニルベンゼン系共
重合体あるいはゲル過剤等、極性の小さい樹脂からな
るものである。また、必要に応じて第１図に示したよう
な装置を用いれば、既存の後退の分野で使用されている
機器（たとえばプレート洗浄機）と組み合わせることに
より、一連の操作を自動化することができる。この場
合、固体吸着剤２はテーパーを有するチップ１に、フィ
ルター3,3を使用して充填してある。

d.検出方法プライマーの伸長反応で得られた標識合成核酸（二本
鎖）と標識物質をもつ他のものとを固体吸着剤を用いて
分離する場合、次の二通りがある。（ｉ）標識合成核酸
が標識物質をもつ他のものより先に溶出する場合（ある
いは標識合成核酸のみが選択的に固体吸着剤に吸着され
ないで溶出する場合）。（ii）標識合成核酸が標識物質
をもつ他のものよりも後に溶出する場合。

（ｉ）の場合は最初に溶出した液をそのまま、（ii）
の場合は標識合成核酸以外の標識物質をもったもので十
分洗浄して除いたあと標識合成核酸を溶出し、その液中
に含まれる標識物質を測定すれば良い。標識物質アイソ
トープである場合はシンチレーターを用いて、螢光、あ
るいは発光物質である場合それぞれに応じた既知の測定
法で測定する。また、一度に複数の目的核酸を検出する
場合は、それぞれの標識物質に対応する測定は同一試料
を用いて行うことが出来る（たとえばそれぞれの標識物
質が螢光特性の異る螢光物質で標識されている場合、そ
れぞれのけい光物質に合った励起波長と螢光波長を選べ
ば良い）。

実際には、第１図に示したような受器５または５′を
使用し、標識物質がアソイソトープである場合はベータ
プレート^Ｒ（LKB）等の機器、標識物質が螢光分質であ
る場合はマイクロプレート用自動螢光測定装置を使用す
れば良い。上記受器５または５′を使用する場合、固体
吸着剤２を充填した前記チップ１をマイクロタイターウ
ェル状のもの４に装着し、これを図示したように上記受
器５または５′に被せるようにして使用すれば良い。な
お、図中Ｂは、標識合成核酸（二本鎖）を溶出させる場
合であり、またＡは標識プライマーあるいは標識単位核
酸を溶出する場合である。

実験例実施例１一本鎖DNAと二本鎖DNAの分離をオクタデシルシラン
（マイクロボンダパックC18,ウォーターズ社）を用いて
行った。

試料1;オリゴデオキシヌクレオチドをT₄ポリヌクレオチドキナーゼと〔γ−³²P〕ATPで５′
末端標識した。

試料2;制限酵素HindIIIで切断すると3000bdと250bpのフ
ラグメントが得られるプラスミドをWindIIIで切断し、
E.Coli DNAポリメラーゼのクレナウフラグメントと〔α
‐³²P〕dCTP,dATP,dGTPおよびdCTPを用いてそれぞれの
フラグメントの両末端を標識した。

試料3;ヒトの胎盤のDNA（１μｇ）、試料１と同様³²Pで
標識したオリゴデオキシヌクレオチド（300ng）、オリゴヌクレオチド（300ng）およびTaq DNAポリメラーゼ（NEB社）を用い
て、NEB社のプロトコールに従って上記２種のプライマ
ーによって夫々の方向よりβ‐グロビン遺伝子の一部を
増幅した。

