JPH01314965A - 検体中の目的核酸の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、いわゆるハイブリダイゼーション法を用いな
いで特定の遺伝子の塩基配列を検出する方法に関する。

より詳細には、検出すべき核酸配列に相補的な少くとも
１種のプライマーを用いて、核酸配列に相補的なプライ
マーの伸長反応を行って得られるに本鎖核酸またはプラ
イマーの伸長生成物同士で形成された二本鎖核酸を、一
本鎖核酸あるいは単位核酸と分離することによって、検
出すべき核酸を検出する方法に関する。

先行技術 遺伝子の分子生物学の急速な進歩に伴い、特定の遺伝子
の塩基配列を検出することはきわめて重要なものとなっ
てきている。例えば、遺伝病の出生前診断、癌の分子レ
ベルでの診断あるいはウィルスのような病原体の検出に
おいて遺伝子の検出を行うことは重大な意義がある。

このような遺伝子の検出を行うには、一般的にはハイブ
リダイゼーションと呼ばれる方法が使われる（Ｂ、Ｄ、
　Ｈａｉｅｓ　　およびＳ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ　：
Ｍｕｅｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｌｏ
ｎ、　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＪ
？Ｌ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８５　）　Ｏこの方法は、標
識配列と相補的な塩基配列をもつ単鎖あるいは相補鎖を
放射性あるいは非放射性の標識物質で標識し、そののち
標的配列との相補性を利用して結合させて、すなわちハ
イブリダイズさせて、標的配列を検出する方法である。

この場合、一般的には、標的物質を担体に固定するドッ
トハイフリダイゼーション法（ＤＮＡ、　４．３２７−
８３１．　（Ｉ９８５）　）あるいはサザンハイプリダ
イゼーション法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、
　ｐ３８２．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　（Ｉ９８２））等が行われる。しかしながら、これら
の方法は煩雑て手間がかかり、機械化の努力もされてい
るにもかかわらず、未だに多数の試料をルーチン作業と
して分析することは不可能である。これらの問題を解消
するためにプローブを担体に固定するハイブリダイゼー
ション法が工夫されているが〔例えば％　Ｔ、Ｒ，Ｇｉ
ｎｇｅｒａｓら：　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ。

旦、　５３７３−５３９０　）　、このような液相−固
相間のハイブリダイゼーションには限界があり、感度等
の点で実際に応用できる方法とはなり得ていない。

これらの液１目−固相聞のハイブリダイゼーションの欠
点を克服するためにサンドイッチ型の液相一液相ハイブ
リダイゼーションが工夫されている〔例えば、Ａｎｎ−
Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ　５ｙｖａｅｎｅｎら；、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｉ？ｅｓ、１４．５０３７−５０
４８　（Ｉ９８Ｂ）、特開昭６２−２２９０６８号公報
〕。しかしながら、これらの方法も、プローブを大過剰
に使う事から来る高いバックグラウンドや感度の点で、
満足のいくものとはなり得ていない。

また、感度を向上させるために、特定の核酸配列を増幅
する方法が開発されているが（特開昭６２−２８１号公
報）、この方法においてもハイブリダイゼーションの操
作は必要であって、煩雑さを減じることになっていない
。

〔発明の概要〕

要旨 本発明は、上記問題点を解決し、特定の塩基配列を容易
にしかも感度よく検出する方法を与えることを目的とし
、検出すべき核酸配列に相補的な少くとも１種のプライ
マーを用いて、該核酸配列に相補的なプライマーの伸長
反応を行って得られるに本鎖核酸、またはプライマーの
伸長生成物同士で形成された二本鎖核酸を、一本鎖核酸
（プライマー）あるいは鎖長伸長用単位核酸と分離した
後、二本鎖核酸の存在を調べることにより目的の核酸配
列を検出する方法である。

即ち本発明による核酸配列の検体中の検出法は、下記の
工程（イ）〜（ヲ）を実施することを特徴とするもので
ある（ただし、工程（ハ）〜（ル）は、目的の核酸配列
が存在するものとして実施するものとする）。

（イ）少くとも一つの目的核酸（以下、核酸（Ｉ）とい
う）存在の有無を検知しようとする検体を用意すること
。

（ロ）核酸（Ｉ）と相補的で、該核酸よりは短いが該核
酸と特異的にハイブリダイズするのに充分な長さの一本
鎖核酸（以下、核酸（ＩＩ）という）を用意すること。

（ハ）該検体中において、核酸（Ｉ）を、これが一本鎖
のものであればそのままで、これが二本鎖のものであれ
ば一本鎖にしてがらその少なくとも一方について、核酸
（ＩＩ）とハイブリダイズさせ、この核酸（Ｉｆ）をブ
ライマーとしてぞこへ単位核酸を付加させることによっ
て鎖長を伸長させて、生成合成核酸鎖と核酸（Ｉ）との
二本鎖核酸を形成させること。

（ニ）必要に応じて、核酸（Ｉ）が二本鎖のものであっ
たときに各鎖について工程（ロ）および（ハ）を実施し
て得られるに種の二本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離さ
せた後、該検体中において、その生得的な相補性を利用
して相互にハイブリダイズさせること。

（ホ）必要に応じて、工程（イ）〜（ハ）または（イ）
〜（ニ）を実施して得られるに本鎖核酸について、これ
を一本鎖にした後、その少くとも一方について、核酸（
Ｕ）とハイブリダイズさせ、そこへ単位核酸を付加させ
ることによって鎖長を伸長させて二本鎖核酸を形成させ
るか、あるいはこの二本鎖核酸の形成工程を核酸（Ｉ）
の各鎖について実施して得られるに本鎖核酸から該合成
核酸鎖を遊離させた後、核酸（Ｉ）の各鎖とハイブリダ
イズしていた合成核酸鎖同志を、該検体中において、そ
の生得的な相補性を利用して相互にハイブリダイズさせ
て二本鎖核酸を形成させること。

（へ）必要に応じて、（ホ）を実施した後、最終的に得
られるに本鎖核酸について、これを一本鎖にして、その
少くとも一方について、核酸（ＩＩ）とハイブリダイズ
させ、そこへ単位核酸を付加させることによって鎖長を
伸長させて二本鎖核酸を形成させるか、あるいはこの二
本鎖核酸の形成工程を核酸（Ｉ）の各鎖について実施し
て得られるに本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離させた後
、核酸（Ｉ）の各鎖とハイブリダイズしていた合成核酸
鎖同志を、該検体中において、その生得的な相補性を利
用して相互にハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成さ
せることから成る工程を、１回行うかまたは複数回にわ
たって順次段階的に繰り返して行なうこと。

（ト）必要に応じて、核酸（Ｉ）の核酸（ＩＩ）とハイ
ブリダイズする塩基部分より５′側の塩基部分と相補的
で、該塩基部分より短いが該塩基部分と特異的にハイブ
リダイズするのに充分な長さの一本鎖核酸（以下核酸（
Ｉ［［）という）を用意すること。