ピペットチップ（1ml用）の先端にシリコナイズした
グタスウールをつめ（第１図参照）、エタノールに懸濁
したC18樹脂（100μ１）を加え、添加用溶液（50mM NaC
l、10mM Tris・HCl pH8.0,1mM EDTA pH 8.0;1ml）で洗
浄した。これにそれぞれの試料（100μ１、NaClの濃度
が50mMになるように調整した）を添加した。さらに添加
用溶液（500μ１）を添加し、溶出した液を一緒にして
溶出液１とした。次に３％エタノールを含む添加用溶液
（500μ１）を添加し、溶出した液を溶出液２とした。
以下溶出液のエタノール濃度を段階的に上げて溶出を行
なった。溶出液3:5％エタノール・添加用溶液（500μ
１）、溶出液4:10％エタノール・添加用溶液（500μ
１）、溶出液5:15％エタノール・添加用溶液、溶出液6:
20％エタノール・添加用溶液。それぞれの溶出液同量を
とり、５％ポリアクリルアミド電気泳動を行なって分離
状況を調べた。得られたＸ線のオートラジオグラムの結
果を第２図に示した。試料１の分析結果から一本鎖DNA
であるは10％エタノール・添加用溶液（溶出液４）から溶出す
ることがわかった。また試料２の分析結果から二本鎖DN
Aは５％エタノール・添加用溶液（溶出液３）で溶出す
ることがわかった。さらに、試料３の分析結果から５％
エタノール・添加用溶液（溶出液３）ではDNAポリメラ
ーゼ反応のよって合成された二本鎖DNAのみ溶出され、1
0％エタノール・添加用溶液（溶出液４）では、合成さ
れた二本鎖DNAとわずかのプライマーが溶出されること
がわかった。

実施例２螢光物質で標識したオリゴデオキシヌクレオチドの逆
相系（オクタデシルシラン）での挙動を調べた。

３′末端にアミノ基をもつオリゴデオキシヌクレオチド
の合成ならびにそれの螢光標識化は特開昭59-93098号、
特開昭59-93099号各公報に従って行った。また、５′末
端アイソトープ標識は実施例１（試料１）と同様に行っ
た。

逆相系での挙動を調べる実験は、実施例１とほぼ同様
にして溶出液1:添加用溶液（500μ１）、溶出液2:5％エ
タノール・添加用溶液（500μ１）、溶出液3:10％エタ
ノール・添加用溶液（500μ１）、溶出液4:15％エタノ
ール・添加用溶液（500μ１）、溶出液5:20％エタノー
ル・添加用溶液（500μ１）、溶出液6:30％エタノール
・添加用溶液（500μ１）を用いて行った。得られたオ
ートラジオグラムの結果を第３図に示した。この結果よ
り、オリゴデオキシヌクレオチドに螢光標識が導入され
ると10％エタノール・添加用溶液（溶出液３）ではほと
んど溶出されず、FITC標識（試料３）の場合特に顕著で
あることがわかった。

実施例３５′末端螢光標識オリゴデオキシヌクレオチドの逆相
系での挙動を螢光を測定することにより調べた。特開昭
59-93098、特開昭59-93099号公報に従って５′末端にフ
ルオレッセインを導入したを合成した。これを実施例２とまったく同様条件で逆相
系にかけ溶出した。溶出液の螢光強度を励起波長489n
m、発光波長520nmで測定した。その結果を以下に示し
た。

相対強度溶出液１ 1 溶出液２ 1 溶出液３ 2 溶出液４ 697 溶出液５ 1242 溶出液６ 146 本結果より５′末端螢光標識オリゴデオキシヌクレオ
チドは10％エタノール・添加用溶液（溶出液３）ではま
ったく溶出されないことがわかった。

実施例４ DNAポリメラーゼによるプライマーの伸長反応を用い
た遺伝子の検出法でヒトのβ‐グロビン遺伝子を検出し
た。

試料1:ヒトの胎盤のDNA（１μｇ）、（300ng）およびをTaq DNAポリメラーゼを含まない反応液（NEB社のプロ
トコールに従って調整したもの。全量100μ１）に加え
た。

試料2:サケ精子DNA（１μｇ）、（300ng）、（300ng）およびTaq DNAポリメラーゼ（NEB社）を用い
てNEB社のプロトコールに従って遺伝子増幅を行った。
（増幅回数:20回、全液量:100μ１）試料3:ヒト胎盤のDNA（１μｇ）、（300ng）、（300ng）およびTaq DNAポリメラーゼ（NEB社）を用い
てNEB社のプロトコールに従って遺伝子増幅を行った
（増幅回数:20回、全液量:100μ１）。試料１〜試料３
で使用したプライマーはすべて同じものの組み合わせで
あり、ヒトβ‐グロビン遺伝子増幅用のものである。