（チ）必要に応じて、工程（イ）〜（ハ）、（イ）〜（
ニ）、（イ）〜（ホ）、または（へ）を実施して得られ
るに本鎖核酸について、これを一本鎖にした後、その少
くとも一方について、核酸（ＩＩＩ）とハイブリダイズ
させ、そこへ単位核酸を付加させることによって鎖長を
伸長させて二本鎖核酸を形成させるか、あるいはこの二
本鎖核酸の形成工程を核酸（Ｉ）の各鎖について実施し
て得られるに本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離させた後
、核酸＜１）の各鎖とハイブリダイズしていた合成核酸
鎖同志を、該検体中において、その生得的な相補性を利
用して相互にハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成さ
せること。

（す）必要に応じて、（チ）を実施した後、最終的に得
られるに本鎖核酸について、これを一本鎖にして、その
少くとも一方について、核酸（Ｉｆｆ）および／または
（ＩＩ）とハイブリダイズさせ、そこへ単位核酸を付加
させることによって鎖長を伸長させて二本鎖核酸を形成
させるか、あるいはこの二本鎖核酸の形成工程を核酸（
Ｉ）の各鎖について実施して得られるに本鎖核酸から該
合成核酸鎖を遊離させた後、核酸（Ｉ）の各鎖とハイブ
リダイズしていた合成核酸鎖同志を、該検体中において
、その生得的な相補性を利用して相互にハイブリダイズ
させて二本鎖核酸を形成させることから成る工程を、１
回行うかまたは複数回にわたって順次段階的に繰り返し
て行なうこと。

（ヌ）工程（ハ）（ニ）（ホ）（へ）（チ）（ワ）のい
ずれかによる産物である二本鎖核酸に、下記のいずれか
の手段によって、検出可能な標識からなる官能基を持た
せること。

（ｉ）官能基を持つ核酸（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を使
用する。

（Ｉ１）官能基を持たない核酸（ＩＩ）または（Ｉ［Ｉ
）を使用する場合は、官能基を持つ単位核酸の使用によ
って、該合成核酸鎖を官能基を持つものとして得る。

（ｊｔｉ）該合成核酸鎖を官能基を持たないものとして
形成させ、その後、そこへ、該検体中において、官能基
を導入する。

（ル）官能基をもつ二本鎖核酸を含む検体を二本鎖核酸
と一本鎖核酸および単位核酸とに対して選択的吸着能を
持つ固体吸着剤に接触させて、該二本鎖核酸と一本鎖核
酸および／または単位核酸とを分離すること。

（ヲ）工程（ル）より得られる官能基をもつ二本鎖核酸
を、該標識からなる官能基を利用する検出操作に付して
、この核酸の有無を、検出すべき核酸に対応するものと
して検知すること。　　・ 効果 本発明においては、先に出願した方法（特願昭６２−３
２８７８５号明細書参照のこと）同様、検体中の一種以
上の目的核酸の存在の有無を同時にしかも迅速に検出で
きる点に特徴がある。

本発明による核酸配列の検出法は、前記で定義したよう
に、ポリメラーゼなどを用いた一連の反応で、標識した
検出対象物の複製物（標識二本鎖核酸）を得、これを適
当な固体吸着剤を用いて検体中の標識一本鎖ブライマー
あるいは標識単位核酸から分離して目的の標識二本鎖核
酸のみを検出することからなり、いわゆるハイブリダイ
ゼーション法という煩雑な操作を必要とせず、現在、他
の分野例えば抗原抗体反応の分野で利用されている装置
を容易に水洗に応用することができる。その結果、−度
に多検体を分析することができる。

そして、核酸のハイブリダイゼーションやゲル電気泳動
での核酸の分離を必要としないため、゛核酸を含む試料
は粗精製の状態でよく、試料の調製も容易で、装置を用
いて行うことができる。

また、本発明ではハイブリダイゼーションを行わないで
ブライマーによる伸長反応を行うために、分析時間を大
幅に短縮することができる。また、本測定法においてあ
らかじめ用意しておく標識物質としては、標識化ブライ
マーあるいは標識化モノヌクレオチドでいずれも化学的
に大量合成でき、従来のハイブリダイゼーション法のよ
うに天然のＤＮＡフラグメントを酵素等を使って標識す
る必要はない。

さらに、それぞれの検出しようとする試料中において、
目的核酸（Ｉ）の塩基配列が微妙に（−塩基以上）異な
る場合も、ポリメラーゼ等の反応条件を適当に調節する
ことにより、ブライマーが目的核酸に完全に相補的であ
る場合とそうでない場合を区別することができる。つま
り、ハイブリダイゼーション法等によらないで容易に点
突然変異をも検出することができる。

そして、それぞれ官能基の異なる標識物質で標識された
複数のブライマーを使用すれば、同時に一種類以上の目
的核酸（Ｉ）に対する伸長反応を行う事ができ、それぞ
れの標識物質の官能基を利用する検出操作を行う事によ
って、同時に多数の　　。

目的核酸の存在の有無を調べる事ができる。

〔発明の詳細な説明〕

検出原理 本発明による目的核酸の検出法は前記の工程（イ）〜（
ヲ）を含んでなるが、この方法は、（ｉ）検体中の目的
核酸（核酸（Ｉ）という）からそれと相補的な核酸を検
体中でつくって（この核酸を合成核酸という）二本鎖を
形成させ、それについて検出を行うこと、（Ｉ１）検体
中の合成核酸を作る際にプライマーあるいは鎖長伸長用
単位核酸を適当な官能基をもつ標識物で標識しておくこ
とにより合成核酸を標識物質を持つものとして得ること
、あるいは事後的に標識物質を導入すること、（ｉｆｆ
）上記（ｉｉ）で得られた標識物質を導入した合成核酸
を適当な固体吸着剤を用いて標識物質をもつ一本鎖プラ
イマーあるいは単位核酸から分離して、目的とする標識
合成核酸を選択的に検出することを基本原理とするもの
である。

このように、適当な官能基で標識したプライマーあるい
は単位核酸を用いてポリメラーゼによる伸長反応を行っ
た場合、反応液中の標識物質は、合成核酸とプライマー
あるいは単位核酸だけに存在する（合成核酸は、目的核
酸と二本鎖を形成しているか、あるいは合成核酸同士で
二本鎖を形成している）。そこで、該合成核酸とプライ
マーとを分離する場合は、二本鎖核酸と一本鎖核酸を分
離できる固体吸着剤を用いればよいし、合成核酸と単位
核酸を分離する場合二本鎖核酸と単位核酸とをそれぞれ
分離できる固体吸着剤を用いれば良い。

このようにして、目的核酸の塩基配列を写しとった合成
核酸を、それに導入された標識物質を用いて検出するこ
とによって目的核酸を検出することができる。なお、検
体中に目的核酸が存在しなければ、標識物質が導入され
た合成核酸が生成しないことから、検出結果は、検体中
には目的核酸不在となる。

このような選択検出性を実現すべき前記官能基の導入は
、所謂ブライマー（前記の核酸（■））を使用して、た
とえば目的核酸がＤＮＡであればそれを一本鎖にしてか
らＤＮＡポリメラーゼにより、目的核酸がＲＮＡであれ
ば逆転写酵素によって、プライマーから鎖長を伸長させ
、その際に、プライマーとして官能基をもつものあるい
はもたないものを使用し、鎖長延伸の際のモノマーない
し単位核酸として官能基をもつものまたはもたないもの
を使用して、これらの適宜な組合せにより最終的に該合
成核酸を官能基を持つものとして得ることによって行う
ことができる。このようにして得られる官能基を持つ合
成核酸鎖の具体例を挙げれば、目的核酸（Ｉ）が二本鎖
である時に一方または両方の鎖について、また、一本鎖
であるときにはそれについて、官能基を持つプライマー
あるいは持たないプライマー（核酸（■））をハイブリ
ダイズさせ、そこへ単位核酸としてｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラー
ゼを働かせて該プライマーの鎖長を伸長させる際に、必
要に応じて（官能基を持たないプライマーを用いる場合
は必ず）単位核酸の一個ないし一種あるいは複数個ない
し複数種に標識を持たせたものを使用して原ＤＮＡ鎖と
合成核酸鎖との二本鎖としたもの、二本鎖ＤＮＡ鎖の一
方について上記の通りに二本鎖構造体をつくり、他方の
ＤＮＡ鎖についても上記の通りに二本鎖構造体をつくり
、両二水路構造体から原ＤＮＡ由来の鎖を除去して合成
鎖を遊離させ、両合成鎖をハイブリダイズさせて、プラ
イマーから供給された官能基を持つ二本鎖としたもの（
（遊離させた各合成鎖についてプライマーの付加および
（または）鎖長の伸長ないし合成鎖の形成を行って、合
成鎖からなる二本鎖の増幅を行うこともできる））、そ
の他がある。また官能基の導入は、その他の合目的的な
方法によって実施することができ、目的とする合成核酸
を形成させた後、任意の官能基を導入することもできる
。このような反応において、導入される官能基は少くと
も一種類で良い。

また、ポリメラーゼによるプライマーの延伸反応は、別
々の官能基または同一の官能基をもつそれぞれ別々のプ
ライマーを用いて、同−検体中復数個の目的核酸（Ｉ）
に対して同時に検出を行うこともできる。

検出の実際 ａ、核酸 本発明でいう検出すべき核酸とは、検出しようとする塩
基配列を含むものであって、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい
。このような核酸は大腸菌、ビールスおよび高等動植物
などあらゆる生命体から調製することができる。また、
上記核酸を、本検出法に用いる場合、核酸は精製されて
いても、されていなくてもよい。

ｂ、プライマーおよびその伸長反応 （ｉ）プライマー（核酸（■）） 本発明でいうプライマーは、検出しようとする上記核酸
の塩基配列（ＤＮＡの場合は変性などの手段により、日
水路核酸配列を一本鎖にする必要がある）と特異的に相
補鎖を形成し、その３′末端にモノヌクレオチドが順次
付加されるもので、３′末端の水酸基が不可欠である。

一般に、プライマーとはオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドのことをさすが、天然から得られる長鎖のＤＮＡフラ
グメントでもよい。目的核酸（核酸（Ｉ））と特異的に
ハイブリダイズするのに充分な長さのものであるべきで
ある。

点突然変異を検出しようとする場合は、点突然変異を起
した目的核酸と特異的にハイブリダイズするのに充分な
長さを有し、かつ完全に相補的なプライマー及び点突然
変異を起してない該核酸と特異的にハイブリダイズする
のに充分な長さを有し、かつ完全に相補的なプライマー
の二種を用いる。これらのプライマーはいずれもオリゴ
デオキシリボヌクレオチドである。

この様な一連のプライマーの具体例としては何も修飾さ
れていないプライマーまたは標識物質が導入されたプラ
イマーを用いることができる。

なお、ここでいうプライマーの標識物質は、プライマー
の伸長反応を妨、げない位置であればどこでもよいが、
好ましくは５′末端である。

標識物質としては、非放射性、放射性物質のどちらを用
いてもよい。

非放射性の標識物質としては、例えば後記実験例で示し
たフルオレセインおよびその誘導体〔フルオレセインイ
ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）］、ローダミンおよびそ
の誘導体〔例えば、テトラメチルローダミンイソチオシ
アネート （ＴＲＩＴＣ）　、テキサスレッド等〕、４−フルオロ
−７−二トロペンゾフラン（ＮＢＤＦ）およびダンシル
などの螢光物質あるいは化学発光物質などがあり、いず
れも公知手段（特開昭５９−９３０９８号、特開昭５９
−９３０９９号各公報参照）により、標識化を行うこと
ができる。

また、放射性物質で標識する場合は、例えば１３１０．
１３３工、１４ｃ、３Ｈ１３５ｓ、３２Ｐ等。放射性同
位元素を用いて公知の手段により標識物質を導入するこ
とができる。

（ｉｆ）プライマーの伸長反応 上記プライマーのうち、プライマーが標識され・ていな
いものを用いた場合、伸長反応は標識物質が導入された
４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸であるデオ
キシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸
、デオキシシチジン三リン酸およびチミジン三リン酸の
うち少くとも１種類を基質としてプライマーにとりこま
せることができる。また、標識されているプライマーを
用いる場合、標識または非標識の上記４種のデオキシリ
ボヌクレオチド三リン酸のうち少くとも一種類を基質と
して同様にプライマーにとりこませることかできる。こ
の伸長反応にはＥ、コーリＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ、
　　コーリＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ−断片、Ｔ
４　　ＤＮＡポリメラーゼ、あるいは逆転写酵素が使用
できる。特に、高温で伸長反応を行える耐熱酵素を用い
ればプライマーによる標的配列認識の特異性を高めるこ
ともでき、点突然変異等を検出する場合にもこの耐熱酵
素が好ましい。

また、より高感度の検出が求められる時、特に検出対象
の塩基配列の量が少ない時は、核酸配列の増幅法を用い
ることができる（特開昭６２−２８１号公報）。すなわ
ち、上記記載の標識プライマーおよび標識モノヌクレオ
チド三リン酸を使えば、容易に二種類の官能基（固相担
体と結合可能な部位または検出に用いる標識物質）を持
たせた標的塩基配列を増幅して得ることができる。

また、上記プライマーの伸長反応によって得られるに本
鎖核酸を一本鎖にした後、再びプライマーによる伸長反
応を行なう工程を順次段階的に繰り返して行なうことに
より、標識された合成核酸鎖が増幅され、検出感度を高
めることができる。

また、プライマーの伸長反応が正しく目的の位置で始ま
るためには、プライマーと鋳型（すなわち目的核酸（Ｉ
））との間での相補性の度合、プライマーの長さ、反応
温度、などの因子を考慮しなければならない。一般に、
プライマーの長さが短い場合や、相補性の度合が低い場
合は、反応をより低い温度にしなければならないことは
いうまでもない。

また、プライマーの伸長反応をより正しい目的の位置で
行わせるためには、最初のプライマー（核酸（■））の
伸長反応以降に、得られるに本鎖核酸について、これを
一本鎖にした後、目的核酸（Ｉ）の、核酸（ＩＩ）とハ
イブリダイズする塩基部分より５′側の塩基部分と相補
的で、該塩基部分より短いが該塩基部分と特異的にハイ
ブリダイズするのに充分な長さの一本鎖核酸（核酸（■
））を用いてさらに新たな伸長反応を行うことが好まし
い。