これらの試料（50μ１）に添加用溶液（450μ１）を
加えて実施例１と同様に調整した逆相樹脂に添加した。
添加用溶液（500μ１）および５％エタノール・添加用
溶液（500μ１）で洗浄したのち、10％エタノール・添
加用溶液（500μ１）で溶出した。得られた溶出液に1M
Tris・HCl（pH9.5:25μ１）を加えてpHをおよそ8.5と
し、螢光強度を励起波長489nm、螢光波長520nmで測定し
た。その結果を以下に示した。

試料１試料２試料３相対強度３ 30 111 この結果により、本法を用いてヒトDNA中のβ‐グロ
ビン遺伝子を検出できることがわかった。

実施例５ DNAポリメラーゼによるプライマーの伸長反応を用い
た遺伝子の検出法で、ヒトのβ−グロビン遺伝子の突然
変異を検出した。テンプレートとしてはβ‐グロビン遺
伝子に点変異を生じた遺伝子をもつプラスミドpBR322-H
βＳ｛Nucleic Acids Res.93647-3656（1981）｝を使用
し、プライマーとしては正常な遺伝子と完全に相補的で
FITCで標識した（Ｆ−GA）、点変異のある遺伝子と完全に相補的な（Ｆ−GS）、および両方の遺伝子に共通なを使用した。また競合プライマーとしてＦ−GAに対して
はGSを、Ｆ−GSに対してはGAを使用した。

反応1:制限酵素EcoRIで切断したpBR322-HβＳ（20n
g）、PG2（300ng）、Ｆ−GA（300ng）およびGS（300n
g）を反応液｛67mM Tris・HCl pH8.8:6.7mM MgCl₂、16.
6mM (NH4)₂SO₄、10mM β‐メルカプトエタノール、6.7
mM EDTA、200μＭ dATP、200μＭ dGTP、200μＭ d
CTP、200μＭ TTP、10％DMSO｝に加え（全液量:49μ
１）、95℃で５分間加熱変性した。65℃で１分間アニー
リングしたのちTaqポリメラーゼ（NEB社、20/μ１、１
μ１）を加え73℃で２分間プライマーの伸長反応を行っ
た。次に、92℃で１分間変性し、65℃で１分間アニーリ
ングした。以後、変性、アニーリング、伸長反応を同様
にして20回繰り返した。

反応2;制限酵素EcoRIで切断したpBR322-HβＳ（20n
g）、PG2（300ng）、Ｆ−GS（300ng）およびGA（300n
g）を用いて反応１とまったく同様の反応条件で伸長反
応を20回繰り返した。

それぞれの反応液（50μ１）に添加用溶液（450μ
１）を加えて実施例１と同様にして調整した逆相樹脂に
添加した。実施例４と同様にして10％エタノール・添加
用溶液（500μ１）で溶出し、1M Tris・HCl（pH9.5、25
μ１）を加えてpHをおよそ8.5とし、螢光強度を励起波
長489nm、発光波長520nmで測定した。その結果を以下に
示した。

反応１反応２相対強度 45 132 以上の結果よりＦ−GSをプライマーとした反応２の方
が、Ｆ−GAをプライマーとした反応１より圧倒的に伸長
反応生成物が多い事から、プラスミドpBR322-HβＳはグ
ロビン遺伝子に点突然変異が生じたものであることが判
定できた。