さらに、水洗を用いて点突然変異などを検出する場合は
、上記に増してプライマーの伸長条件を考慮しなければ
ならない。たとえばプライマーと目的核酸（Ｉ）との間
で形成した二本鎖（完全に相補的である場合とそうでな
い場合）の安定性に差を出すために反応液にＤＭＳＯを
加えたり、競合ブライマー（目的核酸（Ｉ）中の点突然
変異を調べる場合、正常の塩基配列に完全に相補的なプ
ライマーと点突然変異を起した塩基配列に完全に相補的
なプライマーの２種を混合してプライマーの伸長反応を
行う。この時、目的核酸（Ｉ）中の塩基配列が正常であ
れば後者のプライマーが競合プライマーであり、逆に目
的核酸（Ｉ）中の塩基配列に点突然変異を生じている場
合は前者が競合プライマーとなる。）を加えて伸長反応
を行う必要がある。

Ｃ０固体吸着剤 本発明でいう固体吸着剤は、上記プライマーの伸長反応
液中の標識物質を導入した合成核酸（二本鎖）と標識物
質を導入したプライマー、または標識物質を導入した合
成核酸（二本鎖）と標識物質を導入した単位核酸とを容
易に分離できるものであれば何であってもよい。これら
の条件を満たすものとしては、ゲル口過法に使用される
担体やイオン交換法に使用される担体が考えられる。こ
れらの固体吸着剤は、特に標識物質を導入した合成核酸
と標識物質を導入した単位核酸を分離するのにはふされ
しいが、標識物質を導入した合成核酸と標識物質を導入
したプライマーを分離する場合には必ずしも好しくない
。後者の場合にふされしいものとしてはヒドロキシアパ
タイトや逆相系の固体吸着剤、例えば、シリカゲル誘導
体などがあげられる。ヒドロキシアパタイトは従来より
一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡの分離に用いられ、低リン
酸緩衝液中では二本鎖ＤＮＡのみ吸着され、リン酸緩衝
液の濃度を上げると二本鎖ＤＮＡも溶出してくる（Ｙ、
Ｍｉｙａｚａｗａ、　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｃ，Ａ　（Ｉ９
６５）Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１．２２３．、
Ｍ、　ＭｃＣａｌｌｕＩＩｌ、　Ｐ、Ｍ、Ｂ。

Ｗａｌｋｅｒ　（Ｉ９６７）　Ｂｉｏｃｈｅｌｌｌ、　
Ｊ、１０５　、１６３　）。

一方、逆相系の固体吸着剤であるシリカゲル誘導体、特
にオクタデシルシランは高速液体クロマトグラフィーに
頻繁に利用されており、親水性または疎水性の差で物質
を分離することができる。

ところで核酸上について考えると二本鎖ＤＮＡは塩基同
士で水素結合し、塩基間ではスクッキングして、さらに
リン酸ジエステルは二本鎖の外側に位置していることか
ら一本鎖ＤＮＡよりも親水的である。それゆえ上記シリ
カゲル誘導体、例えばオクタデシルシラン等を用いれば
容易に一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡとを分離する事がで
き、しかも二本鎖ＤＮＡを最初に溶出させることができ
る。

ここでいう′、逆相系の固体吸着剤とは、シリカゲル等
に、ジメチルシラン、オクタデシルシラン、オクチルシ
ラン等の炭素数１〜１８の炭化水素残基を持つシランを
化学結合させたものや、スチレン−ジビニルベンゼン系
共重合体あるいはゲル濾過剤等、極性の小さい樹脂から
なるものである。

また、必要に応じて第１図に示したような装置を用いれ
ば、既存の抗体の分野で使用されている機器（たとえば
プレート洗浄機）と組み合わせることにより、一連の操
作を自動化することができる。

この場合、固体吸着剤２はテーパーを有するチッブ１に
、フィルター３，３を使用して充填しである。

ｄ、検出方法 プライマーの伸長反応で得られた標識合成核酸（二本鎖
）と標識物質をもつ他のものとを固体吸着剤を用いて分
離する場合、次の二通りがある。

（Ｉ）標識合成核酸が標識物質をもつ他のものより先に
溶出する場合（あるいは標識合成核酸のみが選択的に固
体吸着剤に吸着されないで溶出する場合）。（Ｉ１）標
識合成核酸が標識物質をもつ他のものよりも後に溶出す
る場合。

（ｉ）の場合は最初に溶出した液をそのまま、（ｉｉ）
の場合は標識合成核酸以外の標識物質をもったものを十
分洗浄して除いたあと標識合成核酸を溶出し、その液中
に含まれる標識物質を測定すれば良い。標識物質がアイ
ソトープである場合はシンチレータ−を用いて、螢光、
あるいは発光物質である場合それぞれに応じた既知の測
定法で測定する。また、−度に複数の目的核酸を検出す
る場合は、それぞれの標識物質に対応する測定は同一試
料を用いて行うことができる（たとえばそれぞれの標識
物質が螢光特性の異る螢光物質で標識されている場合、
それぞれのけい光物質に合った励起波長と螢光波長を選
べば良い）。

実際には、第１図に示したような受器５または５′を使
用し、標識物質がアイソトープである場合はベータプレ
ートＲ（ＬＫＢ）等の機器、標識物質が螢光分質である
場合はマイクロプレート用自動螢光測定装置を使用すれ
ば良い。上記受器５または５′を使用する場合、固体吸
着剤２を充填した前記チップ１をマイクロタイターウェ
ル状のもの４に装着し、これを図示したように上記受器
５または５′に被せるようにして使用すれば良い。

なお、図中Ｂは、標識合成核酸（二本鎖）を溶出させる
場合であり、またＡは標識プライマーあるいは標識単位
核酸を溶出する場合である。

実験例 実施例１ 一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡの分離をオクタデシルシラ
ン（マイクロボンダバックＣ１８，ウォーターズ社）を
用いて行った。

試料１；　オリゴデオキシヌクレオチド５’　ＨｏＡＣ
ＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣをＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼと ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで５′末端標識した。

試料２；　制限酵素Ｈｉｎｄｍで切断すると３０００ｂ
ｐと２５０ｂｐのフラグメントが得られるプラスミドを
ＨｉｎｄＤＩで切断し、Ｅ。

Ｃｏ１ｔ　　ＤＮＡポリメラーゼのフレナラフラグメン
トと〔α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ。

ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰを用いてそれぞれのフラグメン
トの両末端を標識した。

試料３；　ヒトの胎盤のＤＮＡ　（Ｉμｇ）、試料１と
同様３２Ｐで標識したオリゴデオキシヌクレオチド３２
Ｐ−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ（３０
０μｇ）、オリゴヌクレオチド ＨｏＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＣＣ（３０
０μｇ）およびＴａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ
社）を用いて、ＮＥＢ社のプロトコールに従って上記２
種のプライマーによって夫々の方向よりβ−グロビン遺
伝子の一部を増幅した。

ピペットチップ（Ｉｍｌ用）の先端にシリコナイズした
グラスウールをつめ（第１図参照）、エタノールに懸濁
したＣ１８樹脂（Ｉ００μｇ）を加え、添加用溶液（５
０ｍＭ　　ＮａＣ１，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　　ｐ
Ｈ８，０，１ｍＭＥＤＴＡ　　ｐＨ８，Ｏ；　１ｍ１）
で洗浄した。これにそれぞれの試料（Ｉ００μ４７．Ｎ
ａＣ１の濃度が５０ｍＭになるように調製した）を添加
した。

さらに添加用溶液（５００μｇ）を添加し、溶出した液
を一緒にして溶出液１とした。次に３％エタノールを含
む添加用溶液（５００μｇ）を添加し、溶出した液を溶
出液２とした。以下溶出液のエタノール濃度を段階的に
上げて溶出を行なった。

溶出液３：５％エタノール・添加用溶液（５００μｌ１
ｌ）、溶出液４：１０％エタノール・添加用溶液（５０
０μｇ）、溶出液５：１５％エタノール・添加用溶液、
溶出液６：２０％エタノール・添加用溶液。それぞれの
溶出液同量をとり、５％ポリアクリルアミド電気泳動を
行なって分離状況を調べた。得られたＸ線のオートラジ
オグラムの結果を第２図に示した。試料１の分析結果か
ら一本鎖ＤＮＡである ３２Ｐ−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣは
１０％エタノール・添加用溶液（溶出液４）から溶出す
ることがわかった。また試料２の分析結果から二本鎖Ｄ
ＮＡは５％エタノール・添加用溶液（溶出液３）で溶出
することがわかった。さら゛に、試料３の分析結果から
５％エタノール・添加用溶液（溶出液３）では、ＤＮＡ
ポリメラーゼ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡのみ
溶出され、１０％エタノール・添加用溶液（溶出液４）
では、゛　　合成された二本鎖ＤＮＡとわずかのプライ
マーが溶出されることがわかった。

実施例２ 螢光物質で標識したオリゴデオキシヌクレオチドの逆相
系（オクタデシルシラン）での挙動を調べた。

試料１： ３２Ｐ　−ＣＡＡＴＴＧＡＣＣＣＧＧＴＴＡＴＴＧＣ−
ＮＨ２試料２： ３２Ｐ−ＣＡＡＴＴＧＡＣＣＣＧＧＴＴＡＴＴＧＣ−Ｎ
Ｈ−ＮＢＤ試料３： ””Ｐ−ＣＡＡＴＴＧＡＣＣＣＧＧＴＴＡＴＴＧＣ−Ｎ
Ｈ−ＦＩＴＣ３′末端にアミノ基をもつオリゴデオキシ
ヌクレオチドの合成ならびにそれの螢光標識化は特開昭
５９−９３０９８号、特開昭５９−９３０９９号各公報
心合って行った。また、５′末端アイソトープ標識は実
施例１（試料１）と同様に行った。

逆相系での挙動を調べる実験は、実施例１とほぼ同様に
して溶出液１：添加用溶液（５００μｇ）、溶出液２：
５％エタノール・添加用溶液（５００μｇ）、溶出液３
：１０％エタノール・添加用溶液（５００μｇ）、溶出
液４：１５％エタノール・添加用溶液（５００μｇ）、
溶出液５：２０％エタノール・添加用溶液（５００μｇ
）、溶出液６：３０％エタノール・添加用溶液（５００
μｇ）を用いて行った。得られたオートラジオグラムの
結果を第３図に示した。この結果より、オリゴデオキシ
ヌクレオチドに螢光標識が導入されると１０％エタノー
ル・添加用溶液（溶出液３）ではほとんど溶出されず、
ＦＩＴＣ標識（試料３）の場合特に顕著であることがわ
かった。

実施例３ ５′末端螢光標識オリゴデオキシヌクレオチドの逆相系
での挙動を螢光を測定することにより調べた。特開昭５
９−９３０９８、特開昭５９−９３０９９号各公報心合
って５′末端にフルオレッセインを導入した ＦＩＴＣ−ＮＨ−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴ
ＡＧＣを合成した。これを実施例２とまったく同様条件
で逆相系にかけ溶出した。溶出液の螢光強度を励起波長
４８９ｎｍ、発光波長５２０ｎｍで測定した。その結果
を以下に示した。

相対強度 溶出液１１ 溶出液２１ 溶出液３２ 溶出液４　　６９７ 溶出液５　　１２４２ 溶出液６　　１４６ 本結果より５′末端螢光標識オリゴデオキシヌクレオチ
ドは１０％エタノール・添加用溶液（溶出液３）ではま
ったく溶出されないことがわかった。

実施例４ ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長反応を用い
た遺伝子の検出法でヒトのβ−グロビン遺伝子を検出し
た。

試料１：ヒトの胎盤のＤＮＡ　（Ｉμｇ）、ＦＩＴＣ−
ＮＨ−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ（３
００ｎｇ）および ＨｏＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＡＣをＴａ
ｑ　　ＤＮＡポリメラーゼを含まない反応液（ＮＦ２社
のプロトコールに従って調製したもの。

全量１００μＩｌ）に加えた。

試料２：サケ精子ＤＮＡ　（Ｉμｇ）、ＦＩＴＣ−ＮＨ
−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ（３００
μｇ）　、 ＨｏＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＡＣ（３０
０μｇ）およびＴａｑ　　ＤＮＡポリメラー−Ｉｌｌ’
（ＮＥＢ社）を用いてＮＥＢ社のプロトコールに従って
遺伝子増幅を行った。（増幅回数：２０回、全液量：１
００μｇ） 試料３：ヒト胎盤のＤＮＡ　（Ｉμｇ）、ＦＩＴＣ−Ｎ
Ｈ−ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣ−（３
００μｇ）、 ＨｏＣＡＡＣ”ｒＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＡＣ（３
００μｇ）およびＴａｑ　　ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥ
Ｂ社）を用いてＮＥＢ社のプロトコールに従って遺伝子
増幅を行った（増幅回数：２０回、全液量：１００μｇ
）。試料１〜試料３で使用したプライマーはすべて同じ
ものの組み合せであり、ヒトβ−グロビン遺伝子増幅用
のものである。

これらの試料（５０μｇ）に添加用溶液（４５０μｍｌ
）を加えて実施例１と同様に調製した逆相樹脂に添加し
た。添加用溶液（５００μｇ）および５％エタノール・
添加用溶液（５００μΩ）で洗浄したのち、１０％エタ
ノール・添加用溶液（５００μｇ）で溶出した。得られ
た溶出液にＩＭ　　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　　（ｐＨ９，５
：２５μｇ）を加えてｐＨをおよそ８．５とし、螢光強
度を励起波長４８９ｎｍ、螢光波長５２０ｎｍで測定し
た。その結果を以下に示した。