また上の結果を確かめるために、反応１または反応２
のＦ−GAまたはＦ−GSを³²Pで標識して同様に伸長反応
を行った｛反応3:pBR 322-HβＳ（20ng）、³²P‐GA（30
0ng）、GS（300ng）反応4:pBR322-HβＳ（20ng）、³²P
‐GS（300ng）、GA（300ng）｝。得られた反応液を５％
ポリアクリルアミド電気泳動で分析したところ、（第４
図）、反応４において主に伸長反応生成物が得られ、反
応1,2の結果と一致した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、マイクロプレート用自動機器に対応可能な、
固体吸着剤を充填したマイクロプレートを示す説明書で
ある。第２図は、PCR方により増幅されたβ′−グロビ
ン遺伝子の核酸（II）との分離結果を示すオートラジオ
グラムを模写したものである。第３図は、オリゴヌクレ
オチドの螢光物質の違いによる逆相系吸着剤上での挙動
変化を示すオートラジオグラムを模写したものである。
第４図は、PCR反応による点突然変異を識別するオート
ラジオグラムを模写したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の工程（イ）〜（リ）を実施すること
を特徴とする、検体中の少なくとも一つの目的核酸の検
出法。（イ）少なくとも一つの目的核酸（以下、核酸（Ｉ）と
いう）存在の有無を検知しようとする検体を用意するこ
と。（ロ）核酸（Ｉ）が二本鎖の場合は各鎖に対して相補的
であり、核酸（Ｉ）が一本鎖の場合は核酸（Ｉ）および
核酸（Ｉ）と相補的な核酸の各鎖に対して相補的であ
り、、かつ核酸（Ｉ）よりは短いが核酸（Ｉ）と特異的
にハイブリダイズするのに充分な長さの一対の一本鎖核
酸（以下、核酸（II）という）を用意すること。（ハ）工程（イ）の検体を、核酸（Ｉ）が一本鎖核酸で
あればそのままで、これが二本鎖核酸であれば一本鎖に
してから次の工程に供すること。（ニ）前の工程で得られる一本鎖核酸に核酸（II）をハ
イブリダイズさせ、単位核酸の存在下で該一本鎖を鋳型
として核酸（II）の鎖長を伸長させて二本鎖核酸（二本
鎖のうち鎖長の伸長によって生成した核酸鎖を合成核酸
鎖という（以下、同様））を形成させるか、必要に応じ
て、該二本鎖核酸を一本鎖にした後に合成核酸鎖同士を
ハイブリダイズさせて、二本鎖核酸を得ること。（ホ）工程（ニ）で得られる二本鎖核酸を一本鎖にする
こと。（へ）工程（ホ）で得られる一本鎖核酸を用いて、工程
（ニ）を行うか、工程（ニ）および（ホ）の操作を順次
段階的に繰り返し行い、最終的に工程（ニ）に相当する
段階でこの繰り返しを終了して二本鎖核酸を得ること。（ト）工程（ニ）または（ヘ）の産物である二本鎖核酸
に下記のいずれかの手段によって、検出可能な標識から
なる官能基を持たせること。（ｉ）官能基を持つ核酸（II）を使用する。（ii）官能基を持たない核酸（II）を使用する場合は、
官能基を持つ単位核酸の使用によって、該合成核酸鎖を
官能基を持つものとして得る。（チ）官能基をもつ二本鎖核酸を含む検体を二本鎖核酸
と一本核酸鎖および単位核酸とに対して選択的吸着能を
持つ固体吸着剤に接触させて、該二本鎖核酸と一本鎖核
酸および／または単位核酸とを分離すること。（リ）工程（チ）より得られる官能基をもつ二本鎖核酸
を、該標識からなる官能基を利用する検出操作に付し
て、この核酸の有無を、検出すべき核酸に対応するもの
として検知すること。
【請求項２】核酸（II）の伸長反応以降に、得られる二
本鎖核酸について、これを一本鎖にした後、目的核酸
（Ｉ）の、核酸（II）とハイブリダイズする塩基部分よ
り５′側の塩基部分と相捕的で、該塩基部分より短いが
該塩基部分と特異的にハイブリダイズするのに充分な長
さの一本鎖核酸（以下、核酸（III）という）を用いて
さらに新たな伸長反応を行い、工程（ト）を核酸（II）
または（III）について行う、特許請求の範囲第１項に
記載の検出法。
【請求項３】固体吸着剤が逆相系の吸着剤である特許請
求の範囲第１項または第２項に記載の検出法。
【請求項４】逆相系の吸着剤がシリカゲル誘導体である
特許請求の範囲第３項記載の検出法。