試料１　試料２　試料３ 相対強度　　　３３０１１１ この結果より、本性を用いてヒトＤＮＡ中のβ−グロビ
ン遺伝子を検出できることがわかった。

実施例５ ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長反応を用い
た遺伝子の検出法で、ヒトのβ−グロビン遺伝子の突然
変異を検出した。テンプレートとしてはβ−グロビン遺
伝子に点変異を生じた遺伝子をもつプラスミドｐＢＲ３
２２−Ｈβ５（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
　９．３６４７−３６５８　（Ｉ９８１）　）を使用し
、プライマーとしては正常な遺伝子と完全に相補的でＦ
ＩＴＣで標識した ＦＩＴＣ−ＮＨ−ＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡ
ＧＡＡＧＴ（Ｆ−ＧＡ）　　、 点変異のある遺伝子と完全に相補的な ＦＩＴＣ−ＮＨ−ＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＴＧＧＡ
ＧＡＡＧＴ（Ｆ−ＧＳ）、および両方の遺伝子に共通な
ＨｏＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＴＣＡＡＣ（ＰＯ
２）を使用した。また競合プライマーとしてＦ−ＧＡに
対してはＧＳを、Ｆ−ＧＳに対してはＧＡを使用した。

反応１：　制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したｐＢＲ３２２
−ＨβＳ　（２０ｎｇ）　、ＰＯ２（３００μｇ）　、
Ｆ−ＧＡ　（３００μｇ）およびＧＳ　（３００μｇ）
を反応液（６７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　　ｐＨ８，８：
６．７ｍＭＭｇＣ１２，１６，６ｍＭ　　（ＮＨ４）　
２Ｓｏ４．１０ｍＭ　　β−メルカプトエタノール、６
，７ｍＭ　　ＥＤＴＡ、２００μＭ　　ｄＡＴＰ、２０
０μＭ　　ｄＧＴＰ、２００μＭ　　ｄＣＴＰ、２００
μＭＴＴＰ、１０％ＤＭＳＯ）に加え（全液量：４９μ
Ｎ）、９５℃で５分間加熱変性した。６５℃で１分間ア
ニーリングしたのちＴａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ社、２
０／μｇ１１μｇ）を加え７３℃で２分間プライマーの
伸長反応を行った。

次に、９２℃で１分間変性し、６５℃で１分間アニーリ
ングした。以後、変性、アニーリング、伸長反応を同様
にして２０回繰り返した。

反応２；　制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したｐＢＲ３２２
−ＨβＳ　（２０ｎｇ）　、ＰＯ２（３００μｇ）　、
Ｆ−ＧＳ　（３００μｇ）およびＧＡ（３００μｇ）を
用いて反応１とまったく同様の反応条件で伸長反応を２
０回繰り返した。

それぞれの反応液（５０μｇ）に添加用溶液（４５０μ
ｇ）を加えて実施例１と同様にして調製した逆相樹脂に
添加した。実施例４と同様にして１０％エタノール・添
加用溶液（５００μｇ）で溶出し、ＬＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ　　（ｐＨ９，５，２５μｇ）を加えてｐＨをお
よそ８，５とし、螢光強度を励起波長４８９ｎｍ、発光
波長５２０ｎｍで測定した。その結果を以下に示した。

反応１　反応２ 相対強度　　　４５　　　１３２ 以上の結果より、Ｆ−ＧＳをプライマーとした反応２の
方が、Ｆ−ＧＡをプライマーとした反応１より、圧倒的
に伸長反応生成物が多い事から、プラスミドｐＢＲ３２
２−ＨβＳはグロビン遺伝子に点突然変異が生じたもの
であることが判定できた。

また上の結果を確かめるために、反応１または反応２の
Ｆ−ＧＡまたはＦ−ＧＳを３２Ｐで標識して同様に伸長
反応を行った（反応３：ｐＢＲ３２２−ＨβＳ　（２０
ｎｇ）　、３２Ｐ−ＧＡ（３０Ｑｎｇ）　、ＧＳ　（３
００ｎｇ）反応４：ｐＢＲ３２２−ＨβＳ　（２０ｎｇ
）　、”２Ｐ　−ＧＳ（３００ｎｇ）　、ＧＡ　（３０
０ｎｇ））、得られた反応液を５％ポリアクリルアミド
電気泳動で分析したところ（第４図）、反応４において
主に伸長反応生成物が得られ、反応１．２の結果と一致
した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、マイクロプレート用自動機器に対応可能な、
固体吸着剤を充填したマイクロプレートを示す説明図で
ある。第２図は、ＰＣＲ法により増幅されたβ′　−グ
ロビン遺伝子の核酸（ＩＩ）との分離結果を示すオート
ラジオグラムを模写したものである。第３図は、オリゴ
ヌクレオチドの螢光物質の違いによる逆相系吸着剤上で
の挙動変化を示すオートラジオグラムを模写したもので
ある。 第４図は、ＰＣＲ反応による点突然変異を識別するオー
トラジオグラムを模写したものである。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 Ａ　　　　　　　　　　　　　　Ｂ 第１図 試料１　　　試料２　　　試料３ ＸＣキシレンシアツール ＢＰＢ　　　ブロモフェノールブルー １：溶出液１　４二溶出液４ ２：溶出液２　５二溶出液５ ３：溶出液３　６：溶出液６ 第２図 試料１　　試料２　　　試料３ １：溶出液１　４：溶出液４ ２：溶出液２　５：溶出液５ ３：溶出液３　６：溶出液６ 第３図 反応３　反応４ 第４図 手　　続　　補　　正　　書 特許庁長官　　吉　１）文　毅　　殴 １　事件の表示 昭和６３年特許願第１４９１５７号 ２　発明の名称 検体中の目的核酸の検出法 ３　補正をする者 事件との関係　　　　特許出願人 湧永製薬株式会社 ５　補正により　　する請求項の数 ６　補正の対象 ７　補正の内容 （Ｉ）　　特許請求の範囲を別紙の通り補正する。 （２）　　明細書第１０頁下から４行の「（ヲ）」を「
（力）」に補正する。 （３）　　回書同真下から３行の「（ル）」を「（ワ）
」に補正する。 （４）　　同所第１２頁下から４行〜第１３頁１１行の
「（へ）必要に応じて、・・・繰り返して行なうこと。 」を 「（へ）必要に応じて、（ホ）を実施した後、最終的に
得られるに本鎖核酸について、これを一本鎖にして、そ
の少くとも一方について、核酸（ＩＩ）とハイブリダイ
ズさせ、そこへ単位核酸を付加させることによって鎖長
を伸長させて二本鎖核酸を形成させることから成る工程
を、１回行うか、または行った後更に同様の工程を少な
くとも１同順次段階的に繰り返して行なうこと。」に補
正する。 （５）　　同書第１３ｒｏ　１行と１２行の間に、「（
ト）必要に応じて、この二本鎖核酸の形成工程（へ）を
核酸（Ｉ）の各鎖について実施して最終的に得られるに
本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離させた後、核酸（Ｉ）
の６鎖とノ１イブリダイズしていた合成核酸鎖同志を、
該検体中において、その生得的な相補性を利用して相互
にハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成させること。 」を挿入する。 （６）　　同書第１３頁１２行の「（ト）」を「（チ）
」に補正する。 （７）　　同書第１３ｒ−ｒ下から３行〜２行の「（チ
）必要に応じて、・・・または（へ）」を「（す）必要
に応じて、工程（イ）〜（ハ）、（イ）〜（ニ）、（イ
）〜（ホ）、（へ）または（ト）」に補正する。 （８）　　回書第１４頁１２行〜第１５頁７行の「（す
）必要に応じて、・・・繰り返して行なうこと。」を ［（ヌ）必要に応じて、（す）を実施した後、最終的に
得られるに本鎖核酸について、これを一本鎖にして、そ
の少くとも一方について、核酸（ＩＩＩ）および／また
は（ＩＩ）とハイブリダイズさせ、そこへ単位核酸を付
加させることによって鎖長を伸長させて二本鎖核酸を形
成させることから成る工程を、１回行うか、または行っ
た後更に同様の工程を少なくとも１同順次段階的に繰り
返して行なうこと。」に補正する。 （９）　　同書第１５頁７行〜８行の間に、「（ル）必
要に応じて、この二本鎖核酸の形成工程（ヌ）を核酸（
Ｉ）の６鎖について実施して最終的に得られるに本鎖核
酸から該合成核酸鎖を遊離させた後、核酸（Ｉ）の６鎖
とＩ〜イブリダイズしていた合成核酸鎖同志を、該検体
中において、その生得的な相補性を利用して相互にハイ
ブリダイズさせて二本鎖核酸を形成させること。」を挿
入する。 （ｌＯ）同書第１５頁８行の「（ヌ）工程（ハ）・・・
（す）のいずれか」を「（ヲ）工程（ハ）、（ニ）、（
ホ）、（へ）、（ト）、（す）、（ヌ）、（ル）のいず
れか」に補正する。 （Ｉ１）　　同書第１６頁１行の「（ル）」を「（ワ）
」に補正する。 （Ｉ２）同書第１６頁６行「（ヲ）工程（ル）より」を
「（力）工程（ワ）より」に補正する。 （Ｉ３）回書第１８頁下から４行の「（イ）〜（ヲ）」
を「（イ）〜（力）」に補正する。 特許請求の範囲 １、　　ド記の工程（イ）〜（力）を実施することを特
徴とする、検体中の少くとも一つの目的核酸の検出法（
ただし、工程（ハ）〜（ワ）は、該目的核酸が存在する
ものとして実施するものとする）。 （イ）少くとも一つの目的核酸（以下、核酸（Ｉ）とい
う）存在の有無を検知しようとする検体を用意すること
。 （ロ）核酸（Ｉ）と相補的で、該核酸よりは短いが該核
酸と特異的にハイブリダイズするのに充分な長さの一本
鎖核酸（以下、核酸（ＩＩ）という）を用意すること。 （ハ）該検体中において、核酸（Ｉ）を、これが一本鎖
のものであればそのままで、これが二本鎖のものであれ
ば一本鎖にしてからその少なくとも一方について、核酸
（ＩＩ）と／Ｘイブリダイズさせ、この核酸（ＩＩ）を
ブライマーとしてそこへ単位核酸を付加させることによ
って鎖長を伸長させて、生成合成核酸鎖と核酸（Ｉ）と
の二本鎖核酸を形成させること。 （ニ）必要に応じて、核酸（Ｉ）が二本鎖のものであっ
たときに６鎖について工程（ロ）および（ハ）を実施し
て得られるに種の二本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離さ
せた後、該検体中において、その生得的な相補性を利用
して相互にハイブリダイズさせること。 （ホ）必要に応じて、工程（イ）〜（ハ）または（イ）
〜（ニ）を実施して得られるに本鎖核酸について、これ
を一本鎖にした後、その少くとも一方について、核酸（
ＩＩ）とハイブリダイズさせ、そこへ単位核酸を付加さ
せることによって鎖長を伸長させて二本鎖核酸を形成さ
せるか、あるいはこの二本鎖核酸の形成工程を核酸（Ｉ
）の６鎖について実施して得られるに本鎖核酸から該合
成核酸鎖を遊離させた後、核酸（Ｉ）の６鎖とハイブリ
ダイズしていた合成核酸鎖同志を、該検体中において、
その生得的な相補性を利用して相互にハイブリダイズさ
せて二本鎖核酸を形成させること。 （へ）必要に応じて、（ホ）を実施した後、最終に得ら
れるに本鎖核酸について、これを一本鎖にして、その少
くとも一方について、核酸（ＩＩ）とハイブリダイズさ
せ、そこへ単位核酸を付加させることによって鎖長を伸
長させて二本鎖核酸を形成させることから成るＩユ程を
、１回行うか、または行なった後更に同様の工程を少な
くとも１回順次段階的に繰り返して行なうこと。 （ト）必要に応じて、この二本鎖核酸の形成工程（へ）
を核酸（Ｉ）の６鎖について実施して最終的に得られる
に本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離させた後、核酸（Ｉ
）の６鎖とハイブリダイズしていた合成核酸鎖同志を、
該検体中において、その生得的な相補性を利用して相互
にハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成させること。 （チ）必要に応じて、核酸（Ｉ）の核酸（■）とハイブ
リダイズする塩基部分より５′側の塩基部分と相補的で
、該塩基部分より短いが該塩基部分と特異的にハイブリ
ダイズするのに充分な長さの一本鎖核酸（以下核酸（Ｉ
ＩＩ）という）を用意すること。 （す）必要に応じて、工程（イ）〜（ハ）、（イ）〜（
ニ）、（イ）〜（ホ）、（へ）または（ト）を実施して
得られるに本鎖核酸について、これを一本鎖にした後、
その少くとも−ｈ°について、核酸（Ｉｆｆ）とハイブ
リダイズさせ、そこへ単位核酸を付加させることによっ
て鎖長を伸長させて二本鎖核酸を形成させるか、あるい
はこの二本鎖核酸の形成工程を核酸（Ｉ）の６鎖につい
て実施して得られるに本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離
させた後、核酸（Ｉ）の６鎖とハイブリダイズしていた
合成核酸鎖同志を、該検体中において、その生得的な相
補性を利用して相互にハイブリダイズさせて二本鎖核酸
を形成させること。 （ヌ）必要に応じて、（す）を実施した後、最終的に得
られるに本鎖核酸について、これを一本鎖にして、その
少くとも一方について、核酸（ＩＩＩ）および／または
（ＩＩ）とハイブリダイズさせ、そこへ単位核酸を付加
させることによって鎖長を伸長させて二本鎖核酸を形成
させることから成る工程を、１回行うか、または行った
後更に同様の工程を少なくとも１回順次段階的に繰り返
して行なうこと。 （ル）必要に応じて、この二本鎖核酸の形成工程（ヌ）
を核酸（Ｉ）の６鎖について実施して最終的に得られる
に本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離させた後、核酸（Ｉ
）の６鎖とハイブリダイズしていた合成核酸鎖同志を、
該検体中において、その生得的な相補性を利用して相互
にハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成させること。 （ヲ）工程（ハ）、（ニ）、（ホ）、（へ）、（ト）、
（す）、（ヌ）、（ル）のいずれかによる産物である二
本鎖核酸に、ド記のいずれかの手段によって、検出Ｉ″
１１能な標識からなる官能基を持たせること。 （Ｉ）官能基を持つ核酸（ＩＩ）または（ＩＩＩ）を使
用する。 （ＩＩ）官能基を持たない核酸（ＩＩ）または（ＩＩＩ
）を使用する場合は、官能基を持つ単位核酸の使用によ
って、該合成核酸鎖を官能基を持つものとして得る。 （ｉｉｌ）該合成核酸鎖を官能基を持たないものとして
形成させ、その後、そこへ、該検体中において、官能基
を導入する。 （ワ）官能基をもつ二本鎖核酸を含む検体を二本鎖核酸
と一本鎖核酸および単位核酸とに対して選択的吸着能を
持つ固体吸着剤に接触させて、該二本鎖核酸と一本鎖核
酸および／または単位核酸とを分離すること。 （力）工程（ワ）より得られる官能基をもつ二本鎖核酸
を、該標識からなる官能基を利用する検出操作に付して
、この核酸の有無を、検出すべき核酸に対応するものと
して検知すること。 ２、　固体吸着剤が逆相系の吸告剤である請求項第１項
記載の検出法。 ３、　逆相系の吸着剤がシリカゲル誘導体である請求項
第２項記載の検出法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程（イ）〜（ヲ）を実施することを特徴と
   する、検体中の少くとも一つの目的核酸の検出法（ただ
   し、工程（ハ）〜（ル）は、該目的核酸が存在するもの
   として実施するものとする）。 （イ）少くとも一つの目的核酸（以下、核酸（ I ）と
   いう）存在の有無を検知しようとする検体を用意するこ
   と。 （ロ）核酸（ I ）と相補的で、該核酸よりは短いが該
   核酸と特異的にハイブリダイズするのに充分な長さの一
   本鎖核酸（以下、核酸（II）という）を用意すること。 （ハ）該検体中において、核酸（ I ）を、これが一本
   鎖のものであればそのままで、これが二本鎖のものであ
   れば一本鎖にしてからその少なくとも一方について、核
   酸（II）とハイブリダイズさせ、この核酸（II）をプラ
   イマーとしてそこへ単位核酸を付加させることによって
   鎖長を伸長させて、生成合成核酸鎖と 核酸（ I ）との二本鎖核酸を形成させること。 （ニ）必要に応じて、核酸（ I ）が一本鎖のものであ
   ったときに各鎖について工程（ロ）および（ハ）を実施
   して得られる二種の二本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離
   させた後、該検体中において、その生得的な相補性を利
   用して相互にハイブリダイズさせること。 （ホ）必要に応じて、工程（イ）〜（ハ）または（イ）
   〜（ニ）を実施して得られる二本鎖核酸について、これ
   を一本鎖にした後、その少くとも一方について、核酸（
   II）とハイブリダイズさせ、そこへ単位核酸を付加させ
   ることによって鎖長を伸長させて二本鎖核酸を形成させ
   るか、あるいはこの二本鎖核酸の形成工程を核酸（ I
   ）の各鎖について実施して得られる二本鎖核酸から該合
   成核酸鎖を遊離させた後、核酸（ I ）の各鎖とハイブ
   リダイズしていた合成核酸鎖同志を、該検体中において
   、その生得的な相補性を利用して相互にハイブリダイズ
   させて二本鎖核酸を形成させること。 （ヘ）必要に応じて、（ホ）を実施した後、最終的に得
   られる二本鎖核酸について、これを一本鎖にして、その
   少くとも一方について、核酸（II）とハイブリダイズさ
   せ、そこへ単位核酸を付加させることによって鎖長を伸
   長させて二本鎖核酸を形成させるか、あるいはこの二本
   鎖核酸の形成工程を核酸（ I ）の各鎖について実施し
   て得られる二本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離させた後
   、核酸（ I ）の各鎖とハイブリダイズしていた合成核
   酸鎖同志を、該検体中において、その生得的な相補性を
   利用して相互にハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成
   させることから成る工程を、１回行うかまたは複数回に
   わたって順次段階的に繰り返して行なうこと。 （ト）必要に応じて、核酸（ I ）の核酸（II）とハイ
   ブリダイズする塩基部分より５′側の塩基部分と相補的
   で、該塩基部分より短いが該塩基部分と特異的にハイブ
   リダイズするのに充分な長さの一本鎖核酸（以下核酸（
   III）という）を用意すること。 （チ）必要に応じて、工程（イ）〜（ハ）、（イ）〜（
   ニ）、（イ）〜（ホ）、または（へ）を実施して得られ
   るに本鎖核酸について、これを一本鎖にした後、その少
   くとも一方について、核酸（III）とハイブリダイズさ
   せ、そこへ単位核酸を付加させることによって鎖長を伸
   長させて二本鎖核酸を形成させるか、あるいはこの二本
   鎖核酸の形成工程を核酸（ I ）の各鎖について実施し
   て得られる二本鎖核酸から該合成核酸鎖を遊離させた後
   、核酸（ I ）の各鎖とハイブリダイズしていた合成核
   酸鎖同志を、該検体中において、その生得的な相補性を
   利用して相互にハイブリダイズさせて二本鎖核酸を形成
   させること。 （リ）必要に応じて、（チ）を実施した後、最終的に得
   られる二本鎖核酸について、これを一本鎖にして、その
   少くとも一方について、核酸（III）および／または（
   II）とハイブリダイズさせ、そこへ単位核酸を付加させ
   ることによって鎖長を伸長させて二本鎖核酸を形成させ
   るか、あるいはこの二本鎖核酸の形成工程を核酸（ I
   ）の各鎖について実施して得られる二本鎖核酸から該合
   成核酸鎖を遊離させた後、核酸（ I ）の各鎖とハイブ
   リダイズしていた合成核酸鎖同志を、該検体中において
   、その生得的な相補性を利用して相互にハイブリダイズ
   させて二本鎖核酸を形成させることから成る工程を、１
   回行うかまたは複数回にわたって順次段階的に繰り返し
   て行なう こと。 （ヌ）工程（ハ）（ニ）（ホ）（へ）（チ）（リ）のい
   ずれかによる産物である二本鎖核酸に、下記のいずれか
   の手段によって、検出可能な標識からなる官能基を持た
   せること。（ｉ）官能基を持つ核酸（II）または（III
   ）を使用する。 （ｉｉ）官能基を持たない核酸（II）または（III）を
   使用する場合は、官能基を持つ単位核酸の使用によって
   、該合成核酸鎖を官能基を持つものとして得る。 （ｉｉｉ）該合成核酸鎖を官能基を持たないものとして
   形成させ、その後、そこへ、該検体中において、官能基
   を導入する。 （ル）官能基をもつ二本鎖核酸を含む検体を二本鎖核酸
   と一本鎖核酸および単位核酸とに対して選択的吸着能を
   持つ固体吸着剤に接触させて、該二本鎖核酸と一本鎖核
   酸および／または単位核酸とを分離すること。 （ヲ）工程（ル）より得られる官能基をもつ二本鎖核酸
   を、該標識からなる官能基を利用する検出操作に付して
   、この核酸の有無を、検出すべき核酸に対応するものと
   して検知すること。 ２、固体吸着剤が逆相系の吸着剤である請求項第１項記
   載の検出法。 ３、逆相系の吸着剤がシリカゲル誘導体である請求項第
   ２項記載の検出法。